KR20190052075A - 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 보존을 위한 방법 및 용도에 관한 것으로, 상기 방법은 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하는 단계, 상기 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 제조하는 단계를 포함하며, 선택적으로 상기 방법은 상기 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하며, 더욱 바람직하게는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 상기 동결보존 배지 중에 존재하고, 또한 상기 저장 배지 중에도 존재한다. 본 발명은 또한 저장 배지 중에 줄기세포를 저장하는 단계를 포함하는 방법에 의한, 줄기세포의 보존을 위한 방법 및 용도에 관한 것으로서, 상기 줄기세포는 동결보존 배지 중에서 동결되어 있고, 해동된 후, 저장되기 전에 저장 배지로 옮겨졌으며; 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 상기 동결보존 배지 중에 존재하고, 또한 상기 저장 배지 중에도 존재한다.

Description

재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도
서열 목록에 대한 참조
본원은 컴퓨터 판독가능 형태의 서열 목록을 포함하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 생리학적 쇼크 이후의(downstream) 효과로부터 세포를 보호하는 방법 및 용도, 및 이를 위해 유용한 재조합 효모-유래 혈청 알부민을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 특히 동결 및 해동 후, 그리고 해동 후 저장 동안 동결보존된 줄기세포의 생존율을 연장시키기 위한, 생존가능한 상태의 줄기세포 보존에 관한 것이다.
줄기세포는 수년 동안 임상 환경에서 사용되어 왔다. 조혈 줄기세포는 혈액학적 및 비-혈액학적 질환 모두의 치료에 사용되어 왔으며; 보다 최근에는 골수에서 유래한 간엽 줄기세포가 실험실과 초기 임상 연구 둘 다의 대상이 되었다. 이러한 세포는 다능성 및 확장 가능성 둘 다를 보여준다. 인간 배아 줄기세포는 다능성 세포로서, 모든 세가지 배엽(germ layer)로부터 세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있는 안정한 세포주를 형성할 수 있다. 이는 재생 의학과 독성학 둘 다에서 이들이 특별한 의미를 갖게 한다. 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포는 또한 배아 줄기세포를 둘러싼 혼란스러운 일부 윤리적 문제없이 유사한 효용 범위를 제공할 수 있다.
줄기세포의 상업적 및 임상적 응용에 필수적인 전제 조건은, 장기간 저장을 위한 적절한 동결보존 프로토콜이다.
이러한 일상적인 절차는, 일반적으로 세포내 얼음 형성의 손상 효과를 피하기 위해 동결보호제의 존재 하에서 서서히 냉각시키는 것을 포함한다. 디메틸 술폭시드 (DMSO)는 일반적인 동결보호제이다.
현재의 동결보존 프로토콜은 임상적으로는 효과적이지만, 여전히 이들이 최적인지 여부에 대한 의문이 남아 있다. DMSO는 조직과 세포에 독성을 가지며, 독성은 시간, 온도 및 농도에 따라 달라진다. 독성은 세포 유형에 따라 다르며, 실용적으로 고려되는 짧은 기간 동안 저온 (+ 4℃)에서 동결보호제를 도입하는 것이 허용되는 관행이었다.
세포의 해동 후, 세척 절차가 일반적으로 사용되며, 이는 예를 들어 해동된 세포를 DMSO-불포함 배지로 옮기기 위한, 예를 들어 문헌 [Rubenstein et al., 1995, Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 92: 10119-10122]에 의해 원래 개발된 것에 기초한 것이다.
그러나, 동결보존된 줄기세포를 해동시키고, 신선한 (이상적으로는 DMSO-불포함) 배지로 옮긴 후, 줄기세포가 생존능이 있는 상태에서 이후의 사용에 적합하게 남아 있는 기간은 매우 제한된다 (일반적으로 24시간 이하임).
따라서, 본 발명의 목적은, 동결 후 줄기세포의 장기간 저장 능력을 개선시키고, 생존율, 동일성 및 다능성을 손상시키지 않으면서 동결 동안 및 동결 후 임상 등급의 줄기세포의 안정성을 개선시키기 위한 동결보존 방법의 과제를 해결하는 것이다.
발명의 개요
본 출원인은 놀랍게도, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 생리학적 쇼크의 하류 효과로부터 세포를 보호하는 데 특히 효과적 (예를 들어, 혈장-유래 혈청 알부민에 비해)이라는 것을 발견하였다. 즉, AlbIX®, 리콤부민(Recombumin)® 알파 및 리콤부민® 프라임 산물 [알부메딕스 리미티드(Albumedix Ltd.) 사에서 입수가능]과 같은 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 동결보존에 사용되는 동결/해동 단계와 같은 생리학적 쇼크 후에 초기로부터 후기 세포사멸 상태로 이동하는 것으로부터 세포 (예컨대, 줄기세포)를 보호하는 데 있어, 예를 들어 혈장-유래 혈청 알부민 제제와 같은 다른 형태의 알부민 제제에 비해 특히 효과적이라는 것이 밝혀졌다.
따라서, AlbIX®, 리콤부민® 알파 및 리콤부민® 프라임 산물 (알부메딕스 리미티드에서 입수가능함)과 같은 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 동결보존에 사용되는 동결/해동 단계를 거치고, 이어서 사용 전에 저장되는 줄기세포의 생존율의 기간을 실질적으로 연장시키기 위해 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 특히 효과적인 성분임이 본 출원인에 의해 입증되었다. 이전에 동결보존된 줄기세포가 해동 후 저장에서 유지되고 생존가능 상태로 유지될 수 있는 기간의 연장은 중요한 개선 및 유연성 추가를 제공한다.
구체적으로, 동결 후 안정성을 증가시킴으로써, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 저장 및 수송의 문제를 해결하며 줄기세포 치료법을 사용하는 임상 실습자 및 환자에게 유연성을 더해줄 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은,
줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하는 단계, 및 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 단계를 포함하되,
선택적으로, 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 추가로 포함하되,
여기서 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 것인, 줄기세포의 보존 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 측면은 또한,
줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 포함하며,
여기서 줄기세포는 동결보존 배지에서 동결되고, 해동되고, 저장 배지로 옮겨진 후 저장되고;
여기서 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 것인, 줄기세포의 보존 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면의 방법은, 줄기세포를 동결보존 배지에서 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 단계, 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 저장하는 단계를 포함하며, 여기서 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함한다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 줄기세포와 혼합시, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지 중에 존재하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여 용어 "약"은 명시된 값의 ±50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 의미를 포함할 수 있고; 예를 들어, 명시된 값의 10% (w/v)±10%는 9 내지 11% (w/v)이다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 바람직하게는 동결보존 배지 중에 존재할 수 있고, 또한 저장 배지 중에 존재한다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면의 바람직한 구현예에서, 줄기세포는 2 내지 8℃의 온도, 예컨대 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃에서 저장 배지에 저장된다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
예를 들어, 줄기세포는 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 저장 배지에 저장될 수 있고; 선택적으로 줄기세포는 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장되고, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상이다. 기간과 관련하여 사용되는 용어 "약"은 명시된 값의 ±50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 의미를 포함할 수 있다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에 따라, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
본 발명의 제1 측면에 따라 사용되는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체일 수 있고/거나 (이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.3%, 0.1% 이하 또는 그 미만의 의미를 포함할 수 있음);
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 단량체일 수 있고/거나 (이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.3%, 0.1% 이하 또는 그 미만의 의미를 포함할 수 있음); 그리고/또는
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 가질 수 있다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 명시된 값의 ±50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.3%, 0.1% 이하 또는 그 미만의 의미를 포함할 수 있고; 예를 들어 1.0% (w/v)±50%는 0.5 내지 1.5% (w/v)의 범위이다. 이와 관련하여 사용되는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 적용되는 용어 "중합체"는 단량체 및 이량체 형태와는 구별된다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어질 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않을 수 있다.
추가로 선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용되며, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않는다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 가질 수 있거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않는다.
추가로 선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용되며, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않는다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함할 수 있거나, 계면활성제를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제를 전혀 갖지 않는다.
추가로 선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용되며, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않는다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함할 수 있거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않는다.
추가로 선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용되며, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않는다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않을 수 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용되며, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상의 성분, 예컨대 이들 모두를 갖지 않는다. 또한, 전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖는다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 명시된 값의 ±10㎍·L-1, 5㎍·L-1, 4㎍·L-1, 3㎍·L-1, 2㎍·L-1, 1㎍·L-1, 0.5㎍·L-1, 0.1㎍·L-1의 의미를 포함할 수 있다.
추가로 전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용되며, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상의 성분, 예컨대 이들 모두를 갖지 않는다. 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 추가로 또는 대안적으로 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1의 범위 내의 알루미늄 농도를 가질 수 있다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 명시된 값의 ±10㎍·L-1, 5㎍·L-1, 4㎍·L-1, 3㎍·L-1, 2㎍·L-1, 1㎍·L-1, 0.5㎍·L-1, 0.1㎍·L-1 또는 그 미만의 의미를 포함할 수 있다.
추가로 전형적으로, 본 발명의 제1 측면 (또는 본 발명의 임의의 다른 측면)에 따라 사용되며, 또한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 에너지 기질을 갖지 않거나, 본질적으로 갖지 않고/거나, L-글루타민, 폴리-L-리신 및 엑토인의 조합일 수 있는 노화 방지제를 갖지 않거나, 본질적으로 갖지 않는다. 이와 관련하여, 에너지 기질을 "본질적으로 갖지 않음"은 약 0.25% v/v 미만, 예컨대 0.1% v/v 미만, 0.01% v/v 미만, 0.001% v/v 미만, 0.001% v/v 미만, 또는 0% v/v의 의미를 포함한다. 노화 방지제를 "본질적으로 갖지 않음"은 약 0.0005% v/v 미만, 예컨대 5×10-5% v/v 미만, 5×10-6% v/v 미만, 5×10-7% v/v 미만, 또는 0% v/v을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖는다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 약 62% 초과, 예컨대 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함한다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 명시된 값의 ±50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만의 의미를 포함할 수 있고; 예를 들어 80%±10%는 72 내지 88%의 범위를 나타낸다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적(native) 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 약 11개, 1 내지 약 8개, 1 내지 약 5개, 1 내지 약 4개, 1 내지 약 3개, 1 내지 약 2개, 약 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함한다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 단백질 1개당±5, 4, 3, 2 또는 1개의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기의 의미를 포함할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함한다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 제1 측면 (및 모든 다른 측면)에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 그에 의해 생성된 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 식물 단백질 가수분해물을 본질적으로 갖지 않거나, 함유하지 않을 것이다.
용어 "식물 단백질 가수분해물"은, 아미노산 및/또는 펩티드를 함유하는 물질이 식물 단백질의 가수분해에 의해 제조되는 것인, 아미노산 및/또는 펩티드를 함유하는 물질을 나타낸다. 식물 단백질 가수분해물은 특정 효소 등을 사용하여 식물 단백질을 가수분해하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 그 예는 담배, 쌀 또는 콩 단백질 가수분해물일 수 있다. 식물 단백질 가수분해물은 효소 등을 사용하는 식물 단백질의 직접 가수분해의 산물 또는 상업적으로 입수가능한 식물 단백질 가수분해물일 수 있다. 추가의 예는 가수분해된 콩 단백질 및 셰필드(Sheffield) 사에서 제조된 울트라펩 소이(ULTRAPEP SOY) 또는 울트라펩 와이이 (ULTRAPEP YE)이다.
이와 관련하여 용어 "본질적으로 갖지 않음"은, 본 발명의 제1 측면 (및 모든 다른 측면)에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 그에 의해 생성된 동결보존 배지 및/또는 저장 배지와 같은 배지가, 식물 단백질 가수분해물 또는 그의 성분을, 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 하여, 1 중량부 내지 50 중량부 미만, 바람직하게는 1 중량부 내지 100 중량부 미만, 더욱 바람직하게는 1 중량부 내지 1000 중량부 미만의 수준으로 함유하고, 가장 전형적으로는 0의 식물 단백질 가수분해물을 함유함을 나타낸다.
식물 단백질 가수분해물은 세포의 기본 에너지 원으로 사용되어 세포에 영양분을 제공하고 동결 및 해동시 이들의 활성을 증가시키는 필수 아미노산 및/또는 비-필수 아미노산을 포함한다. 이론에 구애되지 않지만, 본 출원인은, 본 발명에서 사용하기 위한 동결보존 배지 및 저장 배지에서의 이러한 성분의 부재가, 저장 동안 동일성(stasis)의 형태로 세포를 유지하고 후기 세포사멸로 진행하는 세포의 능력을 감소시킴에 따라, 해동 후 줄기세포의 생존율을 유지시키는 본 발명의 능력에 기여한다고 믿는다. 또한, 본 발명에서 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 산물에서 알부민 단백질의 고순도 (다른 공급원으로부터의 알부민 제제에서 발견되는 낮은 순도에 비해)는, 보다 덜 순수한 제제 중에 존재하는 요인들에 의해 생성된 신호 '소음'으로부터 줄기세포를 보호하는 데 기여하는 인자이며, 이는 저장 동안 세포의 변화를 최소화하는 데 추가로 기여할 수 있다고 여겨질 것이다.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 동결보존 배지는 재조합 혈청 알부민 제제 및 별도의 동결보존제를 포함한다. 추가로 선택적으로, 동결보존 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 동결보존제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어진다. 바람직하게는 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖는다. 예를 들어, 이온성 완충제는, 100㎖ 당, 약 526mg의 염화나트륨, USP (NaCl); 약 502mg의 나트륨 글루코네이트 (C6H11NaO7); 약 368mg의 아세트산나트륨 삼수화물, USP (C2H3NaO2·3H2O); 약 37mg의 염화칼륨, USP (KCl); 및 약 30mg의 염화마그네슘, USP (MgCl2·6H2O)을 함유하는 멸균 비-발열성 등장액, 예컨대 플라스마라이트(Plasmalyte)®와 실질적으로 동등한 등장 완충제일 수 있다. 가장 바람직하게는 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나 이온성 완충제는 플라스마라이트®이다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 줄기세포 배양 성장 배지가 아니라는 점을 인지해야 한다. 이는 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않는다. 예를 들어, 표준 성장 조건 하에 저장 배지에서 관찰된 세포 성장은 전형적으로, 표준 줄기세포 배양 성장 배지, 예컨대 DMEM에서 성장시켰을 때, 동일한 조건 하에, 동일한 세포에 대해 관찰된 것의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는 0%일 것이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 동결보존 배지는 전형적인 줄기세포 배양 배지의 성분, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 전혀 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 "비타민"은 콜린 클로라이드, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아미드, d-판토텐산 (헤미칼슘), 피리독살, 피리독신, 리보플라빈 및/또는 티아민 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "호르몬"은 트리아이오도티로닌, 파라토르몬, 티로트로핀 방출 호르몬, 소마토메딘, 에스트로겐, 프로락틴, 성장 호르몬, 테스토스테론 및/또는 히드로코르티손 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "철 공급원"은 트랜스페린을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "성장 인자"는, 아드레메듈린(AM); 안지오포이에틴 (Ang); 자가분비 운동성 인자; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 섬모 신경영양 인자 패밀리 (섬모 신경영양 인자 (CNTF), 백혈병 억제 인자 (LIF) 및/또는 인터루킨-6 (IL-6)을 포함하나, 이에 한정되지는 않음)의 하나 이상의 구성원; 하나 이상의 콜로니-자극 인자 (대식세포 콜로니-자극 인자 (m-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 및/또는 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함하하나, 이에 한정되지는 않음); 표피 성장 인자 (EGF); 하나 이상의 에프린 (에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 에리트로포이에틴 (EPO); 섬유아세포 성장 인자 (FGF); 태아 소 소마토트로핀 (FBS); 하나 이상의 GDNF 리간드 패밀리 (신경아교세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴트로핀, 퍼세핀 및/또는 아르테민을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 성장 분화 인자-9 (GDF9); 간세포 성장 인자 (HGF); 간암-유래 성장 인자 (HDGF); 인슐린; 하나 이상의 인슐린-유사 성장 인자 (인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 및/또는 인슐린-유사 성장 인자-2 (IGF-2)를 포함하나, 이에 한정되지는 않음); 하나 이상의 인터루킨 (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및/또는 IL-7을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 각화세포 성장 인자 (KGF); 이동-자극 인자 (MSF); 대식세포-자극 단백질 (MSP); 미오스타틴 (GDF-8); 하나 이상의 뉴레귤린 1 (뉴레귤린 1 (NRG1), 뉴레귤린 2 (NRG2), 뉴레귤린 3 (NRG3) 및/또는 뉴레귤린 4 (NRG4)를 포함하나, 이에 한정되지 않음); 하나 이상의 뉴로트로핀 (뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀-3 (NT-3) 및/또는 뉴로트로핀-4 (NT-4)를 포함하나, 이에 한정되지 않음); 태반 성장 인자 (PGF); 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 레날라제(renalase, RNLS); T-세포 성장 인자 (TCGF); 트롬보포이에틴 (TPO); 하나 이상의 형질전환 성장 인자 (형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α) 및/또는 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)를 포함하나, 이에 한정되지 않음); 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 및/또는 Wnt 신호전달 경로 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "유리 아미노산"은 L-아르기닌, L-시스틴, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및/또는 L-발린 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
동결보존 배지에 사용되는 동결보존제는 재조합 효모-유래 혈청 알부민과 구별되며, 예를 들어 디메틸술폭시드 (DMSO), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜 (EG), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. DMSO가 특히 바람직할 수 있다. 동결보호제는, 줄기세포와 혼합시, 동결보존 효과를 제공하기에 적합한 농도로 동결보존 배지 중에 존재할 수 있다. DMSO의 경우, 이는 약 10% (w/v)±5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%일 수 있다. 당업자는 통상적인 시험을 사용하여 적절한 양의 동결보존제를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 따라, 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함할 수 있으며, 선택적으로, 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어질 수 있고, 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖는다. 예를 들어, 이온성 완충제는, 100㎖당, 약 526mg의 염화나트륨, USP (NaCl); 약 502mg의 나트륨 글루코네이트 (C6H11NaO7); 약 368mg의 아세트산나트륨 삼수화물, USP (C2H3NaO2·3H2O); 약 37mg의 염화칼륨, USP (KCl); 및 약 30mg의 염화마그네슘, USP (MgCl2·6H2O)을 함유하는 멸균 비-발열성 등장액, 예컨대 플라스마라이트®와 실질적으로 동등한 등장 완충제일 수 있다. 가장 바람직하게는 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나 이온성 완충제는 플라스마라이트®이다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 저장 배지는 줄기세포 배양 성장 배지가 아니라는 점을 인지해야 한다. 이는 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않는다. 예를 들어, 표준 성장 조건 하에 관찰된 세포 성장은 전형적으로, 표준 줄기세포 배양 성장 배지, 예컨대 DMEM에서 성장시켰을 때, 동일한 조건 하에, 동일한 세포에 대해 관찰된 것의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는 0%일 것이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 저장 배지는 전형적인 줄기세포 배양 배지의 성분, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 전혀 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "비타민", "호르몬", "철 공급원", "성장 인자", "유리 아미노산"은 상기에서 추가로 정의된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따라 사용되는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 개별적으로 또는 둘 다 혈청-유래 알부민 제제의 하나 이상의 성분, 예를 들어 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스 및/또는 N-아세틸 트립토판으로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성분 (예컨대, 모두)을 포함하지 않고, 바람직하게는 옥타노에이트 및/또는 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는다.
본 발명의 제1 측면의 방법은, 선택적으로 2 내지 8℃의 온도에서 (예를 들어, 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃에서) (여기서 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있음), 또한 추가로 선택적으로 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 저장 배지에 줄기세포를 저장하는 것을 포함할 수 있고, 선택적으로, 여기서 저장 배지에 줄기세포를 저장하는 단계 후에 직접적 또는 간접적으로, 방법은 하기 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함한다:
- 줄기세포를 배양하는 단계;
- 줄기세포의 배양물을 확장시키는 단계;
- 줄기세포를 분화시키는 단계;
- 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양된 및/또는 분화된 세포를, 예를 들어 조직 또는 의료용 이식물 내에 고정화시키는 단계;
- 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양된 세포 및/또는 분화된 세포 또는 다른 산물을, 약학적으로 허용가능한 조성물 또는 수의학적으로 허용가능한 조성물에서 제형화하는 단계; 및/또는
- 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양된 세포 및/또는 분화된 세포 또는 다른 산물을 환자에게 투여하는 단계.
선택적으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 방법은 저장 배지에 줄기세포를 저장하는 것을 포함하되, 저장 후, 줄기세포는, 예를 들어 골세포, 심장세포, 췌장 베타 세포, 신경세포, 섬유아세포, 심근세포, 골아세포 및/또는 연골세포로부터 선택된 세포 유형으로 분화된다.
본 발명의 제2 측면은, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 동결보존제를 포함하는, 줄기세포의 동결보존을 위한 동결보존 배지를 제공한다. 동결보존제는, 예를 들어, 디메틸술폭시드 (DMSO), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜 (EG), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 동결보존 배지는 재조합 혈청 알부민 제제, 동결보존제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어진다. 바람직하게는 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖는다. 예를 들어, 이온성 완충제는, 100㎖ 당, 약 526mg의 염화나트륨, USP (NaCl); 약 502mg의 나트륨 글루코네이트 (C6H11NaO7); 약 368mg의 아세트산나트륨 삼수화물, USP (C2H3NaO2·3H2O); 약 37mg의 염화칼륨, USP (KCl); 및 약 30mg의 염화마그네슘, USP (MgCl2·6H2O)을 함유하는 멸균 비-발열성 등장액, 예컨대 플라스마라이트®와 실질적으로 동등한 등장 완충제일 수 있다. 가장 바람직하게는 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나 이온성 완충제는 플라스마라이트®이다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 줄기세포 배양 성장 배지가 아니라는 점을 인지해야 한다. 이는 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않는다. 예를 들어, 표준 성장 조건 하에 관찰된 세포 성장은 전형적으로, 표준 줄기세포 배양 성장 배지, 예컨대 DMEM에서 성장시켰 때, 동일한 조건 하에, 동일한 세포에 대해 관찰된 것의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는 0%일 것이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 전형적인 줄기세포 배양 배지의 성분, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 전혀 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "비타민", "호르몬", "철 공급원", "성장 인자", "유리 아미노산"은 상기에서 추가로 정의된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 줄기세포를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 줄기세포는 다분화능(pluripotent) 줄기세포 (예컨대, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 유도된 다분화능 줄기세포), 다능성(multipotent) 줄기세포 (예컨대, 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 골수, 제대혈 또는 제대로부터 선택적으로 유래될 수 있는 간엽 줄기세포; 골수 또는 말초 혈액으로부터 선택적으로 유래될 수 있는 조혈 줄기세포; 신경 줄기세포; 또는 배아 줄기세포) 또는 단능성(unipotent) 줄기세포 (예컨대, 간세포가 될(committed) 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
선택적으로, 줄기세포를 포함할 수 있는 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 동결 형태, 예를 들어 0℃ 미만의 형태, 더욱 바람직하게는 약 -80℃ 내지 약 -196℃인 형태이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1℃를 포함할 수 있다. 이 구현예에 따라, 동결 조성물 중에 존재하는 임의의 줄기세포는 바람직하게는 가사 상태이다. 동결 형태의 줄기세포를 포함하는 동결보존 배지는, 1, 2, 3, 4, 5, 5, 6 또는 7일, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 동안 동결된 형태로 유지될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 동결된 형태가 아니지만, 동결되고 이어서 해동된 줄기세포 집단을 포함할 수 있다. 동결 및 해동된 줄기세포 집단은 동결/해동 과정을 거치지 않은 줄기세포 집단과 구별될 수 있다. 동결은 세포에 스트레스를 유발하고 전형적으로 프로그램된 세포 사망 (세포사멸)을 개시할 것이다. 본 실시예에서의 데이터는 본원에서 논의된 바와 같이 세포사멸 단계에 특정 마커, 예컨대 아넥신(Annexin) V 결합 및 PI 및/또는 7AAD 봉입체가 뒤따를 수 있는 방식을 나타낸다. 동결 및 해동된 줄기세포 집단은, 예를 들어, 세포 집단 내 초기 및 후기 세포사멸 수준을 측정하여 동결/해동 과정을 거치지 않은 줄기세포 집단과 구별될 수 있다. 모든 세포 집단은 세포사멸 단계에서 일정 비율의 세포를 갖지만, 동결 및 해동 후에는, 특히 24시간 초과의 기간 동안 2 내지 8℃에서 본원에 기재된 저장 용액 중에 저장시, 수준이 증가된다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 바람직하게는 본 발명의 제1 측면과 관련하여 사용되는 동결보존 배지에 대해 상기에 기재된 특성 중 하나 이상 (예컨대, 모두)을 가질 것이다.
바람직하게는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 줄기세포와 혼합시, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로, 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지 중에 존재한다. 이와 관련하여 용어 "약"은 명시된 값의 ±50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 의미를 포함할 수 있고; 예를 들어, 명시된 값의 0.1% (w/v)±10%는 0.9 내지 0.11% (w/v)이다.
바람직하게는, 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질을 포함한다:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
바람직하게는, 본 발명의 제2 측면의 동결보존 배지는:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 단량체이고/거나;
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖는
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질을 포함한다. 이와 관련하여 사용되는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 적용되는 용어 "중합체"는 단량체 및 이량체 형태와는 구별된다.
바람직하게는, 본 발명의 제2 측면에 따라:
(a) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고/거나;
(b) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않고/거나;
(c) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않고/거나;
(d) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않고/거나;
(e) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않고/거나;
(f) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않고/거나;
(g) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제이고/거나;
(h) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상, 예컨대 모든 성분을 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고/거나;
(i) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖고/거나;
(j) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(k) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(l) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(m) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(n) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함한다.
본 발명의 제3 측면은, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는, 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포의 저장을 위한 저장 배지를 제공한다. 바람직하게는, 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어진다. 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖는다. 예를 들어, 이온성 완충제는, 100㎖ 당, 약 526mg의 염화나트륨, USP (NaCl); 약 502mg의 나트륨 글루코네이트 (C6H11NaO7); 약 368mg의 아세트산나트륨 삼수화물, USP (C2H3NaO2·3H2O); 약 37mg의 염화칼륨, USP (KCl); 및 약 30mg의 염화마그네슘, USP (MgCl2·6H2O)을 함유하는 멸균 비-발열성 등장액, 예컨대 플라스마라이트®와 실질적으로 동등한 등장 완충제일 수 있다. 가장 바람직하게는 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나 이온성 완충제는 플라스마라이트®이다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 동결보존 배지는 줄기세포 배양 성장 배지가 아니라는 점을 인지해야 한다. 이는 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않는다. 예를 들어, 표준 성장 조건 하에 관찰된 세포 성장은 전형적으로, 표준 줄기세포 배양 성장 배지, 예컨대 DMEM에서 성장시켰을 때, 동일한 조건 하에, 동일한 세포에 대해 관찰된 것의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 또는 0%일 것이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 전형적인 줄기세포 배양 배지의 성분, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 전혀 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "비타민", "호르몬", "철 공급원", "성장 인자", "유리 아미노산"은 상기에서 추가로 정의된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 바람직하게는 본 발명의 제1 측면과 관련하여 사용되는 저장 배지에 대해 상기에 기재된 특성 중 하나 이상 (예컨대, 모두)을 가질 것이다.
바람직하게는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 줄기세포와 혼합시, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지 중에 존재한다.
전형적으로, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
전형적으로, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97% 단량체이고/거나;
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖는다. 이와 관련하여 사용되는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 적용되는 용어 "중합체"는 단량체 및 이량체 형태와는 구별된다.
바람직하게는, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지에서,
(a) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고/거나;
(b) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않고/거나;
(c) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않고/거나;
(d) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않고/거나;
(e) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않고/거나;
(f) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않고/거나;
(g) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제이고/거나;
(h) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상, 예컨대 모든 성분을 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고/거나;
(i) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖고/거나;
(j) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(k) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(l) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(m) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(n) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 줄기세포를 추가로 포함한다. 선택적으로, 줄기세포는 다분화능 줄기세포 (예컨대, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 유도된 다분화능 줄기세포), 다능성 줄기세포 (예컨대, 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 골수, 제대혈 또는 제대로부터 선택적으로 유래될 수 있는 간엽 줄기세포; 골수 또는 말초 혈액으로부터 선택적으로 유래될 수 있는 조혈 줄기세포; 신경 줄기세포; 또는 배아 줄기세포) 또는 단능성 줄기세포 (예컨대, 간세포가 될 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 동결보존 배지 (바람직하게는, 본 발명의 제1 및/또는 제2 측면에 의해 정의된 바와 같은 동결보존 배지)에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포를 추가로 포함한다. 상기에서 언급된 바와 같이, 동결 및 해동된 줄기세포 집단은 동결/해동 과정을 거치지 않은 줄기세포 집단과 구별될 수 있다. 동결은 세포에 스트레스를 유발하고 전형적으로 프로그램된 세포 사망 (세포사멸)을 개시할 것이다. 본 실시예에서의 데이터는 본원에서 논의된 바와 같이 세포사멸 단계에 특정 마커, 예컨대 아넥신 V 결합 및 PI 및/또는 7AAD 봉입체가 뒤따를 수 있는 방식을 나타낸다. 동결 및 해동된 줄기세포 집단은, 예를 들어, 세포 집단 내 초기 및 후기 세포사멸 수준을 측정하여 동결/해동 과정을 거치지 않은 줄기세포 집단과 구별될 수 있다. 모든 세포 집단은 세포사멸 단계에서 일정 비율의 세포를 갖지만, 동결 및 해동 후에는, 특히 24시간 초과의 기간 동안 2 내지 8℃에서 본원에 기재된 저장 용액 중에 저장시, 수준이 증가된다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 본 발명의 제1 및/또는 제2 측면의 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포를 포함한다.
전형적으로, 저장 배지에 저장된 줄기세포를 추가로 포함하는 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 냉장고 및/또는 2 내지 8℃의 온도에서 저장된다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
줄기세포를 추가로 포함하는 본 발명의 제3 측면의 저장 배지는 선택적으로, 줄기세포가 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨지고, 줄기세포가 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 저장 배지에서 (전형적으로 냉장고 및/또는 2 내지 8℃의 온도에서) 저장된 것을 특징으로 한다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면의 구현예에 따라, 저장 배지는, 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장된 줄기세포 (선택적으로, 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후 저장 배지로 옮겨지거나, 또는 다른 생리학적 쇼크를 받은 후에 저장 배지로 옮겨진 줄기세포)를 추가로 포함하되, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 초과이다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
예를 들어, 저장에서 약 48시간 후에 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 초과의 생존율이 바람직하다.
저장에서 약 72시간 후에 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 초과의 생존율이 바람직하다.
생존율은, 예를 들어, 도 6 및 실시예 1과 관련하여 하기에서 논의되는 바와 같이, 아넥신 V 결합 및 PI 포함과 같은 마커를 사용하여 결정될 수 있다.
놀랍게도 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 시험에서 5% (w/v)보다는 약 2% (w/v)의 알부민 농도를 사용할 때 해동 후 생존율이 더 연장되었다. 그럼에도 불구하고, 혈장-유래 혈청 알부민보다는 재조합 효모-유래 혈청 알부민을 사용하는 것의 이점은 5% (w/v) 알부민을 사용할 때 더욱 더 두드러졌다.
따라서, 본 발명의 제3 측면의 하나의 구현예에서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 줄기세포와 혼합시, 약 2% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)로 동결보존 및/또는 저장 배지 중에 존재하고, 저장 배지는 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 저장 배지에 저장된 줄기세포 (선택적으로, 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨지거나, 또는 다른 생리학적 쇼크를 받은 후에 저장 배지로 옮겨진 줄기세포)를 추가로 포함하되, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상이다.
본 발명의 제3 측면의 다른 구현예에서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 줄기세포와 혼합시, 5% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)로 동결보존 및/또는 저장 배지 중에 존재하고, 저장 배지는 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 저장 배지에 저장된 줄기세포 (선택적으로, 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨지거나, 또는 다른 생리학적 쇼크를 받은 후에 저장 배지로 옮겨진 줄기세포)를 추가로 포함하되, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% 또는 그 초과, 예컨대 약 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% 또는 그 초과이다.
동결보존 배지 및 저장 배지의 용도 또한 본 발명에 의해 제공된다.
따라서, 제4 측면에서, 본 발명은 줄기세포의 보존을 위한 본 발명의 제2 측면에 따른 동결보존 배지의 용도를 제공한다.
본 발명의 제4 측면의 용도는, 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서의 줄기세포의 저장 후 생존가능 상태의 줄기세포를 보존하기 위한 것일 수 있다. 선택적으로, 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상이다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제4 측면의 용도에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 줄기세포와 혼합시, 약 2% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)로 동결보존 배지 중에 존재한다. 대안적 옵션으로, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 줄기세포와 혼합시, 5% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)로 동결보존 배지 중에 존재할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제4 측면의 용도는, 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서의 저장 전에, 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하고, 상기 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 것 (또는 줄기세포를 다른 생리학적 쇼크를 받게 하는 것)에 의한 줄기세포의 보존을 위한 것이다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
- 이는 선택적으로, 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서 저장 배지에 저장하는 단계를 포함할 수 있다.
- 또한 대안적으로, 이는 선택적으로, 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하고, 줄기세포를 생리학적 쇼크를 받게 하고, 세포를 저장 배지로 옮기고, 줄기세포를 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서 저장 배지에 저장하는 것에 의한 줄기세포의 보존을 위한 것일 수 있다.
바람직하게는 어느 하나의 대안적으로, 저장 배지는 본 발명의 제3 측면에 따른 저장 배지이다.
본 발명의 제5 측면은, 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 것에 의한, 줄기세포의 보존을 위한 본 발명의 제3 측면에 따른 저장 배지의 용도를 제공한다. 선택적으로, 줄기세포는 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 후 저장된다. 대안적으로, 줄기세포는 동결보존 배지와 혼합되고, 생리학적 쇼크를 받고, 저장 배지로 옮겨진 후 저장될 수 있다. 어느 하나의 대안적으로, 동결보존 배지는 본 발명의 제2 측면에 따른 동결보존 배지인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 제6 측면은 동결보존된 줄기세포의 해동 후 생존율을 개선시키기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도를 제공한다. 개선은 전형적으로, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 대신에 혈장-유래 혈청 알부민을 동일한 농도로 사용했을 때 관찰된 동결보존된 줄기세포의 해동 후 생존율의 수준과 비교된다. 개선은, 예를 들어, 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장시, 해동 후 줄기세포에서 관찰가능하다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
본 발명의 제6 측면에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 이를 동결보존 배지로 제형화시키고, 동결보존 배지를 줄기세포와 혼합한 후 동결시킴으로써 사용될 수 있고, 선택적으로, 여기서 동결보존 배지는 본 발명의 제2 측면에 의해 정의된 바와 같은 배지이다.
본 발명의 제6 측면에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 추가로 또는 대안적으로, 이를 저장 배지로 제형화시키고, 저장 배지를 줄기세포와 혼합한 후 해동시킴으로써 사용될 수 있고, 선택적으로, 여기서 저장 배지는 본 발명의 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 배지이다.
본 발명의 제7 측면은, 생리학적 쇼크를 받는 세포의 생존율을 개선시키기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도를 제공한다. 세포는 예를 들어, 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포 및/또는 바람직하게는 줄기세포 또는 림프구일 수 있다. 개선은 전형적으로, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 대신에 혈장-유래 혈청 알부민을 동일한 농도로 사용했을 때 관찰된 세포 (예를 들어, 줄기세포)의 쇼크 후 생존율의 수준과 비교된다. 개선은, 예를 들어, 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장시, 쇼크 후 세포 (예를 들어, 줄기세포)에서 관찰가능하다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
본 발명의 제7 측면에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 이를 동결보존 배지로 제형화시키고, 동결보존 배지를 생리학적 쇼크 이전의 세포 (예를 들어, 줄기세포)와 혼합함으로써 사용될 수 있고, 선택적으로 동결보존 배지는 본 발명의 제2 측면에 의해 정의된 바와 같은 배지일 수 있다.
본 발명의 제7 측면에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 추가로 또는 대안적으로, 이를 저장 배지로 제형화시키고, 저장 배지를 생리학적 쇼크를 받은 후의 세포 (예를 들어, 줄기세포)와 혼합함으로써 사용될 수 있고, 선택적으로, 여기서 저장 배지는 본 발명의 제3 측면에 의해 정의된 바와 같은 배지이다.
본 발명의 실시예는 또한 놀랍게도, 후기 세포사멸 단계보다는 초기 세포사멸 단계에서 스트레스를 받은 세포를 유지하는 데 있어서 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 이점을 나타낸다. 초기 세포사멸 단계에 있는 세포는 세포사멸되지 않을 것이며, 유리한 조건 하에, 생존가능 세포로서 사용될 수 있는 구조된 형태로 회귀될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vives et al, 2003, Met . Eng ., 5: 124-132]에서 논의된 바와 같이, 세포는 세포사멸 프로그램을 활성화시킴으로써 여러 공격에 반응할 수 있지만, 비-유도 세포사멸 조건에 재-노출될 때 보호된 세포의 생존율 및 성장은 회복될 수 있는 반면, 후기 세포사멸로의 진입을 막지 못한 세포는 즉시 죽을 것이다. 문헌 [Tinto et al, J. Biotechnol., 95: 205-214]는 세포사멸-유도 배양 조건에 대해 보호하기 위해 카스파제 억제제를 사용한 하이브리도마 세포 성장의 회복을 예시하고, 유리한 배양 조건으로의 회귀 후 정상 성장으로의 복귀를 보여준다.
따라서, 본 발명의 제8 측면은, 초기 세포사멸로부터 후기 세포사멸로의 세포의 전환을 예방, 지연 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 세포를 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지와 혼합하는 것을 포함한다.
본 발명의 제8 측면은 또한, 초기 세포사멸로부터 후기 세포사멸로의 세포의 전환을 예방, 지연 또는 감소시키기 위한, 예를 들어, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 형태의, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 제8 측면에 따라 처리될 세포는 세포사멸을 겪을 수 있는 임의의 적합한 세포 유형일 수 있고, 예를 들어, 동물 세포 또는 인간 세포로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 줄기세포이다. 이러한 줄기세포의 예는 다분화능 줄기세포 (예컨대, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 유도된 다분화능 줄기세포), 다능성 줄기세포 (예컨대, 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 골수, 제대혈 또는 제대로부터 선택적으로 유래될 수 있는 간엽 줄기세포; 골수 또는 말초 혈액으로부터 선택적으로 유래될 수 있는 조혈 줄기세포; 신경 줄기세포; 또는 배아 줄기세포) 또는 단능성 줄기세포 (예컨대, 간세포가 될 줄기세포)를 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 제8 측면에 따라 처리될 세포는 생체외 세포일 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라, 세포는 생리학적 쇼크를 받기 이전 및/또는 이후에 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지와 혼합될 수 있다. 생리학적 쇼크 이전 및 이후 둘 다에 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 세포에 제공되는 것이 바람직할 수 있다. "생리학적 쇼크"란, 처리될 세포의 집단에서 세포사멸을 유도할 수 있는 세포 환경에서의 물리적 및 화학적 변화를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 측면의 의미 내에서 생리학적 쇼크는, 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장시, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제의 부재 하에, 또한 심지어 혈장-유래 혈청 알부민의 존재 하에, 집단 내의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상에서 세포사멸을 유도할 것이다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
생리학적 쇼크의 예는, 비-제한적으로, 열 쇼크 (예를 들어, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 56, 47, 48, 49 또는 50℃ 초과), 저온 쇼크 (예를 들어, 2, 1, 0, -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -20, -80, -100℃ 미만, 또는 그 미만), 삼투 쇼크 (예를 들어, 세포와 실질적으로 비-등장성인 조건에 대한 노출), 영양 결핍, 독성 화합물에 대한 노출, 대사 물질에 대한 노출 및/또는 대사 물질의 결핍, 효소에 대한 노출 및/또는 효소의 결핍, 화학적 쇼크, pH 쇼크, 유기 용액에 대한 노출 및 전단력에 대한 노출, 표면 노출 및/또는 표면 노출 손실과 같은 다른 쇼크를 포함한다. 선택적으로, 생리학적 쇼크는 동결보존 동안 동결 및/또는 해동 단계 중 하나 이상에 기인한 쇼크일 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라, 비-제한적으로, 초기 세포사멸은, 예를 들어 유동 세포계측법을 사용하여 측정시, 아넥신 (예컨대, 아넥신 V) 결합을 나타내지만 요오드화프로피듐 (PI) 및/또는 7-아미노악티노마이신 D (7AAD) 봉입체는 나타내지 않는 세포를 특징으로 할 수 있다. 초기 세포사멸은 추가로, 아넥신 결합과 조합되며 PI 및/또는 7AAD 봉입체는 없는, 생리학적 쇼크를 받지 않은 동일한 세포 배치에서 관찰된 수준보다 높은 미토콘드리아 투과성을 특징으로 한다. 초기 세포사멸의 다른 특성화 특징은 당업계에 잘 알려져 있으며 (그의 예는 본원 내 다른 부분에서 논의됨), 이는 또한 추가의 또는 대안적 마커로서 사용될 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라, 비-제한적으로, 후기 세포사멸은, 아넥신 (예컨대, 아넥신 V) 결합을 나타내며 또한 요오드화프로피듐 (PI) 포함 및/또는 7-아미노악티노마이신 D (7AAD) 봉입체를 나타내는 세포를 특징으로 할 수 있다. 후기 세포사멸의 다른 특성화 특징은 당업계에 잘 알려져 있으며 (그의 예는 본원 내 다른 부분에서 논의됨), 이는 또한 추가의 또는 대안적 마커로서 사용될 수 있다.
본 발명의 제8 측면에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로 세포와 혼합될 수 있다. 줄기세포와 혼합시, 약 2% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v); 또는 세포와 혼합시, 5% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)의 농도가 바람직할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제8 측면에 따라, 세포는 2 내지 8℃의 온도에서 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지에 저장될 수 있다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다. 저장은 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 시간 동안 수행될 수 있다. 초기 세포사멸로부터 후기 세포사멸로의 세포의 전환에 있어 예방, 지연 또는 감소가 저장 기간 동안 관찰가능할 수 있다.
따라서, 세포를 24시간 초과 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47), 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 (예를 들어, 적어도, 또는 약, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72시간), 또는 그 초과 (예컨대, 최대 3, 4, 5, 6 또는 7일)의 기간 동안 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지에 저장하는 것이 바람직할 수 있다. 선택적으로, 세포는 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장되고, 저장 기간 종료시 세포사멸의 초기에 있는 세포의 백분율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상이다. 선택적으로, 저장 온도는 약 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃이다. 이와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1℃의 의미를 포함할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 제8 측면에 따른 배지에서 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
전형적으로, 본 발명의 제8 측면에 따른 배지에서 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97% 단량체이고/거나;
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖는다. 이와 관련하여 사용되는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 적용되는 용어 "중합체"는 단량체 및 이량체 형태와는 구별된다.
전형적으로, 본 발명의 제8 측면에 따라:
(a) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고/거나;
(b) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않고/거나;
(c) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않고/거나;
(d) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제를 전혀 갖지 않고/거나;
(e) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않고/거나;
(f) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않고/거나;
(g) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 제제는 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제이고/거나;
(h) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상, 예컨대 모든 성분을 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고/거나;
(i) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖고/거나;
(j) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(k) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(l) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(m) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(n) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함한다.
도 1은 실시예 5에 보고된 바와 같은 시판용 알부민 산물의 질량 분광분석을 나타낸다: (a) 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파; (b) 시판용 알부민 1 (식물-유래); (c) 시판용 알부민 2 (식물-유래); (d) 시판용 알부민 3 (피키아 (Pichia) 효모로부터 유래).
도 2는 실시예 5에 기재된 바와 같은 시판용 알부민 산물로부터 기록된 비교 겔 전기영동 데이터를 나타낸다: (a) 리콤부민® 프라임; (b) 리콤부민® 알파; (c) 시판용 알부민 1; (d) 시판용 알부민 3; (e) 시판용 알부민 2.
도 3은 실시예 5에 기재된 바와 같은 재조합 알부민의 착색 비교를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 기재된 연구에서 전개된 실험 단계의 체계를 나타낸다.
도 5는 실시예 1에 기재된 연구에서 2 내지 8℃에서의 안정성 시험에 사용된 구성을 나타낸다.
도 6은, 아넥신 V 결합 (수평축) 및 및 PI 포함 (수직축)에 기초한, 2 내지 8℃에서의 해동 후 안정성에서의 세포사멸 분석의 결과를 나타낸다.
도 7은, 실시예 2에서 논의된 바와 같은, 알부테인(Albutein)® (RI) 또는 AlbIX® (TI) 동결보존 용액을 비교한, 동결 전 및 해동 후 hMSC의 동일성에 대한 % 표면 마커를 나타낸다.
도 8은 하기의 것을 나타낸다: (A) 유동 세포계측 분석. hSERB로 확장된 세포 배양액 중의 알부테인® (RI) 또는 AlbIX® (TI) 첨가제에 대한, 안정성 시점에 따른 % 생존율 (점선은 70% 생존율 규격 한계를 나타냄). 72시간 동안 시간 0을 기준으로 고려한 감소의 %가 나타나 있다. 아노바 터키(ANOVA Tukey) 다중 비교 시험의 결과가 나타나 있다. (B) 유동 세포계측 분석. PL로 확장된 세포 배양액 중의 알부테인® (RI) 또는 AlbIX® (TI) 첨가제에 대한, 안정성 시점에 따른 % 생존율 (점선은 70% 생존율 규격 한계를 나타냄). 72시간 동안 시간 0을 기준으로 고려한 감소의 %가 나타나 있다. 아노바 터키 다중 비교 시험의 결과가 나타나 있다. (C) 및 (D) 유동 세포계측 분석. 알부테인® (RI) 및 AlbIX® (TI) 동결보존 조건, 그리고 hSERB (C) 및 PL (D) 확장 전략에 대한, 시간 0에 대한 % 생존율 감소. 아노바 비-모수 시닥(Sidak) 다중 비교 시험이 통계 분석에 사용되었다.
도 9는 본 발명의 제3 구현예에 따른 재조합 효모-유래 알부민 제제의 알부민 제제의 지방산 프로파일을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 제3 구현예에 따른 재조합 효모-유래 알부민 제제의 알부민 제제의 ICP-OES에 의한 금속 이온 프로파일을 나타낸다.
도 11은 hSERB 배양 배지로 확장된 세포 배양에 대한 알부테인® (RI) 또는 AlbIX® (TI) 동결보존 용액을 비교한, 안정성 평가의 상이한 시점에서의 hMSC의 동일성에 대한 % 표면 마커를 나타낸다.
도 12는 알부테인® (대조군) 또는 AlbIX® 동결보존 용액을 비교한, 안정성 평가의 상이한 시점에서의 hMSC 세포의 초기 및 후기 세포사멸 상태를 나타낸다.
도 13은 동결보존 배지, 저장 배지, 또는 이들 둘 다에서 사용되는 경우, 해동 직후 효모-유래 재조합 인간 혈청 알부민의 보호 효과를 나타낸다. (A)는 유동 세포계측법으로 얻은 모든 항목 (RI, TI1, TI2, TI3; 항목당 n = 3)의 생존율의 백분율을 나타낸다. 점선은 해동 후 생존율에 대한 일상적인 허용 기준에 해당한다. 비교는 일원 아노바, 듀넷(Dunnett) 다중 시험으로 수행되었다. (B)는 뉴클레오카운터(NucleoCounter)로 얻은 모든 항목 (RI, TI1, TI2, TI3; 항목당 n = 3)의 생존율을 나타낸다. 점선은 해동 후 생존율에 대한 일상적인 허용 기준에 해당한다. 비교는 일원 아노바, 듀넷 다중 시험으로 수행되었다.
도 14는 동결보존 배지, 저장 배지, 또는 이들 둘 다에서 사용되는 경우, 해동 직후부터 해동 후 72시간까지의 효모-유래 재조합 인간 혈청 알부민의 보호 효과를 나타낸다. (A)는 유동 세포계측법에 의해 얻어진 생존율의 백분율을 나타낸다. (B)는 뉴클레오카운터에 의해 얻어진 생존율의 백분율을 나타낸다. 두 표시 모두, 모든 항목 (항목 당 n = 3)의 표준 편차와 연합된 안정성 연구에 따른 생존율을 나타낸다. 도 14a 및 도 14b에서, ●는 기준 항목이고, ■는 시험 항목 1이고, ▲는 시험 항목 1이고, ▼는 시험 항목 3이다.
도 15는 2 내지 8℃에서 저장시 해동 후 생존율 (%)에 대해 평가된, RI 및 TI2 샘플의 비교를 나타낸다. (A)는 유동 세포계측법에 의해 측정된 결과를 나타내고, (B)는 뉴클레오카운터에 의해 측정된 결과를 나타낸다.
도 16은, 정규화된 데이터를 사용하고 2 내지 8℃에서 저장시 시간에 따른 해동 후 생존율 (%) 감소에 평가된, RI 및 TI2 샘플의 비교를 나타내며, 여기서는 각 샘플의 시점 0h에서의 시간 생존율이 100%의 생존율을 갖는 시점으로서 고려되었고, 이 시점으로부터의 생존율 감소를 이 값에 대하여 평가하였다. (A)는 유동 세포계측법에 의해 측정된 결과를 나타내고, (B)는 뉴클레오카운터에 의해 측정된 결과를 나타낸다.
도 17은 2 내지 8℃에서 저장시 해동 후 생존율 (%)에 대해 평가된, TI1 및 TI3 샘플의 비교를 나타낸다. (A)는 유동 세포계측법에 의해 측정된 결과를 나타내고, (B)는 뉴클레오카운터에 의해 측정된 결과를 나타낸다.
도 18은 2 내지 8℃에서 저장시 해동 후 생존율 (%)에 대해 평가된, TI1 및 TI3 샘플의 비교를 나타낸다. (A)는 유동 세포계측법에 의해 측정된 결과를 나타내고, (B)는 뉴클레오카운터에 의해 측정된 결과를 나타낸다.
도 19는 초기 세포사멸 세포 및 후기 세포사멸 세포의 백분율의 표시를 나타낸다. 안정성의 각 시점에서, (A)는 기준 항목 (RI)과 시험 항목 2 (TI2)의 비교를 나타내고, (B)는 시험 항목 1 (TI1) 및 시험 항목 3 (TI3)의 비교를 나타내고, (C)는 기준 항목 (RI)과 시험 항목 3 (TI3)의 비교를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
정의
동결: 세포 제제 동결과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "동결(freezing)"은, 세포를 얼음 결정을 생성하기에 충분히 낮은 온도로 노출시키거나 세포 제제를 완전히 동결된 고체 형태, 예를 들어, 0℃ 미만의 형태로 만드는 것을 포함한다. 용어 "동결"은 바람직하게는 동결보존을 나타낸다.
동결보존: 동결보존은, 생물학적 물질 (세포, 조직 및 유기체)을 매우 낮은 온도, 일반적으로 -80℃ 내지 -196℃의 온도에서 동결시켜 양호한 상태로 유지하는 방법이다. 이러한 방식으로, 필수적 기능이 감소하고 이들이 장시간 동안 가사 상태로 유지될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "동결보존 (cryopreservation)"은 동결을 통해 장기간 동안 세포를 안정적으로 유지시키는 것을 나타낸다. 일반적으로, 세포가 배양될 때, 1 대 10,000의 비율로 돌연변이가 발생하고, 세포가 장기간의 계대 배양을 통과할 때, 세포 집단이 달라지고 원래의 집단과 상이하게 된다. 심각한 경우에는, 세포가 계대 배양에 의해 자신의 특정 기능을 상실할 수 있다. 또한, 계대 배양 동안 세포가 마이코플라스마 등으로 감염될 수 있다. 이러한 문제 때문에, 세포 동결보존은, 세포의 본래의 특징을 상실하기 전에 세포를 동결시키고 보존하고, 필요시 이들을 다시 사용하기 위해 수행된다. 특히, 줄기세포가 치료에 사용된다면, 필요시 건강한 줄기세포를 즉시 사용할 수 있어야 한다. 따라서, 효과적인 동결보존은 줄기세포에 있어 특히 중요한 것으로 고려된다.
본 발명의 동결보존 배지로 처리된 줄기세포의 동결은, 당업계에 공지된 줄기세포를 동결시키는 임의의 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있으며, 그 예는 유리화 방법 및 느린 동결 방법을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 유리화 방법은, 예를 들어, 제어 속도 동결기 (CRF)와 같은 장치를 사용하여 일정 속도 (예를 들어, 1분당 1℃)로 온도를 지속적으로 감소시킴으로써 수행된다. 바람직하게는, 온도가 -80℃에 도달하면, 세포를 즉시 질소 탱크에 저장한다. 느린 동결 방법은, 세포를 함유하는 동결보존 배지를 함유하는 바이알을 이소프로필 알콜을 함유하는 동결 컨테이너 박스에 놓고, -70℃ 이하의 초저온 동결기에서 특정 기간 (예를 들어, 12시간 내지 24시간) 동안 온도를 지속적으로 감소시킴으로써 수행될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 동결된 세포는 액체 질소 탱크에 저장할 수 있으며, 필요시 다시 사용할 수 있다.
적합한 예시적인 방법은 또한 실시예에 기재되어 있다.
동결보존 용액: 세포 산물의 동결은 동결보존 용액 중에 하나 이상의 동결보호제를 사용하여 수행된다. 상기 용액의 사용은 일반적으로 세포의 세포내 구획에서 동결된 물의 결정 형성을 방지하기 위해 세포 탈수에 의한 동결 동안 세포 생존율의 보존에 기초한다.
동결보존제: 본원에서 사용되는 용어 "동결보존제(cryopreservant)"는, 세포, 조직 또는 장기가 -80℃ 내지 -200℃의 초저온에서 보존될 때 얼음 결정 형성 및 이온 및 삼투압 불균형에 의해 불가피하게 동반되는 동결 및 해동 과정에 의해 유발되는 세포 손상을 최소화하기 위해 사용되는 물질을 나타낸다.
본 발명의 목적상, "동결보존제"는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 또는 임의의 다른 형태의 알부민 단백질이 아니다. 그렇지 않은 경우, 동결보호제는 동결보존 동안 세포 손상을 감소시킬 수 있는 한, 특정 물질에 한정되지 않는다.
비-제한적으로, 동결보존 용액 중에 존재하는 동결보존제는, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜 (EG), 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 및 트레할로스를 포함할 수 있다. DMSO가 특히 바람직할 수 있다. 동결보호제는, 줄기세포와 혼합시, 동결보존 효과를 제공하기에 적합한 농도로 동결보존 배지 중에 존재할 수 있다. DMSO의 경우, 이는 약 10% (w/v)±5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%일 수 있다. 당업자는 통상적인 시험을 사용하여 적절한 양의 동결보존동결보존제를 용이하게 결정할 수 있다.
줄기세포: 본원에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"는 자가-갱신 및 분화 력을 갖는 미분화 세포를 나타낸다. 줄기세포는 그의 분화능에 따라 전능 (totipotent) 줄기세포, 다분화능(pluripotent) 줄기세포, 다능성(multipotent) 줄기세포 및 단능성(unipotent) 줄기세포의 부분집단을 포함한다. 전능 줄기세포는 배아 조직 및 태반 세포를 포함하는 유기체의 임의의 세포로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다. 다분화능 줄기세포는 살아있는 유기체를 구성하는 모든 조직 또는 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다. 다능성 줄기세포는 모든 종류로 분화하는 능력을 갖지 않지만 여러 종류의 조직 또는 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다. 단능성 줄기세포는 특정 조직 또는 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다.
다분화능 줄기세포는 배아 줄기세포 (ES 세포), 배아 생식 세포 (EG 세포), 유도된 다분화능 줄기세포 (iPS 세포) 등을 포함할 수 있다.
다능성 줄기세포는 성인 줄기세포, 예컨대 간엽 줄기세포 (지방, 골수, 제대혈 또는 제대 등), 조혈 줄기세포 (골수 또는 말초 혈액으로부터 유래), 신경 줄기세포, 생식세포 줄기세포 등을 포함할 수 있다.
단능성 줄기세포는 일반적으로 낮은 자가-재생 능력을 갖고 정상적으로 정지 상태이지만 특정 조건 하에는 간세포로 활발하게 분화하는, 간세포가 될 줄기세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 구현예에서는, 골수 간엽 줄기세포 및 제대 줄기세포를 사용하여 본 발명의 조성물이 안전성 및 안정성을 갖는 줄기세포의 동결보존에 사용될 수 있는지를 검사하였다.
본 발명에 따라, 용어 "줄기세포"는 전형적으로 1차 세포를 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "1차 세포 (primary cell)"는, 살아있는 유기체의 기관/조직의 기능을 나타내는, 임의의 유전자 조작 등이 없이 개인의 조직으로부터 단리된 세포를 나타낸다. 1차 세포는 피부 또는 혈관 내피, 골수, 지방, 연골 등으로부터 단리되어 해당하는 조직 및 세포의 기능의 연구에, 또는 손실 조직의 회복을 위한 치료제로서 사용된다.　
줄기세포 및 1차 세포의 기원은, 본 발명의 조성물에 의해 세포가 안정적으로 동결보존될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 암소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 줄기세포 또는 1차 세포는 인간 줄기세포 또는 1차 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
선택적으로, 본 발명의 방법 및 용도 (특히, 사용된 줄기세포가 인간 배아 줄기세포 (hESC)인 방법 및 용도)는 산업적 또는 상업적 목적을 포함하여 임의의 목적으로 인간 배아의 사용을 배제한다. 이에 따라, 본 발명에 따라 사용되는 임의의 hESC는 인간 배아의 파괴를 통해 직접적 또는 간접적으로 얻어지지 않는 것이 바람직할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명에 따라 사용되는 임의의 hESC는 그것이 일어나는 단계에 관계없이 인간 배아의 사전 파괴 또는 기질로서의 그의 사용을 요구하지 않는 수단을 통해 얻어지는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 임의의 hESC는 인간으로 발달하는 본래의 능력을 갖지 않는 세포의 반수성체(parthenote) 및/또는 다른 세포 또는 세포 집합으로부터 유래되는 것이 바람직할 수 있다.
세포사멸: 세포사멸(apoptosis)은 다세포 생물에서 발생하는 프로그램된 세포 사망의 과정이다. 생화학적 사건은 특징적인 세포 변화 (형태학) 및 사망을 가져온다. 이러한 변화는, 기포형성, 세포 단편화, 핵 분열, 염색질 응축, 염색체 DNA 단편화 및 글로벌 mRNA 붕괴로부터 선택된 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. 세포사멸은 괴사와는 구별되며, 후자는 급성 세포 손상으로 인한 외상성 세포 사망의 형태이다. 반면, 세포사멸은 고도로 조절되고 제어된 과정이다. 괴사와 달리, 세포사멸은 세포사멸체라고 불리는 세포 단편을 생성하여, 세포의 내용물이 주변 세포 상으로 유출되어 손상을 야기하기 전에 식균 세포가 둘러싸고 신속히 제거할 수 있다.
세포 사멸 및 괴사(necrotic) 세포를 구별하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이는, 예를 들어, 시간 경과 현미경법(time-lapse microscopy), 유동 형광세포계측법(flow cytometry) 및 투과 전자 현미경법에 의한 형태학 분석을 포함할 수 있다. 또한, 세포 표면 마커 (유동 형광세포계측법에 의한 세포 투과성 대 포스파티딜세린 노출), DNA 단편화 (유동 형광세포계측법), 카스파제 활성화, Bid 절단, 및 사이토크롬 c 방출 (웨스턴 블롯팅)의 분석을 위한 다양한 생화학적 기술이 있다. 1차 및 2차 괴사 세포는 카스파제, HMGB1 및 사이토케라틴 18의 방출에 대한 상청액 분석에 의해 구별할 수 있다. 그러나 괴사 세포 사망의 뚜렷한 표면이나 생화학적 마커는 아직 밝혀지지 않았으며, 네거티브 마커만 이용가능하다. 이들은 세포사멸 마커 (카스파제 활성화, 사이토크롬 c 방출, 및 올리고뉴클레오솜 DNA 단편화)의 부재 및 세포 사망 마커 (포스파티딜세린 노출 및 세포막 투과성)의 차동 동역학을 포함한다. 세포사멸을 괴사 세포와는 구별하는 데 사용될 수 있는 기술의 선택은 잘 알려져 있다.
아넥신(annexin)은 포스파티딜세린 (PS)에 결합하여 세포사멸 세포를 확인하는 칼슘 의존성 인지질-결합 단백질의 패밀리이다. 건강한 세포에서, PS는 주로 원형질 막의 세포질 측을 따라 위치한다. 세포사멸이 개시되면, PS는 인지질 이중층에서 그의 비-대칭 분포를 잃고, 형광 표지된 아넥신 V로 검출가능한 세포외 막으로 전위된다.
- 세포사멸의 초기에, 원형질 막은 프로피듐 아이오다이드 (PI) 및 7AAD와 같은 생존능 염료를 배제하고, 따라서 아넥신 V 염색 (PI 및/또는 7AAD 네거티브)만을 나타내는 세포는 세포사멸의 초기에 있다. 초기 세포사멸에 있는 세포는 세포사멸에 관여하지 않으며, 유리한 조건 하에, 생존가능 세포로서 사용될 수 있는 구조된 형태로 회귀될 수 있다. 이에 따라, 세포사멸 초기의 세포는, 본원의 목적상, "생존가능 (viable)"한 것으로 고려된다.
- 후기 세포사멸 동안, 세포 막 완전성의 상실은 PI 및/또는 7AAD의 세포 흡수 뿐만 아니라 세포질 PS에 대한 아넥신 V 결합을 허용한다. 세포사멸 후기의 세포는, 본원의 목적상, "생존가능"한 것으로 고려되지 않는다.
7AAD 또는 PI와 함께 사용되는 아넥신 V 염색법은, 예를 들어 유동 세포계측법에 의해 세포사멸 단계를 확인하는 데 널리 사용된다.
초기의 세포사멸에 대한 추가 수단으로는, 예를 들어 문헌 [Milian et al, 2015, J. Biotech., 209: 58-67] (이것의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 미토스크린(Mitoscreen) 키트를 사용하는 것과 같은, 미토콘드리아 투과성의 측정을 포함할 수 있다 (특히, 상기 밀리안(Milian) 등의 문헌의 섹션 2.2 및 도 5A 참조). 또한, 카스파제 3 활성 분석은, 예를 들어 문헌 [Tinto et al, 2002, J. Biotech., 95: 205-214]에 기재되어 있으며, 이것의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
상기 틴토(Tinto) 등의 문헌에는 또한, DNA 래더(ladder) 분석 (틴토 등의 문헌의 도 3B, E, H 참조), 및 예를 들어, 틴토 등의 문헌의 도 1C에 기재된 바와 같은 공초점 이미징을 포함한, 후기 세포사멸을 특성화하기 위해 적용될 수 있는 추가의 유용한 분석이 기재되어 있다.
재조합 효모-유래 알부민: 본 발명은 '재조합 효모-유래 혈청 알부민 (recombinant yeast-derived serum albumin)' 단백질 및 그의 제제에 관한 것이다.
즉, 혈청 알부민 단백질은 알부민-코딩 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 효모를 발효 배지에서 배양하여 얻은 효모 배양물로부터 유래하고, 이로써 상기 효모는 알부민 단백질을 발현하고 이를 배지로 분비한다. 이는 바람직하게는 동물성 또는 인간-유래 물질을 사용하지 않고 제조된다. 이어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질을 실질적으로 정제된 형태로 이로부터 회수하여, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 제조한다.
효모는 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 또는 피키아 속 (예를 들어, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 것이다. 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 제조 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다 (예를 들어, 클루이베로마이세스 (Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975), 피키아 (Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262) 및 사카로마이세스 (Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46)). 모든 인용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 가장 바람직하게는 속은 사카로마이세스이고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에이다.
예시적인 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제의 제조에 적합한 방법 및 이러한 제제 그 자체는, WO 2000/044772 및/또는 WO 2013/006675에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
EP1329460 (A1), EP1329461 (A1), EP1329462 (A1) 및 EP1710250 (A1) (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에도, 본 발명에서 사용하기에 잠재적으로 적합할 수 있는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제의 제조 방법 및 이러한 제제 그 가체가 기재되어 있다.
하기에서 논의되는 바와 같이, 효모에서의 재조합 혈청 알부민의 생성 및 이로부터의 회수는 다른 공급원으로부터 (예를 들어, 혈장으로부터, 또는 식물과 같은 다른 재조합 공급원으로부터) 얻어진 혈청 알부민 조성물과 물리적으로 구별되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 제공한다. 이러한 구별은 다양하며, 혈청 알부민 단백질 그 자체의 구조 및 알부민 단백질과 제제에서 함께 정제되는 동반 성분의 동일성 및/또는 수준에서의 물리적 차이를 포함한다. 적어도 부분적으로, 이는, 다른 공급원으로부터 얻은 혈청 알부민과 비교하여, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 알부민 단백질은 원래의 알부민 분자에 공급원이 단백질에 부과한 변화 및 변경이 상대적으로 없기 때문이다.
알부민은, 다수의 포유류 및 조류로부터 (예를 들어, WO2010/092135 (특히 표 1)에 열거된 알부민 및 WO 2011/124718로서 공개된 PCT/EP11/055577 (특히 페이지 9 및 서열 번호: 2, 4 내지 19 및 31) (이들 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 기재되고 특성화되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 하나 이상의 (여러) 알부민을 포함할 수 있다. 바람직하게는 조성물은 인간 알부민 [예컨대 AAA98797 또는 P02768-1, 서열 번호 2 (성숙), 서열 번호 3 (미성숙)], 비-인간 영장류 알부민, [예컨대 침팬지 알부민 (예컨대, 예측 서열 XP_517233.2, 서열 번호 4), 고릴라 알부민 또는 원숭이 알부민 (예컨대, NP_001182578, 서열 번호 5)], 설치류 알부민 [예컨대 헴스터 알부민 (예를 들어, A6YF56, 서열 번호 6), 기니아 피그 알부민 (예컨대, Q6WDN9-1, 서열 번호 7), 마우스 알부민 (예컨대, AAH49971 또는 P07724-1 버전 3, 서열 번호 8, 또는 성숙 서열 번호 19) 및 래트 알부민 (예컨대, AAH85359 또는 P02770-1 버전 2, 서열 번호 9))], 소 알부민 (예컨대, 암소 알부민 P02769-1, 서열 번호 10), 말 알부민, 예컨대 말 알부민 (예컨대, P35747-1, 서열 번호 11) 또는 당나귀 알부민 (예컨대, Q5XLE4-1, 서열 번호 12), 토끼 알부민 (예컨대, P49065-1 버전 2, 서열 번호 13), 염소 알부민 (예컨대, ACF10391, 서열 번호 14), 양 알부민 (예컨대, P14639-1, 서열 번호 15), 개 알부민 (예컨대, P49822-1, 서열 번호 16), 닭 알부민 (예컨대, P19121-1 버전 2, 서열 번호: 17) 및 돼지 알부민 (예컨대, P08835-1 버전 2, 서열 번호: 18)로부터 선택된 알부민을 포함한다. 성숙한 형태의 알부민이 특히 바람직하고, 당업자는 단백질 데이터뱅크와 같은 공개적으로 입수가능한 정보를 사용하여 및/또는 시그날(Signal)P와 같은 신호 펩티드 인식 소프트웨어 (예를 들어, 시그날P (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6))를 사용하여 성숙 형태를 확인할 수 있다. 시그날P 버전 4.0이 바람직하다 (Petersen et al (2011) Nature methods (8): 785-786).
재조합 효모-유래 혈청 알부민은 바람직하게는 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 HSA 도메인과 동일한 및/또는 매우 유사한 3차 구조를 갖는 단백질이고, HSA 또는 관련 도메인과 유사한 특성을 갖는다.
서열 번호 2에 개시된 인간 알부민 또는 그의 임의의 천연 대립 유전자는 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이다. 서열 번호 2는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 재조합 효모-유래 인간 혈청 알부민 제제의 특히 바람직한 형태는 재조합 효모-유래 리콤부민® 알파 (이전에는 알부쿨트(Albucult)®), 리콤부민® 프라임 (이전에는 리콤부민®) 및/또는 AlbIX® (모두 알부메딕스 리미티드에서 제공)를 포함한다.
대안적으로, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 HSA 또는 HSA 도메인과 매우 유사한 3차 구조를 갖고 HSA 또는 관련 도메인과 유사한 특성을 갖는 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
유사한 3차 구조는 예를 들어 모체 알부민에서 언급된 종에서 유래한 알부민의 구조이다. 알부민의 주요 특성 중 일부는 i) 혈장 부피를 조절하는 능력, ii) 약 19일±5일의 긴 혈장 반감기, iii) 리간드-결합, 예를 들어 산성, 친유성 화합물 (빌리루빈 지방산, 헤민 및 티록신을 포함)과 같은 내인성 분자의 결합 (또한, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695]의 표 1 참조), iv) 산성 또는 전기음성 특징을 갖는 작은 유기 화합물, 예를 들어 와파린, 디아제팜, 이부프로펜 및 파클리탁셀과 같은 약물의 결합 (또한, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695] 참조)이다. 단백질 또는 단편을 알부민으로 특성화하기 위해 이러한 모든 특성이 충족될 필요는 없다. 예를 들어, 단편이 특정 리간드 또는 유기 화합물의 결합을 담당하는 도메인을 포함하지 않는 경우, 이러한 단편의 변이체는 이러한 특성을 가질 것으로 기대되지 않을 것이다. 용어 알부민은 변이체 및/또는 유도체, 예컨대 알부민 또는 알부민 변이체의 융합 및/또는 컨쥬게이션을 포함한다.
용어 "모체(parent)" 또는 "모체 알부민 (parent albumin)"은, 본 발명에서 사용될 수 있는 알부민 변이체를 생성하기 위해 변경이 이루어지는 알부민을 의미한다. 모체는 WO 2011/051489로 공개된 PCT/EP2010/066572에 기재된 변이체 또는 WO 2011/124718로 공개된 PCT/EP2011/055577에 기재된 변이체 또는 유도체와 같은 천연 (야생형) 폴리펩티드 또는 그의 대립 유전자 또는 그의 변이체일 수 있다.
용어 "변이체 (variant)"는 하나 이상의 (여러) 위치에서 변경, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 모체 알부민으로부터 유래된 폴리펩티드를 의미한다. 치환은 위치를 점유하는 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체하는 것을 의미하고; 결실은 위치를 점유하는 아미노산을 제거하는 것을 의미하고; 삽입은 위치를 점유하는 아미노산에 인접한 1 내지 3개의 아미노산을 부가하는 것을 의미한다. 변경된 폴리펩티드 (변이체)는 모체 알부민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형에 의한 인간 개입을 통해 얻어질 수 있다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 특히 인간 알부민은 변이체, 또는 유도체, 예컨대 알부민 또는 알부민 변이체의 컨쥬게이션의 융합일 수 있다. 알부민은 HSA (서열 번호 2)와 적어도 70% 동일성, 더욱 바람직하게는 HSA와 적어도 72, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% 동일성을 갖는 것이 바람직하다. 알부민 변이체는 서열 목록, 특히 서열 번호 2에 제공된 것과 같은 모체 알부민과 비교하여 하나 이상의 (여러) 점 돌연변이, 예를 들어 K573P, K573Y, K573W, K500A를 가질 수 있다 (돌연변이는 서열 번호 2와 관련하여 기재되고, 당업자는 본원에 기재된 엠보스(EMBOSS) 소프트웨어를 사용하여 서열 번호 2에 대하여 알부민 서열을 정렬시킴으로써 다른 알부민에서 동등한 돌연변이를 확인할 수 있음). 서열 번호 2와 약 70 내지 80% 동일성을 갖는 알부민 (예컨대, 마우스 알부민, 예를 들어 서열 번호 19)의 경우, 양이온은 적어도 250mM로부터 존재하는 것이 더욱 바람직하다.
변이체 알부민은 서열 번호 2와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하고, 모체 알부민의 주요 특성 또는 HSA와 유사한 3차 구조 중 적어도 하나를 유지한다.
본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은, 엠보스 패키지 (엠보스 (EMBOSS): European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이후의 니들(Needle) 프로그램에서 실행되는 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘을 사용하여 결정된다 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453). 사용된 파라미터는 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 패널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 엠보스 버전) 치환 매트릭스이다. 니즐 표지된 "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻음)의 출력이 백분율 동일성으로서 사용되고, 이는 하기와 같이 계산된다: (동일 잔기 x 100)/(정렬 길이-정렬에서의 총 갭 수).
변이체는, 모체 알부민과 비교할 때, FcRn에 대한 변경된 결합 친화도 및/또는 내피세포, 상피세포 및/또는 중피세포 단일 세포-층을 가로지르는 통과세포외배출(transcytosis)의 변경된 속도를 가질 수 있다. 변이체 폴리펩티드 서열은 바람직하게는 자연에서 발견되지 않는 것이다. 변이체는, 예를 들어 알부민의 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 450, 500, 550개 연속 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어지는 단편을 포함한다.
용어 "야생형" (WT) 알부민은 동물 또는 인간에서 자연적으로 발견되는 알부민과 동일한 아미노산 서열을 갖는 알부민을 의미한다. 서열 번호 2는 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터의 야생형 알부민의 예이다.
하나의 구현예에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 재조합 효모-유래 혈청 알부민을 포함한다:
(1) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(2) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
적합한 콘카나발린 A 분석은, 예를 들어, WO 2000/044772에 기재되어 있으며, 이것의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체일 수 있다. 최대 0.5%, 바람직하게는 0.2%의 삼량체가 허용되지만, 보다 큰 형태의 알부민은 일반적으로 존재하지 않는다.
특정 바람직한 구현예에서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는:
i. 하기 특히 바람직한 제1 구현예에 기재된 바와 같은, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 프라임 (이전에는 리콤부민®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제;
ii. 하기 특히 바람직한 제2 구현예에 기재된 바와 같은, 알부메딕스 리미티드사에서 시판 중인 리콤부민® 알파 (이전에는 알부쿨트®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제; 또는
iii. 가장 바람직하게는, 하기 특히 바람직한 제2 구현예에 기재된 바와 같은, 알부메딕스 리미티드사에서 시판 중인 AlbIX® 산물, 또는 이것과 유사한 제제;일 수 있다.
따라서, 특히 바람직한 제1 구현예에서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 하기 특성 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있는 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 프라임 (이전에는 리콤부민®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제이다:
i. 이는 알부민 1g을 기준으로 하여, 100ng 미만의 니켈 이온 수준을 가질 수 있음;
ii. 이는 아마도리(Amadori) 산물 분석에 의해 측정시 0.6 몰 미만, 바람직하게는 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당/단백질(몰)의 당화 수준을 가질 수 있음;
iii. 이는 온전한, 즉 동종 C-말단을 가질 수 있음;
iv. 이는 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 conA-결합 알부민의 함량을 가질 수 있음;
v. 이는 적어도 0.85 몰 SH/단백질(몰)의 유리 티올 함량을 가질 수 있음;
vi. C18 또는 C20 지방산을 실질적으로 함유하지 않을 수 있음; 및/또는
vii. 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 중의 단백질의 적어도 99 중량%, 바람직하게는 적어도 99.9 중량%가 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질일 수 있음.
추가적으로 또는 대안적으로, 특히 바람직한 제1 구현예에 따르면, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 프라임 (이전에는 리콤부민®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제이고, 하기 성분을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어질 수 있다:
i. "활성" 성분으로서의 효모-유래 재조합 인간 알부민. 예를 들어, 효모-유래 효모-유래 재조합 인간 알부민은 약 10 내지 400g/ℓ, 예컨대 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200g/ℓ의 농도로 제제 중에 존재할 수 있음.
ii. 장성 조정을 위한 나트륨 (예를 들어, NaCl 형태로 첨가됨). 나트륨은, 예를 들어, 약 145mM,±100mM, 80mM, 60mM, 40mM, 20mM, 10mM, 또는 5mM의 농도로 존재할 수 있음.
iii. 안정화제로서의 옥타노에이트. 옥타노에이트는, 예를 들어, 효모-유래 재조합 인간 알부민 농도 10g/ℓ 당 약 1.6mM, 예를 들어 200g/ℓ 제제의 경우 약 32mM의 농도로 존재할 수 있음. 이와 관련하여, 용어 "약"은 명시된 값의 ±1.0, 0.8, 0.6, 0.4 또는 0.2mM을 의미하는 것으로 의도됨.
iv. 예를 들어 재조합 인간 알부민 농도 200g/ℓ에 대해 약 15mg/ℓ 농도, 또는 다른 농도의 재조합 인간 알부민에 비례하여 조정된, 안정화제로서의 폴리소르베이트 80. 이와 관련하여, 용어 "약"은 재조합 인간 알부민 농도 10g/ℓ 당 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10mg/ℓ 폴리소르베이트 80이 첨가됨을 의미하는 것으로 의도됨.
v. 희석제/비히클로서의 물.
추가적으로 또는 대안적으로, 제1 바람직한 구현예에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 프라임 (이전에는 리콤부민®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제이고, 하기 특징 중 하나 이상 (예컨대, 모두)을 특징으로 할 수 있다:
(i) 이론적 질량±20 Da (66418 내지 66458)를 나타내는 재조합 인간 알부민의 질량 분석;
(ii) 예를 들어 LAL 분석에 의해 측정시, 0.50 EU/㎖ 이하 (바람직하게는, 미만)의 내독소 함량;
(iii) USP <71> 시험의 요구 사항을 충족시키는 멸균성.
(iv) 예를 들어 표준 품질 관리 방법에 의해 측정시, 6.7 내지 7.3의 pH;
(v) 예를 들어 자연적 PAGE에 의해 측정시, 적어도 99.0% (w/w) (바람직하게는, 99.0% (w/w) 초과)의 단백질 순도;
(vi) 예를 들어 GP HPLC에 의해 측정시, 1.0% (w/w) 이하 (바람직하게는, 미만)의 알부민 중합체 함량;
(vii) 단백질 19.0 내지 21.0% 켈달(Kjeldahl);
(viii) 예를 들어 원자 흡광 분광법 (atomic absorption spectroscopy)에 의해 측정시, 130 내지 160mM의 나트륨 함량;
(ix) 예를 들어 육안 검사에 의해 측정시, 가시적인 오염을 실질적으로 갖지 않는 약간 점성의 투명한 담황색 내지 호박색의 용액을 함유하는, 결함이 없는 동결보존 및/또는 저장 배지에 첨가하기 전의 유리 바이알에서의 외관;
(x) 예를 들어 ELISA에 의해 측정시, 0.15㎍/g 이하 (바람직하게는, 미만)의 알부민 단백질의 숙주 세포 단백질 함량;
(xi) 예를 들어 Con A 크로마토그래피에 의해 측정시, 0.30% (w/w) 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 Con A-결합 종;
(xii) 원자 흡수 분광법에 의해 측정시, 0.5㎍/g 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 니켈 함량;
(xiii) 화염 원자 흡수 분광법에 의해 측정시, 0.01mMol/g 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 칼륨 함량;
(xiv) 델타 블루 매트릭스 (DBA, WO 96/37515에 기재됨) 침출물: 예를 들어 각각 RP-HPLC에 의해 측정시, 0.1㎍/g 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 염료 단편 (DAAS), 0.1㎍/g 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 염료 베이스, 및 0.4㎍/g 이하 (바람직하게는, 미만)의 염료 + 스페이서;
(xv) 0.18㎍/g 이하 (바람직하게는, 미만)의 아미노페닐보로네이트 (PBA) 침출물 (RP-HPLC); (xvi) 예를 들어 기체 크로마토그래피로 측정시, 약 28.8mM 내지 약 35.2mM 범위의 옥타노에이트 함량; 및/또는
(xvi) 예를 들어 SEC-HPLC에 의해 측정시, 약 10mg/ℓ 내지 약 20mg/ℓ 범위의 폴리소르베이트 80 함량.
특히 바람직한 제2 구현예에 따르면, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 알파 (이전에는 알부쿨트®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제이고, 하기 성분을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어질 수 있다:
i. "활성" 성분으로서의 효모-유래 재조합 인간 알부민. 예를 들어, 효모-유래 효모-유래 재조합 인간 알부민은 약 10 내지 400g/ℓ, 예컨대 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200g/ℓ의 농도로 제제 중에 존재할 수 있음.
ii. 장성 조정을 위한 나트륨 (예를 들어, NaCl 형태로 첨가됨). 나트륨은, 예를 들어, 약 145mM,±100mM, 80mM, 60mM, 40mM, 20mM, 10mM, 또는 5mM의 농도로 존재할 수 있음.
iii. 안정화제로서의 옥타노에이트. 옥타노에이트는, 예를 들어, 효모-유래 재조합 인간 알부민 농도 10g/ℓ 당 약 0.8mM, 예를 들어 100g/ℓ 제제의 경우 약 8mM, 및 200g/ℓ 제제의 경우 약 16mM의 농도로 존재할 수 있음. 이와 관련하여, 용어 "약"은 명시된 값의 ±0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1mM을 의미하는 것으로 의도됨.
iv. 예를 들어 재조합 인간 알부민 농도 100g/ℓ에 대해 약 50mg/ℓ 농도의, 또는 다른 농도의 재조합 인간 알부민에 비례하여 조정된, 안정화제로서의 폴리소르베이트 80. 이와 관련하여, 용어 "약"은 재조합 인간 알부민 농도 10g/ℓ 당 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10mg/ℓ 폴리소르베이트 80이 첨가됨을 의미하는 것으로 의도됨.
v. 희석제/비히클로서의 물.
추가적으로 또는 대안적으로, 제2 바람직한 구현예에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 알파 (이전에는 알부쿨트®) 산물, 또는 이것과 유사한 제제이고, 하기 특징 중 하나 이상 (예컨대, 모두)을 특징으로 할 수 있다:
(i) 이론적 질량±20 Da (66418 내지 66458)를 나타내는 재조합 인간 알부민의 질량 분석;
(ii) 예를 들어 LAL 분석에 의해 측정시, 0.50 EU/㎖ 이하 (바람직하게는, 미만)의 내독소 함량;
(iii) USP <71> 시험의 요건을 충족시키는 멸균성.
(iv) 예를 들어 표준 품질 관리 방법에 의해 측정시, 6.4 내지 7.4의 pH;
(v) 예를 들어 자연적 PAGE에 의해 측정시, 적어도 99.0% (w/w) (바람직하게는, 99.0% (w/w) 초과)의 단백질 순도;
(vi) 예를 들어 GP HPLC에 의해 측정시, 1.0% (w/w) 이하 (바람직하게는, 미만)의 알부민 중합체 함량;
(vii) 예를 들어 원자 흡광 분광법에 의해 측정시, 120 내지 160mM의 나트륨 함량;
(viii) 예를 들어 육안 검사에 의해 측정시, 가시적인 오염을 실질적으로 갖지 않는 약간 점성의 투명한 담황색 내지 호박색의 용액을 함유하는, 결함이 없는 동결보존 및/또는 저장 배지에 첨가하기 전의 유리 바이알에서의 외관;
(ix) ELISA에 의해 측정시, 알부민 1 그램 당 약 200ng 또는 150ng 숙주 세포 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 숙주 세포 단백질 함량 (예를 들어, YA53M 약 15 ng 이하/g 알부민 및/또는 YA53H 약 150ng 이하/g 알부민); 및/또는
(x) 예를 들어 Con A 크로마토그래피에 의해 측정시, 0.30% (w/w) 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 Con A-결합 종.
제3 구현예에 따르면, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 약 5.0 내지 약 9.0의 pH를 가지며, 30mM 이하의 옥타노에이트를 포함하는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 용매, 적어도 175mM 양이온을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어질 수 있는, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 AlbIX® 산물, 또는 이것과 유사한 제제이다.
제3 구현예의 제제는 양이온의 균형을 맞추기 위한 음이온을 함유하는 것이 바람직하다.
제3 구현예의 제제에서 용매는 무기 용매, 예컨대 물 또는 무기 완충제, 예컨대 포스페이트 완충제, 예컨대 인산나트륨, 인산칼륨, 또는 유기 완충제, 예컨대 아세트산나트륨 또는 시트르산나트륨일 수 있다. 완충제는 pH를 안정화시킬 수 있다. 인산나트륨 (예를 들어, NaH2PO4)은 pH 5.0, 5.5. 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0과 같은 바람직한 pH 완충제이다.
제3 구현예의 제조는 낮은 수준의 옥타노에이트를 포함한다. 예를 들어, 제제가 30mM 미만의 옥타노에이트, 더욱 바람직하게는 약 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 15, 14, 12, 10, 8mM 미만의 옥타노에이트, 더욱 더 바람직하게는 약 6, 5, 4, 3mM 미만의 옥타노에이트, 가장 바람직하게는 약 2, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.01 또는 0.001mM 미만의 옥타노에이트를 포함하는 것이 바람직하다. 제제는 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 제제는 옥타노에이트를 갖지 않는다 (0mM 옥타노에이트).
제3 구현예의 제조에서 지방산에 대한 바람직한 파라미터를 하기에 제공한다. 지방산 함량은 바람직하게는 다중 샘플, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5개 샘플의 평균이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
또한, 제3 구현예의 제제의 전체 지방산 함량이 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM 이하, 더욱 바람직하게는 또는 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1mM 이하인 것이 바람직하다. 조성물이 지방산을 실질적으로 갖지 않는 것이 더욱 바람직하고, 더욱 바람직하게는 지방산을 전혀 갖지 않는다.
100g·L-1 알부민, ≤1mM 옥타노에이트, 250mM Na+를 포함하고, 약 6.5의 pH를 갖는 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제의 지방산 프로파일 및 금속 이온 프로파일이, 각각 도 9 및 10에 제공된다. 이들은 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제의 특히 바람직한 프로파일이다. 알부민 제제는 도 9 및 도 10의 프로파일 중 하나, 또는 둘 다를 따를 수 있다.
양이온이 적어도 약 175mM, 예를 들어 적어도 약 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000mM로 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제 중에 존재하는 것이 바람직하다. 바람직한 최대 양이온 농도는 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275 및 250mM이다. 바람직한 양이온 농도는 200 내지 500mM을 포함한다. 약 200 내지 350mM의 양이온 농도가 더욱 바람직하다. 약 250mM의 양이온 농도가 가장 바람직하다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제의 pH는, 약 5.0 내지 약 9.0, 예를 들어 약 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25, 또는 8.5 내지 약 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25, 8.5, 8.75 또는 9.0이다. pH가 약 5.0 내지 8.0, 예컨대 약 6.0 내지 약 8.0인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.0 또는 6.0 내지 6.5이다. 가장 바람직한 pH는 약 6.5이다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제의 양이온은, 임의의 양이온에 의해 제공될 수 있으며, 하기에 기재된 바와 같이 하나 이상의 (여러) 부류 또는 종에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 양이온은 1가 또는 2가, 1원자 또는 다원자일 수 있고, 하나 이상의 (여러) 알칼리 금속 (예컨대, 나트륨, 칼륨), 알칼리 토금속 (예컨대, 칼슘, 마그네슘) 또는 암모늄에 의해 제공될 수 있다. 양이온이 나트륨 및/또는 칼륨 및/또는 마그네슘, 가장 바람직하게는 나트륨 또는 마그네슘에 의해 제공되는 것이 바람직하다.
양이온은 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제에 무기 산의 염 (예를 들어, 1 또는 2족 금속 또는 암모늄 염, 예컨대 염화나트륨), 2가 산의 염 (예를 들어, 1 또는 2족 금속 또는 암모늄 술페이트 또는 포스페이트, 예를 들어 황산나트륨) 또는 유기산의 염 (예를 들어, 1 또는 2족 금속 또는 아세테이트 또는 시트레이트의 암모늄 염, 예컨대 아세트산나트륨)에 의해 제공될 수 있다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제에서 알부민을 안정화시키는데 사용되는 양이온 및 음이온은, 본원에 기재된 바와 같은 (i) 염 및/또는 (ii) pH 완충제에 의해 제공될 수 있다. 따라서, 1종 초과 (여러 종)의 양이온 또는 음이온, 예컨대 2 또는 3종이 존재할 수 있다. 단일 양이온의 하나 초과의 (여러) 공급원이 존재할 수 있고, 예를 들어 Na가 pH 완충제 (예컨대, 인산나트륨) 및 염 (예컨대, NaCl) 둘 다에 의해 제공될 수 있다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제에 유용한 음이온은 포스페이트와 같은 무기 음이온 및 클로라이드과 같은 할라이드 및 아세테이트 및 시트레이트와 같은 유기 음이온을 포함한다. 음이온은 1가 또는 2가의 1원자 또는 다원자일 수 있다. 바람직한 음이온은 술페이트, 아세테이트 포스페이트 및 클로라이드, 특히 클로라이드, 술페이트 및 아세테이트를 포함한다.
따라서, 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는 알칼리 금속 포스페이트 또는 클로라이드 (예컨대, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화나트륨 또는 염화칼슘), 알칼리 토금속 포스페이트 (예컨대, 인산칼슘, 인산마그네슘, 염화칼슘, 염화마그네슘) 또는 인산암모늄 또는 염화암모늄 중 하나 이상 (여럿)을 포함할 수 있다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는 적어도 175mMol·L-1의 전체 이온 강도를 가질 수 있다. 예를 들어, 약 175 내지 1,000mMol·L-1, 예컨대 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000mMol·L-1 내지 약 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250mMol·L-1이다. 약 200 내지 350mMol·L-1의 전체 이온 강도가 더욱 바람직하다. 약 250mMol·L-1의 이온 강도가 가장 바람직하다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는, 20mg·L-1 미만의 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), 바람직하게는 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.01, 0.001mg. 미만의 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 더 바람직하게는, 제제는 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않는다. 가장 바람직하게는 제제는 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않는다. 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 수준은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 WO 2004/099234 (본원에 참고로 포함됨)에 개시된 분석 (이에 한정되지 않음)에 의해 분석될 수 있다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는, 낮은 수준의 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판)을 가지며, 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판)을 실질적으로 갖지 않거나, 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판)을 전혀 갖지 않는 알부민 조성물일 수 있다. 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제가 5mM 미만의 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판), 바람직하게는 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.01, 0.005, 0.001mM 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판)을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판)을 실질적으로 갖지 않는다. 가장 바람직하게는, 제제는 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판)을 전혀 갖지 않는다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는, 옥타노에이트, 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판) 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는 것이 더욱 더 바람직하다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제의 안정성이 물 또는 150mM Na 중의 동등한 알부민의 안정성보다 높은 것이 바람직하다. 특히 알부민의 불용성 응집체 형성과 관련하여 안정성을 비교하는 하나의 방법은 하기와 같다:
i) 분액 (예를 들어, 1㎖)을 큐벳 (예를 들어, 사르스테트(Sarstedt) 10×4×45mM와 같은 폴리스티렌 큐벳)에 넣음;
ⅱ) 큐벳을 원하는 온도, 예를 들어 65℃로 미리 평형화 및 제어된 온도 제어 분광광도계에 넣음;
iii) 원하는 간격으로 (예를 들어, 18초마다) 판독함으로써 원하는 기간 (예를 들어, 2시간)에 걸쳐 빈 큐벳을 기준으로 하여, 350nm에서의 조성물의 흡광도를 모니터링/측정함;
iv) 첫번째 여러 (예를 들어, 7개) 데이터 포인트를 취하여 데이터 포인트 판독치의 평균을 구하고 모든 데이터 포인트에서 이 데이터 포인트를 빼서 약 0의 베이스 흡광도 값을 제공함으로써 데이터를 처리함;
v) 처리된 흡광도 값이 기준선보다 0.1 AU (흡광도 단위)만큼 증가하는 데 걸리는 시간을 측정 및/또는 기록함.
안정성 분석은 이중으로 수행되는 것이 바람직하다.
제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제의 안정성이, (65℃에서 수행된 상기에 기재된 시험에 따라) 측정된 흡광도가 기준선보다 0.1 AU만큼 증가하는 데 걸리는 시간이, 동일한 조건 하에 측정된 150mM Na 또는 물과 같은 용매 중의 동일한 농도의 알부민의 대조군 용액에 비해, 적어도 10% 더 우수하도록 충분히 높은 것이 바람직하다. 안정성이 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 더 우수한 것이 더욱 바람직하다.
특히 알부민의 가용성 응집체 형성을 위한 대안적 또는 추가적 안정성 시험은, 셋팅된 온도에서 GP-HPLC에 의해 가용성 알부민 중합체의 형성을 모니터링하는 것이다. GP HPLC에 의한 측정에 의한 하나의 적합한 안정성 연구는 하기의 것을 포함한다:
i) 조사할 각 샘플 10㎖를 멸균 상태로 (예를 들어, 멸균 0.22㎛ 필터를 통한 여과로) 멸균 바이알 (예를 들어, 베이킹된 10㎖ 유리 바이알)에 넣고, 이어서 마개로 막음 (예를 들어, 멸균 부틸 고무 시일로, 또한 선택적으로 오버-시일링함).
ⅱ) ~200㎕의 T0 샘플을 취하고, 이어서 바이알을 특정 온도에서 인큐베이션함 (예를 들어, 특정 온도로 (예를 들어, 40℃로) 세팅된 수조에 넣음).
iii) 이어서, 샘플 (~ 200㎕)을 특정 시점 (예를 들어, 14일) 후에 각 바이알로부터 취함.
iv) 바이알로부터 취한 알부민 샘플의 분액 (예를 들어, 25㎕) (예를 들어, 50mg/㎖)을 GP-HPLC 컬럼 (예를 들어, 7.8mM id×300mM 길이 TSK G3000SWXL 컬럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)), 6.0mM id×40mM 길이, TSK SW 가드 컬럼 (토소 바이오사이언스)) 상으로 주입함;
v) 분액을 적합한 완충제 (예를 들어, 25mM, 인산나트륨, 100mM, 황산나트륨, 0.05% (w/v) 나트륨 아지드, pH 7.0) 중에서 적합한 속도 (예를 들어, 1㎖/분)로 크로마토그래피함;
vi) 크로마토그래프 절차를, 예를 들어 280nm에서의 UV 검출에 의해 모니터링함;
vii) 전체 피크 면적에 대한 각각의 피크 면적을 확인함으로써 분액의 단량체, 이량체, 삼량체 및 중합체 함량 중 하나 이상 (여럿) 또는 모두를 % (w/w)로 정량화함.
시험이 삼중으로 수행되는 것이 바람직하다.
따라서, 제3 구현예의 효모-유래 재조합 알부민 제제는 바람직하게는 상기 언급된 시험 중 하나 또는 둘 다에서 정의된 바와 같은 안정성을 갖는다.
제3 구현예의 바람직한 효모-유래 재조합 알부민 제제는 50 내지 250g·L-1 효모-유래 재조합 알부민 단백질, 200 내지 300mM Na+ (예를 들어, 225 내지 275mM Na+), 20 내지 30mM 포스페이트를 포함하고, 2mM 미만의 옥타노에이트를 포함하고, 약 6.0 내지 7.0의 pH (예를 들어, 약 pH 6.5)를 갖는다. 특히 바람직한 제제는 50 내지 150g·L-1 효모-유래 재조합 알부민 단백질, 225 내지 275mM의 Na+, 20 내지 30mM의 포스페이트를 포함하고, 1mM 미만의 옥타노에이트를 포함하고, 약 6.5의 pH를 갖는다.
특히 바람직한 제3 측면에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 하기 성분을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어질 수 있는 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 AlbIX® 산물, 또는 이것과 유사한 제제이다:
i. "활성" 성분으로서의 효모-유래 재조합 인간 알부민. 예를 들어, 효모-유래 효모-유래 재조합 인간 알부민은 약 10 내지 400g/ℓ, 예컨대 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200g/ℓ의 농도로 제제 중에 존재할 수 있음.
ii. 등장성 조정을 위한 나트륨 (예를 들어, NaCl 형태로 첨가됨). 나트륨은, 예를 들어, 약 150mM, 보다 전형적으로는 약 200 내지 약 300mM의 농도로 존재할 수 있음.
iii. 희석제/비히클로서의 물 또는 완충제.
iv. 옥타노에이트, 아미노산 (예를 들어, N-아세틸 트립토판) 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않음.
추가로 또는 대안적으로, 바람직한 제3 구현예에 따라, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 (가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에에서 재조합 DNA 발현에 의해 유래됨)는, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 AlbIX® 산물, 또는 이것과 유사한 제제이고, 하기 특징 중 하나 이상 (예컨대, 모두)을 특징으로 할 수 있다:
(i) 예를 들어 자연적 PAGE에 의해 측정시, 적어도 99.0% (w/w) (바람직하게는, 99.0% (w/w) 초과)의 단백질 순도;
(ii) 예를 들어 USP <85> 시험에 의해 측정시, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 대하여 0.50 EU/㎖ 이하 (바람직하게는, 미만), 더욱 바람직하게는 0.01 EU/mg 이하 (바람직하게는, 미만)의 내독소 함량;
(iii) 예를 들어 USP <791> 시험에 의해 측정시 6.0 내지 7.0의 pH;
(iv) 예를 들어 원자 흡광 분광법에 의해 측정시, 200 내지 300mM의 나트륨 함량;
(v) 예를 들어 육안 검사에 의해 측정시, 투명한 엷은 담황색 내지 호박색인 외관;
(vi) 예를 들어 Con A 크로마토그래피에 의해 측정시, 0.30% (w/w) 단백질 이하 (바람직하게는, 미만)의 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 Con A-결합 종.
의심의 여지를 피하기 위해, 본원에서 사용되는 용어 '재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제'는 특히 혈장-유도된 알부민 산물을 배제한다. 또한, 식물에서의 재조합 발현에 의한 것과 같은 비-효모 공급원으로부터 유래된 재조합 알부민 산물을 특정적으로 배제한다.
역사적으로, 혈청 알부민 제제의 제조를 위한 인간 알부민 공급의 전형적인 방법은, 인간 혈액으로부터 이를 정제하여 혈장-유래 혈청 알부민 제제를 제조하는 것이었다. 혈장에서 얻은 인간 알부민은 미국에서 미국 연방규정집 (CFR) 타이틀 21(Food And Drugs, Chapter I--Food And Drug Administration Department Of Health And Human Services, Subchapter F Biologics, Part 640 Additional Standards For Human Blood And Blood Products, Subpart H Albumin (Human), Sections 640.80 내지 86)에서 관리된다. 이 표준은 거의 요구 사항이 없지만, 예를 들어, 하기를 명시한다: (i) 제제는, 안정화제로서 존재하는, 단백질 1 그램 당 0.08±0.016 밀리몰 나트륨 카프릴레이트 (즉, 나트륨 옥타네이트), 또는 0.08±0.016 밀리몰 나트륨 아세틸트립토파네이트 및 0.08±0.016 밀리몰 나트륨 카프릴레이트를 함유하여야 함; (ii) 제제는 60±0.5℃의 도달 온도에서 10시간 이상, 또는 11시간 초과 동안 연속적으로 가열함으로써 열 처리되어야 함; (ⅲ) 단백질 조성물은 최종 산물에서 총 단백질의 적어도 96% 알부민이어야 함; (ⅳ) 0.15 몰 염화나트륨으로 1% 단백질의 농도로 희석된 최종 산물의 용액 중에서 측정시, pH가 6.9±0.5여야 함; (v) 최종 산물의 나트륨 농도는 1 리터 당 130 내지 160 밀리당량이어야 함; (ⅵ) 최종 산물의 칼륨 농도는 1 리터 당 2 밀리당량을 초과하지 않아야 함; (vii) 이는 57℃에서 50시간 동안 가열 후 육안 검사에 의해 측정시, 이 가열을 행하지 않은 동일 로트로부터의 샘플로 이루어진 대조군과 비교할 때, 최종 용기 샘플이 변하지 않고 남아 있는 경우에 나타나는 바와 같은, 열 안정성을 나타내어야 함.
US 약전 (USP)은, 상기에서 언급한 CFR 항목을 그의 요구 사항의 기초로서 언급하며, 건강한 인간 공여자로부터의 물질 (공급원 혈액, 혈장, 혈청 또는 태반)을 분별분리하여 얻은 혈청 알부민의 멸균, 비-발열성 제제로서의 산물을 나타내며, 여기서 공급원 물질은 B형 간염의 부재에 대해 시험된다. 이는 안정화제로서 나트륨 카프릴레이트를 함유하거나 함유하지 않는 나트륨 아세틸트립토파네이트를 함유하고, 나트륨 함량은 130 mEq/L 이상 160 mEq/L 이하인 것으로 언급되어 있다. 이는, 403nm의 파장에서 측정시, 1cm 보유 셀에서, 1%의 단백질을 함유하도록 희석된 용액의 흡광도가 0.25 이하가 되도록 하는 헴 함량을 갖는 것으로 언급되어 있다.
유럽 약전 (EP) 모노그래프 0255에는, "Plasma for fractionation, human (0853)" 상의 모노그래프의 요구 사항을 따르는 혈장으로부터 얻은 단백질의 수용액으로서의 인간 알부민 용액이 기재되어 있다. 이는 나트륨 카프릴레이트 (나트륨 옥타노에이트) 또는 N-아세틸트립토판 또는 이들 둘의 조합과 같은 열 효과에 대해 적합한 안정화제를 함유하는 것으로 명시되어 있다. 이는 제제를 박테리아-체류 필터로 통과시키고 멸균적으로 멸균 용기에 분배하고, 이어서 오염을 방지하기 위해 폐쇄시키고; 여기서 그 후에 최종 용기 내의 용액을 60±1.0℃로 가열하고, 이온도에서 10시간 이상 동안 유지하는 것을 포함하는 방법에 의해 제제가 제조된다고 명시한다. 이어서, 용기를 30 내지 32℃에서 14일 이상 또는 20 내지 25℃에서 4주 이상 동안 인큐베이션시키고, 미생물 오염의 증거를 육안으로 검사한다.
모든 경우, 혈장-유래 혈청 알부민 제제가 소량의 다른 혈장 단백질 및 기타 오염물의 존재를 나타내는 것이 CFR, USP 및 EP에 의해 허용된다. 예를 들어, 혈장-유래 혈청 알부민 제제는 전형적으로 하기의 것을 함유한다:
· 단량체 인간 알부민과 구별되는 최대 4% 또는 5%의 공급원-유래 단백질.
· 0.15 이하 (하기 방법에 의해 측정됨)인 헴 함량,
· 최대 35 IU/㎖의 프리칼리크레인 활성제 함량,
· 1 리터 당 최대 200㎍까지의 Al의 알루미늄,
· 단백질 1 그램 당 최대 0.05mMol까지의 칼륨, 및
· 나트륨: 1 리터 당 최대 160mMol의 Na.
알부민 제제 중의 헴 함량은 하기 방법을 사용하여 시험할 수 있다. 검사할 제제를 9g/ℓ의 염화나트륨 용액 R을 사용하여 희석하여 10g/ℓ의 단백질을 함유하는 용액을 얻는다. 보정 액체로서 물 R을 사용하여 403nm에서의 용액의 흡광도를 측정한다.
알부민 제제 중의 알루미늄 함량은 하기 방법을 사용하여 시험할 수 있다. 원자 흡수 분광법: 원자 생성기로서 가열로를 사용한다. 용액 제제를 위해 플라스틱 용기를 사용한다. 사용 전에 질산 (200g/ℓ HNO3) 중에서 장비를 세척한다. 시험 용액: 시험할 제제를 사용한다. 검증 용액: 알루미늄 검증 BRP에 대해 인간 알부민을 사용한다. 기준 용액: 적합한 부피의 알루미늄 표준 용액 (10ppm Al) R을 알고있는 부피의 물 R에 첨가함으로써 적합한 범위의 기준 용액을 준비한다. 1.7g/ℓ의 질산마그네슘 R 및 0.05% v/v의 옥톡시놀 10 R을 함유하는 질산 (10g/ℓ HNO3)을 사용하여 필요에 따라 용액을 희석한다. 309.3nm에서의 흡광도를 측정한다. 알루미늄 검증 BRP에 대해 인간 알부민에 대해 측정된 알루미늄 함량이 기준 제제와 함께 제공되는 리플릿에 명시된 값의 20% 이내인 경우 시험이 유효하다.
알부민 제제 중의 칼륨 함량은 원자 방출 분광법 (파장: 766.5nm)을 사용하여 시험할 수 있다.
알부민 제제 중의 나트륨 함량은 원자 방출 분광법 (파장: 589nm)을 사용하여 시험할 수 있다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조 방법은 "무-혈청"이다. 즉, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 혈청 (예를 들어, 인간 혈청, 태아 소 혈청 (FBS), 말 혈청, 염소 혈청 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 동물-유래 혈청)을 함유하지 않는다. 따라서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 일반적으로 혈청-유래 오염물을 전혀 갖지 않을 것이다 (출발 물질 중에 존재하지 않기 때문).
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그 제조 방법은, 혈액, 혈장, 혈청 또는 태반과 같은 혈청 알부민의 천연 생물학적 공급원으로부터 혈청 알부민을 제조하는데 사용되는 공급원 물질로부터 특이적으로 유래된 성분을 갖지 않는다. 공급원 물질로부터 특이적으로 유래된 성분은 혈액, 혈장, 혈청 또는 태반과 같은 혈청 알부민의 천연 생물학적 공급원으로부터 유래된 헴, 프리칼리크레인 활성제 및/또는 다른 비-알부민 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 포함한다. 혈액, 혈장, 혈청 또는 태반과 같은 혈청 알부민의 천연 생물학적 공급원으로부터의 혈청 알부민의 제조는 또한 발열원 및/또는 내독소를 함유할 수 있다. 이들은 또한 질병을 일으킬 수 있는 바이러스 (C형 간염 포함)와 같은 감염성 작용제를 함유할 수 있다. 전형적으로, 특정 바이러스에 대한 사전 노출에 대한 혈장 공여자 스크리닝, 특정 현재의 바이러스 감염의 존재 시험, 및 특정 바이러스의 비-활성화 및/또는 제거 등에 의해 이러한 산물이 감염성 작용제를 전달할 위험이 감소하였으나, 이들 수단에도 불구하고, 이러한 산물은 여전히 잠재적으로 질병을 전달할 수 있다. 이러한 산물에는 알려지지 않은 감염성 작용제가 존재할 수도 있다.
반면, 예를 들어, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조는, 예를 들어 403 ㎚의 파장에서 측정되는, 1 cm 보유 셀에서 1%의 단백질을 함유하도록 희석된 용액의 흡광도에 의해 시험시, 혈장-유래 혈청 알부민 제제에서는 헴이 검출되는 것과 달리, 헴을 갖지 않을 수 있다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조 방법은, 혈장-유래 혈청 알부민 제제에서는 프리칼리크레인 활성제가 검출될 수 있는 것과 달리, 프리칼리크레인 활성제를 갖지 않을 수 있다.
혈장-유래 혈청 알부민 제제에서는 발열원이 검출될 수 있는 것과 달리, 본 발명에서 사용하기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조에서 발열원은 전형적으로 훨씬 더 낮은 수준이다.
혈장-유래 혈청 알부민 제제에서는 인간 바이러스 (C형 간염 포함)가 검출될 수 있는 것과 달리, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조 방법, 또한 그로부터 제조되고 본 발명에 따라 사용되는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지)는 인간 바이러스 (C형 간염 포함)를 갖지 않을 수 있다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조, 또한 그로부터 제조되고 본 발명에 따라 사용되는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지)는 낮은 수준의 옥타노에이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.04, 0.003, 0.002, 또는 0.001mM 미만의 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않는 것 (0mM 옥타노에이트)이 바람직할 수 있다. 반면, 혈장-유래 혈청 알부민 제제는 전형적으로 단백질 1g당 0.08±0.016 밀리몰 나트륨 카프릴레이트를 함유한다 (20% w/v 혈장-유래 혈청 알부민 제제의 경우, 이는 16mM±3.2mM의 나트륨 카프릴레이트 농도에 해당하고; 4% w/v 혈장-유래 혈청 알부민 제제의 경우, 이는 3.2mM±0.64mM의 나트륨 카프릴레이트 농도에 해당함).
재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그의 제조, 또한 그로부터 제조되고 본 발명에 따라 사용되는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지)는 낮은 수준의 N-아세틸 트립토판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.009, 0.008, 0.007, 0.006, 0.005, 0.04, 0.003, 0.002 또는 0.001mM 미만의 N-아세틸 트립토판을 포함하거나, N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않는 것 (0mM N-아세틸 트립토판)이 바람직할 수 있다. 반면, 혈장-유래 혈청 알부민 제제는 전형적으로 단백질 1g당 0.08±0.016 밀리몰 N-아세틸 트립토판을 함유한다 (20% w/v 혈장-유래 혈청 알부민 제제의 경우, 이는 16mM±3.2mM의 N-아세틸 트립토판 농도에 해당하고; 4% w/v 혈장-유래 혈청 알부민 제제의 경우, 이는 3.2mM±0.64mM의 N-아세틸 트립토판 농도에 해당함).
본 발명에 따라 사용하기 위한 효모-유래 재조합 알부민 제제, 및 그로부터 제조되고 본 발명에 따라 사용되는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지)가 옥타노에이트 및 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는 것이 더욱 더 바람직하다.
또한, 전형적으로, 본 발명에 따른 동결보존 배지 및/또는 저장 배지의 형성에 사용되는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 또한 그로부터 제조되고 본 발명에 따라 사용되는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지)는, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖는다.
따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 혈액, 혈장, 혈청 또는 태반과 같은 혈청 알부민의 천연 생물학적 공급원으로부터 얻어진 혈청 알부민 조성물과 물리적으로 구별된다.
본 발명에 사용하기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 또한 다른 공급원으로부터 (예를 들어, 식물에서의 재조합 발현에 의해) 얻어진 혈청 알부민 조성물과 물리적으로 구별된다. 적어도 부분적으로, 이는, 다른 공급원으로부터 얻은 혈청 알부민과 비교하여, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 알부민 단백질은 공급원에 의해 단백질에 부과된 변화 및 변경이 상대적으로 없기 때문이다.
예를 들어, 혈장-유래 혈청 알부민 제제 및 재조합 식물-유래 혈청 알부민 제제는 전형적으로 알부민 단백질로부터 1개 또는 보다 통상적으로 2개의 N-말단 아미노산을 잃는 것으로 알려져 있다. 이론에 구애되지 않지만, 이는 혈장-유래 혈청 알부민 제제 및 재조합 식물-유래 혈청 알부민 제제의 제조에 사용되는 제조 과정에서의 가열의 사용 때문인 것으로 여겨진다. 반면, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 전형적으로 온전한 N-말단 아미노산 서열을 갖는다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 및 그 제조는 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 1.5%의 정량 수준으로 온전한 질량 분광 분석을 사용하여 시험시 관찰가능한 N-말단 소실이 없으면, 단백질은 온전한 N-말단 서열을 갖는 것으로 정의될 수 있다.
또한, 실시예 5의 데이터는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 재조합 식물-유래 혈청 알부민 제제의 명확한 물리적 차이를 입증한다.
더욱 특히, 실시예 5에 나타난 바와 같이, 효모-유래 혈청 알부민 제제의 질량 분광 분석 프로파일링은 약 66.4 kDa의 단일 종을 나타내며, 이는 환원된 Cys34 잔기를 갖는, 자연적 온전한 인간 혈청 알부민 분자를 주로 포함하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 나타낸다. 본원의 도 1에 나타낸 바와 같이, 온전한 질량 분광 분석에 의해 시험된 모든 온전한 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 자연적 온전한 인간 혈청 알부민 분자를 나타내는 약 66.4 kDa에서 단일 주요 피크 및 매우 낮은 수준의 임의의 다른 피크를 나타내었다. 반면, 시험된 2개의 재조합 식물-유래 혈청 알부민 제제는 자연적 온전한 인간 혈청 알부민 분자를 나타내는 약 66.4 kDa에서의 주요 피크와는 구별되는 다수의 피크를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, (도 1에 나타낸 샘플과 같은, 재조합 식물-유래 혈청 알부민 단백질과 비교하여) 자연적 온전한 인간 혈청 알부민 분자를 나타내는 약 66.4 kDa에서의 주요 피크와는 구별되는 피크가 실질적으로 거의 나타내지 않는다(예컨대, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 그 미만).
또한, 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 상이한 재조합 혈청 알부민 산물은 상이한 수준의 착색을 나타낸다. 도 3에 나타낸 이미지는, 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파가 평가된 산물 중에서 가장 덜 착색되었으며, 두 산물 모두 투명/담황색을 가짐을 입증한다. 대안적 산물은, 최대 착색을 나타내는 공급원 1로부터의 알부민 (쌀-유래 산물)에서 착색 수준이 증가함을 나타내었으며, 최종 산물은 오렌지/호박색을 가졌다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제는 오렌지/호박색으로 존재하기에 착색이 지나치게 적은 제제이고, 가장 바람직하게는 투명한 담황색 또는 담황색 내지 호박색이다.
또한, 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 효모-유래 재조합 알부민 제제는 식물-유래의 재조합 알부민 제제보다 현저히 높은 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함한다. 따라서, 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제가 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%인 유리 티올기 함량 (특히, Cys34에서)을 갖는 알부민 단백질을 포함한다. 실제로, 유리 티올기 함량은 약 85% 또는 약 97%일 수 있다. 이와 관련하여 용어 "약"은 선택적으로±3, 2 또는 1%를 포함하도록 의도된다.
또한, 문헌 [Frahm et al, 2014, PLOS One, 9 (1): e109893] (이것의 내용은 본원에 참고로 포함됨)은, 효모-유래 재조합 혈청 알부민의 특성을 혈장-유래 혈청 알부민 및 재조합 식물-유래 혈청 알부민 산물과 비교한 연구를 보고하였다. 구체적으로:
· 시험된 효모-유래 재조합 혈청 알부민 산물은, 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 리콤부민® 알파 (이전에는 알부쿨트®) 및 리콤부민® 프라임 (이전에는 리콤부민®) (둘 다 사카로마이세스 세레비시아에에서 발현됨) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 공급된 알바겐(Albagen) (피키아 파스토리스에서 발현됨)이었고, 이들은 프람(Frahm) 등에 의해 각각 "ScrHSA", "리콤부민®", 및 "PrPHSA"로서 언급되었음;
· 시험된 식물-유래의 재조합 혈청 알부민 산물은, 셀라스팀(Cellastim)으로부터의 오리쟈 사티바(Orzya sativa) (쌀)에서 발현되는 혈청 알부민의 4개의 상이한 로트 (프람 등에 의해 "OsrHSA-sig-C", "OsrHSA-sig-G", "Osr-sig-H" 및 "OsrHSA-sig-J"로서 언급됨); 및 에엔자임 엘엘씨(eEnzyme LLC) ("OrsHSA-phy"), 사이언셀 리서치 래보래토리즈(ScienCell Research Laboratories) ("OsrHSA-sci") 및 암스비오 엘엘씨(amsbio LLC) ("OsrHSA-ams")로부터의 3개의 추가의 상이한 쌀-유래 재조합 혈청 알부민 산물이었음;
· 혈장-유래 혈청 알부민 산물은 본질적으로 시그마-알드리치 사의 FA-불포함 알부민 ("pHSA")이었다.
프람 등은, 한편으로는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 산물과, 다른 한편으로는 혈장-유래 혈청 알부민 및 재조합 식물-유래 혈청 알부민 산물의 많은 차이점을 발견하였다.
예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 평가시, 프람 등은, 효모-유래 재조합 혈청 알부민 산물이 특징적인 단일 집중 피크를 생성함을 보여주었다. 결과는 하기와 같다:
표 S1: 문헌 [ Frahm et al , 2014, PLOS One , 9(1): e109893]으로부터 재현됨
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따라서, 모든 샘플은 약 17.3분 내지 17.4분에 용출되는 주요 피크를 나타내었지만, 효모-유래 재조합 혈청 알부민 산물만이 14분 미만의 피크 보유 시간을 갖는 고분자량 오염물에 해당하는 피크 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 저분자량 오염물에 해당하는 피크가 제외되는 SEC 피크를 나타내었다.
또한, 마이세스 세레비시아에로부터 유래된 알부메딕스 리미티드 사에서 시판 중인 효모-유래 재조합 혈청 알부민 산물 (즉, 프람 등에 의해 각각 "ScrHSA" 및 "리콤부민®"로서 언급됨)은, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타낸 (실제로, ScrHSA 산물은 피크 보유 시간이 15분 미만 및 18분 초과인 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타냄) 유일한 시험 산물이었다. 이들은 또한 90% 초과의 상대적인 양을 나타내는 주요 피크를 나타낸 유일한 시험 산물이다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제가, SEC에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 산물인 제제인 것이 바람직할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제가, SEC에 의해 시험시, 90% 초과, 예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3% 또는 적어도 약 99.4% 초과의 상대량을 나타내는 주요 피크를 나타내는 산물인 제제인 것이 바람직할 수 있다.
상기 정의에서, 이러한 측정을 위해 사용된 SEC 기술은 문헌 [Frahm et al, 2014, PLOS One, 9 (1): e109893] (이것의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)의 방법론인 것이 바람직할 수 있다. 구체적으로, 크기-배제 크로마토그래피 시스템은, 워터스(Waters) 2996 광 다이오드 어레이 검출기가 장착된 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) 2695 분리 모듈 (워터스 코포레이션(Waters Corporation), 미국 매사추세츠주 밀포드)일 수 있다. 기기 작동 및 데이터 수집 및 조작은 워터스 엠파워 2 크로마토그래피 매니저(Waters Empower 2 Chromatography Manager) (워터스 코포레이션)를 사용하여 수행할 수 있다. 내부 치수가 500×8.0mM인 와이엠씨-팩 디올(YMC-Pack Diol)-200 컬럼 (산물# DL20S05-5008WT, 와이엠씨 아메리카 인코포레이티드(YMC America, Inc.), 미국 펜실바니아주 알렌타운)을 0.8 ㎖/min의 유속으로 사용할 수 있다. 이동상은 0.1M 인산나트륨, 0.15M 염화나트륨 (pH 7.0)을 함유할 수 있으며, 피크는 214nm의 파장에서 검출될 수 있다.
프람 등은 추가로, RP-HPLC 분석이 혈장-유래 HSA (즉, "pHSA")가 2개의 주요 피크 1 및 2를 나타내는 불균질성이며, 이들 각각은 이전에 보다 소수성인 피크 2의 부분으로서 용출되는 자연적 HSA를 갖는 여러 성분으로 이루어진 것으로 나타났음을 보여주었다고 보고하였다. 효모-유래 제제 리콤부민® 알파 및 리콤부민® 프라임 (프람 등에 의해 각각 "ScrHSA" 및 "리콤부민®"으로서 언급됨) 및 PprHSA의 RP-HPLC분석은 주요 피크가 피크 2임을 보여주었으며, 이는 효모-유래 제제에서 대부분의 HSA는 자연적 형태로 존재하였음을 시사한다. 시그마-알드리치에서 공급된 OsrHSA의 RP-HPLC는 모든 로트의 주요 피크가 피크 1임을 보여주었으며, 이는 시그마-알드리치에서 공급된 식물-유래 OsrHSA가 변형된 형태로 존재하였음을 시사한다. 모든 다른 형태의 OsrHSA (OsrHSA-sci, -phy 및-ams) 또한 피크 1에 해당하는 피크를 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제는, RP-HPLC에 의해 시험시, pHSA의 피크 2에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 산물이며, 이는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제에서 혈청 알부민의 대부분이 자연적 형태로 존재함을 나타낸다.
상기 정의에서, 이러한 측정을 위해 사용된 SEC 기술은 문헌 [Frahm et al, 2014, PLOS One, 9 (1): e109893] (이것의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)의 방법론인 것이 바람직할 수 있다. 구체적으로, HPLC 시스템은, 워터스(Waters) 2996 UV-Vis 광 다이오드 어레이 검출기에 커플링된 샘플링 냉각 장치를 갖는 컬럼 가열기 및 오토샘플러가 장착된 워터스 얼라이언스 2695를 사용할 수 있다. 기기 작동 및 데이터 수집 및 조작은 예를 들어 워터스로부터의 엠파워 프로 소프트웨어(Empower Pro Software)를 사용하여 수행할 수 있다. 분리 조건은 문헌 [Girard et al., Biomed. Chromatogr., 12: 183-184] (이것의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같을 수 있다. 간단히 말해서, 컬럼은 아쿠아포어(Aquapore) RP-300, C8, 7㎛, 220×2.1mM, i.d. (브라운리(Brownlee))일 수 있고, 50℃에서 유지될 수 있다. 이동상 A (MP A)는 10% 아세토니트릴/90% 물 중의 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어질 수 있고; 이동상 B (MP B)는 90% 아세토니트릴/10% 물 중의 0.05% TFA일 수 있고; 이동상 C (MP C)는 아세토니트릴 중의 0.05% TFA일 수 있다. 안정성 기준선이 얻어질 때까지 컬럼을 MP A 및 MP B (70:30)의 혼합물로 평형화할 수 있다. 용출은, 1분 동안 (0.7㎖/분으로) MP A/MP B (70:30), 5분에 걸쳐 (0.7㎖/분으로) MP A/MP B (65:35)로의 선형 구배, 19분에 걸쳐 (0.7㎖/분으로) MP A/MP B (61:39)로의 선형 구배, 10분에 걸쳐 (0.7㎖/분으로) MP A/MP B (50:50)로의 선형 구배, 5분에 걸쳐 (1.0㎖/분으로) MP C로의 선형 구배, 12분 동안 MP C, 3분에 걸쳐 MP A/MP B (70:30)로의 선형 구배로 이루어진 다단계 구배를 사용하여 수행할 수 있다. 유출물을 220nm에서 모니터링할 수 있다.
프람 등은 또한, 리신/아르기닌 잔기의 차별 당화를 평가하기 위해 질량 분광 분석을 사용하였다. 결과는, 혈장 샘플 (pHSA) 및 모든 식물-유래 (OsrHSA) 재조합 혈청 알부민 제제에 비해, 모든 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제에서 보다 적은 수의 6탄당 변형 리신 또는 아르기닌 잔기를 나타내었다. 결과는 하기와 같다:
표 1: 문헌 [ Frahm et al , 2014, PLOS One , 9 (1): e109893]로부터 재현됨
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* 리더 서열 제외.
출원인은 추가로, 프람 등이 리콤부민® 프라임에서 변형된 8개의 6탄당을, 리콤부민® 알파에서 5개를 발견하였음에도 불구하고, 이들은 제제에서 완전한 분자 집단에 걸쳐 정의되며, 1개의 알부민 단백질 분자에서 모두 변형되지는 않을 것이라고 언급한다. 개별 리콤부민® 프라임 알부민 분자는 1 또는 2개, 아마도 심지어 3개, 그러나 8개 모두는 아닌 6탄당 변형된 K 및 R 잔기를 가질 가능성이 클 것이다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개 미만, 더욱 바람직하게는 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물이다. 상기 정의에서, 이러한 측정을 위해 사용된 질량 분광 분석 기술은 문헌 [Frahm et al, 2014, PLOS One, 9 (1): e109893] (이것의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)의 방법론인 것이 바람직할 수 있다.
특히, 프람 등은 혈장-유래 혈청 알부민 및 식물-유래 재조합 혈청 알부민에 비해, 효모-유래 재조합 혈청 알부민에서 하기 잔기가 거의 당화되지 않았음을 발견하였다 (그의 문헌의 표 S2): K51; K64; K73; K137; K159; K174; K181; K225; K233; K240; K262; K466; K525; K545; 및 K574.
반대로, 프람 등은 혈장-유래 혈청 알부민 및 식물-유래 재조합 혈청 알부민에 비해, 효모-유래 재조합 혈청 알부민에서 하기 잔기가 통상적으로 보다 많이 당화되었음을 발견하였다 (그의 문헌의 표 S2): R485; K500.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 효모-유래 재조합 혈청 알부민 제제가, 프람 등의 문헌에서 보고된 바와 같은, 리콤부민® 알파 또는 리콤부민® 프라임 (프람 등에 의해 각각 "ScrHSA" 및 "리콤부민®"로서 언급됨) 또는 PprHSA에서 관찰된 수준과 실질적으로 동일한, K51; K64; K73; K137; K159; K174; K181; K225; K233; K240; K262; K466; K525; K545; K574, R485; 및/또는 K500 중 어느 하나 또는 하나 이상 (예컨대, 모두)에서의 당화 수준을 나타내는 제제인 것이 바람직할 수 있다. 측정된 당화 수준은 다수의, 예컨대 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 초과의 샘플의 평균에 기초할 수 있다.
프람 등은, 혈장-유래 혈청 알부민 및 식물-유래의 재조합 혈청 알부민에 비해 효모 발현 시스템에서 발현된 재조합 혈청 알부민에는 명백한 차이가 있다고 결론지었다. 유리 아민기를 갖는 잔기가 당으로 변형된 느린 비-효소성 마이야르(Maillard) 반응을 통해 당화가 일어난다고 생각된다. 혈장-유래 HSA의 최대 10%는 건강한 개인에서는 당화되고 고혈당 개인에서는 최대 30% 당화된다고 여겨진다. 혈장-유래 알부민에서 리신 및 아르기닌 잔기의 6탄당 변형은 단백질의 긴 (26 내지 31일) 순환 수명에 걸쳐 발생하는 것으로 여겨지는 반면, 리신 및 아르기닌의 시험관내 당화는 상승된 온도 및 당 농도뿐만 아니라 며칠 또는 몇주의 기간을 필요로 하는 것으로 고려된다. 반면, 효모-발현 재조합 혈청 알부민은 전형적으로 발현 동안 분비되고, 이어서, 성장 배지 (약 2%의 포도당일 수 있음) 내의 당은 분비된 단백질의 당화에 적합한 환경을 제공할 수 있다. 그러나, 식물의 당화 메커니즘은 식물에 대한 명암 사이클 또는 가벼운 스트레스를 포함할 수 있으며, 고등 식물은 초기 당화 부가물을 복구하는 동물 효소의 상동체를 갖기 때문에 식물 단백질의 당화는 예상치 못한 일은 아니라고 제안되었다. 프람 등은, 이들의 실험에 사용된 OsrHSA가 총 중량 1g당 최대 19mg의 포도당을 함유하는 오. 사티바(O. sativa)의 내피에서 발현되었다고 언급하였고, 이 단당류의 존재가 식물의 성장 기간 (곡물 숙성의 경우 대략 30일)에 걸쳐 단백질의 당화를 허용할 수 있고, 식물의 성장 조건의 변동은 관찰된 로트간 변동성을 설명할 수 있다고 제안되었다. 추가로, 식물-유래 재조합 혈청 알부민 단백질은 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화될 수 있다고 언급되었다. 이는 식물-유래 재조합 혈청 알부민 단백질 및 혈장 또는 효모에서의 재조합 발현에 의한 것과 같은 다른 공급원으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 사이의 추가의 물리적 구별일 수 있다.
계면활성제: 계면활성제는, 전하에 따라, 4개의 그룹으로 분류될 수 있다 (음이온성 계면활성제, 양이온 계면활성제, 비-이온성 계면활성제 및 쯔비터이온성 계면활성제).
전형적인 음이온성 계면활성제는 알킬벤젠술포네이트를 포함한다. 이들 음이온의 알킬벤젠 부분은 친유성이며, 술포네이트는 친수성이다. 음이온성 계면활성제의 유형의 예는 분지형 나트륨 도데실벤젠술포네이트, 선형 나트륨 도데실벤젠술포네이트 및 비누를 포함한다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지, 저장 배지 및 다른 배지)는 0.01 미만, 바람직하게는 0.001 미만, 더욱 바람직하게는 0.0001% (w/v) 미만의 음이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
양이온성 계면활성제는 소수성 성분을 갖는 음이온성 계면활성제와 유사하지만, 음이온성 술포네이트기 대신에, 양이온성 계면활성제는 극성 모이어티로서 4차 암모늄 (즉, 양으로 하전된 기)을 갖는다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예를 들어, 동결보존 배지, 저장 배지 및 다른 배지)는 0.01 미만, 바람직하게는 0.001% 미만, 더욱 바람직하게는 0.0001 (w/v) 미만의 양이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
쯔비터이온성 계면활성제는 동일한 수의 +1 및 -1 대전된 화학기의 존재로부터 발생하는 순(net) 제로 전하를 갖는다. 쯔비터이온성 계면활성제의 일례는 CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트)이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 0.001% (w/v) 미만의 쯔비터이온성 계면활성제를 포함할 수 있고, 쯔비터이온성 계면활성제를 본질적으로 갖지 않을 수 있다.
비-이온성 계면활성제는 이들의 비-대전된 친수성 헤드그룹을 특징으로 한다. 전형적인 비-이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 또는 글리코시드를 기재로로 한다. 전자의 통상적 예는 폴리소르베이트 80 (예를 들어, 트윈 ®), 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (예를 들어, 트리톤(Triton)® X-100), 및 브리즈(Brij)® 시리즈를 포함한다. 이러한 물질은 또한 에톡실레이트 또는 페길레이트(PEGylate)로서 공지되어 있다. 글리코시드는 이들의 비-대전된 친수성 헤드그룹으로서 당을 갖는다. 예는 옥틸-티오글루코시드 및 말토시드를 포함한다. 히드록시에틸글루카미드 (HEGA) 및 메틸글루카미드 (MEGA) 시리즈 계면활성제는 유사하며, 헤드그룹으로서 당 알콜을 갖는다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 0.01 미만, 바람직하게는 0.001 미만, 더욱 바람직하게는 0.0001% (w/v) 미만의 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 0.01 미만, 바람직하게는 0.001% 미만, 더욱 바람직하게는 0.0001% (w/v) 미만의 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있고, 폴리소르베이트 80을 본질적으로 함유하지 않을 수 있다. 예를 들어, 조성물은 3.325×10-4% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 2.85×10-4% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 2.375×10-4% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 1.425×10-4% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 9×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 6.625×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 5.7×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 5×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 4.75×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 4.5×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 4.75×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 2.85×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 2.5×10-5 % (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 1.9×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 1.8×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 1×10-5% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 9.5×10-6% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 9×10-6% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20, 예컨대 5×10-6% (w/v) 이하의 폴리소르베이트 80 또는 20을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 20을 실질적으로 갖지 않을 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 0.01 미만, 바람직하게 0.001 미만, 더욱 바람직하게 0.0001% (w/v) 미만의 폴리소르베이트 20을 포함하고, 폴리소르베이트 20을 갖지 않을 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 0.01 미만, 바람직하게는 0.001 미만, 더욱 바람직하게는 0.0001% (w/v) 미만의 폴록사머를 포함할 수 있고, 폴록사머를 갖지 않을 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 0.001, 예컨대 0.002, 예컨대 0.003, 예컨대 0.004, 예컨대 0.005, 예컨대 0.006, 예컨대 0.007, 예컨대 0.008, 예컨대 0.009, 예컨대 0.01, 예컨대 0.02, 예컨대 0.03, 예컨대 0.04, 예컨대 0.05, 예컨대 0.06, 예컨대 0.07, 예컨대 0.08, 예컨대 0.09, 예컨대 0.1, 예컨대 0.2, 예컨대 0.3, 예컨대 0.4, 예컨대 0.5, 예컨대 0.6, 예컨대 0.7, 예컨대 0.8, 예컨대 0.9% (w/v)의 비-이온성 계면활성제 내지 0.002, 예컨대 0.003, 예컨대 0.004, 예컨대 0.005, 예컨대 0.006, 예컨대 0.007, 예컨대 0.008, 예컨대 0.009, 예컨대 0.01, 예컨대 0.02, 예컨대 0.03, 예컨대 0.04, 예컨대 0.05, 예컨대 0.06, 예컨대 0.07, 예컨대 0.08, 예컨대 0.09, 예컨대 0.1, 예컨대 0.2, 예컨대 0.3, 예컨대 0.4, 예컨대 0.5, 예컨대 0.6, 예컨대 0.7, 예컨대 0.8, 예컨대 0.9, 예컨대 1 % (w/v)의 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 및 폴록사머로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 최대 0.01, 바람직하게는 최대 0.001, 더욱 바람직하게는 최대 0.0001% (w/v)의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 및 폴록사머 (이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 계면활성제를 본질적으로 갖지 않을 수 있다.
지방산: 전형적으로 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 이하의 지방산을 포함할 수 있다. 지방산은 포화 또는 불포화 지방산과 같은 임의의 지방산 및 그의 염일 수 있다. 바람직하게는, 지방산은 프로판산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 노나데칸산, 에이코산산, 헤네이코산산, 도코산산, 트리코산산, 테트라코산산, 펜타코산산, 헥사코산산, 헵타코산산, 옥타코산산, 노나코산산, 트리아콘탄산, 헤나트리아콘탄산, 도트리아콘탄산, 트리트리아콘탄산, 테트라트리아콘탄산, 펜타트리아콘탄산 및 헥사트리아콘탄산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산과 같은 하나 이상의 포화 지방산이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 이하의 지방산, 예컨대 20mM 이하의 지방산, 예컨대 15mM 이하의 지방산, 예컨대 10mM 이하의 지방산, 예컨대 5mM 이하의 지방산, 예컨대 2mM 이하의 지방산, 예컨대 1mM 이하의 지방산을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 미만의 지방산, 예컨대 20mM 미만의 지방산, 예컨대 15mM 미만의 지방산, 예컨대 15mM 미만의 지방산, 예컨대 14mM 미만의 지방산, 예컨대 13mM 미만의 지방산, 예컨대 12mM 미만의 지방산, 예컨대 11mM 미만의 지방산, 예컨대 10mM 미만의 지방산, 예컨대 9mM 미만의 지방산, 예컨대 8mM 미만의 지방산, 예컨대 7mM 미만의 지방산, 예컨대 6mM 미만의 지방산, 예컨대 5mM 미만의 지방산, 예컨대 4mM 미만의 지방산, 예컨대 3mM 미만의 지방산, 예컨대 2mM 미만의 지방산, 예컨대 1mM 미만의 지방산, 예컨대 0.5mM 미만의 지방산, 예컨대 0.1mM 미만의 지방산, 예컨대 0.05mM 미만의 지방산, 예컨대 0.01mM 지방산을 포함할 수 있고, 예컨대 여기서 조성물은 지방산을 본질적으로 갖지 않는다.
바람직한 구현예에서, 지방산은 옥타노에이트 (옥탄산)이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 이하의 옥타노에이트, 예컨대 20mM 이하의 옥타노에이트, 예컨대 15mM 이하의 옥타노에이트, 예컨대 10mM 이하의 옥타노에이트, 예컨대 5mM 이하의 옥타노에이트, 예컨대 2mM 이하의 옥타노에이트, 예컨대 1mM 이하의 옥타노에이트를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 20mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 15mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 15mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 14mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 13mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 12mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 11mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 10mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 9mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 8mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 7mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 6mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 5mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 4mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 3mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 2mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 1mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 0.5mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 0.1mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 0.05mM 미만의 옥타노에이트, 예컨대 0.01mM 미만의 옥타노에이트를 포함할 수 있고, 예컨대 여기서 조성물은 지방산을 본질적으로 갖지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 20mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 15mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 10mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 5mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 2.28mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 2.16mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 2mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 1.52mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 1.44mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 1.2mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 1mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 800μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 720μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 456μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 400mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 304mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 288mM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 240μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 160μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 152μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 144μM 이하의 옥타노에이트 또는 총 지방산, 예컨대 80μM 옥타노에이트 또는 총 지방산을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1 이하의 옥타노에이트 대 알부민의 몰비를 포함할 수 있다. 16:1, 11:1 또는 5:1 이하의 몰비가 바람직하다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 20mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 15mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 15mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 14mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 13mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 12mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 11mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 10mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 9mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 8mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 7mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 6mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 5mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 4mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 3mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 2mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 1mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 0.5mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 0.1mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 0.05mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질, 예컨대 0.01mM 미만의 소수성 분자, 예를 들어 인지질을 포함할 수 있고, 예컨대 여기서 조성물은 소수성 분자, 예를 들어 인지질을 본질적으로 갖지 않는다.
하나의 구현예에서, 용어 소수성 분자는 옥타노에이트와 같은 지방산을 포함하나, 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제는 배제한다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 다양한 양친매성 화합물을 포함하거나 배제할 수 있다. 예를 들어, 하나의 유형의 양친매성 화합물이 포함될 수 있지만, 다른 화합물은 배제될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 계면활성제, 지방산 및/또는 인지질과 같은 모든 양친매성 화합물을 본질적으로 배제할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 25mM 이하의 양친매성 화합물을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 양친매성 화합물을 본질적으로 갖지 않을 수 있다.
유리 아미노산: 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 전형적으로 5mM 미만의 유리 아미노산, 예컨대 4mM 미만의 유리 아미노산, 예컨대 3mM 미만의 유리 아미노산, 예컨대 2mM 미만의 유리 아미노산, 예컨대 1mM 미만의 유리 아미노산, 예컨대 0.5 미만, 예컨대 0.1 미만, 예컨대 0.01 미만, 예컨대 0.005 미만, 예컨대 0.001mM 미만의 유리 아미노산을 포함할 수 있거나, 유리 아미노산을 본질적으로 갖지 않을 수 있다.
유리 아미노산은 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 아스파테이트, 글루타메이트, 리신, 아르기닌 및 히스티딘, 또는 변형 및 비-천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 아미노산을 포함한, 하나 이상의 유리 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 아미노산 중 어느 하나는 L-아미노산 또는 D-아미노산일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 유리 아미노산을 본질적으로 갖지 않는다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 전형적으로, 5mM 미만, 예컨대 4mM 미만, 예컨대 3mM 미만, 예컨대 2mM 미만, 예컨대 1mM 미만, 예컨대 0.5mM 미만, 예컨대 0.1mM 미만, 예컨대 0.01mM 미만, 예컨대 0.005mM 미만, 예컨대 0.001mM 미만의 트립토판 또는 N-아세틸 트립토판을 포함하거나, 트립토판 또는 N-아세틸 트립토판을 본질적으로 갖지 않는다. 바람직하게는 이는 트립토판 또는 N-아세틸-트립토판을 포함하지 않는다.
염: 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 임의의 적합한 염, 예컨대 브로마이드, 클로라이드, 플루오라이드, 수소화물, 아이오다이드, 질화물, 산화물, 인화물, 황화물, 과산화물, 보레이트, 브로메이트, 하이포브로마이트, 카르보네이트, 히드로겐 카르보네이트, 비카르보네이트, 클로레이트, 퍼클로레이트, 클로라이트, 하이포클로라이트, 크로메이트, 아이오데이트, 니트레이트, 니트라이트, 포스페이트, 히드로겐 포스페이트, 디히드로겐 포스페이트, 포스파이트, 술페이트, 티오술페이트, 히드로겐 술페이트, 비술페이트, 술파이트, 히드로겐 술파이트, 비술파이트, 아세테이트, 포르메이트, 옥살레이트, 히드로겐 옥살레이트, 비옥살레이트, 히드로겐 술파이드, 비술파이드, 텔루라이드, 아미드, 티오시아네이트, 뮤리에이트 (HCl), 숙시네이트 및 말레에이트 염 또는 임의의 이들의 조합 (이에 한정되지 않음)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물의 염은 또한, 비-독성 무기 산으로부터의 유도체, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 플루오린화수소산, 아인산 등, 또한 비-독성 유기 산으로부터 유래된 염, 예컨대 지방족 모노 및 디카르복실산, 페닐-치환 알칸산, 히드록시 알칸산, 알칸이산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 염은 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 카프릴레이트, 이소부티레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 만델레이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 프탈레이트, 벤젠술포네이트, 톨루엔술포네이트, 페닐아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트 등을 포함한다.
본 발명의 염은 금속의 염, 예컨대 1가 (예를 들어, 1족) 금속 및 2가 (예를 들어, 2족 및 전이 원소) 금속, 및 암모늄의 염을 포함할 수 있다. 염은 NaCl 및 KCl을 포함한다.
금속 이온: 추가의 구현예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 금속 이온을 본질적으로 갖지 않을 수 있고, 예컨대 Zn2 +, Ca2 +, Mg2 +, Mn2 +, Fe2 +, Cu2 +, Co2 + 및/또는 Ni2 + 이온을 본질적으로 갖지 않을 수 있다.
산/염기 고려 사항: 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 4 내지 9; 예컨대 4 내지 8; 예컨대 4 내지 7; 예컨대 5 내지 8; 예컨대 6 내지 8의 pH; 바람직하게는 6.4 내지 7.4; 6.0 내지 7.0; 6.7 내지 7.3 또는 6.5 내지 7.5의 pH를 가질 수 있고, 예컨대 여기서 상기 조성물은 약 7의 pH를 갖는다.
완충제: 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용하기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 (예컨대, 동결보존 배지, 저장 배지 및 기타 배지)는, 완충제, 예컨대 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제 또는 히스티딘 완충제를 포함할 수 있다. 포스페이트 완충제 또는 히스티딘 완충제가 바람직하다. 완충제 농도는 약 10 내지 약 150mM, 예컨대 약 30 내지 약 150mM, 예컨대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 또는 140 내지 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 약 150mM일 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 설명하며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
실시예
실시예 1
줄기세포를 동결보존한 후, 최종 배합으로 컨디셔닝한다. 현재, 사용되는 표준 동결보존 용액은 10%의 DMSO 및 2%의 인간 혈청 알부민 (HSA, 그리폴스(Grifols)로부터의 알부테인)의 용액의 조합으로 이루어진다. 세포 치료 분야, 특히 동종 이계와 관련하여 관심 대상은, 세포 현탁액의 안전성을 확장시키고 동결-해동 사이클 후 세포의 회복을 개선시키는 새로운 동결보호제의 탐색이다.
본 연구의 목적은 인간 간엽 기질 세포 (hMSC)와 조합된 2개의 상이한 재조합 알부민 (AlbIX® 및 리콤부민® 알파) (노보자임스 에이에스(Novozymes A/S)에 의해 개발되고, 현재 알부메딕스 리미티드로부터 시판품으로서 입수가능함)의 잠재적인 용도를 평가하는 것이었다.
Grifols,S.A. 사에서 시판되는 인간 혈액으로부터 유래된 알부민 용액인 알부테인®을 기준 항목으로서 사용하였다.
Figure pct00005
실험 디자인:
연구의 실험 단계는 도 4에서 나타낸 바와 같이 수행하였다.
세포 확장 및 컨디셔닝을 위해, hMSC를 해동시키고, 분주하고, 먼저 1-단계 셀스탁(CellStack)에서, 그 후 5-단계 셀스탁에서 27일 동안 확장시켰다. 세포를 수확하고 3개의 50㎖ 팔콘(Falcon) 튜브 (세포 현탁액 52㎖로 충전됨) 및 3개의 15㎖ 팔콘 튜브 (세포 현탁액 13㎖로 충전됨)에 분배하였다. 튜브를 원심분리 한 후, 상층액을 경사분리로 제거하고, 세포를 플라스마라이트 + 각 연구 알부민에 재현탁시켜 15 M/㎖의 세포 농도를 달성하였다 (도 4에 나타낸 바와 같음).
동결 프로토콜:
장비
- IIA 등급의 층류 부스
- 프로그램되지 않은 동결용 튜브 시스템
- 생물학적 초저온동결기 -80℃
- 액체 질소의 실린더 (적용가능한 경우)
- 자동 피펫터
- 원심분리기
- 1, 2, 5, 10, 25 및 50㎖의 피펫
- 15 및 50㎖의 튜브
- 1, 1.5 또는 2㎖의 동결보존 튜브
- 크로노미터
- 아이스 팩 (얼음으로 교체 가능)
시약
- 플라스마라이트®
- 알부테인® 인간 혈장 알부민 (그리폴스 에스.에이), 20%
- AlbIX® 10% 및 리콤부민® 알파 20% (노보자임스 바이오파마 디케이 에이에스(Novozymes Biopharma DK A/S) 및/또는 델타 바이오테크놀로지 리미티드(Delta Biotechnology Ltd.)에 의해 개발되고, 현재 알부메딕스 리미티드로부터 시판품으로서 입수가능함)
- DMSO
- 이소프로판올
절차
1. 동결보존 용액의 제조:
A. 도 4에 나타낸 바와 같이, 필요한 부피의 동결보존 용액을 제조한다. 필요한 부피가 정확히 알려지지 않은 경우, 필요한 것으로 고려되는 것보다 큰 초과 부피 (일반적으로 5 또는 10㎖)를 제조한다. 사용된 시약의 최종 농도뿐만 아니라 10㎖의 동결보존 용액을 제조하기 위한 부피를 하기에 나타낸다:
동결보존 용액의 제조에서 사용된 시약의 부피 및 농도:
Figure pct00006
B. 각 시약에 필요한 초기 부피를 찾기 위해, 하기 수학식 (Eq) 1을 사용하여 이들 계산을 수행할 것이 권고된다:
Figure pct00007
C. 동결보존 용액을 사용 순간까지 2 내지 8℃의 범위에서 저장하고; 최대로, 이를 1일 동안 2 내지 8℃의 범위에서 저장할 수 있다.
2. 세포 현탁액 수득 및 제조:
D. 동결시킬 간엽 세포를 알려진 부피 및 농도의 세포 현탁액으로부터 얻고, 배양된 세포의 원심분리, 상청액의 제거, 및 15 M/㎖의 세포 농도를 달성하기 위한 플라스마라이트 + 각 연구 알부민 중의 재현탁에 의해, 적절하게 표지된 멸균 튜브 내에서 수집하였다 (도 4에 나타낸 바와 같음).
E. 저온튜브 당 동결되는 세포의 수, 저온튜브의 수, 동결을 위한 세포 농도 (Cc) 및 저온튜브 당 부피는 사용가능한 세포의 양 또는 이들의 의도된 용도에 따라 결정된다.
F. 수식 2로부터 동결에 대한 최종 부피 (Vc)를 계산한다:
Figure pct00008
G. 동결 과정은 동결보존 용액 (즉, 플라스마라이트 + 각 연구 알부민+ 20% w/v DMSO)과 세포 현탁액 (즉, 플라스마라이트 + 각 연구 알부민 중에 재현탁된 세포)의 1:1 희석을 포함한다. 이러한 이유 때문에, 동결을 위해 제조할 세포 현탁액의 부피 및 첨가할 동결보존 용액의 부피 둘 다 수식 2에서 계산된 부피의 1/2일 것이다.
3. 동결보존 용액의 첨가:
H. 첨가할 동결보존 용액의 총 부피 (Vca)가 수식 2에서 계산된 부피의 1/2이며, 상기 부피가 동결시킬 세포 현탁액의 부피에 정확하게 해당한다는 점을 고려하여, 각 단계에서 첨가되는 동결보존 용액의 백분율을 계산하여 하기 표에 나타낸 동결 경사(ramp)를 생성한다.
동결보존 용액의 첨가에 대한 경사:
Figure pct00009
I. 상기 표에 나타낸 '경사' 체계에서 명시된 첨가 경사에 따라 세포 현탁액에 동결보존 용액 (미리 냉각됨)을 서서히 첨가한다. 동결보존 용액의 점진적 첨가는 가능한 세포 삼투 쇼크를 피한다.
4. 세포 현탁액의 분취 :
J. DMSO는 세포 독성인 성분이므로, 세포 현탁액의 분취는 가능한 한 신속하게 수행되어야 하는 절차이다. '경사' 체계 (상기 표에 나타냄)의 단계 6에 명시된 동결보존 용액의 부피가 첨가되면 분취 과정이 시작된다.
K. 미리 표지된 동결보존 튜브 내에 세포 샘플의 최종 부피를 분배한다 (섹션 E에 명기된 저온튜브 당 부피에 따름).
5. 동결
L. 적절한 수준의 이소프로판올을 함유하는 프로그램되지 않은 동결을 위한 튜브의 시스템 ("시스템")에 세포 현탁액을 갖는 동결보존 튜브를 놓는다. 이상적으로, 시스템 용기는 각 사용 전에 2 내지 8℃ 범위의 온도에서 평형화되는 것이 바람직하지만, 이것이 실온에서 평형화된 경우에도 사용될 수 있다.
M. 시스템 용기를 -80℃의 동결기에 넣어 동결시키고, 이를 적어도 밤새, 또한 최대 1개월 동안 유지한다.
N. 튜브가 시스템 용기로부터 제거되면, 이들을 -80℃ 동결기 또는 액체 질소 실린더의 해당하는 박스에 넣는다.
해동 프로토콜:
장비
- IIA 등급의 층류 부스
- 증류수 또는 대안적 열원을 갖는 항온조
- 자동 피펫터
- 인큐베이터
- 원심분리기
- 크로노미터
부패성 재료 및 시약
- 1, 2, 5, 10, 25 및 50㎖의 피펫
- 15 및 50㎖의 팔콘 튜브
- 플라스마라이트 + 각 연구 알부민
- 적용가능한 경우 아이스 팩 (사용가능하지 않은 경우, 얼음 사용 가능)
절차
i. 해동 용액의 제조
A. 플라스마라이트 + 각 연구 알부민으로 이루어진, 필요한 부피의 해동 용액을 제조한다.
B. 해동 용액을 사용 순간까지 2 내지 8℃의 범위에서 저장하여야 한다.
e.ii. 해동
C. 해동시킬 저온튜브(들)를 선택하고, -80℃ 동결기 또는 액체 질소 실린더로부터 취출한다.
D. 동결된 저온튜브를 37℃로 예열된 항온조 (또는 동등한 열원)로 옮긴다. 해동이 신속하게 이루어 지도록 하는 것이 중요하다. 저온튜브는 액체 상태로 변환되는 (그러나, 매우 작은 비율은 여전히 고체, 과립 상태로 존재할 수 있음) 정확한 순간에 열원으로부터 취출하여야 한다.
E. 세포 현탁액이 해동되면, 저온튜브의 내용물을 적절한 경우 15㎖ 또는 50㎖ 튜브로 옮긴다. 동일한 모체 세포 현탁액에 대해 얻어진 1개 초과의 저온튜브를 해동시키는 경우, 각 저온튜브에 대해 해동 과정을 수행하는 대신, 해동된 분획을 모두 조합할 것이 권고된다.
F. 세포 현탁액을 해동 용액으로 1:1 희석하고, 회수된 세포 현탁액의 부피와 동일한 부피의 해동 용액을 첨가한다. 하기 표에 나타낸 전략에 따라, 해동 용액을 서서히 첨가한다.
해동 용액 첨가 전략:
Figure pct00010
G. 희석이 해동 현탁액의 초기 부피의 1:10이 될 때까지 해동 용액으로 세포 현탁액을 희석한다. 계산의 예를 하기에 나타내었다:
해동된 세포 현탁액의 초기 부피가 1㎖ 인 경우:
1㎖ x 10 = 10㎖ (1:10 희석을 위한 최종 부피)
이전에 1㎖의 해동 용액으로 희석되었으므로 (섹션 F의 지침에 따라), 이 단계에서 첨가되는 부피는 하기와 같다:
10㎖-1㎖ (현탁액의 초기 부피) - 1㎖ (1:1 희석을 위해 첨가된 용액의 부피) = 8㎖
이 단계에서, 1㎖의 초기 부피를 위해, 8㎖의 해동 용액을 첨가할 필요가있다.
H. 피펫팅에 의해, 해동 용액의 총 부피를 측정하고, 이어서 현탁액을 철저히 균질화한다 (부피 측정을 어렵게 할 수 있는 버블의 출현을 방지하기 위해).
안정성 시험:
상기에서 논의된 동결 프로토콜 (도 4에 나타낸 바와 같음)에 따라 총 6개의 저온바이알을 동결시키고, 액체 질소 탱크에서 -196℃에서 21일 동안 저장하였다. 이어서, 이들을, 각 경우에 해당하는 알부민 용액을 사용하여, 상기에서 논의된 해동 프로토콜에 따라 해동시켰다.
2 내지 8℃에서 해동 후 세포 안정성 동안, 각 알부민을 2개의 농도: 2% (w/v) 및 5% (w/v)에서 시험하였다.
2 내지 8℃에서의 세포 안정성을 평가하기 위해, 세포 현탁액을 2% (w/v)의 각 알부민 (AlbIX®, 리콤부민® 알파 또는 알부테인®)으로 컨디셔닝하였다. 각 경우에 입증할 세포 현탁액 중 하나를 사용하여 3개의 시린지를 셋업하였다 (도 4에 나타낸 바와 같음). 6.5 M/㎖의 원하는 세포 농도를 달성하기 위해, 0.87㎖의 해당하는 스톡 셀 용액 (15 M/㎖) 및 1.13㎖의 유사 컨디셔닝 용액 (플라스마라이트 + 2%의 해당하는 알부민)을 캡핑된 시린지의 상단을 통해 로딩하였다. 이어서, 플런지를 조립하고, 시린지의 부피를 2.8㎖ (2㎖ 액체 및 0.8㎖ 공기)로 셋팅하였다 (도 5에 나타낸 바와 같음). 최종적으로, 시린지를 시험 동안 냉장고에 저장하여 목표 온도를 유지하였다.
결과 분석:
뉴클레오뷰(NucleoView) NC-3000™ 소프트웨어(케모메텍(Chemometec))를, 세포 카운팅, 세포 생존율 및 세포 응집의 뉴클레오카운터 (케모메텍) 결과의 해석 및 분석에, 또한 세포 집단의 세포사멸 측정에 사용하였다.
마이크로소프트(Microsoft)® 엑셀(Excel) 2007 (마이크로소프트 코포레이션(Microsoft Corporation)) 및 윈도우(Windows)용 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v5 (그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc.))를 결과 분석 및 플롯 생성에 사용하였다.
결과 및 논의:
인간 알부민 단백질은 고급 치료 분야에서 널리 사용된다. 동결-해동 사이클과 관련된 손상으로부터 세포를 보호함으로써 세포 기반 산물의 안정성을 보장한다. 따라서, 다양한 형태의 알부민의 유용성 및 이들의 최적 작업 농도를 확인하기 위해 세포 안정성이 입증되어야 한다. 이 경우, 뉴클레오카운터® NC-3000™ 및 제조업체의 프로토콜 및 지침을 사용하여 세포 카운팅, 세포 생존율, 세포 응집 및 세포 비-세포사멸, 세포사멸 및 사망 집안에 의해 세포 안정성을 평가하였다.
2 내지 8℃에서의 안정성 결과:
(a) 동결 및 해동으로의 전처리가 없는 안정성:
확장, 원심분리, 상청액 제거, 및 15 M/㎖의 세포 농도를 달성하기 위한 플라스마라이트 + 각 연구 알부민 중의 세포 재현탁된 hMSC 세포를, 동결 및 해동없이, 2 내지 8℃에서의 안정성에 대해 시험하였다. 0시간, 23.7시간, 44시간, 51.5시간 및 93.5시간의 저장 후에 시험했을 때, 세포 농도 및 세포 생존율 (데이터는 나타내지 않음)과 관련하여 상이한 시험된 알부민 용액간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 세포 농도는 일정하게 유지되었고, 세포 생존율은 52시간까지 97% 초과였다.
44시간에 걸친 세포사멸 분석에 의해 얻은 결과 (데이터는 나타내지 않음)는 모든 경우에서 두가지 상이한 세포 집단, 즉 생존가능 세포 및 사망 세포를 확인하였다. 세포사멸 집단은 관찰되지 않았다; 따라서 세포가 이전에 세포사멸을 겪지 않고 괴사된 것으로 고려된다. 시험된 알부민간에는 유의한 차이가 없었다. 세포 농도 및 세포 생존율에 대해 얻어진 결과에 따라 세 경우 모두 동일한 패턴이 관찰되었다.
(b) 동결 및 해동으로의 전처리 후의 안정성:
확장, 원심분리, 상청액 제거, 및 15 M/㎖의 세포 농도를 달성하기 위한 플라스마라이트 + 각 연구 알부민 중의 세포 재현탁된 hMSC 세포를, 동결 및 해동 후, 2 내지 8℃에서의 안정성에 대해 시험하였다.
샘플을 하기 시점: 0시간, 23.5시간, 45.5시간 및 72시간에 역전에 의한 균질화의 20 사이클 후에 제거하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 3종의 알부민에서 시험된 세포는 시간이 지남에 따라 생존율이의 점진적 감소를 나타내었고, 재조합 효모-유래 알부민 제제가 세포에 대한 가장 큰 보호를 나타내었다.
도 6의 데이터는 하기와 같이 요약될 수 있다:
Figure pct00011
데이터는 다음을 나타낸다:
- 2% 알부민에서, 2 내지 8℃에서 45.5시간의 저장 후, 생존가능 세포의 수준은 AlbIX® (92.9%), 이어서 리콤부민® 알파 (59.1%)에서 최선이었고, 혈장-유래 알부테인® (40.7%)에서 최악이었다.
- 5% 알부민을 사용했을 때 생존율이 전반적으로 낮았지만, 2 내지 8℃에서 45.5시간 저장 후 생존가능 세포의 수준간의 차이는 더욱 더 현저하였으며, AlbIX® (63.2%), 이어서 리콤부민® 알파 (34.5%)에서 최선의 결과, 또한 혈장-유래 알부테인® (단지 4.5%)에서 최악이었다.
따라서, 동결 및 해동과 같은 생리학적 쇼크 동안 및/또는 후에 세포를 보호하기 위해 사용될 때, 혈장-유래 알부민 산물과 비교하여, 재조합 효모-유래 알부민 제제가 저장 동안 세포에 대해 가장 큰 보호를 제공한다고 결론 지어진다. 차이가 2 내지 8℃에서 23.5시간의 저장 후에는 반드시 분명하지는 않다. 이는, 짧은 기간 후에는, 세포가 동결 및 해동의 생리학적 쇼크에 완전히 반응할 시간이 충분하지 않기 때문인 것으로 고려된다.
또한, 동결 및 해동과 같은 생리학적 쇼크 후에, 저장 동안 세포 생존율을 최대화하기 위해 2% 알부민 농도가 5% 알부민 농도더욱 바람직하다고 결론 지어진다.
실시예 2
추가 시험은 hMSC의 동결보존을 위한 첨가제로서 AlbIX®의 유익한 효과, 및 알부테인® (그리폴스 에스에이에 의해 제조된 시판용 혈장-유래 알부민 용액)과의 비교를 확인하기 위해 수행되었다.
두가지 전략: 표준, 10% hSERB (인간 혈청 B), 및 탐구용 5% PL (혈소판 용해물)을 사용하고 확장된 상이한 공여자로부터의 상이한 세포 배양에서 포괄적인 분석을 수행하여, 해동-동결 과정의 효율성 및 세포 현탁액의 안정성을 생존율, 동일성 및 다능성과 관련하여 평가하였다.
줄기세포를 최종 제제로 컨디셔닝하기 전에 동결보존하였다. 사용된 표준 동결보존 용액은 10%의 DMSO 및 2%의 인간 혈청 알부민의 용액 (HSA, 그리폴스로부터의 알부테인®)의 조합으로 이루어졌다.
시약 및 용액:
연구의 실험 단계에서 사용된 중요한 시약 및 용액을 하기에 기재한다:
- AlbIX® (알부메딕스 리미티드, 배치: AK190201)
- 알부틴 ® (그리폴스 에스에이, 배치: MPAB5HA001)
- 플라스마라이트® + 2% w/v 알부틴 ®
- 플라스마라이트® + 2% w/v AlbIX®
기준 항목 (RI):
명칭: HSA-MSC (알부틴 ®)
조성: 플라스마라이트®, 2% 알부테인® w/v 및 10% v/v DMSO 용액에서 동결보존된 생체외 확장된 BM-hMSC
제시: 10% hSERB 확장에서 각 세포 배치에 대해 2개의 저온바이알; 5% PL 확장에서 각 세포 배치에 대해 1개의 저온바이알.
허용 기준: 저온바이알 세포 농도: 7.5×106 생존가능 hMSC/㎖±20% (6.0×106 - 9.0×106 생존가능 hMSC/㎖).
10% hSERB (인간 혈청 B):
XCC14040: 7.50×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO15048: 7.10×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO13008: 7.50×106 생존가능 hMSC/㎖
5% PL (혈소판 용해물):
XCC14040: 8.01×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO15048: 7.50×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO15054: 8.65×106 생존가능 hMSC/㎖
시험 항목 (TI)
명칭: AlbIX®-MSC
조성: 플라스마라이트®, 2% 알부테인® w/v 및 10% v/v DMSO 용액에서 동결보존된 생체외 확장된 BM-hMSC
제시: hSERB 확장에서 각 세포 배치에 대해 2개의 저온바이알; 5% PL 확장에서 각 세포 배치에 대해 1개의 저온바이알.
허용 기준: 저온바이알 세포 농도: 7.5×106 생존가능 hMSC/㎖±20% (6.0×106 - 9.0×106 생존가능 hMSC/㎖).
10% hSERB (인간 혈청 B):
XCC14040: 7.50×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO15048: 7.10×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO13008: 7.50×106 생존가능 hMSC/㎖
5% PL (혈소판 용해물):
XCC14040: 8.30×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO15048: 7.50×106 생존가능 hMSC/㎖
XCO15054: 7.76×106 생존가능 hMSC/㎖
실험 디자인:
세포 확장
네가지 상이한 1차 hMSC 세포 배양 시험 시스템을 해동시키고, 분주하고, 확장시켜, AlbIX®의 평가 및 알부테인®과 그의 비교를 위한 실험을 수행하기 위해 충분한 수의 세포를 생성하였다.
하기 상이한 전략에 따라 여섯가지 상이한 확장을 수행하였다. 제1 전략에서는 XCC14040, XCO15048 및 XCO13008로 명명된 1차 세포 배양물을 표준 배지: DMEM + 10% 인간 혈청 B (hSERB)를 사용하여 배양하였으며; 제2 전략에서는 XCC14040, XCO15048, XCO15054로 명명된 1차 세포 배양물을 DMEM + 5% 혈소판 용해물 (PL)과 함께 배양하였다.
상이한 조건: 10% hSERB, 및 5% PL으로, 상이한 1차 세포 배양물의 확장 동안 얻어진 동역학 파라미터를 평가하였고, 하기 표에 나타내었다:
Figure pct00012
*동결보존 전 최종 계대 배양 단계의 배증 시간.
상기 표는 연구 동안 사용된 세포주의 동역학 특징을 나타낸다 (CPD: 누적 집단 배증). CPD는 현재의 연구 이전에 세포가 이미 확장되었다는 것을 고려하여 계산되었다. 따라서, 계산된 CPD에 각 이전 계대 배양 단계 또는 통과에 대해 표준 카운팅 3을 더하였다.
이 hMSC에 대해 고려된 초기 통과는 -02였으며, 이는 골수 (BM) 샘플로부터의 hMSC의 단리에 있어 출발점이다. 모든 확장에 대해 CPD는 50 CPD의 헤이플릭(Hayflick) 한계보다 낮았다.
두 배양 전략, XCC14040 및 XCO15048에 공통적인 1차 세포 배양물의 비교에서, 배증 시간에서 차이가 발견되었고, 이는 5% PL의 경우 성장 속도가 더 느렸음을 보여주며, 이에 따라 이것이 세포에 대한 최적 미만적 배양 조건으로서 고려된다. 이러한 덜 유리한 배양 조건에서 얻어진 정보는 동결보호제를 더 잘 비교하는 데 기여하였다.
세균 오염이나 세포 형태의 변화의 존재를 배제하기 위해 세포 확장 동안 역전 현미경을 사용한 주기적 육안 검사를 수행하였다. PL 확장 조건의 경우, 마이코플라즈마 검출의 보완 분석을 수행하였고, 이는 네거티브 결과를 보이고 느린 성장의 원인으로서의 이를 버린다 (데이터는 나타내지 않음).
세포 동결 및 해동
합류에 도달하면 (약 70%) 세포를 트립신처리하고, 세포 카운팅, 생존율 및 표현형을 동결 전에 유동 세포계측 기술에 의해 측정하였다. 세포계측 분석에서 측정된 생존가능 세포의 수를 고려하여, 상이한 확장으로부터의 세포를 2개의 상이한 부분으로 분할하고, 원심분리하고, 배지 상청액을 폐기하고, 각 부분의 세포 펠렛을 15×106 생존가능 hMSC/㎖±20%의 농도로 재구성하였다. 펠렛 재구성을 위한 용액은, RI 조건의 경우 2% w/v 알부테인®의 플라스마라이트®, 및 TI 조건의 경우 2% w/v AlbIX®의 플라스마라이트®였다.
이들 세포 현탁액을,냉각 속도 동안 특정 동결보존 용액을 첨가하여, 실시예 1에 기재된 동결 프로토콜에 상술된 절차 및 단계에 따라 동결시켰다. 각 저온바이알에서 달성된 최종 농도는 7.5×106 생존가능 hMSC/㎖±20%였고, 최종 동결보존된 세포 현탁액의 조성은, RI의 경우 플라스마라이트 중 10% v/v DMSO 및 2% w/v 알부테인, 및 TI 조건의 경우 플라스마라이트 중 10% v/v DMSO 및 2% w/v AlbIX®였다.
최소 7일의 기간 후, 세포를 실시예 1에 기재된 해동 프로토콜에 따라, 그러나 상이한 특정 해동 용액: 플라스마라이트® 중 알부테인® 2% w/v 및 플라스마라이트 중 AlbIX® 2% w/v를 사용하여 해동시켰다.
알부민 용액의 연구는 두 부분:동결보존 과정 및 안정성으로 분할되었다.
동결보존 보호
알부민 용액이 hMSC에 제공할 수 있는 동결보호 효과를 평가하기 위해, 해동 후 세포계측 분석을 반복하고, 동결 전 결과와 비교하였다. 보완 평가인 PL로 배양된 세포의 경우, 세포 카운팅 및 생존율만이 수행되었다.
수행된 동결보존 후 유동 세포계측 분석은 안정성 평가의 시간 0을 구성하였다.
안정성 평가: 세포 생존율 및 세포 동일성
hMSC 현탁액을 PL 또는 hSERB로 각각 확장된 세포에 대해 10 또는 20㎖ 시린지에 포장하고, 공기 부피 대 액체 비율을 0.4로 유지하였다. 샘플을 2 내지 8℃에 저장하고 상이한 시점: 사용된 배양 전략에 따라 0시간, 24시간 초과, 48시간 및 72시간에서 다양한 평가를 수행하였다.
PL 확장 배양.
PL로 확장된 세포의 안정성 평가는 하기 두가지 상이한 방법론을 사용한 언급된 시점을 따르는 생존율 측정법으로 이루어졌다:
- 유동 세포계측법: 수행된 생존율 측정은 각각 7AAD 및 아넥신 V 마커를 사용하여 괴사 및 세포사멸 세포 모두를 고려하였다.
- 다중 이미지 수집을 통한 형광 세포 분석을 기반으로 한 NC3000™ 뉴클레오카운터 (케모메텍) 기술: 두가지 상이한 프로토콜을 따랐다: 제1 프로토콜 또는 표준은 세포 농도, 응집 및 생존율 측정을 가능하게 하고; 제2 프로토콜은 초기 및 후기 세포사멸 세포가 아넥신 V 결합 및 PI 포함을 사용하여 측정된 것을 감안할 때 주어진 세포사멸 과정의 보다 완전한 연구에 사용되었다.
hSERB 확장 배양:
hSERB로 확장된 세포에 대한 안정성 평가는 생존율뿐만 아니라 동일성에 대한 평가로 이루어졌다. 생존율 측정을 위해, PL로 확장된 배양과 동일한 방식으로, 두가지 상이한 방법이 수행되었다:
- 0시간, 24시간 초과, 48시간 및 72시간에서의 유동 세포계측법.
- 0시간, 24시간 및 72시간에서의 세포 카운팅, 응집 및 생존율만을 포함하는 표준 절차를 사용한 뉴클레오카운터 측정.
동일성 측정은 또한 0시간, 24시간 및 72시간 시점에서 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. 고려된 표면 마커 발현은 ISCT (국제 세포 치료 학회)에서 채택되었으며, 허용 기준은 또한 경험에 따라 셋팅되었다: CD105, CD73 및 CD90 항원에 대해 적어도 95.0; CD45 및 CD31에 대해 5% 이하; 및 HLA-DR에 대해 20% 이하.
안정성 평가: 다능성
세포 효능은 10% hSerB 보충-배지로 확장된 세포 배양물로부터 얻은 샘플 및 0시간, 24시간 및 72시간 시점에서만 평가하였다. 세가지 다른 계통 (지방형성, 골형성 및 연골형성)으로 분화하는 세포의 능력을 평가하였다.
2개의 48 웰-포맷 플레이트 (1개는 기초 조건용, 다른 것은 분화용)를 수행된 각 염색 프로토콜에 대해 분주하였다. 기초 조건을 분주 후 0 내지 2일에 염색하였으며, 분화된 것은 표준 배양 조건 (37℃, 5% CO2 및 95% 상대 습도 (RH)) 하에 특정 분화 배지에서의 세포 배양 후에 염색하였고, 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다.
골형성 및 지방형성 분화 분석 둘 다에서, 세포가 사용된 분화 자극 및 세포 밀도에 노출된 시간은 1 내지 4 주 및 3×103 내지 1×105 세포/cm2였다.
연골형성 분화의 경우, 사용된 분주 농도는 72시간에 8.0×104±12.5% 세포/마이크로매스였고, 생존가능 세포의 낮은 수로 인해 일부 세포 배양에서 이는 가능하지 않았다.
결과 분석:
마이크로소프트 엑셀 2007 (마이크로소프트 코포레이션) 및 윈도우용 그래프패드 프리즘 v6.01 (그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)를 결과 분석 및 플롯 생성에 사용하였다.
뉴클레오뷰 NC-3000™ 소프트웨어 (케모메텍)를, 세포 카운팅, 세포 생존율 및 세포 응집의 뉴클레오카운터 (케모메텍) 결과의 해석 및 분석에, 또한 세포 집단의 세포사멸 측정에 사용하였다.
BD 셀 퀘스트(Cell Quest) v5.2.1을 세포 카운팅 및 세포 동일성 평가에 대한 세포계측 분석에 사용하였다.
결과 및 논의:
AlbIX® 대 알부테인®의 동결보존 보호
hMSC에 대한 연구된 알부민 용액, AlbIX® (TI) 및 알부테인® (RI)의 동결보호 효과를 유동 세포계측법에 의해 생존율 및 동일성과 관련하여 평가하였다. 생존율 평가는 hSERB 및 PL의 두가지 배양 확장 전략에서 수행되었지만, 동일성만이 hSERB 확장에 대해 평가되었다.
사용된 각 1차 세포 배양 및 확장 전략에 대해, 각 조건, 알부테인® 또는 AlbIX®에서 동결 전 및 해동 직후에 생존율의 %를 평가하였다.
생존율 감소만이 고려되었음을 감안할 때, 연구된 1차 세포 배양 및 사용된 확장 전략에 의해 제공된 변동성은 데이터 정규화 후에 감소되었다. 이 정규화 후의 결과 (데이터는 나타내지 않음)는 두가지 동결보존 용액간에 유의한 통계적 차이가 없음을 보여주었다 (일말단 t-시험(Unpaired t-Test) 통계 분석 사용). 모든 이전의 결과를 종합해보면, 해동 직후에는, 평가된 두 첨가제 알부테인® 및 AlbIX®의 동결보호 효과가 유사하다는 것을 확인하였다.
동결 전 대 동결 후의 표현형
고려된 상이한 표면 마커의 발현의 %를 검사하여 동결 전 및 해동 후에 hMSC의 동일성을 비교하였다 (도 7 참조).
알부테인® 또는 AlbIX® 동결보존 프로토콜로 탐구된 동결 전 및 해동 후 모든 조건에서, hMSC의 동일성에 대해 현재 허용된 기준이 충족되었다: CD105, CD73 및 CD90 항원에 대해 적어도 95.0; CD45 및 CD31에 대해 5% 이하; 및 HLA-DR에 대해 20% 이하. 또한, 수행된 통계 분석 (아노바 터키 다중 비교 시험 사용)은 평가된 동결보호제간에 임의의 통계적으로 유의한 차이를 발견하지 못하였다.
따라서, 동결보존 과정은 표면 마커의 동일성을 변경시키지 않았으며, AlbIX® 또는 알부테인® 용액은 hMSC의 원래 표현형을 유지하였다.
AlbIX 대 알부테인의 안정성 효과
동결보존 후 hMSC에 대한 연구된 알부민 용액, AlbIX® (TI) 및 알부테인® (RI)의 안정화 효과를 생존율, 동일성 및 다능성과 관련하여 평가하였다.
(a) 생존율:
생존율은 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. hSERB 및 PL 배양 확장 전략 둘 다에서, 괴사 (7AAD) 및 세포사멸 세포 (아넥신 V) 둘 다를 고려한 이중 염색 프로토콜을 사용하여 0, 24, 48 및 72시간의 상이한 시점에서 생존율을 평가하였다.
도 8a (hSERB 확장 세포의 경우) 및 도 8b (PL 확장 세포의 경우)에, 상이한 시점 및 동결보존 조건, AlbIX® 및 알부테인®에 따른 생존율의 %가 나타나 있다.
해동 직후, t=0시간에, 모든 세포는 이어지는 세포 배양 전략 (hSERB 또는 PL) 및 동결보존 조건 (AlbIX® 또는 알부테인 ®)에 대해 독립적으로 방출 기준 (생존율 = 70%)을 준수하였다.
hSerB 세포 배양 전략 및 AlbIX 조건 (도 8a)에 대하여, 모든 세포는, t=24시간으로부터 규격을 벗어나게 된 (OOS) XCO13008을 제외하고는, 상이한 시점을 따라 70% 초과의 생존율을 나타내었다. 이 사실은, 세포가 DMSO에 더 오래 노출되는 해동 동안 발생하는 사건에 대한 결과일 수 있으며, 이는 t=0 시간에서 이미 낮은 생존율을 초래할 수 있다. 알부테인® 조건의 경우 t=24 시간으로부터 안정성 평가 종료시까지 세가지 중 두가지의 1차 세포 배양물이 OOS였고, 72시간에는 모든 1차 세포 배양물이 비-준수되었다. 통계 분석 (아노바, 터키 다중 비교 시험)은 생존율의 감소가 시점 0시간과 72시간 사이에 알부테인®에서는 유의하였지만 (p<0.05), AlbIX® 조건의 경우 생존율의 감소는 통계적으로 유의하지 않았다. 생존율 감소의 값 및 통계 분석의 결과는 hSERB로 확장된 세포에서 AlbIX® 조건에 대한 확장된 안정성을 입증하였다.
PL을 사용한 최적 미만 세포 배양 전략 (도 8b)에서, AlbIX® 조건 또한 알부테인®보다 우수한 결과를 나타내었지만, 이 경우 결과가 보다 분명하였다. 24시간 내지 72시간에서, 알부테인®으로 동결보존된 모든 세포는 OOS였으며, AlbIX® 처리의 경우 생존율은 단지 1차 세포 배양에서 70% 미만이 되었고, 후기 시점까지는 아니었다. 통계 분석 (아노바, 터키 다중 비교 시험)은 hSERB 확장 세포에서 얻은 결과와 유사한 결과를 보였다: 안정성 시점을 따라 AlbIX® 조건에서 유의하지 않은 차이를 보인 반면, 알부테인®은 24, 48, 72시간에 차이를 보였다 (p < 0.05). 이 결과는 hSERB로 확장된 세포에 따르며, AlbIX® 처리가 알부테인® 처리보다 우수한 성능을 제공한다는 결론을 강화하였다.
동결보존 연구의 비교를 위한 두가지 세포 배양 전략을 조합한 데이터는, 알부틴 ® 용액의 경우 24시간 내지 72시간에서 평균 생존율 값이 OOS임을 입증한 반면, 결과는 AlbIX® 용액에 대한 모든 안정성 시점을 따라 규격을 준수하였다.
AlbIX® 및 알부테인® 처리 조건의 % 생존율을 더 잘 비교하기 위해, 상이한 1차 세포주 및 확장 전략에서 관찰된 변동성을 정규화하였다. 정규화는 안정성의 T = 0을 생존율의 100%로 고려하고, 이 값과 관련하여 시간에 따른 감소 백분율을 계산하는 것으로 이루어졌다. 생존율 감소의 이러한 백분율의 그래프 표시가 도 8c 및 8d에 나타나 있다.
데이터 정규화 후의 생존율 감소는 모든 세포주 및 배양 전략에서 AlbIX™ 조건보다 알부테인®에서 항상 더 높았다. 생존율의 감소는 PL 세포의 경우 72시간에서 60 내지 80%, 또는 hSERB 세포의 경우 45 내지 85%의 값을 달성하면서 시간에 따라 점진적으로 증가하였다. 동결보존 조건간의 비교에서 통계 분석 (아노바 비-모수 시닥 다중 비교 시험 사용)을 수행하였고, hSERB 배양 전략의 경우 72시간 (p <0.05), 또한 PL 배양 확장 전략의 경우 24시간 (p<0.05), 48 및 72시간 (p <0.001)에서 유의한 차이가 검출되었다.
전체적으로, 이들 결과는 이전 결론을 뒷받침하고, AlbIX™이 알부테인®에 비해 생존율에 있어 해동 후 산물 안정성을 개선시킨다는 것을 확인시켰다.
표현형
고려된 상이한 표면 마커의 발현의 %를 검사하여 hSERB로 확장된 세포주에 대해 상이한 안정성 시점 (0, 24 및 72시간)을 따라 hMSC의 동일성을 비교하였다 (도 11 참조).
시점 0 및 24시간에 대해, 또한 알부테인® 또는 AlbIX® 동결보존 프로토콜에 대해, hMSC의 확인에 대해 현재 허용된 기준이 충족되었다: CD105, CD73 및 CD90 항원에 대해 적어도 95.0; CD45 및 CD31에 대해 5% 이하; 및 HLA-DR에 대해 20% 이하. 72시간 시점의 경우, 연구된 동결보존 조건 알부테인® 및 AlbIX® 둘 다에 대한 1차 세포 배양물 XCO13008은 포지티브 표면 마커: CD105, CD73 및 CD90에 대해 OOS였다. 언급된 항원의 발현은 적어도 95.0의 허용 한계 미만이었다. 이 결과는 이 1차 세포 배양물의 낮은 생존율: 10%의 결과였다. 실로, 세포가 사망했을 때, 이들은, 잠재적으로 잘못된 결론에 이르는, 모노클론 항체 컨쥬게이트에 의해 결합될 수 있는 환경 내의 다수 세포내 단백질 또는 성분을 방출시킨다 (특히 세포 빈도가 이 경우와 같이 낮은 경우).
수행된 통계 분석 (아노바 터키 다중 비교 시험이 사용됨)은, 안정성 평가를 위해 평가된 동결보호제간의 유의한 차이를 나타내지 않았다. 동결보존 후 세포 현탁액의 안정성은 동일성과 관련하여 AlbIX® 및 알부테인® 용액에 대해 동등하다.
AlbIX® 대 알부테인®의 다능성 보호
hMSC의 다능성, 즉 다른 중배엽 계통 (지방형성, 골형성 및 연골형성)으로 분화하는 능력을 hSERB로 확장 및 알부테인® 또는 AlbIX® 조건으로 동결보존된 1차 세포 배양물에 대하여 해동 후 및 상이한 안정성 시점 (0, 24 및 72시간)에 따라 연구하였다.
얻어진 데이터 (나타내지 않음)는, hMSC의 다능성은 AlbIX® 및 알부테인® 조건 둘 다에 대해 동결보존 후 및 해동 후 72시간 동안 안정함을 나타내었다. 일부 조건에서는 분화능의 부족이 검출되었으며, 이는 낮은 수의 생존가능 세포 수 또는 동결보존 용액과 관련되지 않지만 의존적인 세포 배양물과 관련되었다.
결론:
동결보호 효과
동결 전 및 해동 직후 세포 현탁액을 비교했을 때, 생존율 및 동일성과 관련하여 동결보존 용액 AlbIX® (TI) 및 알부테인® (RI)간의 유의한 차이가 발견되지 않았다.
동결보존 후 안정성 효과
해동 후 평가된 안정성 시점을 따라, AlbIX®는 최선의 세포 생존율 결과를 보장하였다.
- hSERB로 확장된 세포 배양물은 알부테인®에 대해 48시간에서 OOS (생존율 = 70%)를 보였으나, AlbIX®의 경우 72시간에서 최초 OOS가 검출되었다. t=72시간에 대한 t=0의 비교에서 알부틴®에 대해서만 유의한 통계적 차이가 검출되었다.
- 최적 미만 조건 PL로 확장된 1차 세포 배양물은, 알부테인®에 비해 AlbIX®의 우수한 성능을 강화하였다. 생존율 OOS는 알부테인®의 경우 24시간에 이미 검출되었지만, AlbIX®의 경우 72시간에 최초 OOS가 검출되었다. 시간 0과 비교하여 알부테인®의 경우 24시간에 통계적으로 유의한 차이가 검출되었으며, 이는 AlbIX®의 경우에는 검출되지 않았다.
- 데이터 정규화 후, 생존율 감소의 백분율은 이전 데이터를 확인시켰다: AlbIX® 조건에서 더 낮은 감소가 검출되었고, hSERB 확장된 세포의 경우 72시간에, 또한 PL 확장된 세포의 경우 모든 연구된 시점 24, 48 및 72시간에 알부테인®과 비교했을 때 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다.
hMSC의 동일성 및 다능성과 관련하여, 용액 AlbIX® 및 알부테인®은 시점 0에서 얻은 결과를 유지하면서 연구의 다른 시점을 따라 유사한 결과를 나타내었다.
실시예 3
실시예 2의 알부테인®-처리된 (대조군) 및 AlbIX®-처리된 세포를, 2 내지 8℃에서 관련 저장 배지를 저장하였을 때, 해동 후 시점 T=0, 24, 48 및 72시간에 대해 해동 후 저장에 따른 초기 및 후기 세포사멸에 대해 평가하였다. 초기 및 후기 세포사멸을 NC3000™ 뉴클레오카운터를 사용하여 평가하였다. 결과는 도 12에 나타나 있다.
도 12a는, AlbIX®가 24시간보다 긴 기간 동안 저장에 따른 후기 세포사멸로 진입되는 세포의 수 감소에 있어 효과적이고, 이는 48 및 72시간에서 명백한 차이를 나타냄을 보여준다.
도 12b는, AlbIX®가 평가된 모든 시점에서 초기 세포사멸에서 유지된 세포의 수 증가에 있어 효과적임을 보여준다.
세포사멸 연구는, 대조군과 비교하여 세포가 후기 세포사멸로 진행하는 것을 막는 것에 의한 AlbIX®의 작용 방식을 설명할 수 있다.
실시예 4
이전의 실시예는, 동결보존 배지 및 저장 배지 둘 다에 존재하는 경우, 시험된 효모-유래 재조합 혈청 알부민 AlbIX®의, 동결보존 동결/해동 사이클 동안 줄기세포에 대한 유익한 효과를 입증하였다.
본 실시예에서는, 효모-유래 재조합 혈청 알부민의 역할을, 해동 후 안정화제로서, 또는 동결 동안의 동결보호제로서, 또는 이들 둘 다로서의 그의 유익한 효과를 발휘하는지 여부를 결정하기 위해 추가로 연구하였다.
이를 위해, 네가지 조건이 셋팅되었다: 세가지 시험 항목은 대표적인 효모-유래 재조합 혈청 알부민 (AlbIX®)을 사용하였고, 이는 동결보호제만으로서, 안정화제만으로서, 또는 동결보호제 및 안정화제 둘 다로서 사용되었다. 기준 항목 (RI)으로서 제공된 네번째 조건은, 인간 혈액으로부터 유래되고 그리폴스에 의해 시판되는 알부민 용액 알부테인®의 사용이었고, 여기서 알부테인®은 동결보호제 및 안정화제 둘 다로서 포함되었다.
이는 추가로 하기와 같이 더 요약될 수 있다:
Figure pct00013
제조 변화를 수행할 때, GMP 규정에 의해 권고된 바와 같이, 생존율을 사전 동결, 해동 직후, 및 안정성 연구 동안 평가하였다. 효모-유래 재조합 혈청 알부민의 잠재적인 작용 메커니즘을 더 조사하기 위해 세포사멸 연구를 또한 수행하였다.
MSC 배양물:
골수 (BM)로부터 유래된 임상 등급의 MSC를, 다른 부분에서 기재된 바와 같이 (Codinach et al., 2016, Cytotherapy, 18 (9): 1197-1208), 적절한 공여자 동의서와 함께 GMP(Good Manufacturing Practice)를 준수하는 바이오프로세스에 따라 생성하였다. 2mM의 글루타민을 함유하고 10% (v/v) 인간 혈청 B (hSerB; 반크 데 상 이 테익시츠(Banc de Sang i Teixits), 바르셀로나, 스페인) 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM; 깁코(Gibco, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 구성된 "확장 배지"를 사용하여 시험관내에서 추가로 확장시켰다. 모든 배양물을 가습 배양기에서 37℃ 및 5% CO2로 유지시켰고, 전체 배지 교체를 3 내지 4일마다 수행하였다.
동결/해동 후 제제:
대규모 확장 후, 세포를, 10% (v/v) 디메틸 술폭시드 (DMSO, 오리겐 바이오메디칼(OriGen Biomedical), 미국 텍사스주 오스틴) 보충된 둘베코 포스페이트-완충 식염수 (DPBS, 깁코, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 2% (w/v)의 알부테인® 또는 AlbIX®로 구성된 용액 중에 이루어진 용액에서 동결보존하였다. 조건에 따라, 세포를 플라스마라이트® (박스터(Baxter)) 중 2% 알부테인® 또는 AlbIX® (w/v)의 용액과 함께 해동시켰다. 이어서, 세포를 10㎖ 시린지 내에서 컨디셔닝하여 임상 투여량을 재현하고, 안정성 연구를 위해 2 내지 8℃에서 저장하였다.
안정성 평가:
세포 농도 및 생존율을 두가지 기술로 평가하였다: 유동 세포계측법 및 자동 세포 카운터 뉴클레오카운터™ 3000™ (케모메텍, 덴마크 알레로드). 퍼펙트-카운트 마이크로 스피어(Perfect-Count Microsphere)™ (시토그노스(Cytognos))를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 세포 농도를 평가하였다. 뉴클레오카운터 생존율 분석 및 세포 카운팅은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 세포 생존율의 백분율은 7-아미노액티노마이신 D (7AAD; 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)) 및 아넥신-V를 사용하는 이중 염색에 의해 유동 세포계측법으로 측정하였다. 7AAD는 세포막이 괴사 과정에 의해 손상될 때 DNA에 특이적으로 결합하지만, 아넥신-V는 원형질 막의 내부 리플릿에서 정상적으로 발현되는 포스파티딜세린에 결합하여 세포사멸 초기 동안 외부로 전위된다.
세포사멸 분석:
초기 및 후기 세포사멸 세포의 백분율을 제조업체의 지침에 기재된 바와 같이 자동 세포 카운터 뉴클레오카운터 NC-3000™ (케모메텍, 덴마크 알레로드)를 사용하여 평가하였다. 간단히 말하면, 세포를 회슈트(Hoescht) 33342로 염색하여 전체 세포 집단을 선택하고, 아넥신-V 결합을 초기 세포사멸 세포의 특이적인 염색에 사용하였고, 마지막으로 세포를 PI와 함께 인큐베이션시켜 괴사 세포를 정량화하였다. 뉴클레오카운터TM의 결과를 분석하고 해석하기 위해 뉴클레오뷰 NC3000 소프트웨어 (케모메텍 에이/에스, 덴마크 알레로드)를 사용하였다.
참고 문헌:
Application note No. 3017 Rev. 1.4, 표제 "Annexin V Assay using the NucleoCounter® NC-3000 TM System", 케모메텍 에이/에스 (덴마크 DK-3450 알레로드 기데방 43), 또한 온라인, 예를 들어 "https://chemometec.com/wp-content/uploads/2015/04/994-3017-Annexin-V-Assay.pdf"에서 이용가능함.
결과:
생존율 분석:
동결 전 및 동결 후 생존율을 두가지 장치: 유동 세포계측기 및 뉴클레오카운터로 모든 항목에 대해 비교하였다.
두가지 기술의 결과가 도 13에 나타나 있다. 유사한 경향이 두 장치 모두에서 관찰되었다. 해동 직후, 모든 시험 항목 (TI1, TI2 및 TI3)은 허용 기준 (생존율> 70%)을 충족시켰으며, 기준 항목 (RI) 세가지 중 두가지는 이미 규격을 벗어났다. 이는, AlbIX®를 갖는 모든 시험 항목이, 동결보존 및 저장 배지 둘 다에서 알부테인®을 사용한 기준 항목 (RI)에 비해, 해동 직후에 더 우수한 생존율을 나타내었음을 입증하였다.
뉴클레오카운터 기술에 의해 측정된 TI3의 백분율 생존율은 동결 전 샘플의 생존율 수준과 유의하게 다르지 않다는 것이 주목되며, 이는 AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 동결보존 및 저장 배지 둘 다에서 사용될 때 특히 높은 정도의 세포 보호를 나타낸다.
이 데이터는, AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 해동 후 생존율을 개선시킨다는 것을 나타낸다. 유익한 효과는 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 동결보존 배지 단독, 저장 배지 단독, 또는 둘 다에 포함될 때 최대 효과로 관찰되었다.
도 13의 데이터에서 관찰된 해동 직후 (t=0시간) 생존율의 측정가능한 차이에 주목하는 것이 흥미롭다. 반면, 실시예 2에서, 본 발명자들은 해동 직후 생존율이 동결보존 및 저장 배지에서 알부테인® 및 AlbIX®의 사용 사이에서 유사함을 보고하였다. 이론에 구애되지 않지만, 이 차이는 실시예 2 및 4의 시험용 세포를 제공하기 위해 사용된 확장 전략의 차이에 기인할 수 있다고 생각된다. 실시예 2에서와 같이, 세포 확장에 대한 최적의 배지 및 조건의 사용은, 해동 직후에 검출된 생존율의 동등성으로 이어지는 것으로 보이며 (24시간 이상과 같은 더 긴 저장 기간 후에 차이가 명백해졌지만), 동결보존 전 최적 미만 및/또는 스트레스를 받는 조건에서 확장된 세포는 AlbIX® 또는 알부테인®의 사용에 따라 해동 직후 생존율에서 더 현저한 차이를 나타내는 것으로 보인다.
생존율을 또한, 해동 직후로부터 72시간까지 2 내지 8℃에서의 해동 후 저장의 긴 기간에 걸쳐 평가하였다. 결과는 도 14에 제공된다.
도 13 및 14의 결과는, 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 동결보존 배지 단독, 또는 저장 배지 단독에 포함될 때에도 기준 항목에 비해 유익한 보호 효과를 제공하였지만, 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 동결보존 배지 및 저장 배지 둘 다에 포함될 때 가장 유익한 보호 효과를 제공하였음을 나타낸다.
RI 및 TI2의 직접적인 비교는 효모-유래 재조합 혈청 알부민을 단지 저장 배지에 제공하는 것의 이점을 보여준다. 생존율을, 유동 세포계측법에 대한 괴사 (7AAD) 및 세포사멸 세포 (아넥신 V) 둘 다를 고려한 이중 염색 프로토콜로 해동 후 하기 시점: 0시간, 24시간 초과, 48시간 및 72시간에서 평가하였다. 괴사 세포 (PI)와 세포사멸 세포 (아넥신 V)도 고려한 뉴클레오카운터에 대하여 삼중 염색법을 사용하였다. 유동 세포계측기가 크기 및 형태에 따라 세포를 게이팅한 반면, 뉴클레오카운터는 제3 염색 획스트(Hoechst)로 세포를 선택하였다. 결과는 도 15에 나타나 있다.
결과는, 해동 후, RI 샘플로부터의 세가지 중 단지 하나의 세포주만 일상적인 허용 기준 (생존율＞70%)을 충족함을 보여준다. 반면, TI2로부터의 모든 세포주는 70% 초과의 생존율을 보였다. 해동되고 AlbIX®로 컨디셔닝된 TI2는 모든 시험 시점에서 보다 높은 백분율의 생존율을 보였다.
RI 및 TI2에 대한 데이터를, t=0h에서 해동 직후 관찰된 생존율의 초기%에 의해 영향받지 않는 시간 경과에 따른 생존율의 변동을 평가하기 위해 정규화하였다. 이 시험의 목적을 위해, 시점 0h는 각 샘플에 대해 100%의 생존율을 갖는 시점으로 고려되고, 이 시점으로부터의 생존율 감소를 이 값에 대해 평가하였다. 데이터는 도 16에 나타낸 바와 같이 각 세포주에 대해 플롯팅되었다.
유동 세포계측법 및 뉴클레오카운터 둘 다에서 생존율 감소의 유사한 경향이 관찰되었다. 두 장치 모두에서, 정규화된 생존율 감소의 유의한 차이가 t=48 시간으로부터 관찰되었는데, 여기서 생존율 감소는 알부테인™과 함께 해동된 RI에 비해 AlbIX®와 함께 해동된 TI2에서 더 낮았다. 기준 항목에 대한 생존율 감소가 t=24에서 이미 유의하였지만, 생존율 감소는 t=48시간에서 유의하게 되었다 (데이터는 나타내지 않음).
데이터는, AlbIX와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민은 2 내지 8℃에서 나타나는 생존율 감소를 약화시킴으로써, 알부테인®과 같은 혈장-유래 알부민에 비해 산물의 안정성을 유의하게 증가시켰음을 보여준다.
저장 배지에서의 AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민의 유익한 효과가, 효모-유래 재조합 혈청 알부민을 동결보존 배지에 추가적으로 포함시킴으로써 변형되는지 여부를 결정하기 위해, 추가의 시험이 수행되었다. TI1 및 TI3을 비교하는 세포사멸 분석의 결과가 도 17에 제공된다.
상기한 바와 같이, TI1은 동결보존 배지에서 AlbIX®를 사용하지만 저장 배지에서 알부틴TM을 사용하는 것을 특징으로 하며; TI3는 동결보존 배지 및 저장 배지 둘 다에서 AlbIX®를 사용하는 것을 특징으로 한다.
결과는, TI3이 모든 시점을 따라 더 높은 생존율을 가졌음을 보여준다. 데이터 정규화 (나타내지 않음) 후, 데이터는, 생존율 감소가 각 시점에서 TI1의 경우보다 TI3의 경우에 더 낮음을 나타내었다. 이러한 결과는, 저장 배지에서 AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민의 유익한 효과를 입증한다. 유익한 효과는 동결보존 배지 중의 포함에만 한정되지 않으며, 동결보존 배지의 특정 동일성에 의존하지도 않는다 (동결보존 및 저장 배지 둘 다에서의 AlbIX®에서 최선의 결과가 얻어지지만).
RI 및 TI3의 비교는, AlbIX®와 같은 재조합 혈청 알부민을 동결보존 배지 및 저장 배지 둘 다에 포함시키는 것 (TI3)의 이점을, 두 배지 (RI)에서의 알부테인TM의 사용과 비교하여 직접적으로 보여준다. 그 결과는 도 18에 나타나 있으며, 이는 생존율이 모든 시점에서 TI3의 안정성 연구에서 유의하게 더 높았음을 나타낸다. 이러한 차이는 해동 후 저장의 보다 긴 기간에 걸쳐 증가하는 경향이있다.
RI 및 TI3 (데이터는 나타내지 않음)을 비교하는 데이터의 정규화 후, 각 시점에서 생존율 감소가 TI3보다 RI에서 더 컸고, TI3은 RI뿐만 아니라 평가된 다른 시험 항목과 비교했을 때 시간 경과에 따른 생존율 감소가 가장 낮은 최선의 조건인 것으로 관찰되었다.
AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민은 산물의 안정성을 개선시키는 것으로 결론지었다. 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 동결보존 배지 단독, 저장 배지 단독, 또는 둘 다에 포함될 때 유익한 효과가 얻어질 수 있다.
세포사멸 분석:
세포사멸 분석에 의한 RI 및 TI2 샘플의 비교 결과가 도 19a에 제공된다. t=24시간으로부터, 두 항목간에 명확한 유의한 차이가 관찰되었다 (아노바 시닥 다중 비교 시험). 데이터 정규화 후, t=0시간으로부터 72시간까지, 초기 세포사멸 세포의 현저한 감소가 두 항목 모두에서 관찰되었으며, 이는 저장 기간 동안 초기 세포사멸로부터 후기 세포사멸로 전환하는 일반적인 과정을 나타낸다. 그러나 t=24 및 t=48시간에서 RI와 TI2간에 명확한 차이가 있었다. 데이터는, RI 샘플에 비해 TI2에서의 후기 세포사멸로의 전환 감소를 보여주며, 이는 AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 후기 세포사멸로 진입되는 세포의 과정을 늦출 수 있다는 결론을 뒷받침한다.
이러한 결과로부터, 본 발명자들은 AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민은 초기 세포사멸 상태에서 해동 후 저장에서 동결보존된 줄기세포의 유지를 지원하고, 후기 세포사멸로의 전환을 감소시키며, 저장 배지에서 안정화제로 사용되는 경우 세포 산물의 안정성을 증가시킨다고 결론지었다.
세포사멸 분석에 의한 TI1 및 TI3 샘플의 비교 결과가 도 19b에 제공된다. 데이터는, 저장 배지 중의 안정화제로서의 AlbIX와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민이, 동결보존 배지 중의 알부민의 동일성과 상관없이, 후기 세포사멸 상태를 향한 세포의 전환을 늦출 수 있다는 결론을 뒷받침한다.
세포사멸 분석에 의한 RI 및 TI3 샘플의 비교 결과가 도 19c에 제공된다. 결과는, 초기 세포사멸 세포의 백분율이 안정성 시험 도안 모든 시점에서 RI와 TI3 사이에서 유의하게 다르다는 것을 보여준다. 유사하게, 이 두 항목 사이의 후기 세포사멸 세포의 백분율의 차이 또한 유의하였다. 이러한 데이터는, AlbIX®와 같은 효모-유래 재조합 혈청 알부민이 해동 후 저장 동안 후기 세포사멸로 세포 진입을 늦추는 능력을 가짐을 추가로 확인시킨다.
실시예 5
식물-유래 알부민 산물에 대한 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파의 비교
상기한 바와 같이, 본원의 설명에서, 문헌 [Frahm et al, 2014, PLOS One, 9 (1): e109893] (이것의 내용은 본원에 참고로 포함됨)은, 재조합 효모-유래 재조합 혈청 알부민 (특히 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파)의 특성을 다른 재조합 식물-유래 혈청 알부민 산물과, 혈장-유래 혈청 알부민 및 재조합 식물-유래 혈청 알부민 산물과 비교한 연구를 보고하였다.
재조합 효모-유래 혈청 알부민 산물은, 다른 공급원으로부터 (예를 들어, 혈장, 또는 다른 재조합 공급원, 예컨대 식물로부터) 얻은 혈청 알부민 조성물과 많은 물리적 차이를 나타내었다. 또한, 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파 산물은 피키아로부터 얻은 다른 재조합 효모-유래 혈청 알부민과 일부 명확한 차이를 보였다.
본 실시예는 추가의 차이점을 나타낸다.
산물에 대한 요약을 하기 표에 나타내었다. 기재된 모든 재조합 알부민은 생물약제 용도로 의도된다.
Figure pct00014
"표지된 순도"란 컬럼 제목은 제조업체가 산물 시트 상에 나타낸 순도 수준을 나타낸다.
순도 및 균질성:
재조합 알부민과 같은 단백질 부형제의 순도를 이해하는 것은 복잡하다. 숙주 세포 단백질 수준 및 부형제와 같은 최종 제제의 다른 성분의 존재를 이해하는 것 외에도, 또한 단백질 자체의 균질성에 주의를 기울여야 한다. 당화되거나 부분적으로 분해된 단백질과 같은 상당량의 단백질의 변형된 형태의 존재는, 규제 당국에 대한 물질의 허용성을 감소시킬뿐만 아니라 단백질의 기능에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
이 실시예에서 시험된 모든 시판용 재조합 알부민은 전기영동에 기초하여 제조업체-지시된 단백질 순도 규격이 95 내지 99%이다. 이것이 파라미터를 결정하기 위한 표준 기술이지만, 단백질의 이질성을 완전히 해결하지는 못한다. 본 발명자들은 질량 분광 분석에 의한 시판용 재조합 알부민에 대한 상세한 분석을 수행하였으며 데이터는 도 1에 제시되어 있다. 이러한 데이터는 도 2의 비교용 겔 전기영동 데이터와 함께 제시된다.
겔 전기영동에 의한 비교적 유사하게 표지된 순도 요구에도 불구하고, 질량 분광 분석은 보다 흥미로운 도을 나타낸다. 자연적 인간 혈청 알부민 분자를 대표하는 단일 종을 나타내는 66.4 kDa에서의 단일 종을 주로 나타내었다. 반면, 평가된 다른 시판용 재조합 알부민 샘플은 모두, 최종 제제에서 단백질의 부분적으로 분해된 또는 당화된 형태를 나타내는 다중 피크를 함유하였다. 아마도 가장 눈에 띄는 질량 스펙트럼은 공급자 1의 쌀-유래 산물에 대해 기록되었을 것이다 (도 1 (b)). 이 산물은 평가된 질량 범위에서 ~ 40개 피크를 나타내었다. 이 분석에 기초하여, 존재하는 단백질 중 단지 적은 비율이 자연적 인간 혈청 알부민이라는 것이 명백하다. 이는 >96% (w/w)의 표지된 순도 요구에도 불구하고 그렇다.
시각적 외관:
시각적 외관은 종종 산물의 색 및 선명도를 검사하기 위해 수행된 최초의분석 시험 중 하나이다. 이 파라미터는 산물 품질 및 순도의 직접적 지표로 종종 고려되기 때문에 중요한다. 물질이 비교적 다량으로 존재할 수 있는 경우, 부형제로 인한 산물 착색의 현저한 증가는 바람직하지 않을 수 있다.
도 3에 나타낸 이미지는, 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파가 평가된 산물 중에서 가장 덜 착색되었으며, 두 산물 모두 투명/담황색을 가짐을 입증한다. 대안적 산물은, 최대 착색을 나타내는 공급원 1로부터의 알부민 (쌀-유래 산물)에서 착색 수준이 증가하며, 최종 산물은 오렌지/호박색을 가짐을 보여주었다.
기능적 특성화:
알부민 분자는 제제 안정화를 위한 천연 항산화제인 천연 유리 티올기를 함유한다. 이 기는 천연 알부민 분자에 내재되어 있지만, 불량한 저장 및 가공으로 인해 산화되고 비-활성화될 수 있다.
본 실시예에 기재된 시판용 재조합 알부민의 유리 티올 함량이 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00015
산물마다 유리 티올 수준이 달라지며, 효모-유래 재조합 알부민 산물이서 가장 높은 수준의 유리 티올 함량을 나타낸다는 것이 분명하다. 리콤부민® 프라임 및 리콤부민® 알파는 시험된 모든 알부민 중 최고 수준을 보여주었다. 쌀로부터 유래된 시판용 알부민 1은 거의 완전히 블록킹되어있다.
실시예 6
효모-유래 재조합 알부민, 식물-유래 재조합 알부민 산물, 또는 혈장-유래 알부민의 존재 하에 줄기세포 배양의 비교
이 연구의 목적은 인간 배아 줄기세포 (hESC) 배양 응용에서 세포 배양 보충제로 사용하기 위한 6가지 인간 혈청 알부민 (HSA) 샘플의 적합성을 평가하는 것이었다.
시험된 샘플은 하기와 같다:
· 샘플 1, 3, 4 및 5: 효모-유래 재조합 HSA (AlbIX®)의 상이한 로트.
· 샘플 2: 시그마로부터 입수가능한 플라스마-유래 HSA (A 9080).
· 샘플 6: 시그마로부터 입수가능한 식물-유래 재조합 HSA, 셀라스팀™ (A9731).
8 통과에 대해 제노프리(xenofree) 세포 배양 시스템에서 이전에 배양된 두가지 상이한 hESC 계통 (SA121 및 SA181)을 상이한 시험 샘플 각각을 함유하는 제노프리 배지로 옮기고, 추가 7 통과 후, 이들을 면역세포화학 및 QPCR에 의해 다분화능 마커의 발현에 대해 분석하였다. DEF-CS™ (상업적으로 입수가능한 화학적으로 정의된 인간 iPS 세포 배양 배지) 및 AlbIX®를 함유하는 제노프리 배지를 본 연구의 대조군으로 사용하였다.
세포를 각 통과에서 카운팅하고, 배증 시간을 식 Td = t×[log2/log(수확시 세포의 밀도/분주시 세포의 밀도)]를 사용하여 계산하였고, 여기서 t는 통과 사이의 시간 (시간)이다. 이어서, 평균 배증 시간을 시험 배지 각각에 대해 계산하고, 데이터를 터키 쌍체 비교로 일원 아노바에 의해 분석하였다.
결과
효모-유래 재조합 HSA (샘플 1, 3, 4 및 5)는, 7 통과의 SA121 및 SA181 세포주 둘 다의 미분화 성장을 지원하였기 때문에, hESCs를 위한 배지 보충제로서 사용하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. QPCR 및 면역세포화학 분석은, 시험된 분화 마커의 발현 수준이 낮은 이들 배양물에서 다분화능 마커의 균일한 발현을 입증하였다. 샘플 1, 3, 4 및 5에서 얻은 결과는 두 대조군 모두와 유리하게 비교된다.
혈장-유래 HSA (샘플 2)는, SA181 세포주의 미분화 성장을 지원하지 못하였기 때문에 부적합한 것으로 밝혀졌다, SA121 세포는 이 HSA를 함유하는 배지에서 잘 성장하였다.
식물-유래 재조합 HSA, 셀라스팀™ (샘플 6)은, SA121 또는 SA181 세포주의 성장을 지원할 수 없었기 때문에, hESC 배양 응용에 부적합한 것으로 밝혀졌다.
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따라서, 본 발명은 하기 번호의 단락에 의해 정의된 바와 같은 주제를 제공한다:
1. 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하는 단계, 및 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 단계를 포함하되,
선택적으로, 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 추가로 포함하되,
여기서 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 것인, 줄기세포의 보존 방법.
2. 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 포함하며,
여기서 줄기세포는 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 후 저장되고;
여기서 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 것인, 줄기세포의 보존 방법.
3. 제1 단락 또는 제2 단락에 있어서, 줄기세포를 동결보존 배지에서 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 단계, 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 포함하며,
여기서 동결보존 배지 및/또는 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 것인 방법.
4. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 줄기세포와 혼합시, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지 중에 존재하는 것인 방법.
5. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 상기 동결보존 배지 중에 존재하고, 또한 상기 저장 배지 중에도 존재하는 것인 방법.
6. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포를 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장하는 것인 방법.
7. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포를 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 저장 배지에 저장하고; 그리고
선택적으로, 줄기세포를 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장하고, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과,
예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상인 방법.
8. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 방법:
(c) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(d) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
9. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이:
(d) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(e) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 단량체이고/거나;
(f) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖고, 이와 관련하여 사용되는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 적용되는 용어 "중합체"는 단량체 및 이량체 형태와는 구별되는 것인 방법.
10. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지는 것인 방법.
11. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 포함하지 않는 것인 방법.
12. 제11 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않는 것인 방법.
13. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않는 것인 방법.
14. 제13 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않는 것인 방법.
15. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제를 전혀 갖지 않는 것인 방법.
16. 제15 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않는 것인 방법.
17. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않는 것인 방법.
18. 제17 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않는 것인 방법.
19. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는 것인 방법.
20. 제19 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는 것인 방법.
21. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제인 방법.
22. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상의 성분, 예컨대 이들 모두를 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖는 것인 방법.
23. 제20 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상의 성분, 예컨대 이들 모두를 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖는 것인 방법.
24. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖는 것인 방법.
25. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이, 질량 분광 분석 시험시, 재조합 식물-유래 혈청 알부민 단백질 (예컨대, 도 1에 나타낸 샘플)에 비해 (자연적인 온전한 인간 혈청 알부민 분자를 나타내는) 약 66.4 kDa에서의 주요 피크와는 구별되는 피크를 실질적으로 거의 나타내지 않는 (예컨대, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만 또는 그 미만으로 나타내는) 것인 방법.
26. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하는 것인 방법.
27. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하는 것인 방법.
28. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하는 것인 방법.
29. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 약 11개, 1 내지 약 8개, 1 내지 약 5개, 1 내지 약 4개, 1 내지 약 3개, 1 내지 약 2개, 약 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하는 것인 방법.
30. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가 식물-특이적 당에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함하는 것인 방법.
31. 제30 단락에 있어서, 식물-특이적 당이 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스부터 선택되는 것인 방법.
32. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 동결보존 배지가 재조합 혈청 알부민 제제 및 동결보존제를 포함하되,
선택적으로, 여기서 동결보존 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 동결보존제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고,
바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖고,
가장 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나, 여기서 이온성 완충제는 플라스마라이트®인 방법.
33. 제32 단락에 있어서, 동결보존 배지가 줄기세포 배양 성장 배지가 아니고, 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않고, 더욱 바람직하게는 전형적인 줄기세포 배양 배지의 성분, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 전혀 포함하지 않는 것인 방법.
34. 제32 단락 또는 제33 단락에 있어서, 동결보존제가 디메틸술폭시드 (DMSO), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜 (EG), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
35. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 저장 배지가 재조합 혈청 알부민 제제를 포함하되,
선택적으로, 여기서 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고,
바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖고,
가장 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나, 여기서 이온성 완충제는 플라스마라이트®인 방법.
36. 제35 단락에 있어서, 저장 배지가 줄기세포 배양 성장 배지가 아니고, 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않고, 더욱 바람직하게는 전형적인 줄기세포 배양 배지의 성분, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 전혀 포함하지 않는 것인 방법.
37. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 동결보존 배지 및/또는 저장 배지가 혈청-유래 알부민 제제의 하나 이상의 성분, 예를 들어 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스 및/또는 N-아세틸 트립토판으로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성분 (예컨대, 모두)을 포함하지 않고, 바람직하게는 옥타노에이트 및/또는 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않는 것인 방법.
38. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포가 인간 줄기세포인 방법.
39. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포가 다분화능 줄기세포 (예컨대, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 유도된 다분화능 줄기세포), 다능성 줄기세포 (예컨대, 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 골수, 제대혈 또는 제대로부터 선택적으로 유래될 수 있는 간엽 줄기세포; 골수 또는 말초 혈액으로부터 선택적으로 유래될 수 있는 조혈 줄기세포; 신경 줄기세포; 또는 배아 줄기세포) 또는 단능성 줄기세포 (예컨대, 간세포가 될 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
40. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포가 비-인간 줄기세포인 방법.
41. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로 2 내지 8℃의 온도에서, 또한 추가로 선택적으로 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 저장 배지에 줄기세포를 저장하는 단계를 포함하며,
여기서 저장 배지에 줄기세포를 저장하는 단계 후에 직접적 또는 간접적으로, 줄기세포를 배양하는 단계; 줄기세포의 배양액을 확장시키는 단계; 줄기세포를 분화시키는 단계; 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양된 및/또는 분화된 세포를, 예를 들어 조직 또는 의료용 이식물 내에 고정화시키는 단계; 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양된 세포 및/또는 분화된 세포 또는 다른 산물을, 약학적으로 허용가능한 조성물 또는 수의학적으로 허용가능한 조성물에서 제형화하는 단계; 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양된 세포 및/또는 분화된 세포 또는 다른 산물을 환자에게 투여하는 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는 방법.
42. 상기 단락 중 어느 하나에 있어서, 저장 배지에 줄기세포를 저장하는 것을 포함하며, 여기서 저장 후, 줄기세포가, 예를 들어 골세포, 심장세포, 췌장 베타 세포, 신경세포, 섬유아세포, 심근세포, 골아세포 및/또는 연골세포로부터 선택된 세포 유형으로 분화되는 것인 방법.
43. 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 동결보존제를 포함하는, 줄기세포의 동결보존을 위한 동결보존 배지.
44. 제43 단락에 있어서, 동결보존제가 디메틸술폭시드 (DMSO), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜 (EG), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결보존 배지.
45. 제43 단락 또는 제44 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 동결보존제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고,
바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖고,
가장 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나, 여기서 이온성 완충제는 플라스마라이트®인 동결보존 배지.
46. 제43 단락 내지 제45 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포를 추가로 포함하되,
선택적으로, 여기서 줄기세포는 다분화능 줄기세포 (예컨대, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 유도된 다분화능 줄기세포), 다능성 줄기세포 (예컨대, 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 골수, 제대혈 또는 제대로부터 선택적으로 유래될 수 있는 간엽 줄기세포; 골수 또는 말초 혈액으로부터 선택적으로 유래될 수 있는 조혈 줄기세포; 신경 줄기세포; 또는 배아 줄기세포) 또는 단능성 줄기세포 (예컨대, 간세포가 될 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결보존 배지.
47. 제46 단락에 있어서, 동결된 동결보존 배지.
48. 제47 단락에 있어서, 동결된 후 해동된 줄기세포를 포함하는, 동결보존 배지.
49. 제43 단락 내지 제48 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 줄기세포와 혼합시, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로, 동결보존 배지 중에 존재하는 것인 동결보존 배지.
50. 제43 단락 내지 제49 단락 중 어느 하나에 있어서, 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 동결보존 배지:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
51. 제43 단락 내지 제49 단락 중 어느 하나에 있어서, 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97% 단량체이고/거나;
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖는 것인 동결보존 배지.
52. 제43 단락 내지 제51 단락 중 어느 하나에 있어서,
(a) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고/거나;
(b) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않고/거나;
(c) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않고/거나;
(d) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않고/거나;
(e) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않고/거나;
(f) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않고/거나;
(g) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제이고/거나;
(h) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 동결보존 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상, 예컨대 모든 성분을 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고/거나;
(i) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖고/거나;
(j) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(k) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(l) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(m) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(n) 동결보존 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함하는 것인, 동결보존 배지.
53. 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포의 저장을 위한 저장 배지로서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는, 저장 배지.
54. 제53 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 이온성 완충제의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고,
여기서 이온성 완충제는 전해질의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고, 예를 들어 여기서 전해질은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 클로라이드 이온, 아세테이트 이온, 포스페이트 이온, 및/또는 글루코네이트 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 인간 생리학적 혈장의 것을 모방한 전해질 농도, 삼투압 및/또는 pH를 갖고,
더욱 바람직하게는, 여기서 이온성 완충제는 줄기세포에 대해 실질적으로 등장성이고/거나, 여기서 이온성 완충제는 플라스마라이트®인 저장 배지.
55. 제53 단락 또는 제54 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 줄기세포와 혼합시, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로, 저장 배지 중에 존재하는 것인 저장 배지.
56. 제53 단락 내지 제55 단락 중 어느 하나에 있어서, 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인 저장 배지:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
57. 제53 단락 내지 제56 단락 중 어느 하나에 있어서, 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97% 단량체이고/거나;
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖는 것인 저장 배지.
58. 제53 단락 내지 제57 단락 중 어느 하나에 있어서,
(a) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 전적으로 이루어지고/거나;
(b) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않고/거나;
(c) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않고/거나;
(d) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 전혀 갖지 않고/거나;
(e) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않고/거나;
(f) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않고/거나;
(g) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제이고/거나;
(h) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 저장 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상, 예컨대 모든 성분을 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고/거나;
(i) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖고/거나;
(j) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(k) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(l) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(m) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(n) 저장 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함하는 것인, 저장 배지.
59. 제53 단락 내지 제58 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포를 추가로 포함하되,
선택적으로, 여기서 줄기세포는 다분화능 줄기세포 (예컨대, 배아 줄기세포, 배아 생식 세포, 유도된 다분화능 줄기세포), 다능성 줄기세포 (예컨대, 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 골수, 제대혈 또는 제대로부터 선택적으로 유래될 수 있는 간엽 줄기세포; 골수 또는 말초 혈액으로부터 선택적으로 유래될 수 있는 조혈 줄기세포; 신경 줄기세포; 또는 배아 줄기세포) 또는 단능성 줄기세포 (예컨대, 간세포가 될 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 저장 배지.
60. 제59 단락에 있어서, 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포를 추가로 포함하는, 저장 배지.
61. 제60 단락에 있어서, 제43 단락 내지 제52 단락 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포를 추가로 포함하는, 저장 배지.
62. 제53 단락 내지 제61 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포를 추가로 포함하되, 이것이 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장되는 것인, 저장 배지.
63. 제53 단락 내지 제62 단락 중 어느 하나에 있어서, 줄기세포, 선택적으로 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨진 줄기세포를 추가로 포함하되, 여기서 줄기세포는 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 저장 배지에 저장되는 것인, 저장 배지.
64. 제63 단락에 있어서, 줄기세포, 선택적으로 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후, 저장 배지로 옮겨거나 (또는 다른 생리학적 쇼크를 받은 후에 저장 배지로 옮겨졌으며), 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장된 줄기세포를 추가로 포함하되, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상인 저장 배지.
65. 제63 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이, 줄기세포와 혼합시, 2% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)로 저장 배지 중에 존재하고,
여기서 저장 배지는 줄기세포, 선택적으로 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후 저장 배지로 옮겨거나 (또는 다른 생리학적 쇼크를 받은 후에 저장 배지로 옮겨졌으며), 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 저장 배지에 저장된 줄기세포를 추가로 포함하되,
여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과, 예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상인, 저장 배지.
66. 제63 단락에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이, 줄기세포와 혼합시, 5% (w/v)±1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1% (w/v)로 저장 배지 중에 존재하고,
여기서 저장 배지는 줄기세포, 선택적으로 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후 저장 배지로 옮겨거나 (또는 다른 생리학적 쇼크를 받은 후에 저장 배지로 옮겨졌으며), 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 저장 배지에 저장된 줄기세포를 추가로 포함하되,
여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% 또는 그 초과,
예컨대 약 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% 또는 그 초과인 저장 배지.
67. 줄기세포의 보존을 위한 제43 단락 내지 제52 단락 중 어느 하나에 따른 동결보존 배지의 용도.
68. 제67 단락에 있어서, 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서의 줄기세포의 저장 후 생존가능 상태의 줄기세포의 보존을 위한 용도이며,
선택적으로, 여기서 저장 기간 종료시 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과,
예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상인, 동결보존 배지의 용도.
69. 제67 단락 또는 제68 단락에 있어서, 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서의 저장 전에, 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하고, 상기 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 것 (또는 줄기세포가 다른 생리학적 쇼크를 받게 하는 것)에 의한 줄기세포의 보존을 위한, 동결보존 배지의 용도.
70. 제69 단락에 있어서, 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서 저장 배지에 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의한 줄기세포의 보존을 위한, 동결보존 배지의 용도.
71. 제69 단락에 있어서, 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하고, 줄기세포를 생리학적 쇼크를 받게 하고, 상기 세포를 저장 배지로 옮기고, 상기 줄기세포를 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃에서 저장 배지에 저장하는 것에 의한 줄기세포의 보존을 위한, 동결보존 배지의 용도.
72. 제70 단락 또는 제71 단락에 있어서, 저장 배지가 제53 단락 내지 제66 단락 중 어느 하나에 따른 저장 배지인, 동결보존 배지의 용도.
73. 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 것에 의한 줄기세포의 보존을 위한, 제53 단락 내지 제66 단락 중 어느 하나에 따른 저장 배지의 용도.
74. 제73 단락에 있어서, 줄기세포가 동결보존 배지에서 동결되고, 해동된 후 저장 배지로 옮겨진 후 저장된 것인, 저장 배지의 용도.
75. 제73 단락에 있어서, 줄기세포가 동결보존 배지와 혼합되고, 생리학적 쇼크를 받고, 저장 배지로 옮겨진 후 저장된 것인, 저장 배지의 용도.
76. 제74 단락 또는 제75 단락에 있어서, 동결보존 배지가 제43 단락 내지 제52 단락 중 어느 하나에 따른 동결보존 배지인, 저장 배지의 용도.
77. 동결보존된 줄기세포의 해동 후 생존율을 개선시키기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
78. 제77 단락에 있어서, 상기 개선이 동일한 농도로 사용된 혈장-유래 혈청 알부민과 비교되는 것인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
79. 제77 단락 또는 제78 단락에 있어서, 상기 개선이 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장시, 해동 후 줄기세포에서 관찰가능한 것인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
80. 제77 단락 내지 제79 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 이를 동결보존 배지로 제형화시키고, 동결보존 배지를 줄기세포와 혼합한 후 동결시킴으로써 사용되고, 선택적으로, 여기서 동결보존 배지는 제43 단락 내지 제52 단락 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 배지인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
81. 제77 단락 내지 제80 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 이를 저장 배지로 제형화시키고, 저장 배지를 줄기세포와 혼합한 후 해동시킴으로써 사용되고, 선택적으로, 여기서 저장 배지는 제53 단락 내지 제66 단락 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 배지인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
82. 생리학적 쇼크를 받은 줄기세포의 생존율을 개선시키기 위한, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
83. 제82 단락에 있어서, 상기 개선이 동일한 농도로 사용된 혈장-유래 혈청 알부민의 사용과 비교되는 것인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
84. 제82 단락 또는 제83 단락에 있어서, 상기 개선이 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장 배지에 저장시, 쇼크 후 줄기세포에서 관찰가능한 것인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
85. 제82 단락 내지 제84 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 이를 동결보존 배지로 제형화시키고, 동결보존 배지를 생리학적 쇼크 이전의 줄기세포와 혼합함으로써 사용되고, 선택적으로, 여기서 동결보존 배지는 제43 단락 내지 제52 단락 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 배지인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
86. 제82 단락 내지 제86 단락 중 어느 하나에 있어서, 재조합 효모-유래 혈청 알부민은, 이를 저장 배지로 제형화시키고, 저장 배지를 생리학적 쇼크를 받은 후의 줄기세포와 혼합함으로써 사용되고, 선택적으로, 여기서 저장 배지는 제53 단락 내지 제66 단락 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 배지인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
87. 초기 세포사멸로부터 후기 세포사멸로의 세포의 전환을 예방, 지연 또는 감소시키는 방법으로서, 세포 (예를 들어, 동물 세포, 인간 세포, 및 바람직하게는 줄기세포)를 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지와 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
88. 초기 세포사멸로부터 후기 세포사멸로의 세포 (예를 들어, 동물 세포, 인간 세포, 및 바람직하게는 줄기세포)의 전환을 예방, 지연 또는 감소시키기 위한, 예를 들어, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지 형태의, 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제의 용도.
89. 세포가 생체외 세포인, 제87 단락의 방법 또는 제88 단락의 용도.
90. 세포를 생리학적 쇼크를 받기 이전 및/또는 이후에 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지와 혼합하는, 제87 단락 또는 제89 단락의 방법 또는 제88 단락 또는 제89 단락의 용도.
91. 제90 단락에 있어서, 생리학적 쇼크가 열 쇼크, 저온 쇼크, 삼투 쇼크, 표면 상호작용, 전단 응력, 영양 결핍, 독성 화합물에 대한 노출, 대사 물질에 대한 노출, 및/또는 대사 물질의 결핍, 효소에 대한 노출 및/또는 효소의 결핍, 화학적 쇼크, pH 쇼크, 유기 용액에 대한 노출, 및 전단력에 대한 노출, 표면 노출, 및/또는 표면 노출 손실로부터 선택되고, 선택적으로 동결보존 동안 동결 및/또는 해동 단계 중 하나 이상에 기인한 쇼크일 수 있는 것인 방법 또는 용도.
92. 초기 세포사멸이, 예를 들어 유동 세포계측법을 사용하여 측정시, 아넥신 (예컨대, 아넥신 V) 결합을 나타내지만, 요오드화프로피듐 (PI) 및/또는 7-아미노악티노마이신 D (7AAD) 봉입체(inclusion)는 나타내지 않는 세포를 특징으로 하는 것인, 제87 단락 또는 제89 단락 내지 제91 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제91 단락 중 어느 하나의 용도.
93. 제92 단락에 있어서, 초기 세포사멸이 추가로, 바람직하게는 아넥신 결합과 조합되며 PI 및/또는 7AAD 봉입체는 없는, 생리학적 쇼크를 받지 않은 동일한 세포 배치 (batch)에서 관찰된 수준보다 더 높은 미토콘드리아 투과성을 특징으로 하는 것인 방법 또는 용도.
94. 후기 세포사멸이, 아넥신 (예컨대, 아넥신 V) 결합을 나타내며 또한 요오드화프로피듐 (PI) 포함 및/또는 7-아미노악티노마이신 D (7AAD) 봉입체를 나타내는 세포를 특징으로 하는 것인, 제87 단락 또는 제88 단락 내지 제93 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제93 단락 중 어느 하나의 용도.
95. 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제가, 약 0.01% (w/v) 초과 및 10% (w/v) 미만, 약 9% (w/v) 미만, 약 8% (w/v) 미만, 약 7% (w/v) 미만, 또는 약 6% (w/v) 미만의 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 1% (w/v), 약 2% (w/v), 약 3 (w/v) 또는 약 4% (w/v)의 농도를 제공하기에 적합한 양으로 세포와 혼합되는 것인, 제87 단락 또는 제88 단락 내지 제94 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제94 단락 중 어느 하나의 용도.
96. 세포가 2 내지 8℃의 온도에서 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지에 저장되는 것인, 제87 단락 또는 제88 단락 내지 제95 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제95 단락 중 어느 하나의 용도.
97. 세포가 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는 배지에 저장되고;
선택적으로, 여기서 세포는 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간, 또는 그 이상의 기간 동안 2 내지 8℃의 온도에서 저장되고, 여기서 저장 기간 종료시 세포사멸의 초기에 있는 세포의 백분율은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 초과,
예컨대 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상인,
제87 단락 또는 제88 단락 내지 제96 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제96 단락 중 어느 하나의 용도.
98. 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 것인, 제87 단락 또는 제88 단락 내지 제97 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제97 단락 중 어느 하나의 용도:
(a) 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 콘카나발린 A에 대한 결합성; 및/또는
(b) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
99. 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이:
(a) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고/거나;
(b) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97% 단량체이고/거나;
(c) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 갖는 것인, 제87 단락 또는 제88 단락 내지 제98 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제98 단락 중 어느 하나의 용도.
100. (a) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨) 및 밸런싱 음이온 (예컨대, 클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 전적으로 이들로 이루어지고/거나;
(b) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 18mM, 16mM, 15mM, 14mM, 12mM, 10mM, 8mM, 6mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 옥타노에이트를 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 옥타노에이트를 전혀 갖지 않고/거나;
(c) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM 이하의 전체 지방산 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 지방산을 전혀 갖지 않고/거나;
(d) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 200mg·L-1, 150mg·L-1, 100mg·L-1, 90mg·L-1, 80mg·L-1, 70mg·L-1, 60mg·L-1, 50mg·L-1, 40mg·L-1, 30mg·L-1, 20mg·L-1, 15mg·L-1, 10mg·L-1, 5mg·L-1, 4mg·L-1, 3mg·L-1, 2mg·L-1, 1mg·L-1, 0.5mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 포함하거나, 계면활성제를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 계면활성제를 전혀 갖지 않고/거나;
(e) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 35mM, 32.5mM, 30mM, 28mM, 26mM, 24mM, 22mM, 20mM, 15mM, 10mM, 5mM, 4mM, 3mM, 2mM, 1mM, 0.5mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 전혀 갖지 않고/거나;
(f) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 갖지 않거나, 전혀 갖지 않고/거나;
(g) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질 제제는 리콤부민® 프라임 또는 이것과 유사한 제제; 리콤부민® 알파 또는 이것과 유사한 제제; 또는 AlbIX® 또는 이것과 유사한 제제로부터 선택된 제제이고/거나;
(h) 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및/또는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 선택적으로 줄기세포를 포함한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 배지는 헴, 프리칼리크레인 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 인간 바이러스로부터 선택된 하나 이상, 예컨대 모든 성분을 갖지 않고/거나, 200㎍·L-1 미만, 예컨대 180㎍·L-1, 160㎍·L-1, 140㎍·L-1, 120㎍·L-1, 100㎍·L-1, 90㎍·L-1, 80㎍·L-1, 70㎍·L-1, 60㎍·L-1, 50㎍·L-1, 또는 40㎍·L-1 미만, 보다 전형적으로는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고/거나;
(i) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 온전한 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 갖고/거나;
(j) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 약 96%, 약 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(k) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험시, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크가 제외되는 SEC 프로파일을 나타내고, 더욱 바람직하게는 피크 보유 시간이 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과인 피크가 제외되는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(l) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 시험시, 자연적 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(m) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고/거나;
(n) 배지 중에 존재하는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 식물-특이적 당, 예컨대 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함하는 것인,
제87 단락 또는 제88 단락 내지 제99 단락 중 어느 하나의 방법, 또는 제88 단락 내지 제99 단락 중 어느 하나의 용도.
본원에 개시된 구체적 측면은 본 발명의 여러 측면의 예시로서 의도되기 때문에, 본원에 기재되고 청구된 본 발명은 이들 측면에 의해 그 범위가 한정되지 않는다. 임의의 등가의 측면이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 실로, 본원에 나타내고 기재된 것들에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 개시내용이 우선시될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Albumedix A/S <120> Uses of Recombinant Yeast-Derived Serum Albumin <130> ALBBE/P64407PC <140> UNKNOWN <141> 2017-10-04 <150> 16192276.0 <151> 2016-10-04 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1758 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1758) <223> cDNA encoding HSA <400> 1 gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag 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caballus <400> 11 Met Lys Trp Val Thr Phe Val Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Leu Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala 20 25 30 His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Lys His Phe Lys Gly Leu Val Leu 35 40 45 Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Lys Cys Ala Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Ala Thr Tyr Gly Glu Leu Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Thr 115 120 125 His Lys Asp Asp His Pro Asn Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp 130 135 140 Ala Gln Cys Ala Ala Phe Gln Glu Asp Pro Asp Lys Phe Leu Gly Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Gly Pro Glu 165 170 175 Leu Leu Phe His Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Asp Phe Thr Glu Cys Cys 180 185 190 Pro Ala Asp Asp Lys Leu Ala Cys Leu Ile Pro Lys Leu Asp Ala Leu 195 200 205 Lys 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Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val 565 570 575 Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 580

Claims (19)

  1. 줄기세포를 보존하는 방법으로서, 상기 방법은 줄기세포를 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하는 단계, 및 상기 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 단계를 포함하되,
    선택적으로, 상기 방법은 상기 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 상기 저장 배지 중에 저장하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 상기 동결보존 배지 중에 존재하고, 또한 상기 저장 배지 중에도 존재하는, 방법.
  2. 줄기세포를 보존하는 방법으로서, 상기 방법은 줄기세포를 저장 배지에 저장하는 단계를 포함하되,
    상기 줄기세포는 동결보존 배지 중에서 동결되어 있고, 해동된 후, 저장되기 전에 상기 저장 배지로 옮겨졌으며; 그리고
    상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는 상기 동결보존 배지 중에 존재하고, 또한 상기 저장 배지 중에도 존재하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 상기 줄기세포를 동결보존 배지 중에 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생성하는 단계, 상기 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 상기 저장 배지로 옮기는 단계, 및 줄기세포를 상기 저장 배지 중에 저장하는 단계를 포함하고,
    상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하는, 방법
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 상기 줄기세포와 혼합될 때, 약 0.01% (w/v) 초과 내지 약 10% (w/v) 미만, 예컨대 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 바람직하게는 약 2% (w/v)의 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질의 농도를 제공하기에 적합한 양으로 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 줄기세포는 2 내지 8℃의 온도에서 상기 저장 배지 중에 저장되고; 그리고/또는
    (b) 상기 줄기세포는 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 상기 저장 배지 중에 저장되고; 그리고
    선택적으로, 상기 줄기세포는 2 내지 8℃의 온도에서, 24시간 초과, 예를 들어 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 저장되며, 저장 기간 종료시의 상기 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상을 초과하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은 하기 특성들 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    (e) 콘카나발린 (concanavalin) A에 대한 0.5% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.15% 미만의 결합성; 및/또는
    (f) 단백질 1몰당 0.6 몰 미만의 6탄당, 바람직하게는 단백질 1몰당 0.10, 0.075 또는 0.05 몰 미만의 6탄당의 당화 수준.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질이,
    (g) 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99.5%의 단량체 및 이량체, 바람직하게는 본질적으로 100%의 단량체 및 이량체이고;
    (h) 적어도 약 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 단량체이며; 그리고/또는
    (i) 약 1.0% (w/w), 0.1% (w/w) 또는 0.01% (w/w) 이하, 바람직하게는 그 미만의 알부민 중합체 함량을 가지며, 이와 관련하여 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질에 적용되는 용어 "중합체"는 단량체 및 이량체 형태와는 구별되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 양이온 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 바람직하게는 나트륨), 및 밸런싱 음이온 (클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 시트레이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드 또는 포스페이트), 물 및 선택적으로 옥타노에이트 및 폴리소르베이트 80을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지고,
    (b) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및/또는 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 그 자체는, 옥타노에이트를 35mM, 20mM, 10mM, 5mM, 1mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.001mM 미만으로 포함하거나, 옥타노에이트를 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 옥타노에이트를 포함하지 않고,
    (c) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및/또는 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 그 자체는, 35mM, 20mM, 10mM, 5mM, 1mM 이하의 지방산의 총 함량을 갖거나, 지방산을 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 지방산을 포함하지 않고,
    (j) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및/또는 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 그 자체는, 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (바람직하게는, 폴리소르베이트 80)를 200mg·L-1, 100mg·L-1, 50mg·L-1, 10mg·L-1, 1mg·L-1, 0.1mg·L-1, 0.01mg·L-1, 0.001mg·L-1 미만의 농도로 포함하거나, 계면활성제를 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 계면활성제를 포함하지 않고,
    (k) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및/또는 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 그 자체는, 35mM, 20mM, 10mM, 5mM, 1mM, 0.1mM, 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM 미만의 총 유리 아미노산 수준 및/또는 N-아세틸 트립토판 수준을 포함하거나, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판을 포함하지 않고;
    (l) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 및/또는 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 그 자체는, 옥타노에이트, 유리 아미노산 및/또는 특히 N-아세틸 트립토판, 및 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 80) 모두를 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 전혀 포함하지 않고;
    (m) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 레콤부민(Recombumin)® 프라임, 또는 이와 유사한 제제; 레콤부민® 알파, 또는 이와 유사한 제제; Albix®, 또는 이와 유사한 제제로부터 선택되는 제제이며;
    (n) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질, 및/또는 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 그 자체는, 헴(haem), 프레칼리크레인(prekallikrein) 활성제, 발열원, C형 간염 및/또는 사람 바이러스로부터 선택된 요소 중 하나 이상, 예컨대 모두를 포함하지 않으며, 그리고/또는 200㎍·L-1, 100㎍·L-1, 50㎍·L-1 미만이거나, 또는 약 10㎍·L-1 내지 약 30㎍·L-1의 범위 내의 알루미늄 농도를 갖고;
    (o) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 온전하거나 또는 실질적으로 온전한 N-말단 서열을 보유하고;
    (p) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 단백질은, 질량 분광 분석 시험시, 재조합 식물-유래 혈청 알부민 단백질 (예컨대, 도 1에 도시된 샘플)에 비해, 천연의 온전한 인간 혈청 알부민을 나타내는 약 66.4 kDa의 주요 피크와는 구별되는 피크가 실질적으로 거의 나타나지 않으며;
    (q) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 62% 초과, 예컨대 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%의 유리 티올기 함량을 갖는 알부민 단백질을 포함하며;
    (r) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시험될 때, 14분 미만 및 19분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크를 제외한 SEC 프로파일을 나타내며, 더욱 바람직하게는 14분 또는 15분 미만, 및 18분 초과의 피크 보유 시간을 갖는 피크를 배제하고;
    (s) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에서 시험될 때, 천연 단량체 형태의 알부민에 해당하는 단일 주요 피크를 나타내는 알부민 단백질을 포함하고;
    (t) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 질량 분광 분석 시험시, 단백질 1개당 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 미만, 예컨대 약 1 내지 11개, 1 내지 8개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개 또는 1개 미만의 6탄당 변형된 리신 및/또는 아르기닌 잔기를 나타내는 산물인 알부민 단백질을 포함하고; 그리고/또는
    (u) 상기 동결보존 배지 및/또는 상기 저장 배지 중에 존재하는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제는, 식물-특이적 당에 의해 당화되지 않은 알부민 단백질을 포함하되, 상기 식물-특이적 당이 α-1,3-푸코스 및/또는 β-1,2-자일로스로부터 선택되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 배지는 상기 재조합 혈청 알부민 제제 및 동결보존제를 포함하고, 그리고
    선택적으로, 상기 동결보존 배지는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제, 동결보존제 및 이온성 완충액의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지고; 그리고
    상기 동결보존 배지는 줄기세포 배양 성장 배지가 아니며, 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않으며, 더욱 바람직하게는 통상의 줄기세포 배양 배지의 성분들, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 포함하지 않는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하고, 그리고
    선택적으로, 상기 저장 배지는 상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 이온성 완충액의 수용액을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지며, 그리고
    상기 저장 배지는 줄기세포 배양 성장 배지가 아니며, 바람직하게는 줄기세포의 성장을 지원하지 않고, 더욱 바람직하게는 통상의 줄기세포 배양 배지의 성분들, 예컨대 비타민, 호르몬, 성장 인자, 철 공급원, 유리 아미노산 및/또는 포도당 중 어느 하나 이상 (예컨대, 모두)의 수준을 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 포함하지 않는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 선택적으로 2 내지 8℃의 온도에서, 그리고 추가로 선택적으로 24시간 초과, 예컨대 최대 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안, 줄기세포를 상기 저장 배지 중에 저장하는 단계를 포함하며, 그리고
    줄기세포를 상기 저장 배지 중에 저장하는 단계의 이후에 직접 또는 간접적으로, 상기 방법은 이하의 단계들로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    상기 줄기세포를 배양하는 단계; 상기 줄기세포의 배양액을 확장시키는 단계; 상기 줄기세포를 분화시키는 단계; 줄기세포, 또는 이로부터 유래된 배양 및/또는 분화된 세포를, 예를 들어 조직 또는 의료용 이식물 내에 고정시키는 단계; 줄기세포, 또는 배양 및/또는 분화된 세포, 또는 이들로부터 유래된 다른 산물을 약학적으로 허용가능한 조성물 또는 수의학적으로 허용가능한 조성물 중에 제형화시키는 단계; 상기 줄기세포, 또는 배양 및/또는 분화된 세포, 또는 이들로부터 유래된 다른 산물을 환자에게 투여하는 단계.
  12. 줄기세포의 동결보존을 위한 동결보존 배지로서, 상기 동결보존 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제 및 동결보존제를 포함하되, 바람직하게는 상기 동결보존 배지는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의해 정의된 동결보존 배지이고, 그리고
    선택적으로, 상기 동결보존 배지는 줄기세포를 추가로 포함하고,
    추가로 선택적으로, 상기 동결보존 배지는 동결되거나, 또는 동결 후 해동된 줄기세포를 포함하는 동결보존 배지인, 동결보존 배지.
  13. 동결보존 배지 중에서 동결시키고, 해동된 후 저장 배지로 옮겨진 줄기세포의 저장을 위한 저장 배지로서, 상기 저장 배지는 재조합 효모-유래 혈청 알부민 제제를 포함하되, 바람직하게는 상기 저장 배지는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 저장 배지이고, 그리고
    선택적으로, 상기 저장 배지는 줄기세포를 추가로 포함하고, 그리고
    추가로 선택적으로, 상기 줄기세포는 동결보존 배지 (예컨대, 제12항에서 정의한 바와 같은 동결보존 배지) 중에서 동결되고, 해동된 후, 상기 저장 배지로 옮겨진, 저장 배지.
  14. 제13항에 있어서, 동결보존 배지 중에서 동결되고, 해동된 후, 상기 저장 배지로 옮겨졌으며 (또는 상기 저장 배지로 옮겨지기 전에 다른 생리학적 쇼크를 받았고), 2 내지 8℃의 온도에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 상기 저장 배지에서 저장된 줄기세포를 추가로 포함하되, 저장 시기의 종료시 상기 줄기세포의 생존율이 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상을 초과하는, 저장 배지.
  15. 줄기세포의 보존, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 줄기세포를 저장한 후 생존가능한 상태의 줄기세포의 보존을 위한, 제12항에 따른 동결보존 배지의 용도로서,
    선택적으로, 저장 시기의 종료시 상기 줄기세포의 생존율은 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상을 초과하는, 동결보존 배지의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 이하를 위한 동결보존 배지의 용도:
    (a) 2 내지 8℃에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 저장하기에 앞서, 상기 줄기세포를 상기 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 동결시켜 동결된 줄기세포 산물을 생산하는 것에 의한 (또는 상기 줄기세포에 또 다른 생리학적 쇼크를 주는 것에 의한) 줄기세포의 보존;
    (b) 상기 동결된 줄기세포 산물을 해동시키는 단계, 해동된 세포를 저장 배지로 옮기는 단계, 줄기세포를 2 내지 8℃에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 상기 저장 배지 중에 상기 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의한, 줄기세포의 보존; 또는
    (g) 상기 줄기세포를 상기 동결보존 배지와 합쳐서 혼합물을 생성하고, 상기 줄기세포에 생리학적 쇼크를 주고, 상기 세포를 저장 배지로 옮기고, 줄기세포를 2 내지 8℃에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 상기 저장 배지 중에 저장하는 것에 의한, 줄기세포의 보존.
  17. 줄기세포의 보존을 위한, 제13항 또는 제14항에 따른 저장 배지의 용도로서,
    줄기세포는 저장 배지 중에 저장함에 의하며, 선택적으로
    (a) 상기 줄기세포는 동결보존 배지 중에 동결되고, 해동된 후, 저장되기 전에 상기 저장 배지로 옮겨지고, 바람직하게는 상기 동결보존 배지는 제12항에 따른 동결보존 배지이며; 그리고/또한
    (b) 상기 줄기세포는 동결보존 배지와 혼합되고, 생리학적 쇼크를 받은 후, 저장되기 전에 상기 저장 배지로 옮겨졌으며, 바람직하게는 상기 동결보존 배지는 제12항에 따른 동결보존 배지인, 저장 배지의 용도.
  18. 동결보존된 줄기세포의 해동후 생존율을 개선시키기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도로서, 선택적으로
    상기 개선은 동일한 농도로 사용된 혈장-유래 혈청 알부민과 비교되며;
    상기 개선은 2 내지 8℃에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 저장 배지 중에 저장되는 경우, 해동 후 줄기세포에서 관찰될 수 있으며;
    상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 이를 동결보존 배지 내에 제형화시키고, 동결 전에 줄기세포와 상기 동결보존 배지, 예컨대 제12항에서 정의된 동결보존 배지를 혼합함으로써 사용되고; 그리고/또는
    상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 이를 저장 배지에서 제형화시키고, 해동 후에 줄기세포를 상기 저장 배지와 혼합함으로써 사용되며, 선택적으로 상기 저장 배지는 제13항 또는 제14항에 의해 정의된 배지인, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
  19. 생리학적 쇼크를 받은 줄기세포의 생존율을 개선시키기 위한 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도로서, 선택적으로
    상기 개선은 동일 농도로 사용된 혈장-유래 혈청 알부민의 용도와 비교되며,
    상기 개선은 2 내지 8℃에서 24시간 초과, 예컨대 최대 약 48시간, 예를 들어 최대 약 72시간 또는 그 이상의 시기 동안 저장 배지 중에 저장되는 경우, 쇼크 후 줄기세포에서 관찰될 수 있으며;
    상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 이를 동결보존 배지 내에 제형화시키고, 생리학적 쇼크를 받기 이전에 상기 동결보존 배지, 예컨대 제12항에서 정의된 동결보존 배지와 줄기세포를 혼합함으로써 사용되고; 그리고/또는
    상기 재조합 효모-유래 혈청 알부민은 이를 저장 배지 내에 제형화시키고, 생리학적 쇼크를 받은 후에 줄기세포와 상기 저장 배지, 예컨대 제13항 또는 제14항에 의해 정의된 저장 배지를 혼합함으로써 사용되는, 재조합 효모-유래 혈청 알부민의 용도.
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CA3111273C (en) 2018-09-06 2024-03-26 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
AU2020291919A1 (en) * 2019-06-11 2022-01-20 Axogen Corporation Wet preservation of tissue
US20230000774A1 (en) 2019-12-04 2023-01-05 Albumedix Limited Methods and compositions produced thereby
BR112022017438A2 (pt) 2020-03-12 2022-10-18 Bavarian Nordic As Composições que melhoram a estabilidade do poxvírus
CN113549653B (zh) * 2020-04-23 2024-03-22 上海赛比曼生物科技有限公司 用于慢病毒载体长期存贮的组合试剂
JP7280623B2 (ja) * 2020-12-28 2023-05-24 株式会社アビー 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法
JP7318983B2 (ja) * 2021-12-21 2023-08-01 株式会社アビー 細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法
WO2024018452A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Albumin protein variants, production thereof and uses of same
CN117783501B (zh) * 2024-02-26 2024-05-10 四川大学华西第二医院 辛酸钠在注意缺陷与多动障碍中的应用及产品

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130056853A (ko) * 2010-01-25 2013-05-30 벤트리아 바이오사이언스 단백질 제조 개선을 위한 방법 및 조성물

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728553A (en) 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
FR2746109B1 (fr) * 1996-03-12 1998-04-17 Rhone Poulenc Rorer Sa Milieu pour la conservation de materiel biologique
GB9902000D0 (en) 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
CA2395587C (en) 2000-10-24 2012-09-18 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method of monomerizing human serum albumin polymers
JP4798832B2 (ja) 2000-10-24 2011-10-19 一般財団法人化学及血清療法研究所 ヒト血清アルブミン多量体の除去方法
JP4798833B2 (ja) 2000-10-24 2011-10-19 一般財団法人化学及血清療法研究所 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法
JP2004238392A (ja) * 2003-01-14 2004-08-26 Nipro Corp 安定化された蛋白質性製剤
GB0310347D0 (en) 2003-05-07 2003-06-11 Delta Biotechnology Ltd Assay
DE602005013912D1 (de) 2004-01-20 2009-05-28 Chemo Sero Therapeut Res Inst Verfahren zur herstellung von humanserumalbumin durch wärmebehandlung in gegenwart von zweiwertigem kation
SG2014012918A (en) 2009-02-11 2014-04-28 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants and conjugates
WO2010128143A1 (en) * 2009-05-07 2010-11-11 Novozymes Biopharma Dk A/S Method of controlling o-linked glycosylation of antibodies
CN105567699A (zh) 2009-10-30 2016-05-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
WO2011075686A2 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Ventria Bioscience Methods & compositions comprising heat shock proteins
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
WO2013006675A1 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Novozymes Biopharma Uk Limited Albumin formulation and use
US9458424B2 (en) * 2013-12-19 2016-10-04 FertiPro N.V. Methods for cryopreservation of stem cells via slow-freezing

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130056853A (ko) * 2010-01-25 2013-05-30 벤트리아 바이오사이언스 단백질 제조 개선을 위한 방법 및 조성물

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