KR20190042127A - A형 간염 바이러스 검출용 pcr 프라이머 및 이를 이용한 래피드 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 래피드 키트와 A형 간염 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 본 발명의 PCR 프라이머 물환경 등 다양한 시료에서 A형 간염 바이러스를 고감도로 검출할 수 있고, 래피드 키트를 통해 검출 결과를 신속하게 확인할 수 있다.
Description
본 발명은 A형 간염 바이러스(HAV) 검출용 PCR 프라이머, 이를 이용한 래피드 키트 및 A형 간염 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
A형 간염은 A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus)에 의한 급성 간염 질환으로 발열, 구토 및 구역, 암갈색 소변, 식욕부진, 복부 불쾌감, 황달 등 다른 바이러스에 의한 급성 간염과 유사한 증상을 보인다. A형 간염은 위생적인 공중위생시설 및 손씻기와 같은 개인 위생습관의 부족과 밀접하게 관련되어 후진국병으로 불리며, 주로 A형 간염 바이러스에 오염된 물, 음식물 등의 섭취, 주사기나 혈액 제제를 통해 전파되기도 한다. 또한, 감염자와 직접적인 신체 접촉을 통해 전파되기도 하여 인구밀도가 높은 군대, 유치원 등에서 집단 발생하는 경우가 있다. 세계보건기구는 연간 약 140만 명의 환자가 발생하는 것으로 추정하고 있으며, 국내에서는 선진국형으로 변화되어 A형 감염 신고수가 꾸준히 증가하다가 2009년을 정점으로 감소추세에 있다. 20-30대가 전체 환자의 70~80%를 차지하고, 최근에는 10대와 20대를 중심으로 크게 증가하는 양상을 보이고 있다.
A형 간염 바이러스의 진단은 혈액에서 A형 간염 바이러스에 대한 항체를 검출하거나, 검체(대변검체, 혈액 등)에서 RT-PCR 검사법으로 A형 간염 바이러스 특이 유전자를 검출하는 방법으로 수행된다. 항체를 검출하는 방법을 이용하는 경우 항 A형 간염 바이러스 면역글로불린M(IgM anti-HAV) 항체 검사에서 양성이 나타나고, 특징적인 임상징후를 보이는 경우 확진할 수 있다. IgM 항체는 증상 발병으로부터 회복된 후 6개월까지 검사상 양성으로 나타날 수 있다.
A형 간염은 장티푸스나 콜레라 등과 같이 입으로 옮는 수인성 전염병으로, 오염된 물, 오염된 물로 씻은 음식 등을 섭취하여 감염될 수 있다. 따라서, 물이나 식품에 존재하는 바이러스를 효율적으로 검출하는 것이 중요하다. 최근에는 PCR 방법을 기초로 하면서도 높은 검출한도와 특이도를 가지는 real-time PCR 방법이 감염병 진단에 많이 사용되고 있는 추세이다. 그러나, real-time PCR 방법은 분석방법이 어렵고 분석을 위한 장비가 고가이며 소형화 되어있지 않아 현장진단(POCT)용으로는 부적절하다.
전통적인 PCR 방법은 PCR 후 증폭된 유전자 산물을 아가로스겔 전기영동을 통해 가시화해야 검출 결과를 확인할 수 있다. 이를 위해 전기영동 장치 및 자외선 투과조명기(UV transilluminator)와 같은 부가적인 장비를 필요로 하며, 30분~1시간의 시간이 소모된다. 이와 같이, 전통적인 PCR 방법은 공간적, 시간적 제약을 받게 되므로 더욱 간편하고 효율적인 결과 확인 방법을 필요로 한다. 또한, 물과 같이 바이러스의 존재가 매우 낮은 시료에서는 PCR에 사용되는 프라이머가 실제로 존재하는 A형 간염 바이러스를 검출하지 못하는 경우가 있다. 따라서, 물 시료를 포함하는 광범위한 시료에서 A형 간염 바이러스를 고효율로 검출하면서, 기존의 검출용 PCR 프라이머보다 검출한계가 높은 프라이머의 개발이 필요하다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 래피드 키트와 A형 간염 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머가 제공된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 5 내지 8의 염기서열을 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 프라이머를 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 프로브를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 측방유동 스트립을 포함하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 프로브는 상기 PCR 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 바이오틴 및 디곡시게닌을 표지한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 분석대상 시료를 추출하는 단계; 서열번호 1 내지 4의 염기서열 또는 서열번호 5 내지 8의 염기서열로 구성되는 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 준비하는 단계; 상기 PCR 프라이머를 이용하여 상기 분석대상 시료 내 A형 간염 바이러스 표적핵산을 증폭하는 단계; 증폭된 상기 A형 간염 바이러스 표적핵산과 프로브를 혼성화하는 단계; 및 프로브와 혼성화된 상기 표적핵산을 검출하는 단계; 를 포함하는, A형 간염 바이러스 검출방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 프로브는 상기 PCR 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 바이오틴 및 디곡시게닌을 표지 한 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 표적핵산을 검출하는 단계는 측방유동 스트립을 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 환자의 배설물, 혈액뿐만 아니라 물 시료와 같이 바이러스의 밀도가 낮은 시료로부터 A형 간염 바이러스를 고감도로 검출할 수 있다.
또한, 전기영동이나 Real-time PCR과 같은 종래의 분석 방법과 달리, 측방유동 스트립을 이용하는 래피드 키트로 바이러스를 검출함으로써 신속하고 간편하게 결과를 확인할 수 있다. 이를 통해 A형 간염의 진단뿐만 아니라 질환의 예방, 오염원 추적, 모니터링 등에 폭넓게 이용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 바이오틴 및 디곡시게닌이 표지된 PCR 프라이머가 증폭된 A형 간염 바이러스 표적핵산과 혼성화된 것을 나타낸다.
도 2는 증폭된 A형 간염 바이러스 표적핵산을 검출하기 위한 래피드 키트의 모식도를 나타낸다.
도 3은 래피드 키트를 이용하여 프로브가 혼성화된 A형 간염 바이러스 표적핵산을 검출하는 원리를 나타낸다.
도 4는 기존 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 검출한계를 측정한 사진이다.
도 5는 본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 검출한계를 측정한 사진이다.
도 6은 본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 래피드 키트를 이용하여 검출 결과를 확인한 사진이다.
도 2는 증폭된 A형 간염 바이러스 표적핵산을 검출하기 위한 래피드 키트의 모식도를 나타낸다.
도 3은 래피드 키트를 이용하여 프로브가 혼성화된 A형 간염 바이러스 표적핵산을 검출하는 원리를 나타낸다.
도 4는 기존 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 검출한계를 측정한 사진이다.
도 5는 본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 검출한계를 측정한 사진이다.
도 6은 본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 래피드 키트를 이용하여 검출 결과를 확인한 사진이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
A형 간염 바이러스는 Picornaviridae과의 Hepatovirus속으로 분류되며 27nm내지 32nm의 크기를 가지며, 정20면체의 피막이 없는 RNA 바이러스이다. A형 간염바이러스 비리온은 세 개의 주요 구조 폴리펩티드 (VP1, VP2, VP3, 분자량 22 내지 33 KDa)로 이루어져 있다. A형 간염바이러스의 유전자 구조와 복제 기작은 다른 Picornaviridae과에 속하는 바이러스와 흡사하다. 한 가지 혈청형 (serotype)이 알려져 있고 B형 간염바이러스나 다른 간염바이러스와 교차 반응이 없으며 7가지의 유전자형으로 분류 된다. 그러나 이들 유전형들은 바이러스주들 간의 염기서열 동질성이 90% 정도로 비슷하고 특정한 유전자형에 따른 간염의 임상상이나 경과와의 관련성이 없으며 역학적인 분포에 약간의 차이만 있다.
감염 후 1~5주까지 환자의 대변에서 바이러스가 검출되는데 주로 역전사 중합효소연쇄반응법을 사용하여 확인한다. 역전사 중합효소연쇄반응법은 캡시드를 구성하는 유전자 VP1, VP2, VP3 가운데 캡시드 표면에 노출되어 있는 VP1, VP3을 표적 유전자로 하여 검사를 수행한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머가 제공된다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 5 내지 8의 염기서열을 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머가 제공된다. 본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머는 새롭게 디자인한 PCR 프라이머로, 구체적인 염기서열을 아래의 표 1에 나타내었다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 프라이머를 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 키트가 제공된다. PCR 프라이머는 5' 또는 3' 말단에 디곡시게닌 및 바이오틴이 표지 된 것일 수 있으며, 표지된 PCR 프라이머를 이용해 검출하고자 하는 A형 간염 바이러스의 표적핵산을 증폭시킨다. 도 1을 참고하면, 검출하고자 하는 A형 간염 바이러스의 표적핵산을 증폭시키기 위해 본 발명의 PCR 프라이머를 사용하는 것을 확인할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 프로브를 더 포함할 수 있고, 프로브는 서열번호 1 내지 4 또는 서열번호 5 내지 8의 염기서열로 구성되는 PCR 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 바이오틴 및 디곡시게닌을 표지한 것을 사용할 수 있다. PCR 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 디곡시게닌 및 바이오틴이 표지된 프로브는 증폭된 표적핵산에 상보적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 측방유동 스트립을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 도 3을 참고하면, 본 발명의 측방유동 스트립을 포함하는 A형 간염 바이러스 검출용 래피드 키트의 모식도를 확인할 수 있다. 래피드 키트는(rapid diagnostic kit)는 샌드위치 ELISA의 절차와 유사한 과정으로 진행되지만, 시료를 샘플패드에 투입한 후 특별한 힘들 가하지 않고 유체의 흐름만으로 과정이 진행된다는 점에서 차이가 있다. 투입된 시료는 투입구의 반대편에 위치하고 있는 흡수패드까지 이동하게 되는데 시료 내에 존재하는 표적 항원이 이동을 시작한 후 접합패드에 도포되어 있는 탐지항체인 스트렙트아비딘-골드와 결합하게 된다. 스트렙트아비딘은 바이오틴에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자로, 스트렙트아비딘-바이오틴은 결합력이 강하기 때문에 항체 고정화 등에 널리 사용되고 있다. 스트렙트아비딘-골드와 결합한 표적핵산은 이차적으로 포획항체인 항-디곡시게닌 IgG와 결합하게 되고, 검사선 상에서 발색하여 시료 내 표적핵산의 함유 여부를 시각화 하게 된다. 래피드 키트에 존재하는 니트로셀룰로오스막 상에는 검사선과 함께 대조선이 존재하는데, 대조선은 래피드 키트의 이상 여부를 판단하는 기준으로 검사선의 발색 여부와 관계없이 대조선이 발색하지 않는 경우 해당 키트는 신뢰할 수 없다.
이러한 래피드 키트는 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있으며, 의학용 장비가 제한적인 곳에서의 진단이나 예진에 적합하다. 항원-항체 반응과 같은 두 물질간의 특이적인 반응을 기본으로 하기 때문에 민감도와 특이성이 높고, 확인까지 소요되는 시간이 약 5분 내지 20분으로 빠른 시간 내에 결과를 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 분석대상 시료를 추출하는 단계; 서열번호 1 내지 4의 염기서열 또는 서열번호 5 내지 8의 염기서열로 구성되는 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 준비하는 단계; 상기 PCR 프라이머를 이용하여 상기 분석대상 시료 내 A형 간염 바이러스 표적핵산을 증폭하는 단계; 증폭된 상기 A형 간염 바이러스 표적핵산과 프로브를 혼성화하는 단계; 및 프로브와 혼성화된 상기 표적핵산을 검출하는 단계; 를 포함하는, A형 간염 바이러스 검출방법이 제공된다.
분석대상 시료 내에 존재하는 A형 간염 바이러스 표적핵산을 증폭하는 단계는 One-step RT-PCR과 Nested PCR, 두 단계로 수행될 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1,2, 5, 6의 염기서열을 갖는 프라이머가 One-step RT PCR, 서열번호 3, 4, 7, 8의 염기서열을 갖는 프라이머가 Nested PCR에 각각 사용된다. Nested-PCR 방법에 의한 증폭은 의도하지 않은 프라이머 결합 자리에 의해 생산되는 PCR 산물의 오염을 줄일 수 있기 때문에 목적으로 하는 표적핵산을 효율적으로 증폭시키고, 분석 민감도를 향상시킬 수 있다. 즉, Nested PCR 단계에서는 1차 PCR(One-step RT-PCR) 산물 내에 존재하는 표적핵산을 증폭하게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1: A형 간염 바이러스 시료 준비>
A형 간염 바이러스를 African green monkey의 신장세포인 Vero 세포에 감염시켜 증식시키고, RT-PCR을 통해 바이러스의 증식 여부를 확인한다. RT-PCR 과정에서는 식품의약품안전처 및 식품공전에서 제시하는 HAV용 리버스 프라이머(HAV 2) 및 본 발명의 신규한 PCR Primer (HAV R1, HAV R2)를 사용하였다.
<실시예 2: A형 간염 바이러스 검출한계 측정>
2-1. A형 간염 바이러스 표적핵산의 증폭
HAV2, BR2, HAV R1(서열번호 2), HAV R2(서열번호 6) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 표 2와 같은 조성으로 PCR 반응액을 만들고(TaKaRa) PCR을 수행하였다.
2-2. A형 간염 바이러스 유전자 삽입 벡터 제작
Gel extraction kit(m biotech)를 이용하여 실시예 2-1에서 증폭한 각각의 PCR 산물을 겔로부터 분리정제하고, T-vector (Promega)에 T4 DNA ligase를 이용하여 삽입하였다. T-vector에 ligation된 각각의 DNA를 E. coli에 형질전환 시키고, 형질 전환체를 선별한 후 플라스미드 DNA를 제한효소로 처리하여 벡터 DNA에 표적 DNA가 삽입되었는지 확인하였다. 기존의 HAV1, HAV2 프라이머로 증폭된 DNA가 삽입된 벡터를 T-HAV 1/2; 본 발명의 HAV F1, HAV R1 프라이머로 증폭된 DNA가 삽입된 벡터를 T-HAV F1/R1; HAV F2, HAV R2 프라이머로 증폭된 DNA가 삽입된 벡터를 T-HAV F2/R2라 명명하였다.
2-3. A형 간염 바이러스 검출한계 측정
A형 간염바이러스 유전자가 삽입된 플라스미드 DNA를 단위부피당 DNA copy 수를 계산 하여 1×106 copies/㎕로 희석 하고 1/10씩 단계적으로 희석하여 실험에 사용하였다.
먼저, 식품의약품안전처에서 제시하는 프라이머 세트로 PCR반응을 진행하여 검출 한계를 측정하였다(도 4 참조). 주형은 실시예 2-2에서 클로닝을 통하여 확보한 T-HAV 1/2, DNA를 사용하였다. PCR 은 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1회로 하여 30회를 반응시킨 후 72℃에서 5분간 연장 반응하였다. Nested PCR 단계에서는 1차 PCR산물 1㎕를 주형으로 이용하였고, PCR 반응조건은 1차 PCR과 동일하다.
도 4 및 도 5에서 각 레인은 M(DNA 마커), 1×106 -1 copies(레인 1-7), 음성 컨트롤(레인 8)을 나타낸다.
도 4에서 (A)는 HAV1, HAV2 프라이머, (B)는 HAV3, HAV4 프라이머, (A) 는 1차 PCR, (B)는 Nested PCR의 결과이다. 도 4를 참고하면, HAV1, HAV2 프라이머를 이용한 1차 PCR 산물은 1×103 copies까지, HAV3, HAV4 프라이머를 이용한 Nested PCR 산물은 10 copies까지 검출 가능한 것을 확인할 수 있다.
도 5에서 (A)는 HAV F1, HAV R1 프라이머, (B)는 HAV nF1, HAV nR1 프라이머, (C)는 HAV F2, HAV R2 프라이머, (D)는 HAV nF2, HAV nR2 프라이머를 사용한 것이고, (A) 및 (C)는 1차 PCR, (B) 및 (D)는 Nested PCR의 결과이다. 도 5를 참고하면, HAV F1, HAV R1 프라이머를 이용한 1차 PCR 산물은 1×103 copies까지, HAV nF1, HAV nR1 프라이머를 이용한 Nested PCR 산물은 1 copies까지 검출 가능한 것을 확인할 수 있다. 또한, HAV F2, HAV R2 프라이머를 이용한 1차 PCR 산물은 1×103 copies까지, HAV nF2, HAV nR2 프라이머를 이용한 Nested PCR 산물은 10 copies까지 검출 가능한 것을 확인하였다.
즉, A형 간염 바이러스 유전자 증폭 시 1차 PCR 산물은 식약처에서 제공하는 프라이머와 본 연구를 통하여 디자인한 primer 모두 1×103 copies에서 PCR 증폭산물이 명확히 관찰되었고, 1×103 copies의 검출한계를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Nested PCR 결과, 본 발명의 HAV nF1, HAV nR1 프라이머를 사용한 경우 1 copy 로 검출 한계가 측정되어 보다 측정 민감도가 높은 것으로 확인되었다.
<실시예 3: 측방유동 스트립을 이용한 A형 간염 바이러스 표적핵산 검출>
PCR 수행 후 디곡시게닌 및 바이오틴이 붙은 프로브를 PCR 산물에 각 2 ㎕씩 혼합 후 95°C에서 3분, 55°C에서 1분 반응시켰다. 반응물에 측방유동 스트립용 버퍼 80㎕ 를 첨가하고, 혼합한 후 측방유동 스트립의 샘플 주입구에 100㎕를 흘려주었다. 5분 내지 10분 이후, 컨트롤라인과 테스트라인에 착색되는지 여부를 통해 검출 결과를 육안으로 확인한다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> MUHANN Patent&Law Firm
<120> PCR PRIMER AND RAPID KIT FOR DETECTING HEPATITIS A VIRUS
<130> APC-2017-0358
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<400> 1
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<213> Artificial Sequence
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<400> 2
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<223> Nested PCR Primer for detecting Hapetitis A
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cctatgttaa tttctgaggg acc 23
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<223> Nested PCR Primer for detecting Hapetitis A
<400> 8
aattgaattt ggtccagcaa catg 24
Claims (9)
- 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머.
- 서열번호 5 내지 8의 염기서열을 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머.
- 제1항 또는 제2항의 PCR 프라이머를 포함하는, A형 간염 바이러스 검출용 키트.
- 제3항에 있어서,
상기 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 프로브를 더 포함하는 것인, A형 간염 바이러스 검출용 키트.
- 제4항에 있어서,
상기 A형 간염 바이러스 검출용 키트는 측방유동 스트립을 포함하는 것인, A형 간염 바이러스 검출용 키트.
- 제4항에 있어서,
상기 프로브는 상기 PCR 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 바이오틴 및 디곡시게닌을 표지한 것인, A형 간염 바이러스 검출용 키트.
- 분석대상 시료를 추출하는 단계;
서열번호 1 내지 4의 염기서열 또는 서열번호 5 내지 8의 염기서열로 구성되는 A형 간염 바이러스 검출용 PCR 프라이머를 준비하는 단계;
상기 PCR 프라이머를 이용하여 상기 분석대상 시료 내 A형 간염 바이러스 표적핵산을 증폭하는 단계;
증폭된 상기 A형 간염 바이러스 표적핵산과 프로브를 혼성화하는 단계; 및
프로브와 혼성화된 상기 표적핵산을 검출하는 단계; 를 포함하는, A형 간염 바이러스 검출방법.
- 제7항에 있어서,
상기 프로브는 상기 PCR 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 바이오틴 및 디곡시게닌을 표지한 것인, A형 간염 바이러스 검출방법.
- 제7항에 있어서,
상기 표적핵산을 검출하는 단계는 측방유동 스트립을 이용하는 것인, A형 간염 바이러스 검출방법.
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