KR20180119523A

KR20180119523A - 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법 및 발효 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180119523A
Application number: KR1020180047978A
Authority: KR
Inventors: 최영환; 강점순; 쿼루; 이커; 이매; 왕자옥; 강남준
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2018-11-02
Also published as: KR102141862B1

Abstract

본 발명은 딸기, 번데기 및 밀리타리스 동충하초를 이용한 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법, 생산량 증대용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 딸기에 발효원인 번데기를 첨가하고 밀리타리스 동충하초로 발효하는 경우, 동충하초의 코르디세핀 함량이 증대되고 딸기의 주요 생리활성물질의 생산량이 증가되어 기능성 소재로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 본 발명에 따라 딸기에 번데기를 혼합한 혼합물의 발효 추출물은 지방세포 분화를 억제하고 지방세포에서 트리글리세라이드(TG) 축적 억제 및 글루코오스 흡수 억제 효과 등을 가지고 있어 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 바, 지속적인 성장이 예측되는 비만 개선 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

밀리타리스 동충하초의 코르디세핀 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법 및 발효 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물{Increasing method of cordycepin of Cordyceps millitaris and bioactive compounds of strawberry and Composition for preventing or treating obesity comprising fermented extracts}

본 발명은 딸기, 번데기 및 밀리타리스 동충하초를 이용한 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법, 생산량 증대용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

동충하초는 자낭균강(Ascomycetes), 맥각균목(Clavicipitales), 맥각균과(Clavicipitaceae)에 속하며, 세계으로 현재까지 약 800여종의 동충하초균이 알려져 있고 국내에서 채집 분류된 것은 78종으로 알려져 있다. 식품공전상 "식품원재료 분류표"에 제시되어 있는 동충하의 종류로는 꽃동충하 (Paecilomyces japonica/Paecilomyces tenuipes)와 밀리타리스 동충하(Cordyceps militaris)가 있다. 현재 국내 동충하초 시장은 연간 1천 2백만 톤 정도이며, 이중 밀리타리스 동충하가 약 15% 정도를 차지하고 있다. 동충하초의 유효성분으로는 코르디세핀(cordycepin), cordyceptic acid, ophiocordin, 복합다당체, ergosterol 등이 알려져 있다. 또한 밀리타리스 동충하초는 항염증, 항균, 항종양, 면역증강 등 외부물질에 대한 방호작용, 자양강장, 정력증강, 항피로, 운동능력 향상, 노화방지, 수명연장 등 기초대사활성 증강작용, 그리고 동맥경화 억제, 콜레스테롤과 중성지질 저하, 혈당강화, 고혈압 치료 등 질병억제 및 완화 작용 등 다양한 기능성을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다(Park 등, 2002; Lee 등, 2002, 2004; Kim 등, 2001, 2002, 2004, 2005; Lim 등, 2004; Koh, 2001, 2002; Kwon 등, 2001).

자생하는 동충하초는 다량 채취가 어려워 대중적인 약재가 되지 못했으나 인공재배 기술이 개발되어 대량생산이 가능해짐에 따라 많은 연구가 시행되었고 대중화 되고 있으며, 특히 2차 대사산물인 코르디세핀(cordycepin) 등의 생리활성물질로 인하여 건강기능성 식품으로의 인지도가 높아지고 있다. 밀리타리스 동충하초 배양시에 코르디세핀(cordycepin)의 함량을 증가시키기 위하여 번데기를 사용하고 있는데, 번데기 동충하초는 면역증강활성, 항암활성, 항바이러스 효과 및 항염증 효과 등 다양한 생리활성이 보고됨에 따라 강장 식품 혹은 강장제로 폭 넓게 사용되고 있으며, 그들의 활성성분은 다당류 (polysaccharide) 와 nucleoside 유도체인 코르디세핀 (cordycepin, 3'-deoxyadenosine) 등이 알려져 있다 . 우리나라의 경우 번데기 동충하초가 식품원료로 인정되면서 다양한 식품 개발과 더불어 재배 농가의 확대와 함께 번데기 동충하초의 코디세핀 함량 제시가 중요시 되고 있다. 번데기 동충하초는 일반적으로 동물성 배지인 번데기를 사용하여 인공재배 되고 있으나, 동물성 배지의 혐오감으로 인한 식용 여부의 논란으로 인하여 최근에는 식물성 배지인 현미를 이용하여 재배가 이루어지고 있다. 번데기 동충하초의 식품 원료의 이용성 확대를 위한 이와 같이 식물성 배지 성분을 이용한 재배법 개발과 더불어 코디세핀이 번데기 동충하초의 주요 활성성분임이 알려지면서 코디세핀의 함량을 증가시키기 위해서 탄수화물, 당, 무기원소, 환경 조건 등의 다양한 방법이 시도되고 있으나, 원재료에 발효원을 첨가하여 주요성분의 함량변화를 시험한 연구는 거의 없는 실정이다.

한편 비만은 전 세계적으로 가장 흔하게 발생하는 의학적 문제 중 하나이며 이상지질혈증, 지방간 및 고혈압 같은 여러 가지 건강상의 문제를 일으킨다. 또한 지방세포(Adipocytes)는 신체 세포 조직의 주성분이며, 지방세포전구체(pre-adipocytes)의 증가는 지방세포 조직의 증가로 이어진다.

지방세포전구체의 분화가 진행되는 동안 많은 전사 인자들이 지방생성 및 지질 축적에 영향을 미치는데, 예컨대 CCAAT enhancer-binding proteins (C/EBPs) 및 PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors)는 지방세포전구체의 지방세포로의 분화를 촉진시킨다. 또한 PPARs 중 PPAR-γ는 fatty-acid binding protein (A-FABP), fatty acid synthase (FAS), lipoprotein lipase (LPL), 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase (HMGCR) 및 glucose transporter type 4 (Glut4)를 조절한다.

비만에 원인이 되는 지방세포를 제어하여 비만을 억제하는 다양한 방법들이 제시되고 있으나, 비만 억제 효과가 없거나 비만 억제 효과가 있는 경우라도 상당한 부작용을 일으키는 등의 문제점이 있었다. 이에 따라 비만을 안전하고 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있는 방안이 필요한 실정이다.

본 발명에서는 채소 작물로서 많이 소비되고 있는 딸기에 발효원인 번데기를 첨가하여 밀리타리스 동충하초의 주요 생리활성 성분인 코르디세핀의 함량을 증대시킬 수 있는 방법 및 발효 시에 딸기의 주요 생리활성물질의 함량변화를 분석함으로서 기능성 소재를 개발하기 위하여 연구하던 중 본 발명을 완성하였다. 또한 본 발명의 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물 효능을 연구하던 중 이러한 발효 추출물이 비만을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 딸기, 번데기 및 밀리타리스 동충하초를 이용한 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법, 생산량 증대용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (S1) 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (S2) 상기 혼합물에 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 딸기 및 번데기 혼합물의 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris) 발효물을 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따라 딸기에 발효원인 번데기를 첨가하고 밀리타리스 동충하초로 발효하는 경우, 동충하초의 코르디세핀 함량이 증대되고 딸기의 주요 생리활성물질의 생산량이 증가되어 기능성 소재로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 본 발명에 따라 딸기에 번데기를 혼합한 혼합물의 발효 추출물은 지방세포 분화를 억제하고 지방세포에서 트리글리세라이드(TG) 축적 억제 및 글루코오스 흡수 억제 효과 등을 가지고 있어 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 바, 지속적인 성장이 예측되는 비만 개선 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

도 1은 딸기에 존재하는 생리활성 물질의 화학식을 나타낸 도이다.
도 2는 3T3-L1 지방세포 분화 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 번데기 추가에 따른 외형 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 딸기의 생체중당 번데기 무첨가, 번데기 25%, 50% 및 100%로 첨가하여 발효한 발효추출물의 동충하초가 생산하는 코르디세핀(cordycepin)과 딸기의 생리활성 성분 함량을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 다양한 용매를 이용한 추출에 따른 PCA 분석 결과를 나타낸 도이다 ((A) 추출물 내 생리활성물질을 PCA 분석을 통해 명확하게 분리하여 나타낸 결과 (B) 3가지 추출용매(70 % 에탄올, 50 % 에탄올, 물)에 따른 PCA 분석 결과).
도 6은 발효시에 첨가되는 번데기의 첨가 함량에 따른 발효추출물의 주성분 분석(principal component analysis) 결과를 나타낸 도이다(SC1: 비-발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SC1P70, SC1P50, SC1W). SCP0: 발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP0P70, SCP0P50, SCP0W)), SCP25: 25 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP25P70, SCP25P50, SCP25W), SCP50: 50 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP50P70, SCP50P50, SCP50W), SCP100: 발효 번데기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP100P70, SCP100P50, SCP100W).
도 7은 추출용매 및 번데기 첨가 함량에 따른 발효 딸기 추출물의 생리활성 물질을 확인한 결과를 나타낸 도이다 ((A) 다른 종류의 추출 용매에서 나타나는 공통적인/독특한 생리활성물질. (B) 공유 분포를 나타내는 벤다이어그램 (C) 번데기를 포함한 발효 딸기의 추출물의 생리활성물질의 PCA 점수 도표. 타원 및 모양은 샘플의 클러스터링을 나타냄).
도 8은 AHC (agglomerative hierarchical clustering)에 의한 발효 딸기 추출물의 생리활성 물질 분류 결과를 나타낸 도이다 (SC1: 비-발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SC1P70, SC1P50, SC1W). SCP0: 발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP0P70, SCP0P50, SCP0W)), SCP25: 25 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP25P70, SCP25P50, SCP25W), SCP50: 50 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP50P70, SCP50P50, SCP50W), SCP100: 발효 번데기의 70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물(SCP100P70, SCP100P50, SCP100W).
도 9는 동충하초에 의한 딸기 및 번데기 혼합물의 발효에 따른 발효 딸기 추출물의 생리활성 물질 함량을 계층군집분석(Hierarchical cluster analysis, HCA)을 통해 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다((A) HPLC 분석을 위한 추출 프로토콜을 나타낸 순서도. (B) Cordyceps millitaris에 의한 번데기 혼합 발효 딸기 추출물(70%, 에탄올, 50% 에탄올 및 물 추출물)의 생리활성물질의 상대적 수준(log10 scale)을 나타내는 HCA 분석 결과(Heatmaps)).
도 10은 본 발명의 발효 딸기 추출물의 지방세포 분화 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 여기서 oil red O 염색 결과를 도 10A에, OD값 측정 결과를 도 10B에 나타내었다. 물을 첨가한 분화 배지와 비교하여 * p<0.05, ** p<0.01로 나타내었다.
도 11은 본 발명 FSP25E50 의 지방세포에서의 트리글리세라이드(TG) 축적 및 글루코오스 흡수 억제 효과를 확인하기 위해 트리글리세라이드 축적량과 글루코오스 흡수량을 측정한 결과를 나타낸 도이다. 물을 첨가한 분화 배지와 비교하여 * p<0.05, ** p<0.01로 나타내었다.
도 12는 본 발명 FSP25E50(S4WCP25-P50)의 C/EBP-β 및 PPAR-γ의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 분화 1일째에서의 결과를 도 12A에, 8일째에서의 결과를 도 12B에 나타내었다. 도 12A 및 12B에서 In+Dex+Ros 군과 비교하여 * p<0.05로 나타내었다.
도 13은 본 발명 FSP25E50 의 A-FABP, FAS, LPL, HMGCR 및 Glut4 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. In+Dex+Ros 군과 비교하여 * p<0.05, ** p<0.01로 나타내었다.

본 발명은 (S1) 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및 (S2) 상기 혼합물에 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법을 제공한다. 본 발명의 딸기는 특정 품종에 제한되지 않으며, 번데기는 바람직하게는 silkworm pupa일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

상기 (S1) 단계에서 번데기는 딸기의 함량 대비 0.01 내지 60 %(w/w), 바람직하게는 0.01 내지 50 %(w/w), 가장 바람직하게는 0.01, 25 및 50 %(w/w)로 포함될 수 있다. 상기 (S1) 단계에서와 같이 딸기와 번데기를 혼합함으로써 이들 혼합물이 다음 (S2) 단계에서 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)의 효과적인 발효원으로 작용하여 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질의 증대를 더욱 극대화시킬 수 있다.

또한 상기 (S2) 단계의 발효는 고상발효일 수 있다. 밀리타리스 동충하초를 접종하여 고상발효 함으로써 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질을 효과적으로 증진시킬 수 있다. (S2) 단계에서 밀리타리스 동충하초는 혼합물에 3 내지 7 %(v/w), 바람직하게는 5 %(v/w) 농도로 접종될 수 있으며 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 고상발효는 6주, 바람직하게는 4주간 실시될 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.

또한 상기 딸기의 기능성 물질은 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidin-3-glucoside), 신코닌(Cinchonine), 카테킨(Catechin), 에피갈로카테킨(Epi-gallocatechin), p-쿠마린산(p-Coumaric acid) 및 엘라그산(Ellagic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으며 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법을 통해 상기와 같은 딸기의 기능성 물질의 생산량을 더욱 증진시킴으로써 기능성 소재로의 딸기의 활용성을 더욱 높일 수 있다.

본 발명은 또한 딸기 및 번데기 혼합물의 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris) 발효물을 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대용 조성물을 제공한다.

본 발명의 딸기 및 번데기 혼합물의 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris) 발효물이란, 딸기에 번데기를 딸기의 함량 대비 0.01 내지 60 %(w/w), 바람직하게는 0.01 내지 50 %(w/w), 가장 바람직하게는 0.01, 25 및 50 %(w/w) 포함시켜 혼합물을 제조한 후 상기 혼합물에 밀리타리스 동충하초를 3 내지 7 %(v/w), 바람직하게는 5 %(v/w) 농도로 접종하여 고상발효 시킴으로써 얻은 발효물을 의미한다.

본 발명의 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대용 조성물을 사용하면, 코르디세핀 및 여러 가지 딸기의 기능성 물질의 생산량을 효과적으로 증대시킬 수 있어 기능성 소재로의 동충하초 및 딸기의 활용성을 더욱 높일 수 있다.

본 발명은 또한 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 발효 추출물은, (S1) 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (S2) 상기 혼합물에 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)를 접종하여 발효시켜 발효물을 얻는 단계; 및 (S3) 상기 발효물을 C₁ 내지 C₄ 의 저급 알코올로 추출하는 단계;를 포함하여 제조할 수 있다.

상기 (S1) 단계에서 딸기와 번데기의 혼합비는 0.5 : 1 내지 3.5 : 1, 바람직하게는 0.7 : 1 내지 3.3 : 1, 더욱 바람직하게는 1 : 1 내지 3 : 1(w/w)일 수 있다. 상기 혼합비와 같이 딸기와 번데기를 혼합함으로써 상기 혼합물을 발효시키고 추출한 추출물의 지방생성 억제 효과를 더욱 증대시킬 수 있다.

상기 (S2) 단계에서 밀리타리스 동충하초는 혼합물에 3 내지 7 %(v/w), 바람직하게는 5 %(v/w) 농도로 접종될 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.

상기 (S3) 단계에서 저급 알코올은 40 내지 80 %, 바람직하게는 45 내지 75 %, 더욱 바람직하게는 50 내지 70 %(v/v) 에탄올일 수 있다. 상기 비율을 가진 에탄올을 추출에 사용함으로써, 추출물의 지방생성 억제 효과를 더욱 증대시킬 수 있다.

본 발명에 따르면 딸기와 번데기를 3 : 1(w/w) 로 혼합한 혼합물에 밀리타리스 동충하초를 접종하여 발효시켜 얻은 발효물을 50 %(v/v) 에탄올로 추출할 경우, 제조한 발효 추출물이 비만을 가장 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

또한 상기 발효 추출물은 지방세포 분화 억제, 트리글리세라이드 축적 억제, 세포 내 글루코오스 흡수 억제, C/EBP-β(CCAAT-Enhancer-Binding Protein-beta) 발현 억제, PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 발현 억제, A-FABP(Adipocyte fatty acid-binding protein) 발현 억제, FAS(fatty acid synthase) 발현 억제, LPL(lipoprotein lipase) 발현 억제, HMGCR(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase) 발현 억제 및 Glut4(glucose transporter type 4) 발현 억제로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 억제 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 발효 추출물은 상기와 같은 효과를 가짐으로써 비만을 효과적으로 억제 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin)등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학적 유효량은 환자의 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량을 환자에 적용시 0.00001 내지 10000 μg일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

그러나, 본 발명의 약학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명은 또한 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 “식품”은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 시알릴락토오스를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치츠 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 봉독을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 사용하면, 비만을 효과적으로 억제할 수 있어 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 바, 지속적인 성장이 예측되는 비만 개선 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

(1) 실험재료

경남 밀양지역에서 재배중인 설향 품종을 2016년에 농가에서 직접 구입하여 생과를 완전히 분쇄한 것을 재료로 사용하였으며, 번데기는 중국산으로서 마트에서 구입하여 사용하였다. 딸기의 발효에 사용된 균주는 눈꽃 동충하초(Paecilomyces tenuipes)와 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)로서 부산대학교 이상몽 교수님 연구실로부터 분양 받아서 발효에 사용하였다.

(2) 시약 및 기기

HPLC 분석 및 시료의 추출에 사용한 유기용매는 Fisher scientific (Fisher scientific Korea, Seoul, Korea)의 HPLC급 용매를 사용하였다. 그 외는 모두 특급시약을 사용하였다. HPLC 분석기기는 Agilent 1100 Series LC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)의 system controller, photodiode array detector (PDA), auto sample injector, degasser를 사용하였으며 HPLC column은 Phenomenex사의 Luna C18 column (150×4.6 mm, 5 μm, Phenomenx, USA)을 사용하였다.

항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Paso Robles, CA, USA)에서, 파라포름알데히드는 TCI (TCI, Tokyo, Japan)에서, 이소프로판올은 GENEray (GENEray, Shanghai, China)에서 구입하였다. 또한 Western loading buffer, Bio-Rad 단백질 분석 시약 및 단백질 마커는 BioRad (BioRad, Hercules, CA, USA)에서 구매하였다. 트리글리세라이드 검출 키트 및 글루코오스 검출 키트는 아산 제약(Asan Pharmaceutical)(Seoul, Korea)에서 구입하였다. NaHCO₃, HEPEs, 인슐린, 로시글리타존(rosiglitazone), 덱사메타손(dexamethasone), oil red O 및 기타 약품은 Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

(3) 동충하초 균주 배양

균주는 PDA 또는 MEA 평판배지에서 4℃에서 보존하면서 30일 간격으로 계대배양하였다. 균사생장을 위해 PDA 또는 MEA 평판배지를 이용하였고 항온배양기에서 25℃로 7일간 배양하였다. PDB 또는 MEB 배지는 300 ml 삼각플라스크에 100 ml씩 각각 넣어 121℃에서 15분간 살균한 다음 냉각시켜 사용하였다. PDA 평판배지에서 7일간 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 mm 코르크 보러를 사용하여 각각 3조각을 채취하여 PDB와 MEB 액체배지에 접종한 후 25℃에서 7일간 진탕배양(150 rpm)하여 액체 종균을 생산하였다.

(4) 동충하초 고상발효 및 검액의 조제

딸기 및 번데기 혼합물의 동충하초 고상발효를 위해 우선, 신선한 딸기를 씻은 다음 믹서로 혼합하였다. 그 후 0 %, 25 % 및 50 % 번데기(silkworm pupa)(FS, FSP25 및 FSP50)를 포함하는 혼합 딸기(300 g)와 100 % 번데기(FP)를 오토클레이브 가능한 비닐에 넣었다. 즉, 발효에 사용한 실험군은 FS(0 % 번데기, 즉 딸기), FSP25(25 % 번데기를 포함한 딸기), FSP50(50 % 번데기를 포함한 딸기), FP(100 % 번데기)이며 동충하초(C. militaris)를 접종하지 않은 비-발효 딸기(NS)를 대조군으로 사용하였다. 비닐은 현대오토클레이브 (Hyundai Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 121℃에서 30분간 고온가압 멸균한 후 상온에서 30분간 식혔다. 그 후 동충하초 액체종균 현탁액을 멸균된 딸기(FS, FSP25 및 FSP50) 및 번데기(FP)에 5%(v/w) 수준으로 접종하여 25±1℃의 배양기에서 4주간 고상발효시켰다. 발효물을 분쇄기로 완전히 분말화 한 다음 검체 3.0 g에 95 %(v/v)와 50 %(v/v) 에탄올 및 증류수를 각각 10 ml 넣어 1시간 초음파하여 추출한 다음, 3,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 취하고, 9 ml을 다시 첨가하여 2회 반복하여 초음파 추출한 용액을 모두 합하여 총량을 30 ml로 조정하였다. 추출액 5 ml을 취하여 0.45 μm syringe filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였다. 나머지 25 ml을 Whatman filter paper No 2 (No. 2 filter paper, Whatman, Clifton, NJ, USA)로 필터하여 rotary vacuum evaporator (rotavator R-200, Bchi, Flawil, Switzerland)로 45℃에서 감압 농축한 다음 NO 또는 MTT 분석 자료로 사용하였다.

(5) 발효 딸기 추출물 제조 방법

추출 용매에 따른 효과를 확인하기 위하여, NS, FS, FSP25, FSP50 및 FP을 70 % 에탄올, 50 % 에탄올 및 물로 추출하였으며, 상기 70 % 에탄올, 50 % 에탄올 및 물 추출 용매에 따라 E70, E50 및 DW로 표현하였다. 추출은 상기 실험 샘플들을 실온에서 초음파 분쇄기(sonicator)를 통해 1시간 동안 3회 10 배의 용매로 추출하여 사용하였다. 추출물은 Whatman No. 2 여과지로 여과한 후, 잔류물을 동일한 조건 하에서 2회 재추출하였다. 상기 추출물은 45 ℃ 감압 하에서 회전식 증발기 (Heidolph Instruments Co., Ltd, Schwabach, Germany)를 사용하여 농축하였다. 그 후 추출 수율의 계산을 위해 칭량하고 흡습을 방지하기 위해 밀봉한 후 이후의 분석을 위해 -18 ℃에서 저장하였다. 동결건조된 추출물은 분석에 사용하기 전에, 20 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해시킨 다음 추가 분석을 위해 희석하였다.

(6) HPLC 분석을 통한 정량화 및 동시분석 방법 확립

비-발효 딸기 및 번데기를 포함한 발효 딸기 추출물의 주요 화합물은 Ko 등의 방법으로 분석하였다(Ko, Jayaramaiah, Gupta, Kim, An, Wang, et al., 2017). 또한 동충하초의 주요성분인 코르디세핀(cordycepin)과 딸기의 주요 생리활성 물질을 동시 분석하기 위하여 현재까지 보고된 주요성분 14종을 시약회사로부터 구입하여 분석방법을 확립하였다. 국내에서 재배되고 있는 주요 품종과 육성중인 계통의 생리활성물질의 함량을 분석한 자료를 기반으로 하여 고기능성 딸기 품종을 육성하기 위하여 딸기의 주요성분으로 알려진 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidin-3-glucoside), callistephin(pelargonidin 3-O-glucoside chloride), pelarrgonin, cinchonine, epi-gallocatechin, chlorogenic acid, (+)-catechin, epi-catechin, p-coumaric acid, elllagic acid, quercetin-3-glucuronide, fisetin, quercetin, cinnamic acid 및 kaempferol 등 15종의 회귀직선식, 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ) 값을 구하여 동시분석방법을 확립하였다.

구체적으로, 표준품의 정량분석은 용매별 추출물을 0.45 μm syringe filter(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 고성능액체크로마토그래피(HPLC)는 Agilent 1100 series (Agilent Technologies Inc., CA, USA)이고, 칼럼은 역상 (reverse phase) 칼럼인 Luna C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm), 검출기는 UV detector (254 nm)를 사용하였다. 이동상은 0.025% formic acid (A용액)과 acetonitrile (B용액)을 사용하였고 펌프 프로그램을 통해 gradient를 설정하였으며 유속은 0.8 ml/min로 하였다. 제조된 각각의 용액을 autosampler로 10 μl씩 주입하여 분석실험을 실시하였다. 이동상 용매의 조성과 gradient 조건은 표 1에서 보는 바와 같이 다양한 조건으로 설정하여 분석실험을 수행하였다. HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram의 면적을 회귀직선방정식에 대입하여 각각 표준물질의 함량을 구했으며 각각의 시료에 대해 3회 반복하여 지표성분의 함량을 산출하였다.

HPLC를 이용한 분석법의 신뢰도와 재현성을 검증하기 위해서 ICH 가이드라인에 의한 분석을 수행하였다. 직선성(linearity)은 다섯 개의 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml) 별로 피크 면적비를 구하여 표준품 농도(X축)와 피크 면적비(Y축)에 대한 검량선을 작성하였고, 검량선으로부터 직선성의 상관계수를 구하여 확인하였다.

(7) 3T3-L1 세포 배양

3T3-L1 세포는 KCLB (Korea Cell Line Bank, 한국)에서 구입하였으며 10 % FBS (Welgene, Gyeongsina-si, 한국)를 포함하는 DMEM (Gibco, Gland Island, NY, USA), 25 mM NaHCO₃ (Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 25 mM HEPEs (Sigma, St. Louis, MO, USA) (배양 배지)로 유지하였다. 세포를 48-웰 플레이트 내에 완전히 융합될 때까지 성장시킨 후 지방세포(adipocyte)의 분화를 10 μM 로시글리타존(rosiglitazone) (ROS, Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 ㎍/ml 인슐린 (In, Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 1 μM 덱사메타손(dexamethasone) (DEX, Sigma, St. Louis, MO, USA) (분화 배지)로 유도하였다. 48시간 후, 다음 48시간의 배양을 위해 분화 배지를 새로 보충해 주었고 매 2일마다 분화 배지를 보충해 주었다. 분화 과정 동안 본 발명의 실험군(비-발효 딸기(NS), FS(0 % 번데기, 즉 딸기), FSP25(25 % 번데기를 포함한 딸기), FSP50(50 % 번데기를 포함한 딸기), FP(100 % 번데기))을 추출 용매(70 % 에탄올, 50 % 에탄올 및 물)을 추출한 추출물을 증류수에 용해하여 3T3-L1 세포의 유도 과정 시 분화 배지에 첨가함으로써 3T3-L1 지방세포 분화에 대한 효과를 관찰하였다. 상기 분화 과정을 도 2에 나타내었다.

(8) Oil red O 염색

분화 8일째에 지방세포를 PBS로 세척한 후, 상온에서 20분 동안 4 % 파라포름 알데히드 (TCI, Tokyo, Japan)를 사용하여 고정시켰으며 oil red O (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 4 ℃에서 30분 동안 염색하였다. 염색 후 과량의 염료를 제거하고 플레이트를 PBS로 2번 세척한 다음 Motic 현미경 (Moitc, Xiamen, China)을 사용하여 사진을 촬영하였다.

(9) OD 값 측정

사진 촬영 후 PBS를 제거하고 oil red O를 용해시키기 위해 각 웰에 150 ㎕ 이소프로판올 (GENEray, Shanghai, China)을 첨가하였다. 그 후 각 웰에서 100 ㎕를 96-웰 플레이트로 옮기고 BioTek elisa 판독기 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 500 nm에서 OD 값을 측정하였다.

(10) 트리글리세라이드(Triglyceride, TG) 함량 결정

세포를 12-웰 플레이트 내에 완전히 융합되도록 성장시키고 상기 ‘(7) 3T3-L1 세포 배양’ 방법에 기재된 분화 방법에 따라 분화시켰다. 8일째에, 5 % triton X-100 (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada)을 사용하여 트리글리세라이드를 추출하고 시판되는 TG 키트 (아산 제약, 서울, 한국)를 프로토콜에 따라 사용하여 TG 함량을 정량화하였다.

(11) 배지 내 글루코오스 함량 결정

세포를 12-웰 플레이트 내에 완전히 융합되도록 성장시키고 상기 ‘(7) 3T3-L1 세포 배양’ 방법에 기재된 바와 같은 분화 방법에 따라 분화시켰다. 8일째에, 각 웰의 배지를 수집하여 시판용 글루코오스 키트 (아산 제약, 서울, 한국)를 프로토콜에 따라 사용하여 글루코오스를 정량화하였다.

(12) 웨스턴 블롯(Western Blot)

3T3 세포는 배양 배지(대조군), In+Dex, 분화 배지(In+Dex+Ros) 및 25 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 50 % 에탄올 추출물(FSP25E50)을 상이한 농도(2.5 μg/ml, 5.0 μg/ml, 10.0 μg/ml)로 포함한 분화 배지로 24시간 또는 8일 동안 배양하였다. 배양 세포를 수득한 후 RIPA 버퍼 (150 mM Nacl, 1 % Trition X-100, 0.5 % Sodium deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 mM Tris-HCl 및 1 mM phenylmethylsulfonyl flouride)로 30분 동안 얼음으로 용해시켰다. 상기 용해물은 12,000 g, 4 ℃에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 Bio-Rad 단백질 분석 시약 (BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 그 후 4-loading 버퍼 (BioRad, Hercules, CA, USA) 및 2-mercaptoethanol (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada)과 혼합된 단백질을 95 ℃에서 7분간 가열하였으며, 단백질 마커 (BioRad, Hercules, CA, USA)에 따라 12 % SDS-PAGE로 분리시켰다. 그 후, 단백질을 겔로부터 PVDF 멤브레인으로 전기-이동(electro-transfer)시켰으며 Semi Dry Transfer 시스템 (BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 20V에서 약 20분 동안 두었다. 상기 멤브레인을 PBST 버퍼 (0.1 % Tween-20/PBS) 내 1 % BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹한 다음, 3 % BSA-PBST 용액으로 4 ℃에서 밤새 희석한 1차 항체로 검출하였다. 또한 상기 멤브레인을 PBST 용액으로 매회 5분 동안 3회 세척한 후 상응하는 HRP-결합 2차 항체와 반응하도록 상온에서 1시간 더 두었다. 멤브레인을 PBST 용액으로 5분 동안 3회 세척한 후에, 제조사의 설명서에 따라 면역-반응성 밴드를 ECL 검출 키트 (Thermo Scientific, Rocford, IL, USA)를 사용하여 시각화하였다. 밴드는 Image J software(Wayne Rasband, NIH, USA)로 분석하였다.

(13) 통계분석

Dancan’s multiple range test로 생리활성(bio-activity) 물질의 함량을 비교 하였다. 두 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 student’s t-test를 사용하였다. 모든 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험으로부터 means±SD로 나타내었다. P<0.05를 유의적인 통계적 차이가 있는 것으로 판단하였다.

실시예 1. 딸기 주요 생리활성 물질의 증진 효과 확인

딸기의 주요 생리활성물질 증진을 통해 딸기의 부가가치 항상 및 활용도를 높이기 위하여, 이전 재료 및 방법에 기재된 방법에 따라 딸기의 생체중당 번데기를 0%, 25%, 50% 및 100%로 첨가(NS, FS, FSP25, FSP50 및 FP)하여 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)를 접종한 후 4주간 고상발효시켰다. 상기 발효물의 외관을 촬영한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 딸기에 번데기를 첨가하여 밀리타리스 동충하초로 발효시킨 발효물은 외형적으로 상당한 변화가 있음을 확인하였다.

또한 추출 용매에 따른 효과를 확인하기 위하여, 상기 NS, FS, FSP25, FSP50 및 FP을 70 % 에탄올, 50 % 에탄올 및 물로 추출하였으며, 상기 70 % 에탄올, 50 % 에탄올 및 물 추출 용매에 따라 E70, E50 및 DW로 표현하였다. 추출 용매(70% 에탄올, 50% 에탄올 및 물)를 달리한 추출물에서, 딸기의 주요 생리활성물질과 동충하초의 주요성분인 코르디세핀(cordycepin)의 함량 변화를 HPLC 정량 분석을 통해 조사하였으며 이에 대한 결과를 레이더 플로팅(radar plotting)한 결과를 도 4에, 구체적인 수치를 표 2에 나타내었다.

도 4 및 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 코르디세핀 및 딸기의 주요 생리활성물질의 변화는 번데기 함량과 추출 용매에 따라 다르게 나타났다.

우선 코르디세핀의 경우, 25 % 번데기 첨가 발효추출물에서 가장 함량이 높았으며, 50% 번데기 첨가 발효추출물, 번데기 무첨가(100% 딸기) 발효추출물, 100% 번데기 첨가 발효추출물의 순으로 함량이 높은 것을 확인하였다. 특히 25% 번데기 첨가 발효추출물에서 번데기 무첨가 발효추출물에 비해 15배 이상 코르디세핀의 함량이 증가하는 것을 확인하였다. 추출 용매에 따른 변화에서는 코르디세핀의 경우 50% 에탄올로 추출 시에 함량이 가장 많았으며, 그 다음은 70% 에탄올 추출 시에 함량이 많았다. 반면 물 추출물에서는 코르디세핀의 함량이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

딸기의 주요 생리활성 물질의 경우, 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidin-3-glucoside)의 함량은 딸기만으로 발효시(번데기 무첨가 발효)에는 전혀 생성되지 않았으나, 딸기에 첨가된 번데기의 첨가율이 높을수록 증가하였는데, 이러한 경향은 추출용매와는 관계없이 유사한 경향이었다. 신코닌(Cinchonine)은 발효를 함으로서 약 30배 가량 증가되었는데, 번데기의 첨가량이 증가할수록 감소하는 경향이었으며, 추출용매(70% 에탄올, 50% 에탄올 및 물)에 따라서는 거의 차이가 없었다. 칼리스테핀(callistephin)은 딸기의 발효 시 검출되지 않았으나 추출용매에 관계없이 번데기와 혼합한 혼합 딸기의 발효 추출물에서 함량이 증가하였다. 카테킨(Catechin)은 발효를 함으로써 많은 양이 생성되었는데, 번데기의 첨가량이 많을수록 감소하였다. 에피갈로카테킨(Epi-gallocatechin)은 발효시에 약간 증대되었는데, 50% 번데기 첨가 시에 가장 많았으며, 100% 번데기로 발효 시에는 전혀 검출되지 않았다. p-쿠마린산(p-Coumaric acid)는 70% 에탄올 추출 시에는 25%와 50% 번데기 첨가 발효추출물에서 약 40 μg/g 생체중, 50% 에탄올로 추출시에는 50% 번데기 발효 추출물에서 약 30 μg/g 생체중이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 엘라그산(Ellagic acid)은 발효하지 않은 딸기에서 70%와 50% 에탄올로 추출하였을 경우에 약 29 μg/g 생체중이 함유되어 있었으며, 번데기 무첨가 발효추출물에서는 각각 152.1 μg/g 생체중과 133.2 μg/g 생체중으로서 5배와 4배 이상 함량이 증가하여 발효에 의해 함량이 급격히 증가한 것을 확인하였으며, 번데기의 첨가량이 많을수록 함량은 감소하였다.

또한 딸기의 생리활성물질 중 딸기의 발효로 인해 함량이 변화하는 주요 물질 7가지, 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidin-3-glucoside), 신코닌(Cinchonine), 칼리스테핀(callistephin), 카테킨(Catechin), 엘라그산(Ellagic acid) 및 퀘르세틴( quercetin)과 C. militaris의 코르디세핀의 함량에 대해 표 3에 다른 표 형식으로 나타내었다.

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 딸기의 발효로 인해 주요 생리활성물질의 변화가 나타남을 더욱 뚜렷하게 확인하였다. 구체적으로 NS, FS, FSP50, FSP25 및 FP에서의 차이를 살펴보면, 시아니딘-3-글루코사이드는 번데기를 첨가하지 않고 발효시킨 FS에서는 검출되지 않았고, FSP25와 FSP50에서는 NS와 비교하여 10 내지 248배로 현저하게 증대되는 것을 확인하였다. 또한 발효를 통해 칼리스테핀의 경우 NS의 2.4 내지 31.7 배 증가하였으며, 엘라그산의 경우 NS의 2.0 내지 5.1 배, 퀘르세틴의 경우 NS의 1.0 내지 2.9 배, 신코닌의 경우 NS 대비 2.0 내지 31.8 배 증가한 것을 확인하였다.

동충하초의 코르디세핀 성분의 경우에도 발효로 인한 변화가 뚜렷하게 나타났다. 구체적으로 비-발효 딸기에서는 검출되지 않았으나 번데기의 유무와 상관없이 발효된 딸기에서 함량이 현저하게 증대되는 것을 확인하였다. 발효 실험군인 FS, FSP50, FSP25 및 FP를 비교해 보면, 코르디세핀의 경우 낮은 농도의 번데기 첨가 시 더욱 함량이 높아지는 것을 확인하였다. 추출 용매에 따른 함량 변화의 경우, 코르디세핀 함량은 모든 실험군에서 50 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 물 순으로 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 2. 딸기 발효 추출물의 주요 생리활성 상관 분석

Cordyceps millataris 동충하초 균주로 발효한 발효추출물 중에서 크리산테민(chrysanthemin)(시아니딘-3-글루코사이)과 칼리스테핀, 카테킨과 신코닌, 카테킨과 칼리스테핀, 에피갈로카테킨과 엘라그산, 에피갈로카테킨과 퀘르세틴은 상관값이 0.7 이상으로서 고도의 유의성을 나타내는 성분으로서 크리산테민(chrysanthemin)의 함량이 증가하면 칼리스테핀이 카테킨이 증가하면 신코닌, 카테킨과 칼리스테핀이 및 에피갈로카테킨이 증가하면 엘라그산와 퀘르세틴이 증가하는 경향이었다. 상관값이 0.5 이상으로서 고도의 유의성을 나타내는 성분은 퀘르세틴의 경우에는 코르디세핀, p-쿠마린산, 엘라그산 및 이소퀘르세틴(isoquercetin)과 엘라그산의 경우에는 카테킨 등이 있었다. 반면, 0.5 이하의 부의 상관값으로 고도의 유의성을 나타내는 성분은 칼리스테핀의 경우 엘라그산과 퀘르세틴간, 신남산(cinnamic acid)의 경우에는 신코닌과 카테킨간에 부의 상관값을 나타냄으로서 칼리스테핀의 함량이 증가할수록 엘라그산과 퀘르세틴은 감소하고, 신남산이 증가할수록 신코닌과 카테킨도 유의하게 감소하는 경향이었다.

실시예 3. 발효 딸기 추출물의 PCA 분석 및 PCA score plot

발효시에 첨가되는 번데기의 첨가 함량에 따른 발효추출물의 주성분 분석(principal component analysis) 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 첫 번째 주성분(F1)과 두 번째 주성분(F2)는 전체 데이터의 96.6%와 1.6%의 설명력을 보여 주었고, 총설명력은 98.2%였다. 도 5에서 각각의 코드에 대한 설명은 다음과 같다: SC1: 비-발효 딸기의 70%, EtOH, 50% EtOH 및 물 추출물(SC1P70, SC1P50, SC1W), SCP0: 발효 딸기의 70%, EtOH, 50% EtOH 및 물 추출물(SCP0P70, SCP0P50, SCP0W), SCP25: 25 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 70%, EtOH, 50% EtOH 및 물 추출물(SCP25P70, SCP25P50, SCP25W), SCP50: 50 % 번데기를 함유한 발효 딸기의 70%, EtOH, 50% EtOH 및 물 추출물(SCP50P70, SCP50P50, SCP50W), SCP100: 발효 번데기의 70%, EtOH, 50% EtOH 및 물 추출물(SCP100P70, SCP100P50, SCP100W).

각각의 특성분포를 보면 F1의 오른쪽 즉 양의 방향으로 SCP25P70과 SCP25P50, SCP50P70과 SCP50P50, SCP25W와 SCP50W 등이 분포하였고, 왼쪽에는 SCP0P70, SCP0P50, SCP0W, SC1P70, SC1P50, SC1W, SCP100P70, SCP100P5 및 SCP100W 등이 분포하였다. F2 상으로는 양의 방향으로 SCP25P70, SCP25P50, SCP50P70, SCP50P50, SCP0P70, SCP0P50, 및 SCP0W 등이 분포하였으며, 음의 방향으로 SCP100P70, SCP100P50, SCP100W, SC1P70, SC1P50 및 SC1W 등이 분포하였다. 주성분 1과 2의 양의 방향에는 딸기에 번데기를 25%와 50% 첨가하여 발효한 다음 50%와 70%의 에탄올로 추출한 추출물이 분포한 반면, 음의 방향에는 딸기에 번데기 25%와 50%를 첨가한 발효물을 물로 추출한 SCP25W와 SCP50W이 분포하여 물추출물과 에탄올 추출물 간에는 추출 용매로 인한 특성이 드러나는 경향이었다.

주성분 1의 음의 방향과 주성분 2의 양의 방향에는 딸기발효추출물인 SCP0P70, SCP0P50 및 SCP0W가 분포하였으며, 주성분 1과 2의 음의 방향에는 번데기 발효물인 SCP100P70, SCP100P50, SCP100W와 딸기 비-발효추출물인 SC1P70, SC1P50 및 SC1W 등이 분포하였다. 따라서 딸기에 번데기를 첨가하여 발효한 발효추출의 성분 PCA 분석결과, 딸기에 번데기를 첨가하여 에탄올로 추출한 추출물은 제1 주성분과 제 2 주성분의 양의 방향에, 물 추출물은 제 2주성분의 음의 방향에 분포하였다. 제 1주성분의 음의 방향과 제 2주성분의 양의 방향에는 발효딸기의 에탄올 및 물 추출물이 분포하였으며, 음의 방향에는 미발효 딸기와 번데기 발효물이 분포하여, 발효와 미발효, 딸기 발효시에 번데기 첨가 유무, 번데기 발효물 및 발효물의 추출용매 등으로 명확한 차이가 있는 것으로 확인하였다.

또한 딸기와 발효원인 번데기를 혼합하여 Cordyceps millitaris 균주로 발효한 발효물을 용매별(70% 에탄올, 50% 에탄올 및 물)로 추출한 물질을 분류하여 PCA scores plot으로 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 70% 에탄올 추출물의 경우 첫 번째 주성분(F1)과 두 번째 주성분(F2)은 전체 데이터의 96.3%와 2.5%의 설명력을 보여 주었고, 총설명력은 98.8%였다. 70% 에탄올 추출물의 경우 주성분 1의 양의 방향과 2의 음의 방향에는 딸기에 번데기 25%와 50%를 첨가하여 발효한 발효 추출물이 분포하였고, 주성분 1의 음의 방향과 주성분 2의 양의 방향에는 번데기 발효 추출물이, 주성분 1의 음의 방향과 주성분 2의 음의 방향에는 미발효 추출물과 딸기 발효 추출물이 분포하였다. 50% 에탄올 추출물의 경우 제 1과 제 2주성분의 양의 방향에는 딸기에 번데기 50% 첨가와 번데기 발효추출물이 분포하였고, 주성분 1의 음의 방향과 주성분 2의 양의 방향에는 딸기 발효추출물과 딸기에 번데기 25% 추출물이, 주성분 1과 2의 음의 방향에는 미발효 추출물과 딸기 발효 추출물이 분포하였다. 물 추출물의 경우 주성분 1과 2의 음의 방향에 딸기에 번데기 25%와 50%를 첨사하여 발효한 발효추출물, 제 1주성분 음의 방향과 제 2주성분 양의 방향에는 번데기 발효추출물 및 제1과 제2의 주성분의 음의 방향에는 미발효 딸기 추출물과 딸기 발효 추출물이 분포하였다.

이상에서 보는 바와 같이 딸기 발효물의 성분함량은 추출용매에 따라서 주성분 1과 2 사이에 상당히 다른 경향을 보였으므로 발효를 통한 새로운 물질의 생성과 확보 등이 중요한 요인이지만, 추출용매에 따라서 기능성 성분의 함량에 상당한 차이를 나타내었다. 전체 조사한 생리활성 성분 11종 중에서 70%와 50% 추출물에서는 11종의 물질이 모두 검출되었으나, 물 추출물에서는 에피갈로카테킨, 엘라그산 및 이소퀘르세틴이 검출되지 않아서 추출 용매는 생리활성 성분의 함량은 물론 검출여부와도 관련성이 큰 것을 확인하였다.

실시예 4. 계층적 군집분석

계층적 군집분석은 주어진 관측치 중에서 유사한 것들을 집단으로 그룹화하여 집단의 성격을 파악함으로써 데이터 전체의 구조에 대한 이해를 돕고자 하는 분석 방법(Huang 2014)으로서 본 발명에 따라 번데기와 혼합하여 발효한 발효 딸기의 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이 군집의 결과를 덴드로그램으로 표시하였다. 밀리타리스 동충하초 발효추출물의 군집분석 결과 크게 3개의 군으로 분류되었고, 군집간의 거리를 바탕으로 확인한 결과, 발효하지 않은 그룹(SC1), 번데기만으로 발효한 그룹(SCP100) 및 딸기 발효그룹(SCP)그룹으로 분류되었다. 딸기 발효그룹은 다시 번데기 무첨가 발효 (SCP0)와 번데기 25%와 50% 첨가구 그룹으로 분류되었다. 군집간의 거리를 바탕으로 살펴보면 번데기 무첨가(SCP0)와 번데기 첨가(SCP25, SCP50)가 가까운 거리에 위치하였다. 이러한 결과는 크게 딸기 미발효와 발효딸기로 분류되고, 발효는 다시 발효시에 딸기를 포함하는 발효(SCP0, SCP25, SCP50)와 딸기를 포함하지 않은 번데기 발효 (SCP100)로 분류되었다. 딸기를 포함하는 발효는 다시 딸기 단독 발효(SCP0)와 딸기에 번데기 첨가 발효(SCP25, SCP50)으로 분류되어 발효와 미발효, 발효시에 첨가되는 번데기에 따라서 명확한 분류가 가능하였다.

또한 발효 딸기의 추출물에 대한 agglomerative hierarchical clustering (AHC) 결과를 도 8에, 계층군집분석(Hierarchical cluster analysis, HCA) 결과를 도 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이 딸기 발효시에 발효원인 번데기 첨가 유무에 따라 대사물질의 함량이 유의적으로 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 코르디세핀, 퀘르세틴, 이소퀘르세틴 및 캠퍼롤(kaempferol)은 군집분석결과 하나의 하위집단(subgroup)으로 분류되었는데, 딸기에 첨가되는 발효원인 번데기의 첨가량이 높을수록 함량이 증가하는 경향이었고, 번데기만으로 발효하였을 경우에는 발효하지 않은 딸기 추출물과 함량이 유사하였다. 신코닌, 에피갈로카테킨, 카테킨 및 엘라그산은 하나의 하위집단으로서 번데기를 첨가하지 않은 발효추출물에서 함량이 가장 많았으나, 번데기의 첨가량이 증가할수록 감소하는 경향이었다. 신남산은 발효를 함으로서 함량이 감소하였으며, 시아니딘-3-글루코사이드와 칼리스테핀은 동일한 하위집단으로서 딸기에 번데기를 첨가하여 발효한 발효 추출물에서는 차이가 없었으나, 번데기 발효추출물에서의 함량이 증가하는 경향을 나타냈다. 따라서 계층군집분석을 통해 딸기 발효시에 첨가되는 번데기의 양과 발효 유무에 따른 관련 대사경로를 도출하였고 이는 대사물질의 함량을 비교 분석할 수 있는 좋은 분석 방법으로 판단되었다.

실시예 5. 발효 딸기 추출물의 지방세포 분화 억제 효과 확인

본 실시예에서는 본 발명의 NS, FS, FSP25, FSP50 및 FP 추출물의 지방생성 억제 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해 각 추출물을 증류수에 녹인 후 ‘(7) 3T3-L1 세포 배양’에 따라 배양한 3T3-L1 세포주에 처리하여 지방생성 억제 효과가 나타나는지 확인하였다. 3T3-L1 세포주에서 지방 생성을 유도하기 위해서는 로시글리타존, 인슐린 및 덱사메타손을 사용하였으며 유도 8일 후 지방세포의 분화가 유도되는 것을 확인하였다. 이에 대한 oil red O 염색 결과를 도 10A에, OD값 측정 결과를 도 10B에 나타내었다. 도 10에서 물을 첨가한 분화 배지와 비교하여 * p<0.05, ** p<0.01로 나타내었다.

도 10B에 나타낸 바와 같이, 추출 용매와는 상관없이 발효 딸기 추출물 중 FS의 경우 200 ㎍/ml, FSP50의 경우 20 ㎍/ml, FSP25의 경우 10 ㎍/ml 까지 용량 의존적인 효과를 확인하여, 모든 발효 딸기 추출물의 지방생성 억제 효과를 확인하였다. 반면 딸기가 함유되지 않은 FP의 경우는 지방생성 억제 효과를 나타내지 않았다.

또한 추출 용매에 따른 결과를 보면 FSP25E70, FSP25E50 및 FSP25DW 의 경우 5.0㎍/ml 및 10㎍/ml 농도에서 용량 의존적으로 지방생성을 유의하게 억제하였다. FSP50E70, FSP50E50 및 FSP50DW 추출물은 20㎍/ml 농도에서 지방 생성을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 번데기를 포함한 딸기를 발효시킨 발효물의 추출물의 지방생성 억제 효과를 확인한 결과이며, 이중에서도 FSP25의 추출물이 FSP50의 추출물보다 지방생성을 더욱 효과적으로 억제함을 알 수 있는 결과이다. 또한 번데기 혼합 발효 딸기의 에탄올 추출물(70 % 에탄올 및 50 % 에탄올 추출물)이 물 추출물보다 우수한 지방생성 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 6. FSP25E50 의 지방세포에서의 트리글리세라이드(TG) 축적 및 글루코오스 흡수 억제 효과 확인

PPAR-γ는 지방산 저장 및 글루코오스 흡수를 조절한다. 본 실시예에서는 PPAR-γ 작용제인 로시글리타존(rosiglitazone)을 사용하여 3T3-L1 지방세포전구체(pre-adipocyte)의 분화를 유도하였다. 또한 상기 실시예에서 가장 효과적인 지방생성 억제 효과를 나타내는 실험군이 FSP25E50임을 확인했으므로, FSP25E50을 처리하였을 때의 트리글리세라이드 축적량과 글루코오스 흡수량을 측정하여 도 11에 나타내었다. 도 11에서 물을 첨가한 분화 배지와 비교하여 * p<0.05, ** p<0.01로 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, FSP25E50의 처리용량에 의존적으로 3T3-L1 세포의 지방생성 과정에서 트리글리세라이드 축적과 세포 내 글루코오스 흡수가 유의하게 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 7. FSP25E50의 C/EBP-β 및 PPAR-γ의 발현 억제 효과 확인

C/EBP-α, C/EBP-β 및 PPAR-γ 단백질은 지방세포전구체(pre-adipocyte)가 성숙한 지방세포로 분화하는 데에 중요한 역할을 한다. 본 실시예에서는 3T3-L1 세포주에서의 지방생성 억제 메카니즘을 밝히기 위해 분화 배지에서 3T3-L1 세포를 유도하고 1일 및 8일 동안 FSP25E50과 함께 배양하였다. 그 후 Western blot을 이용하여 3T3-L1 세포에서의 C/EBP-α, C/EBP-β 및 PPAR-γ을 측정하여 이를 도 12에 나타내었다. 분화 1일째에서의 결과를 도 12A에, 8일째에서의 결과를 도 12B에 나타내었다. 도 12A 및 12B에서 In+Dex+Ros 군과 비교하여 * p<0.05로 나타내었다.

도 12A에 나타낸 바와 같이, 1일째에 10.0 μg/ml의 처리농도 기준에서 FSP25E50은 In+Dex+Ros와 비교하였을 때 C/EBP-β 및 PPAR-γ의 발현을 각각 70.2 % 및 60.1 % 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다.

또한 도 12B에 나타낸 바와 같이, 8일째에 10.0μg/ml 농도 기준에서 FSP25E50 처리 시 In+Dex+Ros와 비교하여 C/EBP-β 및 PPAR-γ는 각각 약 47.2 % 및 68.7 % 감소하는 것을 확인하였다.

또한 도 12A 및 도 12B에서의 결과를 통해 본 발명의 모든 FSP25E50 처리군에서 C/EBP-β 및 PPAR-γ의 단백질 수준이 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 8. FSP25E50의 PPAR-γ의 표적 유전자들의 발현 억제 효과 확인

A-FABP는 주로 지방 세포에서 발현되고 지방산의 저장 및 지방 분해를 조절하는 지방산 운반체 단백질이다. 이 단백질 발현을 억제시키면 비만을 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다. FAS는 지방 생성에 중요한 역할을 하는 단백질이다. 또한 LPL은 지방 세포 분화에 중요한 역할을 하는 단백질로서, LPL의 발현은 세포의 TG 축적과 함께 증가한다. HMGCR는 콜레스테롤과 다른 이소프레노이드를 생산하는 메발로네이트(mevalonate) 경로의 중요한 효소이다. Glut4는 글루코오스를 배지에서 세포로 이동시키는 데에 필수적인 단백질로, 지방세포전구체가 지방 세포로 분화하는 데에 주요한 글루코오스 전달체이다. 따라서 본 실시예에서는 3T3-L1 세포 분화 8일째에 웨스턴 블롯을 사용하여 FSP25E50의 A-FABP, FAS, LPL, HMGCR 및 Glut4 발현 억제 효과를 확인하였으며 이에 대한 결과는 도 13에 나타내었다. 도 13에서 In+Dex+Ros 군과 비교하여 * p<0.05, ** p<0.01로 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, A-FABP, FAS, LPL, HMGCR 및 Glut4의 발현이 FSP25E50에 의해 유의하게 억제되었음을 확인하였다. 따라서 이러한 결과를 통해서도 본 발명의 FSP25E50이 분화된 3T3-L1 세포에서 지방 생성을 억제하고 TG 축적을 억제시키며 글루코오스 흡수를 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

제제예 1. 의약품의 제조

1.1 산제의 제조

딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물 200mg

유당 100mg

탈크 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2 정제의 제조

딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1.3 캡슐제의 제조

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.

1.4 주사제의 제조

딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물 10μg/ml

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1.5 액제의 제조

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1,00ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품의 제조

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조(예, 영양캔디 등)에 사용할 수 있다.

제제예 3. 음료의 제조

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강기능성 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

(S1) 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 및
(S2) 상기 혼합물에 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법.
제1항에 있어서,
상기 (S2) 단계의 발효는 고상발효인 것을 특징으로 하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법.
제1항에 있어서,
상기 딸기의 기능성 물질은 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidin-3-glucoside), 신코닌(Cinchonine), 카테킨(Catechin), 에피갈로카테킨(Epi-gallocatechin), p-쿠마린산(p-Coumaric acid) 및 엘라그산(Ellagic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대 방법.
딸기 및 번데기 혼합물의 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris) 발효물을 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 딸기의 기능성 물질은 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidin-3-glucoside), 신코닌(Cinchonine), 카테킨(Catechin), 에피갈로카테킨(Epi-gallocatechin), p-쿠마린산(p-Coumaric acid) 및 엘라그산(Ellagic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 밀리타리스 동충하초의 코르디세핀(cordycepin) 및 딸기의 기능성 물질 생산량 증대용 조성물.
딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 발효 추출물은,
(S1) 딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;
(S2) 상기 혼합물에 밀리타리스 동충하초(Cordyceps millataris)를 접종하여 발효시켜 발효물을 얻는 단계; 및
(S3) 상기 발효물을 C₁ 내지 C₄ 의 저급 알코올로 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 (S1) 단계에서 딸기와 번데기의 혼합비는 0.5 : 1 내지 3.5 : 1(w/w) 인 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 (S3) 단계에서 저급 알코올은 40 내지 80 %(v/v) 에탄올인 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
딸기 및 번데기를 포함하는 혼합물의 밀리타리스 동충하초 발효 추출물을 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.