KR20180125502A - 이온적으로 가교결합된 겔의 형성방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 겔의 형성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 경쟁적 리간드 교환을 이용하여 가교결합된 중합체 하이드로겔을 형성하는 방법에 관한 것이다.

Description

이온적으로 가교결합된 겔의 형성방법
본 발명은 겔의 형성에 관한 개선에 관한 것으로, 특히 본 발명은 경쟁적(competitive) 리간드 교환을 이용하여 가교결합된 중합체 하이드로겔을 형성하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 개선된 가교결합된 중합성 겔이 제공된다. 본 발명의 추가적인 양태에서, 본 발명의 가교결합된 중합체 겔을 제조하기 위한 부품으로 구성된 키트가 제공되고, 본 발명의 더 추가적인 양태에서, 본 발명의 겔을 위한 다양한 용도가 제공된다.
하이드로겔 형성 중합체는 자연적 또는 합성적 유래일 수 있다. 하이드로겔은 다른 것들 중 식품, 약학 및 바이오메디컬 산업 내 매우 다양한 응용들에서 사용된다. 이러한 부류의 물질은 물리적 및/또는 화학적 가교결합에 의해 수성 상 중에 안정화된 3차원 중합체 네트워크로 구성된다. 화학적으로 가교결합된 하이드로겔은 공유결합에 의해 형성된 영구적인 접합을 포함하는 반면 (예를 들면 폴리아크릴아미아드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히알루론산, 키토산 유도체, 등), 물리적 네트워크는 중합체 체인의 뒤엉킴(entanglement)(예를 들면 폴리비닐 알코올, 콜라겐, 젤라틴, 많은 폴리사카라이드), 이온성 (예를 들면 알지네이트, 펙틴 등) 및 수소 결합 또는 소수성 상호작용에 의해 유도된 일시적이고, 가역적인 접합을 갖는다. 하이드로겔은 반응성 기를 중합체 체인에 혼입시켜, 화학적인 수단에 의해 중합체를 가교결합성으로 만들거나, 또는 빛, 열 또는 pH 또는 이들의 조합과 같은 자극에 대한 반응성으로 만드는, 수용성 중합체의 변형에 따라서도 형성될 수 있다.
화학적 가교결합은 겔 형성 동력학 및 가교결합의 정도의 좋은 조절을 제공할 수 있다. 그러나, 중합체의 화학적 변형은 몇 가지 단점, 특히 바이오메디컬, 약학 및 식품 응용에서의 단점을 갖고, 여기서 화학적 순도 및 반응성이 주어진 응용에서의 물질 성능을 저해할 수 있다, 예를 들면 물질 염증성, 비-생체친화성 또는 독성으로 만들 수 있다. 그러므로 규제 문제가 발생할 수 있다. 또한, 이러한 변형은 최종 제품에 복잡성 및 관련된 비용을 부가한다.
바이오메디컬 응용에서, 이온성 가교결합은 특히 매력적이며, 이는 이것이 중합체의 공유결합적 변형을 필요로 하지 않고 겔 형성의 온화하고 가역적인 수단을 제공하기 때문이고, 이는 단백질 구조 보존 및 세포 캡슐화와 같은 응용에서 매력적이기 때문이다. 그러나, 이온적으로 가교결합된 겔 공정의 동력학은 조절이 어려우며, 이는 이들이 이온이동성 중합체(ionotropic polymer) 및 무기 이온 간의 상호작용에 의해 좌우되기 때문이다. 주로, 이온성 겔화(gelling)는 극도로 빠르고, 물 중에서 매우 빠른 이온성 확산에 의해 제한된다 (예를 들면 물 중에서 Ca2+ 확산 계수는
Figure pct00001
1.2 x 10-5 cm2 s-1). 이것은 필요시 겔화를 요구하는 응용 (예를 들면 투여의 시점에서 주사가능하게 되는 것을 필요로 하는 치료적 조성물)이 이러한 접근을 이용하여 실현가능하지 않거나 어렵다는 것을 의미한다.
더 느리게, 내부 겔화 방법(internal gelation method)이라 불리는, 산 의존적인 겔화 메커니즘은 또한 광범위하게 연구되어 왔다. 이들은 킬레이트, 주로 Ca-에틸렌디아민테트라아세트산 (Ca-Ethylenediaminetetraacetic acid; Ca-EDTA)로서(K. Toft, Progress in Food and Nutrition Science 1982, 6, 89), 또는 고체, 주로 칼슘 카보네이트 (CaCO3)로서(K. I, Draget, K, Ostgaard, O. Smidsrod, Applied Microbiology and Biotechnology 1989, 31, 79), 중합체 용액 내에 포함된 겔화 이온에 의존한다. WO2006044342 및 US20110117172은 모두 칼슘 이온을 방출하여 중합체의 가교결합으로 이어지기 위해 pH 변화를 요구하는 선행 기술의 방법을 개시한다. Ca2+는 수용성 산의 도입에 의해 빠르게 pH를 낮춤으로써 생성되거나 또는 D-글루코노-δ-락톤(D-glucono-δ-lactone; GDL)의 가수분해에 의해 더 느리게 생성되어, 겔의 느린 형성을 가능하게 하여 주입가능한 또는 성형가능한(moldable) 제제가 달성되는 것을 가능하게 한다. 그러나, Ca-EDTA 착체가 사용될 때, pH는 Ca2+ 이온이 방출되기 위해 pH 5 미만으로 감소되어야만 하며, 이는 세포 또는 단백질 캡슐화와 같은 특정한 응용에서 금지될 수 있다. CaC03 / GDL의 양을 변형시키는 것은 겔화가 중성 조건에서 발생하는 것을 가능하게 할 수 있고, 낮은 pH와 관련된 문제를 감소시킬 수 있다. 그러나, C02 기체가 발생되어 겔 내 버블을 유발시킨다. 추가적으로, 칼슘의 고체 공급원의 사용은 작은 규모의 겔 생성, 특히 고체 CaC03가 마이크로채널을 방해하는 마이크로유체 액적 생성에서 제한의 원인이 된다. 고체 CaC03 공급원의 사용은 또한 제조가 여과에 의해 살균될 수 없음을 의미하고 또한 겔 내의 칼슘의 비균질적인 분포을 초래하는 고체 입자의 침적과 관련된 문제가 있을 수 있음을 의미한다. GDL 성분과 관련하여, 이러한 화학의 가수분해는 극도로 느리고, 이러한 방법에 의해 생성된 겔은 완전히 가교되기에 수 시간이 걸린다. CaC03의 입자 크기를 변화시킴으로써 겔화 동력학에 대한 일부 조절이 있음에도 불구하고, 겔화는 항상 수 시간 단위의 시간이 걸린다. 또한, GDL 용액은 새 것으로 준비되어야만 하고 이는 GDL 용액이 물과 접촉시 자연적으로 가수분해가 시작되기 때문이다. 많은 시간의 연구에도 불구하고, 이온이동성 겔 형성의 동력학을 조절하는 간단하고 융통성 있는 방법은 존재하지 않는다.
그러므로 전술한 문제를 극복하는 겔의 생성을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이 유익할 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면 제1 용액 및 제2 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 가교결합된 중합체 겔의 형성방법이 제공되며, 상기 제1 용액은 가교결합제 및 제1 킬레이트제(chelating agent)를 포함하고; 상기 제2 용액은 치환제(displacing agent)를 포함하고; 상기 제1 또는 제2 용액 중 적어도 하나는 이온이동성 중합체를 함유하고; (a) 상기 이온이동성 중합체는 상기 제1 킬레이트제보다 상기 가교결합제에 대해 더 낮은 친화도(affinity)를 갖고, (b) 상기 제1 킬레이트제는 상기 가교결합제보다 상기 치환제에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 상기 이온이동성 중합체는 상기 치환제에 대해 낮은 친화도를 갖는다.
이 방법은 경쟁적인 리간드 교환을 이용하여 겔 형성 중합체의 수용액에 대한 가교결합제의 방출을 조절한다. 이것은 경쟁적인 리간드 교환이 이온성으로 가교결합 하이드로겔의 제조에 처음으로 사용된 것이다.
본 발명의 구현예는 동반된 다음의 도면을 참조로 하여 아래에서 자세히 설명된다:
도 1은 제1 킬레이터 및 제2 킬레이터를 이용한 리간드 교환 메커니즘의 도식적인 다이어그램이다.
도 2는 유동학(rheology)에 의해 측정된 겔 형성의 동력학을 나타내며, pH의 함수로서 리간드 교환을 이용하여 가교결합된 알지네이트 겔에 대한 시간이 지남에 따른 기계적인 특성에서의 변화를 보여준다. 정의된 pH를 갖는 2개의 알지네이트 용액의 혼합 후, 저장 탄성률(storage modulus) 및 손실 탄성률(loss modulus)을 시간의 함수로 기록했다. 혼합 후, 저장 탄성률은 pH 증가에 따라 더 느리게 증가한다. 겔 형성의 지점은 G'=G"이 되는 시점에 의해 정의된다. G'은 저장 탄성률이다. G"은 손실 탄성률이다. 유동학적 특성화를 Paar Physica MCR 300 유동계(Rheometer)를 이용하여 수행했다. 소형화된 벽 슬립(minimal wall slip)이 구비된, 가장자리가 톱니 모양으로 된(serrated) 플레이트 표면 (PP50 가장자리가 톱니 모양으로 된 플레이트, 직경 = 50 mm)을 갖는 평행한 플레이트 형태를 사용했다. 1 mm의 측정 갭에서 저장 탄성률 및 손실 탄성률을, 10 %의 일정한 변형(strain) (γ), 1 rad s-1의 각 진동수(ω), 1 mrad의 진폭 및 25 ℃의 온도에서, 시간의 함수로 기록했다. 2 성분 겔의 각각의 동일한 부피(1.75 mL)를, 5 mL 피펫을 이용하여 유동계 플레이트 상에서 측정했다. 첫번째 성분을 바닥 플레이트 상에 직접 위치시켰고 이어서 다른 성분을 측정 시작 바로 전에 이로 피펫팅(pipetting)했다. 이러한 접근을 이용하여 대략 30초의 지연 시간이 제2 고분자 용액의 전달 시간으로부터 데이터 수집의 시작까지 발생했다.
도 3은 경쟁적 리간드 교환을 이용하여 형성된 겔의 EPR 특성화를 나타낸다. 그래프 A 및 B는 각각 Mn-EDDA 및 Mn-EDTA을 갖는 알지네이트 샘플을 나타낸다. 그래프 C는 지시된 시점에서 Ca-EDTA 및 Mn-EDDA의 혼합 후 기록된 분광을 나타낸다. 그래프 D는 Mn2+로 가교된 알지네이트의 분광을 나타낸다.
도 4는 혼합 전에 그리고 생성된 벌크 겔 중에서, CaEDTA 및 MnEDDA을 함유한 전구체 알지네이트 샘플 중에 배양된 MC3T3-E1 쥐의 조골아세포(murine pre osteoblast cell)의 세포 생존율을 나타낸다. 배양 시간은 80분이었다. 생 염색(live stain): Calcein-AM, 사 염색(dead stain): 에티듐 호모다이머-1(Ethidium homodimer-1). 이러한 결과는 Zn을 이용하여 또한 보여졌다.
도 5는 60 mM 농도의, 세포 매질에 가해진 본 발명의 지시된 개별적인 화학 성분에 대해 2시간의 노출 후 톨루이딘 블루 침윤 (toluidine blue infiltration)에 의해 결정된 C3T3-E1 쥐의 조골아세포의 세포 생존율을 나타낸다. *세포 생존율에서 현저한 차이 (P< 0.05)가 양성의(비처리된) 대조 세포와 비교할 때 모든 시험된 실험군에서 관찰되지 않았다. n=3, Holm-Sidak의 사후 시험(post hoc test)의 일원배치분산분석(one way ANOVA)을 적용했다. 음성 대조군은 0.1 % triton-X가 처리된 세포였다. DIL 매질은 물로 시험 용액과 동일한 정도(40%)로 희석된 세포 매질이다.
도 6은 본 발명에 따른 마이크로유체 장치의 실시예를 나타낸다 (도 6a). 도 6b는 세포의 캡슐화가 발생하는 장치의 영역의 현미경 이미지를 나타낸다. 도 6c 및 6d는 이러한 방법에 의해 생성된 캡슐화된 포유류의 세포를 함유한 최종적인 겔 비드를 나타낸다.
도 7은 알지네이트 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 남세균 시네코시스티스 종(cyanobacteria Synechocystis sp)의 현미경 이미지를 나타낸다. 모든 이미지는 20x 렌즈를 갖는 Leica SP5 공초점 현미경(confocal microscope)으로 취해진다. 이미지는 비춰진 부분(bright field)의 겹쳐진 이미지이고 조류에 의해 생성된 클로로필의 자동 형광(auto fluorescence)을 포착한 형광 이미지이다. 스케일 바: 20 ㎛.
도 8은 알지네이트 비드 내에 캡슐화된 조류 클라미도모나스 레인하티 (Chlamydomonas reinhardtii) CC-4532의 현미경 이미지를 나타내고, 샘플의 이미지는 캡슐화 후 0(a), 24(b), 48(c) 및 72(d) 시간에 취해졌다. 모든 이미지는 20x 렌즈를 갖는 Leica SP5 공초점 현미경에서 취해진다. 이미지는 비춰진 부분의 겹쳐진 이미지이고 조류에 의해 생성된 클로로필의 자동 형광을 포착한 형광 이미지이다. 스케일 바: 20 ㎛.
도 9는 유동학에 의해 측정된 겔 형성의 동력학을 나타내고, 2 단계 겔화를 이용하여 가교결합된 알지네이트-콜라겐 겔 (0.4% 알지네이트, 1% 콜라겐, pH 7.4)에 대한 시간이 지남에 따른 기계적 특성의 변화를 나타낸다. 1 단계(0 - 1800 s) 동안 알지네이트는 경쟁적인 리간드 교환을 이용하여 겔화되고 이는 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")에서의 증가를 유발한다. 겔 지점 (G'및 G"이 교차하는 지점)은 대략 500 s이다. 1 단계 동안, 온도는 4℃에서 유지되고, 이는 후에 온도가 빠르게 증가되고 측정의 나머지 동안 37 ℃에서 유지된다. 온도의 증가는 콜라겐의 겔화를 유발하고, 이는 온도 증가 후 (대략 100 s) 즉시 일어난다. 콜라겐의 겔화는 가열에 반응하여 1800 - 1900 s 사이에 발생하는 초기 하락 다음에 G' 및 G"에서의 추가적인 증가를 초래한다. 유동학적 특성화는 도 2에서 설명된 것과 같이 수행되었다.
도 10은 알지네이트에서 리간드 교환 가교결합 및 콜라겐에서 열적으로 유발된 가교결합의 조합에 의해 생성된 알지네이트-콜라겐 하이드로겔 내에서 성장한 C3T3 E1 쥐의 조골아세포의 형광 공초점 광 마이크로그래프(3D rendering)의 스택(stack)의 3D 렌더링(3D rendering)을 나타낸다. 세포는 배양 7일 후 잘 부착되고 배양 7일 후 겔 내에서 퍼진다. 녹색 형광은 calcein-AM으로 염색된 살아있는 세포로부터 얻었다. 이미지를 Leica SP5 공초점 현미경을 이용하여 취했다. 필드(Field) = 775 x 775 ㎛.
이온성 중합체는 이온에 의해 가교결합되어 겔을 형성할 수 있는 임의의 중합체일 수 있다. 바람직하게는 금속 이온이 가교결합에 사용된다. 바람직하게는 이온은 다가 양이온이다. 더 바람직하게는 이온은 2가 양이온이다. 이온이동성 하이드로겔-형성 생물고분자(biopolymer), 고분자전해질(polyelectrolyte) 및 합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 중합체들은 이미 당업자에게 알려져 있다. 다가 이온을 이용하여 가교결합되어 겔을 형성할 수 있는 이온성 중합체의 예시는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 폴라사카라이드, 예를 들면 카라나진(carrageenan), 덱스트란, 겔란, 스클레로글루칸(scleroglucan), 키토산 및 이의 유도체; 수용성 폴리포스파진(polyphosphazenes), 예를 들면 폴리(비스(4-카복시페녹시)포스파진) (poly(bis(4-carboxyphenoxy)phosphazene)); 소듐 폴리아크릴레이트; 및 폴리아미노산. 바람직하게는, 사용되는 중합체는 알지네이트, 펙틴 또는 폴리갈락투로네이트(polygalacturonate)이다. 더 바람직하게는, 사용된 중합체는 알지네이트이다.
이온성 중합체는 바람직하게는 용매, 바람직하게는 수용성 용매, 바람직하게는 물, 더 바람직하게는 증류수 중에서 용해된다. 모든 다른 반응물, 에컨대 치환제, 가교제 및 킬레이트제는 바람직하게는 수용성이다.
제1 용액 또는 제2 용액 중 어느 하나는 이온이온성 중합체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 바람직한 구현예에서, 두 용액 모두 이온이동성 중합체를 포함한다. 상기 이온이동성 중합체는 각 용액 중에서 동일할 수 있다.
대안적으로, 제1 용액 및 제2 용액은 상이한 이온이동성 중합체를 함유할 수 있다. 이러한 경우, 생성된 겔은 상이한 중합체의 혼합물일 수 있다.
킬레이트제 또는 킬레이터는 금속 이온을 격리(sequester)할 수 있는 분자이다. 사용될 수 있는 킬레이트제의 예시는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 합성 킬레이터, 예를 들면 EDTA, EGTA, EDDA, CDTA, PDTA, BAPTA, HPED, TES, TRIS, Tricine 및 NTA; 컴플렉손(complexone); 크라운 에터; 히스타딘(histadine); 뉴클레오티드(nucleotide); 뉴클레오시드(nucleosides); 포르피린(porphyrins);, 포스포네이트; 시트레이트; 사이드로포어(siderophore); 아미노산 및 펩타이드.
선택된 이온이동성 중합체와 함께 하이드로겔을 형성하는 임의의 가교결합제가 사용될 수 있다. 본원 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 가교결합제(cross-linking agent) 및 겔화제(gelling agent)는 상호교환적으로 사용된다. 바람직하게는 가교결합제는 가교결합 이온(cross-linking ion)이다. 예를 들면, 알지네이트가 중합체로 사용되는 경우, 다가 양이온, 바람직하게는 2가 금속 이온이 사용된다.
교환제(exchange agent)로도 알려진 치환제(diplacing agent)는 가교결합제를 방출하기 위해서 제1 킬레이터를 바인딩(binding)할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 따라서, 제1 용액 및 제2 용액의 혼합에서, 치환제는 가교결합제를 대신하며 이는 그러면 이온이동성 중합체를 가교결합하기에 자유롭게 만들며, 하이드로겔의 형성을 유발시킨다. 반응이 진행되기 위해서는 치환제가 가교결합제보다 킬레이트제에 대해 더 큰 친화도를 갖는 것이 필수적이다. 바람직하게는, 치환제는 이온, 더 바람직하게는 다가 금속 이온이다. 다가 이온은 일가 이온보다 킬레이트제에 대해 더 큰 친화도를 갖는 경향이 있다. 바람직하게는 치환제는 가교결합제와 적어도 동일한 또는 더 높은 원자가(valence)를 갖는다.
가교결합제 및 치환제(들)은 바람직하게는 다가 이온이고, 가교결합제 이온은 치환제 이온과 상이하다. 바람직한 구현예에서, 가교결합제 및 치환제는 Ca2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Al3+, V02+, Cu2+, Ba2+, Ho3+, Mg2+, Mn2+, Sr2+, Zn2+, Pb2+, Co2+ 및 Ni2+로 구성된 군으로부터 선택된 다가 금속 이온으로부터 독립적으로 선택된다. 더 바람직하게는 가교결합제는 Ca2+를 포함한다. 더 바람직하게는, 치환제는 Zn2+, Fe2+ 및 Mn2+로 구성된 군으로부터 선택된 다가 금속 이온, 더 바람직하게는 Zn2+을 포함한다. 가교결합제(들)은 동일할 필요는 없다, 즉 가교결합제의 혼합물일 수 있다. 유사하게, 치환제(들)은 동일할 필요가 없다. 이러한 혼합 제제들은 조성물의 겔화 특성의 조절을 가능하게 한다.
바람직하게는 제1 킬레이트제는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid; EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (ethylenediamine-N.N'-diacetic acid; EDDA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (propylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid; PDTA), 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (1,2-cyclohexanedinitrilotetraacetic acid; CDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid; BAPTA), 하이드록시페닐-에틸렌디아민 (hydroxyphenyl-ethylenediamine; HPED), 니트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid; NTA), 포르피린(porphyrin), 시트레이트(citrate), 포스포네이트(phosphonates), 및 사이드로포어(siderophores)로 구성된 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA) 및 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA)로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 제1 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA) 및 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA)로 구성된 군으로부터 선택되며, 더 바람직하게는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
바람직하게는, 이온이동성 중합체는 알지네이트, 펙틴, 폴리(갈락투로네이트) (poly(galacturonate)), 카라지난 (carrageenan), 덱스트란 (및 유도체), 젤란(gellan), 스클레로글루칸(scleroglucan), 키토산 (및 유도체), 수용성 폴리포스파젠(water soluble polyphosphazenes), 예컨대 폴리(비스(4-카복시페녹시)포스파젠 (poly(bis(4-carboxyphenoxy)phosphazene)), 소듐 폴리아크릴레이트, 및 폴리아미노산로 구성된 군으로부터 선댁된 것이고, 바람직하게는 알지네이트, 펙틴 및 폴리(갈락투로네이트)로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 가장 바람직하게는 알지네이트이다.
특이적인 바인딩 친화도에 대한 공개된 데이터는 용이하게 이용하능하고, 겔화 반응에서 시약들의 조합을 선택하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, Haug 및 Smidsrad, Acta Chemica Scandinavica, 1965, 19, 341는 알지네이트의 겔화를 가져오기 위해 필요한 이가 양이온에 대한 다음의 시리즈를 수립했다, 가장 낮은 농도를 필요로 하는 Ba2+ 및 가장 높은 농도를 필요로 하는 Mg2+로서: Ba < Pb < Cu < Sr < Cd < Ca < Zn < Ni < Co < Mn, Fe < Mg. 이러한 시리즈를, 잘-연구된 이온 킬레이트 제, 예를 들면 EDTA 및 이의 유도체의 친화도 시리즈에 비교함으로써, 알지네이트 시리즈가 상당히 상이할 수 있음이 분명해진다. 예를 들면, Zn2+ 및 Mn2+는 알지네이트에 약하게 결합하지만 EDTA에는 강하게 결합한다 (각각 Log K = 16.5 및 13.89). 친화도에서 이러한 차이점 및 이온이, 본질적으로 역동적인 물리적, 이온성 상호작용에 의해 고정된다는 사실은, 그러므로, 목적하는 고분자전해질에 이온을 겔화시키는 이용가능성을 조절하기 위해 활용될 수 있다. 예를 들면, 표 1은 일부 흔한 킬레이트제 및 Ca2+ 가교결합된 이온이동성 겔의 형성에서 목적하는 이온의 선택에 대한 이들의 친화도의 요약을 나타낸다. Smith 등으로부터 발췌된, 다른 반대되는 지시가 주어지지 않는 한, 25℃에서 선택된 양이온 및 리간드의 Log K값, 0.1 M의 배경 전해질 농도 (μ) 및 [ML]/[M][L]의 평형 지수(equilibrium quotient). 다른 반대되는 지시가 없는 한, 표준 참고 데이터(Standard Reference Data), 표준 참고 데이터 프로그램(Standard Reference Data Program), 미국표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology), 미국 상무부(U.S. Dept. of Commerce), 게이더스버그(Gaithersburg), MD 2004. 각 셀의 음영(shading)은, 이러한 양이온-리간드 조합이 알지네이트와 함께 일어나는 경우, 즉 이러한 복합체의 강도가 Ca-알지네이트보다 약한 경우, 겔이 형성될지 여부를 나타낸다.
Figure pct00002
& 다음으로부터 얻음: Ewin 및 Hill. A Thermometric Titrimetric Study of the Complexation of Alkaline-earth Metals by Linear Poly(aminocarboxylic) Acids. J. Chem Soc. Dalton Trans. 1983 865-868
￡ 다음으로부터 얻음: Kiss, Sovago 및 Gergely. Critical Survey of Stability Constants of Complexes of Glycine. Pure Appl. Chem. 1991:63(4):597-638. 모든 값은 35℃에서.
a 다음으로부터 얻음: Good 등. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 1966; 5(2): 467-477
b 다음으로부터 얻음: Ahmed. Formation Constants of Ternary Complexes Involving Some Metal Ions, Tricine, Dicarboxylic Amino Acids, as Well as N-(2-Acetamido)iminodiacetic Acid and 3-Amino-5-mercapto-1,2,4-triazole J. Chem. Eng. Data. 2003; 48(2): 272-276
c 다음으로부터 얻음 T. E. Furia, CRC Handbook of Food Additives, Taylor & Francis, 2nd edn, 1973.
표 1: 양이온-리간드 조합 및 이들의 알지네이트와 하이드로겔을 형성할 수 있는 능력
Figure pct00003
pH5 초과에서 Ca-EDTA 복합체를 함유하는 알지네이트 용액은 겔을 형성하지 않을 것이고, Zn2+ 이온의 충분히 낮은 농도를 갖는 알지네이트 용액도 겔을 형성하지 않을 것이다. 당업자라면 요구되는 이온의 정확한 양은 사용된 알지네이트의 농도 및 종류에 의존하는 것임을 이해할 것이나, 충분히 낮다는 것은 대략 9mM 이하를 의미한다. 5보다 낮은 pH에서, Ca2+에 대한 친화도는 EDTA보다 알지네이트에 대해 높을 것이고, 그러므로 중합체가 가교될 것이다. 두 용액이 함께 혼합될 때, 겔은 pH 5 초과에서 형성될 것이다. 이것은 Zn2+에 대한 EDTA의 친화도가 Ca2+보다 훨씬 크기 때문에, EDTA에 의해 킬레이팅된 Ca2+ 이온이 자유 Zn2+ 이온과 빠르게 치환되고 교환될 것이라는 사실로 인한 것이다. 칼슘 이온은 방출될 것이고, 자유 Ca2+가 알지네이트에 강하게 결합하기 때문에, 혼합시 겔이 빠르게 형성될 것이다. 여기서, Zn2+이 Ca-EDTA 착체에서 가교결합 이온(Ca2+)으로 교환되기 때문에, Zn2+는 치환제로 작용한다. pH를 조절함으로써, 겔화가 언제 일어날 지를 조절하는 것이 가능하다. pH 5 미만에서, 알지네이트는 EDTA보다 Ca2+에 대한 더 높은 친화도를 가질 것이고 그러므로 알지네이트를 가교결합된다. 당업자는 이러한 값이 킬레이터 및/또는 이온에 의존하여 변화될 것임을 이해할 것이고, 사용된 pH 또한 중합체의 PKa 값에 의존할 것임을 이해할 것이다. 강한 염기성인 pH에서, Zn이 사용될 경우 이는 ZnOH로 침전하는 경향을 가질 것이다.
바람직한 구현예에서, 이온이동성 중합체는 알지네이트이고, Ca2+가 가교결합제로 사용되고, Zn2+, Fe2+ 또는 Mn2+ 가 치환제로 사용된다. 본 발명자들은, 대략 9 mM Zn2+, 12 mM Fe2+ 또는 Mn2+의 최소 농도가 치환제로 사용되고 Ca2+가 가교결합제로 사용될 때, ZnCl2, FeS04 또는 MnCl2을 함유하는 1% 알지네이트 용액이 겔을 충분히 형성한다는 것을 발견하였다. 이러한 용액이 Ca-EDTA를 함유한 1% 알지네이트 용액과 혼합될 때, Ca-EDTA의 농도가 적어도 3 mM의 Ca2+의 최종 농도를 제공하기에 충분히 높다면, 수 초 내에 겔이 형성된다. 이러한 관찰은 또한, 알지네이트를 겔화시키기에 너무 낮은 농도에서(즉 대략 9 mM Zn2+ 미만, 또는 Fe2+ 또는 Mn2+에서 12 mM 미만)지만 3 mM의 임계 Ca2+ 농도 초과에서, Ca-EDTA 함유 알지네이트 용액이 수용성 Zn2+ Fe2+ 또는 Mn2+ 용액의 첨가시 겔화될 때 또는 수용성 Ca-EDTA가 Zn- Fe- 또는 Mn-알지네이트에 첨가될 때 반복되었다. 이러한 시스템에서 겔 형성은 두 용액이 혼합되고 다음의 반응이 잇따른 후 교환 반응의 동력학에 의해 결정된다: Zn2+ / Fe2+ / Mn2+ + Ca-EDTA→ Zn / Fe / Mn-EDTA + Ca2+.
앞서 설명된 접근법을 이용하여 형성된 하이드로겔은 꽤 빠르게 형성된다. 그러므로, 특히 바람직한 구현예에서, 제2 용액은 상기 치환제를 킬레이팅할 수 있는 제2 킬레이트제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 제2 킬레이트제는 i) 중합체보다 치환제에 대해 더 높은 친화도를 갖고; ii) 중합체보다 가교결합제에 대해 더 높은 친화도를 가지며; iii) 가교결합 이온 킬레이트제보다 치환제에 대해 더 낮은 친화도를 가져서, 반응이 계속 진행될 수 있도록 한다.
치환제는 또한 중합체의 가교결합을 예방하기 위해 킬레이팅될 수 있다. 그러나 가교결합이 일어날 수 있도록 하기 위해서, 이러한 목적을 위해 사용되는 제2 킬레이터는 중합체 자체보다 가교결합제에 대해 더 낮은 친화도를 가져야만 한다. 중합체는 치환제 이온 킬레이터보다 치환제에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 반응 조건은 pH 및 온도의 조절을 통해 가교결합제의 방출을 조절하기 위해 변형될 수 있다. 이것이 겔화 속도에 대한 좋은 조절을 가능하게 하기 때문에 이는 특히 유리하다. 또한, 이러한 접근법은 pH의 정의된 그리고 일정한 조건에서 사용될 수 있으며 이는 추가로 중성 또는 생리학적 (pH 7.4)일 수 있고 그러므로 바이오메디컬 응용에 매우 따르기 쉽다(amenable). 반응은 H+의 소모와 함께 진행되고, 그러므로 작은 pH 증가가 종종 발생한다. 일정한 pH를 유지하기 위해서는 완충액이 사용될 수 있다. 도 1은 2개의 킬레이트제를 이용한 리간드 교환 겔화의 도식적인 다이어그램을 나타낸다.
바람직하게는, 제1 및 제2 킬레이트제는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA), 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 하이드록시페닐-에틸렌디아민 (HPED), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄술폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올 (TRIS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신 (Tricine), 포르피린, 시트레이트, 포스포네이트, 아미노산, 펩타이드 및 사이드로포어로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고, 더 바람직하게는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA), 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA) 및 아미노아세트산 (글라이신)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
더 바람직하게는 제1 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA) 및 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA)로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 더욱 더 바람직하게는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
더 바람직하게는, 제2 킬레이트제는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 아미노아세트산 (글라이신) 및 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA)로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 더욱 더 바람직하게는 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA) 또는 아미노아세트산 (글라이신) 또는 이들의 혼합물이다.
시약의 특히 바람직한 조합은 아래 표에 나열된다. 치환제로서 Zn2+의 사용은 특히 바람직하다. 그러나, 유사한 방식으로 거동하는 다른 이온, 예컨대 Co2+ 및 Ni2+이 사용될 수 있다. 이온이동성 중합체는 제1 및/또는 제2 용액 중에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 이온이동성 중합체는 제1 및 제2 용액 모두 중에 존재한다.
이온이동성 중합체 가교결합제 제1 킬레이트제 치환제 제2 킬레이트제
1 알지네이트 Ca2+ EDTA Zn2+ EDDA
2 알지네이트 Ca2+ EDTA Mn2+ EDDA
3 알지네이트 Ca2+ EDTA Fe2+ EDDA
4 알지네이트 Ca2+ CDTA Zn2+ EDDA
5 알지네이트 Ca2+ PDTA Zn2+ EDDA
6 알지네이트 Ca2+ CDTA Zn2+ EDDS
7 알지네이트 Ca2+ PDTA Zn2+ EDDS
8 알지네이트 Ca2+ EDTA Zn2+ 글라이신
9 알지네이트 Ca2+ EDDS Zn2+ 글라이신
10 펙틴 Ca2+ PDTA Zn2+ EDDA
11 펙틴 Ca2+ CDPA Zn2+ EDDA
12 펙틴 Ca2+ PDTA Mn2+ EDDS
13 펙틴 Ca2+ CDTA Mn2+ EDDS
14 펙틴 Ca2+ EDTA Zn2+ EDDA
15 펙틴 Ca2+ EDTA Zn2+ EDDS
16 폴리(갈락투로네이트) Ca2+ PDTA Zn2+ EDDA
17 폴리(갈락투로네이트) Ca2+ CDTA Zn2+ EDDA
18 폴리(갈락투로네이트) Ca2+ PDTA Mn2+ EDDS
19 폴리(갈락투로네이트) Ca2+ CDTA Mn2+ EDDS
EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산
EDDA: 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산
PDTA: 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산
CDTA: 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산
EDDS: 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산
바람직하게는, 사용된 pH 범위는 아래와 같다:
중합체 pH 범위 가교결합제 제1 킬레이트제 치환제 제2 킬레이트제
알지네이트 5-8 Ca2+ EDTA Zn2+ EDDA
알지네이트 5-8 Ca2+ EDTA Mn2+ EDDA
알지네이트 5-8 Ca2+ EDTA Fe2+ EDDA
알지네이트 4-7 Ca2+ CDTA Zn2+ EDDS
알지네이트 4-7 Ca2+ CDTA Zn2+ EDDA
알지네이트 6.5-9.5 Ca2+ EDTA Zn2+ 글라이신
알지네이트 9-11 Ca2+ EDDS Zn2+ 글라이신
펙틴 4-6 Ca2+ PDTA Zn2+ EDDA
펙틴 4-6 Ca2+ CDTA Zn2+ EDDA
펙틴 4-6 Ca2+ PDTA Mn2+ EDDS
펙틴 4-6 Ca2+ CDPA Mn2+ EDDS
폴리(갈락투로네이트) 5-8 Ca2+ PDTA Zn2+ EDDA
폴리(갈락투로네이트) 5-8 Ca2+ CDTA Zn2+ EDDA
폴리(갈락투로네이트) 5-8 Ca2+ PDTA Mn2+ EDDS
폴리(갈락투로네이트) 5-8 Ca2+ CDTA Mn2+ EDDS
2차 킬레이터의 도입은 몇 가지 이점을 갖는다. 제2 킬레이트제의 사용은 겔을 형성하지 않고 용액 중에 가해지도록, 킬레이팅되지 않을 때, 중합체, 바람직하게는 알지네이트를 완전히 가교결합시키기에 필요한 것의 초과해서 높은 농도의 교환 이온을 가능하게 한다. 이는 강한 겔을 형성하는 고분자전해질 또는 중합체의 완전한 겔화를 가능하게 하거나 또는 실제로 임의의 정도의 겔화를 달성하기 위한 반응의 조절을 가능하게 한다. 두번째로, pH를 더 잘 조절할 수 있게 한다. Zn2+, Fe2+ 및 Mn2+와 같은 자유 교환 이온의 수용액은 산성인 경향이 있으며, pH의 증가에 따라 수산화 염을 침전시키는 경향이 있을 것 같다. 그러나, 이것은 이온이 완전히 킬레이팅될 때 방지되며, 이는 중합체 용액을 원하는 pH, 예를 들면 생리학적 pH에서 완충되도록 하는 것을 가능하게 한다. 또한, 이온 및 킬레이터 및 중합체 사이의 상대적인 친화도가 pH의 함수로서 변화할 것이기 때문에, 교환 반응의 속도는 결국 겔 형성의 동력학을 결정하고 이는 또한 pH에 크게 의존할 것이다.
EDTA/EDDA의 조합은 pH 5-8에서 알지네이트의 Ca2+ 가교결합에 잘 작용하고, 그러므로 알긴산 염에 비해 Ca2+에 대한 유사한 친화도를 갖는 임의의 중합체가 잘 작용할 것이다, 예를 들면 펙틴 및 l-카라지난.
본 발명의 방법은 바람직하게는 5℃ 내지 40℃, 더 바람직하게는 10℃ 내지 30℃에서 수행된다. 0℃ 미만 및 100℃ 초과의 극적인 온도는 피해야 한다. 바람직하게는, 방법은 4 내지 9의 pH, 바람직하게는 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 7.2 내지 7.4의 pH에서 수행된다. pH는 겔화의 반응 과정 동안 및/또는 겔화를 개시하기 위해, 변화될 수 있고, 바람직하게는 이러한 범위 내에서 변화될 수 있다.
바람직하게는, 제1 용액 중의 제1 킬레이트제의 농도는 2 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 180 mM, 더 바람직하게는 4 mM 내지 120 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 110 mM, 더욱 더 바람직하게는 10 mM 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 15 mM 내지 100 mM의 범위에 있다. 바람직하게는, 사용되는 경우, 제2 킬레이트제의 농도는 2 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 180 mM, 더 바람직하게는 4 mM 내지 120 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 110 mM, 더욱 더 바람직하게는 10 mM 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 15 mM 내지 100 mM의 범위에 있다.
바람직하게는, 제1 용액 중의 가교제의 농도는 2 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 180 mM, 더 바람직하게는 4 mM 내지 120 mM, 더욱 바람직하게는 4 mM 내지 110 mM, 더욱 더 바람직하게는 7 mM 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 12 mM 내지 100 mM의 범위에 있다.
바람직하게는, 제1 용액 중의 치환제의 농도는 2 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 180 mM, 더 바람직하게는 4 mM 내지 120 mM, 더욱 바람직하게는 4 mM 내지 110 mM, 더욱 더 바람직하게는 7 mM 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 12 mM 내지 100 mM의 범위에 있다. 치환제는 가교제와 비슷한 농도이여야 한다. 치환제의 양은 혼합 시 방출된 가교제의 양을 결정할 것이다.
최소 농도에서, 하이드로겔은 완전히 가교결합되지 않을 것인 반면, 가교결합 이온의 초과는 강한 겔을 제공할 것이다. 예를 들면, 최종 겔화 용액 중 ~4 mM 내지 120 mM Ca2+의 농도는 알지네이트 하이드로겔을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 1% 알지네이트 용액을 사용할 때, 하이드로겔은 ~4mM에서 완전히 가교결합되지 않으며 농도가 대략 ~30mM일 때까지 완전히 가교결합되지 않는다. 120mM의 가교결합 이온 및 치환 이온의 사용은 최종 제조에서 과량인 60mM를 줄 것이고 이는 알지네이트를 완전히 겔화시키기에 충분히 것보다 많기 때문이다. 알지네이트 용액을 사용하면, 완전한 가교결합이 일어나는 특정한 농도가 G 함량으로도 알려진, α-L-글루로네이트(α-L-guluronate) (G) 잔기의 수에 의존한다. 당업자는 가교결합제 및 치환제의 정확한 농도가 사용된 중합체 및 사용된 중합체 농도에 의존할 것이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 1% 초과의 농도에서 알지네이트 중합체는 더 높은 농도의 가교결합제에서 포화될 것이다.
바람직하게는, 상기 이온이동성 중합체는 0.1 - 20 중량/부피 %, 알지네이트에서 바람직하게는 0.5 - 5 중량/부피%의 범위로 혼합된 용액 중 농도로 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 용매, 바람직하게는 물 중에서 알지네이트와 같은 중합체를 용해시킴으로써 수행된다. 다음으로 가교결합 이온의 수용액 (예를 들면, Ca2+)을 제조하고, 이의 농도는 주로 0.5-1 M이다. 가교결합 이온으로 Ca2+를 사용할 때, 주로 이러한 용액은 CaCl2이다. 킬레이트제의 수용액을 제조한다 (예를 들면, EDTA 용액은 pH > 5에서 제조되고, NaOH를 용해시키기 위해 이용하여, 바람직하게는 pH 8에서 0.5 M에서 용해된다). 임의적으로, 원하는 범위에서 활성인 수용성 완충액이 포함될 수 있다. 예를 들면, 1 M의 농도에서 MOPS (3-(N-몰폴리노)프로판설폰산) ((3-(N-morpholino)propanesulfonic acid))은 (pH 6.5 - 7.9) 사용될 수 있거나 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 ((4-(2- hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid))이 (pH 6.8 - 8.2)사용될 수 있다. MOPS는 특히 바람직하며 이는 이러한 완충액이 목적하는 이온의 양에 무관하게 결합하기 때문이다.
가교결합제 및 킬레이트제, 그리고 사용되는 경우 완충액은 함께 혼합된다. Ca2+, EDTA 및 완충액을 혼합할 때, 몰비는 바람직하게는 1:1:0 - 1:1:1 사이 이어야 하고, Ca 및 EDTA는 바람직하게는 서로 동일해야 한다. pH는 바람직하게는 5 - 9, 바람직하게는 6.5 - 7.5로 조절된다. pH는 바람직하게는 중합체 용액과 혼합되기 전에 조절된다. 중합체 용액 및 가교 결합제/킬레이트제/완충액은 비례해서(in proportions) 혼합된다. 바람직하게는, 1% 알지네이트 농도 및 12-120 mM CaEDTA 농도, 더 바람직하게는 15-100 mM CaEDTA 농도를 갖는 용액이, 수득된다.
다음으로, 제2 (중합체) 용액이 제조된다. 상기 용액은 바람직하게는 제2 킬레이트제, 치환 이온, 및 임의적으로 이온이동성 중합체를 포함한다. 예를 들면, 알지네이트-ZnEDDA 용액. 바람직하게는, 중합체는 물에서 약 3 중량/부피 %의 농도로 용해된 알지네이트이다. 다음, 치환 이온의 수용액이 제조된다, 예를 들면 수용성 Zn2+ 용액이 제조되고, 이의 농도는 바람직하게는 0.5-1 M이다. 가장 바람직하게는, Zn(CH3CO2)2의 수용액이 사용된다. 다음으로, 제2 킬레이트터의 수용액이 제공된다. 바람직하게는, 이는 pH> 5에서 수용성 EDDA 용액으로, NAOH를 용해시키기 위해 사용하여, 주로 0.5M 및 pH 8를 사용한다. 임의적으로, 원하는 범위 내에서 활성인 수성 완충액이 사용될 수 있다. 바람직하게는 이는 1 M의 농도에서 MOPS (pH 6.5 - 7.9) 또는 HEPES (pH 6.8 - 8.2) 일 수 있다.
치환제 및 제2 킬레이터, 및 사용되는 경우 완충액은 혼합된다. 바람직하게는, Zn2+, EDDA 및 완충액은 6:5:0 - 6:5:6의 몰비로 혼합된다. EDDA는 바람직하게는 Zn2+보다 약간 과량, 바람직하게는 6:5의 비율이어야 한다. pH는 바람직하게는 5 - 9, 더 바람직하게는 6.5 - 7.5로 조절되어야 한다. pH는 바람직하게는 중합체 용액과 혼합되기 전에 조절된다. 중합체 용액 및 치환제/제2 킬레이트제/완충액은 혼합된다. 바람직하게는, 1% 알지네이트 농도 및 12-120 mM, 더 바람직하게는 15-100 mM CaEDTA 농도, ZnEDDA 농도를 갖는 용액이 수득된다.
하이드로 겔을 제조하기 위해, 바람직하게는 대략 동일한 비율의 생성된 중합체 용액이 혼합된다. 바람직하게는 알지네이트-CaEDTA와 알지네이트-ZnEDDA가 함께 혼합된다.
동일한 겔화 원리가 두 개의 추가적인 이온이동성 중합체; 펙틴 및 폴리(갈락투로네이트)에 적용된다. 폴리(갈락투로네이트)는 알지네이트보다 Ca2+에 대해 더 높은 친화도를 갖고 그러므로 Ca-EDTA와 혼합하면 이러한 중합체는 약한 겔을 형성한다. 대안적인 킬레이터 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA) 및 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA) 2 가지가 모두, 교환 이온 예를 들면 Zn2+ 및 교환 이온 킬레이트 예를 들면 Zn-EDDA 또는 Mn-EDDS과 혼합 시, Ca2+ 및 폴리(갈락투로네이트)와 안정한 용액을 형성하고, 따라서 안정한 겔을 형성한다는 것이 발견되었다. EDTA 대신 CDTA 및 PDTA를 사용하는 것은 알지네이트 및 펙틴의 유용한 겔을 만드는 것이 가능한 pH 범위를 pH 4-7로 낮춘다.
제안된 겔 형성 메커니즘을 확인하기 위해, 알지네이트의 존재 하에 전자 상자성 분광법 (electron paramagnetic spectroscopy; EPR)이 또한 Ca-EDTA에서 Mn-EDTA로의 반응을 모니터하기 위해 사용되었다 (도 3). Mn2+는 상자성 이온이고 EPR 측정에 적합하기 때문에 이 실험을 위해 선택되었다. Mn-EDDA 내 함유된 Mn2+는 Mn-EDTA 착체 내에서 보다 훨씬 더 자유로운(flexible) 것으로 나타났다 (그림 3A 및 3B 참조). Ca-EDTA를 함유하는 알지네이트 및 Mn-EDDA를 함유하는 알지네이트의 대략 동일한 비율을 혼합 시, EPR 스펙트럼은 Mn-EDDA 구조를 닮은 것으로부터 Mn-EDTA 구조를 닮은 쪽으로 이동했고(도 3C) Mn-알지네이트와 유사한 EPR 스펙트럼을 달성하지 못했다 (도 3d).
이는 Mn2+가 EDDA에서 EDTA로 교환되었고 알지네이트와 연관되지 않았으므며, 이는 해방된 Ca2+에 의해 가교결합되었다는 것의 직접적인 증거이다. 특성화된 Mn-알지네이트 분광은 또한 알지네이트 존재 하에서 Mn-EDDA 또는 Mn-EDTA 착체에 대해 기록되지 않았고, Mn2+가 리간드에 의해 전체적으로 킬레이팅되었음을 가리킨다.
본 발명의 다른 양태에서, 전술한 조절가능한 공정에 의해 수득된 또는 수득가능한 가교결합된 중합성 겔이 제공된다. 바람직하게는 가교결합된 중합성 겔은 겔화된(gelled) 이온이동성 중합체, 가교결합제, 제1 킬레이트제, 제2 킬레이트제 및 치환제 및 물을 포함한다.
본 발명의 하이드로겔은 선행 기술의 하이드로겔보다 많은 이점을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 따라 형성된 하이드로겔은 겔화 전 또는 후에 임의의 고체 성분 (겔 자체는 제외함)을 함유하지 않는다. 이와 같이 겔은 겔화를 통해 광학적으로 투명하게 유지된다. 또한, 겔화 반응에서 물 또는 가스가 생성되지 않는다. 이는 GDL-CaC03 방법의 주요한 제한사항이고, 물 형성 및 이어진 시너레시스(syneresis)로 인해 이는 고 중합체 함량의 겔 및 많은 겔을 형성하기에 여려웠고, 부 생성물로 생성된 CO2는 겔 내에서 포획된 버블을 초래했다. 또한 겔화 시간이 극도로 느리고 (수 시간들) 및 GDL의 퇴화에 의존한다. 또한, 겔화는 pH의 넓은 범위 동안 수행될 수 있고 이는 완충액을 이용하여 조절가능하다.
본 발명의 추가적인 양태에서 부품으로 구성된 키트가 제공되며, 상기 키트는
i) 제1 용액으로, 여기서 제1 중합체 용액은 가교결합제 및 제1 킬레이트제를 포함하는 것인, 제1 용액,
ii) 제2 용액으로, 여기서 상기 제2 용액은 치환제를 포함하는 것인, 제2 용액을 포함하고;
상기 제1 용액 또는 제2 용액 중 적어도 하나는 이온이동성 중합체를 함유하고;
(iii) 상기 이온이동성 중합체는 상기 제1 킬레이트제보다 상기 가교결합제에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것이고,
(iv) 상기 제1 킬레이트제는 상기 가교결합제보다 상기 치환제에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것인, 키트.
본 발명자는 추가적으로 본 발명의 가교결합된 겔이 액체상 중에서 및 생체적합성 조건 하에서 반응물을 전체적으로 사용하여 달성될 수 있음을 발견하였다. 가교결합된 겔 및 이의 개별 성분의 높은 세포 적합성은 도 4 및 5에서 나타난다. 또한, 본 발명의 방법은 시간에 따른 겔화를, 수 초 내지 수 분에서, 제어하는 것이 가능하도록 변형될 수 있어서, 많은 새로운 응용을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 수동(manual) 프린팅, 3D 프린팅에 사용하기 위한 또는 대규모 성형가능한(moldable) 겔의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 가교결합된 중합체 겔의 용도가 제공된다.
이러한 프린팅 조성물은 이러한 프린팅된 조성물을 착색하거나 기능적으로 변형시킬 수 있는 염료 및/또는 안료를 함유할 수 있다. 이러한 염료 또는 안료는 통상적인 양, 예를 들면 최종 겔 조성물의 0.01 - 70 중량%, 바람직하게는 0.1 - 20 중량%, 바람직하게는 0.2 - 5 중량%로 존재한다. 염료 또는 안료는 바람직하게는 본 발명의 방법에 따른 제1 용액 및/또는 제2 용액에 혼입된다. 바람직한 구현예에서, 전도성 잉크는 본 발명에 따른 방법 및 조성물에 혼입된다.
본 발명의 가교결합된 중합체 겔은 또한 자기공명영상에서 사용될 수 있다. 겔화 제조에서 Fe2+, Mn2+, V02+ 및 Ho3+와 같은 상자성 금속 이온의 사용은 자기공명영상에서 대조를 가능하게 하고, 이는 이러한 물질을 바이오메디컬에서 사용되도록 한다. 바람직하게는 이러한 금속 이온은 킬레이트제와 결합하는 치환제에 있어서, 가교결합제를 자유롭게 해서 이온이동성 중합체에 바인딩되도록 한다. 이러한 상자성 금속 이온은 바람직하게는 충분한 이미징을 제공하기에 충분한 양으로 존재하고, 예를 들면 최종 겔화된 조성물의 0.01 - 25 중량%, 바람직하게는 0.1 - 10 중량%, 바람직하게는 0.2 - 5 중량%의 양으로 존재한다. 상자성 금속 이온은 본 발명의 방법에서 치환제의 일부로만 사용될 수 있다, 즉 치환제는 상자성 금속 이온 및 비-상자성 금속 이온의 혼합물일 수 있다.
또한, 본 발명의 가교결합된 중합체 겔은 치료에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 치료(therapy)는 조직 재생(tissue regeneration), 질병, 예를 들면 1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1)의 치료 또는 예방, 및 중금속 제거(heavy metal sequestration)을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본 발명의 가교결합된 중합체를 포함하는, 치료에서 사용하기 위한 조절된 방출의 약제학적 제형이 제공된다. 또한 본 발명의 가교결합된 중합체를 포함하는 경구 제형, 주사제 또는 상처 드레싱제가 제공된다. 본 발명의 겔화 방법에 의해 생성된 가교결합된 겔 및 조성적 부생성물 이외에, 이러한 약제학적 조성물은 비경구, 경구 또는 국소적 전달을 통해 전달하기 위한 통상적인 부형제를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태에서, 본 발명의 가교결합된 중합성 겔 내에 캡슐화된 세포 또는 세포들의 군이 제공된다. 본 발명의 하이드로겔은 특히 세포 치료에서 유용할 수 있다. pH는 캡슐화되는 특이적인 세포 또는 세포들에 대해, 당업자에게 공지된, 허용가능한 범위 내에서 유지되어야 한다. 예를 들면, 포유류 세포 (예를 들면 인간 세포)는 7.4의 중성에 가까운 pH에서 주로 존재하고 포유류 세포의 조직 환경의 최적화된 pH는 7.2-7.4이다. 세포는 pH 6.6-7.8의 범위에서 충분히 생존할 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 살아있는 세포가 알지네이트 내에서 캡슐화된다.
본 발명의 더 추가적인 양태에서, 하이드로겔은 마이크로유체 장치에서 사용될 수 있다. 다양한 마이크로유체 장치가 알려져 있으며, 일부는 2개의 수성 성분을 갖는 에멀전의 생산을 위한 공동-흐름 영역(co-flow region)1을 갖는다. 작은 채널 내 하이드로겔의 겔화는 조급한(premature) 겔화로 인해 균질한 겔을 얻는 것이 어렵고 동시에 마이크로 채널의 클로깅(clogging)을 피하는 것이 어렵기 때문에, 현재의 겔화 방법의 큰 도전이다. 또한, 존재하는 겔화 방법은 세포에 해로운 가교결합 방법, 예를 들면 CaEDTA 및 아세트산에 의존한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 이온 교환 겔화 기술은 높은 세포 생존율 및 효율적인 장치 친화성 겔화를 갖는 다양한 상이한 세포 종류의 용이한 캡슐화를 위한 마이크로유체 장치, 바람직하게는 공동-흐름 마이크로 유체 장치 내에서 활용될 수 있다. 본 발명은 훌륭한 세포 생존율을 제공하며, 비겔화된 용액 및 겔화된 용액이 모두 세포 친화성이다(cell compatible).
세포 캡슐화는 바람직하게는 액적 마이크로유체 장치를 통해 수행된다-즉, 조절된 에멀전화 공정으로서, 오일, 바람직하게는 과불화된 오일(perfluorinated oil), 더 바람직하게는 3MTM NovecTM 7500 엔지니어링된 유체 (HFE7500)가 계면활성제, 바람직하게는 불소계면활성제(fluorosurfactant), 더 바람직하게는 생체친화성인 불소계면활성제와 혼합되는 상기 공정은, 계면활성제에 의해 안정화된 전구체 알지네이트 에멀전을 형성하기 전에 공동-흐름 구역에서 혼합된 2개의 알지네이트 흐름(2개의 킬레이트 및 세포를 포함)을 분해하기 위해 사용된다. 겔화는 바람직하게는 세포가 캡슐화된 후에 이러한 에멀전 내에서 발생한다. 이러한 접근법은 작동하기에 강력하고(robust) 간단하며, 알지네이트 상에 부가되기 위한 값싼 킬레이트와, 공동-흐름 장치의 경우 마이크로유체 장치 내에 단지 하나의 부가적인 수성 흐름을 필요로 한다.
마이크로유체 장치, 바람직하게는 공동-흐름 마이크로유체 장치는 선행 기술의 방법에 따라 제조될 수 있고, 세포 샘플이 도입된다. 2개의 스트림의 중합체 용액, 바람직하게는 알지네이트가 장치에 진입하고, 액적 제조 전에, 바람직하게는 동일한 부피로 합해진다. 10-100 ㎛ 사이, 바람직하게는 30-70 ㎛, 더 바람직하게는 40-60 ㎛, 더욱 더 바람직하게는 50-55 ㎛의 좁은 크기 분포의 균일한 액적이 유체 장치 내에서 생성된다. 사용될 수 있는 마이크로유체 장치의 예시가 도 6a에 나타난다. 도 6b는 세포의 캡슐화가 일어나는 장치의 영역의 마이크로그래프를 나타낸다. 도 6c 및 6d는 이러한 방법에 의해 생성된 캡슐화된 포유류 세포를 함유하는 최종적인 겔 비드를 나타낸다. 알지네이트의 겔화는 본 발명의 리간드 교환 방법에 의존하고, 이는 알지네이트 및 다른 이온이동성 중합체의 마이크로-하이드로겔 내에서 세포 친화적으로, pH 비의존적이고 마이크로유체-친화적인 세포 캡슐화를 달성한다. 생성된 세포-로딩된 겔은 바람직하게는 균질이고 단분산(monodisperse)이며, 몇 가지 상이한 세포 종류에 대해서 캡슐화 및 세척 후 우수한 세포 생존성(viability) 및 생존(survival)에 의해 증명된 것과 같이 크게 생체친화적이다.
이를 증명하기 위해서, 자연적으로 형광인 남세균(cyanobacteria) 시네코시스티스(Synechocystis) 종 PCC 6803 및 클라미도모나스(Chlamydomonas) 레인하드티(reinhardtii) CC-4532 조류의 성장을, 세포가 마이크로콜로니를 형성하고 마이크로겔 구획(confinement)를 탈출할 때까지, 마이크로겔 내에서 모니터링했다. 순수한 매질 내 세포 증식은 본 발명자들의 캡슐화된 세포에서 관찰된 속도의 것과 일치한다. 수집 및 이어서 하이드로겔의 세척 후 표준 살아있는/죽은 염색 어세이(standard live/dead staining assay)을 이용하여, 캡슐화된 포유류 조골아세포의 높은 세포 생존율(90% 이하)를 달성했다. 도 7은 알지네이트 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 남세균 시네코시스티스 종 PCC 6803의 현미경 이미지를 나타낸다. 캡슐화 후 비드는 팔콘(falcon) 튜브 내 BG 11 매질 내에 연속적인 조명(illumination)하에서 광 교반(light agiatation)과 함께 저장된다. 이미징을 위해, 비드를 함유한 매질의 액적을 커버 글라스 상에 위치시켰고 두번째 커버 글라스를 상단 상에 위치시켰다. 샘플의 이미지를 캡슐화 후 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 1 주 및 2 주에서 취했다. 박테리아는 알지네이트 구조 내에서 분열한다. 2주 후 박테리아 콜로니는 비드를 파열하고(burst out) 탈출하기에 충분히 크다. 모든 이미지를 20x 렌즈를 갖는 Leica SP5 공초점 현미경으로 취한다. 이미지는 비춰진 부분의 겹처진 이미지이고 형광 이미지는 조류에 의해 생성된 클로로필의 자동 형광을 포착한다. 스케일 바: 20 ㎛. 도 8은 알지네이트 비드 내에 캡슐화된 조류 클라미도모나스 레인하드티 CC-4532의 현미경 이미지를 나타낸다. 캡슐화 후, 비드를 팔콘 튜브 내 매질(TAP - TrisPO4 및 TrisAcP04 매질) 내에 유지시켰고 그리고 연속적인 조명 하에서 광 교반과 함께 18 ℃에서 저장했다. 이미징을 위해 비드를 함유한 매질의 액적을 커버 글라스 상에 위치시켰고 두번째 커버 글라스를 상단 상에 위치시켰다. 샘플의 이미지를 캡슐화 후 0(a), 24(b), 48(c) 및 72(d) 시간에 취했다. 조류는 알지네이트 구조 내에서 분열한다. 72시간 후 조류 콜로니는 비드를 탈출하기에 충분히 크다. 모든 이미지를 20x 렌즈를 갖는 Leica SP5 공초점 현미경으로 취한다. 이미지는 비춰진 부분의 겹쳐진 이미지이고 형광 이미지는 조류에 의해 생성된 클로로필의 자동 형광을 포착한다. 스케일 바: 20 ㎛.
본 발명의 구현예에서, 이온이동성 겔화 이외의 방법 (즉, 화학적 또는 열적 가교결합에 의함)에 의해 하이드로겔을 형성하도록 가교결합할 수 있는 하나 이상의 추가적인 중합체는 본 발명의 중합체 제제와 블렌딩된다. 이러한 추가적인 중합체는 바람직하게는 수용성이다. 하나 이상의 추가적인 중합체는 겔화의 개시 전에 개별적인 전구체 용액들 중 하나 또는 모두에 첨가될 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 추가적인 중합체는 단백질, 폴리펩타이드, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 폴리사라이드, 폴리올, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리포스파젠, 폴리아미드 및 폴리아크릴아마이드의 목록으로부터 선택된다. 더욱 더 바람직하게는 상기 하나 이상의 추가적인 중합체는 폴라아크릴아마이드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리우레탄, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 히알루론산, 키토산 유도체, 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐 알코올 (PVA), 콜라겐, 젤라틴 및 다양한 폴리사카라이드의 목록으로부터 선택된다. 상기 추가적인 중합체(들)은 본 발명의 겔 제조 내에서 분산된다. 본 발명의 경쟁적인 리간드 교환 겔화 기술에 의한 겔화 시, 상기 추가적인 중합체(들)은 형성된 겔 내에 템플레이팅(templating)되고 이어서 또 다른 수단에 의해 가교결합될 수 있다. 이것은 특히 겔의 플롯팅(plotting) 및 3D 프린팅에 대한 활용성을 갖고 그렇지 않으면 가교결합 방법 내 제한으로 인해 이러한 기술에 적당하지 않다.
도 9는 이러한 다중 중합체 제조의 유동학적 분석을 나타낸다. 여기서 분해된 콜라겐 I형 용액은 이온 및 킬레이트를 함유한 알지네이트와 블렌딩되었다. 온화한(mild) 산 (예를 들면 아세트산 ~pH 4에서)은 가교결합하여 하이드로겔을 형성하기 위해 37 ℃ 및 중성에 가까운 pH에서 온화한 가열을 요구하고, 대략 10-20 분 내에 그렇게 하며, 4 ℃에서 중성 pH 용액은 몇 시간 동안 가교결합하지 않는다. 콜라겐을 모두 함유하지만 하나는 킬레이팅된 가교결합 이온을 함유하고, 다른 하나는 킬레이팅된 치환 이온을 함유한, 2개의 알지네이트 용액이 유동계 내에서 4 ℃에서 함께 혼합되었다. 이러한 온도는 본 발명에 의해 설명되는 겔이 형성되었던 시간인 30분 동안 고정되었고, 이는 샘플의 모듈러스 내 현저한 증가에 의해 입증되었다. 30분 후, 온도는 빠르게 37 ℃로 상승했고 (2분 내), 여기서 콜라겐이 이어서 가교결합 되자마자, 샘플의 모듈러스 내 2번째 증가에 의해 나타나는 것과 같이, 열적 효과에 의해 유도된 초기 감소가 이어졌다. 이러한 제조는 셀 접착 중합체, 예를 들면 콜라겐을 템플레이팅하기에 유용하고 이러한 접근법은 도 10에서 나타나는 것과 같이 3D로 부착성 세포를 배양하기 위해 사용되었다.
실시예:
실시예 1:
CaEDTA / ZnEDDA, 1% 알지네이트 하이드로겔을 다음과 같이 제조했다:
알지네이트-CaEDTA 용액의 제조:
i) 알지네이트를 물 중에서 3 중량/부피%의 농도로 용해하여 알지네이트 스탁(stock)을 제조했다;
ii) 수성 CaCl2 용액을 1M의 농도를 갖게 제조했다;
iii) 수성 EDTA 용액을 NaOH (0.5M, pH 8-9)을 이용하여 제조했다;
iv) 수성 완충액을 1M의 농도에서 MOPS (pH 7.0)를 이용하여 제조했다;
v) 다음, Ca2+, EDTA 및 완충 용액을 1:1:1의 몰 비율로 혼합했다;
vi) pH를 pH 7.0으로 조절했다;
vii) 1% 알지네이트 농도 및 60 mM Ca2+ / EDTA / MOPS을 제공하도록, 알지네이트 스탁을 CaEDTA-완충 용액과 비례해 혼합했다.
알지네이트-ZnEDDA 용액의 제조:
i) 알지네이트를 물 중에서 3 중량/부피%의 농도로 용해시켜 알지네이트 스탁을 제조했다;
ii) Zn(CH3C02)2의 수용액을 1M의 농도를 갖도록 제조했다;
iii) EDDA 용액의 수용액을 NaOH (0.5M pH 8-9)를 이용해서 제조했다;
iv) 수성 완충액을 제조했다. MOPS를 1M의 농도에서 사용했다 (pH 7.0);
v) Zn2+, EDDA 및 완충 용액을 5:6:5의 몰 비율에서 혼합했다;
vi) pH를 7.0으로 조절했다;
vii) 1% 알지네이트 농도 및 60mM Zn2+ / 72mM EDDA / 60mM MOPS을 제공하도록, 알지네이트 스탁을 ZnEDDA-완충 용액과 비례해 혼합했다.
하이드로겔의 제조
알지네이트-CaEDTA 및 ZnEDDA의 동일한 비율을 함께 혼합하여 하이드로겔을 제조했다.
실시예 2:
세포를 다음과 같이 구분할(compartmentalise) 수 있다. 바람직하게는, 높은 기체 수송을 제공하고 PDMS 장치의 부풀음(swelling)을 피하는 저 점도 하이드로플루오로에테르 (예를 들면 3MTM NovecTM 7500 엔지니어링된 유체 (HFE7500))를 연속 상으로 사용했다. 불소계면활성제(이러한 경우, 2% (v/v) Krytox®-PEG600 기반의 불소계면활성제)를 연속 상에 가해서 액적 분해를 용이하게 하고, 에멀전을 안정화시키고 합체(coalescence)를 피했다. 2개의 분산된 상을 사용했다: (1) pH 6.7에서 84 mM Ca2+ / 84m EDTA / 40mM MOPS를 함유한 및 (2) pH 6.7에서 84 mM Zn2+ / 100mM EDDA / 40mM MOPS를 함유한 0.6% (중량) 알지네이트. 2개의 수성 상은 액적을 분해시키기 전에 마이크로유체 채널 내 공동-흐름 영역에서 만난다.
유속을 Harvard Apparatus로부터의 실린지 펌프 (PHD ULTRA) 상에 실장된 플라스틱 실린지를 이용하여 조절된 주입에 의해, 연속상에서 200μL/hr 및 두 수상 모두에서 50μL/hr로 설정했다. 분산된 상에서 사용된 실린지는 자석을 포함했고 세포의 침적을 피하기 위해 연속적으로 교반했다. 세포는 캡슐화 효율을 증가시키기 위해 수상 모두에서 존재할 수 있다.
실시예 3:
CaEDTA / ZnEDDA, 0.4% 알지네이트, 1% 콜라겐 I형 하이드로겔을 다음과 같이 제조했다:
알지네이트-CaEDTA-콜라겐 용액의 제조:
i) 알지네이트를 물 중에서 3 중량/부피%의 농도로 용해시켜 알지네이트 스탁을 제조했다;
ii) 수성 CaCl2 용액을 1M의 농도를 갖도록 제조했다;
iii) 수성 EDTA 용액을 NaOH (0.5 M, pH 8-9)를 이용해 제조했다;
iv) 수성 완충액을 1M의 농도에서 MOPS (pH 7.0)를 이용해 제조했다;
v) 다음, Ca2+, EDTA 및 완충 용액을 1:1:1의 몰 비율에서 혼합했다;
vi) pH를 pH 7.4로 조절했다;
vii) 0.6% 알지네이트 농도 및 36 mM Ca2+ / EDTA / MOPS를 제공하도록, 알지네이트 스탁을 CaEDTA-완충 용액과 비례해서 혼합했다.
viii) 알지네이트-CaEDTA 용액을 4℃로 식혔다(chilled).
ix) 다음 20 mM 아세트산 중에 용해된 랫트 꼬리(Rat Tail)로부터의 차가운 (4℃) 3 중량/부피% 콜라겐 I형을 1:2의 부피 비에서 차가운 알지네이트-CaEDTA 용액에 가했다.
알지네이트-ZnEDDA-콜라겐 용액의 제조:
i) 알지네이트를 물 중에서 3 중량/부피%의 농도로 용해시켜 알지네이트 스탁을 제조했다;
ii) Zn(CH3C02)2의 수용액을 1M의 농도를 갖도록 제조했다;
iii) 수성 EDDA 용액을 NaOH (0.5 M, pH 8-9)을 이용하여 제조했다;
iv) 수성 완충액을 1M의 농도에서 MOPS (pH 7.0)을 이용하여 제조했다;
v) 다음, the Zn2+, EDDA 및 완충 용액을 1:1:1의 몰 비율에서 혼합했다;
vi) pH를 pH 7.4로 조절했다;
vii) 0.6% 알지네이트 농도 및 36 mM Zn2+ / EDDA / MOPS를 갖도록, 알지네이트 스탁을 Zn-EDDA-완충 용액과 비례해서 혼합했다.
viii) 알지네이티-ZnEDDA 용액을 4 ℃로 식혔다
ix) 다음 20 mM 아세트산 중에 용해된 랫트 꼬리로부터의 차가운 (4℃) 3 중량/부피% 콜라겐 I형을 1:2의 부피 비에서 차가운 알지네이트-ZnEDDA 용액에 가했다
알지네이트-콜라겐 하이드로겔의 제조
알지네이트-CaEDTA-콜라겐 및 알지네이트-ZnEDDA-콜라겐의 동일한 비율을 4 ℃에서 함께 혼합하고 37 ℃로 가온하여 하이드로겔을 제조했다.

Claims (36)

  1. 제1 용액 및 제2 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 가교결합된 중합체 겔의 형성방법으로서, 상기 제1 용액은 가교결합제 및 제1 킬레이트제(chelating agent)를 포함하고; 상기 제2 용액은 치환제(displacing agent)를 포함하고; 상기 제1 또는 제2 용액 중 적어도 하나는 이온이동성 중합체(ionotropic polymer)를 함유하고;
    (a) 상기 이온이동성 중합체는 상기 제1 킬레이트제보다 상기 가교결합제에 대해 더 낮은 친화도(affinity)를 갖고,
    (b) 상기 제1 킬레이트제는 상기 가교결합제보다 상기 치환제에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것인,
    가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 용액은 상기 치환제를 킬레이팅할 수 있는 제2 킬레이트제를 추가로 포함하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이온이동성 중합체는 상기 제2 킬레이트제보다 상기 치환제에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 제2 킬레이트제는 상기 이온이동성 중합체보다 상기 가교결합제에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온이동성 중합체는 상기 제2 킬레이트제보다 상기 치환제에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교결합제 및 상기 치환제는 상이한 다가(multivalent) 금속 이온들인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 용액은 이온이동성 중합체를 함유하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 용액은 동일한 이온이동성 중합체 또는 상이한 이온이동성 중합체를 함유하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교결합제 및 상기 치환제는 Ca2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Al3+, V02+, Cu2+, Ba2+, Sr2+, Ho3+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Pb2+, Co2+ 및 Ni2+로 구성된 군으로부터 선택된 다가 금속 이온으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교결합제는 Ca2+를 포함하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환제는 Zn2+, Fe2+ 및 Mn2+로 구성된 군으로부터 선택된 다가 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+를 포함하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 킬레이트제는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid; EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (ethylenediamine-N.N'-diacetic acid; EDDA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (propylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid; PDTA), 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (1,2-cyclohexanedinitrilotetraacetic acid; CDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (ethylene glycol tetraacetic acid; EGTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid; BAPTA), 하이드록시페닐-에틸렌디아민 (hydroxyphenyl-ethylenediamine; HPED), 니트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid; NTA), 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄술폰산(2-[(2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethanesulfonic acid), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid; TES), 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올 (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propanediol; TRIS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글라이신 (N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine; Tricine), 포르피린(porphyrin), 시트레이트(citrate), 포스포네이트(phosphonates), 아미노산(amino acids), 펩타이드(peptides) 및 사이드로포어(siderophores)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고, 바람직하게는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA), 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA) 및 아미노아세트산 (글라이신)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 프로필렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (PDTA) 및 1,2-사이클로헥산디니트릴로테트라아세트산 (CDTA)로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 바람직하게는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 킬레이트제는 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 아미노아세트산 (글라이신) 및 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA)로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 바람직하게는 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산 (EDDA) 또는 아미노아세트산 (글라이신) 또는 이들의 혼합물인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온이동성 중합체는 알지네이트, 펙틴, 폴리(갈락투로네이트) (poly(galacturonate)), 카라지난 (carrageenan), 덱스트란 (및 유도체), 젤란(gellan), 스클레로지칸(sclerogiucan), 키토산 (및 유도체), 수용성 폴리포스파젠(water soluble polyphosphazenes), 예컨대 폴리(비스(4-카복시페녹시)포스파젠 (poly(bis(4-carboxyphenoxy)phosphazene)), 소듐 폴리아크릴레이트, 및 폴리아미노산로 구성된 군으로부터 선댁된 것이고, 바람직하게는 알지네이트, 펙틴 및 폴리(갈락투로네이트)로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 가장 바람직하게는 알지네이트인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중에서 성분들은 다음의 조합을 가질 수 있는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법:
    Figure pct00004
    .
  17. 제16항에 있어서, 상기 이온이동성 중합체는 제1 용액 및 제2 용액 모두 중에 존재하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형성방법은 5 ℃ 내지 40 ℃ 사이, 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃ 사이에서 수행되는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형성방법은 4 내지 9의 pH, 바람직하게는 6 내지 8의 pH, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH, 바람직하게는 7.2 내지 7.4의 pH에서 수행되는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 킬레이트제의 농도는 2 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 180 mM, 더 바람직하게는 4 mM 내지 120 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 110 mM, 더욱 더 바람직하게는 10 mM 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 15 mM 내지 100 mM의 범위에 있는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 킬레이트제의 농도는 2 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 3 mM 내지 180 mM, 더 바람직하게는 4 mM 내지 120 mM, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 110 mM, 더욱 더 바람직하게는 10 mM 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 15 mM 내지 100 mM의 범위에 있는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온이동성 중합체는 0.1 - 20 중량/부피%의 범위의 농도로 혼합된 용액 중에 존재하는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이온이동성 겔화(ionotropic gelation) 이외의 방법으로 하이드로겔을 형성하도록 가교결합을 할 수 있는 하나 이상의 추가적인 중합체(들)이 겔화의 시작 전에 첨가되는 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 중합체(들)은 제1 용액 중에, 제2 용액 중에, 또는 제1 용액 및 제2 용액 모두 중에 분산된 것인, 가교결합된 중합체 겔의 형성방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 형성방법에 의해 수득되는 또는 수득가능한 가교결합된 중합성 겔.
  26. 겔화된(gelled) 이온이동성 중합체, 가교결합제, 제1 킬레이트제, 제2 킬레이트제 및 치환제 및 물을 포함하는 가교결합된 중합설 겔로서, 상기 겔화된 이온이동성 중합체, 가교결합제, 제1 킬레이트제, 제2 킬레이트제 및 치환제의 각각은 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에서 정의된 것인, 가교결합된 중합성 겔.
  27. 제26항에 있어서, 상이한 이온이동성 중합체의 혼합물을 포함하는 것인, 가교결합된 중합성 겔.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 이온이동성 겔화 이외의 방법에 의해 하이드로겔을 형성하도록 가교결합할 수 있는 하나 이상의 추가적인 중합체(들)을 더 포함하는, 가교결합된 중합성 겔.
  29. 부품으로 구성된 키트로서, 상기 키트는
    i) 가교결합제 및 제1 킬레이트제를 포함하는 제1 중합체 용액,
    ii) 치환제를 포함하는 제2 용액을 포함하고;
    이때 상기 제1 중합체 용액 및 제2 용액 중 적어도 하나는 이온이동성 중합체를 함유하고;
    (c) 상기 이온이동성 중합체는 상기 제1 킬레이트제보다 상기 가교결합제에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것이고,
    (d) 상기 제1 킬레이트제는 상기 가교결합제보다 상기 치환제에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것인, 키트.
  30. 대규모 성형가능(moldable) 겔의 제조에 사용하기 위한 또는 3D 프린팅에 사용하기 위한, 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 가교결합된 중합성 겔의 용도.
  31. 치료에 사용하기 위한, 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 가교결합된 중합성 겔의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 상기 치료는 조직 재생(tissue regeneration), 질병, 예를 들면 1형 당뇨병(diabetes mellitus type 1)의 치료 또는 예방, 및 중금속 제거(heavy metal sequestration)을 포함하는 것인, 용도.
  33. 자기공명영상(magnetic resonance imaging)에서의 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 가교결합된 중합성 겔의 용도.
  34. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 가교결합된 중합성 겔을 포함하는, 치료에서 사용하기 위한 조절된 방출의 약제학적 제형.
  35. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 가교결합된 중합성 겔을 포함하는, 경구 제제, 주사제 또는 상처 드레싱제.
  36. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 가교결합된 중합성 겔 내에 캡슐화된 세포 또는 세포들의 군.
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