KR20190016737A - 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 급성 폐손상의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 급성 폐손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 급성 폐손상의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물 및 건강기능식품은 급성 폐손상 환경에서 폐조직으로의 호중구 유출 등을 효과적으로 억제하여 급성 폐손상에 우수한 치료, 예방 및 개선 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 함유하는 급성 폐손상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
급성 폐손상은 영구적인 폐부종과 호흡부전을 초래하는 위험한 질병으로, 외상, 출혈, 감염, 패혈증 등 다양한 임상적 상황에 의해 발생할 수 있다. 급성 폐손상 발생시, 폐포-모세혈관 장벽의 투과성 증가, 활성화된 염증 세포의 침윤, 염증 세포로부터 생성된 염증 매개물질 및 활성 산소의 생성 등에 의해 과도한 면역 반응으로 이어지며, 사망에 이르는 심각한 증상을 야기할 수 있다.
급성 폐손상의 개시에 관여하는 인자 중 순환하는 염증 세포, 특히 호중구가 중요한 역할을 한다는 것이 인간과 실험용 동물 모델 모두에서 보고된 바 있다. 급성 폐손상에서 호중구는 폐 내에 광범위하게 축적되며, 활성화된 호중구는 폐손상에 관련된 다양한 매개체를 방출하여 질환을 악화시킬 수 있다.
이와 같은 급성 폐손상의 치료를 위한 많은 시도가 있었음에도 불구하고, 여전히 급성 폐손상으로 인한 높은 사망률이 보고되고 있다 (문헌 [Bernard, Gordon R., et al., American journal of respiratory and critical care medicine 149 (1994): 818-824)] 등). 따라서, 급성 폐손상의 효과적인 치료제 개발이 시급한 실정이다.
한편, 녹용은 사슴과(Cornu cervi)에 속하는 사슴의 각화되지 않은 유각을 채취하여 건조한 것으로, 인삼과 더불어 한방에서 널리 사용되고 있는 생약 중의 하나이다. 녹용은 예로부터 강장작용, 생장, 발육촉진작용, 신경쇠약 치료작용 등 다양한 효능이 알려졌으며, 녹용의 약효를 규명하기 위해 그의 성분에 관한 다양한 연구가 이루어져왔다.
1-팔미토일 (palmitoyl)-2-리놀레오일 (linoleoyl)-3-아세틸글리세롤 (acetylglycerol)은 모노아세틸디글리세라이드 (monoaetyldiglyceride)의 일종으로 녹용으로부터 분리되었으며, 암 항암화학요법의 맥락에서 백혈구 감소증 또는 혈소판 감소증의 치료 효과가 있음이 알려져있다. 그러나 상기 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물이 급성 폐손상에 있어서 어떠한 효과를 나타낼지에 대하여는 아직까지 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 급성 폐손상 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물이 급성 폐손상 환경에서 폐 조직으로의 호중구 유출을 효과적으로 억제하여 급성 폐손상을 효과적으로 치료하는 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 급성 폐손상의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 약학적 조성물을 급성 폐손상의 발병 가능성이 있거나 급성 폐손상을 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 폐손상의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 급성 폐손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
[화학식 1]
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다. 본 명세서에서 지방산기는 지방산의 카르복실기에서 -OH기가 제외된 나머지 부분을 의미한다.
본 발명에서 용어“모노아세틸디아실글리세롤(monoacethyldiacylglycerol; MADG) 화합물”은 하나의 아세틸기와 2개의 아실기를 갖는 글리세롤의 유도체를 의미하며, 급성 폐손상의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기일 수 있으며, 구체적으로 팔미토일 (palmitoyl), 올레오일 (oleoyl), 리놀레오일 (linoleoyl), 리놀레노일 (linolenoyl), 스테아로일 (stearoyl), 미리스토일 (myristoyl) 또는 아라키도노일 (arachidonoyl) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 R1 및 R2의 조합 (R1/R2)은 올레오일/팔미토일, 팔미토일/올레오일, 팔미토일/리놀레오일, 팔미토일/리놀레노일, 팔미토일/아라키도노일, 팔미토일/스테아로일, 팔미토일/팔미토일, 올레오일/스테아로일, 리놀레오일/팔미토일, 리놀레오일/스테아로일, 스테아로일/리놀레오일, 스테아로일/올레오일, 미리스토일/리놀레오일 또는 미리스토일/올레오일 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 광학활성에 있어, (R)-형, (S)-형 또는 라세미체일 수 있다.
화학식 1로 표시되는 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 녹용으로부터 추출/분리되거나, 공지의 유기합성법 (대한민국등록특허 제10-0789323호)으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일례로 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 다음의 과정을 통해 제조될 수 있다. 먼저, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출한 다음, 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 클로로포름 추출물을 수득할 수 있다. 상기 추출에서 사용되는 추출용매인 헥산 및 클로로포름의 양은 각각 사용된 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로는 녹용 1kg에 대하여 헥산 및 클로로포름을 각각 4~5ℓ정도의 비로 사용할 수 있으나, 추출용매의 종류와 사용량이 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법으로 수득한 녹용의 클로로포름 추출물을 계속해서 일련의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 TLC 방법에 의해 더 분획화하고 정제하여, 본 발명에 사용되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 얻을 수 있다. 상기 크로마토그래피 정제 단계의 용리액으로는 클로로포름/메탄올, 헥산/에틸아세테이트, 헥산/에틸아세테이트/아세트산 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또다른 일례로, 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 화학적으로 합성하는 방법은 대한민국등록특허 제10-0789323호에 공개되어 있다. 구체적으로, (a) 1-R1-글리세롤의 3번 위치에 보호기를 붙여 1-R1-3-보호기-글리세롤을 제조하는 과정; (b) 1-R1-3-보호기-글리세롤의 2번 위치에 R2기를 도입하여 1-R1-2-R2-3-보호기-글리세롤을 제조하는 과정 및; (c) 1-R1-2-R2-3-보호기-글리세롤의 탈보호 반응 및 아세틸화 반응을 동시에 수행하는 과정을 포함할 수 있고, 필요에 따라 정제하여, 목적하는 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물을 합성할 수 있으며, 다른 방법으로는 포스파티딜콜린을 가아세트산 분해 (acetolysis)하여 얻을 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 입체이성질체도 모두 본 발명의 범주 내로 포함될 수 있다.
상기 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물은 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함한다.
[화학식 2]
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 1-팔미토일 (palmitoyl)-2-리놀레오일 (linoleoyl)-3-아세틸글리세롤 (acetylglycerol)이라고 하며, PLAG 또는 EC-18이라 명명되기도 한다. 상기 화합물의 R1과 R2는 각각 팔미토일과 리놀레오일에 해당한다.
본 발명에서 상기 화학식 2로 표시되는 PLAG 화합물은 급성 폐손상의 예방 또는 치료 효과를 보이는 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물의 일 예시로 제공된다.
본 발명에서 용어“급성 폐손상 (acute lung injury; ALI)”은 폐포-모세혈관 장벽의 손상을 특징으로 하는 중증 호흡 염증성 폐 질환을 의미하며, 이는 호중구의 간질조직 (interstitium) 및 기관지 폐포 공간 (bronchoalveolar space)으로의 대량의 호중구 침투 뿐만 아니라 과도한 면역 반응으로 이어진다. 급성 폐손상은 폐포-모세혈관 장벽의 투과성 증가, 활성화된 염증세포의 침윤, 염증 세포로부터 생성된 염증 매개물질 및 활성 산소 (reactive oxygen species, ROS)가 중요한 역할을 하며, 특히 호중구의 활성화 및 이동은 급성 폐손상 진행에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 하나의 양태에 따른 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 급성 폐손상을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 급성 폐손상은 세균 감염, 외상, 수혈, 췌장염, 또는 구토 물질의 흡입, 유독한 증기의 흡입, 폐렴 또는 폐 좌상과 같은 폐의 직접적인 손상에 의해 유발될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 급성 폐손상의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 조성물에 의해 급성 폐손상에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 하나의 양태에 따른 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 폐 조직으로의 호중구 이동을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또다른 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물은 염증 세포의 활성 산소 생성을 효과적으로 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또다른 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물은 MIP-2 등의 염증 인자의 분비를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적 일실시예에서, 본 발명의 화학식 2로 표시되는 PLAG 화합물은 급성 폐손상에서 폐로의 호중구 이동을 효과적으로 저해 (도 1-3, 9, 10, 15)하고, 염증 세포의 활성 산소 생성을 효과적으로 억제하며 (도 11), MIP-2 등의 염증 인자의 분비를 효과적으로 억제 (도 6-8, 13)한다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 급성 폐손상의 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 100.0 중량%, 0.001 내지 50.0 중량%로, 또는 0.01 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.0005 내지 4000 mg/kg의 양, 0.001 내지 2000 mg/kg의 양, 0.01 내지 1000 mg/kg의 양, 0.05 내지 200 mg/kg의 양, 또는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물은 급성 폐손상의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 및 인간 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또다른 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 급성 폐손상의 예방 또는 개선용 건강기능식품이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
구체적으로, 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 급성 폐손상의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 포함되어 사용될 수 있다. 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물 및 급성 폐손상에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에서 용어, "개선"은 상기 화합물을 이용하여 급성 폐손상의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 화합물은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 또는 10 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 영양 캡슐, 비타민 복합제, 캔디류, 스넥류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 및 알코올 음료 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 화합물 100 ㎖ 당 0.01 내지 0.04g, 또는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산 (예컨대, 중쇄 지방산(medium chain fatty acid, MCT)), 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 또다른 하나의 양태는 상기 약학적 조성물을 급성 폐손상의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 폐손상의 예방 또는 치료 방법이다. 본 발명에서 상기 급성 폐손상의 의심 개체는 급성 폐손상이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 급성 폐손상 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 급성 폐손상에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 급성 폐손상 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상기 화학식 1의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.0005 내지 4000 mg/kg의 양, 0.001 내지 2000 mg/kg의 양, 0.01 내지 1000 mg/kg의 양, 0.05 내지 200 mg/kg의 양, 또는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 급성 폐손상 환경에서 폐 조직으로의 호중구 유출, 염증 세포의 활성 세포 생산, 및 MIP-2 등의 염증 인자의 분비 등을 효과적으로 억제함으로써, 급성 폐손상의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물 및 건강기능식품은 급성 폐손상의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 급성 폐손상 (acute lung injury; ALI) 동물 모델의 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 내 호중구 수치 상승에 대한 PLAG (1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol)의 억제 효과를 나타낸다.
도 2는 ALI 동물 모델에서 LPS (lipopolysaccaride) 처리 동시에, 또는 처리 이후에 PLAG를 투여한 경우 BALF 내 호중구 수치 상승에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 마우스에 PLAG 단독 투여시 BALF 내 호중구 수에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 ALI 동물 모델의 폐에서의 혈액 삼출에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 5는 ALI 동물 모델에서 PLAG의 호흡 패턴 회복 효과를 나타낸다.
도 6은 ALI 동물 모델의 BALF 및 폐조직에서 염증 관련 인자 발현 및 분비에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 7은 ALI 동물 모델의 BALF 및 폐조직에서 케모카인 발현에 대한 PLAG의 효과를 나타낸다.
도 8은 ALI 동물 모델에서 LPS 처리 후 PLAG 투여시 BALF 내 염증 관련 인자 분비에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 9는 ALI 동물 모델에서 PLAG에 의한 조직학적 변화를 나타낸다.
도 10은 ALI 동물 모델의 폐에서 MPO (myeloperoxidase) 활성 증가에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 11은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG의 ROS 생성 억제 효과를 나타낸다.
도 12는 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 p47phox 및 Rac-1의 세포막 이동 억제 효과를 나타낸다.
도 13은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 염증 관련 인자 분비에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 14는 분리된 일차 호중구의 순도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주 분비 인자에 의해 유도된 일차 호중구의 이동에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 16은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에 STAT3, PKCδ, NOX, NF-kappaB, 및 ERK 억제제를 처리할 경우 MIP-2 분비량에 미치는 영향을 나타낸다.
도 17은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에 STAT3, PKCδ, NOX, NF-kappaB, ERK, 및 TLR4 억제제를 처리할 경우 호중구 이동능에 미치는 영향을 나타낸다.
도 18은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG에 의한 STAT3 및 PKCδ의 탈인산화 효과를 나타낸다.
도 19는 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG에 의한 TLR4 엔도시토시스 유도 효과를 나타낸다.
도 20은 PLAG와 PLAG 유도체의 ALI 억제 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
도 21은 PLAG의 ALI 치료 효과에 관여하는 메커니즘에 대한 도식을 보여준다.
도 2는 ALI 동물 모델에서 LPS (lipopolysaccaride) 처리 동시에, 또는 처리 이후에 PLAG를 투여한 경우 BALF 내 호중구 수치 상승에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 마우스에 PLAG 단독 투여시 BALF 내 호중구 수에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 ALI 동물 모델의 폐에서의 혈액 삼출에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 5는 ALI 동물 모델에서 PLAG의 호흡 패턴 회복 효과를 나타낸다.
도 6은 ALI 동물 모델의 BALF 및 폐조직에서 염증 관련 인자 발현 및 분비에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 7은 ALI 동물 모델의 BALF 및 폐조직에서 케모카인 발현에 대한 PLAG의 효과를 나타낸다.
도 8은 ALI 동물 모델에서 LPS 처리 후 PLAG 투여시 BALF 내 염증 관련 인자 분비에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 9는 ALI 동물 모델에서 PLAG에 의한 조직학적 변화를 나타낸다.
도 10은 ALI 동물 모델의 폐에서 MPO (myeloperoxidase) 활성 증가에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 11은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG의 ROS 생성 억제 효과를 나타낸다.
도 12는 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 p47phox 및 Rac-1의 세포막 이동 억제 효과를 나타낸다.
도 13은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 염증 관련 인자 분비에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 14는 분리된 일차 호중구의 순도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주 분비 인자에 의해 유도된 일차 호중구의 이동에 대한 PLAG의 억제 효과를 나타낸다.
도 16은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에 STAT3, PKCδ, NOX, NF-kappaB, 및 ERK 억제제를 처리할 경우 MIP-2 분비량에 미치는 영향을 나타낸다.
도 17은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에 STAT3, PKCδ, NOX, NF-kappaB, ERK, 및 TLR4 억제제를 처리할 경우 호중구 이동능에 미치는 영향을 나타낸다.
도 18은 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG에 의한 STAT3 및 PKCδ의 탈인산화 효과를 나타낸다.
도 19는 LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG에 의한 TLR4 엔도시토시스 유도 효과를 나타낸다.
도 20은 PLAG와 PLAG 유도체의 ALI 억제 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
도 21은 PLAG의 ALI 치료 효과에 관여하는 메커니즘에 대한 도식을 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<
실시예
1>
PLAG
(1-
palmitoyl
-2-
linoleoyl
-3-
acetylglycerol
)의 급성
폐손상
(acute lung injury; ALI) 치료 효과 확인
1-1. ALI 동물 모델의 폐포 세척액 (
bronchoalveolar
lavage
fluid;
BALF
) 내 호중구 수치 상승에 대한
PLAG
의 억제 효과
LPS (lipopolysaccharide)는 폐로 면역 세포를 모집하고, 염증 매개 인자의 분비를 유도할 수 있기 때문에 마우스 모델에서 ALI의 발병을 유도하기 위해 사용될 수 있다. ALI 동물 모델 제작을 위해, Balb/c 마우스 (9주 내지 11주령 수컷)를 Koatech Co. (Pyongtaek, Republic of Korea)에서 구입하여 무병균 (specific pathogen-free; SPF) 환경에서 유지했다. 상기 마우스를 150 mg/kg의 2,2,2-트리브로모에탄올 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)로 복강 주사로 마취시키고, 비강 내에 LPS (25 mg/kg, Sigma Aldrich)를 투여하였다. PLAG 투여군의 경우, LPS 처리와 동시에(도 2의 A 상단), 또는 LPS 처리 2 시간 후에(도 2의 A 하단) 250 mg/kg의 PLAG (Enzychem Lifesciences Co., Daejeon, Republic of Korea)를 각각 구강 투여하였다. 2, 4, 8 및 16 시간 후, 기관 캐뉼라를 통해 차가운 포스페이트 완충액 식염수 (PBS)로 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF)을 수집하였다. 그 다음, Mindray BC-5300 auto hematology analyzer (Shenzhen Mindray Bio-medical Electronics, China)를 사용해 전혈 수치 (Complete Blood Count, CBC)를 측정하여, BALF 샘플 내 호중구 수를 카운팅했다.
그 결과, LPS 투여군에서는 대조군에 비해 BALF로 침투한 호중구의 양이 현저히 증가하였다. 반면, LPS와 PLAG를 동시에 공동 투여한 경우 (도 2의 A 상단)에는 투여 16 시간 후 BALF로 이동한 호중구의 양이 현저히 감소된 것으로 나타났다 (도 1). 또한, LPS 처리 2 시간 후에 PLAG를 투여할 경우(도 2의 A 하단)에도 BALF로 이동한 호중구의 양이 현저히 감소된 것으로 나타났다 (도 2의 B).
한편, 정상 마우스에 LPS를 처리하지 않고 PLAG (250 mg/kg)를 단독 투여한 경우에는 정상 마우스에 비해 BALF 내 호중구의 수에 유의한 변화가 없었다 (도 3).
따라서, PLAG는 ALI에서 폐 호중구 수치 상승을 억제하는 현저한 효과를 나타낸다.
1-2. ALI 동물 모델의 폐에서의 혈액 삼출에 대한
PLAG의
억제 효과
조직으로의 혈액 삼출량은 혈관 투과성 및 호중구 이동성의 지표이며, 에반스 블루 (Evans Blue) 염색을 통해 측정될 수 있다. PLAG의 혈관 삼출에 대한 효과를 알아보기 위해, 상기 기재된 것과 같은 방식으로 마우스에 LPS 처리 후 16 시간 동안 에반스 블루 염색으로 분석했다 (도 4의 A). 간략히 설명하면, 에반스 블루 (50 mg/kg, Sigma Aldrich)를 PBS에 희석시켜 마우스에 정맥 주사하고, 30 분 후 마우스를 희생시켰다. 그 다음, 희생된 마우스의 우심실을 천공한 다음 PBS를 관류시키고, 폐를 사진 촬영했다. 그 후, 56 ℃에서 48 시간 동안 폐를 건조시킨 후, 무게를 잰 다음 에반스 블루 염색약을 500 ㎕의 포름아마이드 (Sigma Aldrich)로 추출했다. 그 다음, 분광 광도계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 상층액의 흡광도를 620 nm의 파장에서 측정했다. 에반스 블루 농도는 건조 폐 조직 중량 (mg)에 대한 추출된 에반스 블루 농도 (ng)로 계산하였고, 이를 표준 곡선의 측정치와 비교했다.
그 결과, LPS 투여군에서 폐 조직에 대량의 에반스 블루가 축적된 것을 확인하였다. 반면, LPS/PLAG 공동 투여군에서 폐 조직에 축적된 에반스 블루의 양은 감소했다 (도 4의 A). 상기 결과는 에반스 블루로 라벨링된 알부민을 추출하여 정량 분석한 결과를 통해서도 확인된다 (도 4의 B).
따라서, PLAG는 ALI에서 폐로의 혈액 삼출을 억제하는 현저한 효과를 나타낸다.
1-3. ALI 동물 모델에서
PLAG의
호흡 패턴 회복 효과
LPS로 유도된 ALI 마우스의 폐 기능 회복에 미치는 PLAG의 영향을 알아보기 위해, 상기 기재된 것과 같은 ALI 마우스에 전신 프레치스모그래피 (plethysmography)를 실시하였다. LPS 또는 PLAG 투여 후, 마우스를 전신 프레치스모그래피 챔버 (Allmedicus Co.,OCP-3000)에 집어넣었다. 호흡 패턴을 3 분 동안 기록했고, enhanced pause (Penh)을 호기 (expiratory time) 및 이완기 (relaxation time), 최대호기유속 (peak inspiratory flow)과 같은 파라미터 측정치에 기반해 소프트웨어 프로그램 (Allmedicus Co.)을 사용해 계산했다. 데이터는 3회 수행된 실험 중 하나를 나타낸다.
그 결과, LPS로 유도된 비정상적인 호흡 상태가 PLAG 처리에 의해 대조군 수준으로 회복되었다. 따라서, PLAG는 LPS로 유도된 ALI를 현저히 억제함을 확인하였다 (도 5).
따라서, PLAG는 ALI에서 호흡 패턴을 회복시키는 현저한 효과를 나타낸다.
상기 결과들을 통해, PLAG는 LPS에 의해 유도된 ALI에 대해 현저한 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<
실시예
2> ALI에서
PLAG의
염증 반응 억제 효과 확인
ALI에서 PLAG가 항염증 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 1에 기재된 것과 같은 ALI 마우스의 BLAF 세포 및 균질화된 폐 조직에서 염증 인자의 mRNA 발현 수준을 측정했다 (도 6의 A, B). mRNA 발현 수준 측정을 위해, 제조사의 설명서에 따라 전체 RNA 추출 용액 (Bioassay, Daejeon, Republic of Korea)을 사용하여 균질화된 폐 조직 및 분리된 BALF 세포에서 전체 RNA를 추출했다. 그 다음, 상기 전체 RNA를 올리고-dT 프라이머 및 M-MLV RT 시약 (Promega, Madison, Wis, USA)를 사용하여 역전사 반응을 수행하고, cDNA를 얻었다. cDNA에 대한 PCR을 위해, 제조사의 설명서에 따라 합성 cDNA를 2X PCR 마스터 믹스 (Bioassay)와 혼합하고, 10 pmol의 특이적 PCR 프라이머쌍과 혼합했다. 프라이머는 바이오니어에서 합성했다 (표 1).
| 센스 프라이머 | 안티센스 프라이머 | |
| MIP-2 (CXCL2) | AGTGAACTGCGCTGTCAATG (서열번호 1) |
CTTTGGTTCTTCCGTTGAGG (서열번호 2) |
| IL-6 | GATGCTACCAAACTGGATAT (서열번호 3) |
GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGTG (서열번호 4) |
| S100A8 | ATGCCGTCTGAACTGGAGAA (서열번호 5) |
TGCTACTCCTTGTGGCTGTC (서열번호 6) |
| S100A9 | ATGGCCAACAAAGCACCTT (서열번호 7) |
TTACTTCCCACAGCCTTTGC (서열번호 8) |
| CXCL1 | AGACTGCTCTGATGGCACCT (서열번호 9) |
CTGCACTTCTTTTCGCACAA (서열번호 10) |
| CXCL3 | CAACGGTGTCTGGATGTGTC (서열번호 11) |
AGCCAAGGAATACTGCCTTA (서열번호 12) |
| CXCL5 | GTATCCTGGGTTTCCGGACT (서열번호 13) |
GATCTCCATCGCTTTCTTCG (서열번호 14) |
| CXCL12 | GAGCCAACGTCAAGCATCTG (서열번호 15) |
CGGGTCAATGCACACTTGTC (서열번호 16) |
| CCL2 | CCCAATGAGTAGGCTGGAGA (서열번호 17) |
AAAATGGATCCACACCTTGC (서열번호 18) |
| CCL3 | CCAAGTCTTCTCAGCGCCAT (서열번호 19) |
TCCGGCTGTAGGAGAAGCAG (서열번호 20) |
| CCL4 | TCTTGCTCGTGGCTGCCT (서열번호 21) |
GGGAGGGTCAGAGCCCA (서열번호 22) |
| CCL5 | ATATGGCTCGGACACCACTC (서열번호 23) |
AGCAAGCAATGACAGGGAAG (서열번호 24) |
| CCL7 | GTGTCCCTGGGAAGCTGTTA (서열번호 25) |
TCCTTAGGCGTGACCATTTC (서열번호 26) |
| CCR1 | AAGGCCCAGAAACAAAGTCT (서열번호 27) |
TCTGTAGTTGTGGGGTAGGC (서열번호 28) |
| CCR2 | CCTGCAAAGACCAGAAGAGG (서열번호 29) |
GTGAGCAGGAAGAGCAGGTC (서열번호 30) |
| CCR3 | AAGGACTTAGCAAAATTCACCA (서열번호 31) |
ACACCAGGGAGTACAGTGGA (서열번호 32) |
| CCR5 | CGTTCCCCCTACAAGAGACT (서열번호 33) |
ACCCACAAAACCAAAGATGA (서열번호 34) |
| CXCR1 | TCAGTGGTTCCTGCTGCTG (서열번호 35) |
GCAGACGAGGATAGTGAGCA (서열번호 36) |
| CXCR2 | GATGTCTACCTGCTGAACCT (서열번호 37) |
ACCAGGTTGTAGGGCAGCCA (서열번호 38) |
| CXCR4 | GGGGACATCAGTCAGG (서열번호 39) |
GTGGAAGAAGGCGAGGG (서열번호 40) |
| GAPDH | CCATCACCATCTTCCAGGAG (서열번호 41) |
ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT (서열번호 42) |
이후, 증폭된 생성물을 1% 아가로스 젤 상에서 분리하여, 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색하고, GelDoc을 사용하여 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) UV 조명 하에서 촬영했다. 그리고, SYBR 그린 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 리얼-타임 PCR 분석을 실시했다. ViiA 7 Real-Time PCR System machine (Applied Biosystems)을 사용하여 열 사이클링을 수행했으며, 구체적으로 95 ℃에서 15 분 동안 최초 변성 후, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 40 사이클을 수행하고, 마지막 사이클 후 온도를 72 ℃에서 95 ℃로 상승시키면서 멜팅 단계를 수행했다. 표적 유전자 발현 수준은 사이클 역치 (Ct) 수치의 계산에 의해 샘플 내 GAPDH에 대한 비로 나타난다. 표적 유전자의 상대 발현 수준은 2-△Ct 상대 정량 방법으로 계산되었다.
그 결과, LPS를 처리한 마우스는 LPS를 처리하지 않은 대조군 마우스에 비해 BALF 세포 내에서 MIP-2 (CXCL2), IL-6, S100A8, 및 S100A9의 발현 수준이 증가했다. 반면, LPS와 PLAG를 함께 처리한 마우스의 경우, 상기 유전자 발현이 모두 현저히 감소했다 (도 6). 다른 일부 케모카인도 PLAG 처리 후 발현량이 감소하는 것을 확인하였다 (도 7).
한편, BALF 및 혈청 내 분비된 MIP-2 및 IL-6의 수준을 측정하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 이를 위해, 제조사의 설명서에 따라 MP-2 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 마우스 IL-6 ELISA 키트 (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용해 MIP-2 및 IL-6의 농도를 측정했다. 측정치는 ELISA 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용해 450 nm에서 생성된 표준 커브로부터 시토카인 수준을 추산했다.
그 결과, LPS 처리 후 BALF 및 혈청 내에서 MIP-2 및 IL-6의 분비량이 현저히 증가하였으나, LPS와 PLAG를 함께 처리하면 MIP-2 및 IL-6의 분비량이 현저히 감소됐다 (도 6의 C, D). 더욱이, LPS 처리 2 시간 후 PLAG를 투여하였을 경우에도 MIP-2 및 IL-6의 분비 억제 효과가 나타났다 (도 8).
따라서, PLAG는 MIP-2 및 IL-6 등의 면역 인자 분비의 발현 및 분비의 억제를 통해 우수한 항염증 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<실시예 3> ALI에서 염증 세포의 폐 이동에 대한 PLAG의 억제 효과 확인
3-1. ALI 동물 모델에서 폐조직 내 염증세포에 대한 PLAG의 조직학적 관찰
폐로 세포가 침투하는 것에 PLAG가 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 마우스 폐 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색했다. 먼저, 마우스 폐 조직 시료를 실시예 1에 기재된 것과 같은 방식으로 LPS 투여 16 시간 후 얻었고, 10% 완충 포르말린에서 24 시간 동안 고정하고 파라핀에 포매한 뒤 4 μm 두께로 절편화했다. 조직 절편을 H&E로 염색한 뒤, 염증 세포의 침투 정도를 평가했다.
그 결과, LPS를 처리하면 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비해 많은 양의 염증 세포가 폐로 침투되는 것을 확인하였다 (도 9의 A). 반면, LPS와 PLAG가 함께 처리된 마우스는 폐포로 침투된 염증 세포의 양이 현저히 감소하여, 정상적인 폐포의 형태를 나타냈다 (도 9의 A).
한편, 폐 조직으로 모집된 호중구의 IHC 분석을 위해, 4 μm 두께로 연속적으로 절편화된 폐 절편을 하전된 유리 슬라이드 (SuperfrostPlus; Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)에 마운팅했다. 상기 절편에서 파라핀을 제거한 뒤 메탄올 내 3% 과산화수소로 처리하여 내생 페록시다제 활성을 켄칭했다. 그 다음, 샘플을 1% BSA와 함께 인큐베이션하여 비특이적 결합을 블로킹했다. 그 후, 절편들을 1차 래트 항-마우스 호중구 (NIMP-R14, Thermo Fisher Scientific Inc.) 항체 (1:100)로 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, TBS로 세척한 다음, 슬라이드를 1:250으로 희석된 2차 항체 홀스래디쉬 페록시다제-콘쥬게이션 염소-항-래트 IgG (Santa CruzBiotechnology)로 상온에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 조직 절편을 기질로 사용된 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC, Dako, Denmark)에 담군 다음, 샘플을 10% Mayer 헤마톡실린으로 반대염색 (counterstain)하고, 탈수한 뒤, 크리스탈 마운트로 마운팅했다. 동일한 아이소타입의 염소 IgG와 항체 희석액이 네거티브 대조군로 사용됐다. 이미지를 광학 현미경 (Olympus) 하에서 관찰했다. 폐 손상 점수는 폐포 또는 간질 (interstitial space)에서의 호중구 침투, 히알린 막, 기강 (airspace)에 분포한 단백질성 잔해 (debris)에 근거한 공지된 기준 (표 2)을 사용하여 블라인드된 조사자에 의해 측정됐다.
| 필드 당 스코어 | |||
| 파라미터 | 0 | 1 | 2 |
| A. 폐포 공간 (alveolar space) 내 호중구 | 없음 | 1-5 | >5 |
| B. 간질 (interstitial space) 내 호중구 수 | 없음 | 1-5 | >5 |
| C. 히알린 (Hyaline) 막 | 없음 | 1 | >1 |
| D. 기강 (airspace를)에 분포한 단백질성 잔해 | 없음 | 1 | >1 |
| E. 폐포 격벽 비대 (alveolar septal thickening) | <2x | 2x-4x | >4x |
그 결과, LPS와 PLAG가 함께 처리된 마우스에서 치료 효과를 의미하는 조직학 점수 (histological score)가 나타났다 (도 9의 B 및 표 2). 또한, PLAG가 처리된 샘플에서, 폐로의 호중구 이동이 현저히 감소하였다 (도 9의 C).
따라서, PLAG는 ALI 동물 모델에서 폐로 염증 세포, 특히 호중구 세포가 이동하는 것을 억제하는 현저한 효과를 나타낸다.
3-2. ALI 동물 모델의 폐에서 MPO 활성 증가에 대한 PLAG의 억제 효과
폐에서 MPO (myeloperoxidase) 활성은 호중구 축적을 반영하는 지표이다. 실시예 1에 기재된 것과 같은 ALI 마우스에서 MPO 활성을 측정하기 위해, 폐를 분리하여 0.1% IGEPAL(R) CA-630 (Sigma Aldrich)로 균질화했다. 30 분 동안 원심분리 후, MPO 활성을 myeloperoxidase activity assay kit (Abcam, Cambridge, UK)를 사용해 측정했다. 간략히 설명하면, 10 ㎕의 균질화된 폐 조직 상층액을 40 ㎕ MPO 분석용 완충액과 혼합하고, 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 2 ㎕의 Stop Mix 첨가 후, 샘플을 상온에서 10 분 동안 TNB 시약과 인큐베이션했다. 샘플의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices)를 사용해 410 nm에서 측정했다.
그 결과, 분리된 폐 조직의 MPO 활성은 LPS가 처리된 마우스에서 현저히 증가하였다. 반면, LPS와 PLAG가 공동 처리된 마우스에서는 MPO 활성이 현저히 감소했다 (도 10).
상기 결과를 통해, PLAG는 ALI에서 호중구가 폐로 이동하는 것을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다.
<
실시예
4> 염증 세포 모델에서
PLAG의
p47phox
막 이동 억제 및 활성
산소종
(reactive
oxigen
species; ROS) 생성 억제 효과 확인
LPS를 처리할 경우, 매크로파지에서 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS)이 생성되고 케모카인 (주로 MIP-2)이 분비되어 순환중인 호중구를 감염 부위로 모집하는 것으로 알려져 있다. PLAG가 매크로파지의 ROS 생성에 관여하는지 알아보기 위해, 마우스 매크로파지 세포주인 Raw264.7을 사용하여 ROS 생성 여부를 측정했다. 간략히 설명하면, Raw264.7 (ATCC, VA, USA) 세포를 2 mM L-글루타민 및 10% 우태아 혈청 (TCB, Long Beach, CA, USA)으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양했다. 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 유지했다.
컨포컬 이미징 측정을 위해, 세포를 4% 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로 고정하고 투과화 (permeabilization)하였다. PBS로 세척 후, 샘플을 1% BSA (Gibco, Waltham, MA, USA)를 함유한 PBS로 블로킹했다. ROS 분석을 위해, 세포를 FITC 콘쥬게이션 CM-H2DCFDA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 염색하였다. 하기에서 설명할 p47phox, Rac-1의 확인을 위해서는 토끼 항-p47phox (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 및 마우스 항-Rac-1 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 항체로 세포를 염색했다. 이차 항체로는 Alexa488로 콘쥬게이션 항-토끼 IgG (Invitrogen) 또는 Alexa594로 콘쥬게이션 항-마우스 IgG (Thermo Fisher Scientific Inc.)로 사용했다. 세포를 PBS로 세척하고 DAPI-함유 형광 현미경 마운팅 용액 (Invitrogen)으로 마운팅했다. 샘플을 레이저 스캐닝 컨포컬 현미경 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 분석했다.
그 결과, LPS가 처리된 세포주에서 ROS 생성이 관찰되었으나, PLAG가 함께 처리될 경우, ROS 생성이 억제됨을 확인하였다 (도 11).
한편, 세포질 및 세포막 분획에서 p47phox 및 Rac-1의 수준을 측정하기 위해, 제조사의 설명서에 따라 Mem-PER plus Membrane Protein Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용해 세포에서 세포질 및 세포막 추출물 샘플을 준비했다. 웨스턴 블롯을 위해, 각 샘플을 폴리아크릴아미드 젤 상에서 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분리하고 단백질을 PVDF 멤브레인 (Bio-Rad) 상에 블롯팅했다. 그 다음, 멤브레인을 0.05% 트윈-20 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)을 함유한 PBS 내 5% BSA (Gibco)로 블로킹했다. 그 다음, 멤브레인을 토끼 항-p47phox (Thermo Fisher Scientific Inc.) 또는 마우스 항-Rac-1 (Merck Millipore) 또는 토끼 항-알파-튜불린 또는 토끼 항-Na, K-ATPase 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션했다. 그 다음, 0.05% 트윈-20을 함유한 PBS로 세척한 후, 멤브레인을 퍼옥시다제-콘쥬게이션 염소 항-토끼 IgG (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) 또는 퍼옥시다제-콘쥬게이션 염소 항-마우스 IgG (Santa CruzBiotechnology) 항체로 염색했다. 그리고, 표적 단백질을 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck Millipore)로 검출했다.
그 결과, LPS가 처리된 세포주에서 p47phox 및 Rac1가 세포질에서 세포막으로 이동하였으나, PLAG가 함께 처리될 경우, 세포막에 발현된 p47phox 및 Rac1 수준이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다 (도 12).
상기 결과를 종합하면, PLAG는 염증 세포 모델에서 p47phox의 막 이동을 억제하여, 활성 산소종 생성을 현저히 억제하는바, NOX-ROXS-매개 신호전달경로를 차단하여 염증 부위에 침투된 과도한 호중구를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
<실시예 5> PLAG의 STAT3 및 PKCδ 매개 경로의 억제를 통한 호중구의 이동능 억제 효과 확인
5-1.
LPS가
처리된
Raw264
.7 세포주에서 염증 관련 인자 분비에 대한
PLAG의
억제 효과
MIP-2, IL-6 및 TNF 분비를 측정하기 위해, Raw264.7 세포주를 1, 10, 100 ug/ml의 PLAG 또는 DMSO (용매 대조군)과 함께 인큐베이션 한 뒤, 100 ng/ml LPS를 8 시간 동안 처리했다. 제조사의 설명서에 따라 상층액을 MIP-2, 마우스 IL-6 및 마우스 TNF ELISA kit를 사용하여 분석했다.
그 결과, LPS에 의한 MIP-2 및 IL-6의 생성은 LPS 및 PLAG 공동 투여군에서 PLAG의 용량에 의존적으로 현저히 감소됐다 (도 13의 A, B). 그러나, PLAG는 TNF 분비에는 영향을 미치지 않았다 (도 13의 C).
5-2. LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에 의해 유도된 일차 호중구의 이동에 대한 PLAG의 억제 효과
LPS에 의해 ROS가 생성되면, 케모카인이 분비되어 호중구 이동을 야기한다는 점이 널리 알려져있다. PLAG가 호중구 이동에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 마우스 일차 호중구를 65% 및 72% percoll (Sigma-Aldrich) 이중층 구배를 이용해 마우스의 대퇴골 (femur) 및 경골 (tibias)에서 분리했다. 원심분리 후, 회복된 세포를 RBC 용해액 (ACK lysing buffer, Gibco)과 함께 인큐베이션했다. 분리된 일차 호중구 (CD11b+GR1+)의 순도는 90% 이상으로 확인되었다 (도 14). 그리고, Raw264.7 세포를 1, 10, 100 ㎍/ml의 PLAG와 함께 1 시간 동안 사전 인큐베이션한 뒤, LPS (100 ng/ml)로 8 시간 동안 처리했다. 그 후, 세포를 원심분리하여 상층액을 트랜스웰 하단 챔버에 옮겼다. 그 후, 분리된 마우스 호중구를 FBS가 없는 RPMI 1640으로 현탁하여 이동 챔버의 상단에 위치한 3 μm-pore 트랜스웰 필터 (Corning) 상에 로딩했다. 그 후, 트렌스웰을 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 하단 챔버로 이동한 호중구를 트립판 블루 염색하여 헤모사이토미터를 사용해 카운팅했다.
그 결과, PLAG는 LPS에 의해 유도된 호중구 이동을 현저히 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인했다 (도 15).
5-3. LPS가 처리된 Raw264.7 세포주에서 PLAG에 의한 STAT3 및 PKCδ의 탈인산화 효과
인산화된 STAT3 및 PKCδ는 염증 반응의 핵심 인자로서, LPS에 의해 유도되는 염증반응의 매개 인자로 널리 알려져 있다. PLAG가 상기 염증 매개 인자를 억제하는지 여부를 확인하기 위해, 먼저 Raw264.7 세포를 S3I-201 (STAT3 억제제) 또는 Rottlerin (PKCδ 억제제) 또는 Apocynin (NOX 억제제) 또는 Bay11-7082 (NF-kappaB 억제제) 또는 PD98059 (ERK 억제제)와 함께 인큐베이션했다. 1 시간 후, 100 ng/ml의 LPS를 8 시간 동안 처리했다. 그 후, 제조사의 설명서에 따라 MIP-2 ELISA 키트를 사용하여 상층액 내 MIP-2 농도를 측정하거나, 또는 상층액을 트랜스웰 시스템의 화학주성제 (chemoattractant)로 사용하여 2 시간 인큐베이션 후 이동한 일차 호중구의 수를 카운팅했다. 그 결과, STAT3, PKCδ, NOX, NK-kappaB, ERK 및 TLR4 억제제는 각각 LPS에 의해 유도된 MIP-2 분비 및 호중구 이동을 모두 억제하는 것으로 확인되었다 (도 16 및 도 17).
그 다음, Raw264.7 세포를 1, 10, 100 ㎍/ml의 PLAG 또는 DMSO (대조군 용매)로 인큐베이션한 뒤, LPS로 15분 동안 자극했다. 그리고, Raw264.7 세포를 얼음 상에서 프로테아제 저해제 (Roche, Indianapolis, IN, USA) 및 포스파타제 억제제 (Thermo Fisher Scientific Inc.)를 함유한 1x RIPA lysis buffer (Cell Signaling Technology)로 터트린 후, 원심분리하여 세포 용해물을 얻었다. 상기 세포 용해물 샘플에 대해, phospho-STAT3 (Ser727), STAT3, phospho-PKCδ (PKCδ, Thr505), 및 PKCδ 항체 (Cell Signaling Technology)를 사용하여 실시예 4에 기재된 것과 같은 방식으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, LPS에 의해 유도된 STAT3 및 PKCδ의 인산화는 PLAG 전처리에 의해 용량 의존적 방식으로 현저히 감소됨을 확인했다 (도 18).
상기 결과를 통해, PLAG는 염증 반응의 핵심 인자인 STAT3 및 PKCδ 경로를 차단함으로써 매크로파지의 화학주성을 억제하고, 염증 부위를 향한 호중구 이동을 억제한다는 것을 알 수 있다.
<실시예 6> PLAG의 TLR4 엔도시토시스 유도 효과 확인
PLAG가 LPS 수용체인 TLR4/MD2의 발현을 조절하는지 확인하기 위해, 유세포분석 (flow cytometry)을 실시하였다. 먼저, Raw264.7 세포를 1, 10, 100 ㎍/ml의 PLAG 또는 DMSO (용매 대조군)으로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ng/ml의 LPS를 10, 20 및 30 분 동안 처리하고, 세포를 토끼 항-TLR4/MD2 항체 (Thermo) 및 Alexa488 컨쥬게이션된 항-토끼 IgG (Invitrogen)와 함께 인큐베이션했다. 세포를 FACSVerse flow cytometer (BD Biosciences)로 분석했고, 데이터를 FlowJo software (Tree Star, OR, USA)를 사용해 처리했다. PLAG를 100 ㎍/ml 사용하고 LPS를 10, 20 및 30분 동안 처리한 경우 (도 19의 A), PLAG를 100 ㎍/ml 사용하고 LPS를 30분 동안 처리한 경우, PLAG를 1, 10, 100 u/ml 사용하고 LPS를 30분 동안 처리한 경우의 유세포 분석 결과가 도 19에 나타난다 (도 19의 A-C).
그 결과, LPS와 PLAG가 공동 투여된 Raw264.7 세포에서 LPS 단독 투여시보다 TLR/MD2의 표면 발현이 현저히 감소되었음을 확인했다 (도 19의 A-C). 이는, LPS가 처리된 세포주에서, PLAG가 TLR의 엔도시토시스를 유도하는 것을 의미한다.
한편, TLR/MD2의 세포 내 localization을 컨포컬 이미징으로 확인하기 위해, 먼저 세포를 4% 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로 투과화 (permeabilization) 없이 세포를 고정하였다. 그 다음, 세포를 토끼 항-TLR4/MD2 항체 (Thermo) 및 Alexa88 콘쥬게이션 항-토끼 IgG (Invitrogen)와 함께 인큐베이션하고, PBS로 세척한 뒤 DAPI-함유 형광 현미경 마운팅 용액 (Invitrogen)으로 마운팅했다. 샘플을 레이저 스캐닝 컨포컬 현미경 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 분석했다.
컨포컬 이미징 결과, 30분 동안 LPS가 처리된 세포에서, PLAG는 TLR4의 엔도시토시스를 유도하는 것을 확인했다 (도 19의 D).
따라서, PLAG는 TLR4 엔도시토시스를 유도하여, LPS에 의해 촉진된 폐 염증을 완화시키고 염증을 회복시킬 수 있는 효과를 나타낸다.
<실시예 7> ALI 억제 효과에 대한 DAG의 아세틸화의 역할 확인
PLAG의 ALI 억제 효과에 있어서 다이아실글리세롤 (DAG)의 아세틸화의 역할을 알아보기 위해, ALI 마우스 모델에서 전혈 및 BALF 내 호중구 수치에 대한 PLAG 화합물 및 PLAG 유도체 화합물의 영향을 측정했다. 도 20 의 A에 기재된 것처럼, PLAG는 팔미트산, 리놀렌산 및 아세틸화된 글리세롤로 구성되어 있고, PLG는 팔미트산 (PA) 및 리놀렌산 두 개의 지방산 쇄로 구성되어 있으며, HLH는 리놀렌산 (LA)으로 구성되어 있다(도 20의 A). PLAG 유도체로서 PLG, HLH, PA, LA를 사용하였다. 마우스를 대조군, LPS 처리군, LPS/PLAG 공동 처리군, LPS/PLG 공동 처리군, LPS/HLH 공동 처리군, LPS/LA 공동 처리군, 및 LPS/PA 공동 처리군의 7개의 그룹으로 나누었다 (그룹당 n = 5). 실시예 1에 기재된 것과 같이 마우스에 LPS (25 mg/kg)를 비강내 투여하고, PLAG (250 mg/kg) 또는 각 PLAG 유도체 (250/kg)를 경구투여했다. 16 시간 후, BALF 내 호중구 세포를 카운팅했다.
그 결과, PLAG는 LPS 단독 처리군에 비해 BALF 내 호중구 양을 현저히 감소시켰으나, PLAG 유도체인 PLG, HLH, LA 및 PA는 호중구 양에 미치는 영향이 미미하거나 없었다 (도 20의 B).
상기 결과는, 다이아실글리세롤 (DAG)의 아세틸화가 PLAG의 ALI 치료 효과를 나타내는 것에 핵심적인 역할을 담당함을 보여준다.
상기 실시예들은 본 발명의 PLAG 화합물은 급성 폐손상(ALI)에서 염증 세포의 활성 산소종(ROS) 및 염증 매개 인자 등의 생산을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 호중구의 폐 이동을 현저히 저해하는 효과가 있음을 보여준다 (도 21). 따라서, 본 발명의 조성물은 급성 폐손상의 예방, 치료 및 개선에 현저한 효과를 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.
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containing monoacetyldiacylglycerol compounds
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> MIP-2 (CXCL2) 5' primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH 3' primer
<400> 42
acagtcttct gggtggcagt 20
Claims (8)
- 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤의 화합물을 유효성분으로 함유하는, 급성 폐손상 (acute lung injury; ALI)의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다. - 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 팔미토일 (palmitoyl), 올레오일 (oleoyl), 리놀레오일 (linoleoyl), 리놀레노일 (linolenoyl), 스테아로일 (stearoyl), 미리스토일 (myristoyl), 아라키도노일 (arachidonoyl)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 약학 조성물.
[화학식 2]
- 제1항에 있어서, 상기 급성 폐손상은 패혈증에 의해 유발되는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 급성 폐손상은 외상에 의해 유발되는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 폐 조직으로의 호중구 이동을 억제하는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 투여되는 것인 약학 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤의 화합물을 유효성분으로 함유하는, 급성 폐손상 (acute lung injury; ALI)의 예방 또는 개선용 건강기능식품:
[화학식 1]
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 22의 지방산기이다.
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|---|---|
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|---|---|
| KR (1) | KR20190016737A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021181279A1 (en) * | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Enzychem Lifesciences Corporation | Compositions and methods for treating covid-19 infections and/or symptoms thereof |
-
2017
- 2017-08-09 KR KR1020170101041A patent/KR20190016737A/ko not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021181279A1 (en) * | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Enzychem Lifesciences Corporation | Compositions and methods for treating covid-19 infections and/or symptoms thereof |
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| Date | Code | Title | Description |
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