KR20190034195A - 눈에서의 벡터-매개 면역 관용 - Google Patents

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매튜 루이스 허쉬
브라이언 크리스토퍼 길거
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더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
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Abstract

본 발명은 눈 및/또는 각막 체외이식편에 인간 백혈구 항원 G를 전달하기 위한 벡터, 및 각막 이식편 거부 및 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 기타 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

눈에서의 벡터-매개 면역 관용
우선권에 관한 언급
본 출원은 2016년 7월 26일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/366,822를 우선권 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원에 관한 언급
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 교부 번호 AI072176 및 AR064369의 정부 지원 하에 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리가 있다.
발명의 분야
본 발명은 눈 및/또는 각막 체외이식편에 인간 백혈구 항원 G (HLA-G)를 전달하기 위한 벡터, 및 각막 이식편 거부 및 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 기타 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
시력 상실을 치료하기 위한 각막 생착은 전세계적으로 가장 통상적인 형태의 조직 이식으로, 미국에서만 약 47,000건이 발생한다. 저위험 환자에서, 2년 후의 이식편 거부는 약 15％이고, 주로 이의 성공은 비교적 건강한 각막에서의 혈관화 결여에 기인한다. 대조적으로, 고위험 각막 이식은 불과 2년 후에 걱정스러운 50-70％ 거부율을 입증하고, 다수의 중증 각막 질환 환자는 이러한 절차의 후보로 고려되지 않는다. 이러한 고위험 사례는 상당한 양의 기존의 각막 혈관화가 있고/있거나 이전 생착이 있는 것으로 정의된다. 현재의 치료는 낮은 수준의 성공 및 심각한 유해 부작용을 나타내는 국소 및 전신 코르티코스테로이드에 부분적으로 의존한다.
눈은 면역 특권 부위로 널리 간주되고, 이러한 지정은 각막을 포함한다. 각막의 면역 특권 상태는 혈액-안구 장벽, 각막 림프관 및 혈관구조의 결여, 각막 세포 상에서의 Fas 리간드의 발현, 각막 세포 상에서의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 분자의 낮은 발현, 중심 각막에 성숙형 항원 제시 세포 (APC)가 거의 없는 것, 방수 및 눈물막 내의 면역조정 인자의 존재 (예를 들어, 알파 멜라닌세포 자극 호르몬 및 전환 성장 인자 베타), 및 전방 연관 면역 편위 현상을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 유지된다. 안구 염증, 감염, 외상 및 후속 혈관화와 함께 발생할 수 있는 각막 면역 특권의 임의의 성분의 상실이 있는 경우에 각막 이식편은 거부 위험이 높은 것으로 간주된다.
각막 이식편 거부는 수술 후 수주 이내에 발생되고, 상피 또는 내피 거부선, 기질 거부 띠, 각막 두께 증가, 및 전방 염증 (각막 침착물, 방수 흐림, 및 세포)에 의해 임상적으로 명시된다. 이러한 급성 이식편 거부에서, 공여자 APC의 표면 상의 공여자 MHC 분자 (클래스 I 및 II)가 숙주 수용자 T 세포에 의해 직접적으로 인식되어 급속한 이펙터 염증을 초래하고, 이식편 거부에 대한 직접적인 경로로서 기술되었다. 이식 후의 시간이 증가하고, 공여자 APC가 공여자 조직 밖으로 이동함에 따라, 이러한 유형의 거부가 발생될 가능성이 덜해진다. 그러나, 장기적으로, 수용자 MHC 분자가 공여자 MHC 분자를 받아들이고 수용자 T 세포에 제시하여, 구심성 면역학적 반응을 개시시킬 때 이식 실패가 또한 발생할 수 있고, 이는 이식편 거부의 간접적인 경로로 지칭된다. 따라서, MHC 동종항원의 수용자 T-세포 인식이 각막 이식편 거부에서 중요한 역할을 한다.
공여자 클래스 I 항원 (상피, 기질 및 내피 세포의 HLA-A, B, C)은 숙주 세포독성 T 세포 (CD8+)에 의해 인식되는 한편, APC (예를 들어, 림프구, 대식세포, 랑게르한스 세포, 및 사이질 수지상 세포)에 의해 제시되는 공여자 클래스 II 항원은 헬퍼 T 세포 (CD4+)에 의해 인식되고, 이는 활성화되는 경우 케모카인, 시토카인 (IL-2, IFN-감마, 대식세포 활성화 인자, 이동 억제 인자), 및 산화질소, 수퍼옥시드 라디칼 및 종양 괴사 인자 알파를 포함하는 독성 분자를 상향조절시키고, 이들은 각각 각막 동종이식편을 손상시킨다. 이러한 시토카인 및 케모카인은 클래스 II 항원의 추가 발현에 의해 염증을 강화한다. 세포독성 T 림프구 (CTL)는 외래 항원을 보유하는 세포를 직접적으로 공격하는 주요 이펙터 세포이다. 적응 면역 반응에 더하여, 선천 면역 반응의 NK 세포 및 대식세포가 각막 이식편 거부에서 또한 역할을 할 수 있다. 각막 이식편의 장기 생존은 Foxp3+의 발현이 높고 T 세포 증식 억제에 효과적인 CD4+ CD25+ Foxp3+ 조절 T-세포의 발생에 좌우된다.
CTL에 의한 직접적인 인식 및 용해 이외에, 각막 이식편 거부에서의 또 다른 주요 요인이지만 간접적인 요인은 수용자 각막의 혈관화 및 림프관이다; 이들 중 어느 하나의 존재는 각막 면역 특권을 폐지한다. 임상적으로, 초기 거부 장소가 숙주 혈관화에 가장 가까운 각막 이식편 가장자리에 있는 것이 관찰된다. 혈관 및 림프관은 동종항원 (혈관) 또는 APC (림프)가 말초 면역계 및 림프절로 떠나가는 것을 위한 직접적인 경로를 제공함으로써, 그리고 또한 순환 중인 이펙터 면역 세포 및 동종항원-특이적 T 세포가 각막 동종이식편으로 이동하여 거부를 개시시키는 것을 용이하게 함으로써 이식편 거부를 강화한다.
본 발명은 각막 체외이식편 및 눈에서의 HLA-G의 발현을 위한 벡터, 및 각막 이식편 거부 및 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 기타 눈 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공함으로써 관련 분야의 단점을 극복한다.
본 발명은 인간 백혈구 항원 G (HLA-G)의 유전자 전달을 통해 외래 조직에 대한 신체의 자연 면역 관용 방법을 모방하는 개념을 기초로 한다. HLA-G의 가용성 및 막횡단 형태 양쪽 모두가 모체/태아 경계면에서 발현되어 외래 항원을 발현하는 태아의 거부를 예방한다. HLA-G의 효과는 항-혈관화 및 T 세포 및 항원 제시 세포와의 직접적인 상호작용을 포함하여 다양한 수준에서 존재한다.
각막에서의 HLA-G 발현은, 부분적으로, NK 세포, 이펙터 세포독성 T 세포, T 세포 증식, 및 공여자 항원 제시를 억제하는 이의 능력을 통해, 공여자 각막 이식편 항원의 관용을 개선시킬 수 있다. CTL을 억제하는 HLA-G의 능력에 더하여, 막횡단 및 가용성 형태의 HLA-G는 혈관형성을 억제하고 내피 세포의 아팝토시스를 유발한다. 따라서, HLA-G 발현은 간접적으로 각막 혈관화의 예방/감소를 통해 및/또는 직접적으로 CTL 불활성화를 통해 각막 이식편 관용을 개선시킬 수 있다.
각막 체외이식편 및 눈에서 혈관화를 저해하고 면역 반응을 억제하는 HLA-G의 능력은 이식편 거부 및 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 기타 눈 장애의 치료 및/또는 예방에 도달한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 HLA-G를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 핵산을 포함하는 AAV 벡터 게놈, 이러한 AAV 벡터 게놈을 포함하는 AAV 입자, 및 이러한 AAV 입자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 HLA-G를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 이를 포함하는 벡터, 바이러스 입자, 세포, 트랜스제닉 동물 및 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 AAV 복제에 대해 허용성인 세포에 (a) (i) 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트, 및 (ii) 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 재조합 AAV 주형; 및 (b) Rep 코딩 서열 및 Cap 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 AAV 주형의 복제 및 패키징에 충분한 조건 하에 제공하고; 이에 의해 재조합 AAV 입자가 세포에서 생산되는 것을 포함하는, 재조합 AAV 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포를 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 HLA-G를 세포에 전달하는 것을 포함하는, HLA-G를 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포를 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 HLA-G를 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 세포에서 HLA-G를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 각막 체외이식편을 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 HLA-G를 각막 체외이식편에 전달하는 것을 포함하는, HLA-G를 각막 체외이식편에 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 각막 체외이식편을 (예를 들어, 이식 전에, 동안, 및/또는 후에) 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 이식 후의 각막 체외이식편의 거부를 억제하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 이식 후의 각막 체외이식편의 거부를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물 대상체의 눈에 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉된 세포를 투여하고, 이에 의해 HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여/전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물 대상체의 눈에 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물을 투여하고, 이에 의해 HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여/전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 포유동물 대상체 (예를 들어, 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체)의 눈에 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉된 세포 (예를 들어, 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물을 포함하는 세포)를 투여/전달하고, 이에 의해 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체의 눈에 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물을 투여하고, 이에 의해 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면이 하기의 발명의 상세한 설명에서 더욱 상세하게 기재된다.
도 1a-1c는 시험관 내에서의 scAAV8G9-optHLA-G의 특성화를 나타낸다. a) 자기-상보적 scAAV8G9-optHLA-G 벡터 카세트의 삽화. b) 웨스턴 블롯에 의한 293 세포에서의 optHLA-G 아이소형 생산의 확인. JEG-3 세포는 태반 세포이고, 양성 대조군으로서의 역할을 한다. 이러한 데이터를 간결하게 나타내도록 웨스턴 블롯 영상을 잘라서 정렬하였고, 전장 블롯은 도 11에서 제시된다. c) 293 세포를 지시된 cDNA로 형질감염시킨 후에 동일한 노출 시간에 영상화된, optHLA-G 아이소형의 디아미노벤지딘 염색. ITR = 역전 말단 반복부.
도 2a-2b는 WT 또는 코돈-최적화 cDNA로부터의 HLA-G 존재도의 비교를 나타낸다. a) WT HLA-G cDNA 또는 코돈-최적화 HLA-G cDNA를 함유하는 동일한 플라스미드 환경을 별개의 293 세포 형질감염에 사용하였다. 형질감염 3일 후에 용해물을 회수하고, 지시된 단백질에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. b) a에 도시된 데이터의 웨스턴 블롯 밀도측정을 기초로 하는 정량. Opt = 코돈-최적화, ORF = 오픈 리딩 프레임.
도 3은 AAV-HLA-G에 인간 세포에서의 항-혈관형성 기능이 있다는 것을 나타낸다.
도 4는 항-혈관형성 모델로서의 내피 관 검정법에서의 HLA-G1 및 HLA-G5 발현의 효과를 나타낸다.
도 5a-5c는 scAAV8G9가 토끼 각막에서 유전자 전달을 매개한다는 것을 나타낸다. a) 토끼 각막 기질 내로의 50 ㎕의 벡터 주사가 일시적인 각막 혼탁을 야기한다. b) 주사가 커버한 각막 면적의 정량. c) GFP 발현의 강도를 도시하는 대표적인 생체내 영상, 및 지시된 시점에서의 지시된 주사제의 GFP 강도의 정량. (P < 0.0009). P.I. = 주사 후, sc = 자기-상보적.
도 6a-6b는 scAAV8G9-optHLA-G 콤보가 화상-유도 각막 혈관화를 예방한다는 것을 나타낸다. scAAV8G9-GFP 또는 scAAV8G9-optHLA-G 콤보 (1:1 비의 아이소형 1 및 5)의 각막 기질내 주사 7일 전에 토끼 각막에 중심에서 화상을 입혔다. a) 지시된 벡터를 주사하고 나서 42일 후의 처리 각막의 대표적인 생체내 영상과 혈관화 트레이싱의 영상. b) 각막 화상 직후 (제0일), 지시된 벡터를 주사하고 나서 3일 후 (제10일), 및 최종 실험 시점 (제56일)의 트레이싱된 혈관화 면적의 정량 (제10일의 P < 0.001 및 제56일의 P < 0.002). sc = 자기-상보적.
도 7a-7c는 화상-유도 각막 혈관화 분석, 및 생체내 영상의 정량을 나타낸다. 중심에서 화상을 입힌 토끼 각막에 손상을 유도하고 나서 7일 후에 scAAV8G9-GFP 또는 scAAV8G9-optHLA-G 콤보의 기질내 주사를 제공하였다. a-c) 혈관 내향성장의 총면적을 정량하기 위한 지시된 시점의 지시된 벡터로 처리된 각막의 생체내 라이브 영상으로부터의 트레이싱된 혈관화를 도시하는 대표적인 영상. sc = 자기-상보적.
도 8a-8b는 AAV 벡터 각막 주사 후의 안구내 압력을 나타낸다. 식염수, scAAV8G9-GFP, 또는 scAAV8G9-optHLA-G 콤보 (1:1 비의 아이소형 1 및 5)의 각막 기질내 주사 8일 전에 토끼 각막에 중심에서 화상을 입혔다. a) 주사 후의 지시된 일수에 안구내 압력이 보고된다. b) 주사 후의 지시된 일수에 중심 각막 두께가 보고된다.
도 9a-9b는 scAAV8G9-optHLA-G 콤보가 각막 화상-유도 혈관화 및 면역 세포 침윤을 예방한다는 것을 나타낸다. 지시된 벡터를 외상 유도 각막 내로 주사하고 나서 60일 후에 토끼 각막 절편을 취득하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. a) 지시된 벡터 제제로 처리된 프로세싱된 절편의 대표적인 영상. b) (a)에서 제시된 모든 H&E 절편의 임상 조직학 검사 점수의 정량 (P <0.0005).
도 10a-10c는 scAAV8G9-optHLA-G 콤보가 각막 화상-유도 혈관화 및 세포독성 T-세포 침윤을 예방한다는 것을 나타낸다. 지시된 벡터를 화상 각막 내로 주사하고 나서 60일 후에 토끼 각막 절편을 취득하고, 내피 세포 마커 (CD31), T 세포 마커, 및 지시된 처리 군에서의 트랜스진 존재도에 대해 염색하였다. 척도 막대 = (a) 10 ㎛, (b) 5 ㎛, (c) 20 ㎛.
도 11a-11b는 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. (a) 293 세포에서의 optHLA-G 아이소형 생산의 확인을 위한 HLA-G, GFP 및 베타-액틴 및 (b) WT HLA-G cDNA 또는 코돈-최적화 HLA-G cDNA를 함유하는 동일한 플라스미드 환경의 형질감염 3일 후에 회수된 용해물에서의 HLA-G 및 베타-액틴 발현에 대한 전장 웨스턴 블롯 영상. HLA-G, GFP 및 베타-액틴에 대한 예상 표적 크기는 각각 39 kDa, 27 kDa. 및 42 kDa이다.
도 12a-12d는 AAV-HLA-G가 이식편-연관 각막 면역 반응을 억제한다는 것을 나타낸다. a) 토끼에서 동종이형 각막 이식편 조직을 AAV-GFP 또는 AAV-HLA-G로 생체 외에서 처리하였다. b) AAV-GFP로 처리된 눈에서는 각막 이식편 거부가 급속하게 발생된 한편, AAV-HLA-G로 처리된 눈은 제84일까지 거부하지 않았다. c) 거부 지수 점수. d) 수술 84일 후의 인큐베이션된 공여자 조직의 HLA-G 발현 (적색) 증가를 나타내는 면역형광.
이제 본 발명이 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시된 첨부 도면을 참조로 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 기재된 실시양태에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그보다는, 이러한 실시양태들은 본 개시내용이 철저하고 완전할 것이며, 본 발명의 범주를 관련 분야의 기술자에게 충분히 전달할 것이도록 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명을 기술하는데 사용된 용어법은 특정 실시양태를 기술하려는 목적뿐이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다.
달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 본원에서 단일 가닥에만 의해서 왼쪽에서 오른쪽으로 5' → 3'방향으로 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 본원에서 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)가 권장하는 방식으로, 또는 (아미노산의 경우) 37 CFR §1.822 및 확립된 용법 양쪽 모두에 따르는 1-문자 코드 또는 3-문자 코드에 의해 표현된다. 예를 들어, 문헌 [PatentIn User Manual, 99-102 (Nov. 1990) (U.S. Patent and Trademark Office)]을 참조한다.
달리 지시되지 않는 한, 관련 분야의 기술자에게 공지된 표준 방법이 재조합 재조합 파르보바이러스 및 AAV (rAAV) 구축물, 파르보바이러스 Rep 및/또는 Cap 서열을 발현하는 패키징 벡터, 및 일시적으로 및 안정하게 형질감염된 패키징 세포의 구축에 사용될 수 있다. 이같은 기술은 관련 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)]; [AUSUBEL et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]을 참조한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 특색 또는 특색들의 조합이 배제 또는 생략될 수 있다는 것도 구상한다.
추가로 설명하기 위해, 예를 들어, 명세서가 특정 아미노산이 A, G, I, L 및/또는 V로부터 선택될 수 있다고 나타내는 경우, 이러한 표현은 아미노산이 이러한 아미노산(들)의 임의의 부분집합, 예를 들어 A, G, I 또는 L; A, G, I 또는 V; A 또는 G; L 단독 등으로부터 선택될 수 있고, 각각의 이같은 하위조합이 본원에 명확하게 기재된 바와 같다는 것을 또한 나타낸다. 또한, 이같은 표현은 특정된 아미노산 중 하나 이상이 부인될 수 있다는 것을 또한 나타낸다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 아미노산은 A, G 또는 I가 아니거나; A가 아니거나; G 또는 V가 아니거나 하는 식이고, 각각의 이같은 가능한 부인이 본원에 명확하게 기재된 바와 같다.
정의
하기의 용어들이 본원에서의 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된다.
문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 단수형 형태는 복수형 형태 또한 포함하도록 의도된다.
더욱이, 측정가능한 값 예컨대 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이의 양, 용량, 시간, 온도 등을 지칭할 때 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 상술된 양의 20％, 10％, 5％, 1％, 0.5％, 또는 심지어 0.1％의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
또한 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연합되어 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우의 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 이행구 "본질적으로 ~로 이루어지는"은 열거된 물질 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들) (예를 들어, rAAV 복제)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포괄하는 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 ~로 이루어지는"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용된 바와 같은, 용어 "본질적으로 ~로 이루어지는" (및 문법적 변형)은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능이 실질적으로 변경되지 않도록 열거된 서열 (예를 들어, 서열식별번호(SEQ ID NO)) 및 열거된 서열의 5' 및/또는 3' 또는 N-말단 및/또는 C-말단 끝부분 상의 총 10개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 추가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 양쪽 모두로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 총 10개 이하의 추가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산은 함께 부가된 양쪽 모두의 끝부분 상의 추가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 개수를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 적용된 바와 같은 용어 "본질적으로 변경된"은 열거된 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준에 비교하여 적어도 약 50％ 이상의 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 능력의 증가 또는 감소를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드에 적용된 바와 같은 용어 "본질적으로 변경된"은 열거된 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 활성에 비교하여 적어도 약 50％ 이상의 효소 활성의 증가 또는 감소를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "파르보바이러스"는 자가-복제 파르보바이러스 및 디펜도바이러스(dependovirus)를 포함하여 파르보비리다에(Parvoviridae) 과를 포괄한다. 자가 파르보바이러스는 파르보바이러스(Parvovirus), 에리트로바이러스(Erythrovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus), 및 콘트라바이러스(Contravirus) 속의 구성원을 포함한다. 예시적인 자가 파르보바이러스는 마우스 미세 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 닭 파르보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파르보바이러스, 거위 파르보바이러스, H1 파르보바이러스, 머스코비 오리 파르보바이러스, 뱀 파르보바이러스, 및 B19 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 자가 파르보바이러스가 관련 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
디펜도바이러스 속은 제1형 AAV, 제2형 AAV, 제3형 AAV (제3A형 및 제3B형을 포함함), 제4형 AAV, 제5형 AAV, 제6형 AAV, 제7형 AAV, 제8형 AAV, 제9형 AAV, 제10형 AAV, 제11형 AAV, 제12형 AAV, 제13형 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 염소 AAV, 뱀 AAV, 말 AAV, 및 양 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]; 및 표 1을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아데노-연관 바이러스" (AAV)는 제1형 AAV, 제2형 AAV, 제3형 AAV (제3A형 및 제3B형을 포함함), 제4형 AAV, 제5형 AAV, 제6형 AAV, 제7형 AAV, 제8형 AAV, 제9형 AAV, 제10형 AAV, 제11형 AAV, 제12형 AAV, 제13형 AAV, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 및 공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다. 다수의 비교적 새로운 AAV 혈청형 및 클레이드가 확인되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gao et al., (2004) J. Virol. 78:6381]; [Moris et al., (2004) Virol. 33-:375]; 및 표 1을 참조한다).
본 발명의 파르보바이러스 벡터, 입자, 및 게놈은 AAV로부터의 것일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 혈청형의 AAV 및 자가 파르보바이러스의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 ITR, Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열이 관련 분야에 공지되어 있다. 이같은 서열들을 문헌에서 또는 공공 데이터베이스 예컨대 진뱅크(GenBank)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 및 AY530579를 참조하고; 이의 개시내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virol. 73: 939]; [Chiorini et al., (1997) J. Virol. 71:6823]; [Chiorini et al., (1999) J. Virol. 73:1309]; [Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854]; [Moris et al., (2004) Virol. 33-:375-383]; [Mori et al., (2004) Virol. 330:375]; [Muramatsu et al., (1996) Virol. 221:208]; [Ruffing et al., (1994) J. Gen. Virol. 75:3385]; [Rutledge et al., (1998) J. Virol. 72:309]; [Schmidt et al., (2008) J. Virol. 82:8911]; [Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921]; [Srivastava et al., (1983) J. Virol. 45:555]; [Xiao et al., (1999) J. Virol. 73:3994]; 국제 특허 공보 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 번호 6,156,303을 또한 참조하고, 이의 개시내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 표 1을 또한 참조한다. AAV1, AAV2 및 AAV3 ITR 서열의 초기 설명이 문헌 [Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA] (본원에 전문이 포함됨)에서 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "향성"은 바이러스가 세포 내로 진입하고, 임의적으로 및 바람직하게는, 그 후에, 바이러스 게놈이 보유하는 서열이 세포 내에서 발현 (예를 들어, 전사 및 임의적으로는 번역)되는 것, 예를 들어, 재조합 바이러스의 경우, 이종성 뉴클레오티드 서열(들)이 발현되는 것을 지칭한다. 관련 분야의 통상의 기술자는, 예를 들어, 유도성 프로모터 또는 다른 방식으로 조절되는 핵산 서열에 대해, 트랜스-작용 인자의 부재 하에 바이러스 게놈으로부터의 이종성 핵산 서열의 전사가 개시되지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다. AAV의 경우, 바이러스 게놈으로부터의 유전자 발현은 안정하게 통합된 프로바이러스로부터, 통합되지 않은 에피솜으로부터, 뿐만 아니라 바이러스가 세포 내에서 취할 수 있는 임의의 다른 형태로부터의 것일 수 있다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
본원에서 사용된 바와 같이, 파르보바이러스 또는 AAV에 의한 세포의 "형질도입"은 세포 내로의 유전 물질의 파르보바이러스/AAV-매개 전달을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
용어 "5' 부분" 및 "3' 부분"은 2개 이상의 요소 사이의 공간적 관계를 정의하는 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 "3' 부분"은 또 다른 절편의 하류에 있는 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "3' 부분"은 그럴 수는 있지만 절편이 반드시 폴리뉴클레오티드의 3' 끝부분에 있거나 또는 심지어 반드시 폴리뉴클레오티드의 3' 절반에 있다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드의 "5' 부분"은 또 다른 절편의 상류에 있는 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "5' 부분"은 그럴 수는 있지만 절편이 반드시 폴리뉴클레오티드의 5' 끝부분에 있거나 또는 심지어 반드시 폴리뉴클레오티드의 5' 절반에 있다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 달리 지시되지 않는 한 펩티드 및 단백질 양쪽 모두를 포괄한다.
"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 염기들의 서열이고, RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열 (자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오티드 양쪽 모두를 포함함)일 수 있으며, 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열일 수 있다.
용어 "서열 동일성"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 관련 분야에서의 표준 의미를 갖는다. 관련 분야에 공지된 바와 같이, 다수의 상이한 프로그램을 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 공지된 서열에 대한 서열 동일성 또는 유사성이 있는지 여부를 확인할 수 있다. 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소적 서열 동일성 알고리듬, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 서열 동일성 정렬 알고리듬, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리듬들의 컴퓨터 실행 (위스컨신주 매디슨 사이언스 드라이브 575의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스컨신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 문헌 [Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984)]에 기술된 베스트-핏(Best Fit) 서열 프로그램 (바람직하게는 디폴트 설정을 사용함), 또는 검사를 포함하지만 이에 제한되지 않는 관련 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 서열 동일성 또는 유사성을 결정할 수 있다.
유용한 알고리듬의 예는 PILEUP이다. PILEUP은 일군의 관련된 서열들로부터 점진적인 쌍-형식 정렬을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성시킨다. 이는 정렬을 생성시키는데 사용된 클러스터링 관계를 나타내는 나무를 플롯팅할 수도 있다. PILEUP은 문헌 [Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987)]의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용한다; 이러한 방법은 문헌 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989)]에 기술된 것과 유사하다.
유용한 알고리듬의 또다른 예는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)] 및 [Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)]에 기술된 BLAST 알고리듬이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460 (1996)]으로부터 수득된 WU-BLAST-2 프로그램이다; blast.wustl/edu/blast/README.html. WU-BLAST-2는 여러 검색 파라미터를 사용하고, 이는 바람직하게는 디폴트 값으로 설정된다. 파라미터들은 동적 값이고, 관심 서열이 이에 대해 검색되는 특정 데이터베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립된다; 그러나, 감도를 증가시키도록 값이 조정될 수 있다.
추가적인 유용한 알고리듬은 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 :3389 (1997)]에서 보고된 바와 같은 갭 BLAST이다.
백분율 아미노산 서열 동일성 값은 매칭되는 동일한 잔기의 개수를 정렬된 영역 내의 "더 긴" 서열의 잔기의 총 개수로 나눔으로써 결정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역 내에 가장 많은 실제 잔기가 있는 것이다 (정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시한다).
유사한 방식으로, 퍼센트 핵산 서열 동일성은 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다.
정렬은 정렬될 서열들 내에 갭을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로, 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드보다 더 많은 또는 더 적은 뉴클레오티드를 함유하는 서열의 경우, 한 실시양태에서, 서열 동일성의 백분율은 뉴클레오티드의 총 개수에 상대적인 동일한 뉴클레오티드의 개수를 기초로 결정될 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 한 실시양태에서, 본원에 구체적으로 개시된 서열보다 더 짧은 서열의 서열 동일성은 더 짧은 서열 내의 뉴클레오티드의 개수를 사용하여 결정될 것이다. 퍼센트 동일성 계산에서, 다양한 표현의 서열 변경, 예컨대 삽입, 결실, 치환 등에 상대적 가중치가 할당되지 않는다.
한 실시양태에서, 동일성만 양으로 채점되고 (+1), 갭을 포함하는 모든 형태의 서열 변경에는 "0"의 값이 할당되며, 이는 서열 유사성 계산에 대해 하기에 기술된 바와 같은 가중 스케일 또는 파라미터에 대한 필요성을 제거한다. 예를 들어, 매칭되는 동일한 잔기의 개수를 정렬된 영역 내의 "더 짧은" 서열의 잔기의 총 개수로 나누고 100을 곱함으로써, 퍼센트 서열 동일성을 계산할 수 있다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역 내의 가장 많은 실제 잔기가 있는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된" 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")는 자연 발생 생물 또는 바이러스의 다른 성분들, 예를 들어, 통상적으로 이러한 폴리뉴클레오티드와 회합되어 발견되는 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 중 적어도 일부가 분리되거나 또는 실질적으로 없는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
유사하게, "단리된" 폴리펩티드는 자연 발생 생물 또는 바이러스의 다른 성분들, 예를 들어, 통상적으로 이러한 폴리펩티드와 회합되어 발견되는 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 중 적어도 일부가 분리되거나 또는 실질적으로 없는 폴리펩티드를 의미한다.
"치료용 폴리펩티드"는 세포 또는 대상체 내의 단백질의 부재 또는 결함으로부터 초래되는 증상을 경감 또는 감소시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 대안적으로, "치료용 폴리펩티드"는 다른 방식으로 대상체에게 이점, 예를 들어, 항암 효과 또는 이식 생존가능성의 개선을 부여하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용되는 경우에, 하나 이상의 결실, 부가, 치환, 또는 이의 임의의 조합으로 인해 야생형 서열과 상이한 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터를 "단리하다" 또는 "정제하다" (또는 문법적 등가물)는 바이러스 벡터가 출발 물질 내의 다른 성분들 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된다는 것을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "~의 치료" (및 이의 문법적 변형)는 대상체의 상태의 중증도가 감소되고/되거나, 적어도 부분적으로 개선 또는 안정화되고/되거나, 적어도 하나의 임상 증상에서의 약간의 경감, 완화, 감소 또는 안정화가 달성되고/되거나, 질환 또는 장애의 진행에서의 지연이 있는 것을 의미한다.
용어 "예방한다", "예방하는", 및 "예방" (및 이의 문법적 변형)은 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병을 예방 및/또는 지연하는 것, 및/또는 본 발명의 방법의 부재하에 발생할 것에 비교하여 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병의 중증도가 감소되는 것을 지칭한다. 예방은 완전할 수 있고, 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 완전한 부재일 수 있다. 또한 예방은 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발생 및/또는 발병의 중증도가 본 발명의 부재 하에 발생할 것보다 덜하도록 부분적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료 유효량"은 대상체에게 약간의 개선 또는 이점을 제공하는데 충분한 양이다. 달리 말하면, "치료 유효량"은 대상체에서 적어도 하나의 임상 증상의 약간의 경감, 완화, 감소 또는 안정화를 제공할 양이다. 관련 분야의 기술자는 대상체에게 어떤 이익이 제공되는 한 치료 효과가 완전하거나 또는 치유적일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "예방 유효량"은 대상체에서 질환, 장애, 및/또는 임상 증상의 발병을 예방 및/또는 지연시키는데, 및/또는 본 발명의 방법의 부재하에 발생할 것에 비교하여 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상의 발병의 중증도를 감소 및/또는 지연시키는데 충분한 양이다. 관련 분야의 기술자는 대상체에게 어떤 이익이 제공되는 한 예방 수준이 완전할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
용어 "이종성 뉴클레오티드 서열" 및 "이종성 핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 바이러스에서 자연적으로 발생하지 않는 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 (예를 들어, 세포 또는 대상체에 전달하기 위한) 관심 대상인 폴리펩티드 또는 번역되지 않는 RNA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터," "벡터" 또는 "유전자 전달 벡터"는 핵산 전달 비히클로서의 기능을 하고, 비리온 내로 패키징된 벡터 게놈 (예를 들어, 바이러스 DNA [vDNA])을 포함하는 바이러스 (예를 들어, AAV) 입자를 지칭한다. 대안적으로, 일부 맥락에서, 용어 "벡터"는 벡터 게놈/vDNA 단독 또는 플라스미드를 지칭하도록 사용될 수 있다.
추가로 본 발명의 바이러스 벡터는 국제 특허 공보 WO 01/92551 (이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은 듀플렉스화 파르보바이러스 입자일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이중 가닥 (듀플렉스) 게놈이 패키징될 수 있다.
"rAAV 벡터 게놈" 또는 "rAAV 게놈"은 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 포함하는 AAV 게놈 (즉, vDNA)이다. 일반적으로 rAAV 벡터는 바이러스를 생성시키기 위해 염기 145개의 ITR을 시스(cis)로 필요로 할 뿐이다. 모든 다른 바이러스 서열은 없어도 되고, 트랜스로 공급될 수 있다 (문헌 [Muzyczka (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97]). 전형적으로, rAAV 벡터 게놈은 벡터에 의해 효율적으로 패키징될 수 있는 트랜스진의 크기를 최대화하도록 1개 이상의 ITR 서열을 유지할 것이다. 구조적 및 비-구조적 단백질 코딩 서열이 트랜스로 (예를 들어, 벡터, 예컨대 플라스미드로부터, 또는 이러한 서열을 패키징 세포 내로 안정하게 통합시킴으로써) 제공될 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, rAAV 벡터 게놈은 적어도 하나의 ITR 서열 (예를 들어, AAV ITR 서열), 임의적으로는 2개의 ITR (예를 들어, 2개의 AAV ITR)을 포함하고, 이는 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 끝부분에 있고, 이종성 핵산에 플랭킹될 것이지만, 이에 연속적일 필요는 없다. ITR은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 헤어핀 구조를 형성하고 역전 말단 반복부로서의 기능을 하는 (즉, 원하는 기능 예컨대 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는) 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있다. 예를 들어, 비-AAV ITR 서열 예컨대 기타 파르보바이러스 (예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)의 것 또는 SV40 복제 기원으로서의 역할을 하는 SV40 헤어핀이 ITR로서 사용될 수 있고, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 결실에 의해 추가로 변형될 수 있다. 추가로, ITR은 부분적으로 또는 완전히 합성일 수 있고, 예컨대 사물스키(Samulski) 등의 미국 특허 번호 5,478,745에 기술된 바와 같은 "이중-D 서열"일 수 있다.
파르보바이러스 게놈은 이의 5' 및 3' 끝부분 양쪽 모두에 회문식 서열이 있다. 이러한 서열들의 회문식 성질은 상보적 염기 쌍들 사이의 수소 결합 형성에 의해 안정화되는 헤어핀 구조의 형성에 이른다. 이러한 헤어핀 구조는 Y" 또는 "T" 형상을 채택하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
"AAV 역전 말단 반복부" 또는 "AAV ITR"은 혈청형 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 또는 공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 AAV로부터의 것일 수 있다 (예를 들어, 표 1을 참조한다). 말단 반복부가 원하는 기능, 예를 들어, 복제, 바이러스 패키징, 지속 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는 한, AAV ITR은 천연 말단 반복부 서열을 가질 필요가 없다 (예를 들어, 천연 AAV ITR 서열이 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다).
추가로 본 발명의 바이러스 벡터는 국제 특허 공보 WO 00/28004 및 문헌 [Chao et al., (2000) Mol. Therapy 2:619]에 기술된 바와 같은 "표적화된" 바이러스 벡터 (예를 들어, 지향성 향성이 있음) 및/또는 "하이브리드" 파르보바이러스 (즉, 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파르보바이러스로부터의 것임)일 수 있다.
추가로, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 다른 변형을 함유할 수 있다.
용어 "주형" 또는 "기질"은 파르보바이러스 바이러스 DNA를 생산하도록 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 벡터 생산의 목적을 위해, 전형적으로 주형은 플라스미드, 네이키드 DNA 벡터, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, AAV, 배큘로바이러스, 레트로바이러스 벡터 등)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 더 큰 뉴클레오티드 서열 또는 구축물 내로 매립될 것이다. 대안적으로, 주형은 패키징 세포의 염색체 내로 안정하게 통합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 파르보바이러스 또는 AAV "Rep 코딩 서열"은 바이러스 복제 및 신규 바이러스 입자 생산을 매개하는 파르보바이러스 또는 AAV 비-구조적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al., Virology, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 파르보바이러스 및 AAV 복제 유전자 및 단백질이 기술되어 있다.
"Rep 코딩 서열"은 모든 파르보바이러스 또는 AAV Rep 단백질을 코딩할 필요가 없다. 예를 들어, AAV와 관련하여, Rep 코딩 서열은 4개 모두의 AAV Rep 단백질 (Rep78, Rep 68, Rep52 및 Rep40)을 코딩할 필요가 없고, 실제로, AAV5는 스플라이싱된 Rep68 및 Rep40 단백질만 발현하는 것으로 여겨진다. 대표적인 실시양태에서, 적어도 Rep 코딩 서열은 바이러스 게놈 복제 및 신규 비리온 내로의 패키징에 필수적인 복제 단백질을 코딩한다. Rep 코딩 서열은 일반적으로 적어도 1개의 대형 Rep 단백질 (즉, Rep78/68) 및 1개의 소형 Rep 단백질 (즉, Rep52/40)을 코딩할 것이다. 특정 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 AAV Rep78 단백질 및 AAV Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 단백질, Rep68 및 Rep40 단백질, Rep78 및 Rep52 단백질, 또는 Rep78 및 Rep40 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대형 Rep 단백질"은 Rep68 및/또는 Rep78을 지칭한다. 청구된 발명의 대형 Rep 단백질은 야생형 또는 합성일 수 있다. 야생형 대형 Rep 단백질은 혈청형 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13, 또는 공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 임의의 파르보바이러스 또는 AAV로부터의 것일 수 있다 (예를 들어, 표 1 참조). 합성 대형 Rep 단백질은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
관련 분야의 기술자는 복제 단백질들이 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 필수적이지 않다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, MVM의 경우, NS-1 및 NS-2 단백질 (스플라이스 변이체임)이 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 유사하게, AAV의 경우, p19 프로모터가 불활성화될 수 있고, 대형 Rep 단백질(들)이 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있고, 소형 Rep 단백질(들)이 상이한 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 복제 단백질들을 단일 구축물로부터 발현시키는 것이 더욱 편리할 것이다. 일부 시스템에서, 세포가 바이러스 프로모터 (예를 들어, AAV p19 프로모터)를 인식하지 못할 수 있고, 따라서 대형 및 소형 Rep 단백질을 별개의 발현 카세트로부터 발현시키는 것이 필요하다. 다른 경우에, 대형 Rep 및 소형 Rep 단백질을 별개로, 즉 별개의 전사 및/또는 번역 제어 요소의 제어 하에 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 대형 대 소형 Rep 단백질의 비를 감소시키도록, 대형 Rep 단백질의 발현을 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 곤충 세포의 경우, 세포에 대한 독성을 피하기 위해 대형 Rep 단백질 (예를 들어, Rep78/68)의 발현을 하향-조절하는 것이 유리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935]을 참조한다).
본원에서 사용된 바와 같이, 파르보바이러스 또는 AAV "cap 코딩 서열"은 기능성 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드를 형성하는 (즉, DNA를 패키징할 수 있고 표적 세포를 감염시킬 수 있는) 구조적 단백질을 코딩한다. 전형적으로, cap 코딩 서열은 모든 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드 서브유닛을 코딩할 것이지만, 기능성 캡시드가 생산되는 한 전체보다 적은 캡시드 서브유닛이 코딩될 수 있다. 필수적이지는 않지만, 전형적으로, cap 코딩 서열은 단일 핵산 분자 상에 존재할 것이다.
자가 파르보바이러스 및 AAV의 캡시드 구조가 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
용어 "코돈-최적화된"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 코딩 서열 (예를 들어, HLA-G에 대한 코딩 서열을 예를 들어 포함하는 야생형 서열)에 정상적으로 존재하는 하나 이상의 코돈을 동일한 (동의성) 아미노산에 대한 코돈으로 치환함으로써 발현을 증가시키도록 최적화된 유전자 코딩 서열을 지칭한다. 이러한 방식으로, 유전자가 코딩하는 단백질은 동일하지만, 유전자 또는 상응하는 mRNA의 기저 핵염기 서열은 상이하다. 일부 실시양태에서, 최적화는 하나 이상의 희귀 코돈 (즉, 특정 종으로부터의 세포에서 비교적 드물게 발생하는 tRNA에 대한 코돈)을 더욱 빈번하게 발생하는 동의성 코돈으로 치환하여, 번역 효율을 개선시킨다. 예를 들어, 인간 코돈-최적화에서, 코딩 서열 내의 하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산에 대해 인간 세포에서 더욱 빈번하게 발생하는 코돈에 의해 교체된다. 코돈 최적화는 전사 및/또는 번역 효율을 개선시킬 수 있는 다른 메커니즘을 통해 유전자 발현을 또한 증가시킬 수 있다. 전략은, 비제한적으로, 총 GC 함량 (즉, 전체 코딩 서열 내의 구아닌 및 시토신의 퍼센트)을 증가시키는 것, CpG 함량 (즉, 코딩 서열 내의 CG 또는 GC 디뉴클레오티드의 개수)를 감소시키는 것, 잠적성 스플라이스 공여자 또는 수용자 부위를 제거하는 것, 및/또는 리보솜 진입 부위, 예컨대 코작(Kozak) 서열을 부가 또는 제거하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 코돈-최적화된 유전자는 개선된 단백질 발현을 나타내고, 예를 들어, 이에 의해 코딩되는 단백질이 세포에서 다른 면에서는 유사한 세포에서 야생형 유전자가 제공하는 단백질의 발현 수준과 비교하여 검출가능하게 더 큰 수준으로 발현된다.
HLA-G를 발현하는 벡터
각막 체외이식편 및 눈에서 혈관화를 저해하고 면역 반응을 억제하는 HLA-G의 능력은 눈에서의 이식편 거부 및 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 기타 눈 장애의 치료 및/또는 예방에 도달한다.
본 발명의 한 측면은 인간 백혈구 항원-G (HLA-G)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 막횡단 형태의 HLA-G (HLA-G1) 및/또는 가용성 형태의 HLA-G (HLA-G5)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산은 서열식별번호:1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80％ 동일한, 예를 들어, 서열식별번호:1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 HLA-G 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 HLA-G 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 기능성 HLA-G 폴리펩티드는 전장 HLA-G의 생물학적 활성, 예를 들어, 면역억제제 및/또는 항혈관 활성의 적어도 약 25％, 50％, 또는 75％를 유지하는 전장 HLA-G 폴리펩티드의 일부분이다. 기능성 HLA-G 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편은 야생형 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 연속적 및/또는 비-연속적 결실을 포함할 수 있다.
생물에서의 발현을 최대화하도록 뉴클레오티드 서열을 코돈-최적화하는 방법은 관련 분야에 널리 공지되어 있고, 대중적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. HLA-G의 야생형 뉴클레오티드 서열은 관련 분야에 공지되어 있고, 본원에서 서열식별번호: 4로서 기술된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 코돈-최적화 서열은 야생형 서열에 비교하여 인간 세포에서의 강화된 HLA-G 발현, 예를 들어, 야생형 서열에 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 또는 5배의 발현 증가, 또는 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％, 150％, 200％, 또는 300％의 발현 강화를 제공한다.
본 발명은 HLA-G를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 또한 제공한다. 특정 실시양태에서, HLA-G 폴리뉴클레오티드는 야생형 HLA-G 서열 또는 코돈-최적화 서열이다. 발현 카세트는 HLA-G1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HLA-G5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 양쪽 모두를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 HLA-G1 또는 HLA-G5를 택일적으로 발현하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 택일적 발현은 차별적인 스플라이싱, 예를 들어, 인트론 공여자/수용자 부위의 존재에 기인할 수 있고, 이는, 예를 들어, HLA-G의 막횡단 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 주변에 있다. 선천적으로, HLA-G1 및 HLA-G5는 HLA-G1의 C-말단의 아미노산 ~25개의 막횡단 도메인 이전에 HLA-G5를 종결시키는 차별적인 스플라이싱에 의해 생산된다. 이러한 실시양태에서, 2개의 상이한 엑손으로의 스플라이싱을 허용하는 제어가능한 합성 인트론이 동일한 프로모터로부터 HLA-G1 및 HLA-G5를 생산하는데 사용될 수 있다.
발현 카세트는 추가적인 발현 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터일 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적 또는 선호형 프로모터 또는 세포 유형-특이적 또는 선호형 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 각막-특이적 프로모터, 예를 들어, 케라토칸(keratocan)일 수 있다. 발현 카세트가 1개를 초과하는 HLA-G 오픈 리딩 프레임을 포함하는 경우, 일부 실시양태에서, 각각의 오픈 리딩 프레임은 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다중 HLA-G 오픈 리딩 프레임이 단일 발현 제어 요소 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터 게놈, 예를 들어, 파르보바이러스 벡터 게놈, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 게놈의 일부분일 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 하나의 AAV 역전 말단 반복부 (ITR), 예를 들어, 2개의 AAV ITR을 추가로 포함할 수 있다. 2개의 ITR은 뉴클레오티드 서열이 동일할 수 있거나 또는 뉴클레오티드 서열이 상이할 수 있다. AAV ITR은 임의의 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV2로부터의 것일 수 있다. 각각의 ITR은 독립적으로 야생형 서열 또는 변형 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 AAV 게놈, 예를 들어, 자기-상보적 AAV 게놈이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 적절한 벡터는 플라스미드, 파지, 파지미드, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 알파바이러스, 또는 배큘로바이러스 벡터), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 효모 인공 염색체 (YAC)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 핵산은 5' 및/또는 3' 말단 반복부 (예를 들어, 5' 및/또는 3' AAV 말단 반복부)를 포함하는 AAV 벡터를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 파르보바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, AAV8 또는 AAV9 벡터이다. 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 주형을 포함하는 핵산을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 핵산은 파르보바이러스 캡시드에 의해 캡시드화된다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 파르보바이러스 입자 (예를 들어, 재조합 AAV 입자)를 추가로 제공한다. 바이러스 벡터 및 바이러스 입자가 하기에서 추가로 논의된다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 본 발명의 캡시드 단백질의 존재에 기인하는 변형된 향성을 나타낸다. 한 실시양태에서, 파르보바이러스 벡터는 각막 및/또는 눈의 또 다른 조직에 대한 침투성 향성을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 파르보바이러스 벡터는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 벡터에 비교하여 간에 대한 향성이 감소되었다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터를 포함하는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터는 세포 게놈 내로 안정하게 혼입된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 제약상 허용되는 담체 내의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 제약 제형에 관한 것이다.
바이러스 벡터를 생산하는 방법
본 발명은 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 본 발명은 파르보바이러스 복제에 대해 허용성인 세포에 (a) (i) 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트, 및 (ii) 파르보바이러스 ITR을 포함하는 재조합 파르보바이러스 주형; (b) Rep 및 Cap 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 파르보바이러스 주형의 복제 및 패키징에 충분한 조건 하에 제공하고, 이에 의해 세포에서 재조합 파르보바이러스 입자가 생산되는 것을 포함하는, 재조합 파르보바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 재조합 파르보바이러스 주형의 복제 및 패키징에 충분한 조건은, 예를 들어, 파르보바이러스 주형의 복제 및 파르보바이러스 캡시드 내로의 캡시드화에 충분한 AAV 서열 (예를 들어, 파르보바이러스 rep 서열 및 파르보바이러스 cap 서열), 및 아데노바이러스 및/또는 헤르페스바이러스로부터의 헬퍼 서열의 존재일 수 있다. 특정 실시양태에서, 파르보바이러스 주형은 2개의 파르보바이러스 ITR 서열을 포함하고, 이들은 이종성 핵산 서열에 대해 5' 및 3'에 위치하지만, 이에 직접적으로 연속적일 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 재조합 파르보바이러스 주형은 국제 특허 공보 WO 01/92551에 기술된 바와 같이 Rep에 의해 풀리지 않아 듀플렉스화 AAV 벡터를 만드는 ITR을 포함한다.
파르보바이러스 캡시드 내에 패키징된 파르보바이러스 주형을 포함하는 바이러스 벡터가 세포 내에서 생산되도록 하는 조건 하에 파르보바이러스 주형 및 파르보바이러스 rep 및 cap 서열이 제공된다. 방법은 세포로부터 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 벡터를 배지로부터 및/또는 세포를 용해시킴으로써 수집할 수 있다.
세포는 파르보바이러스 바이러스 복제에 대해 허용성인 세포일 수 있다. 관련 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 세포를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 영장류 또는 인간 세포)이다. 추가적인 옵션으로서, 세포는 복제-결손 헬퍼 바이러스로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-보완 패키징 세포주, 예를 들어, 293 세포 또는 기타 E1a 트랜스-보완 세포일 수 있다.
파르보바이러스 복제 및 캡시드 서열은 관련 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제공될 수 있다. 현행 프로토콜은 전형적으로 단일 플라스미드 상의 파르보바이러스 rep/cap 유전자를 발현시킨다. 파르보바이러스 복제 및 패키징 서열은 함께 제공될 필요는 없지만, 그렇게 하는 것이 편리할 수 있다. 파르보바이러스 rep 및/또는 cap 서열은 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, rep/cap 서열은 하이브리드 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다 (예를 들어, 결실형 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 영역 내로 삽입됨). EBV 벡터를 파르보바이러스 cap 및 rep 유전자를 발현시키는데 또한 사용할 수 있다. 이러한 방법의 한 장점은 EBV 벡터가 에피솜성이지만, 연속적인 세포 분열 전반에 걸쳐 높은 카피수를 유지할 것이다 (즉, "EBV 기반 핵 에피솜"으로서 지정된 염색체외 요소로서 세포 내로 안정하게 통합된다)라는 것이다 (문헌 [Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67]을 참조한다).
추가 대안으로서, rep/cap 서열은 세포 내로 안정하게 혼입될 수 있다.
전형적으로, 파르보바이러스 rep/cap 서열의 구제 및/또는 패키징을 방지하기 위해, 이러한 서열에 TR이 플랭킹되지 않을 것이다.
관련 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 파르보바이러스 주형을 세포에 제공할 수 있다. 예를 들어, 비-바이러스 (예를 들어, 플라스미드) 또는 바이러스 벡터에 의해 주형이 공급될 수 있다. 특정 실시양태에서, 파르보바이러스 주형은 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 의해 공급된다 (예를 들어, 결실형 아데노바이러스의 E1a 또는 E3 영역 내로 삽입됨). 또다른 예시로서, 문헌 [Palombo et al., (1998) J. Virology 72:5025]은 AAV TR이 플랭킹된 리포터 유전자를 보유하는 배큘로바이러스 벡터를 기술한다. rep/cap 유전자에 관하여 상기 기술된 바와 같이, EBV 벡터가 주형을 전달하는데 또한 사용될 수 있다.
또 다른 대표적인 실시양태에서, 파르보바이러스 주형은 복제성 rAAV 바이러스에 의해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 파르보바이러스 주형을 포함하는 AAV 프로바이러스가 세포의 염색체 내로 안정하게 통합된다.
바이러스 역가를 강화하기 위해, 생산성 파르보바이러스 감염을 촉진하는 헬퍼 바이러스 기능 (예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)이 세포에 제공될 수 있다. 파르보바이러스 복제에 필요한 헬퍼 바이러스 서열이 관련 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 서열은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공될 것이다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열이 또 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해, 예를 들어, 문헌 [Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295], 및 미국 특허 번호 6,040,183 및 6,093,570에 기술된 바와 같이 효율적인 파르보바이러스 생산을 촉진하는 모든 헬퍼 유전자를 보유하는 비-감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서 제공될 수 있다.
추가로, 염색체 내에 매립되어 있거나 또는 안정적인 염색체외 요소로서 유지되는 헬퍼 서열이 있는 패키징 세포에 의해 헬퍼 바이러스 기능이 제공될 수 있다. 일반적으로, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온 내로 패키징될 수 없고, 예를 들어, ITR이 플랭킹되지 않는다.
관련 분야의 기술자는 파르보바이러스 복제 및 캡시드 서열 및 헬퍼 바이러스 서열 (예를 들어, 아데노바이러스 서열)을 단일 헬퍼 구축물 상에서 제공하는 것이 유리할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 헬퍼 구축물은 비-바이러스 또는 바이러스 구축물일 수 있다. 한 비제한적인 예시로서, 헬퍼 구축물은 AAV rep/cap 유전자를 포함하는 하이브리드 아데노바이러스 또는 하이브리드 헤르페스바이러스일 수 있다.
한 특정 실시양태에서, 파르보바이러스 rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이러한 벡터는 파르보바이러스 주형을 추가로 포함할 수 있다. 파르보바이러스 rep/cap 서열 및/또는 파르보바이러스 주형은 아데노바이러스의 결실된 영역 (예를 들어, E1a 또는 E3 영역) 내로 삽입될 수 있다.
추가 실시양태에서, 파르보바이러스 rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이러한 실시양태에 따르면, 파르보바이러스 주형이 플라스미드 주형으로서 제공될 수 있다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 파르보바이러스 rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공되고, 파르보바이러스 주형은 프로바이러스로서 세포 내로 통합된다. 대안적으로, 파르보바이러스 주형은 세포 내에서 염색체외 요소로서 (예를 들어, EBV 기반 핵 에피솜으로서) 유지되는 EBV 벡터에 의해 제공된다.
추가의 예시적인 실시양태에서, 파르보바이러스 rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼에 의해 제공된다. 파르보바이러스 주형은 별개의 복제성 바이러스 벡터로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 파르보바이러스 주형은 파르보바이러스 입자 또는 제2 재조합 아데노바이러스 입자에 의해 제공될 수 있다.
상기 방법에 따르면, 하이브리드 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 복제 및 패키징에 충분한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스 서열 (즉, 아데노바이러스 말단 반복부 및 PAC 서열)을 전형적으로 포함한다. 파르보바이러스 rep/cap 서열 및 존재하는 경우의 AAV 주형은 아데노바이러스 백본 내에 매립되고, 5' 및 3' 시스 서열이 이에 플랭킹되어, 이러한 서열들이 아데노바이러스 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 파르보바이러스 rep/cap 서열은 이러한 서열들이 파르보바이러스 비리온 내로 패키징되지 않도록 일반적으로 ITR이 플랭킹되지 않는다.
문헌 [Zhang et al., (2001) Gene Ther. 18:704-12]에는 아데노바이러스 및 AAV rep 및 cap 유전자 양쪽 모두를 포함하는 키메라 헬퍼가 기술되어 있다.
헤르페스바이러스 또한 파르보바이러스 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있다. 파르보바이러스 Rep 단백질(들)을 코딩하는 하이브리드 헤르페스바이러스가 유리하게 확장성 파르보바이러스 벡터 생산 계획을 용이하게 할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 하이브리드 제I형 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV-1) 벡터가 기술되어 있다 (문헌 [Conway et al., (1999) Gene Ther. 6:986] 및 WO 00/17377).
추가 대안으로서, 예를 들어, 문헌 [Urabe et al., (2002) Human Gene Ther. 13:1935-43]에 기술된 바와 같이, rep/cap 유전자 및 파르보바이러스 주형을 전달하기 위해 배큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 본 발명의 바이러스 벡터가 생산될 수 있다.
오염성 헬퍼 바이러스가 없는 파르보바이러스 벡터 스톡을 관련 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 파르보바이러스 및 헬퍼 바이러스는 크기를 기초로 쉽게 구별될 수 있다. 또한 파르보바이러스는 헤파린 기질에 대한 친화성을 기초로 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다 (Zolotukhin et al., (1999) Gene Therapy 6:973). 임의의 오염성 헬퍼 바이러스가 복제 적격성이지 않도록 결실형 복제-결손 헬퍼 바이러스를 사용할 수 있다. 추가 대안으로서, 후기 유전자 발현이 결여된 아데노바이러스 헬퍼를 사용할 수 있는데, 아데노바이러스 초기 유전자 발현만이 파르보바이러스 패키징을 매개하는데 요구되기 때문이다. 후기 유전자 발현에 대해 결손성인 아데노바이러스 돌연변이체가 관련 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이체).
재조합 바이러스 벡터
본 발명의 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서, 생체 외에서 및 생체 내에서 세포에 전달하는데 유용하다. 특히, 이러한 바이러스 벡터는 핵산을 포유동물 세포를 포함하는 동물 세포에 배달 또는 전달하는데 유리하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바이러스 벡터는 HLA-G를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체의 눈에 또는 이식이 의도되는 눈 조직, 예를 들어, 각막 체외이식편에 전달하는데 유용하다.
관련 분야의 기술자는 HLA-G를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적합한 제어 서열과 작동가능하게 회합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 발현 제어 요소, 예컨대 전사/번역 제어 신호, 복제 기원, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 프로모터, 및/또는 인핸서 등과 작동가능하게 회합될 수 있다.
관련 분야의 기술자는 다양한 프로모터/인핸서 요소가 원하는 수준 및 조직-특이적 발현에 따라 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 프로모터/인핸서는 원하는 발현 패턴에 따라 구성적 또는 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 선천적 또는 외래성일 수 있고, 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래는 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서 이러한 전사 개시 영역이 발견되지 않는다는 것을 의도한다.
특정 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 치료될 표적 세포 또는 대상체에 대해 선천적일 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 HLA-G 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 선천적일 수 있다. 일반적으로 프로모터/인핸서 요소는 관심 표적 세포(들)에서 기능하도록 선택된다. 추가로, 특정 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유동물 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
핵산 서열의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 용도에서 전형적으로 유도성 발현 제어 요소가 유리하다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직-특이적 또는 -선호형 프로모터/인핸서 요소일 수 있고, 눈 특이적 또는 선호형 (망막-특이적 및 각막-특이적을 포함함) 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 기타 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르모-유도성 및 금속-유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온(on)/오프(off) 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드 서열이 표적 세포에서 전사된 후 번역되는 실시양태에서, 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적인 개시 신호가 일반적으로 포함된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 이러한 외인성 번역 제어 서열은 천연 및 합성 양쪽 모두로 기원이 다양할 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 파르보바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터일 수 있다. AAV 벡터는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV8, 또는 AAV9 벡터이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 하이브리드 벡터, 예를 들어, 한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 또 다른 혈청형으로부터의 게놈이 있는 것 또는 합성 캡시드 단백질이 있는 것이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 향성이 변경된 하이브리드 캡시드를 포함한다. 한 예에서, 한 혈청형 (예를 들어, AAV9)으로부터의 글리칸 결합 부위 (예를 들어, 갈락토스 결합 부위)를 또 다른 혈청형 (예를 들어, AAV8)으로부터의 캡시드 서열 내에 포함하는 하이브리드 캡시드 (예를 들어, 본원에 전문이 참조로 포함된 WO 2014/144229를 참조한다).
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 HLA-G 폴리뉴클레오티드를 분열 중인 세포 및 분열 중이지 않은 세포를 포함하여 광범위한 세포 내로 전달하는 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 세포에 전달하는데, 예를 들어, 시험관 내에서 또는 생체외 유전자 요법을 위해 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 바이러스 벡터는, 예를 들어, HLA-G를 발현시키기 위해, 폴리뉴클레오티드를 필요로 하는 대상체에게 이를 전달하는 방법에서 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드가 대상체에서 생체 내에서 생산될 수 있다. 대상체는 폴리펩티드를 대상체에 이러한 폴리펩티드의 결핍이 있기 때문에 필요로 할 수 있다. 추가로, 대상체에서의 폴리펩티드 생산이 어떤 이로운 효과를 부여할 수 있기 때문에 이러한 방법이 실행될 수 있다.
바이러스 벡터는 배양된 세포에서 또는 대상체에서 HLA-G를 생산하는데 사용될 수도 있다 (예를 들어, 대상체를 폴리펩티드를 생산하거나 대상체에 대한 폴리펩티드의 효과를 관찰하기 위한 생물반응기로서, 예를 들어, 스크리닝 방법과 함께, 사용함).
본 발명의 바이러스 벡터는 HLA-G를 전달하는 것이 이로운 임의의 질환 상태 또는 병태, 예를 들어, 각막 이식편 거부, 면역-매개 건성안, 알레르기성 결막염, 면역-매개 포도막염, 또는 연령-관련 황반 변성/만성 혈관신생을 치료 및/또는 예방하기 위해 HLA-G를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 진단 및 스크리닝 방법에서 용도가 확인되고, 이에 의해 HLA-G 폴리뉴클레오티드가 세포 배양 시스템에서, 기관 또는 기관 배양물 (예를 들어, 눈)에서, 또는 대안적으로 트랜스제닉 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정하게 발현된다.
본 발명의 바이러스 벡터는 관련 분야의 기술자에게 명백할 바와 같은, 유전자 표적화, 소거, 전사, 번역 등을 평가하기 위한 프로토콜에서의 용도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 비-치료 목적으로 또한 사용될 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 안전성 (확산, 독성, 면역원성 등)을 평가하는 목적으로도 사용될 수 있다. 이같은 데이터는, 예를 들어, 미국 식품의약국에 의해 임상 효능 평가 전의 규제 승인 과정의 일부로서 간주된다.
대안적으로, 바이러스 벡터는 생체 외에서 세포에 투여될 수 있고, 변경된 세포는 대상체에 투여된다. HLA-G 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터가 세포 내로 도입되고, 세포가 대상체에게 투여되며, 대상체에서 핵산이 발현될 수 있다.
대상체, 제약 제형, 및 투여 방식
본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 캡시드는 수의학 및 의학 용도 양쪽 모두에서 용도가 확인된다. 적절한 대상체는 조류 및 포유동물 양쪽 모두를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조류"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 꿩, 앵무새, 잉꼬 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 인간, 비-인간 영장류, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼목 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 대상체는 신생아, 영아, 청소년 및 성인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 장애로 진단되었거나 또는 이러한 장애에 걸린 것으로 추정되는 대상체이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 내의 본 발명의 바이러스 벡터를 포함하고, 임의적으로, 다른 의약품, 약제, 안정화제, 완충제, 담체, 아주반트, 희석제 등을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 주사의 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡성일 것이고, 임의적으로는 고체 또는 액체 입상물질 형태일 수 있다.
"제약상 허용되는"은 독성이거나 다른 방식으로 바람직하지 않은 물질을 의미하고, 즉, 이러한 물질은 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 야기하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 핵산을 시험관 내에서 세포에 전달하는 방법이다. 특정 표적 세포에 적절한 표준 형질도입 방법에 따라 바이러스 벡터가 적합한 감염 다중도로 세포 내로 도입될 수 있다. 투여되는 바이러스 벡터의 역가는 표적 세포 유형 및 개수, 및 특정 바이러스 벡터에 따라 변할 수 있고, 과도한 실험 없이 관련 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 적어도 약 103개의 감염 단위, 더욱 바람직하게는 적어도 약 105개의 감염 단위가 세포에 도입된다.
바이러스 벡터가 도입되는 세포(들)는 눈의 세포 (망막 세포, 망막 색소 상피, 섬모체 상피, 및 각막 세포 (예를 들어, 각막기질세포, 상피 세포, 및 내피 세포)를 포함함) 및 면역 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의 유형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 HLA-G 발현을 위해 눈에 전달될 세포, 예컨대 줄기 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포이다. 또한, 세포는 상기 지시된 바와 같이 임의의 기원 종으로부터의 것일 수 있다.
변형된 세포를 대상체에게 투여하기 위한 목적으로 시험관 내에서 세포 내로 바이러스 벡터를 도입할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 제거되었고, 바이러스 벡터를 그 안에 도입한 후, 세포를 다시 대상체 내로 투여한다. 생체 외에서의 조작을 위해 대상체로부터 세포를 제거한 후 다시 대상체 내로 도입하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346을 참조한다). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터를 공여자 대상체로부터의 세포 내로, 배양된 세포 내로 또는 임의의 다른 적절한 공급원으로부터의 세포 내로 도입할 수 있고, 이러한 세포를 이를 필요로 하는 대상체 (즉, "수용자" 대상체)에 투여한다.
생체외 유전자 전달을 위한 적절한 세포는 상기 기술된 바와 같다. 대상체에게 투여할 세포의 투여량은 대상체의 나이, 상태 및 종, 세포의 유형, 세포가 발현하는 핵산, 투여 방식 등에 따라 다를 것이다. 전형적으로, 용량 당 적어도 약 102 내지 약 108개의 세포 또는 적어도 약 103 내지 약 106개의 세포가 제약상 허용되는 담체 내에서 투여될 것이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터가 형질도입된 세포는 제약 담체와 조합되어 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 대상체에게 투여된다.
본 발명의 추가 측면은 바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 방법이다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 인간 대상체 또는 동물에게 투여하는 것은 관련 분야에 공지된 임의의 수단에 의해서 행해질 수 있다. 임의적으로, 바이러스 벡터는 제약상 허용되는 담체 내에서 치료 유효 용량 또는 예방 유효 용량으로 전달된다.
대상체에게 투여될 바이러스 벡터의 투여량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방될 질환 또는 병태, 개별적인 대상체의 상태, 특정 바이러스 벡터, 및 전달될 핵산 등에 의존적이고, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 예시적인 용량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개의 형질도입 단위, 임의적으로는 약 108개 내지 약 1015개 또는 약 108개 내지 약 1013개의 형질도입 단위의 역가이다.
특정 실시양태에서, 1회를 초과하는 투여 (예를 들어, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)가 다양한 간격의 기간에 걸쳐, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등으로 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하는데 사용될 수 있다.
눈으로의 예시적인 투여 방식은 기질내, 국소, 유리체내, 전방내, 결막하, 망막하, 공막위, 공막내, 눈주위, 맥락막위, 안구뒤, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
표적 조직으로의 전달은 바이러스 벡터를 포함하는 저장소를 전달하는 것에 의해 달성될 수도 있다. 대표적인 실시양태에서, 바이러스 벡터를 포함하는 저장소가 각막 또는 눈의 기타 조직 내로 이식되거나, 또는 이러한 조직이 바이러스 벡터를 포함하는 필름 또는 기타 매트릭스와 접촉될 수 있다. 이같은 이식가능한 매트릭스 또는 기판이 미국 특허 번호 7,201,898에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 세포를 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 HLA-G를 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 세포에서 HLA-G를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 세포에서 발현된다.
본 발명의 추가 측면은 각막 체외이식편을 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 HLA-G를 각막 체외이식편에 전달하는 것을 포함하는, HLA-G를 각막 체외이식편에 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 각막 체외이식편을 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 이식 후의 각막 체외이식편의 거부를 억제하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 이식 후의 각막 체외이식편의 거부를 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이식은 동종이형 이식이다. 일부 실시양태에서, 이식은 이종이식이다. 일부 실시양태에서, 각막 체외이식편은 비-영장류, 예를 들어, 돼지로부터의 것이고, 영장류, 예를 들어, 인간에게 이식된다.
본 발명의 또 다른 측면은 각막 체외이식편을 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 각막 체외이식편의 이식, 예를 들어, 이종이식을 수행하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 각막 체외이식편은 영장류, 예를 들어, 인간으로부터의 것이고, 영장류, 예를 들어, 인간에게 이식된다. 일부 실시양태에서, 각막 체외이식편은 비-영장류, 예를 들어, 돼지로부터의 것이고, 영장류, 예를 들어, 인간에게 이식된다.
일부 실시양태에서, 각막 체외이식편은 이식 전에 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 각막 체외이식편은 이식 동안 및/또는 후에 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 각막 체외이식편은 이식 전, 동안, 및/또는 후에 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉된다. AAV 입자 또는 제약 조성물은 체외이식편에서 HLA-G를 발현시키는데 효과적인 임의의 수단에 의해 체외이식편에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 입자 또는 제약 조성물은 체외이식편 내로 주사된다. 일부 실시양태에서, AAV 입자 또는 제약 조성물에서 체외이식편이 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 각막 체외이식편에서 발현된다.
본 발명의 추가적인 측면은 포유동물 대상체의 눈에 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉된 세포를 투여하고, 이에 의해 HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물 대상체의 눈에 본 발명의 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물을 투여하고, 이에 의해 HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 눈에서 또는 눈의 일부 또는 조직에서 발현된다.
본 발명의 추가 측면은 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체의 눈에 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물과 접촉된 세포를 투여하고, 이에 의해 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포이다.
본 발명의 추가적인 측면은 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체의 눈에 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물을 투여하고, 이에 의해 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 눈에서 또는 눈의 일부 또는 조직에서 발현된다.
AAV 입자 또는 제약 조성물은 전달에 효과적인 것으로 관련 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 눈에 또는 눈의 일부분에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 입자 또는 제약 조성물은 기질내, 국소, 유리체내, 전방내, 결막하, 망막하, 공막위, 공막내, 눈주위, 맥락막위, 안구뒤, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애는 면역 반응과 연관된 장애이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 면역 반응과 연관된 장애는 세포성 및/또는 체액성 면역 반응이 장애의 하나 이상의 증상의 원인이고, 면역 반응 억제가 장애의 하나 이상의 증상의 호전을 초래하는 장애이다. 예는, 비제한적으로, 이식편 거부, 면역-매개 건성안, 알레르기성 결막염, 및 면역-매개 포도막염을 포함한다. HLA-G1 발현이 면역 반응의 억제와 연관된다. 따라서, 면역 반응과 연관된 눈 장애의 치료는 HLA-G1, 또는 HLA-G1 및 HLA-G5 양쪽 모두의 발현에 의해 치료될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애는 혈관화와 연관된 장애이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 혈관화와 연관된 장애는 혈관화가 장애의 하나 이상의 증상의 원인이고, 혈관화 억제가 장애의 하나 이상의 증상의 호전을 초래하는 장애이다. 예는, 비제한적으로, 각막 외상, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 눈 후방에서의 혈관화, 맥락막 혈관신생, 및 신생혈관 녹내장을 포함한다. HLA-G5 발현이 혈관화 억제와 연관된다. 따라서, 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료는 HLA-G5, 또는 HLA-G5 및 HLA-G1 양쪽 모두의 발현에 의해 치료될 수 있다.
일부 실시양태에서, HLA-G1 및 HLA-G5가 함께 발현되는 것이 다른 폴리펩티드가 단독으로 발현되는 것보다 더 효과적이고, 예를 들어, 부가적 또는 상승작용성 효과가 있다.
눈에서 또는 체외이식편에서 HLA-G1 및 HLA-G5 양쪽 모두가 발현되는 것은 양쪽 폴리펩티드를 발현하는 단일 벡터를 사용하여 또는 각각 폴리펩티드 중 하나를 발현하는 별개의 벡터들을 사용하여 수행될 수 있다. 별개의 벡터들을 사용하는 경우, 벡터들은 동일한 조성물에서 또는 순차적으로 또는 상이한 시간에 투여되는 별개의 조성물에서 투여될 수 있다.
주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 내에 용해 또는 현탁시키는데 적절한 고체 형태, 또는 에멀션으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 캡시드를, 예를 들어, 저장소 또는 지속 방출 제형에서, 국소적인 방식으로 투여할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 캡시드가 수술에 의해 이식할 수 있는 매트릭스에 부착되어 전달될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004-0013645에 기술된 바와 같음).
본 발명이 기술되었지만, 하기 실시예에서 본 발명이 더욱 상세하게 설명될 것이고, 이는 설명의 목적을 위해서만 본원에 포함되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
HLA-G의 AAV 벡터-매개 발현이 손상-유도 각막 혈관화 및 면역 세포 침윤을 감소시킨다
이러한 연구의 목적은 손상 후의 각막 혈관화의 치료를 위해, 면역 억제의 천연 메커니즘을 기초로 하는 치료제를 조작하고 입증하기 위한 것이었다. 이를 위해, HLA-G cDNA를 코돈 최적화에 의해 강화하고, 시험관 내에서 자기-상보적 AAV 벡터 환경에서 입증하였다. 그 후, 최적화된 HLA-G1 및 5 카세트를 다종 각막 유전자 전달에 능숙한 캡시드 내에 패키징하고 (Vance et al., Scientific Rep. 6:22131 (2016)), 토끼 모델에서의 각막의 화학 화상 8일 후에 기질내 주사를 통해 투여하였다. 과도하게 혈관화된 대조군 주사 각막에 대조적으로, scAAV8G9-optHLA-G가 제공된 각막은 손상 후의 2개월 기간에 걸쳐 혈관구조의 거의 완전한 부재를 입증하였다. 이러한 결과는 각막의 면역 세포 침윤 감소와 커플링되었고, 이는 세포독성 T 림프구를 포함하였다. 외상을 입은 각막의 기질내 주사 후의 생체분포에 관련하여, 벡터 게놈은 각막 외부에서 검출되지 않았지만, AAV 캡시드 중화 항체 반응은 약 50％의 사례에서 도출되었다. 총괄적 데이터는 각막의 혈관화를 제거하는 scAAV8G9-optHLA-G의 임상 잠재력을 입증하는 한편, 동종이형 기관 이식의 가능성 및 안구 표면 면역에서의 더 광범위한 역할을 암시한다.
물질 및 방법
최적화된 AAV HLA-G 구축물 및 시험관내 발현: HLA-G1 cDNA를 코돈 최적화하고 (진스크립트 유에스에이(GenScript USA), 뉴저지주 피스카타웨이), 웨스턴 블롯 검출을 사용하여 WT 또는 코돈-최적화 HLA-G1 cDNA로부터의 플라스미드-보유 HLA-G1의 양을 비교하였다. 그 후, PCR 증폭을 사용하여, HLA-G1의 막횡단 도메인을 결실시켜 가용성 아이소형인 HLA-G5 cDNA를 생성시켰다. 인간 배아 신장 293 세포에서의 이러한 플라스미드의 형질감염 후, 세포 용해물을 제조하고, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여, 생성된 단백질 생성물의 크기를 검출하였다. 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB)으로의 면역세포화학을 사용하여, 형질감염된 293 세포에서의 HLA-G1 및 HLA-G5의 세포내 국소화를 관찰하였다. 인간 태반 세포 (JEG-3 세포)를 양성 대조군으로서 사용하였다 (ATCC® HTB36™). 그 후, HLA-G1 및 HLA-G5 양쪽 모두를 자기-상보적 AAV 플라스미드 환경 내로 클로닝하였다.
scAAV8G9-optHLA-G의 기질내 주사 후의 생체내 HLA-G 발현: 이러한 연구에서의 동물 사용은 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)을 철저히 준수하였고, 프로토콜은 노스캐롤라이나 주립 대학교 동물 사용 및 관리 위원회(North Carolina State University Institutional Animal Use and Care committee) (IACUC)에 의해 승인 및 모니터링되었다. 비근교계 정상 수컷 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 토끼 (오릭토라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus))를 사용하였다. 토끼를 마취하고, 국소 마취제 (0.5％ 프로파라카인 HCl [알카인(Alcaine), 알콘 래버러토리즈(Alcon Laboratories), 텍사스주 포트워스])를 적용한 후, 중심 각막에 30초 동안 20 ㎕의 1 M NaOH에서 인큐베이션된 5.0 mm-직경 원형 필터 디스크를 적용함으로써 오른쪽 눈에서 각막 상처를 생성시켰다 (Wang et al., Ophthalmic Res. 46:66 (2011); Ye et al., Eye 20:482 (2006)). 각막에 상처를 내고 나서 7일 후, 각각의 토끼를 마취하고, 양쪽 눈에 식염수 용액 (평형 염 용액 (BSS), 알콘 래버러토리즈, 텍사스주 포트워스), 또는 GFP를 코딩하는 scAAV8G9 벡터, 또는 1:1 비의 HLA-G1 + HLA-G5 벡터의 조합물의 기질내 주사를 제공하였다 (각각의 처리군에 대해 n=3). 각각의 주사에 대해, 31-게이지 바늘을 사용하여 50 ㎕의 식염수 용액 또는 1×109 vg/㎕ 바이러스 농도의 AAV 벡터를 표재성 각막 기질 내로 전달하였다. 상처 입히기 및 기질내 주사 후, 예방용 항생제 (목시플록사신(Moxifloxacin), 알콘 래버러토리즈, 텍사스주 포트워스)를 각각의 각막에 국소적으로 적용하고, 부프레노르핀(buprenorphine)을 피하로 제공하여, 수술후 불쾌감을 감소시키는 것을 도왔다. 주사 후에 의식이 있을 때, scAAV8G9-GFP가 주사된 토끼에서 주사 레이저 검안경 (SLO) + 482 nm 레이저 광원 (인프라레드 cSLO(Infrared cSLO); 독일의 레티맵 롤랜드 컨설트(RetiMap Roland Consult), 독일 비스바덴)을 사용하여 GFP의 생체내 발현을 평가하였다. 그 후, 보정된 총 세포 형광 (CTCF)을 계산하기 위한 이전에 기술된 방법을 사용하여 생체내 영상으로부터 GFP 형광 발현의 강도를 정량하였고, 여기서 CTCF는 적분 밀도 - (선택된 세포 / 형광의 면적 × 배경 판독치의 평균 형광)이다 (Burgess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:12564 (2010); McCloy et al., Cell cycle (Georgetown, Tex.) 13:1400 (2014)).
생체 내에서의 각막 혈관화에 대한 scAAV8G9-optHLA-G의 효과: 세극등 생체현미경검사 및 사진촬영술, 중심 각막 각막두께측정 (패크펜 핸드헬드 패키미터(PachPen Handheld Pachymeter), 애큐톰(Accutome), 펜실베이니아주 말번), 및 안구내 압력 (IOP; 토노벳(Tonovet) 압력계, 아이케어(Icare), 핀란드)을 제0일 (상처 입히기 전)에, 그리고 이후의 56일 동안 2-3일마다 수행함으로써, 혈관신생을 모니터링하였다. 각각의 생체내 세극등 생체현미경 영상 파일을 이미지J(ImageJ)를 통해 8-비트로 변환하고, 모든 흑색 및 백색 값을 반전시키는 것과 함께 가장자리 찾기 및 대비 강화 프로세스로 혈관구조의 시각화를 증가시킴으로써 혈관화를 정량하였다. 그 후, 변환된 영상을 GNU 이미지 조작 프로그램 (GIMP 2.8.20)에서 열고, 투명한 오버레이 층을 각각의 영상 파일에 부가하고, 혈관을 새로운 층 상에 수동으로 트레이싱하고, 마지막으로, 트레이싱된 혈관의 면적을 이미지J를 사용하여 총 픽셀 수로 변환하였다.
손상 각막에서의 HLA-G의 발현 및 HLA-G에 의한 면역 관용의 재확립: 토끼를 안락사시키고, 눈을 회수하고, 철야로 4℃에서 중성 완충 포르말린 내에 후고정시킨 후, 파라핀에 매립할 때까지 70％ EtOH에서 보관하였다. 조직을 5 μM로 절편화하고, 각막 혈관구조의 정량 (CD31)에 대해, 그리고 CD3, CD8, 및 CD4를 사용하여 면역 반응에 대해 조직병리학적으로 평가하였다. 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 절편을 광현미경검사로 검사하였다. 각막의 조직학적 채점 체계를 이전에 기술된 방법 (Mercadal et al., J. Virol. 67:3404 (1993))으로부터 변형시키고, 면적, 세포 침윤물의 정도, 섬유화 정도, 및 혈관화 정도에 따라 등급화하였다. 하기의 규정을 기초로 0-4점을 할당하였다: 0, 유의한 병변 없음; 1, 낮은 개수의 염증 세포, 경도의 섬유화, 최소 혈관화; 2, 중등도의 광범위한 기질 염증 세포 침윤물, 섬유화, 또는 혈관신생; 3, 중등도 내지 현저한 광범위한 기질 염증 세포 침윤물, 섬유화, 또는 혈관신생; 4, 현저한 광범위한 세포 침윤물, 섬유화, 혈관화. 그 후, 누적 조직학 점수를 분석하고, 처리군 당 평균 ± 표준 편차 (SD)로서 보고하였다.
면역조직화학: 각막 조직을 파라핀에 매립하고, 마이크로톰을 사용하여 5 ㎛ 절편을 절단한 후, 슬라이드 상에 마운팅하고 건조시켰다. 조직 절편을 염색하고 알렉스 플루오르(Alexa Fluor) 접합 2차 항체를 사용하여 형광을 영상화하기 위해, 절편을 탈파라핀화시키고, 재수화시켰다. 슬라이드를 크실렌에서 각각 5분으로 2회 인큐베이션함으로써 탈파라핀화를 수행하였다. 감소되는 에탄올 구배를 사용하여, 각각 3분 동안 100％ 에탄올에서의 2회 인큐베이션, 95％에서의 1회의 인큐베이션, 80％에서의 1회의 인큐베이션으로 슬라이드를 순차적으로 이동시킴으로써 조직을 재수화시키고, 마지막으로 탈이온수에서 적어도 5분 동안 헹궜다. 조직 절편을 염색하기 전에, 열-유도 에피토프 복구 (HEIR) 절차를 98℃에서 15-20분 동안 수행하여, 파라핀화 공정 동안 가교된 단백질의 에피토프를 드러냈다. 구체적으로, HLA-G (산타 크루즈(Santa Cruz), sc-21799, 희석 1:50), GFP (아베스(Aves), gfp-1020, 희석 1:500), CD3 (바이오르비트(Biorbyt), orb323391, 1:100), CD4 (인비트로젠(Invitrogen), MA1-81588, 1:100), 및 CD8 (노부스 바이올로지컬스(Novus Biologicals, NB10064021, 1:100)에 대해 염색된 절편을 예비-가열된 시트레이트 기반 항원 복구 용액, pH 6.0 (벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories), H-3300) 내로 함침시킨 한편, CD31 (앱캠(Abcam), ab199012, 1 ㎍/ml) 에피토프는 1 mM EDTA, pH 8.0에서 복구되었다. HEIR을 완료한 후, 슬라이드를 20분 동안 실온에서 냉각되게 하고, 부드럽게 교반하면서 절편을 TBS + 0.025％ 트리톤(Triton) X-100에서 각각 5분 동안 2회 세정하였다. 그 후, 슬라이드를 10％ 정상 혈청과 함께 인큐베이션함으로써 조직 내의 비-특이적 결합 부위를 차단하였고, 실온에서 1시간 동안 TBS 내의 1％ BSA와 함께, HLA-G에 대해 염색된 조직은 정상 말 혈청으로 차단한 한편, 다른 모든 것들은 정상 염소 혈청으로 차단하였다. 차단 용액을 슬라이드로부터 배수시킨 후, 절편을 TBS + 1％ BSA에서 적합하게 희석된 1차 항체와 함께 4℃에서 철야로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 부드럽게 교반하면서 절편을 TBS + 0.025％ 트리톤 X-100으로 각각 5분으로 2회 세정하여, 비-특이적으로 결합된 1차 항체를 제거하였다. 적절한 형광단-접합 2차 항체를 제조사의 제안에 따라 TBS + 1％ BSA에서 희석한 후, 각각의 조직 절편에 첨가하고, 부드럽게 교반하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 슬라이드를 TBS로 각각 5분으로 3회 세정하였다. 커버슬립에 프로롱 다이아몬드 안티페이드 마운탄트(ProLong Diamond Antifade Mountant + DAPI (몰레큘러 프로브스(Molecular Probes), P36971)를 마운팅했을 때 각각의 절편 내의 핵이 염색되었다. 올림푸스(Olympus) IX83 연구용 도립 현미경 + 40× 대물렌즈 (올림푸스, 일본 도쿄)를 사용하여 각각의 슬라이드로부터의 영상을 취하고, 올림푸스 셀샌스(cellSans) 생명과학 영상화 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다.
기질 주사 후의 AAV8G9 생체분포: 시작 전 및 이러한 실험의 완료 시에 혈청을 수집하고, AAV 캡시드에 대해 생성된 중화 항체에 대해 분석하였다. 추가적으로, Q-PCR을 이용하는 벡터 생체분포 검정법을 위해 간, 뇌, 신장, 심장, 및 배수 림프절을 수확하였다.
중화 항체 검정법: 토끼 혈청 내의 중화 항체의 존재를 약간 변형된 기존에 기술된 방법을 사용하여 검정하였다 (Li et al., Gene Therapy 19:288 (2012)). 24웰 플레이트에서 HEK293 세포를 500 ㎕의 완전 DMEM (10％ 혈청, 1％ P/S) 내에 5×104개의 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 37℃ 및 5％ CO2에서 배양하였다. 각각의 토끼의 주사전 및 주사후 혈청을 DPBS에서 2배에서 시작하여 1:256까지 단계적으로 12.5 ㎕의 최종 부피로 희석하였다. 혈청 희석물을 3.84×108 바이러스 게놈 (7,680개의 게놈/세포)의 AAV8G9-루시페라제와 함께 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 시딩된 HEK293 세포에 최적의 배양 조건 하에서 48시간 동안 바이러스-혈청 혼합물을 형질도입한 후, 형질도입 효율을 루시페라제 검정법으로 측정하였다.
루시페라제 검정법: 루시페라제 검정법을 수행하여, 토끼 혈청의 존재 하에서의 AAV8G9의 형질도입 효율을 측정하였다. 프로메가(Promega) 루시페라제 검정법 시스템을 하기와 같이 수행하였다. 5× 프로메가 수동 용해 완충제를 ddH2O에 용해시킴으로써 1× 용해 시약을 제조하였다. 배지를 흡인하고, 250 ㎕의 용해 시약을 HEK293 세포의 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 20분 동안 진탕시킴으로써 세포를 용해시켰다. 100 ㎕의 용해된 세포 및 100 ㎕의 루시페라제 검정법 시약의 혼합물을 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 퍼킨 엘머 빅터3(Perkin Elmer Victor3) 다중표지 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 카운트/초 (CPS)로서 측정하였다. 나노드롭(Nanodrop) 2000c 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 각각의 샘플에 대해 루시페라제 활성을 총 단백질 농도에 대해 정규화하였으며, 이를 CPS/[P]로서 보고하였다.
결과
최적화된 AAV HLA-G 구축물 및 시험관내 발현: 먼저, 인간 세포에서의 이론적으로 강화된 트랜스진 생산을 위해, 뿐만 아니라 원치 않는 택일적 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 제거하기 위해, HLA-G1 cDNA (등록 BC021708)를 코돈-최적화하였다 (도 1a) (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:10770 (2009)). WT 또는 코돈-최적화 HLA-G1 cDNA로부터의 플라스미드-보유 HLA-G1의 웨스턴 블롯 검출은 인간 배아 293 세포에서 코돈-최적화 버전 (optHLA-G1)을 사용했을 때 일관적인 3배 상승을 입증하였다 (도 2a-2b). 다음으로, optHLA-G1 막횡단 도메인을 결실시켜 optHLA-G5 cDNA를 생성시키고, optHLA-G1 및 optHLA-G5 양쪽 모두를 자기-상보적 AAV 플라스미드 환경 내로 클로닝하였다 (도 1a). 293 세포에서의 이러한 플라스미드들의 형질감염 후의 웨스턴 블롯 분석에서, optHLA-G1에 대한 39 kDA에서의 예기된 단일 밴드, 및 optHLA-G5에 대한 예상된 더 작은 생성물이 생성되었고, optHLA-G5에는 더 작은 형태들이 동반되었으며, 이들 중 하나는 약 32 kDA에서 JEG-3 태반 대조군 세포에서 관찰된 더 작은 HLA-G 형태의 크기에 필적하는 것으로 보였다 (도 1b). 다음으로, HLA-G1 (막횡단) 및 HLA-G5 (가용성 및 분비형)의 세포내 국소화를 293 세포에서의 형질감염 후 면역세포화학을 통해 조사하였다. JEG-3 세포의 면역염색은 세포질, 표면 및 세포외 염색을 입증하였다. 대조적으로, optHLA-G1로 형질감염된 293 세포는 주로 표면 막 염색을 입증하는 한편, optHLA-G5로 형질감염된 세포는 사이토졸 및 세포외 매트릭스에서 더 많은 염색이 있는 것으로 보인다 (도 10). 이러한 총괄적 결과들은 최적화된 HLA-G 아이소형이 효율적인 단백질 생산 및 예상된 HLA-G 국소화를 초래한다는 것을 입증한다.
HLA-G의 항-혈관형성 기능: 인간 제대혈관 내피 세포 (HUVEC)에서의 관 형성 검정법을 수행하여, HLA-G의 항-혈관형성 활성을 분석하였다. HUVEC을 매트리겔(Matrigel) 상에서 배양하였고, 이는 자발적으로 관을 형성하였다 (도 3). 그 후, 세포를 1×104 바이러스 게놈/세포의 HLA-G1 또는 HLA-G5 벡터로 감염시키고, 24시간 동안 배양하였다. 도 4는 양쪽 모두의 벡터가 관 형성을 실질적으로 감소시켰음을 입증하고, 이는 HLA-G1 및 HLA-G5 양쪽 모두의 혈관형성을 억제하는 능력을 나타낸다.
AAV8G9 캡시드가 토끼 각막으로의 효율적인 유전자 전달을 매개한다: 추정 AAV9 갈락토스 수용체 결합 도메인이 그래프팅된 AAV8 캡시드 서열인 키메라 캡시드 "8G9"가 기질내 주사 후의 인간 각막 형질도입에 우수한 것으로 발견되었다 (Vance et al., Scientific Rep. 6:22131 (2016)). AAV8G9가 토끼 각막에 또한 형질도입되는지를 결정하기 위해, 자기-상보적 (sc) JET-GFP 리포터 카세트를 AAV8G9 캡시드 내에 패키징하고, 5×1010 바이러스 게놈 (vg)의 50 ㎕ 기질내 주사를 통해 토끼 각막에 투여하였다 (McCarty et al., Gene Therapy 8:1248 (2001)). 평형 염 용액 (BSS) 또는 scAAV8G9-GFP의 기질내 주사 후, 중심 각막의 약 30％에 걸친 즉각적인 중심 각막 혼탁이 발생되었다 (도 5a 및 5b). 이러한 혼탁은 주사로부터 24시간 이내에 완전히 해소되었다 (도 5a). 라이브 영상화를 사용하여, 주사 21일 후에 GFP 형광이 중심 각막에서 벡터 주사 위치에서 검출되었다 (도 5c). 신호 정량은 주사 28일 후에 피크 GFP 강도를 입증하였다 (도 5c).
생체 내에서의 각막 혈관화에 대한 scAAV8G9-optHLA-G의 효과: HLA-G 호모로그들이 비-영장류 종에서 확인되지 않았지만, HLA-G 단백질을 사용한 기존의 보고는 인간에서의 이의 공지된 역할에 부합하는 HLA-G의 기능을 토끼 모델에서 입증하였다 (Fons et al., Blood 108:2608 (2006)). 추가적으로, 토끼 눈은 구조 및 크기 면에서 인간 눈과 유사하고, 아마도 안구 연구를 위한 가장 인기있는 모델일 것이다. AAV8G9가 토끼 각막 형질도입에 대해 입증된 것을 고려하여 (도 5a-5c), optHLA-G 플라스미드 구축물을 사용하여 임상전 scAAV8G9 벡터를 생산하였다. 임상적으로 관련된 시나리오를 모방하기 위해, 토끼를 마취시키고, 중심 5 mm 각막 NaOH 화학 화상을 통해 AAV 벡터 주사 전에 각막을 손상시켰다. 화상 손상 7일 후, GFP를 코딩하는 scAAV8G9 벡터, 또는 HLA-G 아이소형의 정확한 역할이 미지이기 때문에, 그리고 치료 효과를 볼 수 있는 기회를 증가시키기 위한 시도로 1:1 비의 optHLA-G1 + optHLA-G5 (optHLA-G 콤보)를 기질내 주사하였다. 손상 약 7일 후에 각막 혈관화가 가장자리를 지나 각막 조직 내로 진행되기 시작하였고, 손상 10일 후에 처리군 사이에 유의한 차이가 있었다 (p<0.001) (도 6a). 실제 화상은 실험 기간에 걸쳐 해소되지 않는 중심 각막 혼탁을 남긴다는 것을 주지하여야 한다. 이미지J를 사용한 혈관화 면적의 정량은 모든 실험 시점에서의 혈관 내향성장 증가를 입증하였고, 주사 56일 후에 scAAV8G9-GFP로 처리된 각막에서 최대 혈관화가 있었다. 대조적으로, 손상 2개월 후, scAAV8G9-optHLA-G 콤보가 제공된 대상체에서는 어떠한 유의한 혈관 형성도 명시되지 않았고, 이는 scAAV8G9-GFP로 처리된 눈보다 10배 더 적다 (P<0.002) (도 6a 및 6b 및 7a-7c). 주사 24시간 후까지, 그리고 실험 평가 기간 전반에 걸쳐 안구내 압력 또는 각막 두께와 연관된 유의한 변화가 없었다 (도 8a-8b).
손상 각막에서의 HLA-G의 발현 및 HLA-G에 의한 면역 관용의 재확립: 8주 관찰 후, 조직학적 분석을 위해 조직을 회수하였다. scAAV8G9-GFP가 주사된 손상 유도 각막의 조직학은 중심 각막 단핵 세포 침윤물, 중심 각막 내로의 혈관화 및 경도 내지 중등도의 양의 섬유화로 이루어지는 조직학적 변화를 입증하였다 (도 9a). 대조적으로, scAAV8G9-optHLA-G 콤보가 주사된 손상 각막의 조직학적 분석은 세포 침윤물이 최소였고, 혈관화가 없었으며, 결과적으로 GFP 대조군 벡터가 주사된 각막과 유의하게 상이하였다 (도 9b). 실제로, scAAV8G9-HLA-G 콤보가 주사된 손상 후 각막의 평균 누적 조직학 점수가 GFP 대조군 벡터가 주사된 각막에 대한 평균 점수보다 유의하게 더 낮았다 (P<0.0005) (도 9b).
H&E 염색에 더하여, 내피 세포간 접합부 세포 마커인 CD31의 존재를 밝힘으로써 중심 각막 내의 혈관을 확인하기 위해 면역형광을 사용하였다 (도 10a). CD3 면역염색에서 scAAV8G9-GFP 손상 각막 내의 침윤 세포의 대부분이 CD3 표면 항원에 대해 양성인 것으로 확인되었다 (도 10b). 이러한 집단의 부분집합이 CD8에 대해 또한 양성으로 염색되었고, 이는 각막 손상 후의 세포독성 T 세포의 유입을 입증한다 (도 10b). 이러한 T 세포 집단의 더 작은 부분집합이 CD4+인 것으로 증명되었고, 이는 헬퍼 T 세포의 존재를 또한 입증한다.
면역형광을 사용하여 벡터가 트랜스진 생산을 유도하였음을 확인하기 위해 각막 조직을 또한 분석하였다. 본 발명가들이 보고한 인간 결과와 유사하게 (Vance et al., Scientific Rep. 6:22131 (2016)), GFP가 scAAV8G9-GFP가 제공된 토끼의 각막 전반에 걸쳐 존재하는 것으로 발견되었다. 예상한 바와 같이, HLA-G 단백질이 scAAV8G9-optHLA-G 콤보가 주사된 각막에서만 명백하였고, 이에 의해 치료 효과를 HLA-G와 상호관련시켰다 (도 10c).
각막 기질내 주사 후의 AAV8G9 생체분포: scAAV8G9 기질내 주사 후의 지속성 AAV 벡터의 생체분포를 결정하는 것이 잠재적인 임상 용도에 중요한데, 이러한 투여 경로는 아직 임상에서 행해지지 않았다. 이를 위해, 간 및 2개의 뇌 영역 (각막의 신경을 지배하는 삼차신경핵, 및 망막의 신경을 지배하는 가쪽무릎핵)의 샘플로부터 전체 DNA를 회수하였다.
트랜스제닉 카세트에 대한 프라이머를 사용한 PCR은, 이러한 실험의 결론과 관계없이, 테스트된 조직에서 어떠한 바이러스 게놈도 각막 외부에서 검출하지 못했다. 그럼에도 불구하고, 연구 마지막에, scAAV8G9-GFP 처리를 받았고 광범위한 각막 혈관화가 발생된 토끼 중 하나에서 1/256의 역가로 강한 scAAV8G9 캡시드-특이적 중화 항체 반응이 검출되었다 (표 1). 트랜스진 또는 혈관화 출현과 관계없이, 2마리의 다른 토끼는 scAAV8G9 캡시드에 대한 매우 가벼운 항체 반응을 입증하였다 (표 1).
<표 1>
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논의
미국에서만 년간 140만명에 영향을 미치는 각막 혈관화는 염증 또는 저산소증인 2가지 종류의 병태 중 하나에 의해 유발된다. 염증 및/또는 저산소증은 박테리아 또는 바이러스 감염, 자가면역 또는 퇴행성 질환, 물리적 외상/조작, 콘택트렌즈의 장기 착용, 화학 화상 또는 독성 오염을 포함하는 다양한 손상의 결과일 수 있다. 가장자리에서 기원하는 혈관의 침습은 시력에 영향을 미치거나 시각을 차단할 뿐만 아니라, 또한 각막 면역 항상성을 파괴하여, 2차 병태, 예컨대 증가된 염증 및 흉터형성을 초래하고, 건성안 및 각막 이식편 거부가 발생되는 것에서의 주요 성분이다. 혈관화를 치료하기 위한 현재의 약물 양식은 빈번한 투여에 의존적이고, 시각을 위협하는 심각한 부작용이 있으면서 부분적으로만 효과적이다. 더욱 침습성인 절차 예컨대 아르곤 레이저 광응고 및 절단은 진단에 따라 특히 성공적이지 않고, 점점 더 덜 사용된다. 따라서, 시각을 위협하는 부작용 없이 혈관구조를 예방하거나 또는 혈관구조의 퇴행을 유도할 수 있는 단일 용량 치료제가 현재의 각막 혈관화 치료 결손을 교체하기 위해 요구된다. 이를 위해, 코돈-최적화 HLA-G 아이소형의 AAV 유전자 전달이 토끼 각막에서 손상 후에 사용되었다. 불완전하게 이해되었지만, HLA-G의 효과는 다인성이고, 아마도 눈에서 자연적일 것인데, HLA-G가 안구 면역 특권에서 역할을 하는 것으로 가정되었기 때문이다 (Carosella et al., Adv. Immunol. 127:33 (2015)). 또한, 태아 모체 면역 관용에서의 이의 고유의 기능은 인간에서 HLA-G가 성공적인 유전자 요법 접근법에 중요한 속성인 "자가" 단백질이라는 것을 암시한다. scAAV8G9-optHLA-G의 시험관내 특성화 및 벡터 검증 후, 실험 데이터는 현저한 유의성으로 2개의 중요한 치료 결과를 입증한다: i) 외상 후 투여된 경우의 각막 혈관화의 거의 완전한 억제 (도 6a-6b), 및 ii) 각막의 면역 세포 침윤의 방지에 의한 면역 항상성의 유지 (도 9a-9b). 예상되는 임상 용도에 대한 추가 특성화는 화상을 입은 각막 내로 주사된 AAV 벡터가 바이러스 캡시드에 대한 전신 항체 반응을 유발할 수 있었음을 나타냈다 (표 1). 그러나, 테스트된 조직에서, 주사 2개월 후에, 트랜스제닉 게놈이 각막 외부에서 검출되지 않았다.
먼저, WT HLA-G cDNA에 비교하여 전체적인 존재도를 증가시킨 방식으로, 그리고 전신 유전자 요법 후 CTL을 유발할 수 있는 택일적 ORF를 제거하기 위해, HLA-G1의 코돈 용법을 구상되는 인간 용도에 대해 변경시켰다 (도 2a-2b) (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:10770 (2009))19. 코돈 최적화가 일관적이지 않게 성공적이었지만 (Hirsch et al., Mol. Therapy 21:2205 (2013); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714 (2000)), HLA-G1의 경우, 결과는 합성 ORF를 사용하여 3배 증가된 존재도를 입증하였고, 이는, 부분적으로, WT HLA-G를 표적화하는 마이크로RNA에 의한 변경된 전사-후 조절에 기인할 수 있다 (Sethupathy et al., Trends Genetics 24:489 (2008); Vasudevan et al., Science 318:1931 (2007)). 개념적으로, 이는 동반적인 용량 감소를 허용하고, 인간에서의 이용가능한 AAV 벡터 결과를 기초로, 더 낮은 투여 용량은 더 적은 벡터 관련 면역 합병증 및 더 양호한 치료 결과를 초래한다 (Salganik et al., Microbiol. Spectr. 3:doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0052-2014 (2015)). 본 발명가들의 지식에 따르면, 이는 AAV 벡터와 연관된 외래 에피토프인 캡시드 또는 외래 트랜스진 생성물, 이러한 경우에는 GFP에 의해 유발될 가능성이 있는, 각막에서의 AAV 유전자 요법에 대한 최초로 보고된 면역 반응이다.
scAAV8G9-optHLA-G 기질내 주사가 잘 허용되었고, 이때 24시간까지 각막이 거의 완전히 청소되었고, 주사-관련 염증이 주사 3일 후까지 해소되었다 (도 5a-5c). 이러한 주사는 인간 각막과 유사한 크기의 각막이 있는 종인 토끼의 정상 각막 및 손상 각막에서 GFP 또는 HLA-G 아이소형의 광범위한 각막 형질도입을 초래하였다. 50 ㎕의 총 주사 부피 후에 주사가 약 30％ 각막 커버 범위를 초래하였음이 특히 주목된다 (도 5a). 기질 내로 주사된 이러한 부피는 주사 2개월 후에 혈청에서 비일관적으로 캡시드 중화 항체를 유발하였다. 대조적으로, 표적을 벗어난 조직 (예를 들어, 간, 뇌)에서 AAV 벡터 게놈이 기록되지 않았고, 이는 말초 바이러스의 수준이 PCR의 검출 감도 미만이었거나 또는 AAV 벡터 형질도입이 거의 전적으로 각막으로 제한되었다는 것을 시사한다. 어느쪽이든, 그리고 구상 또는 예상되지 않았지만, AAV 캡시드 백신 접종과 독립적으로 각막으로의 성공적인 반복된 AAV 벡터 투여가 보고되었다 (Hippert et al., PloS One 7:35318, (2012)).
치료 수준에서, scAAV8G9-GFP에 비교했을 때, scAAV8G9-optHLA-G 콤보를 주사한 각막은 각막 손상 2개월 후에 혈관화 및 염증 세포 침윤물이 유의하게 더 적었다. HLA-G가 혈관형성, T 세포, NK 세포, B 세포, 및 단핵구 침윤물을 억제하는 다른 모델과 상호관련되어, 토끼 각막에서의 이러한 데이터는 HLA-G를 이용한 AAV 요법이 안구 표면에 지속적인 면역 관용을 제공한다는 견해를 지지한다.
본원에서의 결과는 본 발명가들의 지식으로는 AAV 벡터를 임의의 조직에서의 HLA-G 유전자 요법에 사용하는 최초의 용도를 입증하고, 각막 혈관화에 대한 단일 용량의 안전하고 효과적인 치료에 대한 낙관이 생성된다. 각막에서의 HLA-G 유전자 요법의 이러한 유효성은 각막 손상, 감염, 면역-매개 질환을 포함하는, 정상적인 면역학적 관용이 파괴된 안구 표면 장애의 치료, 및 저위험 및 고위험 환자 양쪽 모두에서의 각막 이식편 거부의 예방에 광범위하게 영향을 미칠 뿐만 아니라, 건성안, 신생혈관 녹내장, 포도막염, 망막/맥락막 혈관화, 및 임의의 고형 기관 이식의 치료에 영향을 미친다.
실시예 2
AAV HLA-G가 동종이형 각막 이식 거부를 예방한다
HLA-G가 이식편 거부를 예방하는 능력을 테스트하기 위해, 동종이형 각막 이식을 토끼에서 수행하였고, 이는 이같은 이식물을 수주 이내에 급속하게 거부하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 실험에서, 안락사된 토끼가 각막 공여자로서의 역할을 하는 한편, 2마리의 토끼가 수용자로서의 역할을 하였다. 이식 전에, 각막 공여자 버튼을 scAAV8G9-GFP (대조군) 또는 scAAV8G9-HLA-G 콤보를 함유하는 용액에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각막 생착을 경시적으로 모니터링하였다 (도 12a-12d). 수술 10일 후에 GFP 처리 각막에서 각막 혈관화, 각막 이식편 부종 및 흐릿함이 관찰되었고, 이는 6을 초과하는 거부 지수 (RI)를 초래하여, 이식편이 임상적으로 거부되었음을 나타냈다. 놀랍게도, HLA-G 처리 각막 버튼은 84일의 관찰 기간에 걸쳐 각막 혈관화가 없으면서 깨끗하게 유지되었다 (도 12b, 12c). 실제로, 가벼운 섬유화 수술 상처 이외에는 공여자 및 수용자 각막이 완전히 건강하게 유지되었다. 토끼 모델에서의 동종이형 각막 이식편의 이러한 장기 생존은 동종이형 각막 이식편 거부를 예방하기 위한 AAV-HLA-G 생체외 형질도입에 대한 능력을 입증하고, 이종이식의 성공에 대한 잠재력을 암시한다.
상기는 본 발명의 예시이고, 이의 제한으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 하기의 청구범위에 의해 정의되고, 청구범위의 등가물이 이에 포함된다.
서열
서열식별번호: 1 HLA-G1 코돈 최적화 #1 (432)
서열식별번호: 2 HLA-G1 코돈 최적화 #2 (438)
서열식별번호: 3 HLA-G5 (435)
서열식별번호: 4 WT HLA-G1 (429)
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill North Carolina State University Hirsch, Matthew Louis Gilger, Brian Christopher <120> VECTOR-MEDIATED IMMUNE TOLERANCE IN THE EYE <130> 5470-790WO <150> US 62/366,822 <151> 2016-07-26 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Codon Optimized HLA-G1 <400> 1 atggtcgtga tggctcctcg cacactgttc ctgctgctgt ctggggctct gacactgact 60 gaaacttggg ctggatcaca ctcaatgaga tacttcagcg ccgccgtgag caggccatcc 120 cgcggcgagc ccaggtttat cgctatgggc tatgtggacg atacccagtt cgtgcgcttt 180 gactccgatt ctgcctgccc taggatggag cctcgcgccc cctgggtgga gagggagggc 240 ccagagtact gggaggagga gacccgcaac acaaaggccc acgcccagac cgaccggatg 300 aacctgcaga cactgagagg ctactataat cagtccgagg ccagctccca caccctgcag 360 tggatgatcg gctgtgacct gggctctgat ggccggctgc tgagaggcta cgagcagtac 420 gcctatgacg gcaaggatta tctggccctg aatgaggacc tgcggtcttg gaccgcagca 480 gatacagcag cccagatcag caagagaaag tgcgaggcag caaacgtggc 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Claims (58)

  1. 인간 백혈구 항원-G (HLA-G)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, HLA-G1 및/또는 HLA-G5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80％ 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 HLA-G 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 HLA-G 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  5. HLA-G를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  6. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 HLA-G1을 코딩하는 것인 발현 카세트.
  7. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 HLA-G5를 코딩하는 것인 발현 카세트.
  8. 제5항에 있어서, HLA-G1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HLA-G5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  9. 제5항에 있어서, HLA-G를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 HLA-G1 또는 HLA-G5를 택일적으로 발현하는 단일 오픈 리딩 프레임인 발현 카세트.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드인 발현 카세트.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  14. 제13항에 있어서, 2개의 AAV ITR을 포함하는 발현 카세트.
  15. 제14항에 있어서, 2개의 AAV ITR의 뉴클레오티드 서열이 동일한 것인 발현 카세트.
  16. 제14항에 있어서, 2개의 AAV ITR의 뉴클레오티드 서열이 상이한 것인 발현 카세트.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인 발현 카세트.
  18. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-상보적 AAV 게놈인 발현 카세트.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  21. 제20항에 있어서, AAV 벡터인 벡터.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 및/또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제22항의 형질전환된 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 입자.
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터, 제22항의 형질전환된 세포, 및/또는 제24항의 재조합 AAV 입자, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  26. AAV 복제에 대해 허용성인 세포에
    (a) (i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 및 (ii) 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 재조합 AAV 주형; 및
    (b) Rep 코딩 서열 및 Cap 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    를 재조합 AAV 주형의 복제 및 패키징에 충분한 조건 하에 제공하고;
    이에 의해 재조합 AAV 입자가 세포에서 생산되는 것
    을 포함하는, 재조합 AAV 입자를 생산하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, Rep 코딩 서열 및 Cap 코딩 서열이 재조합 AAV 입자 내로 패키징될 수 없는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, Rep 코딩 서열 및/또는 Cap 코딩 서열이 플라스미드에 의해 제공되는 것인 방법.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, Rep 코딩 서열 및/또는 Cap 코딩 서열이 바이러스 벡터에 의해 제공되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 및 배큘로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Rep 코딩 서열이 세포 내로 안정하게 통합되는 것인 방법.
  32. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Cap 코딩 서열이 세포 내로 안정하게 통합되는 것인 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 AAV 주형이 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의해 제공되거나, 또는 프로바이러스로서 세포 내로 안정하게 통합되는 것인 방법.
  34. 세포를 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 세포에서 HLA-G를 발현시키는 것을 포함하는, 세포에서 HLA-G를 발현시키는 방법.
  35. 제34항에 있어서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 세포에서 발현되는 것인 방법.
  36. 각막 체외이식편을 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 HLA-G를 각막 체외이식편에 전달하는 것을 포함하는, HLA-G를 각막 체외이식편에 전달하는 방법.
  37. 각막 체외이식편을 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 이식 후의 각막 체외이식편의 거부를 억제하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 이식 후의 각막 체외이식편의 거부를 억제하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 이식이 동종이형 이식인 방법.
  39. 제37항에 있어서, 이식이 이종이식인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 체외이식편이 이식 전에 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉되는 것인 방법.
  41. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 체외이식편이 이식 동안 및/또는 후에 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물과 접촉되는 것인 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 각막 체외이식편에서 발현되는 것인 방법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물이 각막 체외이식편 내로 주사되는 것인 방법.
  44. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 AAV 입자 또는 제약 조성물이 각막 체외이식편과 함께 인큐베이션되는 것인 방법.
  45. 포유동물 대상체의 눈에 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물과 접촉된 세포를 투여하고, 이에 의해 HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 세포가 줄기 세포인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 세포가 중간엽 줄기 세포인 방법.
  48. 포유동물 대상체의 눈에 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물을 투여하고, 이에 의해 HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, HLA-G를 포유동물 대상체의 눈에 투여하는 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 눈에서 발현되는 것인 방법.
  50. 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체의 눈에 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물과 접촉된 세포를 투여하고, 이에 의해 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 세포가 줄기 세포인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 세포가 중간엽 줄기 세포인 방법.
  53. 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체의 눈에 제24항의 재조합 AAV 입자 또는 제25항의 제약 조성물을 투여하고, 이에 의해 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 포유동물 대상체에서 면역 반응 및/또는 혈관화와 연관된 눈 장애를 치료하는 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G1, HLA-G5, 또는 양쪽 모두가 눈에서 발현되는 것인 방법.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 입자 또는 제약 조성물이 기질내, 국소, 유리체내, 전방내, 결막하, 망막하, 공막위, 공막내, 눈주위, 맥락막위, 안구뒤, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응과 연관된 눈 장애가 이식편 거부, 면역-매개 건성안, 알레르기성 결막염, 또는 면역-매개 포도막염인 방법.
  58. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관화와 연관된 눈 장애가 각막 외상, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 눈 후방에서의 혈관화, 맥락막 혈관신생, 또는 신생혈관 녹내장인 방법.
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