KR20190007040A - 간엽 줄기 세포 및 근육 손상 및 근육-관련된 질환의 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

간엽 줄기 세포 및 근육 손상 및 근육-관련된 질환의 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

간엽 줄기 세포 표현형 및 근육 세포 표현형을 지닌, 혼합된 특성의 단리된 세포 뿐만 아니라, 이로부터 분비된 세포외 소포, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이를 투여함을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 또한, 이를 공-투여함으로써 외부 세포의 생착을 증가시키는 방법이 제공된다.

Description

간엽 줄기 세포 및 근육 손상 및 근육-관련된 질환의 치료를 위한 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조　
본원은 2016년 5월 16 일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/336,858호의 우선권의 이점을 청구하며, 이들의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 간엽 줄기 세포(MSC)의 근육으로의 분화, 및 근육 및 운동 뉴런 질환의 치료의 분야에 관한 것이다.
발명의 배경
간엽 줄기 세포(MSC)는 자가조직 골수, 치수(dental pulp), 또는 지방 조직으로부터 또는 동종이계 양수, 태반 및 탯줄로부터 수득될 수 있는 중배엽-유래된 기질 세포의 불균질 모집단이다. 이들 마지막 3 개의 공급원으로부터의 MSC는 비-면역원성이므로, 이들은 재고 세포로서 사용될 수 있다. 최근 리포트는 이들 세포가 연골, 뼈 및 지방 세포로 분화하는 그것의 천연 능력 외에, 간세포, 근육, 내피, 뉴런의, 및 인슐린-생산 세포를 포함하는, 다른 세포 유형으로 트랜스-분화되는 잠재능을 또한 가지고 있음을 실증하여 왔다.
MSC는 실험적 동물 모델에서 및 더욱 최근에 파일럿트 임상시험에서 여러 가지의 질환 및 기능이상 시 치료학적 효과를 발휘함이 밝혀졌다(Gao 등, 2015, International Journal of Cardiology, 168: 3191-3199; Zhang 등, 2013, Journal of neuroinflammation, 10:106). 이들 세포는 염증 및 손상의 부위로 이주하고 여기에 이식되어 상주하는 조직 내에서 국소 효과를 발휘하는 수용력을 가진다. 성인 MSC는 비-면역원성임이 보고되었으며, 이는 면역억제가 동종이계 숙주내로 그것의 이식을 위해 요구되지 않음을 나타낸다.
연구는 MSC가 면역억제성 및 면역조절 특성을 가짐을 밝혀 왔다. MSC의 유익한 효과는 이러한 면역조절 활성 및 영양 인자의 분비에 주로 기인한다. 사실상, MSC는 아주 다양한 생물활성 분자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인 및 케모카인을 분비하며 다중 조직에 대해 영양성 지지체를 제공할 수 있다. 또한, 최근 연구는 MSC가 세포간 통신의 일부로서 다양한 단백질 외에 RNA 및 DNA 분자를 전달하는 세포외 소포를 분비함을 실증하였다.
최근 연구는 MSC가 또한 근육 세포로 분화할 수 있고 이들 세포의 근육생성 분화가 갯과 및 마우스 뒤센트 근이영양증(Deschene's Muscular Dystrophy: DMD) 동물 모델 둘 다에서 그것의 치료 효과를 증가시킬 수 있음을 실증하였다(Liu 등, 2007, Stem Cells and Development, 16(5):695-706; Goudenege 등, 2009, Molecular Therapy, 17(6):1064-72). 따라서, 근육 재생 관여된 주요 세포인 MSC-유래된 위성 세포(SC), 또는 근육 세포 자체의 사용은 모터 및 주변 뉴런 질환 외에 DMD, 근육 손상, 악액질 및 에이징을 포함하는 다양한 근육 퇴화 장애에서 세포 대체 요법에 대한 자가조직 또는 동종이계 세포의 쉽게 접근가능한 공급원으로서 큰 잠재능을 갖는다.
또한, 근아세포를 사용한 치료가 허혈성 사지 손상의 치료 및 운동 뉴런 손상 및 퇴행의 질환에서 또한 이용될 수 있다. 운동 뉴런 질환(MND)은 운동 뉴런의 퇴행 및 사망이 일어나는 진행성 신경적 장애의 그룹이다. 근육 질환과 유사하게, 이들 질환은 점진적인 근육 약화 및 허약, 조절되지 않는 잡아당기기 및 결국 자발적인 운동 제어의 손실을 특징으로 한다. 운동 뉴런은 신경이 통하는 골격 근육에 의해 분비된 표적-유래 인자에서 그것의 생존에 대해 의존적이다. 따라서, 근아세포의 투여는 손상된, 다친 또는 축퇴된 운동 뉴런의 생존을 지지하는 생리적 접근법을 제공한다.
근육 이영양증, 및 근육 및 운동 뉴런 장애는 일반적으로, 유전적 장애가 바디내 모든 근육/운동 뉴런에 영향을 주기 때문에, 치료하기가 매우 어렵다. 추가로, 골격 근육은 후 유사분열 핵을 지닌 큰 다핵화된 섬유로 구성되므로, 임의의 치료는 수백만 세포의 표적화를 필요로 할 수 있다. 그러나, 이전의 연구 뿐만 아니라 본 발명자들의 현 기술은 MSC가 염증 반응을 감소시키고, 혈관신생 및 폐지하는 섬유증을 증가시키며, SC의 증식을 향상시키고 근아세포 및 SC로 분화하도록 유도될 수 있음을 입증한다. 이런 식으로 MSC 치료는 이론적으로 주변분비 효과를 통한 및 분화된 세포를 사용하는 대체 요법에 의한 조직 둘 다에 영향을 미치는 상보적인 방식으로 퇴행성 염증성 장애, 손상, 악액질 및 에이징과 관련된 다양한 장애 및 상태를 표적화할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 혼합된 특성의 단리된 세포, 이에 의해 분비된 엑소좀, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이들 세포, 엑소좀 또는 조성물을 투여함을 포함하여 근육-관련된 질환 및 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 이들 세포와 동시-투여하는 단계를 포함하여, 외부 세포의 생착을 증가시키는 방법을 제공한다.
제1 양태에 따라서, 혼합된 특성의 단리된 세포가 제공되며, 여기서 상기 세포는 간엽 줄기 세포(MSC) 표현형 및 근육 세포 표현형을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면,상기 MSC 표현형은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 발현 마커를 포함한다: CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44 발현 및, MHCII 발현의 부재. 일부 구현예에 따르면, 상기 MSC 표현형은 면역억제 능력을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 MSC 표현형은 항-염증 능력을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 MSC 표현형은 염증, 손상 또는 질환의 부위로 귀결되는 능력(ability to home)을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 근육 세포 표현형은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 발현 마커를 포함한다: MyoD, Myf6, Myf5, MRF4, ITGA7, 오스테오프로테그린, 이리신, 디스트로핀, 미오신 중쇄, 미오게닌, PAX7, TALNEC2, C-MET, G-CSF, 오스테오프로테그린, IL-10, 및 MEF2A 발현 및 오스테오칼라신의 부재, PPARG3, 및 COL2A1 발현. 일부 구현예에 따르면, 상기 근육 세포 표현형은 근육 신시티움(syncytium)과 병합하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 근육 세포 표현형은 위성 세포 표현형을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 근육 세포 표현형은 근아세포 표현형을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는: a) MSC를 제공하는 단계; b) MSC를 ROCK 억제제, 산성 배지, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및 c) PDGFBB, HGF, PDGFβPDGFAA, EGF, VEGF, TGFβ 및 IGF1 중 적어도 하나를 MSC 내로 도입하는 단계에 의해 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 MSC PCAT1 및 NEAT1 또는 GAS5 및 PTENP1 발현의 억제제 내로 추가로 도입시켜 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 MSC를 근육 세포, 근육 세포로부터의 조건화된 배지, 또는 근육 세포의 세포외 소포와 함께 공-배양함으로써 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 MSC 내로 NANOG, SOX2, KLF4, OCT4 또는 이들의 조합 중 임의의 하나를 도입시킴으로써 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 MSC를 5-AZA를 함유하는 배지에서 추가로 인큐베이팅함으로써 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 다음 중 임의의 하나에서 MSC를 배양함으로써 생산된다: 산성 배지; 저산소; 저 부착 플레이트; FGF 또는 EGF로 보충된 저 혈청 배지; 5-AZA로 보충된 배지; ROCK 억제제, STAT3, NF-KB 활성제, CHIR99021, 메트포르민, 트라닐사이프로민, Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A, mTor 억제제, TGFβ 억제제, 티아조비빈, A83-01, LiCl, SB431542, 5-AZA, 라파마이신, ERK 활성제 및 발포르 산으로 구성된 군으로부터 선택된 소분자를 함유하는 배지; 및 이들의 조합.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 MSC 내로 MYF5, PAX3, PAX7, 디스트로핀, 마이크로 디스트로핀, 유트로핀, MyoD 및 PAX3, MyoD 및 PAX7, 및 MyoD 및 MYF5로 구성된 군으부터 선택된 적어도 하나의 전사 인자를 도입함으로써 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는: a) MSC를 제공하는 단계; b) MSC를 산성 배지, a ROCK 억제제, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및 c) MSC 내로 BIL, PAR5, BIC, DISC2, GAS5DLG2AS, 7SK, Y1, LINCRNA, PCAT-1 SFMBT2, Y4, SCA8, MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 긴 비-코딩 RNA(lncRNA; long non-coding RNA)를 도입시키는 단계에 의해 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 lncRNA는 PAR5, DISC2 및 PCAT1으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 MSC 내로 MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 lncRNA를 추가로 도입함으로써 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 상기 MSC 내에서 ANRIL, PTENP1 및 aHIF 중 적어도 하나의 발현을 추가로 다운 조절함으로써 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 위성 세포 표현형을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는: a) MSC를 제공하는 단계; b) 상기 MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 MSC 내로 miR-10b, miR-22, miR-122, miR-125a, miR-140-5p, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-148b, miR-150, miR-155, miR-181b, miR-215, miR-296, miR-330, miR-370, miR-429, miR-520, miR-524, miR-543, miR-550, miR-561, miR-564, miR-582, miR-583, miR-587, miR-613, miR-614, miR-629, miR-634, miR-645, miR-646, miR-649, miR-661, miR-662, miR-663, miR-665, miR-668, miR-671, miR-887, miR-1183, miR-1224, miR-1225, miR-1228, miR-1234, miR-1246, miR-1247, miR-1257, miR-1258, miR-1268, miR-1269, miR-1289, miR-1287, miR-1909, miR-1911, miR-759, miR-3150, miR-3174, miR-3180, miR-3191, miR-3197, miR-4292, miR-2115, miR-4312, miR-92, 93 및 miR-99로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA를 도입시키는 단계에 의해 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 miR는 miR-10b, miR-138, miR-154, miR-155, miR-181, miR-215, miR-614, 및 miR-668로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 MSC는 탯줄 또는 태반으로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 SOX2, KLF4, OCT4 및 NANOG로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 줄기세포성 마커를 발현한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 VEGF, GDNF 및 IGF1로부터 선택된 적어도 하나의 영양 인자를 분비한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 세포의 표면 또는 세포의 세포외 소포의 표면 상의 근육 세포 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 근육 세포 표적화 모이어티는 다음 중 임의의 하나를 포함한다: 카베올린 3에 대한 리간드, M-카드헤린, 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 리간드, 미오스타틴의 돌연변이 우세 음성 형태, 및 안지오텐신 II 유형 1. 일부 구현예에 따르면, 상기 근육 세포 표적화 모이어티는 M-카드헤린을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 약물, 판독 약물(read-through drug), RNA, DNA 분자, 벡터, 엑손 스킬링 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA(miR), 작은 간섭하는 RNA(siRNA), 안타고미르(antagomir), 긴 비코딩 RNA(lncRNA) 및 바이러스. 일부 구현예에 따르면, 상기 RNA는 변형된 MyoD mRNA이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 안타고미르는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 항-miR-424, 항-miR-195, 항-miR-16, 항-miR-497, 항-miR-135, 항-miR-6793, 항-miR-21, miR-133b 및 이들의 조합. 일부 구현예에 따르면, 상기 안타고미르는 항-let-7이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 세포 중 임의의 단리된 세포외 소포가 제공된다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 혼합된 특성의 세포, 본 발명의 세포외 소포, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 아쥬반트를 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 근육-관련된 질환 또는 근육 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 것을 필요로 하는 대상체에서 이들을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써, 근육-관련된 질환 또는 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 조성물은 상기 대상체에게 대해 동종 이계 또는 자가조직인 MSC로부터 유래된 세포를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 근육-관련된 질환 또는 근육 손상은 운동 뉴런 질환, 주변 뉴런 질환, 근이영양증, 척수 손상, 근육 소모, 심장 근육 손상, 염증성 근병증, 중증 근무력증, 근육감소증, 악액질, 및 골격 근육 손상으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 근육-관련된 질환은 근위축 측삭 경화증(ALS), 악액질, 및 근이영양증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 근이영양증은 뒤센느 근이영양증(DMD)이다.
일부 구현예에 따르면, 근육-관련된 질환은 ALS이고 본 방법은 추가로, 별아교세포 표현형 또는 뉴런의 줄기 세포 (NSC) 표현형에 대해 분화된 적어도 하나의 MSC를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 미분화된 MSC, 미분화된 MSC의 세포외 소포, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 구현예 및 적용가능성의 전체 범위는 이하에 제공된 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 본 발명의 사상 및 범위내 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 분명해질 것이므로, 예시로서만 제공됨이 이해되어야 한다.
도 1a-1k. MSC는 재생을 증가시키고 섬유증을 감소시킨다(1a) 5x105 개의 MSC 또는 CD34+ 세포의 주사 후 4 주째에 야생형 마우스의 사두근 근육내에서 VEGF, HIF1α, 유트로핀, 콜라겐 I 및 NCAM의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (1b) 5x105 개의 MSC 또는 그것의 엑소좀의 주사 후 4 주째에 MDX 마우스의 사두근 근육내에서 TNFα, 유트로핀, 콜라겐 I 및 NCAM의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (1C) 다양한 조직으로부터 5x105 개의 MSC의 주사 후 4 주째에 MDX 마우스의 사두근 근육내에서 유트로핀의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (1d) 다양한 조직으로부터 5x105 개의 MSC의 주사 후 4 주째에 MDX 마우스의 사두근 근육내에서 콜라겐 I의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (1e) 5x105 개의 MSC로부터의 엑소좀의 주사 후 4 주째에 mdx 마우스의 사두근 내에서 NCAM 양성 세포를 계수함으로써 측정된 재생 퍼센트를 나타내는 막대형 차트. (1f) 다양한 조직으로부터의 MSC와 함께 공배양된 인간 근육 세포 내에서 유트로핀 발현의 상대적인 수준을 나타내는 막대형 차트. (1g) 적어도 4 개 세포의 근관내로 형성된 근아세포의 %를 나타내는 막대형 차트, 및 (1h) 다양한 조직의 MSC와 공배양 후 건강한 근아세포 내에서 MYH2 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 이미지. (1i) 다양한 조직의 MSC와 공배양 후 DMD 환자로부터의 근아세포 내에서 적어도 4 개 세포의 근관 내로 형성된 근아세포의 %를 나타내는 막대형 차트. (1j) 다양한 조직 또는 그것의 엑소좀의 MSC와 공배향 후 위성 세포 내에서 MyoD 단백질 발현의 웨스턴 블랏 이미지. (1k) 다양한 조직 또는 그것의 엑소좀의 MSC와 공배향 후 마우스 C2C12 세포 내에서 MyoD 단백질 발현의 웨스턴 블랏. BM-골수, AD-지방질, AM-양막 태반, CH-융모막 태반, UC-탯줄.
도 2: MSC는 근육 세포 생착의 효능을 증가시킨다. 이식 후 2 주째에 이식된 인간 근아세포 또는 위성 세포로부터 상대적인 형광을 나타내는 막대형 차트. 세포는 단독으로 이식되었거나, 또는 MSC와 함께 공동-이식되었다.
도 3: 프라이밍된 MSC는 MyoD를 발현한다 프라이밍된 MSC 내에서 MyoD-GFP 발현을 나타내는 막대형 차트.
도 4a 및 4b: 프라이밍된 세포는 재생을 증가시키고 섬유증을 감소시킨다 (4a) 1x106 개의 프라이밍되지 않은 및 프라이밍된 MSC의 주사 후 4 주째에 야생형 마우스의 사두근 근육 내에서 섬유증 마커 콜라겐 I 및 재생 마커 NCAM의 발현에 있어서 퍼센트 변화를 나타내는 막대형 차트. 발현 수준은 모의 주사된 대조군 사두근 근육에 대해 측정된다. (4b) 심장독 치료 후 7 일째에 야생형 마우스의 비복근 근육 내에서 새로 생성된 근육 섬유의 수를 나타내는 막대형 차트. 마우스에게 PBS, MSC 또는 프라이밍된 MSC를 미리 주사하였다.
도 5a 내지 5i: MSC-근육 세포 하이브리드 세포는 근육 마커 및 영양 인자를 발현한다 (5a) 프로토콜 1을 사용하여 하이브리드 세포로 분화시킨 MSC 및 처리되지 않은 MSC에서 MyoD 발현을 나타내는 현미경 사진. (5b) 프로토콜 1을 사용하여 이들을 하이브리드 세포로 분화시키기 위해 처리한 후 다양한 조직으로부터 유래된 MCS 내에서 MyoD, 디스트로핀 및 미오게닌의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (5C) 함께 성장된 하이브리드 세포(적색으로 표지됨) 및 근육 세포(녹색으로 표지됨)를 나타내는 현미경 사진. 근육 세포와 하이브리드 세포 사이의 융합의 위치는 황색(화살표)으로 나타난다. (5d) 프로토콜 2를 사용하여 이들을 하이브리드 세포로 분화시키기 위해 처리한 후 다양한 조직으로부터 유래된 MSC 내에서 MyoD, 디스트로핀 및 미오게닌의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (5e) 프로토콜 1을 사용하여 이들을 하이브리드 세포로 분화시키기 위해 처리한 후 다양한 조직으로부터 유래된 MSC 내에서 GDNF, IGF1 및 VEGF의 상대적인 발현 수준을 나타내는 막대형 차트. (5f) Nanog mRNA 또는 대조군 mRNA로 프라이밍시킨 다음 프로토콜 3을 사용하여 하이브리드 세포로 분화시킨 MSC 내에서 상대적인 MyoD 발현을 나타내는 막대형 차트. (5g) 열거된 lncRNA를 사용하여 프로토콜 5로 분화 후 Pax7 및 MyoD에 대해 이중 양성인 세포에 의해 측정된 것으로서, 위성 세포 표현형을 지닌 세포의 상대적인 수준을 나타내는 막대형 차트. (5h) 대조군의 처리되지 않은 MSC 및 프로토콜 5를 사용하여 생산된 하이브리드 세포의 형태 및 ANRIL, PTENP1 및 aHIF의 다운조절을 나타내는 현미경 사진. (5i) 산성 매질 및 저산소로 프라이밍하거나 5-AZA로 프라이밍하고 열거된 miR로 프로토콜 6을 사용하여 분화 후 MyoD 양성 세포의 상대적인 수를 나타내는 막대형 차트.
도 6a 내지 6e: DMD를 치료하기 위한 CH-MSC, 프라이밍된 MSC 또는 MSC-근육 세포 하이브리드 세포의 용도 (6a) 대조군 모의 주사 및 비변형된 CH-MSC를 사용한 주사 후 3 주째에 mdx 마우스 사두근 근육 내에서 크레아틴 키나제(CPK) 수준을 나타내는 막대형 차트. (6b) PBS 및 다양한 조직으로부터의 비변형된 MSC로 주사 후 3 주째에 MDX 마우스 사두근 근육 내에서 크레아틴 키나제(CPK) 수준을 나타내는 막대형 차트. (6c) PBS 및 다양한 조직으로부터 유래된 하이브리드 세포의 주사 후 3 주째에 MDX 마우스 사두근 내에서 크레아틴 키나제 (CPK) 수준을 나타내는 막대형 차트. (6d) 대조군 처리되지 않은 CH-MSC, 산성 매질 및 저산소로 프라이밍된 CH-MSC, 근육 공배양물로 프라이밍된 CH-MSC, 및 프로토콜 3으로 생산된 하이브리드 세포로 주사한 후 3 주 째에 mdx 마우스 사두근 근육 내에서 상대적인 인간 디스트로핀 mRNA 발현을 나타내는 막대형 차트. (6e) 비변형된 MSC로부터의 엑소좀, 하이브리드 세포로부터의 엑소좀, 이들 둘 다의 혼합물, 및 PBS로 주사한 후 3 주 째에 mdx 마우스 사두근 근육 내에서 크레아틴 키나제(CPK) 수준을 나타내는 막대형 차트.
도 7a 내지 7e: ALS를 치료하는 MSC-근육 세포 하이브리드 세포의 용도 (7a) PBS 또는 하이브리드 세포가 근육 내로 주사된 전-증상 SOD 랫트의 카플란-마이어 생존 플롯. 랫트는 거꾸로 배치된 후 30 초 내에 그것의 올바른 위치로 더 이상 회복할 수 없는 경우 희생시켰다. (7b) PBS 또는 별아교세포 표현형(MSC-AS)으로 분화된 MSC로 척추강 내 주사된 전-증상 SOD 랫트의 카플란-마이어 생존 플롯. 랫트는 거꾸로 배치된 후 30 초 내에 그것의 올바른 위치로 더 이상 회복할 수 없는 경우 희생시켰다. (7c) MSC-AS를 척추강내로, 하이브리드 세포를 근육내로, 둘 다로 또는 PBS로 주사한 증상이 있는 SOD 랫트의 생존 기간(일)을 나타내는 막대형 차트. 랫트는 거꾸로 배치된 후 30 초 내에 그것의 올바른 위치로 더 이상 회복할 수 없는 경우 희생시켰다. (7d) PBS 또는 하이브리드 세포가 근육내로 주사된 전-증상 SOD 랫트의 카플란-마이어 생존 플롯. 랫트는 10 분 동안 로타로드(Rotarod) 위에 더 이상 서 있을 수 없는 경우 희생시켰다. (7e) PBS 또는 뉴런의 줄기 세포 표현형으로 분화된 MSC(MSC-NSC)가 정맥내로 주사된 전-증상 SOD 랫트의 카플란-마이어 생존 플롯. 랫트는 10 분 동안 로타로드(Rotarod) 위에 더 이상 서 있을 수 없는 경우 희생시켰다.
도 8: 악액질을 치료하는 MSC 및 그것의 엑소좀의 용도 배지를 사용한 모의 처리 및 TNFα 및 IFNγ를 사용한 처리 후 CH- 및 UC- MSC 및 그것의 엑소좀과 함께 공배양된 근육 세포 내에서 상대적인 미오신 중쇄 발현을 나타내는 막대형 차트.
도 9a 내지 9e: 치료 전달 시스템으로서 MSC의 용도 (9a) 열거된 안타고미르와 함께 장입된 MSC로부터의 엑소좀과 함께 인큐베이션 후 근아세포 내에서 상대적인 유트로핀 mRNA 발현을 나타내는 막대형 차트. (9b) let-7 및 miR-133b에 대한 안타고미르를 발현하는 CH-MSC의 주사 후 근육 세포 내에서 생체내 유트로핀 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 이미지. (9c) let-7에 대한 안타고미르를 발현하는 CH-MSC로부터의 근육-표적화된 및 표적화되지 않은 엑소좀의 주사 후 근육 세포 내에서 생체내 유트로핀 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 이미지. (9d) let-7에 대한 안타고미르를 발현하는 CH-MSC와 공배양 후 미오신 중쇄 양성 세포의 상대적인 수를 나타내는 막대형 차트. (9e) 형질감염에 의한 변형된 MyoD mRNA의 세포내로의 도입, MSC로부터의 전부하된 엑소좀과의 인큐베이션, 또는 변형된 mRNA를 발현하는 MSC와의 트랜스-웰 공배양 후 MyoD 단백질에 대한 핵 염색을 나타내는 근아세포의 수를 나타내는 막대형 차트.
발명의 상세한 설명
본 발명은 간엽 줄기 세포 표현형 및 근육 세포 표현형을 지닌 세포 뿐만 아니라 이로부터 분비된 세포외 소포, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이들 투여함을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
혼합된 특성의 세포
일 측면에 의해, 본 발명은 혼합된 특성의 단리된 세포에 관한 것이며, 여기서 상기 세포는 간엽 줄기 세포(MSC) 표현형 및 근육 세포 표현형을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"는 골아세포, 지방세포, 근세포, 연골아세포, 골격 근육 세포 및 내피 세포로 분화하는 능력을 갖는 다분화능 기질 줄기 세포를 지칭한다. MSC는 다른 조직 중에서도 골수, 지방 조직, 말초 혈액, 융모막 태반, 양막 태반, 탯줄 혈액, 및 치수 속에 존재한다. 용어 "다분화능"은 많은 세포 유형으로 생성될 수 있는 줄기 세포를 지칭한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 예컨대 수의과 동물의 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 수의과 동물은 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 양 및 염소로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 근육-관련된 질환 또는 근육 손상에 대한 치료가 필요한 대상체에 대해 동종이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 근육 질환 또는 근육 손상에 대한 치료가 필요한 대상체에 대해 자가조직이다.
일부 구현예에서, 혼합된 특성의 세포는 프라이밍된 세포이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프라이밍된 세포"는 근육 세포로의 분화 과정을 시작했지만, 이러한 과정의 매우 초기 단계에 있는 세포를 지칭한다. 그와 같은 세포는 MyoD를 발현한다. 일부 구현예에서, 근육 세포는 평활근 세포, 골격 근육 세포 또는 위성 세포이다.
일부 구현예에서, 프라이밍된 세포는 탈-분화된 MSC이다. 일부 구현예에서, 탈-분화된 MSC는 SOX2, NANOG, OCT4 및 KLF4 중 적어도 하나를 발현한다. 일부 구현예에서, 탈-분화된 MSC는 SOX2, NANOG, OCT4 및 KLF4 중 적어도 하나를 처리되지 않은 MSC 내에서 발현된 것보다 더 높은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, 탈-분화된 MSC는 복수의 SOX2, NANOG, OCT4 및 KLF4를 발현한다. 일부 구현예에서, 탈-분화된 MSC는 뼈, 지방질 또는 힘줄로 분화하지 않거나 저조하게 분화한다. 일부 구현예에서, 탈-분화된 MSC는 처리되지 않은 MSC보다 불량한 비율로 뼈 지방질 또는 힘줄로 분화한다. 일부 구현예에서, 탈-분화된 MSC는 처리되지 않은 MSC가 분화하는 것보다 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 또는 0.01 미만의 비율로 뼈, 지방질 또는 힘줄로 분화한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 혼합된 특성의 세포는 하이브리드 세포이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "하이브리드 세포"는 2개의 상이한 및 구별되는 세포 유형, 예를 들어, MSC 및 근육 세포의 품질, 특징, 발현 프로파일 또는 표현형을 갖는 세포를 지칭한다. 이는 2개의 별개의 세포가 함께 융합되어 제조되어진 물리적 하이브리드를 지칭하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하이브리드 세포는 분화가 완료되지 않는 근육 세포로 분화된 MSC이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 세포는 프라이밍된 세포보다 근육 세포로 더 분화된다.
일부 구현예에서, MSC 표현형은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표면 마커의 발현을 포함한다: CD73, CD105, CD90, CD44 및 CD146. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 표면 마커의 발현을 포함한다: CD73, CD105, CD90, CD44 및 CD146. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 IL-10의 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 주조직 적합성 복합 단백질 II(MHCII) 발현의 부재를 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 발현 마커를 포함한다: CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44 발현 및 MHCII 발현의 부재. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 발현 마커를 포함한다: CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44 발현 및 MHCII 발현의 부재.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어　"발현"은　상기　유전자 생성물의 전사 및/또는 번역을 포함하는 유전자 생성물의 생합성을 지칭한다. 따라서, 핵산 분자의 발현은　핵산 단편의 전사(예를 들어, mRNA 또는 다른 기능적 RNA를 생성하는 전사) 및/또는 RNA의 전구체 또는 성숙한 단백질(폴리펩타이드)로의 번역을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 마커는 RNA 발현을 지칭한다. 일부 구현예에서, 발현 마커는 단백질 발현을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표면 발현 마커는 세포 표면 상에서 또는 세포의 원형질막 내에서 단백질의 발현을 지칭힌다.
일부 구현예에서, MSC 표현형은 항-염증 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 상기 MSC는 항-염증 세포이다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 염증을 감소시키는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 항-염증성 사이토카인의 분비를 포함한다. 항-염증성 사이토카인은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, IL-10, IL-4, IL-13, 및 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)를 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 표현형은 염증, 손상 또는 질환의 부위로 귀결되는 능력을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 표현형은 면역조절 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 대상체의 면역계를 조절하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 면역억제 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 대상체의 면역계를 억제하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, MSC 표현형은 T-세포의 활성화를 감소시키는 능력을 포함한다.
일부 구현예에서, MSC 표현형은 염증, 손상 또는 질환의 부위로 귀결되는 능력을 포함한다.
MSC 표현형을 검출하고 측정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로, 검정 예컨대 FACS 또는 웨스턴 블랏에 의한 MSC 표면 마커에 대한 염색을 포함한다. 인간 및 마우스 간엽 줄기 세포 ID 키트(R&D Systems), MSC 표현형 검사 키트, 인간(Miltenyi Biotech) 및 BD 수간 유하량(Stemflow) hMSC 분석 키트(BD Biosciences)를 포함하는 몇 개의 상업적 키트가 이러한 검출 및 측정을 수행하는데 이용가능하다. 다른 방법은 분비된 프로- 및 항-염증성 사이토카인, 예컨대 비제한적으로 IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, TNFα, IL-13, 및 TGFβ를 측정하고 당해 분야에서 잘 알려진 귀소 검정을 사용하여 세포 귀소를 측정하며 MSC 전사 인자의 mRNA 발현을 검출하고 측정함을 포함한다.
일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 MyoD, Myf6, Myf5, MRF4, ITGA7, GFF11, 오스테오프로테그린, 이리신, 디스트로핀, 미오신 중쇄, 미오게닌, PAX7, TALNEC2, C-MET, G-CSF, 오스테오프로테그린, IL-10, 및 MEF2A 중 적어도 하나의 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 복수의 MyoD, Myf6, Myf5, MRF4, ITGA7, 오스테오프로테그린, 이리신, 디스트로핀, 미오신 중쇄, 미오게닌, PAX7, TALNEC2, C-MET, G-CSF, 오스테오프로테그린, IL-10, 및 MEF2A의 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 MyoD, Myf6, Myf5, MRF4, ITGA7, 오스테오프로테그린, 이리신, 디스트로핀, 미오신 중쇄, 미오게닌, PAX7, TALNEC2, C-MET, G-CSF, 오스테오프로테그린, IL-10, 및 MEF2A 발현 및 오스테오칼신의 부재, PPARG3, 및 COL2A1 발현으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 발현 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 MyoD, Myf6, Myf5, MRF4, ITGA7, 오스테오프로테그린, 이리신, 디스트로핀, 미오신 중쇄, 미오게닌, PAX7, TALNEC2, C-MET, G-CSF, 오스테오프로테그린, IL-10, 및 MEF2A 발현 및 오스테오칼신의 부재, PPARG3, 및 COL2A1 발현으로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 발현 마커를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기에 기재된 근육 발현 마커는 이들이 미분화된 MSC 내에서 발현된 것보다 더 높은 수준에서 발현된다. 일부 구현예에서, 이들은 이들이 미분화된 MSC에서 발현된 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 배 더 높은 수준에서 발현된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 근육 신시티움과 병합하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 근관의 크기 또는 직경을 증가시키는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 근육 재생이다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 손상 또는 상해 후 근육 조직을 재생하는 능력이다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 신규한 근육 섬유를 생성하는 능력이다.
일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 위성 세포 표현형이다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 평활근 표현형이다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 골격 근육 표현형이다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표현형은 심장 근육 표현형이다.
근육 세포 표현형을 검출하고 측정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로, 예를 들어, 웨스턴 블랏, FACS 또는 ELISA에 의한 근육 단백질의 염색; 근육 세포 전사 인자 및 단백질을 검출하고 정량화하기 위한 정량적 PCR; 및 근육 신시티움에 대한 융합의 검정을 포함한다. 근육 융합을 위한 검정은 당해 분야에서 잘 알려져 있으며 이중 형광 태그를 사용하여 색상의 혼합을 찾을 수 있다.
세포의 생산
프로토콜 A: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 근육 세포, 근육 세포, 또는 근육 세포의 세포외 소포로부터의 조건화된 배지와 공-배양함으로써 생산된다.
프로토콜 B: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC내로 NANOG, SOX2, KLF4, OCT4 또는 이들의 조합 중 임의의 하나를 도입시켜 생산한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 Nanog를 MSC 내로 도입시켜 생산된다.
프로토콜 C: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 5-아자시티딘(5-AZA)과 인큐베이팅함으로써 생산된다.
프로토콜 D: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 a) ROCK 억제제 및 b) 산성 매질 또는 저산소로 인큐베이팅함으로써 생산된다.
프로토콜 E: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 다음 중 임의의 하나 속에서 배양함으로써 생산된다: 산성 배지; 저산소; 저 부착 플레이트; FGF 또는 EGF로 보충된, 저 혈청을 지닌 배지; ROCK 억제제, STAT3 활성제, NF-KB 활성제, CHIR99021, 메트포르민, 트라닐사이프로민, Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A, mTor 억제제, TGFβ 억제제, 티아조비빈, A83-01, LiCl, SB431542, 5-AZA, 라파마이신, ERK 활성제 및 발포르 산; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 소분자를 함유하는 배지.
프로토콜 1: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 제공하는 단계, MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계, MSC 내로 HGF 또는 PDGFβ를 도입시키는 단계 및 MSC 내로 PCAT1 및 NEAT1을 도입시키는 단계에 의해 생산될 수 있다.
프로토콜 2: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 제공하는 단계, MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA와 접촉시키는 단계, MSC 내로 HGF 또는 PDGFβ를 도입하는 단계 및 MSC 내로 GAS5 및 PTENP1 발현의 억제제를 도입하는 단계에 의해 생산될 수 있다.
프로토콜 3: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 제공하는 단계, MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA와 접촉시키는 단계, MSC 내로 PDGFAA, PDGFBB, EGF, VEGF, TGFβ 및 IGF1을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성장 인자를 도입시키는 단계에 의해 생산될 수 있다.
프로토콜 4: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC 내로 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전사 인자를 도입시킴으로써 생산될 수 있다: MYF5, PAX3, PAX7, 디스트로핀, 마이크로디스트로핀, 유트로핀, MyoD 및 PAX3, MyoD 및 PAX7, 및 MyoD 및 MYF5.
프로토콜 5: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 세포는 MSC를 제공하는 단계, MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA와 접촉시키는 단계, MSC 내로 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)를 도입시키는 단계에 의해 생산된다: BIL, PAR5, BIC, DISC2, GAS5DLG2AS, 7SK, Y1, LINCRNA, PCAT-1 SFMBT2, Y4, SCA8, MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 lncRNA는 PAR5, DISC2 및 PCAT1으로부터 선택된다.
프로토콜 6: 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 제공하는 단계; MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및 MSC 내로 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA(miR)를 도입시키는 단계에 의해 생산된다: miR-10b, miR-22, miR-122, miR-125a, miR-140-5p, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-148b, miR-150, miR-155, miR-181b, miR-215, miR-296, miR-330, miR-370, miR-429, miR-520, miR-524, miR-543, miR-550, miR-561, miR-564, miR-582, miR-583, miR-587, miR-613, miR-614, miR-629, miR-634, miR-645, miR-646, miR-649, miR-661, miR-662, miR-663, miR-665, miR-668, miR-671, miR-887, miR-1183, miR-1224, miR-1225, miR-1228, miR-1234, miR-1246, miR-1247, miR-1257, miR-1258, miR-1268, miR-1269, miR-1289, miR-1287, miR-1909, miR-1911, miR-759, miR-3150, miR-3174, miR-3180, miR-3191, miR-3197, miR-4292, miR-2115, miR-4312, miR-92, 93 및 miR-99. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 miR은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: miR-10b, miR-138, miR-154, miR-155, miR-181, miR-215, miR-614, 및 miR-668.
일부 구현예에서, MSC는 골수, 지방 조직, 양막 태반, 융모막 태반, 또는 탯줄로부터 유래된다. 일부 구현예에서, MSC는 융모막 태반 또는 탯줄로부터 유래된다. 일부 구현예에서, MSC는 융모막 태반으로부터 유래된다.
세포의 공-배양은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, 공-배양은 근육 세포 배지 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 공-배양은 MSC 배지 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 공-배양을 트랜스-웰 플레이트 내에서 수행함으로써, 세포의 혼합이 일어나지 않지만, 세포들이 분비된 인자를 교환한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "조건화된 배지"는 적어도 1 일 동안 세포의 성장이 있었던 이전의 배지를 지칭한다. 그와 같은 배지는 성장한 세포로부터 분비된 인자, 예컨대, 비제한적으로 가용성 인자, 엑소좀, 마이크로솜, 및 다른 세포외 소포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조건화된 배지는 세포의 성장이 적어도 24, 48, 72, 96 또는 120 시간 동안 있었다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "세포외 소포"는 비제한적으로 엑소좀 및 미세소포를 포함하는 MSC로부터 분비된 모든 세포-유래된 소포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "엑소좀"은 크기가 50 내지 100 nm이고, MSC로부터 분비된, 식균 작용 기원의 세포-유래된 소포를 지칭한다. 비제한적인 구현예로서, 엑소좀 생성을 위해 세포는 Opti-MEM 및 엑소좀이 없는 인간 혈청 알부민 또는 5 % FBS로 유지된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "미세소포"는 크기가 100 내지 1000 nm이고, MSC로부터 분비된 원형질막으로부터 기원한 세포-유래된 소포를 지칭한다.
엑소좀, 세포외 소포, 또는 미세소포는 MSC를 엑소좀이 없는 혈청이 들어있는 배양 배지 속에서 또는 무혈청 배지 예컨대 OptiMeM 속에서 성장시키고 후속적으로 엑소좀을 초원심분리에 의해 분리함으로써 수득할 수 있다. 비드, 칼럼, 필터 및 항체와 관련된 다른 방법도 또한 이용된다. 일부 구현예에서, 세포는 저산소 조건 하에서 성장하거나 낮은 pH를 지닌 배지에서 인큐베이션하여 엑소좀의 수율을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포는 방사선에 노출시킴으로써 엑소좀 분비 및 수율을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 엑소좀을 투여용으로 적절한 배지에서 현탁시킨다.
일부 구현예에서, ROCK 억제제와의 인큐베이션은 적어도 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC는 ROCK 억제제와 함께 약 24 시간 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 5-AZA와의 인큐베이션은 적어도 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 동안이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC는 5-AZA와 함께 약 24 시간 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 배지는 MSC 배지이다. 일부 구현예에서, 배지는 근육 세포 배지이다. 일부 구현예에서, 배지는 줄기 세포 배지이다. 그와 같은 배지는 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 비제한적으로, 골격 근육 세포 배지(Promocell), 혈관 평활근 세포 성장 키트, (ATCC), 평활근 세포 배지(Promocell), 평활근 세포 배지 보충물 키트(Cell Biologics), MesenPRO RS 배지(ThermoFisher), StemPro MSC SFM (ThermoFisher), 및 NutriStem MSC XF 배지(Biological Industries)를 포함한다.
유전자, RNA, 핵산 또는 단백질의 살아 있는 세포 내로의 도입은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "도입"은 세포 내로 유전자, 단백질 또는 화합물의 외인성 첨가를 지칭한다. 이는 유전자, 단백질 또는 화합물의 내인성 발현의 증가를 지칭하지 않는다. 이러한 도입의 예는 비제한적으로 형질감염, 렌티바이러스 감염, 핵감염, 또는 형질도입을 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 생체외에서 일어난다. 일부 구현예에서, 도입은 생체내에서 일어난다. 일부 구현예에서, 도입은 생체내 또는 생체외에서 일어난다. 일부 구현예에서, 도입은 관심 유전자를 포함하는 벡터의 도입을 포함한다.
벡터는 비-바이러스 방법 또는 바이러스성 방법을 통해 전달된 DNA 플라스미드이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련된 바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터일 수 있다. 프로모터는 포유동물 세포 내에서 활성일 수 있다. 프로모터는 바이러스성 프로모터일 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 전기천공(예를 들어, From 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)에 기재된 바와 같이), 열충격, 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내, 또는 표면 위에 핵산을 지닌 작은 입자에 의한 고 속도 탄도 침투(Klein 등, Nature 327. 70-73 (1987)) 및/또는 유사 방법을 포함하는 표준 방법에 의해 세포 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 포유동물 발현 벡터는 비제한적으로, pcDNA3, pcDNA3.1 (±), pGL3, pZeoSV2(±), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81(이들은 Invitrogen로부터 이용가능하다), pCI(이는 Promega로부터 이용가능하다), pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV(이들은 Strategene으로부터 이용가능하다), pTRES(이는 Clontech로부터 이용가능하다), 및 그것의 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵 바이러스, 예컨대 레트로바이러스로부터 조절 인자를 함유하는 발현 벡터가 본 발명에 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 구현예에서, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고 엡슈타인 바르 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAM네오-5, 배큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 루 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포 내에서 발현에 효과적인 것으로 밝혀진 다른 프로모터의 지시하에서 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 이점, 예컨대 측면 감염 및 표적화 특이성을 부여하는 재조합 바이러스 벡터가 생체내 발현에 사용된다. 일 구현예에서, 측면 감염은 예를 들어, 레트로바이러스의 수명 주기 내에 내재되어 있으며 단일 감염된 세포가 싹 터서(bud off) 인접하는 세포를 감염시키는 많은 자손 비리온을 생산하는 과정이다. 일 구현예에서, 결과는 넓은 부위가 빠르게 감염된다는 것이며, 이중 대부분은 최초 바이러스 입자에 의해 초기에 감염되지 않았다. 일 구현예에서, 측면으로 확산할 수 없는 바이러스 벡터가 생산된다. 일 구현예에서, 이러한 특징은 원하는 목적이 명시된 유전자를 단지 국소화된 수의 표적화된 세포 내로 도입하기 위한 것일 경우 유용할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터를 세포로 도입하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel 등에서, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang 등, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 일반적으로 기재되어 있으며 예를 들어, 안정한 또는 일시적인 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및 재조합 바이러스 벡터를 사용한 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선별 방법에 대해 미국 특허 번호 제5,464,764호 및 제5,487,992호를 참고한다.
일 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용된다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현은 수많은 프로모터에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 바이러스의 프로모터 예컨대 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터[Brisson 등, Nature 310:511-514 (1984)], 또는 TMV에 대한 코트 단백질 프로모터[Takamatsu 등, EMBO J. 6:307-311 (1987)]가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 식물 프로모터 예컨대, 예를 들어, RUBISCO의 작은 하위단위[Coruzzi 등, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); 및 Brogli 등, Science 224:838-843 (1984)] 또는 열충격 프로모터, 예를 들어, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B[Gurley 등, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]가 사용된다. 일 구현예에서, 작제물은 식물 세포 내로 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질 전환, 미세주입, 전기천공 및 숙련가에게 잘 알려진 다른 기술을 사용하여 도입된다. 예를 들어, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, 부문 VIII, pp 421-463 (1988)]를 참고한다. 다른 발현 시스템, 예컨대 당해 분야에서 잘 알려진 곤충 및 포유동물 숙주세포 시스템, 또한 본 발명에 의해 사용될 수 있다.
삽입된 코딩 서열(폴리펩타이드를 암호화하는)의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유하는 것 외에, 본 발명의 발현 작제물은 또한 발현된 폴리펩타이드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하기 위해 조작된 서열을 포함할 수 있음이 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 관심 유전자의 도입은 유도성 벡터의 도입을 포함하며, 여기서 세포에 대한 약물의 투입은 관심 유전자의 발현을 유도할 것이다. 약물 유도성 벡터는 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, 일부 비-제한적인 예는 타목시펜-유도성, 테트라사이클린-유도성 및 독시사이클린-유도성을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도성-벡터는 MSC에 생체외로 도입되고 MSC는 도입된 약물과 생체내에서 접촉된다. 이런 식으로 유도된 유전자의 발현, 및 결과로서 MSC의 프라이밍 또는 분화는 생체내에서만 일어난다. 일부 구현예에서, MSC의 프라이밍 또는 분화는 MSC가 대상체의 바디 내 위치로 귀소한 후에만 일어난다.
일부 구현예에서, 도입은 변형된 mRNA를 도입함을 포함한다. 용어 "변형된 mRNA"는 세포의 세포질내로 도입될 수 있고 단백질로 번역될 안정한 mRNA를 지칭한다. 그와 같은 mRNA는 단백질 발현을 위한 전사를 필요로 하지 않으므로 단백질을 보다 빠르게 생산할 것이며 거의 조절에 영향을 받지 않는다. 변형된 mRNA는 당해 기술에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 B 및 C를 배합시켜 생산한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC 내로 NANOG, SOX2, KLF4, OCT4 또는 이들의 조합 중 어느 하나를 도입시키고 MSC를 5-AZA와 함께 인큐베이팅함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 Nanog를 MSC 내로 도입시키고 MSC를 5-AZA와 인큐베이팅함으로써 생산된다.
용어 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "산성 배지"는 pH가 6.0 이하인 배지를 지칭한다. 산성 배지에서, 성장 배지는 pH가 약 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 또는 3.0일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 산성 배지와의 인큐베이션은 적어도 15분, 30 분, 45분, 60 분, 90 분, 또는 120 분 동안이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC는 산성 배지 속에서 약 1 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 산성 배지는 pH가 약 6이다. 일부 구현예에서, 산성 배지는 pH가 5 내지 6이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "저산소" 또는 "저산소 상태"는 바디, 바디의 영역, 또는 세포가 적절한 산소의 공급이 궁핍한 상태를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포는 배양물 속, 저산소 조절 챔버 속에서 성장하며, 여기서 산소 수준은 밀접하게 제어될 수 있다. 저산소에서, 산소 수준은 5 % 미만, 4.5 % 미만, 4 % 미만, 3.5 % 미만, 3 % 미만, 2.5 % 미만, 2 % 미만, 1.5 % 미만, 1 % 미만, 0.5 % 미만, 또는 0.1 % 미만일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 저산소는 2 내지 4 %의 산소 수준을 지칭한다. 일부 구현예에서, 저산소를 사용한 인큐베이션은 적어도 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, MSC는 저산소 조건 속에서 약 24 시간 동안 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 D에 이어서 프로토콜 E를 수행함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 Nanog를 MSC 내로 도입한 다음 프로토콜 D, 프로토콜 E, 또는 프로토콜 D 및 E 둘 모두를 수행함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 a) ROCK 억제제, b) 산성 배지 또는 저산소, 및 c) 저 부착 플레이트; FGF 또는 EGF가 보충된 저 혈청을 지닌 배지; ROCK 억제제, STAT3, NF-KB 활성제, CHIR99021, 메트포르민, 트라닐사이프로민, Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A, mTor 억제제, TGFβ 억제제, 티아조비빈, A83-01, LiCl, SB431542, 5-AZA, 라파마이신, ERK 활성제 및 발포르 산으로 구성된 군으로부터 선택된 소 분자를 함유하는 배지; 및 이들의 조합 중 임의의 하나와 함께 인큐베이팅함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 a) Nanog를 MSC 인큐베이팅 내로 도입하는 단계, b) ROCK 억제제와 인큐베이팅하는 단계, c) 산성 배지 또는 저산소 속에서 인큐베이팅하는 단계, 및 d) 저 부착 플레이트; FGF 또는 EGF가 보충된 저 혈청을 지닌 배지; ROCK 억제제, STAT3 활성인자, NF-KB 활성제, CHIR99021, 메트포르민, 트라닐사이프로민, Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A, mTor 억제제, TGFβ 억제제, 티아조비빈, A83-01, LiCl, SB431542, 5-AZA, 라파마이신, ERK 활성제 및 발포르 산으로 구성된 군으로부터 선택된 소분자를 함유하는 배지; 및 이들의 조합 중 임의의 하나와 함께 인큐베이팅함으로써 생산된다.
일부 구현예에서, 저 부착 플레이트 상의 세포의 성장은 3D 세포 배양을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "3D 세포 배양"은 세포가 모든 3 개 차원에서 성장하거나 그것의 주변과 상호작용하도록 허용된 세포 배양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이것은 세포를 저 부착 플레이트, 생물반응기, 또는 작은 캡슐 상에서 성장시킴으로서 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 배양물 속에서 성장된 세포는 이들이 자라면서 회전타원체의 형상을 취할 것이다. 다른 구현예에서, 세포는 오가노이드의 형상을 취할 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "오가노이드"는 시험관내에서 성장된 3차원 장기-버드(bud)를 지칭하며, 이는 이것이 모델링한 장기와 유사한 사실적인 마이크로-해부학을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "GSK-3 억제제"는 글리코겐 합성효소 키나제 3 A 또는 글리코겐 합성효소 키나제 B의 키나제 기능을 방해하고 표적을 포스포릴레이트화하는 그것의 능력을 억제하는 임의의 화합물, 치료 또는 약물을 지칭한다. 이러한 억제는 탈아세틸화효소 활성의 적어도 60 %, 및 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 억제일 수 있다. 많은 특성이 잘 규명된 GSK-3 억제제는 당해 기술에 공지되어 있고, 예를 들어 CHIR99021 또는 LiCl이다. 일부 구현예에서, GSK-3 억제제는 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 μM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, CHIR99021은 1-10 μM의 농도로 투여된다. 일부 구현예에서, GSK-3 억제제는 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-10, 5-15, 5-20, 10-15, 또는 10-20 mM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, LiCl은 5-10 mM의 농도로 투여된다.
mTOR 억제제는 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, PP242를 포함한다. 그와 같은 억제제에 의한 억제는 mTOR 경로의 적어도 60 %, 및 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 억제일 수 있다. 일부 구현예에서, mTOR 억제제는 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 μM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, PP242는 1-10 μM의 농도로 투여된다.
TGFβ 억제제는 당해 분야에서 잘 알려져 있으며 많은 다른 것들 중에서 RepSox, SB431542 및 A83-01를 포함한다. 그와 같은 억제제에 의한 억제는 TGFβ경로의 적어도 60 %, 및 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 억제일 수 있다. 일부 구현예에서, TGFβ억제제는 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 μM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, A83-01은 0.5-1 μM의 농도로 투여된다. 일부 구현예에서, SB431542는 약 10 μM의 농도로 투여된다.
ROCK 억제제는 당해 분야에서 잘 알려져 있으며 많은 다른 것들 중에서 티아조비빈을 포함한다. 그와 같은 억제제에 의한 억제는 ROCK 경로의 적어도 60 %, 및 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 억제일 수 있다. 일부 구현예에서, ROCK 억제제는 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 μM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 티아조비빈은 1-10 μM의 농도로 투여된다.
ERK 활성제는 당해 분야에서 잘 알려져 있으며 레스베라트롤 및 피스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, 발포르산은 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-2, 0.5-3, 0.5-4, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 mM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 발포르산은 0.5-2 mM의 농도로 투여된다.
일부 구현예에서, 라파마이신은 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-2, 0.5-3, 0.5-4, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 nM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 라파마이신은 1-10 nM의 농도로 투여된다.
일부 구현예에서, 메트포르민은 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 mg/ml의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 메트포르민은 약 10 mg/ml의 농도로 투여된다.
일부 구현예에서, 트라닐사이프로민은 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 μM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 트라닐사이프로민은 1-10 μM의 농도로 투여된다.
일부 구현예에서, 3-데아자네플라노신 A는 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 0.5-1, 0.5-5, 0.5-10. 0.5-15, 0.5-20, 0.1-1, 0.1-5, 0.1-10, 0.1-15, 또는 0.1-20 μM의 농도로 투여된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 3-데아자네플라노신 A는 1-10 μM의 농도로 투여된다.
일부 구현예에서, 프로토콜 E의 인큐베이션은 적어도 30 분, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 동안이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 G-CSF 처리와 조합하여 생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "G-CSF 처리"는 세포 또는 대상체로 G-CSF의 투여를 지칭하며, 여기서 상기 처리는 MSC 및 CD34+ 세포를 이동시킨다.
일부 구현예에서, HGF 또는 PDGFβ와의 인큐베이션은 적어도 30 분, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 동안이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
PCAT1 및 NEAT1은 lncRNA이며 당해 기술에 공지되어 있다. lncRNA의 도입은 핵산 분자를 세포내로 도입시키기 위한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그와 같은 방법은 상기에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, lncRNA의 억제제는 siRNA이다. 일부 구현예에서, lncRNA의 억제제는 miR이다. 일부 구현예에서, 억제제의 도입은 프리(pre)-miR 또는 프리-siRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 3을 수행하고 MSC PCAT1 및 NEAT1 내로 추가로 도입함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 3을 수행하고 MSC GAS5 및 PTENP1 발현의 억제제내로 추가로 도입함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 제공하는 단계; MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 또는 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; MSC 내로 PDGFAA, PDGFBB, EGF, VEGF, TGFβ 및 IGF1로부터 선택된 적어도 하나의 성장 인자를 도입하는 단계; 및 MSC 내로 PCAT1 및 NEAT1 또는 GAS5 및 PTENP1 발현의 억제제를 도입하는 단계에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 산성 배지, 저산소, ROCK 억제제, 또는 5-AZA와 함께 인큐베이팅한 후 프로토콜 4를 수행함으로써 생산된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 5를 수행하고 상기 MSC 내로 MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 lncRNA를 추가로 도입함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 5를 수행하고 ANRIL, PTENP1 및 aHIF 중 적어도 하나의 발현을 상기 MSC에서 추가로 다운 조절함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 상기 MSC에서 프로토콜 5 또는 프로토콜 5를 포함하는 임의의 과정을 수행하고, ANRIL, PTENP1 및 αHIF 중 적어도 하나의 발현을 추가로 다운-조절함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 프로토콜 5에 의해, 또는 프로토콜 5를 포함하는 공정에 의해 생산된 세포는 위성 세포 표현형을 나타낸다.
일부 구현예에서, 발현의 다운-조절은 세포 내로 발현의 억제제를 도입함으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 발현의 억제제는 miR, 프리-miR 또는 siRNA로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 다운-조절은 게놈 변경, 예컨대 CRISPR 또는 슬리핑 뷰티 기술에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 프로토콜 A 내지 E 중 적어도 하나를 수행한 후 프로토콜 1 내지 6 중 임의의 하나를 수행함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 프라이밍 한 후 프로토콜 1 내지 6 중 임의의 하나를 수행함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 MSC를 프라이밍한 후 상기 MSC를 하이브리드 세포로 분화시킴으로써 생산된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 줄기세포성 마커를 발현한다: SOX2, KLF4, OCT4 및 NANOG. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 줄기세포성 마커를 발현한다: SOX2, KLF4, OCT4 및 NANOG. 일부 구현예에서, 프로토콜 A 내지 E 중 임의의 하나를 포함하는 임의의 과정에 의해 생산된 본 발명의 세포는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 줄기세포성 마커를 발현한다: SOX2, KLF4, OCT4 및 NANOG. 일부 구현예에서, 프로토콜 A 내지 E 중 임의의 하나를 포함하는 임의의 과정에 의해 생산된 본 발명의 세포는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 줄기세포성 마커를 발현한다: SOX2, KLF4, OCT4 및 NANOG.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 VEGF, GDNF 및 IGF1로부터 선택된 적어도 하나의 영양 인자를 분비한다. 일부 구현예에서, 프로토콜 1 내지 6 중 임의의 하나를 포함하는 임의의 과정에 의해 생산된 본 발명의 세포는 VEGF, GDNF 및 IGF1로부터 선택된 적어도 하나의 영양 인자를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 본원에 기재된 프로토콜 중 적어도 하나를 수행하고 세포 내에서 MSC 표현형 및 근육 세포 표현형의 존재를 추가로 측정하거나 검출함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 검출은 MSC 단백질 마커의 존재를 검출함을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출은 근육 단백질 마커의 존재를 검출함을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 본원에 기재된 프로토콜 중 적어도 하나를 수행하고 MSC 표현형 및 근육 세포 표현형을 가진 것으로 확인된 세포를 추가로 선택함으로써 생산된다.
또 다른 양태에 의해, 본 발명은 본 발명의 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본원에 기재된 프로토콜 중 적어도 하나를 수행함을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 MSC 표현형 및 근육 세포 표현형을 포함하는 혼합된 특성의 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 프로토콜 1 내지 6 및 A 내지 E 중 적어도 하나를 수행함을 포함한다.
세포에 대한 첨가
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 세포의 표면 또는 세포의 세포외 소포의 표면 위에 근육 세포 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 근육 세포 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포 표적화 모이어티는 카베올린 3에 대한 리간드, M-카드헤린, 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 리간드, 미오스타틴의 돌연변이 우세 음성 형태, 및 안지오텐신 II 유형 1 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 미오스타틴 프로펩타이드의 우세한 음성 형은 미오스타틴의 C313Y 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 CD63 또는 CD81에 융합된 상기에 기재된 분자 중 임의의 하나를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 세포-표적화 모이어티는 M-카드헤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 근육 세포 표적화 모이어티는 형질감염에 의해 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 벡터 내에서 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 원형질 막내에서 발현하도록 도입된다. 일부 구현예에서, 원형질막 내 발현은 원형질막의 외면의 발현이다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 엑소좀 및 다른 세포외 소포의 막내에서 발현하도록 도입된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 근육 치료제이다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 약물, 판독 약물, RNA, DNA 분자, 벡터, 엑손 스킬링 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA(miR), 작은 간섭하는 RNA(siRNA) 안타고미르, 긴 비코딩 RNA(lncRNA) 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 RNA는 변형된 MyoD mRNA이다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 miR-424, miR-195, miR-16, miR-497, miR-135, miR-6793, miR-2, let-7, miR-133b 및 이들의 조합으로부터 선택된 miR의 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 항-miR-424, 항-miR-195, 항-miR-16, 항-miR-497, 항-miR-135, 항-miR-6793, 항-miR-21, 항-miR-133b 및 이들의 조합. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 항-let 7 및 항-miR-133b로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 항-let 7이다.
일부 구현예에서, 상기 약물은 옥시토신, 멜라토닌, G-CSF, 보르테조밉 및 메트포르민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 약물은 유트로핀의 발현을 증가시키는 약물이다.
일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 디스트로핀을 표적화하는 miR에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 miR에 하이브리드화한다: miR-606, miR-6893, miR-521, miR-3646 및 miR-214. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 항-miR-214이다. 일부 구현예에서, 세포는 항-miR-214, 및 마이크로디스트로핀 또는 디스트로핀을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스는 디스트로핀, 유트로핀, lncRNA, CCAT1, Hur 및 IGFBP123 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA를 수반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)이다. 일부 구현예에서, 상기 siRNA는 ALS와 관련된 SOD1의 돌연변이체 형에 대해 지향된다. 일부 구현예에서, 상기 siRNA는 ALS와 관련된 다른 돌연변이 유전자 또는 단백질에 대해 지향된다.
약제학적 조성물
또 다른 양태에 의해, 본 발명은 본 발명의 임의의 세포에 의해 분비된 단리된 세포외 소포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포외 소포는 엑소좀이다. 세포외 소포를 단리하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다.
또 다른 양태로서 다음 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다: 본 발명의 혼합된 특성의 세포, 본 발명의 세포외 소포, 및 이들의 조합. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가로, 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 아쥬반트를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "캐리어", "부형제", 또는 "아쥬반트"는 활성제가 아닌 약제학적 조성물의 임의의 성분을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 무독성의, 불활성 고체, 반-고체 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 임의의 유형의 제형 보조제, 또는 단순히 멸균된 수성 배지, 예컨대 염수를 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어로서 제공될 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스, 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분, 셀룰로스 및 그것의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트라가칸쓰; 맥아, 젤라틴, 탈크; 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 잇꽃 오일, 참께 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리올 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트, 한천; 완충제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 무발열원 물; 등장성 염수, 링거액; 에틸 알코올 및 포스페이트 완충 용액, 뿐만 아니라 약제학적 제형 속에 사용되는 다른 무독성 양립가능한 서브스턴스를 지칭한다. 본원의 캐리어로서 제공될 수 있는 서브스턴스의 일부 비-제한적인 예는 당, 전분, 셀룰로스 및 그것의 유도체, 분말화된 트라가칸쓰, 맥아, 젤라틴, 탈크, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 황산 칼슘, 식물성 오일, 폴리올, 알긴산, 무발열원 물, 등장성 염수, 포스페이트 완충 용액, 코코아 버터(좌약 베이스), 유화제 뿐만 아니라 다른 약제학적 제형 속에 사용되는 다른 무독성 약제학적으로 양립가능한 서브스턴스를 포함한다. 습윤제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트, 뿐만 아니라 착색제, 풍미제, 부형제, 안정화제, 산화방지제, 및 보존제 또한, 존재할 수 있다. 임의의 무독성, 불활성, 및 효과적인 캐리어를 사용하여 본원에 고려된 조성물을 제형화할 수 있다. 이와 관련하여 적합한 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제, 및 희석제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 예컨대 The Merck Index, Thirteenth Edition, Budavari et al., Eds., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (2001); the CTFA (Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association) International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Tenth Edition (2004); and the "Inactive Ingredient Guide," U.S. Food and Drug Administration (FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Office of Management에 기재된 것들이고, 이들 모두의 내용은 그 전문이 참고로 본원에 편입된다. 본 조성물에 유용한 약제학적으로 허용가능한 부형제, 캐리어 및 희석제의 예는 증류수, 생리적 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 한스 용액(Hank's solution), 및 DMSO를 포함한다. 이들 추가의 불활성 성분 뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당해 분야에서 잘 알려져 있고, Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Gilman et al. Eds. Pergamon Press (1990); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., (2005)와 같은 표준 교재에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 편입된다. 현재 기재된 조성물은 또한, 인공적으로 생성된 구조, 예컨대 리포좀, ISCOMS, 느린-방출 입자, 및 혈청 속에서 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 다른 비히클을 함유할 수 있다. 리포좀은 에멀젼, 포움, 미셀(micelies), 불용성 단일층, 액체 결정, 인지질 분산물, 라멜라 층 및 기타 동종의 것을 포함한다. 현재 기재된 펩타이드와 함께 사용하기 위한 리포좀은 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 일반적으로 포함하는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 고려 사항들, 예컨대 리포좀 크기 및 혈액 속의 안정성에 의해 일반적으로 결정된다. 여러 가지의 방법이 예를 들어, Coligan, J. E. et al, Current Protocols in Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., New York에 의해 검토된 바와 같이 리포좀을 제조하는데 이용가능하며, 또한 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호를 참고한다.
상기 캐리어는 본원에 나타낸 약제학적 조성물의 총, 약 0.1 중량% 내지 약 99.99999 중량%를 포함할 수 있다.
혼합된 특성의 세포를 포함하는 치료 방법
또 다른 양태에 의해, 필요로 하는 대상체에서 근육-관련된 질환 또는 근육 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써, 근육-관련된 질환 또는 근육 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 의해 근육-관련된 질환 또는 근육 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는데 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에 의해 근육-관련된 질환 또는 근육 손상을 치료, 예방 또는 완화를 위한 본 발명의 약제학적 조성물의 용도가 제공된다. 또 다른 양태에 의해, 근육-관련된 질환 또는 근육 손상을 치료, 예방 또는 완화에 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 상기 대상체에 대해 동종 이계 또는 자가조직인 MSC로부터 유래된 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 근육 재생을 증가시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 섬유증을 감소시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 근육내에서 유트로핀의 발현을 증가시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 근육내에서 디스트로핀의 발현을 증가시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 완화하는 또는 완화는 대상체 내에서 증상의 개시를 지연시킴을 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 본 발명의 약제학적 조성물을 근육 세포에 투여함으로써 근육 세포 내에서 유트로핀 또는 디스트로핀의 발현을 증가시킴을 포함하여, 근육 세포 내에서 유트로핀 또는 디스트로핀의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에 의해, 근육 세포 내에서 유트로핀 또는 디스트로핀의 발현을 증가시키는데 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 근육 세포는 배양물 속에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 세포는 대상체 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재한다.
또 다른 양태에 의해, 필요로 하는 대상체에서 근육 생성을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여함으로써, 그것을 필요로 하는 대상체 내에서 근육 재생을 증가시킴을 포함한다. 또 다른 양태에 의해 근육 생성을 증가시키는데 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 근육 생성은 근육 재생이다. 일부 구현예에서, 상기 근육은 배양물 속에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 근육은 대상체 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 근육은 시험관내 또는 생체내에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "근육-관련된 질환"은 근육 성분을 가지는 것 외에, 또는 근육 기능 또는 건강에 영향을 미치는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 근육 증상과 관련된 질환은 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, 몇 개만 예로 들면, 근육 자체의 질환, 골격의 질환, 근육을 약하게 하는 뉴런의 질환, 미토콘드리아 질환, 및 에너지 항상성 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육-관련된 질환 또는 손상은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 운동 뉴런 질환, 주변 뉴런 질환, 근이영양증, 척수 손상, 근육 소모, 심장 근육 손상, 심장 섬유증, 염증성 근병증, 중증 근무력증, 근육감소증, 악액질, 및 골격 근육 손상. 일부 구현예에서, 근육-관련된 질환은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 근위축 측삭 경화증(ALS), 악액질, 심장 섬유증, 및 근이영양증. 일부 구현예에서, 근이영양증은 뒤센느 근이영양증(DMD)이다.
일부 구현예에서, 근육-관련된 질환은 ALS이며 본 방법은 추가로, 별아교세포 표현형 또는 뉴런의 줄기 세포(NSC) 표현형을 향해 분화된 적어도 하나의 MSC를 투여하는 단계를 포함한다. MSC는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 많은 방법에 의해 분화될 수 있다. 일부 구현예에서, 별아교세포 표현형으로의 분화는 미국 특허출원 제US20150037298호에 기재된 바와 같이 수행된다. 일부 구현예에서, NSC 표현형으로의 분화는 미국 특허출원 제US20150037299호에 기재된 바와 같이 수행된다.
일부 구현예에서, 근육-관련된 질환은 DMD이고, 본 방법은 추가로, 미분화된 MSC, 미분화된 MSC의 세포외 소포, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포 또는 그것의 세포외 소포는 상기 대상체의 적절한 신체 영역을 충격파, 집중적인 초음파 또는 저 레이저 요법에 노출시킴으로써 골격 근육, 심장, 또는 횡격막에 대해 표적화된다.
또 다른 양태에 의해, 필요로 하는 대상체 내로 세포의 생착을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물, 비변형된 MSC를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 상기 세포와 함께 공-투여함으로써, 세포의 생착을 증가시킴을 포함한다. 또 다른 양태에 의해, 세포의 생착을 증가시키는데 사용하기 위한, 본 발명의 혼합된 특성의 세포, 비변형된 MSC, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 대상체에 대해 동종 또는 자가조직이다. 일부 구현예에서, 비변형된 MSC는 탯줄 또는 융모막 태반으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 비변형된 MSC는 융모막 태반으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 그라프팅될 세포는 근아세포, 위성 세포, 메소혈관모세포(mesangioblast), 심장 줄기 세포, 별아교세포 및 뉴런의 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 그라프팅될 세포는 근아세포, 위성 세포, 별아교세포 및 뉴런의 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 투여된 MSC 또는 혼합된 특성의 세포 대 생착 세포의 비는 1:1 내지 2:1이다.
또 다른 양태에 의해서, 본 발명의 약제학적 조성물, 비변형된 MSC, 비변형된 MSC로부터 유래된 엑소좀, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 근육 세포에 투여함으로써 근육 세포 내에서 유트로핀 또는 디스트로핀의 발현을 증가시킴을 포함하여, 근육 세포 내에서 유트로핀 또는 디스트로핀의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에 의해서 근육 세포 내에서 유트로핀 또는 디스트로핀의 발현을 증가시키는데 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물, 비변형된 MSC, 비변형된 MSC로부터 유래된 엑소좀, 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 근육 세포는 배양물 속에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 세포는 대상체 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 비변형된 MSC는 탯줄 또는 융모막 태반으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 비변형된 MSC는 융모막 태반으로부터 유래된다.
본 발명의 키트(kit)
또 다른 양태에 의해, MSC 배지 및 적어도 하나의 분화 제제를 포함하는 키트가 제공된다. 또 다른 양태에 의해, 탯줄 MSC 또는 융모막 MSC 및 적어도 하나의 분화 제제를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 MSC 배지를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 의해, 본 발명의 혼합된 특성의 세포, 본 발명의 단리된 세포외 소포, 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 키트가 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "분화 제제"는 프로토콜 A 내지 E 및 1 내지 6에서 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 서브스턴스를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 키트는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 분화 제제를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, 분화 제제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 줄기세포성 인자, ROCK 억제제, STAT3 활성제, NF-KB 활성제, CHIR99021, 메트포르민, 트라닐사이프로민, Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A, mTor 억제제, TGFβ 억제제, 티아조비빈, A83-01, LiCl, SB431542, 5-AZA, 라파마이신, ERK 활성제, 발포르 산. 일부 구현예에서, 줄기세포성 인자는 NANOG, SOX2, KLF4, OCT4 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 분화 제제는 성장 인자, lncRNA, 전사 인자 및 miR로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 성장 인자는 HGF, PDGFβ, PDGFAA, PDGFBB, EGF, VEGF, TGFβ IGF1 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 전사 인자는 MYF5, PAX3, PAX7, MyoD 및 PAX3, MyoD 및 PAX7, 및 MyoD 및 MYF5로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 분화 제제는 근육 세포, 근육 세포 엑소좀, 디스트로핀, 마이크로디스트로핀, 및 유트로핀으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 lncRNA는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: PCAT1, NEAT1, GAS5, BIL, PAR5, BIC, DISC2, GAS5DLG2AS, 7SK, Y1, LINCRNA, SFMBT2, Y4, SCA8, MALAT1, MEG3, EGO, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19. 일부 구현예에서, 상기 lncRNA는 PAR5, DISC2 및 PCAT1으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 miR은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: miR-10b, miR-22, miR-122, miR-125a, miR-140-5p, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-148b, miR-150, miR-155, miR-181b, miR-215, miR-296, miR-330, miR-370, miR-429, miR-520, miR-524, miR-543, miR-550, miR-561, miR-564, miR-582, miR-583, miR-587, miR-613, miR-614, miR-629, miR-634, miR-645, miR-646, miR-649, miR-661, miR-662, miR-663, miR-665, miR-668, miR-671, miR-887, miR-1183, miR-1224, miR-1225, miR-1228, miR-1234, miR-1246, miR-1247, miR-1257, miR-1258, miR-1268, miR-1269, miR-1289, miR-1287, miR-1909, miR-1911, miR-759, miR-3150, miR-3174, miR-3180, miR-3191, miR-3197, miR-4292, miR-2115, miR-4312, miR-92, 93 및 miR-99. 일부 구현예에서, 상기 miR은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: miR-10b, miR-138, miR-154, miR-155, miR-181, miR-215, miR-614, 및 miR-668.
일부 구현예에서, 상기 키트는 근육 세포-표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 세포 표적화 모이어티는 다음 중 임의의 하나를 포함한다: 카베올린 3에 대한 리간드, M-카드헤린, 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 리간드, 미오스타틴의 돌연변이 우세 음성 형태, 및 안지오텐신 II 유형 1. 일부 구현예에서, 미오스타틴 프로펩타이드의 우세한 음성형은 미오스타틴의 C313Y 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표적화 모이어티는 CD63 또는 CD81에 융합된 상기에 기재된 분자 중 임의의 하나를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 근육 세포-표적화 모이어티는 M-카드헤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 또한 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 근육 치료제이다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 약물, 판독 약물, RNA, DNA 분자, 벡터, 엑손 스킬링 올리고뉴클레오타이드, 마이크로RNA(miR), 작은 간섭하는 RNA(siRNA) 안타고미르, 긴 비코딩 RNA(lncRNA) 및 바이러스.
일부 구현예에서, 상기 RNA는 변형된 MyoD mRNA이다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 다음으로부터 선택된 miR의 억제제이다: miR-424, miR-195, miR-16, miR-497, miR-135, miR-6793, miR-2, let-7, miR-133b 및 이들의 조합. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 항-miR-424, 항-miR-195, 항-miR-16, 항-miR-497, 항-miR-135, 항-miR-6793, 항-miR-21, 항-miR-133b 및 이들의 조합. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 항-let 7 및 항-miR-133b로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 항-let 7이다.
일부 구현예에서, 상기 약물은 옥시토신, 멜라토닌, G-CSF, 보르테조밉 및 메트포르민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 약물은 유트로핀의 발현을 증가시키는 약물이다.
일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 디스트로핀을 표적화하는 miR에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 miR에 하이브리드화한다: miR-606, miR-6893, miR-521, miR-3646 및 miR-214. 일부 구현예에서, 상기 안타고미르는 항-miR-214이다. 일부 구현예에서, 세포는 항-miR-214, 및 마이크로 디스트로핀 또는 디스트로핀을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 바이러스는 다음 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA를 수반하는 아데노 관련된 바이러스(AAV)이다: 디스트로핀, 유트로핀, lncRNA, CCAT1, Hur 및 IGFBP123. 일부 구현예에서, 상기 siRNA는 ALS와 관련된 SOD1의 돌연변이체 형에 대해 지향된다. 일부 구현예에서, 상기 siRNA는 ALS와 관련된 다른 돌연변이 유전자 또는 단백질에 대해 지향된다.
비변형된 MSC를 포함하는 치료 방법
또 다른 양태에 의해, 근이영양증, 섬유증, 또는 악액질을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 방법에 제공되며, 상기 방법은 미분화된 MSC, 미분화된 MSC의 세포외 소포 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에 의해, 근이영양증, 섬유증, 또는 악액질을 치료하거나, 예방하거나 완화하는데 사용하기 위한 미분화된 MSC, 미분화된 MSC의 세포외 소포 또는 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에 의해, 근이영양증, 섬유증, 또는 악액질의 치료, 예방 또는 완화에 사용하기 위한 미분화된 MSC, 미분화된 MSC의 세포외 소포 또는 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 MSC는 탯줄 또는 융모막 태반으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 MSC는 융모막 태반으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 근이영양증은 DMD이다. 일부 구현예에서, 섬유증은 심장 섬유증이다.
융모막 MSC는 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 융모막 MSC 또는 그것의 분비된 소포는 하기 중 임의의 것의 발현을 시험함으로써 확인될 수 있다: a) SCA8, TU00176, LINC-VLDLR 및 선택적으로 ROR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 긴 비-코딩 RNA(lncRNA); b) mir-3163, mir-128, mir-27a, mir-27b, mir-148a, mir-148b, mir-152, mir-651, mir-9, mir-466, mir-577, mir-380, mir-2909, mir-4803, mir-556-3p, mir-182, mir-4677-5p, mir-4672, mir-3942-5p, mir-4703-5p, mir-4765, mir-4291, mir-144, mir-1206, mir-4435, mir-452, mir-4676-3p, mir-25, mir-32, mir-363, mir-367, mir-92a, mir-92b, mir-340, mir-3620, mir-4324, mir-4789-5p, mir-346, mir-944, mir-3180-5p, mir-202, mir-511, mir-4326, mir-578, mir-4312, mir-4282, mir-597, mir-3689d, mir-2116, mir-4517, mir-199a-3p, mir-199b-3p, mir-3129-5p, mir-520d-5p, mir-524-5p, mir-203, mir-3942-3p, mir-501-5p, mir-143, mir-4770, mir-4422, mir-4495, mir-1271, mir-96, mir-1297, mir-26a, mir-26b, mir-4465, mir-4273, mir-1294, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i, mir-4458, mir-4500, mir-98, mir-4652-3p, mir-4716-5p, mir-513a-5p, mir-223, mir-4288, mir-455-5p, mir-632, mir-4477b, mir-142-3p, mir-561, mir-4698, mir-3140-3p, mir-3662, mir-410, mir-376a, mir-376b, mir-1270, mir-620, mir-515-5p, mir-875-5p, mir-140-5p, mir-4256, mir-30a, mir-30b, mir-30c, mir-30d, mir-30e, mir-4254, mir-515-3p, mir-519e, mir-2964a-5p, mir-2115, mir-520a-5p, mir-525-5p, mir-1244, mir-3190, mir-548a-5p, mir-548ab, mir-548ak, mir-548b-5p, mir-548c-5p, mir-548d-5p, mir-548h, mir-548i, mir-548j, mir-548w, mir-548y, mir-559, mir-2681, mir-3671, mir-375, mir-4789-3p, mir-3143, mir-125a-5p, mir-125b, mir-4319, mir-5096, mir-338-5p, mir-493, mir-3153, mir-875-3p, mir-516a-3p, mir-323-3p, mir-3065-5p, mir-4762-3p, mir-3617, mir-641, mir-124, mir-506, mir-4531, mir-4512, mir-570, mir-4679, mir-3144-3p, mir-4777-3p, mir-4732-3p, mir-3177-5p, mir-548n, mir-4328, mir-2355-3p, mir-4330, mir-4524, mir-4719, mir-3976, mir-544, mir-3607-3p, mir-581, mir-205, mir-4731-3p, mir-4801, mir-3667-5p, mir-1245b-3p, mir-4760-3p, mir-137, mir-3194-3p, mir-342-3p, mir-2682, mir-449c, mir-532-3p, mir-4305, mir-1, mir-206, mir-613, mir-676, mir-1296, mir-196a, mir-196b, mir-3941, mir-4795-3p, mir-431, mir-607, mir-548k, mir-4464, mir-4748, mir-654-3p, mir-544b, mir-3074-5p, mir-3115, mir-4635, mir-4323, mir-548t, mir-4680-5p, mir-133a, mir-133b, mir-600, mir-1208, mir-4708-5p, mir-3123, mir-4251, mir-4307, mir-3185, mir-582-5p, mir-4436b-3p, mir-378, has, mir-378b, mir-378c, mir-378d, mir-378e, mir-378f, mir-378h, mir-378i, mir-422a, mir-4460, mir-200b, mir-200c, mir-429, mir-4470, mir, 1245b-5p, mir-3142, mir-576-3p, mir-548m, mir-4666-3p, mir-325, mir-330-3p, mir-3690, mir-548a-3p, mir-548e, mir-548f, mir-4709-5p, mir-532-5p, mir-539, mir-4303, mir-4302, mir-300, mir-381, mir-4645-3p, mir-3910, mir-1301, mir-5047, mir-188-5p, mir-3974, mir-3923, mir-3686, mir-670, mir-2052, mir-548al, mir-3200-3p, mir-4686, has, mir-3545-5p, mir-194, mir-498, mir-3913-3p, mir-3168, mir-499-3p, mir-499a-3p, mir-656, mir-4762-5p, mir-4496, mir-141, mir-200a, mir-3529, mir-379, mir-3691-3p, mir-520f, mir-503, mir-4477a, mir-513a-3p, mir-3149, mir-3927, mir-1283, mir-4767, mir-487b, mir-4637, mir-19a, mir-19b, mir-4683, mir-548an, mir-1200, mir-4638-3p, mir-1825, mir-522, miR-24, miR-22-3p, miR-92, miR-378, miR-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA; c) HGF, wnt2, GDNF, 오스테오프로테그린, MIP3α, NT-3, IL-6, IL-8, FGF7, NT-4, EGFL6 및 선택적으로 LIF 및 BDNF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분비된 인자; d) TCR 알파-베타, CD55, LIFR, 및 ST6GALNACS로부터 선택된 하나 이상의 표면 마커; e) 저 YKL40 및 KLF4로부터 선택된 하나 이상의 줄기세포성 및 간엽 마커; f) COL4A2, LGALS3, SCUBE1, LGAS3, 및 S100A10로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 MSC-유래된 소포 발현; g) BCMS, BIC, 및 선택적으로 HAR1B으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 lncRNA의 MSC-유래된 소포 발현; 및 h) 이들의 조합.
일부 구현예에서, 융모막 MSC는 또한, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 세포-유래된 소포에 의해 확인될 수 있다: CASK, COL3A1, B2M, CDH2, CTNNA1, DLG1, EGFR, F3, FARP1, GPC1, CDH2, CTNNA1, HAPLN1, LAMB1, LAMB2, LAMPC1, LGALS3BP, LOXL2, MCAM, NID1, OLXNB2, S100A6, TNC, WNT5A, 및 PLXNB2.
또 다른 양태에 의해, 필요로 하는 대상체에서 ALS를 치료하거나, 예방하거나 완화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 별아교세포 표현형을 향해 분화된 MSC, 뉴런의 줄기 세포 표현형을 향해 분화된 MSC 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에 의해, ALS를 치료하거나, 예방하거나 완화하는데 사용하기 위한 별아교세포 표현형을 향해 분화된 MSC, 뉴런의 줄기 세포 표현형을 향해 분화된 MSC 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에 의해, ALS의 치료, 예방 또는 완화에 사용하기 위한 별아교세포 표현형을 향해 분화된 MSC, 뉴런의 줄기 세포 표현형을 향해 분화된 MSC 및 이들의 조합 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 MSC는 탯줄 또는 융모막 태반으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 MSC는 융모막 태반으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 근육 재생을 증가시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 섬유증을 감소시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 근육내에서 유트로핀의 발현을 증가시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 근육내에서 디스트로핀의 발현을 증가시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 완화하는 또는 완화는 대상체내에서 증상의 개시를 지연시킴을 포함한다.
일부 구현예에서, 비처리된 MSC를 포함하는 방법은 상기 본 명세서에서 기재된 바와 같이 근육 세포-표적화 모이어티를 포함하는 MSC를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 비처리된 MSC를 포함하는 상기 방법은 상기 본 명세서에서 기재된 바와 같이 치료제를 포함하는 MSC를 사용하여 수행된다.
또 다른 양태에 의해, 필요로 하는 대상체에서 악액질을 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체의 혈청으로부터 엑소좀을 제공하는 단계, 엑소좀을 인간 불멸화된 세포주와 함께 인큐베이팅하는 단계, 및 세포사, 및 미오신 중쇄 발현 중 하나를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 세포사에 있어서의 증가 또는 미오신 중쇄 발현에 있어서의 감소는 상기 대상체가 악액질을 가짐을 나타낸다.
또 다른 양태에 의해, 대상체에서 악액질성 엑소좀을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체의 혈청으로부터 엑소좀을 제공하는 단계, 엑소좀을 인간 불멸화된 세포주와 함께 인큐베이팅하는 단계, 및 세포사, 및 미오신 중쇄 발현 중 하나를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 세포사에 있어서의 증가 또는 미오신 중쇄 발현에 있어서의 감소는 상기 대상체 내에서 악액질성 엑소좀의 존재를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 특정 용어들의 정의가 본원에 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 일반적으로 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에서 기재된 것에 대해 유사하거나 등가인 많은 방법 및 물질을 인식할 것이며, 이는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 사실상, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 제한되지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 내용이 분명히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "하나의 핵산"에 대한 참고는 2 개 이상의 핵산, 및 유사물의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약"은 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 것이며 이것이 사용된 문맥에 따라 어느 정도까지 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명확하지 않은 용어가 사용된 경우, 이것이 사용된 문맥을 고려하여, "약"은 열거된 값의 플러스 또는 마이너스 10 %까지를 의미할 것이다.
본 발명의 추가의 목적, 이점, 및 신규한 특징은, 제한하는 것으로 의도되지 않은 하기 실시예의 시험시 당해 기술 분야에서 통상적으로 숙련된 자에게 명백할 것이다. 추가로, 상기에서 기술되고 아래 청구항 부분에서 청구된 바와 같은 본 발명의 각각의 다양한 구현예 및 양태는 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침될 것이다.
실시예
물질 및 방법
태반-유래된 MSC의 제조
태반 및 탯줄 MSC를 인간, 갯과 및 말로부터 하기 프로토콜에 의해 단리하였다: 조직을 PBS로 세정하였다. 양막 및 융모막을 작은 조각으로 기계적으로 단편화한 후 2 단계로 효소적 소화에 적용시켰다. (1) 0.25 % 트립신/EDTA와 함께 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 상피 세포를 제거한다. (2) 0.1 % 콜라겐 분해효소 IV로 60 분 동안 37 ℃에서 처리한 후 소 태아 혈청으로 불활성화한다. 이후에, 세포 현탁액을 100 μM 필터를 통해 여과하고 원심분리된 세포를 75 cm2 코닝 플라스크(Corning flask) 속에 15 % 소태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 이루어진 DMED 배지/영양소 혼합물 F-12 (DMEM/F12) 속에 씨딩하였다. 대안적으로, 세포를 무혈청 MSC 배지 속에 유지시켰다. 유사한 절차를 탯줄로부터의 MSC의 제조에 대해 이용하였다. 2 주 후, 세포를 Rock 억제제와 함께 1 일 동안 인큐베이션한 후 저산소 조건 속에서 추가 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 엑소좀이 궁핍한 배지 속에 유지시켰다.
엑소좀 단리
세포 배양 배지로부터의 엑소좀 단리는 4 ℃에서 다단계 원심분리에 의해 수행되었다. 간단히, 배지를 10,000xg에서 30 분 동안 원심분리하여 큰 잔해를 제거한 후 0.22 μM 필터를 통해 여과하여 작은 세포 잔해를 제거하였다. 이후에, 상청액을 100,000xg에서 1 내지 2 시간 동안 원심분리하였다. 엑소좀을 전자 현미경 및 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 CD63, CD9 및 ALIX의 발현으로 확인하였다. 엑소좀의 정량화는 총 단백질 농도의 측정 및 CD63 ELISA(SBI)에 의해 분석되었다.
qRT PCR
총 RNA를 RNeasy 미디 키트를 사용하여 제조자의 지침(Qiagen)에 따라 추출하였다. 역전사 반응을 총 2 ㎍의 RNA를 사용하여 수행하였다. 프라이머 최적화 단계는 각각의 프라이머 세트에 대해 테스트하여 최적의 프라이머 농도를 측정하였다. 프라이머, 25 μ의 2x SYBR 녹색 마스터 믹스(Master Mix)(Invitrogen), 및 30 내지 100 ng cDNA 샘플을 총 용적 50 μL의 PCR 증폭 용액 속에 재현탁시켰다. 사용된 프라이머를 표 1에 열거하였다. 반응을 ABI Prism 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티)에서 작동시켰다. 사이클 역치(Ct) 값을 ABI 7000 소프트웨어로부터 수득하였다. S12 또는 β-액틴 수준을 또한 대조군으로서 각각의 RNA 샘플에 대해 측정하였다.
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표면 마커 분석
표면 마커 발현을 FACS 분석으로 측정하였다. 세포를 0.25 % 트립신-EDTA (Life Technologies)을 사용하여 해리시키거나 플레이트로부터 수집하고 칼슘 및 마그네슘이 들어있지 않은 포스페이트 완충 염수 속에 재현탁시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 3 x 105 개의 세포를 MSC 아이소타입 칵테일(Miltenyi Biotec) 및 인간 MSC 기능적 ID 키트(R&D 시스템)를 사용한 염색에 사용하였으며, 이는 양성(CD73-APC, CD90-FITC, CD105-PE) 및 음성(CD34/CD45/CD14/CD20-PerCp) 항체 둘 다를 포함한다. 상기 세포를 항체와 함께 30 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션하고, PBS로 3회 세정하고 0.5 ml PBS에서 재현탁시켰다. 세포를 FACS Aria III 기기(BD BioSciences)에서 분석하였다.
신규한 근육 섬유 계수
마우스에게 PBS로 25 μl의 심장독을 그것의 TA 근육에 주사하고 7 일 후 희생시켰다. 근육을 해부하고 배아 미오신 중쇄(MYH1)에 대해 염색하여, 중심으로 위치한 핵을 지닌 MYH1에 대해 양성인 세포를 새로 생성된 근육으로서 기록하였다. 대안적으로, MyoD 및 Pax7에 대해 이중 양성인 세포를 비대칭으로 분열하는 위성 세포로 고려하고 NCAM에 대해 양성인 세포를 재생 세포로 고려한다.
엑소좀 장입
MSC를 렌티바이러스 감염, 또는 silMporter(밀리포어)를 사용한 형질감염에 의해 장입될 분자(miR, siRNA, pre-miR, shRNA, 변형된 mRNA)로 형질도입시켰다. 다음에 엑소좀을 단리하고(상기 참조) 검사하여 장입된 분자의 발현을 확인하였다.
동시-이식
생착을 위한 인간 세포는 mCherry 또는 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키거나 Qtracker 655 세포 라벨링 키트(Thermo)를 사용하여 Qdot 655 나노결정으로 장입하였다. 이후에 표지된 세포를 MSC와 1:1 내지 2:1(더 많이 표지된 세포)의 비로 혼합하였다. 1x105 개의 MSC를 항상 사용하였다.
근육 세포 표적화 모이어티
CH-MSC를 M-카드헤린으로 형질감염시키고 상기 세포들로부터 엑소좀을 수집(상기 참고)하여 형광 염료로 표지하고 분석하여 형광을 확인하였다. 이후에, 상기 엑소좀을 배양물 속의 인간 근육 세포 및 인간 별아교세포에 투여하였다. 28 시간 후, 세포를 세정하여 흡수되지 않은 엑소좀을 제거하고, 형광 세포(엑소좀을 취한)의 수를 측정하였다.
실시예 1: MSC는 재생을 증가시키고 섬유증을 감소시킨다.
MSC가 근육 건강을 달성하는 근본적인 기전이 충분히 이해되지 않았지만 근육 이영양증에 대한 가능한 치료로서 다양한 조직으로부터 간엽 줄기 세포(MSC)의 용도가 제안되어 왔다(Markert CD, et al., 2009, PM&R, 1(6): 547-559; Rajput BS. et al., 2015, Journal of Stem Cells, 10(2): 141-156; Li P, et al., 2015, International Journal of Molecular Medicine, 35(4): 1051-1057). Mdx 마우스는 뒤센의 근이영양증(DMD)의 동물 모델로서 널리 사용된다. mdx 마우스 내에서 근육 기능에 있어서 최적의 치료 효과를 갖는 MSC 공급원을 확인하기 위하여, 골수(BM), 지방 조직(AD), 탯줄(UC) 및 태반의 양막(AM) 및 융모막(CH)로부터 유도된 MSC, 또는 CD34+ 조혈 선조 세포를 mdx 마우스의 사두근내로 주사(주사 당 5x105 세포)하고, 재생 및 섬유증과 관련된 몇 가지 주요 인자의 발현을 4주 후 검사하였다.
모든 테스트된 세포 유형은 세포 재생의 2개의 마커: 배아 미오신 중쇄(MYH1, ~4 배수 증가, 데이터 도시되지 않음), 및 NCAM의 사두근내 mRNA 발현에 있어서 유의미한 증가를 유도하였다(도 1a 및 1b). 또한, UC- 및 CH-MSC는 디스트로핀을 기능적으로 대체할 수 있는 단백질인, 유트로핀의 발현을 상당히 증가시켰으며(도 1a-1c), 따라서 mdx 마우스 및 이론적으로 DMD 환자에서 치료 효과를 발휘한다. BM-, AD- 및 AM-MSC는 유트로핀 발현에 있어서 통계적으로 유의미한 증가가 아닌 단지 매우 작게 유발하였다. VEGF 및 HIF1α의 수준 또한 증가하였다(도 1a). 추가로, UC- 및 CH-MSC는 섬유증의 마커인, 콜라겐 I의 발현을 횡격막 및 심장 내에서 현저히 감소시킨 반면, BM-, AD- 및 AM-MSC는 효과가 없었다(도 1a-b 및 d). 마지막으로, UC-MSC 및 HC-MSC 둘 다는 염증성 마커, 예컨대 TNFα 및 INFγ의 발현을 감소시킨 반면(도 1b), 보다 낮은 효과가 BM 및 AD-유래된 MSC로 관찰되었다.
근육 세포는 간엽 계통의 일부이므로, MSC의 치료 가치가 이들이 물리적으로 근육 신시티움의 일부가 되어 세포 대체로서 작용하는 것으로부터 올 수 있음이 가능하다. 그러나, MSC는 또한 근육에 있어서 그것의 효과를 매개할 수 있는 큰 세크로톰(secretome)을 갖는다. mdx 마우스에서 관측된 유전자 발현 변화가 주로 MSC 융합에 기인하는지 또는 오히려 분비된 인자에 기인하는지를 시험하기 위하여, 엑소좀을 5x105 개의 UC- 또는 CH-MSC로부터 정제하고 MDX 마우스의 사두근 내로 주사하였다. 약간 감소되었지만, 동일한 유전자 발현 변화가 엑소좀 만을 주사한 경우 시험된 4 개의 유전자 모두에서 관찰되었으며(도 1b), 또한 사두근에서 재생의 양이 상당히 증가하였다(도 1e). 이는 세포 대체가 MSC에 의해 부여된 치료 이점의 주요 공급원이 아님을 나타낸다.
마우스 세포주 C2C12 및 인간 근육 세포를 사용한 시험관내 실험은 MSC에 의해 야기된 발현 변화를 확인하였다. 인간 근육 세포와 MSC의 트랜스-웰 플레이트에서의 공-배양은 UC- 및 CH-MSC 만이 유트로핀 발현을 증가시켰음을 나타내었다(도 1f). 이들 세포로부터의 엑소좀 또한 그러하였다. 근육 세포 분화는 또한 근관의 형성(도 1g) 및 미오신 중쇄 2의 발현(도 1h)에 의해 각각 측정된 바와 같이, AD-, CH-, 및 UC-MSCS 및 그것의 엑소좀에 의해 증가되었다. 그러나, DMD 환자로부터의 근육 세포를 MSC와 함께 공배양한 경우 CH- 및 UC-MSC 만이 근관의 형성을 증가시켰다(도 1i). 인간 위성 세포와 UC- 및 CH-MSC, 및 그것의 엑소좀과의 공배양은, BM-MSC는 그렇지 않았지만, 비대칭 분할(MyoD 발현)을 증가시켰다(도 1j). 그리고C2C12 마우스 근육 세포와의 공배양은 유사한 결과를 나타내었다(도 1k).
실시예 2: MSC는 근육 세포 생착의 효능을 증가시킨다
MSC는 그것의 세포 표면에서 MHCII 분자를 발현하지 않으므로 이식체 세포로서 잘 용인된다. 또한, MSC는 내성을 추가로 증진시키는 면역억제를 초래하는 이식수여자(transplantee)에서 면역조절 효과를 갖는다. 많은 근육 질환, 근육 이영양증 및 근육 손상이 근육 세포 대체 요법으로 치료될 수 있음이 제안되었으나, 이러한 요법은 이식체의 거부로 인하여 달성하기 어려운 것으로 입증되었다. 따라서 MSC(CH 및 UC)가, 이식체 속에 포함된 경우 거부를 감소시키고 외부 세포의 생착을 증가시킬 수 있는지를 시험하였다. 일반적으로, 및 하기 실험을 통해서, CH 또는 UC MSC는 이들이 최대의 치료 잠재성 및 근육생성 잠재성을 나타내었으므로 항상 사용되었다. 융모막 및 양막 조직 외에 태반의 다른 부위, 예컨대 태반 융모를 시험하였으나, 융모막이 한 치료 잠재성을 나타낸 영역은 없었다.
MSC를 형광 적혈구 트래커(tracker)로 표지된 인간 근육 세포와 함께 야생형 마우스의 앞정강 동맥(TA) 근육 내로 동시-이식하였다. 2 주 후, 근육내 적색 형광의 수준을 현미경으로 측정하고, 근아세포 생착 및 위성 세포 생착 둘 다를 검사하였다. 임의의 MSC의 부재하에서 이식체와 비교한 것으로서, UC- 및 CH-MSC 둘 다 근아세포 및 위성 세포의 생착을 상당히 증가시켰다(도 2). 차이가 통계적으로 유의미하지는 않지만, UC-MSC 동시-이식은 근아세포의 더 나은 생착을 야기한 반면, CH-MSC 동시-이식은 위성 세포의 더 나은 생착을 야기한 것으로 관측되었다. 유사한 결과가 이식 후 4 주째에 또한 관측되었다.
인간 별아교세포 및 신경 줄기 세포(NSC)의 이식을 또한 시험하였다. UC-MSC 또는 CH-MSC를 척추강내로 형광 적색 표지된 세포와 함께 동시-이식하고 척수내 적색 형광을 별개의 실험에서 2 주 및 4주 후 측정하였다. 별아교세포의 이식 후 적색 형광의 수준은 UC-MSC의 경우 4.55(±0.67) 및 CH-MSC의 경우 3.89(±0.54)이었으며 유사한 결과가 NSC의 이식의 경우 발견되었다(대조군 형광은 1로 설정됨). 이들 실험을 MDX 마우스 뿐만 아니라 근위축 측삭 경화증(ALS)에 대한 랫트 모델에서 반복하였으며 모든 경우에 MSC를 사용한 동시-이식은 근육 세포 생착을 증진시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3: 근육 분화를 위해 프라이밍된 MSC
근육 재생을 유도하고, 근육 섬유증을 감소시키며 주변분비 효과를 통해 이식을 증가시키는 MSC의 능력의 측면에서, MSC의 치료 효과를 보충하는 방법을 개발하였다. "근육생성 프라이밍"으로 불리는 이러한 방법은 한편으로 근육 세포에서 세포의 주변분비 효과를 증가시키고 다른 한편으로 근육 세포로 MSC 자체의 분화를 촉진시켰다. 이러한 프라이밍은 비대칭 분할을 겪는 위성 세포로 및 존재하는 근육 섬유와 융합하여 디스트로핀을 세포로 전달하는 근아 세포로 분화하는 MSC의 능력을 증가시켰다. 세포 내에서 MyoD 발현을 유도하는 것은 프라이밍의 하나의 방법이 될 수 있다는 가설을 세웠다. 이는 MyoD-GFP 리포터를 함유하는 CH- 및 UC-MSC를 인간 근육 세포가 들어있는 트랜스-웰 플레이트 속에서 배양함으로써 시험하였다(프로토콜 A). 이런 식으로, 근육 세포로부터 세포외 소포 및 분비된 인자는 MSC와 접촉할 수 있었다. 3-일 인큐베이션은 근육 세포에 노출되지 않았던 대조군 세포와 비교하여 MyoD 발현에 있어서 2-배 더 큰 증가를 초래하였다(도 3).
근육 세포와의 공-배양 외에, 후속적인 인자에 대한 반응하여 그것의 근육 분화 능력을 증가시키기 위해 MSC에서 일시적인 줄기 세포 특징을 유도하는 다양한 방법을 사용하였다. 공-배양 전에 변형된 Nanog mRNA(그와 같은 mRNA는 세포질 내에서 안정하며 즉시 번역될 수 있다)을 사용한 MSC의 형질감염은, 5-아자시티딘 (5-AZA)과 MSC의 1 일 인큐베이션에서 그랬던 바와 같이(프로토콜 C), myoD 발현을 증가시켰다(프로토콜 B). 이러한 효과는 형질감염된 세포 및 5-AZA와 함께 인큐베이션된 공배양 세포로, 2 가지 처리를 조합했을 때 향상되었다. 이는 MyoD-GFP 발현에 있어서 5.7-배 증가를 이끌었다.
ROCK 억제제(Y-27632)를 사용하여 24 시간 동안 세포의 인큐베이션에 이어서, pH가 약 6인 배지 속에서 1시간 동안의 인큐베이션 또는 24 시간 동안 저산소에 대한 노출은 또한 MSC에서 프라이밍된 줄기 세포 표현형을 유도하였다(프로토콜 D). 추가로, 몇 개의 소분자, 예컨대 STAT3, NF-KB 활성제, CHIR99021(1-10 □M), 메트포르민(10 mg/ml), 트라닐사이프로민(파르네이트 1 내지 10 μM), Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A(1 내지 10 μM), mTOR 억제제(PP242, 1 내지 10 μM), TGFβ 억제제(RepSox), 티아조비빈(1 내지 10 μM), A83-01(0.5 내지 1 μM), LiCl(5 내지 10 mM), SB431542(10 μM), 및 발포르 산(0.5 내지 2.0 mM), 라파마이신(1 내지 10 Nm), ERK 활성제(레스베라트롤 또는 피스테인)와 1 내지 6 일 동안의 인큐베이션 또는 낮은 pH, 저산소 속에서 배양, 및/또는 저 부착 배양판 위에서 FGF 또는 EGF(10 ng/ml)를 가진 저수준의 혈청 또는 인간 BSA와 배양 모두는 MSC를 정도까지 프라이밍하였다(프로토콜 E). 이들 인큐베이션을 또한 변형된 Nanog mRNA를 사용한 MSC의 제1 형질감염 후 수행하였다.
일시적인 줄기 세포 표현형을 발현하도록 프라이밍된 MSC는 SOX2, NANOG, OCT4 및 KLF4를 처리되지 않은 MSC에서 관측된 것보다 더 높은 수준에서 뿐만 아니라 RTVP-1를 저 수준에서 발현함이 밝혀졌다. 이들 줄기세포성 마커는 프라이밍을 근육 세포의 소포와 인큐베이션에 의해 수행하는 경우 보다 낮게 발현되었다. 줄기세포성에 있어서의 증가로 인하여. 세포가 간엽 계통, 예컨대 지방, 힘줄 또는 뼈의 다른 세포로 분화할 수 있는지를 시험하였다. 그와 같은 분화는 모든 프라이밍된 세포의 경우 열악하였고 근육 세포외 소포에 의해 프라이밍된 세포의 경우 불가능하였다.
프라이밍된 세포의 특성을 보다 잘 이해하기 위하여, 다양한 MSC, 근육 및 줄기세포성 마커를 검사하였다. 모든 프라이밍된 세포는 여전히 MSC 마커 CD73, CD105, CD90, CD146 및 CD44를 발현하였으며 또한 MHCII를 발현하지 않았다. 이들은 또한 낮은 내지 중간 수준의 MyoD, MYF6, MYF5, ITGA7, 오스테프로테게린, 이리신 및 Pax7을 발현하였다. 근육 세포외 소포와의 인큐베이션은 최고 발현을 야기하였지만, 이들 근육 마커의 수준은 실제의 근육 세포에서 관찰된 것보다 더 낮았다. 5-AZA로 프라이밍된 세포 또한 운동 뉴런의 생존 및 신경근육 접합의 유지를 위해 중요한 VEGF 및 GDNF, 영양 인자를 매우 높은 수준으로 발현하였다.
실시예 4: 프라이밍된 세포는 재생을 증가시키고 섬유증을 감소시킨다.
프라이밍된 세포는 MSC의 많은 특징을 보유할 뿐만 아니라 근육 분화의 아래 경로를 시작했음으로, 이들이 재생을 증가시키고 섬유증을 감소시키는 그것의 능력에 대해 처리되지 않은 MSC와 비교하는 방법을 시험하였다. 처리되지 않은 CH- 및 UC-MSC를 야생형 마우스의 좌측 사두근 근육 내로 주사(5x105 개의 세포)한 반면, 프라이밍된 CH- 및 UC-MSC는 우측으로 주사(5-AZA 또는 근육 공배양에 의해 분화된 5x105 개의 세포)하였다. 조직 둘 다로부터 유도된 이전에 관측된 MSC는 횡격막 및 심장 내에서 섬유증을 감소시켰으며(콜라겐 I 발현) 주사된 근육내에서 재생을 증가(NCAM 발현)시켰지만, 주목하게도, 프라이밍된 MSC는 섬유증에 있어서의 감소는 변함없지만, 재생 수준이 거의 2배가 되었다(도 4a).
신규한 근육 형성을 생체내 유도하기 위한 처리되지 않은 및 프라이밍된 MSC의 능력을 다음에 시험하였다. 야생형 마우스의 TA 근육에 PBS, CH-MSC, UC-MSC, 프라이밍된 CH-MSC 또는 프라이밍된 UC-MSC(모두 5x105 개의 세포)를 주사하고 그 다음 심장독으로 처리하여 근육 손상을 유도하였다. 7 일 째에, 마우스를 희생시키고 비복근 근육내에 새로 생성된 근육 섬유를 핵에 집중적으로 위치한 MYH1 염색에 의해 계수하였다. UC-MSC는 신규한 근육 세포의 수가 2배 이상이었으나, CH-MSC는 3배였다(도 4b). 프라이밍된 MSC는 프라이밍된 UC-MSC 또는 CH-MSC가 신규한 근육 세포의 수를 각각 344 % 및 387 %로 증가시키므로 훨씬 더 강력한 효과를 가졌다.
실시예 5: MSC-근육 세포 하이브리드 세포의 생성을 위한 기원의 조직의 선택
본 데이터는 근육 신시티움 뿐만 아니라 MHCII의 MSC-유사 부재에 융합하는 능력 및 조직 거부를 감소시키는 능력은 모두 근육 세포 이식/대체로부터 유리할 수 있는 질환을 치료하는에 유용함을 강하게 시사한다. 따라서, 정상의 위성 세포 또는 근아세포를 공급하기 위해 분화하는 능력과 함께 MSC의 주변분비 효과 둘 다와 조합된 세포를 생성하는 것은 크게 관심을 끌고 있다. 실험과정은 그와 같은 하이브리드 세포로 MSC를 분화시키기 위해 수행되었다.
골수(BM), 지방 조직(AD), 탯줄(UC), 융모막 태반(CH) 및 양막 태반(AM)으로부터의 MSC를 표준 MSC 배양 조건에 따라 모두 단리하여 배양하였다. 이후에, 하기 분화 프로토콜(프로토콜 1)을 모든 5개의 샘플에서 시험하였다. 세포를 pH가 약 6.0인 배지 속에 1 시간 동안 두었다. PBS로 세척한 후, 상기 세포를 ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 MSC 배지에 다시 두고 24 시간 동안 배양하였다. 다음 24 시간에 걸쳐 상기 세포를 5-아자시티딘(5-AZA)이 보충된 배지 속에서 배양하였다. 이를 이어서 HGF 또는 PDGF로 보충된 배지 속에서 인큐베이션 뿐만 아니라 PCAT1 및 NEAT1을 과발현하는 렌티바이러스로 세포를 감염시켰다.
이러한 프로토콜의 완료 후, RNA를 세포로부터 추출하고 다양한 MSC 및 근육 마커의 발현을 qRT-PCR로 검사하였다. 모든 처리된 MSC는 탯줄 및 융모로부터의 MSC가 최고의 발현을 나타내었지만(도 5b), 동일한 조직으로부터의 처리되지 않은 MSC와 비교하여 증가된 수준의 MyoD(도 5a), 디스트로핀 및 미오게닌을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 지방질 및 양막 MSC는 UC 및 CH MSC와 비교하여 중간 정도로 열등하였고, 골수 MSC는 이들 근육 세포 마커를 가장 열악하게 발현하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 모든 처리된 세포는 근육 마커 미오신 중쇄(MYH), 알파 7 인테그린(ITGA7), MYF6, MRF4, G-CSF, TALNEC2 및 MEF2A, 뿐만 아니라 높은 수준의 IL-10을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, UC 및 CH MSC는 또한 오스테오프로테그린을 발현하였지만, BM 및 AD MSC는 그렇지 않았다. 또한, UC 및 CH MSC는 높은 수준의 이리신을 발현하였지만 다른 MSC는 낮은 발현으로만 생산하였다. 중요하게는, 모든 하이브리드 세포는 함께 배양된 경우 인간 근아세포와 융합하는 능력을 나타내었으며(도 5c), 이들이 근육 신시티움의 일부가 되는 능력을 지니며 이들이 잠재적으로 대체 세포 요법을 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 마지막으로, 위성 세포의 마커인, PAX7은 모든 MSC에 의해 발현되었지만, CH-MSC는 단연코 최고의 발현을 나타내었으며, 이는 이들이 위성 세포 표현형으로 분화하는 더 높은 경향을 가짐을 시사한다.
중요하게는, 처리 후, 상기 세포는 여전히 검출가능한 수준의 MHCII를 발현하지 않았으므로, 여전히 비-면역원성이었다. 따라서, 이들 세포는 근육생성 표현형을 가지지만, 여전히 인간 대상체에 대한 투여용의 "재고 세포"로서 사용될 수 있다. 상기 세포는 여전히 근육 세포로 아직 완전하게 분화되지 않았고, 이들은 여전히 CD73, CD105, CD146, 및 CD90의 발현을 보유하였는데, 모든 마커는 MSC 상에 존재하고 근육 세포로부터는 부재한다. 상기 세포는 또한 처리되지 않은 세포보다 더 낮은 수준이지만 CD44를 발현하였다. 그러나, 모두 MSC에 의해 고도로 발현되는, 오스테오칼신, PPARG3 및 COL2A1은 분화 프로토콜의 완료 후 모두 부재하였다. 유사하게, RTVP-1의 발현은 분화 후 감소하였다. 상기 처리된 세포를 또한 간엽 계통(뼈, 힘줄, 지방질)의 다른 조직으로 분화하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 이러한 능력은 상당히 감소되었으며, 다시 한번 상기 세포의 하이브리드 성질을 증명한다.
제2의, 유사한, 분화 프로토콜(프로토콜 2)을 또한 검사하였다. 모든 5개의 MSC 유형을 다시 시험하고, 산성 배지, ROCK 억제제, 5-AZA 및 HGF+PDGF를 사용한 처리를 앞서와 같이 수행하였다. 그러나, PCAT1 및 NEAT1을 과발현시키는 대신에, 상기 세포를 플라스미드를 과발현하는 GAS5 뿐만 아니라 PTENP1에 대한 siRNA로 형질감염시켰다. 다시 한번, 모든 5개의 MSC 유형은 처리 프로토콜의 완료 후, MyoD, 디스트로핀 및 미오게닌을 발현하였으며, 다시 한번 계층이 관측되었고 여기서 UC 및 CH는 최상의 발현자이었으며, 이어서 AD 및 AM, 및 BM이 가장 약한 효과를 발휘하였다(도 5d). 제1 처리 후 관측된 일반적인 발현 패턴이 또한 제2 프로토콜 후에 존재했다.
유도된 근육 세포 표현형의 마커를 측정하는 것 외에, 영양 인자 GDNF, VEGF, CNTF 및 IGF1의 발현을 또한 검사하였다. MSC는 뉴런의 기능을 뒷받침하는 많은 영양 인자를 발현하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 발현의 손실은 근육 세포 표현형으로 분화하는 바람직하지 않은 부작용일 수 있다. 현저하게, 이들 4 개의 영양 인자의 발현은 하이브리드 세포(및 또한 프라이밍된 세포) 내에서 유지될 뿐 아니라, 사실상 모든 4 개의 발현이 처리되지 않은 MSC에서 관측된 것보다 크게 증가되었다(도 5e). 이러한 증가는 UC-MSC로부터 유래된 하이브리드 세포에서 가장 강력하며, VEGF 발현에서 10-배 이상 증가되고, IGF1 발현에서 6-배 이상 증가하며, GDNF 발현에서 5-배 이상 증가하고 CNTF 발현에서 4-배 이상 증가하였다. CH-MSC는 또한 모든 3 개의 인자에 대해 4-배 초과하는 증가를 수득하였다. 유사한 결과가 제1 또는 제2 분화 프로토콜이 수행되는 것에 상관없이 관측되었다.
실시예 6: TF, miR 및 lncRNA와의 MSC-근육 세포 하이브리드 세포의 생성
가장 긍정적인 결과가 탯줄 및 융모로부터 유래된 MSC에서 관측되었으므로, MSC의 이들 2개의 공급원을 모든 후속적인 분화에 사용하였다. 단축된 제3 프로토콜(프로토콜 3)을 검사하였으며 또한 MSC-근육 세포 하이브리드 세포를 생산함을 발견하였다. MSC를 정상의 MSC 배양 조건에서 배양하고 이어서 5-AZA로 배지를 보충하여 24 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 이후에 2 % 말 혈청 및 HGF 및 PDGF로 보충된 배지 속에서 2 주 동안 성장시켰다. 유사한 결과가 이러한 단축된 분화 프로토콜로 관측되었다. 하기 성장 인자를 개별적으로 및 조합하여 둘 다 시험하였는데, 대체로서, 또는 HGF 및 PDGF: EGF, IGF1, PDGFAA, PDGFBB, 및 VEGF와의 조합으로 시험하였다. 모두는 하이브리드 세포를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 프로토콜은 처리된 MSC를 보충되지 않은 MSC 배지로 이동시킴으로써 중단시킬 수 있었다. 생산된 하이브리드 세포는 따라서 추가의 분화로부터 정지될 수 있었다.
모든 3 개의 프로토콜을 상기에 기재된 바와 같이 근육생성 프라이밍을 처음 겪은 MSC를 사용하여 또한 수행하였다. 변형된 Nanog mRNA로 프라이밍한 후, 5-AZA 및 PDGFBB로 프로토콜 3에 기재된 바와 같이 처리한 MSC는, 예를 들어, MyoD 발현에 있어서 거의 6-배 증가를 나타내었다(도 5f).
근육 전사 인자(TF)의 직접적인 발현은 특히 근육생성 프라이밍에 의해 또는 낮은 pH, 저산소, ROCK 억제제 또는 5-AZA(프로토콜 4)와 조합하여 진행하는 경우 하이브리드 세포로의 분화를 또한 유도하였다. 렌티바이러스를 사용하여 MYF5, PAX3, PAX7, 디스트로핀/마이크로디스트로핀, 유트로핀 또는 MyoD+PAX3, MyoD+PAX7, 또는 MyoD+MYF5의 조합을 처리되지 않은 및 프라이밍된 UC- 및 CH-MSC 둘 다에서 발현시켰다. 3 개의 이전에 기재된 프로토콜에 대해 관측된 것과 유사한 발현 프로파일은 이러한 방법을 사용하여 또한 밝혀졌다.
TF를 타목시펜 및 4-하이드록시타목시펜에 대해 반응성인 변형된 에스트로겐 수용체를 함유하는 렌티바이러스 또는 AAV 벡터를 사용하여 MSC 내로 또한 도입시켰다. 이는 특정 및 최적의 시점에서 생체내에서 TF의 유도를 허용하며, MSC의 주변분비 효과를 먼저 및 후속적으로 그것의 대체 능력을 이용한다. 타목시펜은 DMD에서 치료 효과를 발휘하는 것으로 보고되었으므로, 이러한 접근법은 이중으로 유익할 수 있다. 타목시펜-유도성 작제물을 시험하였고, MSC에서 특정 TF 발현을 유도하고 타목시펜에 대한 반응으로 근육생성 분화를 유도하는 그것의 능력을 확인하였다.
비-코딩 RNA는 다양한 세포의 분화에 연루되어 왔다. 근육생성 분화의 유도에 역활을 담당하는 잠재적인 비-코딩 RNA를 확인하기 위해, 인간 근육 세포 및 MSC를 비교하는 miRNA 및 lncRNA 배열을 수행하였다. MSC를 또한 MyoD 과발현을 사용하여 근육 세포로 분화시키고, 근육 세포 및 분화된 MSC에 대해 공통적이지만 비변형된 MSC에서는 상이한 miRNA 및 lncRNA의 클러스터를 확인하였다. 이들 MSC의 근육 세포로의 분화시 이들 miRNA 및 lncRNA의 발현의 변경을 rt-PCR로 확인하였다.
이후에, 분화를 아래와 같이(프로토콜 5) MSC 내에서 수행하였다: MSC를 1 시간 동안 산성 배지 pH=5-6 속에서 인큐베이션한 다음, ROCK 억제제 또는 5-AZA와 함께 24-시간 인큐베이션한 후, lncRNA를 세포내로 도입하였다. 위성 특징을 발현하는 세포를 생산하기 위해 하기 lncRNA를 사용하였다: BIL, PAR5, BIC, DISC2, GAS5DLG2AS, 7SK, Y1, LINCRNA, PCAT-1 SFMBT2, Y4 및 SCA8. 이러한 방법에 의해 생산된 하이브리드 세포는 MyoD 및 PAX7에 대해 이중 양성인 것으로 확인되었으며, 이는 이들이 위성 세포로서 완전하게 기능적이고 비대칭 분할할 수 있음을 나타낸다(도 5g). 보다 분화된 위성 세포 및 근아세포의 유도를 위하여, 하기 추가의 lncRNA의 도입을 적용할 수 있다: MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19. ANRIL, PTENP1 및 aHIF의 침묵화(silencing)는 또한 근육생성 분화를 유도하였다. 구체적으로, ANRIL, PTENP1 또는 aHIF, 단독, 또는 조합에 대해 siRNA와 조합으로 상기 열거된 긴 lncRNA를 사용한 MSC의 형질감염은 상기 세포의 형태적 외관(도 5h) 및 특정 근육 단백질의 발현(예를 들어, 위성 세포에서 PAX7 및 myoD 발현 및 그 초과 분화된 근육생성 세포에 대한 MyoD, 미오게닌, 미오신 중쇄 및 디스트로핀)을 변화시켰다.
분화는 또한 확인된 miR를 사용하여 수행하였다(프로토콜 6). 하기 miR이 모두 근육 세포로의 MSC 분화시 변경되는 것으로 밝혀졌다: miR-10b, miR-22, miR-122, miR-125a, miR-140-5p, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-148b, miR-150, miR-155, miR-181b, miR-215, miR-296, miR-330, miR-370, miR-429, miR-520, miR-524, miR-543, miR-550, miR-561, miR-564, miR-582, miR-583, miR-587, miR-613, miR-614, miR-629, miR-634, miR-645, miR-646, miR-649, miR-661, miR-662, miR-663, miR-665, miR-668, miR-671, miR-887, miR-1183, miR-1224, miR-1225, miR-1228, miR-1234, miR-1246, miR-1247, miR-1257, miR-1258, miR-1268, miR-1269, miR-1289, miR-1287, miR-1909, miR-1911, miR-759, miR-3150, miR-3174, miR-3180, miR-3191, miR-3197, miR-4292, miR-2115 및 miR 4312, miR-92, 93 및 miR-99. MSC는 산성 배지 pH=5-6 속에서 1시간에 이어서 저산소 속에서 24-시간 인큐베이션 또는 5-AZA와 함께 24 시간 동안 인큐베이션에 의해 처음 근육생성으로 프라이밍되었다. 다양한 miR(miR-10b, miR-138, miR-154, miR-155, miR-181, miR-215, miR-614, 및 miR-668)을 형질감염에 의해 세포내로 도입하고 MyoD 발현을 모니터링하였다(도 5i).
실시예 7: DMD를 치료하기 위한 MSC, 프라이밍된 MSC 및 MSC-근육 세포 하이브리드 세포의 용도
상기 데이터를 기반으로 하여, 처리되지 않은 MSC, 프라이밍된 MSC 및 하이브리드 세포는 모두 뒤센의 근이영양증(DMD)을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다는 이론을 세웠다. Mdx 마우스를 DMD 모델로서 사용하고 크레아틴 키나제 (CPK) 수준을 측정하여 요법의 효능을 평가하였다. 마우스에게 비변형된 CH-MSC를 한쪽 사두근 근육에 주사하고 모의 주사를 다른 사두근에 수행하였다. CPK 수준을 3 주 후 측정하였으며, 비처리된 CH-MSC는 CPK 수준을 거의 75 %까지 감소시켰다(도 6a). 동일한 실험을 BM, AD, AM, CH 및 UC로부터 유래된 MSC를 사용하여 반복하였다. BM, AD 및 AM로부터 유래된 MSC는 CPK 발현을 30 내지 40 %까지 감소시켰고, UC-MSC는 이를 60 %까지 감소시켰으며 CH-MSC는 70 % 이상의 감소를 다시 한번 유발하였다(도 6b).
비처리된 MSC와 비교한 하이브리드 세포의 효능을 시험하기 위하여, mdx 마우스에게 PBS를 한쪽 사두근에 및 다른 사두근 근육에는 프로토콜 1에 의한 동일한 MSC 공급원으로부터 유도된 하이브리드 세포를 주사하였다. 모든 5개 세트의 하이브리드 세포는 3 주 후 사두근 내에서 CPK 수준을 상당히 감소시켰으며, UC 및 CH 유래된 세포는 다시 최대 효과를 나타내었다(도 6c). 프로토콜 2에 의해 생산된 하이브리드 세포는 동일한 효과를 가졌다.
프라이밍된 MSC를 또한 시험하였다. 다시 한번, mdx 마우스에게 한쪽 사두근에 비처리된 CH-MSC를 주사하였으며, 이는 상기에 기재된 바와 같은 치료 효과를 발휘하였으며, 다른 쪽에는 산성 배지 및 ROCK 억제제로 프라이밍된 CH-MSC, 근육 세포와 공배양으로 프라이밍된 CH-MSC, 또는 프로토콜 3에 의해 생산된 CH-MSC로부터의 하이브리드 세포를 주사하였다. 모든 3 개의 변형된 세포는 3 주 후 마우스 사두근 속에서 인간 디스트로핀의 발현에 의해 측정된 바와 같이 증가된 치료 효과를 생산하였다(도 6d). 인간 디스트로핀은 인간 단백질에 대해 고유한 프라이머를 사용한 qRT-PCR에 의해 측정되었으므로 측정된 디스트로핀에 있어서 전체 증가는 주사된 세포로부터 유래된 것이었다.
MSC는 다수의 세포외 소포 및 구체적으로 엑소좀을 분비하는 것으로 알려져 있으며, 이들 소포는 부분적으로 MSC의 주변분비 효과를 매개하는 것으로 알려져 있다. 하이브리드 세포의 세포외 소포가 또한 하이브리드 세포의 치료 효과에 대해 부분적으로 관여하였는지를 시험하기 위하여, 5x105 개의 비처리되거나 분화된 CH-MSC로부터의 엑소좀을 MDX 마우스의 사두근 내로 주사하고 CPK 수준을 측정하였다. 도 6e에서 나타낸 바와 같이, 엑소좀 세트 둘 다는 CPK 수준을 감소시켰으나, 비처리된 CH-MSC의 엑소좀은 하이브리드 세포로부터의 엑소좀보다 더 큰 효과를 가졌다. 흥미롭게도, 비처리된 CH-MSC 및 하이브리드 세포로부터의 엑소좀의 혼합물은 훨씬 큰 치료효과를 가졌다.
실시예 8: ALS를 치료하기 위한 MSC-근육 세포 하이브리드 세포의 용도
근위축 측삭 경화증(ALS)은 운동 뉴런 질환일 뿐만 아니라 근육 손실로 인한 서서히 악화되는 약화를 수반한다. MSC-근육 세포 하이브리드 세포는 ALS에서 근육 증상의 진행을 늦추는데 효과적일 수 있다는 가설을 세웠다. 이를 시험하기 위해, 프로토콜 1을 사용하여 CH-MSC으로부터 유래된 하이브리드 세포를 전-증상 SOD1G93A 랫트의 사두근 내로 근육내(IM) 주사하고 상기 동물을 증상 진행에 대해 매일 모니터링하였다. 구체적으로, 랫트는 거꾸로 배치된 후 30 초 내에 그것의 올바른 위치로 더 이상 다시 회복할 수 없는 경우 희생시켰다. PBS와 비교하여 하이브리드 세포의 투여는 SOD 마우스의 생존을 현저히 증가시켰거나, 또는 환언하면, 하이브리드 세포는 ALS 증상의 개시를 상당히 지연시켰다(도 7a).
ALS는 뉴런의 질환이므로 동일한 실험을 별아교세포 표현형으로 분화된 MSC를 사용하여 시도하였다(참조: 본원에 참고로 편입된 미국 특허출원 US20150037298호). MSC-별아교세포의 척추강내로(IT)의 투여는 유사한 효과를 가졌으며, 또한 ALS 증상의 개시를 상당히 지연시켰다(도 7b). 이들 실험을 증상의 개시 후, 그러나 랫트가 자세를 바르게 하는 능력을 상실하기 전에 세포의 주사로 반복하였다. 주사를 전-증상 랫트에서 수행한 경우와 비교하여 유사한, 그러나 감소된 효과가 하이브리드 세포 및 MSC-별아교세포 둘 다의 경우에서 관측되었다.
하이브리드 세포 및 MSC-별아교세포 둘 다는 양성 치료 효과를 가지고, 이들은 상이한 세포 표적에 영향을 줄 것 같음으로, 병용 요법을 시험하였다. 전-증상 랫트에게 하이브리드 세포를 IM 투여에 의해 및 MSC-별아교세포를 IT 투여에 의해 둘 다 제공하였다. 병용 요법은 단일요법과 비교하여 통계적으로 상당한 양으로 생존을 증가시켰으므로(증상의 개시를 지연시킴), 상승작용 효과가 관측되었다(도 7c).
ALS 증상의 개시를 시험하는 다중 방법이 존재하므로, 상기 실험을 반복하였으나, 질환 개시는 10 분 동안 로타로드에 남아있는 랫트의 능력을 분석하여 결정하였다. 또한 이러한 측정에 의해, 하이브리드 세포는 ALS 증상의 개시를 상당히 지연시켰다(도 7d). 뉴런의 줄기 세포(NSCs, 본원에 참고로 편입된 미국 특허출원 US20150037299호 참고)로 분화된 MSC의 척추강내 투여는 또한 유사한 긍정적인 결과를 생산하였다(도 7e). 그리고 다시 한번, IM 하이브리드 세포 및 IV MSC-NSC로 이루어진 병용 요법은 상승작용 효과를 생산하고 ALS 증상 개시에 있어서의 지연을 증가시켰다.
실시예 9: 악액질을 치료하기 위한 MSC 및 그것의 엑소좀의 용도
만성 병 또는 암으로 인한 바디의 근육의 약화 또는 소모성인, 악액질은 또 다른 근육 병이며 이에 대해 MSC의 용도를 조사하였다. 인간 근육 세포를 트랜스-웰 플레이트 속에서 CH- 또는 UC-MSC 또는 그것의 엑소좀과 함께 공배양하였다. 기대된 대로, 세포 및 엑소좀 둘 다는 미오신 중쇄의 발현을 증가시켰으며(도 8), 이는 증가된 근육 성장을 나타낸다. 전염증성 TNFα 및 IFNγ를 사용한 세포의 처리는 악액질을 모사하였으며 미오신 중쇄 발현을 대조군에서 60 % 이상까지 감소시켰다. 이러한 효과의 상당한 억제는 비록 상이한 정도이긴 하나, UC- 및 CH-MSC와 공배양된 근육 세포에서 관측되었다 엑소좀의 첨가 또한 미오신 중쇄 발현을 개선시켰지만, MSC 자체의 수준까지는 아니었다(도 8).
악액질의 제2 모델을 또한 이용하였다. 인간 불멸화된 근육 세포를 악액질과 관련된 인간 세포주(예컨대 1차 폐 종양 세포) 유래 엑소좀과 함께 인큐베이션하였다. 악액질 엑소좀은 불멸화된 세포 내에서 근육 세포사를 유도하고, 분화를 억제하며 미오신 중쇄 발현을 감소시켰다. 그러나, 감소된 세포사, 및 증가된 분화 및 미오신 중쇄 발현이 관측된 바와 같이, UC- 및 CH-MSC 또는 그것의 엑소좀과 함께 공배양은 이들 악액질 효과를 폐기하였다.
실시예 10: 치료 전달 시스템으로서 MSC의 용도
몇 개의 잠재적으로 유망한 치료제가 근육, 운동 뉴런, 및 주변 뉴런 질환 및 손상에 대해 존재한다. 그러나, 빈번하게 치료제를 직접적으로 및 구체적으로 손상된 또는 질환 부위로 전달하는데 어려움이 있다. 그것의 분비된 소포의 큰 레퍼토리와 함께 MSC의 귀소 능력으로 인하여, MSC가 근육 및 뉴런에 대한 이상적인 전달 제제로서 제공될 수 있다는 가설을 세웠다.
이러한 가설을 시험하기 위하여, 비변형된 CH- 및 UC-MSC로부터 유래된 엑소좀을 유트로핀 발현(항-miR-424, 195, 16, 497, 135, 6793, 및 21)을 감소시키는 것으로 공지된, 몇 개의 마이크로 RNA(miR)에 대한 안타고미르와 함께 장입하고 인간 근아세포와 함께 인큐베이션하였다. 이들 엑소좀과의 인큐베이션은 근아세포 내에서 유트로핀 mRNA 발현을 크게 증가시켰으며, 이는 상기 엑소좀이 안타고미르를 근아세포로 성공적으로 전달하였음을 나타낸다(도 9a).
유사하게, let-7 안타고미르 또는 miR-133b 안타고미르로 형질감염된 CH-MSC는 시험관 내에서 근육 세포로 안타고미르를 전달하여 그 결과 유트로핀 단백질 발현이 증가하였다(도 9b). 이들 세포로부터의 엑소좀은 또한 유트로핀 단백질 발현을 시험관 내에서 성공적으로 증가시켰다(도 9c). 다음으로, 엑소좀 표면에 있는 M-카드헤린 에피토프에 의해 근육 세포로 표적화된 엑소좀을 근육 세포/별아교세포 혼합된 배양물에 투여하였다. 항-let-7을 함유하는 표적화된-엑소좀은 배양물 속의 별아교세포 세포의 55 내지 68 %에서 유트로핀 발현을 증가시켰지만, 또한 배양물 속의 근육 세포의 85 내지 92 %에서도 증가시켰다(도 9c, 근육 세포 용해물로 나타냄). 이는 엑소좀이 안타고미르를 전달할 뿐 아니라 엑소좀(또는 MSC) 상의 근육 표적화 모이어티가 전달의 유효성을 증가시킬 것임을 나타내었다. Let-7은 또한 미오신 중쇄 발현을 감소시켜 근육 재생을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 상기 let-7 안타고미르는 또한 미오신 중쇄 발현을 상당히 증가시키고(도 9d) 따라서 이중 치료 이점을 갖는다.
디스트로핀 단백질의 전달은 또한 많이 조사된 치료 방안이지만, 재조합 디스트로핀은 강력한 면역원성 반응을 유도하고, 아직까지, 효과적인 전달 시스템이 발견되지 않았다. MSC는 면역억제성 능력을 가지므로, 비변형된 CH-MSC를, 이들이 면역 반응없이 디스트로핀을 발현시킬 수 있다는 희망으로 디스트로핀 및 마이크로디스트로핀을 발현하는 바이러스 벡터로 감염시켰다. 이들 플라스미드의 효과를 추가로 확대하기 위하여, 디스트로핀을 표적화하는 miR, miR-214에 대한 안티고미르를 발현하는 MSC를 또한 이용하였다. 디스트로핀 플라스미드 및 항-miR-214의 조합된 효과는 놀랍게도 디스트로핀 발현을 약 4.5-배 증가시켰다. 중요하게는, 이러한 치료는 또한 유트로핀 발현을 증가시켰다. 따라서, 항-miR-214 전달은 또한 이것이 디스트로핀 및 유트로핀 발현을 모두 증가시키므로 이중 치료 이점을 갖는다.
치료제를 전달하는 엑소좀 및 MSC의 능력은 MSC 및 엑소좀을 변형된 myoD mRNA와 함께 장입시켜 추가로 시험하였다. 세포의 세포질도 들어갈 때 그와 같은 mRNA는 단백질로 즉시 변역될 수 있다. myoD 장입된 엑소좀의 근아세포 내로의 직접적인 첨가뿐만 아니라 트랜스-웰 플레이트 속에서 장입된 MSC 및 근아세포의 공배양은 myoD 양성 핵의 수에 의해 측정된 바와 같이 강력한 myoD 발현을 야기했다(도 9e). 변형된 myoD mRNA를 사용한 세포의 직접적인 형질감염을 양성 대조군으로 사용하였으며, 사실상 엑소좀 또는 공배양에 의한 상기 mRNA의 전달은 거의 형질감염에 의한 직접적인 투여와 마찬가지로 효과적이었다. 따라서, MSC 및 그것의 엑소좀은 다른 RNA 분자와 유사하게 변형된 mRNA를 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명을 이의 특정 구현예와 함께 기술하였지만, 많은 대안, 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것임은 명백하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 취지 및 넓은 범위 내에 속하는 이러한 대안, 변형 및 변화 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
<110> EXOSTEM BIOTEC LTD. <120> MESENCHYMAL STEM CELL AND USE THEREOF FOR TREATMENT OF MUSCLE INJURY AND MUSCLE-ASSOCIATED DISEASES <130> BNST-P-008-KR <150> US 62/336,858 <151> 2016-05-16 <150> PCT/IL2017/050548 <151> 2017-05-16 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 1 atcagccaca tcgcccagca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 2 cccagcagcc tcaaaatcct 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgggttcggt ggtcaagtc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cgctctggta gtgctggga 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgctggaggt gtaatggacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caagcacaca aagatgggct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggtgcttgtt cctcagcctc 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 caggcagaag agcgtggtg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tctcattgtt tttaagccta 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 catctacgat gtcagtactt cca 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gcgcttgaac atcatcagcc 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggaacgcgtg tgcgagt 17 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 tctcatcgta cctaagcctc 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 cagtgccttg ttgacattgt tcag 24 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tgaaagagat ggggaggaac ca 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggcagaagag ggcaatgaca c 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ccagttttca cataatacac ggc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aagagcgtca aagccagaaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 aaacatccag gtcaaccccc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 accactcgac tccacagtct 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 acctcatccc tgtctattgc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ctgttggctc cttgcttgtt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ctccacctga agaagattgt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 aagatgtaac ctcctgaagt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 attccccagc aactcttctt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tacagcaacc acttcccatt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gaacctgacc tcccactgaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 tcctgcctgc ttacgccaac 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 caaccaggag gagcgtgac 19 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cagccgtgag cagatgat 18 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 atgatacggg acgaacaggg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 tgaacttgcc acttgcttga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 cccacctcca actgctctga 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 caactggaga gagagaagcc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 caccccacat cttctccatc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ccttcttctt ctccccagta 20 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 ccgcagccgc cttctatg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 acaccgccgc actcttcc 18 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tgataacggc taaggaagga 20 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 cacgatggaa gaaaggca 18

Claims (47)

  1. 혼합된 특성의 단리된 세포로서, 상기 세포는 간엽 줄기 세포(MSC) 표현형 및 근육 세포 표현형을 나타내는, 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 MSC 표현형은 CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44 발현 및 MHCII 발현의 부재로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 발현 마커를 포함하는, 세포.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 MSC 표현형은 면역억제 능력을 포함하는, 세포.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC 표현형은 항-염증 능력을 포함하는, 세포.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC 표현형은 염증, 손상 또는 질환의 부위로 귀결되는 능력(ability to home)을 포함하는, 세포.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포 표현형은 MyoD, Myf6, Myf5, MRF4, ITGA7, 오스테오프로테그린, 이리신, 디스트로핀, 미오신 중쇄, 미오게닌, PAX7, TALNEC2, C-MET, G-CSF, 오스테오프로테그린, IL-10, 및 MEF2A 발현, 및 오스테오칼라신, PPARG3, 및 COL2A1 발현의 부재로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 발현 마커를 포함하는, 세포.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포 표현형은 근육 신시티움(syncytium)과 병합하는 능력을 포함하는, 세포.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포 표현형이 위성 세포 표현형을 포함하는, 세포.
  9. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포 표현형이 근아세포 표현형을 포함하는, 세포.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가
    a. MSC를 제공하는 단계;
    b. 상기 MSC를 ROCK 억제제, 산성 배지, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및
    c. 상기 MSC내로 PDGFBB, HGF, PDGFβ PDGFAA, EGF, VEGF, TGFβ, 및 IGF1 중 적어도 하나를 도입시키는 단계에 의해 생산되는, 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 세포가 상기 MSC 내로 PCAT1 및 NEAT1 또는 GAS5 및 PTENP1 발현의 억제제를 추가로 도입시켜 생산되는, 세포.
  12. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 MSC를 근육 세포, 근육 세포로부터의 조건화된 배지, 또는 근육 세포의 세포외 소포와 공-배양(co-culturing)함으로 생산되는, 세포.
  13. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 MSC 내로 NANOG, SOX2, KLF4, OCT4 또는 이들의 조합 중 임의의 하나를 도입시켜 생산되는, 세포.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 세포가 상기 세포를 5-AZA를 함유하는 배지 속에서 추가로 인큐베이팅함으로 생산되는, 세포.
  15. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 다음 중 임의의 하나 속에서 MSC를 배양하여 생산되는, 세포:
    a. 산성 배지;
    b. 저산소;
    c. 저 부착 플레이트;
    d. FGF 또는 EGF로 보충된 저 혈청을 지닌 배지;
    e. 5-AZA로 보충된 배지;
    f. ROCK 억제제, STAT3, NF-KB 활성제, CHIR99021, 메트포르민, 트라닐사이프로민, Gsk3 억제제, 3-데아자네플라노신 A, mTor 억제제, TGFβ 억제제, 티아조비빈, A83-01, LiCl, SB431542, 5-AZA, 라파마이신, ERK 활성제 및 발포르 산으로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자를 함유하는 배지; 및
    g. 이들의 조합.
  16. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 MSC 내로 MYF5, PAX3, PAX7, 디스트로핀, 마이크로디스트로핀, 유트로핀, MyoD 및 PAX3, MyoD 및 PAX7, 및 MyoD 및 MYF5로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전사 인자를 도입시켜 생산되는, 세포.
  17. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가:
    a. MSC를 제공하는 단계;
    b. 상기 MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및
    c. 상기 MSC 내로 BIL, PAR5, BIC, DISC2, GAS5DLG2AS, 7SK, Y1, LINCRNA, PCAT-1 SFMBT2, Y4, SCA8, MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)를 도입시키는 단계에 의해 생산되는, 세포.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 적어도 하나의 lncRNA가 PAR5, DISC2 및 PCAT1으로부터 선택되는, 세포.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 세포가 상기 MSC 내로 MALAT1, MEG3, NEAT1, EGO, GAS5, KRASP1, LOC28519, BC200, 및 H19로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 lncRNA를 추가로 도입시켜 생산되는, 세포.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 세포가 상기 MSC 내에서 ANRIL, PTENP1 및 aHIF 중 적어도 하나의 발현을 추가로 다운 조절하여 생산되는, 세포.
  21. 청구항 17 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 위성 세포 표현형을 나타내는, 세포.
  22. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가:
    a. MSC를 제공하는 단계;
    b. 상기 MSC를 산성 배지, ROCK 억제제, 및 5-AZA 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계; 및
    c. 상기 MSC 내로 miR-10b, miR-22, miR-122, miR-125a, miR-140-5p, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-148b, miR-150, miR-155, miR-181b, miR-215, miR-296, miR-330, miR-370, miR-429, miR-520, miR-524, miR-543, miR-550, miR-561, miR-564, miR-582, miR-583, miR-587, miR-613, miR-614, miR-629, miR-634, miR-645, miR-646, miR-649, miR-661, miR-662, miR-663, miR-665, miR-668, miR-671, miR-887, miR-1183, miR-1224, miR-1225, miR-1228, miR-1234, miR-1246, miR-1247, miR-1257, miR-1258, miR-1268, miR-1269, miR-1289, miR-1287, miR-1909, miR-1911, miR-759, miR-3150, miR-3174, miR-3180, miR-3191, miR-3197, miR-4292, miR-2115, miR-4312, miR-92, 93 및 miR-99로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA를 도입시키는 단계에 의해 생산되는, 세포.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 적어도 하나의 miR는 miR-10b, miR-138, miR-154, miR-155, miR-181, miR-215, miR-614, 및 miR-668로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  24. 청구항 10 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 탯줄 또는 태반으로부터 유래되는, 세포.
  25. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 SOX2, KLF4, OCT4 및 NANOG로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 줄기세포성 마커를 발현하는, 세포.
  26. 청구항 14 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 VEGF, GDNF 및 IGF1로부터 선택된 적어도 하나의 영양 인자를 분비하는, 세포.
  27. 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포의 표면 또는 상기 세포의 세포외 소포의 표면 상에 근육 세포 표적화 모이어티를 포함하는, 세포.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 근육 세포 표적화 모이어티가 카베올린 3에 대한 리간드, M-카드헤린, 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 리간드, 미오스타틴의 돌연변이 우세 음성 형태, 및 안지오텐신 II 유형 1 중 임의의 하나를 포함하는, 세포.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 근육 세포 표적화 모이어티가 M-카드헤린을 포함하는, 세포.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 치료제를 포함하는, 세포.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 치료제가 약물, 판독 약물(read-through drug), RNA, DNA 분자, 벡터, 엑손 스킬링 올리고뉴클레오타이드(exon skilling oligonucleotide), 마이크로RNA(miR), 작은 간섭하는 RNA(siRNA) 안타고미르(antagomir), 긴 비코딩 RNA(lncRNA) 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  32. 청구항 30에 있어서, 상기 RNA가 변형된 MyoD mRNA인, 세포.
  33. 청구항 30에 있어서, 상기 약물이 디스트로핀 또는 마이크로디스트로핀인, 세포.
  34. 청구항 30에 있어서, 상기 안타고미르가 항-miR-424, 항-miR-195, 항-miR-16, 항-miR-497, 항-miR-135, 항-miR-6793, 항-miR-21, 항-let-7, 항-miR-133b, 항-miR-214 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  35. 청구항 30에 있어서, 상기 안타고미르가 항-let-7인, 세포.
  36. 청구항 33에 있어서, 항-miR-214를 추가로 포함하는, 세포.
  37. 청구항 1 내지 청구항 36 중 어느 한 항의 임의의 세포의 단리된 세포외 소포.
  38. 다음 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물:
    a. 청구항 1 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 따른 혼합된 특성의 세포,
    b. 청구항 37의 세포외 소포, 및
    c. 이들의 조합.
  39. 청구항 38에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 아쥬반트를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  40. 근육-관련된 질환 또는 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 이들을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 청구항 38 또는 청구항 39의 약제학적 조성물을 투여함으로써 상기 근육-관련된 질환 또는 손상을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 조성물이 상기 대상체에 대해 동종 이계(allogenic) 또는 자가조직인 MSC로부터 유래된 세포를 포함하는, 방법.
  42. 청구항 40 또는 청구항 41에 있어서, 상기 근육-관련된 질환 또는 손상이 운동 뉴런 질환, 주변 뉴런 질환, 근이영양증, 척수 손상, 근육 소모, 심장 근육 손상, 염증성 근병증, 중증 근무력증, 근육감소증, 악액질, 섬유증, 평활근 손상 및 골격 근육 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 근육-관련된 질환이 근위축 측삭 경화증(ALS), 섬유증, 악액질, 및 근이영양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 근이영양증이 뒤센느 근이영양증(Duchene's muscular dystrophy, DMD)인, 방법.
  45. 청구항 43에 있어서, 상기 섬유증이 심장 섬유증인, 방법.
  46. 청구항 43에 있어서, 상기 근육-관련된 질환이 ALS이고 상기 방법이 별아교세포 표현형 또는 뉴런의 줄기 세포(NSC) 표현형을 향해 분화된 적어도 하나의 MSC를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  47. 청구항 44에 있어서, 다음 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    a. 미분화된 MSC,
    b. 상기 미분화된 MSC의 세포외 소포, 및
    c. 이들의 조합.
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