KR20180136515A

KR20180136515A - 상피성 세포 성장 인자 수용체 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법

Info

Publication number: KR20180136515A
Application number: KR1020187033674A
Authority: KR
Inventors: 히로시 이즈츠; 게이스케 고다마; 미츠타카 나카다; 도시후미 와카이; 히토시 가메야마; 마사유키 나가하시; 요시후미 시마다; 히로시 이치카와
Original assignee: 덴카 주식회사; 고쿠리츠다이가쿠호진 니이가타 다이가쿠
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2018-12-24
Also published as: CN109072228A; JP6917595B2; EP3450555A4; EP3450555A1; KR102367595B1; JPWO2017187937A1; EP3450555B1; WO2017187937A1

Abstract

본 발명은 암을 앓고 있는 인간 환자에게 있어서, EGFR 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법으로서, 상기 인간 환자로부터 채취된 상기 암세포를 포함하는 샘플을 사용하여, 상기 암세포의 B-Raf 단백질의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정하는 공정을 갖고, 상기 아미노산 잔기의 변이가 있는 경우에, 상기 암세포는 EGFR 저해제에 대하여 내성이라고 판정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의하면, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를 미리 선별할 수 있다.

Description

상피성 세포 성장 인자 수용체 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법

본 발명은 암을 앓고 있는 인간 환자에게 있어서, 상피성 세포 성장 인자 수용체 저해제(이하, 「EGFR 저해제」라고 함)에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법에 관한 것이다.

암의 치료약으로서, EGFR 저해제, 예를 들어 세툭시맙(Cetuximab) 및 파니투무맙(Panitumumab) 등의 항상피성 세포 성장 인자 수용체 항체약(항EGFR 항체약)이 알려져 있다. 이들 EGFR 저해제는 암세포에 있어서, 암세포의 증식에 관여하는 상피성 세포 성장 인자 수용체(EGFR)의 작용을 저해하는 작용을 갖는다.

한편, 암 환자의 암세포가 KRAS 유전자에 변이를 갖는 경우, 암세포는 EGFR 저해제에 대하여 저항성을 나타내기 때문에, EGFR 저해제의 효과가 저하되는 것이 알려져 있다. EGFR 저해제는 피부 장애 등의 부작용을 갖기 때문에, EGFR 저해제의 투여에 의해 높은 치료 효과가 인정되는 암 환자에게만 EGFR 저해제를 투여하는 것이 바람직하다. 환자에게 있어서 EGFR 저해제에 의한 치료가 유효한지 여부를 판별하는 방법으로서, 환자의 암세포의 KRAS 유전자에 있어서의 변이 유무를 조사하는 방법이 알려져 있다.

예를 들어, 특허문헌 1에는 혈액 샘플 중에 변이형의 KRAS 유전자 유래 핵산 또는 그의 단백질이 검출된 경우에, 종양이 EGFR 저해제 감수성이 아닐 가능성이 높다고 판정하는 EGFR 저해제 감수성 예측 방법이 기재되어 있다.

국제 공개 제2014/148557호

본 발명자들은 암세포가 야생형의 KRAS 유전자를 갖는 암 환자라도, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 경우가 있는 것을 발견했다.

본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것이고, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를 미리 선별하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 암을 앓고 있는 인간 환자에게 있어서, EGFR 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법으로서, 상기 인간 환자로부터 채취된 상기 암세포를 포함하는 샘플을 사용하여, 상기 암세포의 B-Raf 단백질(이하, 간단히 「B-Raf」라고도 함)의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정하는 공정을 갖고, 상기 아미노산 잔기의 변이가 있는 경우에, 상기 암세포는 EGFR 저해제에 대하여 내성이라고 판정하는 방법이다.

본 방법에 의하면, 암세포의 B-Raf의 아미노산 서열에 있어서의, 제326번째 아미노산 잔기라는 특정한 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정함으로써, EGFR 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정할 수 있기 때문에, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를 미리 선별할 수 있다.

상기 EGFR 저해제는 항상피성 세포 성장 인자 수용체 항체약이어도 된다.

상기 아미노산 잔기의 변이 유무의 결정은 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이의 검출을 포함하고 있어도 된다.

상기 염기 서열의 변이의 검출은 DNA 시퀀싱, 폴리메라아제 연쇄 반응, 대립 유전자 특이적 증폭, 대립 유전자 특이적 프로브에서의 하이브리다이제이션, 미스매치 절단 해석, 단쇄 고차 구조 다형, 변성 구배 겔 전기 영동 또는 온도 구배 겔 전기 영동에 의해 행해도 된다.

상기 샘플은 암 절제 조직 검체, 생검 검체, 복수 침윤 암세포, 혈액 순환 암세포, 혈청 또는 혈장이어도 된다. 샘플이 이들의 샘플이면, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

상기 암은 대장암 또는 직장암일 수 있다. 암이 대장암 또는 직장암이면, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

상기 아미노산 잔기의 변이는 I326V여도 된다. 변이가 I326V이면, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

상기 염기 서열의 변이는 c. 976A>G여도 된다. 변이가 c. 976A>G이면, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

상기 암세포는 야생형의 KRAS 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 암세포가 야생형의 KRAS 유전자를 가짐으로써, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

본 발명에 따르면, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를 미리 선별할 수 있다.

도 1은 실시예의 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대하여 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시 형태에 한정되는 것은 아니다.

일 형태에서는, 본 발명은 암을 앓고 있는 인간 환자(이하, 「암 환자」라고도 함)에게 있어서, EGFR 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법이다. 본 형태에 관한 방법은, 인간 환자로부터 채취된 암세포를 포함하는 샘플을 사용하여, 암세포의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정하는 공정을 갖는다.

본 발명에 관한 방법을 이용 가능한 암으로서는, 예를 들어 대장암, 직장암, 결장암, 위암, 간암, 갑상선암, 자궁암, 신장암, 췌장암, 설암, 전립선암, 폐암, 피부암, 난소암, 담낭암, 두경부암, 정소 종양, 부신암, 구강암, 골연부 종양, 뇌종양, 악성 흑색종, 골육종, 연골육종, 횡문 근육종, 평활 근육종, 백혈병, 악성 림프종 및 다발성 골수종을 들 수 있다. 이들 중에서도, 암이 대장암 또는 직장암인 경우, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「EGFR 저해제」는 EGFR의 발현 또는 활성을 저해하는 약제라면 특별히 제한되지 않고, 게피티닙, 에를로티닙 등의 EGFR를 표적으로 하는 저분자 화합물, 항EGFR 항체약, EGFR에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 등의 어느 것이어도 된다. 항EGFR 항체약은, 예를 들어 상피성 세포 성장 인자(EGF)와 EGFR의 결합을 저해하는 항체이다. 항EGFR 항체약으로서는, 예를 들어 EGFR의 세포외 도메인을 에피토프로 하는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 항EGFR 항체약의 구체예로서는, 세툭시맙 및 파니투무맙을 들 수 있다. EGFR 저해제는 단독으로 사용되어도 되고, 복수의 EGFR 저해제가 병용되어도 된다.

또한, 본 명세서에 있어서의 「항체」는 2개의 완전한 경쇄와 2개의 완전한 중쇄를 갖는 항체 분자뿐만 아니라, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편도 포함한다. 항체 단편으로서는, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab 및 Fv를 들 수 있다. 항체로서는, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체 중 어느 것이 바람직하다.

또한, 본 실시 형태에 관한 방법은, EGFR 저해제와 다른 항암제를 병용하는 치료에 대한 암세포의 내성을 판정하는 경우에도 유효하다. EGFR 저해제와 다른 항암제를 병용하는 치료로서는, 예를 들어 CPT-11+파니투무맙 요법, IRIS+파니투무맙 요법, FOLFOX(예를 들어, mFOLFOX6)+파니투무맙 요법, FOLFIRI+파니투무맙 요법, CPT-11+세툭시맙 요법, IRIS+세툭시맙 요법, FOLFOX(예를 들어, mFOLFOX6)+세툭시맙 요법, FOLFIRI+세툭시맙 요법 및 sLV5FU2+세툭시맙 요법을 들 수 있다.

암세포를 포함하는 샘플로서는, 예를 들어 암 절제 조직 검체, 생검 검체, 복수 침윤 암세포, 혈액 순환 암세포, 혈청, 혈장, 혈액, 분변, 소변, 담, 골수액, 흉강 내액, 유두 흡인액, 림프액, 세포 배양액, 그리고 환자로부터 채취된 그 밖의 조직 및 액체를 들 수 있다. EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를 더 높은 확실성으로 선별하는 관점에서, 암세포를 포함하는 샘플은, 암 절제 조직 검체, 생검 검체, 복수 침윤 암세포, 혈액 순환 암세포, 혈청, 또는 혈장인 것이 바람직하고, 암 절제 조직 검체 또는 생검 검체인 것이 보다 바람직하다. 또한, 암세포를 포함하는 샘플이 암 절제 조직 검체 또는 생검 검체인 경우, 이들의 검체는 동결, 알코올 고정, 포르말린 고정, 파라핀 포매, 또는 이들의 처리를 조합한 처리가 되어 있어도 된다.

본 명세서에 있어서, 「아미노산 잔기의 변이」란, 단백질의 아미노산 서열 중의 특정한 아미노산 잔기가, 대응하는 야생형의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기와는 상이한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 서열 번호 1로 나타나는 야생형의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기는 이소류신이고, 이것이 이소류신 이외의 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 변이라고 한다.

B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이는 이소류신이, 페닐알라닌, 트레오닌, 아스파르트산, 리신, 세린, 아르기닌, 메티오닌, 글리신, 알라닌, 발린 또는 류신으로 치환된 것이어도 된다. 아미노산 잔기의 변이가 이들의 변이인 경우, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다. 그 중에서도, 변이가, 이소류신으로부터 발린으로 치환된 변이(I326V)인 경우, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

상기 아미노산 잔기의 변이 유무의 결정은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 변이의 유무의 결정은, 예를 들어 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이의 검출을 포함하고 있어도 된다.

본 명세서에 있어서, 「염기 서열의 변이」란, 해당 염기 서열이 코딩하는 아미노산 잔기가, 대응하는 야생형의 염기 서열이 코딩하는 아미노산 잔기와는 상이하도록, 염기 서열 중의 염기의 적어도 일부가 다른 염기로 치환되어 있는 것을 의미한다(「미스센스 변이」라고도 함).

B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이는 해당 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 잔기가, 이소류신으로부터, 페닐알라닌, 트레오닌, 아스파르트산, 리신, 세린, 아르기닌, 메티오닌, 글리신, 알라닌, 발린 또는 류신으로 변화된 것이어도 된다. 염기 서열의 변이가 이들의 변이인 경우, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다. 그 중에서도, 상기 염기 서열의 변이가, 이소류신을 코딩하는 염기 서열로부터 발린을 코딩하는 염기 서열로 변이된 것(c. 976A>G)인 경우, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 암 환자를, 더 높은 확실성으로 선별할 수 있다.

염기 서열의 변이의 검출은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 염기 서열의 변이의 검출은, 예를 들어 DNA 시퀀싱, 폴리메라아제 연쇄 반응, 대립 유전자 특이적 증폭, 대립 유전자 특이적 프로브에서의 하이브리다이제이션, 미스매치 절단 해석, 단쇄 고차 구조 다형, 변성 구배 겔 전기 영동, 또는 온도 구배 겔 전기 영동에 의해 행해도 된다. 이들 기술은 단독으로 사용해도 되고, 복수의 기술을 조합하여 사용해도 된다.

암세포의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기에 변이가 있는 경우, 암세포가 EGFR 저해제에 대하여 내성이라고 판정할 수 있다.

암세포의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무와, 암세포의 EGFR 저해제에 대한 내성 사이의 메커니즘은 분명하지는 않지만, 본 발명자들은, 이들이 적어도 이하와 같은 기구로 관련되어 있다고 추측하고 있다. B-Raf는 암세포의 증식에 관여하는 세포 내 증식 시그널 전달 경로에 있어서, EGFR의 하류에 존재하는 활성화 인자이다. EGFR 저해제는 EGFR의 작용을 저해함으로써 EGFR의 하류에 증식 시그널이 전달되는 것을 저해하고, 암의 진행을 억제하는 효과를 갖는다. 그러나, 암세포의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기에 변이가 있으면, EGFR 저해제에 의해 EGFR로부터 하류로 증식 시그널이 전달되지 않아도, B-Raf가 활성화되어, B-Raf의 하류로 증식 시그널이 전달된다. 따라서, 이와 같은 암세포에 EGFR 저해제를 투여해도, 암의 진행을 억제하는 효과가 발휘되지 않거나, 또는 발휘되기 어려운 것이라고 생각된다.

본 발명은 암을 앓고 있는 인간 환자에게 있어서, EGFR 저해제에 대한 암세포의 내성을 결정하는 방법으로서, 인간 환자로부터 채취된 암세포를 포함하는 샘플을 사용하여, 암세포의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정하는 공정을 갖고, 아미노산 잔기의 변이가 있는 것이, 암세포가 항EGR 항체약에 대하여 내성인 것을 나타내는 방법이라고도 할 수 있다.

일 실시 형태에서는, 암 환자로부터 채취된 암세포는, 야생형의 KRAS 유전자를 가져도 된다. 암 환자의 암세포가 야생형의 KRAS 유전자를 갖고 있어도, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 경우가 있다. 본 실시 형태에 의하면, 암세포가 야생형의 KRAS 유전자를 갖는 암 환자에 대한 EGFR 저해제의 유효성을 평가함으로써, EGFR 저해제에 의한 불필요한 부작용을 회피할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 야생형의 KRAS 유전자란, EGFR 저해제에 대한 내성을 암세포에 부여하는 변이가 없는 KRAS 유전자를 의미한다. 당해 변이는 KRAS 단백질의 제12번째 및 제13번째 아미노산의 종류에 변화를 초래하는 유전자 변이이다.

일 실시 형태에서는, 암 환자는 EGFR 저해제의 투약 치료를 받으려고 하거나, 또는 받은 환자여도 된다. 본 실시 형태에 의하면, EGFR 저해제에 내성인 암세포를 갖는 환자에 대하여 EGFR 저해제의 투약 치료를 행하는 것을 회피하거나, 또는 투여량을 감소시킬 수 있다. 이에 의해, EGFR 저해제에 의한 부작용을 회피 또는 감소시킬 수 있다.

일 실시 형태에서는, 암 환자로부터 채취된 암세포는 야생형의 KRAS 유전자를 갖고, 또한 야생형의 NRAS 유전자를 가져도 된다. 일반적으로, 암세포가 야생형인 KRAS 유전자를 갖고, 또한 야생형의 NRAS 유전자를 갖는 암 환자에게는, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하다고 생각되고 있지만, 이와 같은 환자 중에도, EGFR 저해제에 의한 치료가 유효하지 않은 환자가 있다. 본 실시 형태에 의하면, 이와 같은 암 환자 중에서, EGFR 저해제가 유효하지 않은 환자를 판별할 수 있다. 본 명세서에 있어서 야생형의 NRAS 유전자란, EGFR 저해제에 대한 내성을 암세포에 부여하는 변이가 없는 NRAS 유전자를 의미한다. 당해 변이는, 예를 들어 NRAS 단백질의 제12번째, 제13번째, 제59번째, 제61번째, 제117번째 또는 제146번째 아미노산의 종류에 변화를 초래하는 유전자 변이이다.

일 형태에서는, 본 발명은 암의 예후를 판정하는 방법이고, 즉 암을 앓고 있는 인간 환자로부터 채취된 암세포를 포함하는 샘플을 사용하여, 암세포의 B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정하고, 아미노산 잔기의 변이가 있는 경우에, 예후 불량이라고 판정하는 방법이다.

이상, 본 발명의 특정한 실시 형태에 대하여 상세하게 설명했지만, 본 발명은 상기 실시 형태에 한정되지 않는다.

실시예

이하, 실시예에 기초하여 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(BRAF 유전자에 있어서의 변이 검출)

KRAS 단백질의 제12번째 및 제13번째 아미노산의 코돈에 변이가 없는 대장암 환자에 대하여, 파니투무맙 또는 세툭시맙을 사용한 요법(표 1에 나타냄)에 의한 치료를 행하였다. 환자의 암 절제 검체 포르말린 고정 파라핀 포매 검체를 제작하고, 이것을 얇게 커트하여 두께 20㎛의 절편을 2개 제작했다. 제작한 2매의 절편을 슬라이드 글래스에 부착한 것을 DNA 추출용의 샘플로 했다. 별도로 두께 4㎛의 절편을 제작하고, 제작한 절편을 슬라이드 글래스에 부착한 것을 현미경 관찰용의 샘플로 했다. 환자 26인분(환자 A 내지 Z)의 샘플을 제작하고, 각각의 환자의 샘플에 대하여, 이하와 같이 하여 BRAF 유전자의 염기 서열에 있어서의 변이를 검출했다.

현미경 관찰용의 샘플을 헤마톡실린에오신으로 염색했다. 염색 후의 샘플을 현미경으로 관찰하고, 절편 중, 암세포를 많이 포함하는 부위를 특정했다. DNA 추출용의 샘플로부터, 현미경 관찰용의 샘플에서 특정한 부위를 면도기로 깎아 내고, 깎아낸 부위로부터 DNA를 추출했다. DNA의 추출은 BiOstic FFPE Tissue DNA Isolation Kit(상품명)를 사용하여 행하였다.

프로브로서, BRAF 유전자의 18개의 엑슨 서열 각각에 있어서의 연속된 일부 또는 전부의 서열(100 내지 130 염기), 또는 이들의 상보 서열을 포함하는 프로브 핵산을 사용하여, 검체의 DNA로부터 BRAF 유전자를 분리했다. 이루미나사의 MiSeq 시퀀서에 의해 BRAF 유전자의 염기 서열을 분석하고, BRAF 유전자의 염기 서열에 있어서의 변이를 검출했다.

환자 A에 대해서는, BRAF 유전자의 염기 서열에 있어서, B-Raf의 아미노산 서열에 I326V의 변이를 초래하는 변이(c. 976A>G)가 검출되었다. 환자 F, K, O 및 U에 대해서는, BRAF 유전자의 염기 서열에 있어서, B-Raf의 아미노산 서열에, 각각 D22N, V600E, N581Y, V600E의 변이를 초래하는 변이가 검출되었다. 그 밖의 환자에 대해서는, BRAF 유전자의 염기 서열에 있어서, B-Raf의 아미노산 서열에 변이를 초래하는 변이가 검출되지 않았다.

(항EGFR 항체약에 의한 치료 효과)

환자 A 내지 Z에 대하여, 하기 식과 같이 암 축소 인덱스(%)를 산출했다.

암 축소 인덱스(%)=(치료 후의 원발소의 직경+치료 후의 전이소의 직경)/(치료 전의 원발소의 직경+치료 전의 전이소의 직경)×100-100

환자 A 내지 Z에 있어서의, BRAF 유전자의 변이 유무와 항EGFR 항체약에 의한 치료 효과의 관계를 도 1 및 표 1, 표 2에 나타낸다.

도 1 및 표 1, 표 2에 나타낸 바와 같이, BRAF 유전자의 염기 서열에 있어서, B-Raf의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기에 변이를 초래하는 변이가 검출된 환자 A에 있어서는, 암의 진행이 인정되고, 환자 A의 암세포는 항EGFR 항체약에 대하여 내성을 갖고 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> Denka Company Limited Niigata University <120> A method of determining resistance of cancer cell against anti-EGFR antibody drug <130> FP17-0160-00 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45 Asn Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu 85 90 95 Gln Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140 Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe 145 150 155 160 Leu Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile 195 200 205 Gly Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 210 215 220 Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys 225 230 235 240 Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Gln Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Pro Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro 325 330 335 Ser Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350 His Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn 355 360 365 Val His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg 370 375 380 Asp Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala 385 390 395 400 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu 405 410 415 Gln Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp 435 440 445 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly 450 455 460 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val 465 470 475 480 Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gln Gln Leu Gln 485 490 495 Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ala Ile Val 515 520 525 Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile 530 535 540 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr 545 550 555 560 Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp 565 570 575 Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile 580 585 590 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His 595 600 605 Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val 610 615 620 Ile Arg Met Gln Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr 625 630 635 640 Ala Phe Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gln Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys Ile His Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly Phe Gln Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His 755 760 765

Claims

암을 앓고 있는 인간 환자에게 있어서, 상피성 세포 성장 인자 수용체 저해제에 대한 암세포의 내성을 판정하는 방법으로서,
상기 인간 환자로부터 채취된 상기 암세포를 포함하는 샘플을 사용하여, 상기 암세포의 B-Raf 단백질의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기의 변이 유무를 결정하는 공정을 갖고,
상기 아미노산 잔기의 변이가 있는 경우에, 상기 암세포는 상기 상피성 세포 성장 인자 수용체 저해제에 대하여 내성이라고 판정하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 상피성 세포 성장 인자 수용체 저해제가 항상피성 세포 성장 인자 수용체 항체약인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변이 유무의 결정이, B-Raf 단백질의 아미노산 서열의 제326번째 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이의 검출을 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 염기 서열의 변이의 검출이, DNA 시퀀싱, 폴리메라아제 연쇄 반응, 대립 유전자 특이적 증폭, 대립 유전자 특이적 프로브에서의 하이브리다이제이션, 미스매치 절단 해석, 단쇄 고차 구조 다형, 변성 구배 겔 전기 영동 또는 온도 구배 겔 전기 영동에 의해 행해지는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이, 암 절제 조직 검체, 생검 검체, 복수 침윤 암세포, 혈액 순환 암세포, 혈청 또는 혈장인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 대장암 또는 직장암인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변이가 I326V인, 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 염기 서열의 변이가 c. 976A>G인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포가 야생형의 KRAS 유전자를 갖는, 방법.