KR20190007701A

KR20190007701A - 인간 타액선 줄기세포의 3차원 순차적 배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법

Info

Publication number: KR20190007701A
Application number: KR1020170089020A
Authority: KR
Inventors: 임재열; 신현수; 고원건
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2019-01-23
Also published as: KR101953978B1

Abstract

본 발명은 인간 타액선 줄기세포의 3차원 순차적 배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법 및 이를 이용한 타액선 치료의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 일차적으로 인간 타액선 줄기세포의 3차원 스페로이드 배양을 통해 기능을 강화하고, 순차적으로 3차원 오가노이드 배양을 통해 다양한 타액선 세포의 특성을 보유하는 타액선 오가노이드를 제작하는 방법에 대한 것이다. 본 발명자들은 인간 성체 타액선으로부터 단일 조직줄기세포의 분리 조건과 균질한 오가노이드가 형성되는 3차원 배양 조건을 결정하여 타액선 조직유사 오가노이드를 형성할 수 있음을 확인하였으며, 상기 오가노이드는 질환 모델링, 병리연구, 약물스크리닝, 독성평가, 유전자조작에 활용될 수 있다.

Description

인간 타액선 줄기세포의 3차원 순차적 배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법{Method for generation of salivary organoids from human salivary glandular stem cells through three-dimensional sequential culture}

본 발명은 인간 타액선 줄기세포의 3차원 순차적 배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법 및 이를 이용한 타액선 치료의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 일차적으로 인간 타액선 줄기세포의 3차원 스페로이드 배양을 통해 기능을 강화하고, 순차적으로 3차원 오가노이드 배양을 통해 다양한 타액선 세포의 특성을 보유하는 타액선 오가노이드를 제작하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있다.

첫째는 수정란으로부터 발생한 배아(배아줄기세포)로부터 얻는 것이고, 둘째는 성인이 된 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다. 상기 세포들은 만능분화능(pluripotency)를 가졌으며, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들 수 있는 자기재생(self-renewal) 능력을 갖고 있다.

성체줄기세포는 배아줄기세포 만큼 전분화능(totipotency)을 띄지는 않지만 다분화능(multipotency)을 가지고 있고, 또한 난자를 사용하지 않으므로 윤리적인 문제가 없고, 환자 본인의 세포를 추출하여 환자 개개인에 맞게 맞춤형 치료로 사용하기 때문에 면역거부반응도 없다는 점이 가장 큰 장점이다. 대표적인 성체줄기세포로 중간엽(간엽성) 줄기세포가 있으며 골수, 지방, 태반, 탯줄 등에서 분리가 가능하다. 이와 같은 줄기세포는 간엽성 (중간엽성) 조직인 뼈, 연골, 지방 분화가 가능하며 조직내 생착하여 면역조절 및 다양한 치료인자 분비를 통해 손상된 조직을 치유할 수 있다. 그러나 조직 내 생착률이 낮고 조직 내 구성세포로의 분화가 적은 단점이 있다.

다양한 분리기술을 이용하여 타액선 조직에 존재하는 조직줄기세포가 존재하고 이를 분리할 수 있음이 확인되었다. 기존에 보고된 타액선 줄기세포는 상피성 줄기세포의 특성을 보이거나 중간엽성 줄기세포의 특성을 보이는 세포가 각각 개별적으로 보고되었으나 아직까지 모든 타액선 조직세포로 분화가 가능한 타액선 줄기세포는 발견되지 않았다. 기존의 방식으로 분리해낸 줄기세포가 균질한 특성을 갖는 동일한 세포들로 보기는 어려운 반면, 본 발명자들은 단일 클론의 줄기세포 (single clonal stem cells)를 분리 배양한 고순도 줄기세포의 특성을 분석하여 상피성 세포로 분화가 가능함과 동시에 중간엽성 세포로도 분화가 가능하고 상피성 줄기세포 표지자(LGR5)와 중간엽성 줄기세포 표지자(CD90)를 동시에 발현하는 다분화능 타액선 조직줄기세포가 존재하며 이를 분리 배양할 수 있음을 보고하였다 (Scientific Report, 2016 Nov 8;6:36303).

유사장기 (오가노이드, organoid) 형성은 대표적으로 장 조직줄기세포 (intestinal stem cells)인 LGR5+ 단일 줄기세포에서 촉진인자를 이용하여 제작하는 방식이 대표적이나 아직까지 타액선 오가노이드 제작이 가능한 단일 성체줄기세포가 분리되지 못하였다. 따라서 타액선 오가노이드를 제작하기 위해서 타액선 상피성 줄기세포와 타액선 중간엽 줄기세포의 공배양, 타액선 도관 스케폴드 또는 태아 타액선상피세포와 세포간엽 (mesenchyme)의 혼합배양, 성체 중간엽줄기세포와 타액선세포의 공배양을 포함하는 세포 혼합배양 방식이 주로 사용되어 왔는데, 이러한 타액선세포 혼합배양 방식은 분리된 세포가 균등하지 않은 혼합세포의 형태를 공배양하게 되어 순도가 낮으며 오가노이드 형태가 불규칙하고 대량 배양이 불가능하다는 문제가 있다. 따라서, 보다 균등하게 대량 수득이 가능하며, 타액선 조직의 특성이 강화된 단일 성체 조직줄기세포를 이용하는 방법이 요구되고 있다.

한편, 타액선은 내배엽성 선세포와 중배엽성 상피세포 및 간질 조직으로 구성되어 있으며 선세포 - 개재도관세포 - 줄무늬관세포 - 분비관세포와 근상피세포로 구성되어 있다. 따라서 하나의 성체 세포로 타액선 조직을 재생할 수 없으며 타액선 조직의 복잡성을 그대로 재생하기 위해서는 다상분화를 유도할 수 있는 줄기세포치료제가 필요할 뿐만 아니라 단순 세포치료제 개념보다는 기능이 우수한 기능조절 줄기세포치료기술이 유용할 수 있다. 특히, 조직 손상이 광범위한 만성 타액선 기능저하 질환의 기능회복을 위해서는 줄기세포의 단일 이식 전략보다는 기능이 강화된 줄기세포의 이식을 통해 내재 줄기세포 증식 및 분화 증대, 치료인자 분비 촉진을 통한 미세환경 제어기술 개발이 새로운 해결방안이 될 수 있다. 방사선에 의한 조직손상으로 인한 타액 분비 감소의 경우 타액선 조직 내 줄기세포 고갈로 인한 조직 재생 및 회복력의 감소가 영구적 손상의 주된 기전으로 알려져 있으며, 따라서 근본적 치료를 위해서는 손상된 조직을 재건 및 대체 (내재세포로의 분화 유도 및 치료적 인자 분비를 통한 세포, 조직 재생)할 수 있는 조직 복원 기술 개발이 필요하다.

또한, 새로운 치료약물을 발굴 및 개발하기 위해서는 생체를 모사할 수 있으며 질환의 특성을 잘 나타내는 모델 개발이 필수적이다. 현재까지 가장 정확하고 신뢰할 수 있는 생물학적 분석은 동물을 이용한 실험이며 동물을 이용한 분석이 독성학이나 신약 스크리닝과 같은 생물학적 분석 분야에서 높은 정확도의 장점을 가지나 여러 단점도 가지고 있다. 현재 실험실에서 쓰이고 있는 일차배양 세포모델의 경우 해당 장기 또는 조직에서 유래한 세포를 인공적으로 불멸화(immortalized) 시키거나 2차원적으로 평면배양하면서 후보물질의 효능 및 독성을 검증하게 된다. 하지만 2차원적으로 인공적으로 배양되는 세포들은 조직에서 분리된 후 배양되는 과정에서 본래 세포 형태의 변화뿐만 아니라 조직 단위의 세포 기능을 일부 상실하게 되며 아울러 세포외환경(ECM, microenvironment) 과의 연결이 단절되어 실제 생체에서 나타나는 현상을 반영하지 못하는 치명적인 단점이 있다. 뿐만 아니라 인간 세포가 아닌 경우 종간 차이로 인해 약물의 작용 및 기전이 인간과 동일하지 않은 경우가 많아 이로 인해 효율적인 약물개발의 발전이 저해가 되고 시간과 비용 또한 많이 소요가 된다. 이를 해결하기 위한 수단으로 최근 환자 유래 유사 장기를 제작하여 질환 모델링, 병리연구, 약물스크리닝, 독성평가, 유전자조작에 활용하는 방법으로써 줄기세포 오가노이드 제작 기술 개발이 관심을 받고 있다.

미국공개특허 US 2015/0284689 (2015.10.08 공개)

본 발명의 목적은 인간 타액선 줄기세포의 3차원 순차적 배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법에 관한 것으로, 상세하게는 인간 타액선에서 채취한 조직 샘플에서 분리한 단일 클론 성체줄기세포 중에서 상피성 줄기세포(epithelial stem cells)와 중간엽성 줄기세포(mesenchymal stem cells)의 특성을 모두 보유한 타액선 조직줄기세포를 분리하여, 일차적으로 3차원 스페로이드 배양을 통해 기능을 강화하고, 순차적으로 3차원 오가노이드 배양을 통해 다양한 타액선 세포의 특성을 보유하는 타액선 오가노이드를 제작하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 선 조직으로부터 선줄기세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 선줄기세포를 3차원 스페로이드 배양하여 3차원 스페로이드를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 형성된 3차원 스페로이드로부터 오가노이드(organoid) 형성을 유도하는 배양 단계를 포함하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법을 제공한다.

도 1은 타액선 조직에서 분리한 단일 성체조직줄기세포의 줄기세포 기능 검증을 위한 자가증식능, 분화능에 관한 염색 결과와 PCR, CFU (Colony-forming unit), FACS 분석 결과를 나타낸다. 분리된 타액선 줄기세포는 자가증식능, 분화능 뿐만 아니라 줄기세포의 마커가 증가되어 있음을 PCR과 FACS 분석을 확인하였다.
도 2는 타액선 조직에서 분리된 단일 성체조직줄기세포를 3차원 스페로이드 배양 (floating 플로팅, Matrigel 마트리젤, 마이크로웰 나노스케폴드)에서 배양하였을 때 스페로이드 형성하는 것을 현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 플로팅, 마트리젤, 마이크로웰 나노스케폴드에 따라 세포의 증식을 Live/Dead와 viability로 확인한 결과를 나타낸다. 3차원 스페로이드 배양했을 때 생체재료에 따라 스페로이드의 크기나 개수가 다르게 형성되는 것을 알 수 있었고, 뿐만 아니라 이러한 스페로이드가 형성될 때 생체재료가 스페로이드 증식에 크게 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
도 3은 타액선 조직에서 분리된 성체 조직줄기세포를 3차원 스페로이드 배양 에서 스페로이드 배양액 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)을 사용하여 배양한 후에 줄기세포 및 타액선 세포의 마커 발현 변화를 PCR 신호로 분석 결과를 나타낸다. 3차원 스페로이드 배양을 했을 때 줄기세포의 마커는 시간이 지날수록 증가됨을 확인할 수 있고, 반면 타액선세포의 마커는 감소하는 것을 확인하였다.
도 4 및 도 5는 타액선 조직에서 분리된 성체 조직줄기세포를 3차원 스페로이드 배양에서 (1) 줄기세포 스페로이드 배양액을 이용하여 3일간 배양했을 때 (PRE)와 (2) 3일 후에 오가노이드 형성을 위한 오가노이드 배양액 (Serum-free hepato-STIM medium, 5 μg EGF, 2mM L-glutamine, 1% penicillin/streptomycin)로 스위치하여 배양했을 때 (POST) 줄기세포 및 상피세포의 마커 차이를 PCR 신호와 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 스페로이드 배양 (PRE) 후에 오가노이드 배양 (POST) 했을 때 시간이 지날수록 줄기세포의 마커는 감소하고, 타액선세포의 마커는 증가하는 것을 PCR과 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
도 6은 타액선 조직에서 분리된 단일 성체줄기세포를 3차원 스페로이드 배양 3일 후에 오가노이드 배양 배지 (Hepato-STIM)로 배양했을 때 형성된 타액선 오가노이드의 기능을 아밀레이즈 활성과 세포내 칼슘을 측정 후 분석한 결과를 나타낸다. 스페로이드 배양 (PRE) 후에 오가노이드 배양 (POST) 했을 때 증가하는 것을 아밀레이즈 활성과 세포내 칼슘이 증가되는 것을 확인하였다.
도 7은 인간 타액선 줄기세포의 3차원 순차적 배양을 통한 타액선 오가노이드 형성 방법에 대한 모식도를 나타낸다.

본 발명은 (1) 선 조직으로부터 선줄기세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 선줄기세포를 3차원 스페로이드 배양하여 3차원 스페로이드를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 형성된 3차원 스페로이드로부터 오가노이드(organoid) 형성을 유도하는 배양 단계를 포함하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 (1) 단계는 층 분리 배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 단계 또는 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드 배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 단계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 분리된 선줄기세포는 상피성 줄기세포 마커인 LGR5 및 중간엽성 줄기세포 마커인 CD90를 발현하는 단일 클론 선줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 분리된 선줄기세포는 자가복제능을 가지며, 연골세포, 지방세포, 골세포, 선세포 또는 간세포로의 분화가 가능한 다분화능 줄기세포일 수 있다.

보다 바람직하게는, 인간 타액선 조직을 용해하여 단일 클론 줄기세포주를 얻는 방법으로 순차적인 상층액 배양시 형성되는 단일 클론을 분리하여 개별적으로 배양하거나 마이크로패턴화 된 마이크로웰 나노스케폴드에 분리배양되는 작은 세포군집을 개별적으로 분리하여 수득하는 것이 단일 클론 줄기세포주 분리 배양에 적합할 수 있다.

본 발명에 의해 분리된 타액선 단일 클론 줄기세포는 다양한 특성을 가지게 되는데, 이 중 유세포 분리방법을 통해 상피성 줄기세포 마커인 LGR5와 중간엽성 줄기세포 마커인 CD90을 모두 발현하는 세포주를 선별하는데 이러한 방법이 기능이 우수한 균질한 타액선 줄기세포 분리에 가장 효과적인 바, 본 발명의 방법이 타액선 줄기세포 분리 배양에 적합한 것이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 선 조직은 타액선, 간, 췌장, 신장과 같이 발생 기원이 유사한 선 장기 중 선택되는 1종일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 분리 배양에 사용할 수 있는 타액선 조직은 주 타액선인 이하선, 악하선, 설하선에서 단일클론 분리배양방식으로 배양한 세포주 중 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간 이하선을 사용하여 분리 배양한 타액선줄기세포를 사용하였다.

바람직하게는, 상기 (2) 단계의 3차원 스페로이드 배양은 세포 클러스터 형성이 가능한 세포외기질 (extracellular matrix, Matrigel)을 이용한 배양방식, 세포의 부착을 방지하여 세포가 배양액에 부유하며 응집하는 부유 배양방식(floating culture), 마이크로패턴화된 나노섬유 스케폴드에 세포 클러스터를 형성하는 배양방식을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 바닥은 나노섬유 마이크로 영역으로 제한은 없으나, Polycaprolactone(PCL), polylactic-co-glycolic acid (PLGA), Polylactic acid (PLA) 등으로 이루어질 수 있고, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드의 벽은 하이드로젤 마이크로 영역으로 제한은 없으나, Polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid (HA), alginate 등으로 이루어질 수 있다.

상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 스페로이드가 형성되는 나노섬유 기반의 마이크로 영역과 세포의 부착이 일어나지 않는 하이드로젤 기반의 마이크로 영역으로 구성된 스케폴드로서, 정사각형 마이크로패턴의 크기는 100 ~ 500 μm인 것을 특징으로 하며 가장 바람직하게는 200 μm이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 형성된 3차원 스페로이드는 줄기세포성 마커인 CD24, CD29, CD90, LGR5, Nanog, OCT4 및 SOX2의 발현이 증가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명에서 3차원 스페로이드 배양은 줄기세포 배양액 (DMEM)을 사용하나, 3차원 오가노이드 배양방식은 세포의 분화를 유도하는 Hepato-STIM 배양액으로 전환하여 타액선 오가노이드 생성을 유도한다. 타액선 조직줄기세포의 기능 강화를 통한 전 처치 (priming) 형성 조건으로 3일간 DMEM 배양액으로 스페로이드 형성을 유도함으로써 이룰 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 (2) 단계의 3차원 스페로이드 배양은 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지 배양액에서 3 내지 5일 동안 배양하고, 상기 (3) 단계의 오가노이드 형성을 유도하는 배양은 5 ㎍ EGF, 2mM L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 Hepato-STIM 배지 배양액에서 3 내지 5일 동안 순차적으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 선 오가노이드는 아밀레이즈 활성 및 세포 내 칼슘의 농도가 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

“타액(saliva)”은 이하선, 악하선, 설하선 및 구강점막에 존재하는 점액선 등으로부터 분비되는 혼합액이다. 타액은 인체의 핵심 성분으로 타액선에서 생성되어 구강 내로 배출된다. 타액은 인체의 필수 성분으로서, 생체활성단백질, 소화효소, 점액, 면역글로불린, 각종 염류 등이 포함되어 있다.

타액은 구강 내 건강뿐만 아니라 인체의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 수행한다. 예를 들어 타액의 주요 성분인 뮤신(mucin), 면역글로불린 등은 외부의 감염으로부터 1차적인 방어 역할을 수행하며, 구강 및 치아의 윤활 및 수분 유지, pH 중화 기능을 통하여 구강점막 및 치아를 보호한다. 뿐만 아니라 타액에는 프티알린(ptyalin) 등의 아밀라아제(amylase)와 같은 소화 효소들이 있어 전분을 말토오스 단위까지 분해하는 등 소화를 촉진시키는 기능을 담당한다. 또한 타액의 분비에 의하여 인체의 수분대사 및 체온 조절이 이루어질 수 있으며, 유독물(I, Hg, Pb 등)을 배설하기도 한다.

“타액선(침샘, salivary gland)”은 타액을 생성, 분비하는 기관으로 이하선(귀밑샘, parotid gland), 악하선(턱밑샘, submaxillary gland), 설하선(혀밑샘, sublingual gland)과 같은 주타액선(major salivary gland)과, 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막(mucous membrane of oral cavity)에 존재하는 점액선(mucous gland)과 같이 구강점막의 여러 부위에 분포하는 소타액선(minor salivary gland)으로 분류된다.

본 발명에 있어서, "스페로이드(spheroid)"란 3차 조직배양을 통하여 만들어지는 작은‘구’체로서, 스페로이드는 일종의 작은‘조직’으로서, 외부와 내부가 구분되어 기능이 나뉘기도 하며, 조직의 기능적 단위를 모사하는 형태를 띤다. 스페로이드 배양은 동물이나 인체 조직이 가지고 있는 고유 형태나 성질이 비슷할 뿐만 아니라, 이를 적용하여 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 개발되고 있다.

본 발명에 있어서, "오가노이드(organoid)"란 조직에서나 혹은 배아줄기세포에서 유래된 세포를 이용하여 이를 3D 형태로 배양을 하여 마치 인공장기와 같은 형태로 만들 수 있는 것을 의미한다. 오가노이드는 장기의 ‘organ’과 같은 의미를 가진 접미어로 ‘장기와 유사한 것’이라는 말을 지니고 있다. 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통하여 세포와 세포의 기능이 좀 더 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 기능을 지닌다. 오가노이드는 줄기세포연구와 3D 세포배양 등이 개발되고, 다양한 조직으로 분화시킬 수 있는 생장 및 분화 인자의 최적화 연구와 함께 주목을 받고 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 사람 선줄기세포 분리 및 배양

1. 사람 타액선 줄기세포의 분리 및 배양

타액선 조직을 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 잘게 자른 조직을 콜라게나아제 타입 1 용액에 넣어 37 ℃, 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 시킨 조직을 80 ㎛의 조직 거름망 (Cell Strainers)을 이용하여 조직을 걸러낸 뒤, 상층액만 모아서 원심분리기 1500rpm, 5분간 돌려준다. 원심분리 후에 상층액은 제거하고 세포를 분리하였다(도 1).

(1) 층 분리 및 배양

인체 타액선 조직에서 분리한 세포가 포함된 배양액을 세포배양 플레이트(D1)에 뿌려준 뒤 2시간 마다 바닥에 붙은 세포를 제외한 상층액만 조심스럽게 걷어서 새 플레이트에 뿌려주고 이전 플레이트에는 새로운 배양액을 뿌려주는 과정을 반복하여 총 5개의 플레이트를 만들어 배양한다. 플레이트에 붙은 세포들이 각각의 콜로니를 형성하게 되면 클로닝 실린더와 0.05% trypsin/EDTA를 사용하여 콜로니를 분리하여 세포를 DMEM 배양액 (Dulbecco Modified Eagle Medium-DMEM, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin)에서 대량으로 배양한다.

(2) 마이크로웰 나노스케폴드 분리 및 배양

가로, 세로 18mm 크기에 간격이 200㎛인 마이크로웰 나노 스케폴드를 70% 에탄올과 배양액에 순차적으로 담궈 소독을 하고 세포배양 플레이트에 놓은 뒤, 그 위에 인체 타액선 조직에서 분리한 세포가 포함된 배양액 500㎕을 뿌린다. 일주일간 배양하고 현미경상으로 관찰하여 스페로이드를 형성한 나노 스케폴드만을 선택하고 0.05% trypsin/EDTA를 사용하여 스페로이드를 형성한 세포를 분리하여 세포배양 플레이트에 뿌려 DMEM 배양액 (Dulbecco Modified Eagle Medium-DMEM, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin)에서 대량으로 배양한다.

2. 줄기세포의 자가복제능 , 분화능 분석

층분리 배양 방식이나 마이크로웰 나노스케폴드에서 단일 클론 형태로 분리 배양한 타액선 조직줄기세포를 자기복제능, 중간엽 세포(지방, 골, 연골세포) 및 선세포 (간세포, 타액선 선세포)로 분화하는 실험을 통해 분화능 분석을 실시하였다(도 1).

(1) 연골세포분화: 우태혈청이 포함되지 않은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 2×10⁵개의 세포수로 15 mL polypropylene tube에 넣은 후 원심 분리하여 펠렛을 얻었으며 6주간 분화 배양하였다. 연골세포 분화배지는 10 ng/mL TGF-3, dexamethasone, 50 g/mL ascorbicacid, 40 g/mL proline, 100 g/mL pyruvate (Sigma) 그리고 50 mg/mL ITS+ Premix (BectonDickinson)를 포함하는 αMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 분화된 연골세포는 7㎛로 동결섹션을 하여 Safranin O 용액으로 염색하여 연골세포로의 분화를 관찰하였다(도 1).

(2) 지방세포분화: 중간엽 줄기세포 1×10⁵ 개를 12 well plate에 분주하여 하루 동안 배양한 후 1 ml의 지방분화유도배지는 10% FBS, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX, 200 μl indomethacin를 포함하는 DMEM에서 7일간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 고정 및 세척 후 Oil Red O (Sigma) 용액으로 세포를 염색하였으며 광학 현미경하에서 지질적화 형성을 관찰하였다(도 1).

(3) 골세포 분화: 중간엽 줄기세포 1×10⁵ 개를 12 well plate에 분주하여 하루동안 배양 한 후 1 ml의 골분화유도배지는 10% FBS, 0.1 uM dexamethasone, 10 mM β-glycerophosphate, 0.5 mM ascorbate-2-phosphate를 포함하는 α-MEM에서 2주간 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 고정 및 세척 후 Alizarin Red S (Sigma) 용액으로 세포를 염색하였으며 광학 현미경하에서 석회화 결절 형성을 관찰하였다(도 1).

(4) 선세포분화: 선줄기세포를 1×10⁵ 개를 마트리젤로 코팅한 6 well plate에 분주하여 Hepato-STIMs 배지에서 배양한다. 분화 배지 (Hepato-STIMs, 2mM L-glutamine, 1% PS, 20ng/ml EGF)에서 3 일간 분화를 유도함으로써, 타액선 상피세포의 특징을 관찰하였다(도 1).

(5) 간세포분화: 줄기세포를 30 ㎜ dish에 ㎜² 당 5×10⁴ 세포로 seeding하고 세포가 85% 이상 자라면 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) 배지로 교환한 후 48시간 배양한다. 분화 배지 (DMEM, 40% MCDB201, 2% FBS, 1X PS, 20ng/ml HGF, 10ng/ml FGF)에서 7일 혹은 14일간 분화를 유도함으로써, 간세포의 형태와 유사한 입방(cuboidal) 형태의 세포로 분화 및 성숙을 광학 현미경 하에서 관찰하였다(도 1).

3. 유세포 분석(Flow cytometry ) 및 분리

분리된 세포를 확인하기 위해 fluorescence-activated cell sorting (FACS)을 시행하였다. 분리 배양된 선줄기세포를 0.05% trypsin/EDTA로 처리한 후 각각 1×104 씩 분주하고, FACS buffer (1% 우태 혈청과 0.05% sodium azide가 포함된 PBS)로 부유한 다음 anti-CD29, anti-CD73, anti-CD90, anti-CD105, anti-OCT4, anti-LGR5, anti-CD45와 anti-HLA-DR (BD Biosciences)를 2 μL씩 넣어 30분간 4℃에서 염색하였다. 이 후, 염색된 세포를 FACS buffer 500 μL에 부유하여 FACS analysis (BD FACSverse flow cytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 수행하였고, BD FACSuite software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 이후 LGR5와 CD90의 발현이 확인된 세포들에 대하여 유세포 분리기 (BD Aria Ⅱ)를 통해 LGR5와 CD90을 동시에 발현하는 순수한 타액선 줄기세포를 분리하였다(도 1).

4. 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

Real-time PCR을 위해서 수거된 세포를 세포 용해 용액(Trizol solution)을 처리한 후 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml 을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm 으로 15분간 4℃에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4℃에서 10분 동안 방치 후 다시 원심 분리하였다. 상층액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃, 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다.

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다(도 2). 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열은 표 1과 같다.

α-Amylase (AMY1A)	F	AATTGATCTGGGTGGTGAGC
α-Amylase (AMY1A)	R	CTTATTTGGCGCCATCGATG
Aquaporin 5 (AQP5)	F	ACTGGGTTTTCTGGGTAGGG
Aquaporin 5 (AQP5)	R	GTGGTCAGCTCCATGGTCTT
CK7 (KRT7)	F	CAGGATGTGGTGGAGGAC
CK7 (KRT7)	R	AACTTGGCACGCTGGTTCT
CK18 (KRT18)	F	GGAGGCTGGAGAGCAAAATC
CK18 (KRT18)	R	AGTCATCAGCAGCAAGACGG
CK5 (KRT5)	F	TTTGGCCGAGGGATAGAAGT
CK5 (KRT5)	R	TATTGCCATCTCTTGCTGCC
LGR5	F	TGGAGAGCAACGAGAGGG AG
LGR5	R	CGTGAGCGTCTCGATCTTGG
HSA	F	CGCATTGCCACATACACTCT
HSA	R	TTGGCTGAGGATGGTGTA AG
OCT4 (POU5F1)	F	AAGCGATCAAGCAGCGACTA
OCT4 (POU5F1)	R	GAAGTGAGGGCTCCCATAGC
SOX2	F	CAACATGATGGAGACGGAGC
SOX2	R	GTGCATCTTGGGGTTCTCCT
Nanog	F	CAGAAAAACAACTGGCCGAA
Nanog	R	GGCCTGATTGTTCCAGGATT
CD90 (Thy1)	F	GACAGCCTGAGAGGGTCTTG
CD90 (Thy1)	R	CCCAGTGAAGATGCAGGTTT
BMI	F	TACAGGGCGGCCACAAGTTTT
BMI	R	ATGGAGAGCAAAGCCCTGCTC

< 실시예 2> 조직에서 분리된 타액선 줄기세포의 스페로이드 배양( 플로팅 , 마트리젤 , 마이크로웰 나노스케폴드 ) 후 줄기세포와 타액선세포 마커 분석

1. 사람 타액선 줄기세포의 3차원 스페로이드 배양

사람 선줄기세포를 다양한 스페로이드 배양 방식 (플로팅, 마트리젤, 마이크로웰 나노스케폴드)을 이용하여 스페로이드 배양액 (Dulbecco Modified Eagle Medium-DMEM, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin)에서 배양 후 광학현미경(microscopy) 및 LIVE/DEAD kit를 이용하여 스페로이드를 관찰하였다. Calcein AM (calcein acetoxymethyl ester)과 ethidium homodimer-1 사용하여 형광 현미경을 통해 줄기세포의 스페로이드 생성 유도시 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였다. 스페로이드 배양액에서 다양한 생체재료를 이용하여 배양한 결과, 스페로이드가 형성되었음을 확인하였다. LIVE/DEAD 염색법을 통해 이미지를 확인한 결과, 스페로이드가 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다(도 2).

2. 사람 타액선 줄기세포를 3차원 스페로이드 배양 후 줄기세포와 상피세포의 특성 분석

사람 타액선 줄기세포를 다양한 스페로이드 배양방식 (플로팅, 마트리젤, 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드)을 이용하여 스페로이드 배양액 (Dulbecco Modified Eagle Medium-DMEM, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin)에서 배양 후 줄기세포와 타액선 세포의 특성을 Real-time PCR을 통해 분석을 실시하였다.

3차원 스페로이드 배양을 통해 CD24, CD29, CD90, LGR5, Nanog, OCT4, SOX2등 줄기세포 마커 발현이 의미있게 증가하고, 타액선 세포의 마커는 유의적으로 감소함을 Real-time PCR으로 확인하였다(도 3).

< 실시예 3> 3차원 스페로이드 배양 후 순차적오가노이드 배양을 통해 타액선 줄기세포의 줄기세포와 타액선 세포의 특성 변화 분석

1. 순차적으로 오가노이드 배양을 통한 선줄기세포의 줄기세포 특성 변화 분석

사람 타액선 줄기세포를 스페로이드 배양방식 (플로팅, 마트리젤, 마이크로나노스케폴드)을 이용하여 1. 스페로이드 배양액 (Dulbecco Modified Eagle Medium-DMEM, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin)에서 3일간 배양(PRE)한 후, 2. 오가노이드 배양액 (Serum-free hepato-STIM medium, 5 μg EGF, 2mM L-glutamine, 1% penicillin/streptomycin)으로 배양했을 때 (POST) 줄기세포 및 상피세포의 마커 차이를 PCR 신호와 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. PRE 상태일 때 줄기세포 마커가 증가하였고 타액선 마커는 감소하였다. 반대로 오가노이드 형성을 유도한 POST 상태일 때는 줄기세포 마커가 PRE에 비해 감소하였고, 타액선세포 마커는 증가하는 것을 Real-time PCR, western blotting으로 확인하였다(도 4 및 도 5).

2. 실시간 PCR을 이용한 mRNA 발현 분석

RNA 1㎕에 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR (real-time PCR)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응 당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 10 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다(도 4). 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열은 표 1과 같다.

3. 웨스턴 블랏 분석을 통한 줄기세포 마커 확인

먼저, 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 전자염색 (electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분 동안 차단시키고, 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다: α-amylase, AQP5, ZO-1, CK7, CK18 and β-actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); E-cadherin (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA); anti-CD90, anti-LGR5, anti-Nanog, anti-Krt5, anti-OCT4, anti-SOX2 (Abcam, Cambridge, UK), PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출 (Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다(도 5).

4. 오가노이드의 기능 평가: α-amylase 활성 측정

오가노이드 배양 3 ~ 5일 후 오가노이드의 기능을 측정하기 위해서 아밀레이즈 활성도를 측정하였다. 3차원 오가노이드에 방사선을 조사하여 배양한 오가노이드의 배양액을 모아서 α-amylase activity assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 아밀레이즈 활성도를 측정하였다. 생체재료를 이용하여 순차적인 배양 방법을 실시하였을 때, 오가노이드는 아밀레이즈의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 6).

5. 오가노이드의 기능 평가: 세포 내 pH 측정

오가노이드의 기능을 측정하기 위해서 오가노이드에서 세포 내 pH을 BCECF-AM (Molecular Probe, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 형성된 오가노이드에 BCECF-AM를 넣고 37℃에서 1시간 동안 염색하였다. 염색된 오가노이드에 HCO3-가 들어있지 않는 버퍼를 넣어주고 형광 현미경을 이용하여 형광값을 측정하고, HCO3-가 들어있는 버퍼를 넣어준 형광값을 측정하였다. 생체재료를 이용하여 순차적인 배양 방법을 실시하였을 때 세포 내 pH가 달라지는 것을 확인하였다(도 6).

6. 오가노이드의 기능 평가: 세포 내 칼슘 측정

오가노이드의 기능을 측정하기 위해서 오가노이드에서 세포 내 칼슘을 Fluo-4AM (Molecular Probe, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 형성된 오가노이드에 Fluo-4AM를 넣고 37℃에서 1시간 동안 염색한 후 칼슘 indicator ATP (adenosine triphosphate, 100 μM), TG (thapsigargin, 1 μM) and CChol (Carbachol, 10 μM) (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 넣어서 라이브하게 형광현미경으로 형광값을 측정하였다. 생체재료를 이용하여 순차적인 배양 방법을 실시하였을 때 칼슘 분비가 증가하는 것을 확인하였다(도 6).

Claims

(1) 선 조직으로부터 선줄기세포를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 선줄기세포를 3차원 스페로이드 배양하여 3차원 스페로이드를 형성하는 단계; 및
(3) 상기 형성된 3차원 스페로이드로부터 오가노이드(organoid) 형성을 유도하는 배양 단계를 포함하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계는 층 분리 배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 단계 또는 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드 배양을 통해 선줄기세포를 분리하는 단계인 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제2항에 있어서, 상기 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드는 100 내지 500 ㎛의 정사각형 형태의 3차원 배양용 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 선 조직은 타액선, 췌장, 신장 및 간으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 조직인 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 선줄기세포는 상피성 줄기세포 마커인 LGR5 및 중간엽성 줄기세포 마커인 CD90를 발현하는 단일 클론 선줄기세포인 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 선줄기세포는 자가복제능을 가지며, 연골세포, 지방세포, 골세포, 선세포 또는 간세포 분화능을 가지는 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 3차원 스페로이드 배양은 부유 배양(floating culture), 세포외기질(extracellular matrix; Matrigel)을 이용한 배양 또는 마이크로패턴화 된 나노섬유 스케폴드 배양인 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 형성된 3차원 스페로이드는 줄기세포성 마커인 CD24, CD29, CD90, LGR5, Nanog, OCT4 및 SOX2의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 3차원 스페로이드 배양은 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지 배양액에서 3 내지 5일 동안 배양하고, 상기 (3) 단계의 오가노이드 형성을 유도하는 배양은 5 ㎍ EGF, 2mM L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 Hepato-STIM 배지 배양액에서 3 내지 5일 동안 순차적으로 배양하는 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.
제1항에 있어서, 상기 선 오가노이드는 아밀레이즈 활성 및 세포 내 칼슘의 농도가 증가하는 것을 특징으로 하는 선 줄기세포의 순차적 배양을 통한 선 오가노이드 형성 방법.