KR20190031647A - 해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법 - Google Patents

해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법 Download PDF

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KR20190031647A KR1020170119320A KR20170119320A KR20190031647A KR 20190031647 A KR20190031647 A KR 20190031647A KR 1020170119320 A KR1020170119320 A KR 1020170119320A KR 20170119320 A KR20170119320 A KR 20170119320A KR 20190031647 A KR20190031647 A KR 20190031647A
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Abstract

다당 분해효소의 분리 및 탈염과정 없이 저분자화된 후코이단을 다량 함유하는 해조류 분해액을 간단하게 제조할 수 방법이 개시된다. 특히 갈색해조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 보다 효과적으로 추출하고, 300만∼500만의 다당체로서 소화흡수가 안되는 후코이단을 소화 흡수가 용이하도록 저분자화하는 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 먼저 톳, 미역, 다시마, 감태, 모주꾸, 큰실말 등의 갈조류로부터 후코이단(Fucoidan)의 추출을 극대화하여 후코이단 추출액을 얻은 후 이렇게 얻어진 후코이단 추출액을 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) KCTC 10998BP 와 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)·바실러스 메젠테리쿠스(Bacillus mesentericus)·클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)으로 이루어진 프로바이오틱스 및 이들 미생물의 당전이 효소를 이용하여 저분자화 하는 방법이 제공된다.

Description

해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법{METHOD OF PRODUCING SMALL MOLECULAR FUCOIDAN SEAWEED}
본 발명은 해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 보다 효과적으로 추출하고 이를 소화 흡수가 용이하도록 저분자화하는 제조방법에 관한 것이다.
아토피성 피부염은 피부염증과 색소침착, 간지러움 등의 고통 외에도, 잦은 재발로 인한 치료 시간의 증가로 정신적 스트레스를 안고 살아가기 때문에 정신적으로 삶의 질이 현저히 떨어져 있고, 또한 잘못 전달된 아토피 피부염 치료정보가 스테로이드 제제의 불신으로 이어져 여러 민간요법 및 이차적 치료법을 찾다보니 환자들의 삶의 질을 떨어뜨리는 비용적 요인으로 작용하고 있기도 하다.
이러한 아토피 피부염을 치료하기 위하여 종래 세라마이드, 리놀레산, 식물유 또는 광물성 오일 등의 성분들, 하이드로코티손(hydrocortisone) 등의 스테로이드(steroid) 제제 또는 이들에 항균 및 항염 기능을 강화한 물질, 자외선 요법을 통한 DNA 합성 억제재, 세포 과증식 억제제, 염증 및 가려움증 억제제 등이 제안된 바 있다.
그러나, 상기 스테로이드 제제는 표피의 성장억제나 부작용 등의 역효과를 유발할 수 있으며, 우레아 퍼록사이드 등은 피부의 과다 자극을 야기할 수 있고, 항히스타민제 등의 항생물질은 균의 내성 및 광과민 등의 부작용을 유발할 가능성이 높은 문제점이 있다.
아토피 피부염의 정확한 병리 생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않지만 유전적 소인과 함께 면역학적, 비면역학적 기전이 관여한다고 보고되어 있다. 아토피 피부염의 대부분을 차지하는 외인성 아토피 피부염은 면역 글로브린 E (IgE)와 연관된 면역기전에 의해 발생되는데 특정 알러젠(allergen)에 대한 즉시형 면역 반응보다는 T세포 이상에 의한 지연성 면역 반응이 관여한다는 보고들이 많다.
또한, 요즘은 B세포로부터 IgE의 생성을 유도하는 인터루킨(IL)-4 등 Th2 관련 사이토카인([0006] cytokine)들이 아토피 피부염의 원인이라고 보고되고 있다. 그러므로 아토피 피부염의 가장 큰 문제는 면역기능의 비정상적인 활성화로 염증반응이 항진되어 사이토카인의 발생이 증가하는 것이다.
최근의 연구에서 피부세포막에 존재하는 단백질분해효소 활성화 수 용체인 프로티네이즈-활성화 리셉터-2(proteinase-activated receptor-2; PAR-2)의 발현이 증가하고 활성화되면 세포내의 IκB kinase (IKK) --> nuclear factor kappa B (NF-κB)의 기전을 활성화시켜 염증반응을 증가시키고, 그 결과 다양한 염증물질인 사이토카인(tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-6, IL-10)과 시클로옥시게나아제(COX)-2, 사이토카인-inducible nitric oxide synthases (iNOS), adhesion molecules의 발현을 증가시켜 아토피 피부염을 악화시키는 것이 보고되었다.
즉, PAR-2 활성화는 피부염증과 색소침착, 간지러움 등을 유발하므로 이것을 억제하는 것이 아토피 피부염의 호전에 도움이 될 것으로 생각된다. 최근 연구에 따르면 PAR-2 억제제가 임상에서 국소도포제로 사용되었을 때 아토피 피부염을 임상적으로 호전시킨다는 것이 보고되어서, PAR-2 억제제가 국소도포제로 개발될 수 있는 가능성을 보여 주기도 하였다.
1. 대한민국 공개특허 제10-2015-0022358호 (2015.03.04)
본 발명의 목적은 미생물을 이용하여 후코이단 함유 유용 성분의 손실이나 저하 없이 후코이단을 대량생산이 가능한 효율적인 방법으로 저분자화할 수 있도록 한 해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법은,
(a) 갈조류를 수세하여 염분과 이물질을 제거한 후 건조시키는 단계; 건조된 갈조류를 조분쇄한 후 100∼130℃에서 교반하면서 배소시키는 단계; 및 배소된 갈조류 조쇄물에 5∼15배의 물을 가하고 100∼120℃에서 가열 추출하여 후코이단액(상등액)과 여과물(고형물)로 분리한 후 이 후코이단액을 다시 가온하여 후코이단(Fucoidan)액을 얻는 단계로 이루어진 갈조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 추출하는 공정과,
(b) 상기 공정에서 얻은 후코이단액 1L에 대하여 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) 및 이의 당전이 효소를 포함하는 균체 배양액을 건조물량 기준으로 0.1∼0.2g 투입하여 발효시키는 단계; 계속하여 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)·바실러스 메젠테리쿠스(Bacillus mesentericus)·클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)을 건조물량 기준으로 각각 1.0×106∼1.0×109/g 함유하는 프로바이오틱스를 후코이단액 1L에 대하여 0.1∼0.2g 투입하여 발효시키는 단계; 및 상기 발효 후 90∼130℃로 가열하여 미생물과 효소를 멸균 및 불활성화시키는 단계로 이루어진 후코이단액을 저분자화하는 공정을 포함하는 해조류추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법에 있어서,
상기 효모 발효물에 상기 혼합물(정제수 제외)의 15배수의 별도의 정제수를 다시 첨가하여 24㎑(300W)의 초음파와 2,450㎒(1㎾)의 마이크로파를 병행 처리하면서 100℃에서 6시간 추출하여 여과, 농축, 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 해조류는 다시마, 미역, 큰실말, 톳 중 어느 하나를 선택하여 사용하거나 2종 이상을 임의로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 배소시키는 단계는 배소와 동시에 자외선 조사가 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 미생물을 이용하여 후코이단을 인간이 흡수할 수 있는 상태로 효율적으로 저분자화한다.
또한, 본 발명의 방법에 따르면 높은 수율로 해조류로부터 저분자화된 후코이단을 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 저분자화된 후코이단은 후코이단(Fucoidan)의 유용한 효능을 다양한 분야에서 활용할 수 있도록 해주며, 특히 건강식품, 암환자 등의 환자식, 의약품, 화장품, 농수축산 분야 등에서 크게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 해조추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법의 바람직한 일 실시예를 블록도로 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 해조추출물의 저분자 후코이단의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에서는, (a) 해조류를 수세하여 염분과 이물질을 제거한 후 수분함량 5∼10％로 건조시키는 단계; 건조된 해조류를 조분쇄한 후 100∼130℃에서 10∼30분간 교반하면서 배소시키는 단계; 및 배소된 해조류 조쇄물에 5∼15배의 물을 가하고 100∼120℃에서 3∼6시간 가열 추출하여 후코이단액(상등액)과 여과물(고형물)로 분리한 후 이 후코이단액을 다시 가온하여 7∼8brix의 후코이단(Fucoidan)액을 얻는 단계로 이루어진 해조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 추출하는 공정과,
(b) 상기 공정에서 얻은 후코이단액 1L에 대하여 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) <16> KCTC 10998BP(기탁기관: 한국생명공학연구원 생물자원센터, 기탁일: 2006.10.10.) 및 이의 당전이 효소를 포함하는 균체 배양액을 건조물량 기준으로 0.1∼0.2g 투입하여 20분∼4시간 발효시키는 단계; 계속하여 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)·바실러스 메젠테리쿠스(Bacillus mesentericus)·클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)을 건조물량 기준으로 각각 1.0×106∼1.0×109/g 함유하는 프로바이오틱스를 후코이단액 1L에 대하여 0.1∼0.2g 투입하여 2∼6시간 발효시키는 단계; 및 상기 발효 후 90∼130℃로 20분∼2시간 가열하여 미생물과 효소를 멸균 및 불활성화시키는 단계로 이루어진 후코이단액을 저분자화하는 공정을 포함하는 해조추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법이 제공된다.
또한, 본 발명에서는 본 발명에 따라 제조된 저분자 후코이단을 유효성분으로 함유하는 건강식품이 제공된다.
이하, 본 발명에 따른 해조류 유래 후코이단(Fucoidan)의 저분자화 제조방법을 각 공정별로 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 해조류 유래 후코이단(Fucoidan)의 저분자화 제조방법의 바람직한 일 실시예를 나타낸블록도이다.
<해조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 추출하는 공정>
1. 해조류의 수세 및 건조 단계
해조류는 먼저 담수에 수세하여 염분과 이물질을 제거한다. 해조류로는 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 톳, 미역, 다시마, 감태, 모주꾸, 큰실말 등이 주로 이용될 수 있다. 바람직하게는 해조류를 담수에 1시간 정도 침지하여 이물질을 제거하고 염분을 용출시킨 후 다시 2∼3시간 침지시켜 염분을 용출시킨 후 다시 한차례 2∼3시간 더 침지시켜 최대한 탈염시킨다. 이물질과 염분을 제거한 후에는 후코이단(Fucoidan)의 물적 특성상 수분함량이 적을수록 저분자화가 잘 이루어지므로, 이점을 감안하여 후코이단을 수분함량 5∼10％로 건조시킨다. 건조는 바람직하게는 먼저 태양열과 해풍을 이용하여 해조류가 부서질 정도로 자연 건조시킨 후 건조기를 이용하여 원하는 수분함량이 될 때까지 건조시킨다.
2. 분쇄 및 배소 단계
상기 단계에서 건조된 해조류는 분쇄기를 이용하여 적당한 크기로 조분쇄 시킨다. 바람직하게는 50∼100메쉬(mesh)로 분쇄시킨다. 분쇄 후 100∼130℃에서 10∼30분간 교반하면서 구수한 풍미가 나도록 배소시키며, 이때 바람직하게는 배소와 동시에 자외선 투사를 한다. 이러한 배소 및 자외선 투사 과정은 후코이단(Fucoidan)을 1차 저분자화하여 중저분자 상태로 만들어 주게 된다.
3. 후코이단의 가열 추출단계
상기 단계에서 배소된 해조류 분쇄물에 5∼15배의 물을 가하고 100∼120℃의 조건에서 3∼6시간 가열 추출한 후, 이를 정치하여 후코이단(Fucoidan)액과 여과물로 분리하고, 이 후코이단액을 다시 가온하여 7∼8brix의 후코이단(Fucoidan)액을 얻는다. 이때 가온은 100∼120℃ 정도로 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 다음의 저분자화공정을 수행하기에 앞서 이렇게 얻어진 후코이단 액을 멸균 처리한다. 멸균처리에는 공지의 식품 멸균방법이 모두 이용가능하며, 일반적으로는 열처리하여 멸균시킬 수 있다.
<후코이단액을 저분자화하는 공정>
1. 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) KCTC 10998BP를 투입하여 발효시키는 단계
상기 공정에서 얻은 중저분자화된 7∼8brix의 후코이단(Fucoidan)액 1L에 대하여 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) KCTC 10998BP 및 이의 당전이 효소를 포함하는 균체 배양액을 건조물량 기준으로 0.1∼0.2g 투입하여 20분∼4시간 발효시킨다.
바람직하게는 균체 배양액을 건조물량 기준으로 0.12∼0.18g 투입하며, 33∼37℃, 더욱 바람직하게는 35℃ 정도에서 1∼2시간 교반 발효시킨다. 발효시간은 일반적으로는 20분∼4시간 정도가 적당하나, 필요에 따라 시간을 더 연장하거나 단축할 수 있다. 본 단계의 발효과정 및 다음 단계의 프로바이오틱스를 이용한 발효과정을 거쳐 상기 공정에서 중저분자화된 후코이단이 추가로 저분자화되어 인체에 흡수되기에 적당한 상태로 저분자화가 이루어지게 된다.
2.프로바이오틱스를 투입하여 발효시키는 단계
계속하여 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)·바실러스 메젠테리쿠스(Bacillus mesentericus)·클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)을 건조물량 기준으로 각각 1.0×106∼1.0×109/g 함유하는 프로바이오틱스를 후코이단액 1L에 대하여 0.1∼0.2g 투입하여 2∼6시간 발효시킨다. 본 발명의 일 실시예에서는 프로바이오틱스로 일본 TOA PHARMACEUTICAL사의 “Probiotics Powder Complex"를 사용하였으나 사용 가능한 프로바이오틱스가 이에 한정되지는 않으며, 상기 3가지 균주를 적어도 각각 1.0×106/g 이상 함유하는 프로바이오틱스면 모두 사용 가능하다. 프로바이오틱스는 바람직하게는 상기 미생물들을 각각 1.0×106∼1.0×109/g 함유하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1.0×107∼1.×108/g 함유한다. 건조물량기준으로 프로바이오틱스를 후코이단액에 ℓ당 0.1∼0.2g 투입하며, 바람직하게는 0.12∼0.18g 투입한다. 프로바이오틱스 제제 내에는 함유 미생물의 효소, 특히 당전이 효소도 포함되어 있으므로, 별도로 당전이 효소를 사용하지 않더라도 함유 미생물의 균체와 함께 당전이 효소도 후코이단액에 투입되는 효과가 있다.
발효시간은 일반적으로는 2∼6시간 정도가 적당하나, 필요에 따라 시간을 더 연장하거나 단축할 수 있다. 상기 단계의 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli)를 이용한 발효과정 및 본 단계의 발효과정을 거쳐 상기 공정에서 중저분자화된 후코이단이 추가로 저분자화되어 인체에 흡수되기에 적당한 상태로 초저분자화가 이루어지게 된다.
후코이단의 저분자화 정도는 바람직하게는 전체 후코이단 중 70% 이상이 분자량 10만 이하이며 이중 50% 이상이 분자 1만 이하이다. 더욱 바람직하게는 전체 후코이단 중 80% 이상이 분자량 10만 이하이며 이중 40% 이상이 분자량 1,000 이하이다.
3. 미생물 및 효소의 멸균 및 불활성화 단계
상기 단계의 발효가 끝난 후에는 90∼130℃로 20분∼2시간 가열하여 미생물과 효소를 멸균 및 불활성화시킨다.
바람직하게는 저분자화된 후코이단(Fucoidan)액을 유리병에 충전하여 상기 온도와 시간 범위로 열탕 살균한 후 냉각수에서 냉각시킨다. 이로써 발효반응은 중단되고 후코이단의 저분자화공정도 완료된다.
상기와 같은 과정을 거쳐 얻어진 저분자화된 후코이단은 분말, 과립 또는 엑기스 형태로 제제화되어 건강식품으로 이용될 수 있고, 의약품, 화장품, 기능성 사료 등의 유효성분으로도 이용될 수 있다.
4. 초음파 마이크로파 병행 추출단계
상기 공정에서 제조된 효모발효 갈조류와 미생물 혼합물에 정제수를 중량대비 1:10~20의 비율로 혼합한 후 90℃ 이상에서 20∼40㎑의 초음파와 2450㎒의 마이크로파를 병행 처리하면서 4∼24시간 추출하여 추출된 다당체인 후코이단의 분자량이 10,000da∼100,000da 이 되도록 추출한 후 여과 농축 동결건조하여 저분자 후코이단을 제조한다.
이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.
<실시예>
1. 해조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 추출하는 공정
1) 제주도에서 시판되고 있는 톳, 미역, 다시마, 감태를 각 3kg씩 12kg을 담수에 1시간 침지하여 이물을 제거하고 염분을 용출시킨 후 다시 2시간 정도 침지시켜 염분을 용출시키고, 다시 한차례 3시간 정도 침지시켜 염분을 최대한 탈염시켰다.
2) 태양열과 해풍을 이용하여 상기 처리된 해조류가 부서질 정도로 자연 건조시키고 이를 다시 건조기에서 습도 6％ 정도가 될 때까지 건조시켰다.
3) 건조된 해조류를 50∼100메쉬(mesh)로 조분쇄하였다.
4) 상기 조분쇄물을 120℃에서 20분간 교반하면서 배소시키고 동시에 자외선 투사를 하여 후코이단(Fucoidan)이 중저분자화 되도록 하였다.
5) 배소된 조분쇄물을 추출자루에 넣고 물을 가한 후 105℃로 고압 추출기에서 5시간 가열하여 후코이단(Fucoidan)을 추출하였다.
6) 추출이 끝난 후 정치하여 이를 후코이단액(상등액)과 여과물(고형물)로 분리하고, 상등액을 취해 다시 110℃로 2∼5 시간 가온하여 7brix 정도의 후코이단(Fucoidan)액을 얻었다.
2. 후코이단액을 저분자화하는 공정
1) 상기 공정에서 얻은 7brix의 후코이단(Fucoidan)액 50ℓ에 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) 및 이의 당전이 효소를 포함하는 균체 배양액을 건조물량 기준으로 8g을 투입하여 1시간 30분 동안 교반하면서 발효시켰다.
2) 계속하여 일본 TOA PHARMACEUTICAL사의 Probiotics Powder Complex (Streptococcus feacalis T-110; Bacillus mesentericus TO-A; Clostridium butyricum TO-A, 균체수 각각 2.4×108/g; 6.7×108/g; 1.1×107/g) 8g을 가하고 3시간 동안 발효시켰다.
3) 발효 후 120℃에서 1시간 가열하여 균과 효소를 멸균 및 불활성화시켰다.
4) 상기 3)의 효모 발효물에 상기 혼합물(정제수 제외)의 15배수의 별도의 정제수를 다시 첨가하여 24㎑(300W)의 초음파와 2450㎒(1㎾)의 마이크로파를 병행 처리하면서 100℃에서 6시간 추출하여 여과, 농축, 동결건조하여 본 발명에 의한 갈조류 발효 저분자 후코이단을 제조하였다.
실험예
TSKgel GMPWXL 컬럼을 사용한 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 상기 실시예에서 제조된 저분자화된 후코이단의 분자량 분포를 측정하였다. 실험은 일본식품분석센터에 의뢰하여 실시하였다. 분자량 분포를 측정한 결과는 다음의 표 1과 같다.
분자량 범위 피크면적 백분율
1,000,000 이상 미량
300,000 - 1,000,000 2
100,000 - 300,000 13
30,000 - 100,000 24
10,000 - 30,000 13
3,000 - 10,000 5
1,000 - 3,000 6
1,000 이하 37
합계 100

Claims (3)

  1. (a) 갈조류를 수세하여 염분과 이물질을 제거한 후 건조시키는 단계; 건조된 갈조류를 조분쇄한 후 100∼130℃에서 교반하면서 배소시키는 단계; 및 배소된 갈조류 조쇄물에 5∼15배의 물을 가하고 100∼120℃에서 가열 추출하여 후코이단액(상등액)과 여과물(고형물)로 분리한 후 이 후코이단액을 다시 가온하여 후코이단(Fucoidan)액을 얻는 단계로 이루어진 갈조류로부터 후코이단(Fucoidan)을 추출하는 공정과,
    (b) 상기 공정에서 얻은 후코이단액 1L에 대하여 비브리오 하일로티콜리(Vibrio hailoticoli) 및 이의 당전이 효소를 포함하는 균체 배양액을 건조물량 기준으로 0.1∼0.2g 투입하여 발효시키는 단계; 계속하여 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)·바실러스 메젠테리쿠스(Bacillus mesentericus)·클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)을 건조물량 기준으로 각각 1.0×106∼1.0×109/g 함유하는 프로바이오틱스를 후코이단액 1L에 대하여 0.1∼0.2g 투입하여 발효시키는 단계; 및 상기 발효 후 90∼130℃로 가열하여 미생물과 효소를 멸균 및 불활성화시키는 단계로 이루어진 후코이단액을 저분자화하는 공정을 포함하는 해조류추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법에 있어서,
    상기 효모 발효물에 상기 혼합물(정제수 제외)의 15배수의 별도의 정제수를 다시 첨가하여 24㎑(300W)의 초음파와 2,450㎒(1㎾)의 마이크로파를 병행 처리하면서 100℃에서 6시간 추출하여 여과, 농축, 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 해조류추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 해조류는 다시마, 미역, 큰실말, 톳 중 어느 하나를 선택하여 사용하거나 2종 이상을 임의로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 해조류추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배소시키는 단계는 배소와 동시에 자외선 조사가 이루어지는 것을 특징으로 하는 해조류추출물의 저분자 후코이단(Fucoidan)의 제조방법.
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