KR20180126974A

KR20180126974A - 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 미백화장료 조성물

Info

Publication number: KR20180126974A
Application number: KR1020170062183A
Authority: KR
Inventors: 노호식; 최경오; 김동재
Original assignee: 수원대학교산학협력단
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2018-11-28
Also published as: KR101964929B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 미백화장료 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]

R_1,R₂는 수소, R₁는 히드록시이고 R₂는 수소 또는 R_1,R₂는 히드록시이다.

Description

아마이드 구조의 피토알렉신 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 미백화장료 조성물 {Amide type phytoalexin compound and preparation method thereof and whitening cosmetic composition containing it}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 미백화장료 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

사람의 피부색은 혈액 내의 적혈구, 카로틴 및 멜라닌에 의해서 복합적으로 결정되나 인종 간의 피부색 차이나 기미, 주근깨 등의 과색소증은 멜라닌에 의한 영향이다. 피부의 외각인 표피층에 존재하는 멜라닌은 자외선 차단의 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 역할을 하여 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 한다. 그러나, 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 또한, 생체 내에서 티로신(Tyrosine) 혹은 도파(DOPA)를 기질로 하여 티로시나제(Tyrosinase) 등의 효소를 촉매로 한 중합화 산화과정을 통해 피부에서 자유 라디칼(free radical) 생성이 많아지거나, 염증반응이 있거나 자외선 등을 받게되면 멜라닌 생성은 증가된다. 특히, 자외선은 멜라닌 생성을 증가시켜 부분적으로 증가된 멜라닌이 기미 등으로 발전하여 미관상 원하지 않는 결과가 생길 수도 있고 더 심하게는 피부암 등을 유발하여 생명에 위험을 줄 수도 있다. 이러한 이유들로 인하여 현재 알부틴, 글루타치온, 비타민 A, 비타민 C 등을 함유한 연고, 크림, 로션 등의 많은 멜라닌 생성 억제제가 개발되고 있으나 소비자들이 만족할 만한 미백효과를 갖는 미백제품은 없는 실정이다. 또한, 하이드로퀴논을 함유한 미백제의 경우는 어느 정도의 미백효과가 있지만, 피부자극이 심하여 그 이용이 제한적이다.

피토알렉신은 일반적으로 식물이 미생물과 접촉하였을 때, 식물에 의해 합성 축적되는 저 분자의 항균성 화합물을 말한다 (Trends in Plant Science, 2012, 17, 73). 식물이 병원체와 접촉한 후에 자신을 병원체로부터 보호하기 위해서 형성 된 방어물질인 데 이것은 병원성 미생물의 성장을 억제하는 효능을 나타낸다.

최근 연구결과에 의하면 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물들이 카네이션 줄기로부터 분리되었고, 이들의 구조가 확인 되었다 (Phytochemistry, 1991, 30, 3923 ; Phytochemistry, 1992, 31, 3761).

화합물의 구조는 아래와 같다.

화합물 1 : N-(3-Hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 2 : 2-Hydroxy-N-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide

화합물 3 : 2,4-Dihydroxy-N-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide

상기 화합물은 두 개의 페놀화합물이 아마이드 구조로 연결된 폴리페놀 화합물로서 멜라닌 생성 억제 효능을 나타낼 가능성이 있는 구조이다.

공개특허공보 제10-2013-0013197호 (공개일자: 2013.02.06)

Ahuja, I., Kissen, R., & Bones, A. M. (2012). Phytoalexins in defense against pathogens. Trends in Plant Science, 17(2), 73-90. Niemann, G. J., Liem, J., Pureveen, J. B., & Boon, J. J. (1991). The amide-type phytoalexin activity of carnation extracts is partly due to an artifact. Phytochemistry, 30(12), 3923-3927. Niemann, G. J., Liem, J., Hoof, A. V., & Niessen, W. M. (1992). Phytoalexins, benzoxazinones, N-aroylanthranilates and N-aroylanilines, from Fusarium-infected carnation stems. Phytochemistry, 31(11), 3761-3767.

이에, 본 발명자들은 상기 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물의 미백 효능을 확인하고자 하였다. 하지만 천연에는 미량으로 존재하므로 미백 효능을 측정하는데 충분한 양을 확보하는 데 어려움이 있다. 이러한 어려움을 해결하고자 유기 합성 방법으로 상기 화합물을 확보하였다.

얻어진 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물 들이 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 생성을 크게 억제함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 0.01-20중량%의 양으로 함유하는 미백화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 제공한다.

상기 화학식 1에서,

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 이용하는 멜라닌 생성 억제방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물을 제공한다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 멜라닌 생성억제 효능을 나타내는 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물 및 이를 함유하는 미백 화장료 조성물을 제공하는 효과를 가져온다.

본 발명의 효과는 전술한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 인식될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 제조 방법을 하기 반응식 1을 예로 들어 설명한다.

(A) 히드록시 벤조산과 초산 무수물, 트리에틸아민, 디메틸아미노피리딘을 이용하여 아세틸화 화합물을 제조하는 단계;

(B) 상기 (A) 단계에서 생성된 히드록시기가 아세틸로 치환된 화합물과 에틸클로로포메이트와 3-히드록시 아닐린을 이용하여 아미드를 제조하는 단계; 및

(C) 상기 (B) 단계에서 아미드 화합물의 아세틸기를 가수분해하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서,

R_1,R₂는 수소, R₁는 히드록시이고 R₂는 수소 또는 R_1,R₂는 히드록시이고,

R_3,R₄는 수소, R₃는 아세톡시이고 R₂는 수소 또는 R_1,R₂는 아세톡시이다.

본 발명에 따른 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물의 제조방법은 상기한 반응식 1에서 알 수 있는 바와 같이, 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(A) 히드록시 벤조산과 초산 무수물, 트리에틸아민, 다이메틸아미노피리딘을 이용하여 아세킬화 반응을 하여 상기 구조식(II)로 표현되는 아세틸화된 화합물을 제조하는 단계 :

본 발명의 제조방법 중 (A)단계에서 염기로는 피리딘, 트리에틸아민 등을 사용할 수 있으며, 용매로는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 등을 사용할 수 있다.

한편, 디메틸아미노피리딘을 촉매로 사용하여 화합물을 제조하여야 하며, 사용하지 않을 경우 반응이 진행이 어려우며 수율이 낮아지게 된다.

반응온도는 10 - 80℃이나, 40℃ 정도의 온도가 바람직하다.

(B) 상기 (A) 단계에서 생성된 아세틸화된 화합물과 에틸클로로포메이트(ethylchloroformate)와 3-히드록시 아닐린(3-hydroxyaniline)을 이용하여 아마이드를 제조하는 단계:

본 발명의 제조방법 중 (B)단계에서 구조식(II)의 아마이드 화합물의 제조는 산할로겐화법, 활성에스테르법, 산무수물(acid anhydride)법이 모두 가능하나, 에틸클로로포메이트를 이용하여 무수물 상태로 치환하는 방법이 가장 바람직하며, 여기에 3-히드록시 아닐린으로 치환하여 화합물 (III)을 제조한다. 화합물 (Ⅱ)와 반응하는 3-히드록시 아닐린의 당량비는 1.1 - 1.3 이 바람직하다. 당량비가 1 : 1 미만이면 목적하는 생성물의 양이 적다.

본 발명의 제조방법 중 (B)단계에서 염기로는, 피리딘, 트리에틸아민과 같은 염기가 사용될 수 있으나, 트리에틸아민을 사용하는 것이 바람직하다. (B)단계에서 반응용매로는 디클로로메탄, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란 등이 사용될 수 있으나, N,N-디메틸포름아미드와 테트라히드로퓨란을 사용하는 것이 바람직하다. 한편 반응온도는 10- 60℃이나, 30℃ 정도의 온도가 바람직하다.

(C) (B)에서 얻은 구조식 (III)의 화합물을 염기와 반응하여 가수분해하는 단계 :

본 발명의 제조방법 중 (C)단계에서 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 알칼리 금속 수산화물이 사용될 수 있다. (C)단계에서 반응용매로는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 테트라하이드로퓨란, 다이클로로메탄 등이 사용될 수 있으나, 테트라하이드로퓨란과 메탄올을 섞어 사용하는 것이 가장 빠른 시간에 반응을 완결시킬 수 있다. 메탄올과 테트라하이드로퓨란의 비율은 1 : 1 - 1 : 5 까지 모두 가능하며 이중 1 : 1 비율이 바람직하다.

상기의 제조방법에 의해 얻어지는 화학식 1의 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물의 구체적인 예로는,

화합물 1 : N-(3-Hydroxy-phenyl)-benzamide,

화합물 2 : 2-Hydroxy-N-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide,

화합물 3 : 2,4-Dihydroxy-N-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide,

를 들 수 있다.

상기한 제조방법에 의해 제조한 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물은 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 생성을 크게 억제함으로서 피부 미백효과를 나타낼 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명에 따른 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물의 제조방법 및 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 생성 억제 효과를 보다 구체적으로 설명한다.

[실시예 1] N-(3-Hydroxy-phenyl)-benzamide 의 제조

벤조산(100g, 0.81mol)을 테트라하이드로퓨란(1500㎖) 에 녹이고 트리에틸아민(82.8g, 0.81mol)을 적가 한 후 여기에 1.3당량의 에틸클로로포메이트(115g, 1.06mol)을 천천히 적가시킨 후 30분간 교반하고 여기에 3-히드록시 아닐린(89.3g, 0.81mol)과 트리에틸아민(82.8g, 0.81mol)을 N,N-디메틸포름아미드 1500ml에 녹인 후 천천히 적가한 뒤 3시간 동안 추가 교반하였다. 반응이 완결된 후 여과하고 반응액을 농축시킨 다음 디클로로메탄 1500ml에 다시 녹인 후 증류수(500ml)로 씻어준 후 포화된 탄산수소나트륨 500ml로 씻어준 다음 무수 망간(100g)으로 건조시킨 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화한 후 여과하여 148g(수율 = 85%)의 목적물을 미황색 고체로 얻었다.

TLC(초산 에틸 : 헥산 = 1 : 1) Rf = 0.47

¹H NMR(DMSO-d6, δ) : 10.11 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 7.93 (m, 2H), 7.55 (m, 3H), 7.35 (s, 1H), 7.10 (m, 2H), 6.51 (d, 1H, J = 7.8 Hz).

[실시예 2] 2-Hydroxy-N-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide 의 제조

2-히드록시 벤조산(100g, 0.72mol)을 1000㎖의 다이클로로메탄에 녹인 다음 다이메틸아미노피리딘을 촉매량(8.8g, 0.072mol) 넣고 5분간 환류 시킨 다음 트리에틸아민(146g, 1.44mol)을 적가한다. 여기에 초산 무수물(147g, 1.44mol)을 천천히 적가하고 반응온도 40도에서 2시간 동안 환류 시킨다. 반응이 완결된 후 반응용액을 다이클로로메탄(1000ml)을 적가하여 희석시킨 후 물 1000㎖를 넣어 씻어준 후 1M HCl용액 500ml으로 씻어준 다음, 무수 망간(100g)으로 건조시킨 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화 한 후 여과하여 108g(수율 = 83%)을 얻었다. 이 화합물(100g, 0.55mol)을 테트라하이드로퓨란(1500㎖)에 녹이고 트리에틸아민(56.1g, 0.55mol)을 적가 한 후 여기에 1.3당량의 에틸클로로포메이트(77.6g, 0.715mol)을 천천히 적가시킨 후 30분간 교반하고 여기에 3-히드록시 아닐린(60g, 0.55mol)과 트리에틸아민(56.1g, 0.55mol)을 N,N-디메틸포름아미드 1500ml에 열을 가하여 녹인 후 천천히 적가한 뒤 3시간 동안 추가 교반하였다. 반응이 완결된 후 여과하고 반응액을 농축시킨 다음 디클로로메탄 1500ml에 다시 녹인 후 증류수(500ml)로 씻어준 후 포화된 탄산수소나트륨 500ml로 씻어준 다음 무수 망간(100g)으로 건조시킨 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화한 후 여과하여 155g(수율 = 79%)을 얻었다. 이 화합물(100g, 0.36mol)을 테트라하이드로퓨란과 메탄올 (1 : 1) 용매 1500㎖에 녹인 뒤 15%의 수산화칼륨을 넣고 100ml을 넣고 30분 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 산을 가하여 중화하고 반응액을 농축시킨 후 초산에틸 1500ml을 넣고 녹인후 물 1000ml로 씻어준 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화한 후 여과하여 77.7g(수율 = 92%)의 목적물을 미황색 고체로 얻었다.

TLC(초산 에틸 : 헥산 = 1 : 1) Rf = 0.45

¹H NMR(DMSO-d6, δ) : 11.79 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 7.93 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.42 (m, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.13 (m, 2H), 6.88 (m, 2H), 6.53 (d, 1H, J = 7.8 Hz).

[실시예 3] 2,4-Dihydroxy-N-(3-hydroxy-phenyl)-benzamide 의 제조

2-히드록시벤조산 대신에 2,4-디히드록시벤조산을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 목적물(67g, 90%수율)을 미황색 고체로 얻었다.

TLC(초산 에틸 : 헥산 = 1 : 1) Rf = 0.43

¹H NMR(DMSO-d6, δ) : 12.12 (s, 1H), 10.16 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 7.88 (d, 1H, 8.7 Hz), 7.22 (s, 1H), 7.11 - 7.01 (m, 2H), 6.52 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 6.34 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 6.31 (s, 1H).

[시험예 1] 티로시나제 활성 억제효과 측정

상기 실시예 1 내지 3에서 수득한 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물들의 티로시나제 억제효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 버섯유래의 티로시나제와 티로신은 Sigma Chemical로 부터 구매하여 사용하였다. 티로시나제 활성은 0.1 M 포스페이트 버퍼 (pH 6.5) 150 마이크로 리터와 8 마이크로 리터의 버섯 티로시나제 (2,100 unit/ml, 0.05 M 포스페이트 버퍼, pH 6.5), 36 마이크로리터의 1.5 mM 농도의 L-티로신과 함께 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물 (실시예 1 내지 3과 코지산)을 농도 별로 처리하였다. 티로시나제 활성은 37도에서 20분 동안 효소반응을 진행 시킨 후에 마이크로플레이트 리더기 (Bio-Rad 3550, Richnmond, CA, U.S.A.)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 다음의 식에 의거하여 실시예 1 내지 3의 반응생성물에 의한 티로시나제 저해효과를 구하였다. 대조군으로 코지산을 사용하였다.

티로시나제 저해율 (%) = 100 - ((각 시료의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)X100)

상기 공식에 의해 각 시료의 단계별 희석 용액의 티로시나제 저해율로부터 티로시나제 활성을 50% 감소시키는 각 시료의 용량을 구하였다. 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다.

시험물질	티로시나제 활성 억제 (IC₅₀)
코지산	50.29 μM
실시예 1의 화합물	〉500.00 μM
실시예 2의 화합물	〉500.00 μM
실시예 3의 화합물	37.17 μM

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1과 실시예 2 화합물은 티로시나제 활성을 50% 감소시키는 농도가 500.00 μM 이상이었다. 하지만 실시예 3 화합물의 경우는 티로시나제 활성을 37.17 μM 농도에서 50% 감소하였다. 이 결과는 대조군으로 사용한 코지산 보다 좋은 효과이다.

[시험예 2] 멜라닌 색소생성세포에서의 멜라닌 생성억제효과

상기 실시예 1 내지 3의 세포 내의 멜라닌 생성 정도를 측정하였다. 세포주는 B16 멜라노마 세포주를 사용하였다. 배양은 10% 소태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일 포르볼(Tetradecanoyl Phobol)-13-아세테이트(Acetate), 1nM 콜레라 톡신(Cholera Toxin)을 함유한 DMEM 배지, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 이루어졌다. 배양된 B16 멜라노마 세포를 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어내고, 24-배양용기(well plate)에 다시 동일한 숫자(1×105 cells/well)로 깔은 후에 이틀째부터 3일 연속으로 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물 (실시예 1 내지 3)과 코지산을 포함시킨 배지로 교체하는 방식으로 물질 처리를 하였다. 5일째 이후에 1N NaOH를 처리하여 세포에 포함된 멜라닌을 녹여내어 400㎚에서의 흡광도 측정을 통해 멜라닌의 양을 측정하였다.

다음의 식에 의거하여 실시예 1 내지 3의 반응생성물에 의한 멜라닌생성 억제 효과를 구하였다. 대조군으로 코지산을 사용하였다.

멜라닌생성 저해율 (%) = 100 - ((각 시료의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)X100)

상기 공식에 의해 각 시료의 단계별 희석 용액의 멜라닌생성 저해율로부터 멜라닌생성을 50% 감소시키는 각 시료의 용량을 구하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.

멜라닌생성 저해효과

시험물질	멜라닌 생성억제 (IC₅₀)
코지산	2.10 mM
실시예 1의 화합물	90.53 μM
실시예 2의 화합물	24.60 μM
실시예 3의 화합물	24.80 μM

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1, 실시예 2 그리고 실시예 3 화합물 모두 대조군으로 사용한 코지산 보다 좋은 효과를 보였다. 코지산의 멜라닌 생성을 50% 감소시키는 농도는 2.10 mM 이었다

[제형예 1] 영양화장수(밀크로션)의 제조

표 3에 제시된 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 함유하는 영양화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량 %)
1. 정제수	잔량
2. 글리세린	8.0
3. 부틸렌글라이콜	4.0
4. 히아로론산 추출물	5.0
5. 베타글루칸	7.0
6. 카보머	0.1
7. 피토알렉신 유도체	적량
8. 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	8.0
9. 스쿠알렌	5.0
10. 세테아릴 글루코사이드	1.5
11. 소르비탄 스테아레이트	0.4
12. 세테아릴 알코올	1.0
13. 방부제	적량
14. 향	적량
15. 색소	적량
16. 트리에탄올아민	0.1

[제형예 2] 영양크림의 제조

표 4에 제시된 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 함유하는 영양크림을 제조하였다.

성분	함량(중량 %)
1. 정제수	잔량
2. 글리세린	3.0
3. 부틸렌글라이콜	3.0
4. 유동파라핀	7.0
5. 베타글루칸	7.0
6. 카보머	0.1
7. 피토알렉신 유도체	적량
8. 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
9. 스쿠알렌	5.0
10. 세테아릴 글루코사이드	1.5
11. 소르비탄 스테아레이트	0.4
12. 폴리솔베이트	1.2
13. 방부제	적량
14. 향	적량
15. 색소	적량
16. 트리에탄올아민	0.1

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R_1,R₂는 수소, R₁는 히드록시이고 R₂는 수소 또는 R_1,R₂는 히드록시이다.
청구항 1에 의한 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 이용하는 멜라닌 생성 억제방법.
청구항 1에 의한 아마이드 구조의 피토알렉신 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.