KR101249800B1 - 발효 팥 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 측면은 홍국균에 의해 발효된 팥으로부터 추출되고, 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성을 나타내는 발효 팥 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 홍국균에 의해 생산된 활성형의 모나콜린 K 뿐만 아니라 페놀 화합물, 플라보노이드 등 다양한 생리활성 성분을 포함하고 있어서, 항산화 활성, 콜레스테롤 저하 활성, 지질 저하 활성 또는 중성지방 저하 활성 등과 같은 매우 우수한 기능성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 신장 장애를 일으키는 독소 물질인 시트리닌을 포함하고 있지 않거나 매우 미량으로 포함하고 있어서 안전성이 우수한 소재이다.

Description

발효 팥 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도{Extract of red bean fermented with Monascus species, method for preparing the same and use of the same}

본 출원은 팥으로부터 유래되는 유용한 기능성 소재 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 홍국균에 의해 발효된 팥의 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

홍국(red yeast rice, red koji)은 붉은색의 사상균인 모나스커스(Monascus)속의 균을 곡류에 접종하여 제조한 것이다. 이 균은 중국을 중심으로 동아시아의 여러 지역에서 천연의 식품 착색제나 가공품 및 소화 촉진과 혈류 개선의 소재로서 오랫동안 사용되어 왔다. 근래에는 홍국균이 생성하는 2차 대사산물인 메비놀린[혹은 로바스타틴(lovastatin), 모나콜린(monacolin) K, 또는 메바코르(mevacor)로 표시됨]이 콜레스테롤 생합성효소인 HMG-CoA(3-hydroxy-methyl-3- glutaryl-coenzyme) 환원효소를 강력하게 저해하여 혈중지질 농도를 감소시키고 콜레스테롤 합성을 억제한다는 등의 각종 기능성이 보고되고 있으며(Wang IK et al., J. Agri. Food Chem. 48: 3183-3189 2000; Endo A. et al., J. Antibiotechnol. 38: 420-422 1985; Manzoni M & Rollini M. App. Microbiol. Biotechnol. 58: 555-564 2002; Wei W. et al., J. Nutri. Biochem. 14: 314-318 2003), 이로 인해 홍국균이 크게 주목을 받고 있다.

그러나 모나스커속 균주는 대사 산물로서 메비놀린 이외에도 모나스코루브라민(monascorubramin)이나 모나신(monascin) 등의 색소성분과 함께, 신장과 간장의 독 성분으로 알려진 시트리닌 등의 마이코톡신 (mycotoxin)을 생산한다(Blanc PJ, Loret MO, Goma G.Biotechnol. Lett. 17: 291-294 1995; Wang YZ, Ju XL, Zhou YG. Food Microbiol. 22: 145-148 2005). 이는 모나스커스속 균주의 광범위한 활용에 장애가 될 수 있다. 즉, 이들 2차 대사산물의 생산은, 균체 내에서 아세틸-코에이(acetyl-coA)와 말로닐-코에이(malonylcoA)로 개시되는 폴리케타이드 경로(polyketide pathway)를 동일하게 경유하여 생합성(Hendrickson L. et al., Chem. Biol. 6: 429-439 1999; Shinizu T. et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:3453-3457 2005) 되기 때문이다. 최근 Wang 등은 여러 종의 모나스커스의 배양물에 함유된 시트리닌의 양을 측정한 결과, 조사된 모든 시료에서 최고 480/ℓ에서 최저 65/ℓ의 시트리닌이 검출되어, 모나스커스 균주를 이용한 모든 제품에 대한 안전성 평가의 필요성을 제기하였다(Wang YZ, Ju XL, Zhou YG. Food Microbiol. 22: 145-148 2005). 시트리닌은 1931년에 밝혀진 곰팡이의 대사 산물로서, 신장과 간장의 기능에 영향을 주는 곰팡이 독소 성분으로 알려져 왔다. 특히 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)에서 분리하여 시트리닌(citrinin)으로 명명되었으나, 이후에 아스퍼질러스(Aspergillus)나 모나스커스(Monascus)속 곰팡이의 대사산물에서도 그 존재량이 0.065-0.48 ㎎/㎖로 알려졌다.

지금까지 홍국균을 이용하여 뛰어난 약리 효능을 가진 기능성 소재를 얻기 위한 연구가 적극적으로 이루어져 오고 있으며, 홍국균의 발효 기질로 쌀, 보리, 밀 등과 같은 곡물이 사용되고 있고, 최근에 대한민국 등록특허공보 제10-1145181호에 콩을 기질로 사용하고 홍국균으로 발효시켜 제조한 항비만 활성을 가진 검정콩 발효물이 개시된바 있다. 그러나, 홍국균을 활용한 다양한 기능성 소재를 얻기 위해서는 기능성과 안전성을 동시에 확보할 수 있는 새로운 기질 및 이의 발효 공정을 확립시킬 필요가 있다.

본 발명은 종래의 배경하에 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 유용한 생리활성을 나타내는 발효 팥, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 유용한 생리활성을 나타내는 발효 팥 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는데에 있다

본 발명의 발명자들은 팥을 홍국균으로 발효시키는 경우 모나콜린 K가 다량으로 생성되고, 독소 물질인 시트리닌이 거의 생성되지 않으며, 발효된 팥의 총 페놀 화합물 함량, 총 플라보노이드 함량, 조단백질 함량 및 조섬유 함량이 증가하여 발효된 팥이 현저히 향상된 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성, 지질 저하 활성 또는 중성지방 저하 활성 등과 같은 기능성 및 의약, 식품 소재로서의 안전성을 가진다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 팥을 홍국균으로 발효시켜 얻은 산물로서, 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성을 나타내는 발효 팥을 제공한다. 또한, 본 발명은 고체 배지에 홍국균 또는 홍국균을 포함하는 종균용 배양액을 접종하고 배양하여 고체 종균을 수득하는 단계; 및 팥에 고체 종균을 접종하고 배양하여 팥을 고상 발효시키는 단계를 포함하고, 상기 고체 배지는 밀 기울인 것을 특징으로 하는 발효 팥의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 발효 팥의 용도로서, 홍국균에 의해 발효된 팥을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 조성물에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 발효 팥의 다른 용도로서, 홍국균에 의해 발효된 팥을 포함하는 중성지방 또는 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 식품 조성물 또는 사료 조성물에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 홍국균에 의해 발효된 팥으로부터 추출되고, 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성을 나타내는 발효 팥 추출물을 제공한다. 또한, 본 발명은 팥에 홍국균을 포함하는 고체 종균을 접종하고 배양하여 팥을 고상 발효시키는 단계; 및 상기 발효된 팥으로부터 추출물을 추출하는 단계를 포함하는 발효 팥 추출물의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 발효 팥 추출물의 용도로서, 홍국균에 의해 발효된 팥으로부터 추출된 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다. 이때 상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 첨가제에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 발효 팥 추출물의 다른 용도로서, 홍국균에 의해 발효된 팥으로부터 추출된 추출물을 유효 성분으로 포함하는 중성지방 또는 콜레스테롤 저하용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물 또는 사료 첨가제에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 홍국균에 의해 생산된 활성형의 모나콜린 K 뿐만 아니라 페놀 화합물, 플라보노이드 등 다양한 생리활성 성분을 포함하고 있어서, 항산화 활성, 콜레스테롤 저하 활성, 지질 저하 활성 또는 중성지방 저하 활성 등과 같은 매우 우수한 기능성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 신장 장애를 일으키는 독소 물질인 시트리닌을 포함하고 있지 않거나 매우 미량으로 포함하고 있어서 안전성이 우수한 소재이다. 따라서, 본 발명에 따른 발효 팥의 추출물은 산화적 스트레스로 인한 각종 질환, 예를 들어 노화, 간 손상, 암 또는 각종 성인병 등을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 지방간, 당뇨, 고지질혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 심혈관 질환, 동맥경화, 지질 관련 대사 증후군과 같은 지질 관련 대사성 질환, 변비, 비만 등을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있다.

도 1은 PDA 배지에서 활성화된 홍국균 균주들의 성상을 나타낸 사진이고, 도 2는 Mizutani 배지에서 Monascus pilosus IFO 4480을 배양했을 때 배양 시간의 경과에 따른 배양액 내 건조 세포 중량 변화 및 및 모나콜린 K의 함량 변화를 나타낸 그래프이며, 도 3은 Mizutani 배지에서 Monascus pilosus IFO 4480을 7일간 배양하여 얻은 배양액을 HPLC로 분석하여 얻은 피크 결과이다. 도 2의 그래프에서 오른쪽 Y 좌표는 배양액 g 당 모나콜린 K의 양을 나타내며, "MKA"는 모나콜린 K의 활성형(acid form)과 비활성형(lactone form)을 모두 포함한다. 또한, 도 3의 그래프에서 왼쪽(A)은 시트리닌 표준 시약에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이고, 오른쪽(B)는 배양액에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이다.
도 4는 고체 배지인 밀 기울의 수분 함량별 Monascus pilosus IFO 4480 종균의 성상을 나타낸 것이고, 도 5는 고체 배지인 밀 기울의 수분 함량별 Monascus pilosus IFO 4480 종균의 모나콜린 K 생성량을 나타낸 그래프이다. 도 4에서 "control"은 홍국균을 접종하지 않은 밀기울을 나타낸 것이다. 또한, 도 5에서 모나콜린 K 생성량은 종균(고체 배지인 밀기울과 홍국균으로 이루어짐) g 당 양으로 표시되며, "MK"는 모나콜린 K의 비활성형(lactone form)을 의미하고, "MKA"는 모나콜린 K의 활성형(acid form)을 의미한다. 또한, 도 5에서 x축은 고체 배지인 밀기울의 수분 함량을 나타낸 것이다.
도 6은 발아된 팥을 나타낸 사진이다.
도 7은 제조예 6에서 얻은 발효 팥 샘플의 고상 발효 시간의 경과에 따른 모나콜린 K 함량 변화를 나타낸 그래프이고, 도 8은 발효에 사용되는 미발효 팥 샘플(왼쪽) 및 15일 발효 후 얻은 발효 팥 샘플(오른쪽)을 나타낸 사진이다. 도 7에서 모나콜린 K는 모나콜린 K의 활성형과 비활성형을 모두 포함하고, 발효 팥의 g 당 양으로 표시된다.
도 9는 미발효 팥(위)과 제조예 7에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥(아래)에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이다.
도 10은 제조예 6, 11, 12, 13, 14 및 15에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K(활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 나타낸 그래프이다. 도 10에서 모나콜린 K의 양은 발효 팥 g당 양으로 표시된다.
도 11은 제조예 6, 7, 8, 9 및 10에서 채취한 발효 밭에 존재하는 모나콜린 K(활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 발효 시간의 경과별로 나타낸 그래프이다. 도 11에서 모나콜린 K의 양은 발효 팥 g당 양으로 표시된다.
도 12는 제조예 6 및 제조예 16에 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K(활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 나타낸 그래프이다. 도 12에서 모나콜린 K의 양은 발효 팥 g당 양으로 표시된다.
도 13은 제조예 6에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥(위) 및 제조예 18에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥(아래)에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이다.
도 14는 2가지 형태의 모나콜린 K의 화학식을 나타낸 것이다. 도 14의 A는 비활성형(lactone form)의 모나콜린 K를 나타낸 것이고, 도 14의 B는 활성형(acid form)의 모나콜린 K를 나타낸 것이다.
도 15는 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물에 대해 DPPH 어세이로 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 15에서 x축의 "UAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB1"은 제조예 6의 첫 번째 배치에 의해 제조된 발효 팥을 의미하고, "MFAB2"는 제조예 6의 두 번째 배치에 의해 제조된 발효 팥을 의미하고, "MFAB3"은 제조예 6의 세 번째 배치에 의해 제조된 발효 팥을 의미한다.
도 16은 미발효 팥 추출물, 발효 팥 추출물, 미발효 발아 팥 추출물 및 발효 발아 팥 추출물에 대해 DPPH 어세이로 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 16에서 x축의 "팥"은 미발아 팥을 의미한다.
도 17은 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물에 대해 ABTS 어세이로 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 17에서 x축의 "NAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB"는 제조예 6에서 제조된 발효 팥을 의미한다.
도 18은 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물을 시료로 사용하여 총 페놀 화합물 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 18에서 총 페놀 화합물 함량은 발효 팥 또는 미발효 팥의 g 당 양으로 표시된다. 도 18에서 x축의 "NAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB"는 제조예 6에서 제조된 발효 팥을 의미한다.
도 19는 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물을 시료로 사용하여 총 플라보노이드 화합물 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 19에서 총 플라보노이드 화합물 함량은 발효 팥 또는 미발효 팥의 g 당 양으로 표시된다. 도 19에서 x축의 "NAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB"는 제조예 6에서 제조된 발효 팥을 의미한다.
도 20은 미발효 팥과 제조예 6에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥의 조단백질, 조지방, 조섬유, 회분 및 탄수화물의 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "홍국균"은 모나스커스(Monascus)속에 속하고 2차 대사산물로 모나콜린 K를 생성할 수 있는 균을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 개선 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 유용한 생리활성을 나타내는 발효 팥, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는데에 있다.

본 발명에 따른 발효 팥은 팥을 홍국균으로 발효시켜 얻은 산물로서, 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성 등을 나타낸다. 이때, 홍국균은 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus), 모나스커스 러버(Monascus ruber), 모나스커스 퍼프레우스(Monascus purpureus), 모나스커스 카올리앙(Monascus kaoliang), 모나스커스 바리케리(Monascus barykery), 모나스커스 안카(Monascus anka) 등 모나스커스(Monascus)속에 속하고 2차 대사산물로 모나콜린 K를 생성할 수 있는 균이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 모나콜린 K의 높은 생산성 및 시트리닌의 낮은 생산성을 고려할 때 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)인 것이 바람직하고, 활성형의 모나콜린 K를 생성하는 관점에서 상기 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)는 기탁번호가 IFO 4480 또는 KCCM 60396인 것이 더 바람직하다. 또한, 홍국균의 기질로 사용되는 팥의 입도는 크게 제한되지 않으나, 홍국균의 기질로서의 적합성 및 모나콜린 K의 높은 생산성을 고려할 때 입도가 1㎝ 이하인 것이 바람직하고, 0.8~0.2㎝인 것이 더 바람직하고 0.4~0.6㎝인 것이 가장 바람직하다. 팥의 입도는 분쇄 등의 공정을 통해 조절될 수 있다. 또한, 홍국균의 기질로 사용되는 팥은 항산화 활성 측면을 고려할 때 발아 팥인 것이 바람직하고, 이때 발아 팥의 발아 길이는 크게 제한되지 않으나 적어도 0.5㎜ 이상인 것이 바람직하고, 1~5㎜인 것이 더 바람직하고, 1~3㎜인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 발효 팥의 제조방법은 고체 배지에 홍국균 또는 홍국균을 포함하는 종균용 배양액을 접종하고 배양하여 고체 종균을 수득하는 단계; 및 팥에 고체 종균을 접종하고 배양하여 팥을 고상 발효시키는 단계를 포함한다. 이때, 고체 배지는 쌀겨, 밀 기울 등 홍국균의 고체 배양이 가능하고 고체 배양에 의해 홍국균의 균체수를 증가시키거나 모나콜린 K의 생산 능력을 향상시킬 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 이 중 밀 기울인 것이 바람직하다. 또한, 상기 고체 배지로 사용되는 밀 기울의 수분 함량은 홍국균의 생장 및 모나콜린 K의 생산 능력 향상 측면에서 45~60%인 것이 바람직하고, 50~60%인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 고체 종균을 수득하는 단계에서 고체 배지에 대한 종균용 배양액의 접종량은 홍국균 생장 및 경제성 측면에서 고체 배지 중량 대비 10~30%인 것이 바람직하고, 15~30%인 것이 더 바람직하고 15~25%인 것이 가장 바람직하다. 또한, 고체 배지에 접종되는 종균용 배양액은 홍국균을 공지의 다양한 액상 배지에 접종하고 액상 배양시켜 얻을 수 있는데, 바람직하게는 홍국균을 PDB 배지, Mizutani 배지 또는 S-INAE 배지에서 선택된 액상 배지에 접종하고 배양하여 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥의 제조방법에서 사용되는 홍국균은 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus), 모나스커스 러버(Monascus ruber), 모나스커스 퍼프레우스(Monascus purpureus), 모나스커스 카올리앙(Monascus kaoliang), 모나스커스 바리케리(Monascus barykery), 모나스커스 안카(Monascus anka) 등 모나스커스(Monascus)속에 속하고 2차 대사산물로 모나콜린 K를 생성할 수 있는 균이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 모나콜린 K의 높은 생산성 및 시트리닌의 낮은 생산성을 고려할 때 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)인 것이 바람직하고, 활성형의 모나콜린 K를 생성하는 관점에서 상기 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)는 기탁번호가 IFO 4480 또는 KCCM 60396인 것이 더 바람직하다. 또한, 홍국균을 포함하는 고체 종균의 기질로 사용되는 팥은 홍국균의 이용성을 증대시키고 발효시 오염 등을 예방하는 측면에서 증자 등과 같은 방법, 예를 들어 가압 및 가열에 의해 멸균되는 것이 바람직하다. 또한, 홍국균을 포함하는 고체 종균의 기질로 사용되는 팥의 입도는 크게 제한되지 않으나, 홍국균의 기질로서의 적합성 및 모나콜린 K의 높은 생산성을 고려할 때 입도가 1㎝ 이하인 것이 바람직하고, 0.8~0.2㎝인 것이 더 바람직하고 0.4~0.6㎝인 것이 가장 바람직하다. 팥의 입도는 분쇄 등의 공정을 통해 조절될 수 있다. 또한, 홍국균을 포함하는 고체 종균의 기질로 사용되는 팥은 항산화 활성 측면을 고려할 때 발아 팥인 것이 바람직하고, 이때 발아 팥의 발아 길이는 크게 제한되지 않으나 적어도 0.5㎜ 이상인 것이 바람직하고, 1~5㎜인 것이 더 바람직하고, 1~3㎜인 것이 가장 바람직하다. 또한, 홍국균을 포함하는 고체 종균의 접종량은 크게 제한되지 않으나, 모나콜린 K의 생산성을 고려할 때 팥 중량 대비 1.5~30%인 것이 바람직하고, 경제성을 고려할 때 1.5~10%인 것이 더 바람직하고, 1.5~5%인 것이 가장 바람직하다. 또한, 팥을 고상 발효시키는 단계에서 고체 종균의 배양 온도 및 배양 시간은 사용되는 홍국균에 의해 다양한 범위에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 모나콜린 K의 생산성을 고려할 때 배양 온도는 25~30℃인 것이 바람직하고, 배양 시간은 10~15일인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 발효 팥은 홍국균에 의해 생산된 모나콜린 K를 다량으로 함유하고 있고 미발효 팥에 비해 총 페놀 화합물 함량, 총 플라보노이드 함량, 조단백질 함량 및 조섬유 함량이 상대적으로 높아 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성, 지질 저하 활성 또는 중성지방 저하 활성 등 매우 우수한 기능성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥은 신장 장애를 일으키는 독소 물질인 시트리닌을 포함하고 있지 않거나 매우 미량으로 포함하고 있어서 안전성이 우수한 소재이다. 따라서, 본 발명에 따른 발효 팥은 그 자체로 항산화용 조성물, 중성지방 저하용 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물 등이 될 수 있고, 이러한 조성물의 일 성분을 구성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항산화용 조성물은 발효 팥을 유효 성분으로 포함하고, 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 조성물에서 선택되는 어느 하나의 형태를 가질 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 항산화용 조성물은 산화적 스트레스로 인한 각종 질환, 예를 들어 노화, 간 손상, 암 또는 각종 성인병 등을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 중성지방 또는 콜레스테롤 저하용 조성물은 발효 팥을 유효 성분으로 포함하고, 식품 조성물 또는 사료 조성물에서 선택되는 어느 하나의 형태를 가질 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 중성지방 또는 콜레스테롤 저하용 조성물은 지방간, 당뇨, 고지질혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 심혈관 질환, 동맥경화, 지질 관련 대사 증후군과 같은 지질 관련 대사성 질환, 변비, 비만 등을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 발효 팥을 포함하는 조성물의 구체적인 제형 및 이용 방법 등은 후술하는 발효 팥 추출물을 포함하는 조성물에 기재된 내용을 참조한다.

본 발명의 다른 측면은 유용한 생리활성을 나타내는 발효 팥 추출물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 이하, 전술한 발효 팥, 이의 제조방법 및 이의 용도와 동일한 내용은 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 발효 밭 추출물은 홍국균에 의해 발효된 팥으로부터 추출되고, 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성을 나타낸다. 상기 발효 팥 추출물은 홍국균 발효에 의해 생성된 모나콜린 K(특히 활성형의 모날콜린 K) 외에 페놀 화합물(특히 폴리페놀 화합물), 이소플라본 등과 같은 다양한 생리활성 성분을 포함한다.

본 발명에 따른 발효 팥 추출물의 제조방법은 팥에 홍국균을 포함하는 고체 종균을 접종하고 배양하여 팥을 고상 발효시키는 단계; 및 상기 발효된 팥으로부터 추출물을 추출하는 단계를 포함한다. 이때, 홍국균을 포함하는 고체 종균은 고체 배지에 홍국균 또는 홍국균을 포함하는 종균용 배양액을 접종하고 배양하여 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용하여 제조될 수 있다. 용매 추출법을 이용한 발효 팥 추출물 제조시 사용되는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것이 바람직하다. 추출 용매로 물을 사용하는 경우 물은 열수인 것이 바람직하다. 예를 들어 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 발효 팥에 발효 팥 중량 대비 5~20배 부피의 물을 가하고 80~120℃에서 2~8시간 동안 환류 추출 후 여과하고 동결건조하여 얻을 수 있다. 또한, 추출 용매로 알코올을 사용하는 경우 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올인 것이 바람직하고, 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 한편, 본 발명의 발효 팥 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 발효 팥 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 다른 추출 방법을 통해 얻어진 추출물 내지 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다. 상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205). 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다. 또한, 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다. 초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 홍국균에 의해 생산된 활성형의 모나콜린 K 뿐만 아니라 페놀 화합물, 플라보노이드 등 다양한 생리활성 성분을 포함하고 있어서, 항산화 활성, 콜레스테롤 저하 활성, 지질 저하 활성 또는 중성지방 저하 활성 등과 같은 매우 우수한 기능성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 신장 장애를 일으키는 독소 물질인 시트리닌을 포함하고 있지 않거나 매우 미량으로 포함하고 있어서 안전성이 우수한 소재이다. 따라서, 본 발명에 따른 발효 팥 추출물은 항산화용 조성물, 중성지방 저하용 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물 등의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항산화용 조성물, 중성지방 저하용 조성물, 콜레스테롤 저하용 조성물 등은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 조성물(특히 기능성 식품 조성물), 화장료 조성물(특히, 기능성 화장료 조성물) 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 발효 팥을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 산화적 스트레스로 인한 각종 질환, 예를 들어 노화, 간 손상, 암 또는 각종 성인병 등을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있고, 지방간, 당뇨, 고지질혈증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 심혈관 질환, 동맥경화, 지질 관련 대사 증후군과 같은 지질 관련 대사성 질환, 변비, 비만 등을 예방 또는 치료하는데에도 사용될 수 있다.

본 발명의 발효 팥 추출물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물에서 발효 팥 추출물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.1~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 발효 팥 추출물 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 발효 팥 추출물 외에 항산화 활성, 콜레스테롤 저하 활성, 지질 저하 활성 또는 중성지방 저하 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 벌나무 추물물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분인 발효 팥 추출물을 기준으로 할 때 0.1 내지 1000 ㎎/㎏이고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎎/㎏이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 발효 팥 추출물을 유효 성분으로 포함하는 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물에서 발효 팥 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 발효 팥 추출물 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 발효 팥 추출물을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물에서 발효 팥 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~30 중량%, 바람직하게는 0.01~20 중량%, 더 바람직하게는 0.1~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물은 발효 팥 추출물 외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 발효 팥 추출물을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제는 예를 들어 발효 팥 추출물 0.1 ~ 20 중량%, 지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01 중량%, 제 3 인산칼슘 1 ~ 20 중량%, 비타민 E 0.01 ~ 0.1 중량%, 효소분말 1 ~ 10 중량%, 유산균 0.1 ~ 10 중량%, 바실러스(Bacillus) 배양액 0.01 ~ 10 중량% 및 포도당 20 ~ 90 중량%로 구성될 수 있으나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니며, 발효 팥 추출물이 유효량으로 첨가되어 있다면, 본 발명의 사료첨가제로서 가능하다. 상기 유효량이란, 가금류, 가축 등이 꾸준히 섭취함으로써 우울증을 예방하거나 치료할 수 있는 양, 또는 대장염을 예방하거나 치료할 수 있는 양을 의미한다. 또한, 첨가에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

1. 홍국균 균주의 선별

한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections, KFCC)의 부설 균주기탁 및 보존기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 홍국균 균주인 Monascus pilosus KCCM 60084, Monascus pilosus IFO 4480(기탁번호 KCCM 60396 균주와 동일한 균주임), Monascus ruber ATCC 22080, 및 Monascus kaoliang KCCM 60154를 분양받아 이들의 모나콜린 K(Monacolin K) 및 시트리닌(Citrinin) 생산 능력을 조사하였다. 모나콜린 K(Monacolin K)는 혈중 콜레스테롤의 생체 내 합성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 홍국균 대사생성물이고, 시트리닌(Citrinin)은 신장 장애를 일으키는 독소 물질로 알려져 있다.

분양받은 모든 균주들을 감자한천배지(potato dextrose agar medium, PDA 배지)에서 배양하여 활성화시키고, 이후 Mizutani 배지(글루코오스 5.0g, 펩톤 2.0g, KH₂PO₄ 0.8g, MgSO₄·7H₂O 0.05g, 포타슘아세테이트 0.2g, NaCl 0.1g, 증류수 100㎖; pH 6.0)에 활성화된 균주를 접종하고 28℃에서 약 10일간 배양하였다. 이후, 배양액(균주 포함)의 모나콜린 K(Monacolin K) 함량 및 시트리닌(Citrinin) 함량을 HPLC(고성능액체크로마토그래피)를 이용하여 분석하였다. 구체적으로 모나콜린 K(Monacolin K) 함량 및 시트리닌(Citrinin) 함량 분석은 Lee, et al[Lee, S.I., Kim, J.W., Lee, Y.K., Yang, S.H., Lee, I.A., Suh, J.W. and Kim, S.D. (2011) Anti-obesity effect of Monascus pilosus Mycelial Extract in high fat diet-induced obese rats. J. Appl . Biol . Chem . 54:197-205.]에 기재된 방법을 사용하였다. 모나콜린 K의 비활성형(lactone form) 분석을 위한 표준 물질로 Mevinolin(공급자 : Sigma)을 사용하였고, 모나콜린 K의 활성형(acid form) 분석을 위헤 Ajdari et al[Ajdari Z, Ebrahimpour A, Abdul Manan M, Hamid M, Mohamad R, Ariff AB. (2011) ssessment of monacolin in the fermented products using Monascus purpureus FTC5391. Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2011, Article ID 426168, 9 pages doi:10.1155/2011/426168]에 기재된 방법을 이용하여 모나콜린 K의 활성형(acid form)을 제조하였다.

도 1은 PDA 배지에서 활성화된 홍국균 균주들의 성상을 나타낸 사진이고, 도 2는 Mizutani 배지에서 Monascus pilosus IFO 4480을 배양했을 때 배양 시간의 경과에 따른 배양액 내 건조 세포 중량 변화 및 및 모나콜린 K의 함량 변화를 나타낸 그래프이며, 도 3은 Mizutani 배지에서 Monascus pilosus IFO 4480을 7일간 배양하여 얻은 배양액을 HPLC로 분석하여 얻은 피크 결과이다. 도 2의 그래프에서 오른쪽 Y 좌표는 배양액 g 당 모나콜린 K의 양을 나타내며, "MKA"는 모나콜린 K의 활성형(acid form)과 비활성형(lactone form)을 모두 포함한다. 또한, 도 3의 그래프에서 왼쪽(A)은 시트리닌 표준 시약에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이고, 오른쪽(B)는 배양액에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이다.

홍국균 균주들의 모나콜린 K(Monacolin K) 및 시트리닌(Citrinin) 생산 능력을 분석한 결과, Monascus pilosus IFO 4480(기탁번호 KCCM 60396 균주와 동일한 균주임) 균주의 배양액에서 모나콜린 K(Monacolin K)의 함량이 가장 높고 시트리닌(Citrinin)이 검출되지 않아 Monascus pilosus IFO 4480(기탁번호 KCCM 60396 균주와 동일한 균주임) 균주를 최종 균주로 선별하였다.

2. 선별된 홍국균 균주의 종균 배양 조건 확립

(1) 홍국균 종균용 고체 배지의 선별

일반적으로 홍국균 종균은 PDB (potato dextrose Broth) 배지, Mizutani 배지, S-INAE 배지(쌀가루 2.0g, 글루코오스 3.0g, 펩톤 2.0g, KH₂PO₄ 0.8g, MgSO₄·7H₂O 0.05g, 소듐니트레이트 0.2g, NaCl 0.1g, 증류수 100㎖; pH 6.0) 등과 같은 액체 배지에 홍국균을 접종하고 배양하여 얻어진다. 그러나 이러한 액체 배지는 주성분이 글루코오스, 펩톤 등이어서 매우 고가이고, 홍국균을 이용하여 대량 발효시 경제성이 떨어지는 문제가 있다. 또한, 액체 배지에서 배양하여 얻은 액체 종균은 배양시 오염의 위험에 노출되기 쉽다. 따라서, 본 발명의 발명자는 밀기울(wheat bran) 및 쌀겨(rice bran)의 종균용 고체 배지로서의 특성을 조사하였다. 먼저 Monascus pilosus IFO 4480(기탁번호 KCCM 60396 균주와 동일한 균주임)를 PDB 배지(Potato Dextrose Broth medium; 공급자 : Difco, MI, USA)에 접종하고 28℃에서 약 4일간 배양한 다음 수분 함량이 약 50%(중량 기준)인 밀기울 또는 쌀겨에 접종하고 약 28℃로 조절된 배양기 내에서 약 7일간 배양하여 고체 배지(밀기울 또는 쌀겨) 및 홍국균으로 이루어진 고체 종균을 얻었다. 이때, 배양액의 접종량은 수분을 포함하는 고체 배지 중량 대비 5%, 10%, 20%, 및 30% 이었다.

얻은 고체 종균의 성상 및 모나콜린 K의 함량을 분석한 결과 밀기울을 최종 종균용 고체 배지로 선별하였고, 배양액의 최적 접종량은 고체 배지 중량 대비 약 20%인 것으로 나타났다.

(2) 고체 배지의 수분 함량에 따른 종균 특성 변화

선별된 고체 배지인 밀기울의 수분 함량을 40%, 50% 및 60%로 조절하고, 여기에 Monascus pilosus IFO 4480(기탁번호 KCCM 60396 균주와 동일한 균주임) 배양액(PDB 배지, 28℃, 4일)을 고체 배지 중량 대비 20%의 양으로 접종하고 약 28℃로 조절된 배양기 내에서 약 7일간 배양하여 고체 배지 및 홍국균으로 이루어진 고체 종균을 얻었다. 도 4는 고체 배지인 밀 기울의 수분 함량별 Monascus pilosus IFO 4480 종균의 성상을 나타낸 것이고, 도 5는 고체 배지인 밀 기울의 수분 함량별 Monascus pilosus IFO 4480 종균의 모나콜린 K 생성량을 나타낸 그래프이다. 도 4에서 "control"은 홍국균을 접종하지 않은 밀기울을 나타낸 것이다. 또한, 도 5에서 모나콜린 K 생성량은 종균(고체 배지인 밀기울과 홍국균으로 이루어짐) g 당 양으로 표시되며, "MK"는 모나콜린 K의 비활성형(lactone form)을 의미하고, "MKA"는 모나콜린 K의 활성형(acid form)을 의미한다. 또한, 도 5에서 x축은 고체 배지인 밀기울의 수분 함량을 나타낸 것이다.

분석 결과, 종균 생산을 위한 고체 배지의 최적 수분 함량은 약 45~60%인 것으로 나타났다.

(3) 선별된 홍국균 균주의 고체 종균을 위한 최적 배양 조건

선별된 홍국균 균주인 Monascus pilosus IFO 4480의 고체 종균을 얻기 위한 최적 배양 조건은 다음과 같다.

- 먼저 Monascus pilosus IFO 4480을 Mizutani 배지(글루코오스 5.0g, 펩톤 2.0g, KH₂PO₄ 0.8g, MgSO₄·7H₂O 0.05g, 포타슘아세테이트 0.2g, NaCl 0.1g, 증류수 100㎖; pH 6.0) 또는 PDB 배지에 접종하고 28℃에서 4일간 배양하여 종균용 배양액을 얻는다.

- 종균용 배양액을 수분 함량이 50%인 밀기울에 수분을 포함한 밀기울의 중량 대비 20%의 양으로 접종하고 28℃로 조절된 배양기 내에서 7일간 배양하여 밀기울 및 Monascus pilosus IFO 4480이 주성분인 고체 종균을 얻는다.

3. 쌀, 대두, 산약 및 팥의 발효를 위한 고체 종균의 제조

제조예 1 : Monascus pilosus IFO 4480 고체 종균의 제조

Monascus pilosus IFO 4480을 Mizutani 배지(글루코오스 5.0g, 펩톤 2.0g, KH₂PO₄ 0.8g, MgSO₄·7H₂O 0.05g, 포타슘아세테이트 0.2g, NaCl 0.1g, 증류수 100㎖; pH 6.0)에 접종하고 28℃에서 4일간 배양하여 종균용 배양액을 얻었다. 얻은 종균용 배양액을 수분 함량이 50%인 밀기울에 수분을 포함한 밀기울의 중량 대비 20%의 양으로 접종하고 28℃로 조절된 배양기 내에서 7일간 배양하여 밀기울 및 Monascus pilosus IFO 4480이 주성분인 고체 종균을 얻었다.

제조예 2 : Monascus purpureus KACC 42430 고체 종균의 제조

농촌진흥청 농업유전자원정보센터에서 분양받은 Monascus purpureus KACC 42430을 Mizutani 배지(글루코오스 5.0g, 펩톤 2.0g, KH₂PO₄ 0.8g, MgSO₄·7H₂O 0.05g, 포타슘아세테이트 0.2g, NaCl 0.1g, 증류수 100㎖; pH 6.0)에 접종하고 28℃에서 4일간 배양하여 종균용 배양액을 얻었다. 얻은 종균용 배양액을 수분 함량이 50%인 밀기울에 수분을 포함한 밀기울의 중량 대비 20%의 양으로 접종하고 28℃로 조절된 배양기 내에서 7일간 배양하여 밀기울 및 Monascus purpureus KACC 42430이 주성분인 고체 종균을 얻었다.

4. 고체 종균을 이용한 발효 쌀, 발효 대두, 발효 산약의 제조

제조예 3 : 발효 쌀의 제조

쌀을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 이후, 분쇄기로 조분쇄한 다음 조분쇄된 쌀 100g을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이후, 제조예 2에서 얻은 Monascus purpureus KACC 42430 고체 종균을 쌀에 쌀 중량 대비 2%의 양(2g에 해당함)으로 접종하고 28℃에서 15일간 배양하여 쌀을 고상 발효(Solid state fermentation)시켰으며, 접종한 날부터 3일, 6일, 9일, 12일 및 15일이 경과한 때 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 50℃에서 12시간 건조하고, 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 발효 쌀을 얻었다.

제조예 4 : 발효 대두의 제조

대두를 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 이후, 분쇄기로 조분쇄한 다음 조분쇄된 대두 100g을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이후, 제조예 1에서 얻은 Monascus pilosus IFO 4480 고체 종균을 대두에 대두 중량 대비 2%의 양(2g에 해당함)으로 접종하고 28℃에서 15일간 배양하여 대두를 고상 발효시켰으며, 접종한 날부터 3일, 6일, 9일, 12일 및 15일이 경과한 때 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 50℃에서 12시간 건조하고, 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 발효 대두를 얻었다.

제조예 5 : 발효 산약의 제조

산약(Dioscorea batatas, Dioscorea opposita, Dioscorea japonica, Dioscorea tenuipes 등의 덩이뿌리로서, 본 실험에서는 Dioscorea batatas의 덩이뿌리를 사용함)을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 이후, 분쇄기로 조분쇄한 다음 조분쇄된 산약 100g을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이후, 제조예 2에서 얻은 Monascus purpureus KACC 42430 고체 종균을 산약에 산약 중량 대비 2%의 양(2g에 해당함)으로 접종하고 28℃에서 15일간 배양하여 산약을 고상 발효시켰으며, 접종한 날부터 3일, 6일, 9일, 12일 및 15일이 경과한 때 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 50℃에서 12시간 건조하고, 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 발효 산약을 얻었다.

5. 고체 종균을 이용한 발효 팥의 제조

제조예 6.

2011년 대한민국에서 수확한 팥을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 최초 수확한 팥의 입도는 0.8~1.2㎝ 이었다. 이후, 분쇄기로 팥을 0.4~0.6㎝의 입도 크기로 조분쇄한 다음 조분쇄된 팥 100g을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이후, 제조예 1에서 얻은 Monascus pilosus IFO 4480 고체 종균을 팥에 팥 중량 대비 2%의 양(2g에 해당함)으로 접종하고 28℃에서 15일간 배양하여 팥을 고상 발효시켰으며, 접종한 날부터 3일, 5일, 6일, 9일, 10일, 12일 및 15일이 경과한 때 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 50℃에서 12시간 건조하고, 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 발효 팥을 얻었다. 팥의 발효를 동일한 조건으로 3 배치(batch) 수행하였다.

제조예 7.

팥의 발효시 배양 온도를 20℃로 유지한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 8.

팥의 발효시 배양 온도를 25℃로 유지한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 9.

팥의 발효시 배양 온도를 30℃로 유지한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 10.

팥의 발효시 배양 온도를 35℃로 유지한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 11.

고체 종균의 접종량을 팥 중량 대비 1%의 양으로 한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 12.

고체 종균의 접종량을 팥 중량 대비 5%의 양으로 한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 13.

고체 종균의 접종량을 팥 중량 대비 10%의 양으로 한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 14.

고체 종균의 접종량을 팥 중량 대비 20%의 양으로 한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 15.

고체 종균의 접종량을 팥 중량 대비 30%의 양으로 한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

제조예 16.

2011년 대한민국에서 수확한 팥을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 수확한 팥의 입도는 0.8~1.2㎝ 이었다. 이후, 표면의 수분이 제거된 팥 100g을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이후, 제조예 1에서 얻은 Monascus pilosus IFO 4480 고체 종균을 팥에 팥 중량 대비 2%의 양(2g에 해당함)으로 접종하고 28℃에서 15일간 배양하여 팥을 고상 발효시켰으며, 접종한 날부터 3일, 5일, 6일, 9일, 10일, 12일 및 15일이 경과한 때 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 50℃에서 12시간 건조하고, 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 발효 팥을 얻었다. 팥의 발효를 동일한 조건으로 3 배치(batch) 수행하였다.

제조예 17.

2011년 대한민국에서 수확한 팥을 흐르는 물에 씻은 후 촉촉한 여과지에 올려 놓고 28℃에서 24시간 동안 발아시켰다. 팥의 발아가 약 2㎜ 정도 진행되면 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 도 6은 발아된 팥을 나타낸 사진이다. 이후, 분쇄기로 표면의 수분이 제거된 발아 팥을 0.4~0.6㎝의 입도 크기로 조분쇄한 다음 조분쇄된 발아 팥 100g을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이후, 제조예 1에서 얻은 Monascus pilosus IFO 4480 고체 종균을 발아 팥에 발아 팥 중량 대비 2%의 양(2g에 해당함)으로 접종하고 28℃에서 15일간 배양하여 발아 팥을 고상 발효시켰으며, 접종한 날부터 3일, 5일, 6일, 9일, 10일, 12일 및 15일이 경과한 때 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 50℃에서 12시간 건조하고, 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 발효 발아 팥을 얻었다. 발아 팥의 발효를 동일한 조건으로 3 배치(batch) 수행하였다.

제조예 18.

고체 종균으로 제조예 2에서 얻은 Monascus purpureus KACC 42430 고체 종균을 사용한 점을 제외하고는 제조예 6과 동일한 방법으로 분말 형태의 발효 팥을 얻었다.

6. 홍국균 발효에 따른 모나콜린 K 생산량 측정

(1) 발효 쌀, 발효 대두, 발효 산약 및 발효 팥의 모나콜린 K 함량

제조예 3에서 얻은 발효 쌀, 제조예 4에서 얻은 발효 대두, 제조예 5에서 얻은 발효 산약 및 제조예 6에서 얻은 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K(모나콜린 K의 활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 측정하였다. 도 7은 제조예 6에서 얻은 발효 팥 샘플의 고상 발효 시간의 경과에 따른 모나콜린 K 함량 변화를 나타낸 그래프이고, 도 8은 발효에 사용되는 미발효 팥 샘플(왼쪽) 및 15일 발효 후 얻은 발효 팥 샘플(오른쪽)을 나타낸 사진이다. 도 7에서 모나콜린 K는 모나콜린 K의 활성형과 비활성형을 모두 포함하고, 발효 팥의 g 당 양으로 표시된다. 도 7에서 보이는 바와 같이 발효 시간이 약 12일이 경과 되었을 때 모나콜린 K의 함량은 포화 상태에 도달한 것으로 나타났다. 또한, 표 1에 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 쌀, 발효 대두, 발효 산약 및 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K의 함량 측정 결과를 나타내었다.

종균	샘플 g 당 모나콜린 K의 양
	발효 쌀	발효 대두	발효 산약	발효 팥
Monascus purpureus KACC 42430	400~500㎍		134㎍
Monascus pilosus IFO 4480		500~1000㎍		1500㎍ 이상

표 1에서 보이는 바와 같이 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 홍국균으로 발효된 팥은 모나콜린 K의 함량 측면에서 모나스커스 퍼프레우스(Monascus purpureus) 홍국균으로 발효된 쌀보다 약 3배 이상, 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 홍국균으로 발효된 대두보다 약 1.5~3배, 모나스커스 퍼프레우스(Monascus purpureus) 홍국균으로 발효된 산약보다 10배 이상 높은 것으로 나타났다.

(2) 팥의 발효 여부에 따른 모나콜린 K 생산 양상

발효 여부에 따른 모나콜린 K의 생산 양상을 살펴보기 위해 미발효 팥과 제조예 7에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥의 모나콜린 K 존재 양상을 분석하였다. 미발효 팥은 2011년 대한민국에서 수확한 팥을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거한 후, 분쇄기로 입도가 0.4~0.6㎝가 되도록 조분쇄하고 이를 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균한 후, 50℃에서 12시간 건조하고 분쇄기로 분말화한 것을 사용하였다. 도 9는 미발효 팥(위)과 제조예 7에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥(아래)에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이다. 도 9에서 보이는 바와 같이 미발효 팥에서는 모나콜린 K가 검출되지 않았고, 발효 팥에서는 활성형(acid form)의 모나콜린 K가 검출되었다.

일반적으로 홍국균 균사체의 양은 모나콜린 K의 생산과 연관되어 있는 것으로 알려져 있고, 홍국균 균사체의 추출물은 콜레스테롤 저하 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 고체 종균을 이용하여 팥을 고상 발효시키는 경우 홍국균 균사체 생산이 활발히 이루어진 것으로 판단되며, 발효 팥은 콜레스테롤 저하 활성을 가질 것으로 추정된다.

(3) 팥의 발효시 고체 종균의 접종량이 모날콜린 K의 생산에 미치는 영향

팥의 발효시 고체 종균의 접종량이 모나콜린 K의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 제조예 6, 11, 12, 13, 14 및 15에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K의 양을 측정하였다. 도 10은 제조예 6, 11, 12, 13, 14 및 15에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K(활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 나타낸 그래프이다. 도 10에서 모나콜린 K의 양은 발효 팥 g당 양으로 표시된다. 도 10에서 보이는 바와 같이 팥 중량 대비 고체 종균의 접종량이 2% 이상인 경우 모나콜린 K의 양은 접종량의 증가에도 불구하고 크게 증가하지 않았다. 분석 결과, 팥의 발효시 홍국균 고체 종균의 최적 접종량은 팥 중량 대비 2%인 것으로 나타났다.

(4) 팥의 발효시 홍국균의 배양 온도가 모날콜린 K의 생산에 미치는 영향

팥의 발효시 홍국균의 배양 온도가 모날콜린 K의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 제조예 6, 7, 8, 9 및 10에서 채취한 발효 밭에 존재하는 모나콜린 K의 양을 발효 시간의 경과별로 살펴보았다. 도 11은 제조예 6, 7, 8, 9 및 10에서 채취한 발효 밭에 존재하는 모나콜린 K(활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 발효 시간의 경과별로 나타낸 그래프이다. 도 11에서 모나콜린 K의 양은 발효 팥 g당 양으로 표시된다. 도 11에서 보이는 바와 같이 홍국균으로 팥을 발효시킬 때 홍국균의 최적 배양 온도는 25~30℃인 것으로 나타났다.

(5) 홍국균으로 팥의 발효시 팥의 입도 크기가 모날콜린 K의 생산에 미치는 영향

홍국균으로 팥의 발효시 팥의 입도 크기가 모날콜린 K의 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해 제조예 6 및 제조예 16에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K의 양을 측정하였다. 도 12는 제조예 6 및 제조예 16에 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥에 존재하는 모나콜린 K(활성형과 비활성형을 모두 포함)의 양을 나타낸 그래프이다. 도 12에서 모나콜린 K의 양은 발효 팥 g당 양으로 표시된다. 도 12에서 보이는 바와 같이 홍국균의 기질로 사용되는 팥이 본래 크기보다 1/2 수준으로 조분쇄되었을 때 모나콜린 K의 생산량이 약 2배 수준으로 증가하는 결과를 나타내었다.

(6) 팥의 발효시 홍국균의 종류에 따른 모나콜린 K의 생산 양상

팥의 발효시 홍국균의 종류에 따른 모나콜린 K의 생산 양상을 알아보기 위해 제조예 6 및 제조예 18에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥의 모나콜린 K 존재 양상을 분석하였다. 도 13은 제조예 6에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥(위) 및 제조예 18에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥(아래)에 대한 HPLC 분석 피크를 나타낸 것이다. 도 13에서 보이는 바와 같이 Monascus pilosus를 종균으로 사용한 경우 활성형(acid form)의 모나콜린 K가 비활성형(lactone form)의 모나콜린 K에 비해 상대적으로 더 많이 생산된 반면, Monascus purpureus를 종균으로 사용한 경우 비활성형(lactone form)의 모나콜린 K가 활성형(acid form)의 모나콜린 K에 비해 상대적으로 더 많이 생산되었다. 홍국균은 일반적으로 활성형(acid form)의 모나콜린 K와 비활성형(lactone form)의 모나콜린 K를 생산하는 것으로 알려져 있다. 도 14는 2가지 형태의 모나콜린 K의 화학식을 나타낸 것이다. 도 14의 A는 비활성형(lactone form)의 모나콜린 K를 나타낸 것이고, 도 14의 B는 활성형(acid form)의 모나콜린 K를 나타낸 것이다. 도 14에서 보이는 바와 같이 활성형의 모나콜린 K는 비활성형의 모나콜린 K에 존재하는 락톤 고리(lactone ring)가 깨진 형태이며, HMG-CoA와 유사한 구조를 가지고 있다. 활성형의 모나콜린 K는 HMG-CoA reductase(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, HMG-CoA 환원효소)에 대한 친화력이 HMG-CoA보다 10,000배나 높기 때문에 HMG-CoA reductase에 미리 결합함으로써 HMG-CoA reductase를 저해하고 콜레스테롤 생합성을 억제한다. 반면, 비활성형의 모나콜린 K는 그 자체로는 콜레스테롤 생합성을 억제하는 활성을 가지지 못하며, 인체 내에서 전환효소에 의해 약 25% 정도가 활성형으로 전환되는 것으로 알려져 있다. 따라서, Monascus pilosus를 종균으로 사용하여 팥을 발효시키는 경우 발효 팥의 기능성을 증가시키고 경제적 가치를 높일 수 있다.

7. 홍국균 발효에 의해 제조된 발효 쌀, 발효 대두 및 발효 팥 등의 추출물 제조

제조예 19 : 발효 쌀의 추출물 제조

제조예 3에서 발효 시간이 12일 경과 되었을 때 채취한 샘플을 건조 및 분쇄하여 얻은 분말 형태의 발효 쌀 10g에 70% 에탄올 수용액 100㎖를 첨가하고 약 25℃에서 24시간 동안 추출한 후 여과지로 여과하여 발효 쌀의 액상 추출물을 제조하였다. 발효 쌀의 액상 추출물을 약 50℃에서 감압농축하고, 이후 동결건조하여 분말 형태의 발효 쌀 추출물을 제조하였다.

제조예 20 : 발효 대두의 추출물 제조

제조예 4에서 발효 시간이 12일 경과 되었을 때 채취한 샘플을 건조 및 분쇄하여 얻은 분말 형태의 발효 대두 10g에 70% 에탄올 수용액 100㎖를 첨가하고 약 25℃에서 24시간 동안 추출한 후 여과지로 여과하여 발효 대두의 액상 추출물을 제조하였다. 발효 대두의 액상 추출물을 약 50℃에서 감압농축하고, 이후 동결건조하여 분말 형태의 발효 대두 추출물을 제조하였다.

제조예 21 : 발효 팥의 추출물 제조

제조예 6에서 발효 시간이 12일 경과 되었을 때 채취한 샘플을 건조 및 분쇄하여 얻은 분말 형태의 발효 팥 10g에 70% 에탄올 수용액 100㎖를 첨가하고 약 25℃에서 24시간 동안 추출한 후 여과지로 여과하여 발효 팥의 액상 추출물을 제조하였다. 발효 팥의 액상 추출물을 약 50℃에서 감압농축하고, 이후 동결건조하여 분말 형태의 발효 팥 추출물을 제조하였다.

제조예 22 : 미발효 팥의 추출물 제조

2011년 대한민국에서 수확한 팥을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거한 후, 분쇄기로 입도가 0.4~0.6㎝가 되도록 조분쇄하고 이를 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균한 후, 50℃에서 12시간 건조하고 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 미발효 팥을 제조하였다. 분말 형태의 미발효 팥 10g에 70% 에탄올 수용액 100㎖를 첨가하고 약 25℃에서 24시간 동안 추출한 후 여과지로 여과하여 미발효 팥의 액상 추출물을 제조하였다. 미발효 팥의 액상 추출물을 약 50℃에서 감압농축하고, 이후 동결건조하여 분말 형태의 미발효 팥 추출물을 제조하였다.

제조예 24 : 발효 발아 팥의 추출물 제조

제조예 17에서 발효 시간이 12일 경과 되었을 때 채취한 샘플을 건조 및 분쇄하여 얻은 분말 형태의 발효 발아 팥 10g에 70% 에탄올 수용액 100㎖를 첨가하고 약 25℃에서 24시간 동안 추출한 후 여과지로 여과하여 발효 발아 팥의 액상 추출물을 제조하였다. 발효 발아 팥의 액상 추출물을 약 50℃에서 감압농축하고, 이후 동결건조하여 분말 형태의 발효 발아 팥 추출물을 제조하였다.

제조예 25 : 미발효 발아 팥의 추출물 제조

2011년 대한민국에서 수확한 팥을 흐르는 물에 씻은 후 촉촉한 여과지에 올려 놓고 28℃에서 24시간 동안 발아시켰다. 팥의 발아가 약 2㎜ 정도 진행되면 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거하였다. 이후, 분쇄기를 이용하여 표면의 수분이 제거된 발아 팥을 0.4~0.6㎝의 입도 크기로 조분쇄하였다. 조분쇄된 발아 팥을 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균한 후, 50℃에서 12시간 건조하고 분쇄기로 분말화하여 분말 형태의 미발효 발아 팥을 제조하였다. 분말 형태의 미발효 발아 팥 10g에 70% 에탄올 수용액 100㎖를 첨가하고 약 25℃에서 24시간 동안 추출한 후 여과지로 여과하여 미발효 발아 팥의 액상 추출물을 제조하였다. 미발효 발아 팥의 액상 추출물을 약 50℃에서 감압농축하고, 이후 동결건조하여 분말 형태의 미발효 발아 팥 추출물을 제조하였다.

8. 홍국균 발효가 발효 산물의 항산화 활성에 미치는 영향

8-1. DPPH((1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)) 어세이에 의한 라디칼 소거 활성 측정

(1) 발효 여부에 따른 항산화 활성 변화

제조예 21 및 22에서 각각 제조한 액상 추출물 50㎕에 0.0002M DDPH 용액(DPPH를 에탄올에 용해시켜 제조함) 200㎕를 첨가하고 10초간 혼합한 다음 약 20분간 반응시켰다. 이후, 분광광도계를 이용하여 반응액의 흡광도를 517㎚에서 측정하고, DPPH 라디칼 소거 활성을 다음과 같은 식으로 계산하였다.

DDPH radical scavenging activity(%) = (1-A₁/A₀)×100

* A₁ : 시료(즉, 액상 추출물) 첨가구의 흡광도

* A₀ : 시료 무첨가구의 흡광도

도 15는 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물에 대해 DPPH 어세이로 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 15에서 x축의 "UAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB1"은 제조예 6의 첫 번째 배치에 의해 제조된 발효 팥을 의미하고, "MFAB2"는 제조예 6의 두 번째 배치에 의해 제조된 발효 팥을 의미하고, "MFAB3"은 제조예 6의 세 번째 배치에 의해 제조된 발효 팥을 의미한다. 도 15에서 보이는 바와 같이 홍국균의 발효에 의해 제조된 발효 팥은 미발효 팥에 비해 DDPH 라디칼 소거 활성을 기준으로 한 항산화 활성이 약 10~15% 증가하는 것으로 나타났다.

(2) 발아 및 발효 여부에 따른 항산화 활성 변화

제조예 21 및 25에서 각각 제조한 액상 추출물 50㎕에 0.0002M DDPH 용액(DPPH를 에탄올에 용해시켜 제조함) 200㎕를 첨가하고 10초간 혼합한 다음 약 20분간 반응시켰다. 이후, 분광광도계를 이용하여 반응액의 흡광도를 517㎚에서 측정하고, DPPH 라디칼 소거 활성을 다음과 같은 식으로 계산하였다.

DDPH radical scavenging activity(%) = (1-A₁/A₀)×100

* A₁ : 시료(즉, 액상 추출물) 첨가구의 흡광도

* A₀ : 시료 무첨가구의 흡광도

도 16은 미발효 팥 추출물, 발효 팥 추출물, 미발효 발아 팥 추출물 및 발효 발아 팥 추출물에 대해 DPPH 어세이로 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 16에서 x축의 "팥"은 미발아 팥을 의미한다. 도 16에서 보이는 바와 같이 팥은 발아 및 발효 과정을 통해 DDPH 라디칼 소거 활성을 기준으로 한 항산화 활성이 약 20% 증가하는 것으로 나타났다.

(3) 발효 쌀, 발효 대두 및 발효 팥의 항산화 활성 비교

제조예 19 내지 21에서 제조한 분말 형태의 발효 쌀 추출물, 분말 형태의 발효 대두 추출물 및 분말 형태의 발효 팥 추출물을 시료로 하여 DDPH 라디칼 소거 활성 값이 50%가 되는 각 추출물의 농도, 즉 EC₅₀ 값을 결정하였다. 분말 형태의 추출물을 에탄올에 용해하여 추출물의 농도가 0.1~2.0㎎/㎖인 시료들을 제조하였다. 각각의 시료 50㎕에 0.0002M DDPH 용액(DPPH를 에탄올에 용해시켜 제조함) 200㎕를 첨가하고 10초간 혼합한 다음 약 20분간 반응시켰다. 이후, 분광광도계를 이용하여 반응액의 흡광도를 517㎚에서 측정하고, DPPH 라디칼 소거 활성을 다음과 같은 식으로 계산하였다..

DDPH radical scavenging activity(%) = (1-A₁/A₀)×100

* A₁ : 시료(즉, 액상 추출물) 첨가구의 흡광도

* A₀ : 시료 무첨가구의 흡광도

표 2는 발효 쌀, 발효 대두 및 발효 팥의 항산화 활성을 EC₅₀ 값을 통해 비교한 것이다.

구분	발효 쌀	발효 대두	발효 팥
DDPH 라디칼 소거 활성을 기준으로 한 EC50(㎎ extract/㎖)	0.59	2.7	0.48

표 2에서 나타나는 바와 같이 홍국균에 의해 발효된 팥의 DDPH 라디칼 소거 활성을 기준으로 한 항산화 활성은 홍국균에 의해 발효된 콩의 항산화 활성에 비해 약 5.6배 높은 것으로 나타났고, 홍국균에 의해 발효된 쌀의 항산화 활성에 비해서도 약 1.2배 높은 것으로 나타났다.

8-2. ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] 어세이에 의한 라디칼 소거 활성

제조예 21 및 22에서 각각 제조한 액상 추출물 20㎕에 ABTS 표준 용액 1000㎕를 첨가하고 10초간 혼합한 다음 약 20분간 반응시켰다. 이때, ABTS 표준 용액은 7mM ABTS 용액에 포타지움 설페이트(potassium persulfate)의 농도가 2.4mM이 되도록 용해시킨 다음, 암실에서 12~16시간 동안 반응시키고, 여기에 증류수를 가하여 414㎚에서의 흡광도 값이 약 1.5가 되도록 조정한 것이다. 이후, 분광광도계를 이용하여 반응액의 흡광도를 414㎚에서 측정하고, ABTS 라디칼 소거 활성을 다음과 같은 식으로 계산하였다.

ABTS radical scavenging activity(%) = (1-A₁/A₀)×100

* A₁ : 시료(즉, 액상 추출물) 첨가구의 흡광도

* A₀ : 시료 무첨가구의 흡광도

도 17은 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물에 대해 ABTS 어세이로 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 17에서 x축의 "NAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB"는 제조예 6에서 제조된 발효 팥을 의미한다. 도 17에서 보이는 바와 같이 홍국균의 발효에 의해 제조된 발효 팥은 미발효 팥에 비해 ABTS 라디칼 소거 활성을 기준으로 한 항산화 활성이 약 10% 증가하는 것으로 나타났다. 발효 팥의 ABTS 라디칼 소거 활성은 약 75% 이었고, 미 발효 팥의 ABTS 라디칼 소거 활성은 약 65% 이었다.

9. 홍국균 발효가 발효 산물의 총 페놀 화합물 함량에 미치는 영향

(1) 총 페놀 화합물 함량 측정 방법

시료 1㎖에 Folin-Ciocalteau's phenol 시약(공급자 : Sigma) 1㎖ 및 10% Na₂CO3 용액 1㎖를 차례로 첨가한 다음 실온에서 약 1시간 동안 정치한 후 700㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로 갈산(gallic acid)을 사용하여 얻은 표준 검량선과 비교하여 총 페놀 화합물 함량을 계산하였다.

(2) 발효 여부에 따른 총 페놀 화합물 함량 변화

제조예 21 및 22에서 각각 제조한 액상 추출물을 시료로 사용하여 팥 g당 총페놀 화합물 함량을 측정하였다. 도 18은 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물을 시료로 사용하여 총 페놀 화합물 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 18에서 총 페놀 화합물 함량은 발효 팥 또는 미발효 팥의 g 당 양으로 표시된다. 도 18에서 x축의 "NAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB"는 제조예 6에서 제조된 발효 팥을 의미한다. 도 18에서 보이는 바와 같이 홍국균의 발효에 의해 제조된 발효 팥은 미발효 팥에 비해 총 페놀 화합물 함량이 약 50% 증가하는 것으로 나타났다. 발효 팥의 총 페놀 화합물 함량은 911㎍/g 이었고, 미 발효 팥의 총 페놀 화합물 함량은 595㎍/g 이었다.

산화물질은 노화, 당뇨, 암 등 각종 질환과 밀접한 관계를 가지며, 페놀 화합물은 항산화 효과에 의해 이러한 질병의 예방 또는 치료에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 팥을 기질로 하여 홍국균으로 발효시키는 경우 팥에 함유된 페놀 화합물의 함량을 증가시키고, 발효 팥의 항산화 효과를 증가시키는 것으로 판단된다.

(3) 발효 쌀, 발효 대두 및 발효 팥의 총 페놀 화합물 함량 비교

제조예 19 내지 21에서 각각 제조한 액상 추출물을 시료로 하여 발효 산물 g 당 총 페놀 화합물 함량을 측정하였다. 표 3은 발효 쌀, 발효 대두 및 발효 팥의 총 페놀 화합물 함량 측정 결과를 나타낸 것이다.

구분	발효 쌀	발효 대두	발효 팥
총 페놀 화합물 함량(㎍/g)	834	672	911

표 3에서 나타나는 바와 같이 홍국균에 의해 발효된 팥의 총 페놀 화합물 함량은 홍국균에 의해 발효된 콩의 총 페놀 화합물 함량에 비해 약 1.35배 높은 것으로 나타났고, 홍국균에 의해 발효된 쌀의 총 페놀 화합물 함량에 비해서도 약 1.1배 높은 것으로 나타났다.

10. 홍국균 발효 여부가 팥의 총 플라보노이드 화합물 함량에 미치는 영향

(1) 총 플라보노이드 화합물 함량 측정 방법

시료 0.5㎖에 10% 질산알루미늄(aluminum nitrate) 용액 0.1㎖, 1M 초산칼륨(potassium acetate) 용액 0.1㎖ 및 80% 에탄올 수용액 4.3 ㎖를 차례로 첨가하고 혼합한 다음 실온에서 약 40분간 정치한 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로 퀘르세틴(quercetin)을 사용하여 얻은 표준 검량선과 비교하여 총 플라보노이드 화합물 함량을 계산하였다.

(2) 발효 여부에 따른 총 플라보노이드 화합물 함량 변화

제조예 21 및 22에서 각각 제조한 액상 추출물을 시료로 사용하여 팥 g당 총플라보노이드 화합물 함량을 측정하였다. 도 19는 발효 팥 추출물과 미발효 팥 추출물을 시료로 사용하여 총 플라보노이드 화합물 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 19에서 총 플라보노이드 화합물 함량은 발효 팥 또는 미발효 팥의 g 당 양으로 표시된다. 도 19에서 x축의 "NAB"는 미발효 팥을 의미하고, "MFAB"는 제조예 6에서 제조된 발효 팥을 의미한다. 도 19에서 보이는 바와 같이 홍국균의 발효에 의해 제조된 발효 팥은 미발효 팥에 비해 총 플라보노이드 화합물 함량이 약 40% 증가하는 것으로 나타났다. 발효 팥의 총 플라보노이드 화합물 함량은 1821㎍/g 이었고, 미 발효 팥의 총 플라보노이드 함량은 1300㎍/g 이었다.

11. 홍국균 발효 여부가 팥의 기본 성분에 미치는 영향

홍국균 발효 여부가 팥의 기본 성분에 미치는 영향을 알아보기 위해 미발효 팥과 제조예 6에서 발효 시간이 12일 경과 되었을 때 채취한 샘플을 건조 및 분쇄하여 얻은 분말 형태의 발효 팥에 함유된 조단백질, 조지방, 조섬유, 회분 및 탄수화물의 함량을 분석하였다. 미발효 팥은 2011년 대한민국에서 수확한 팥을 물에 12시간 침지한 다음 자연 건조하여 표면의 수분을 제거한 후, 분쇄기로 입도가 0.4~0.6㎝가 되도록 조분쇄하고 이를 삼각 플라스크에 넣고 밀봉한 다음 121℃에서 20분간 멸균한 후, 50℃에서 12시간 건조하고 분쇄기로 분말화한 것을 사용하였다. 도 20은 미발효 팥과 제조예 6에서 발효 시간이 12일이 경과 되었을 때 채취한 발효 팥의 조단백질, 조지방, 조섬유, 회분 및 탄수화물의 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 20에서 보이는 바와 같이 팥을 홍국균으로 발효시키는 경우 탄수화물 함량은 10% 정도 감소하고 조단백질 함량 및 조섬유 함량이 각각 6% 및 4% 증가하였다. 따라서, 홍국균에 의한 팥의 발효에 의해 팥의 부족한 단백질을 보충할 수 있고 홍국균에 의해 발효된 팥은 조섬유의 함량이 증가하므로 변비 및 비만 억제 능력이 향상될 것으로 기대된다.

12. 홍국균에 의해 발효된 팥의 콜레스테롤 저하 효과

(1) 실험동물 및 기본 식이

2012년 1월 15~17일에 출생하여 4주령이 된 평균체중 21~24g의 SPF/VAF outbred mice[학명 : Crljorli;CD1 (ICR); 공급자 : (주)오리엔트바이오, 성남시, 경기도, 대한민국)를 구입하여 1주일간 기본 식이 만을 공급하여 사육실 환경에 적응시켰다. 기본 식이는 5L79 Rat/Mouse Formula 18%(PMI Nutrition LLC, Po Box 19798 Brentwood Mo63144, USA)로 crude porotein(minimum) 18%, crude fat(minimum 5%, fiber(maximum) 5%, ash(maximum) 8%, carbohydrate 64%인 것을 사용하였다.

사육실 환경과 관련하여 사육실 온도는 22±2℃, 습도는 60±5%로 조정하였고, 명암 주기(light-dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.

(2) 실험 식이 및 사육방법

1주일간 환경에 적응시킨 실험동물을 무작위로 선택하여 한 군당 6마리씩 총 5개의 군으로 나누고, 이들에게 다음과 같은 실험 식이를 공급하였다.

* 정상 급여군 : 기본 식이 급여(표시 : NC)

* 고지방식 급여군 : 기본 식이에 라드(lard) 37.54% 함유시킨 실험 식이 급여(표시 HC)

* HC+AK 급여군 : 기본 식이에 라드 37.54% 및 팥 2% 함유시킨 실험 식이 급여(표시 : AK)

* HC+MAK 급여군 : 기본 식이에 라드 37.54% 및 홍국균에 의해 발효된 팥(제조예 6에서 발효 시간이 12일 경과 되었을 때 채취한 샘플을 건조 및 분쇄하여 얻은 분말 형태의 발효 팥) 2% 함유시킨 실험 식이 급여(표시 : MAK)

* HC+MPM 급여군 : 기본 식이에 라드 37.54% 및 홍국균 균사체 2% 함유시킨 실험 식이 급여(표시 : MPM)

실험 식이는 매일 오전 10시에 50g씩 공급한 후 남은 양을 제외한 것을 식이량으로 산정하였으며, 물은 매일 수돗물을 공급하였다. 실험 식이는 10일간 공급할 양을 한번에 제조하여 4℃에서 냉장보관하였고, 매일 신선한 식이를 공급하였다.

(3) 간 조직 내 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량

7주간 실험 식이를 공급하여 사육한 쥐에게 12시간 동안 물만을 주면서 절식시켰다. 이후 쥐를 에테르로 마취하고 복부 대동맥으로부터 채혈한 다음, 간 문맥을 통하여 차가운 생리식염수를 관류시킨 후 간을 적출하였다. 적출한 간 조직 일정량에 약 4배 가량의 0.25M 수크로스(sucrose) 용액을 가하고 마쇄하여 균질화하였다. 마쇄한 균질액을 10,000 rpm의 속도로 30분간 원심분리한 다음 Folch, et al.[Folch J,Lees M,Sloanestanley GH.1957.A simple method for the isolation and purification oftotallipids from animaltissue.J BiolChem 226:497-509.]의 방법으로 지질 측정용 시료를 준비하였다. 이후, 콜레스테를 측정용 키트(모델명 : AM 157S-K, AM 202-K; 공급자 : Asanpharm Co., Korea)을 사용하여 총 지질, 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량을 간 조직 g 당 양으로 정량하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

구분	NC	HF	AK	MAK	MPM
총 지질(total lipid, ㎎/g)	65.7±3.2	96.7±9.2	87.6±5.6	72.6±6.6	74.8±5.8
중성지방(triglyceride, ㎎/g)	33.5±1.8	47.8±2.9	45.4±3.9	35.8±0.9	36.9±2.6
총 콜레스테롤(total cholesterol, ㎎/g)	11.3±0.9	33.8±7.6	30.4±1.7	14.9±1.3	15.7±1.7

표 4에서 나타나는 바와 같이 고 지방식 급여군의 경우 정상 급여군보다 간 조직 내 총 지질 함량 및 총 콜레스테롤 함량이 크게 증가하였다. 반면, 홍국균의 의해 발효된 팥을 식이한 실험군은 고 지방식 급여군 및 미발효 팥을 급여한 군에 비해 간 조직 내 총 지질 함량 및 총 콜레스테롤 함량이 현저하게 감소하였으며, 홍국균 균사체를 급여한 군보다 약간 높은 수준을 보였다.

13. 홍국균에 의해 발효된 팥의 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제조

<13-1> 산제의 제조

제조예 21의 발효 팥 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<13-2> 정제의 제조

제조예 21의 발효 팥 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<13-3> 캡슐제의 제조

제조예 21의 발효 팥 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<13-4> 환의 제조

제조예 21의 발효 팥 추출물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<13-5> 과립의 제조

제조예 21의 발효 팥 추출물 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<13-6> 주사제의 제조

제조예 21의 발효 팥 추출물 100 ㎎

소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎

메틸파라벤 0.8 ㎎

프로필파라벤 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수 적량

상기의 성분을 혼합한 후, 이중 2㎖를 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

14. 홍국균에 의해 발효된 팥의 추출물을 포함하는 식품 조성물의 제조

<14-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.

<14-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<14-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<14-4> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<14-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 제조예 21의 발효 팥 추출물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

제조예 1의 발효 팥 추출물(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

<14-6> 건강음료의 제조

액상과당(0.5g), 올리고당(2g), 설탕(2g), 식염(0.5g), 물(75g)과 같은 부재료와 본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.

<14-7> 야채 주스의 제조

본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.

<14-8> 과일 주스의 제조

본 발명의 제조예 21의 발효 팥 추출물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.

15. 홍국균에 의해 발효된 팥의 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조

<15-1> 유연 화장수의 제조

유연화장수를 통상의 방법에 따라 다음 표 1과 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 PEG 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2NA 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 옥틱도데세스-16 폴리솔베이트 20 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.1 미량 잔량
합계	100

<15-2> 수렴화장수의 제조

수렴화장수를 통상의 방법에 따라 다음 표 2와 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2NA 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 폴리솔베이트 20 위치하젤 추출물 구연산 방부제, 향, 색소 증류수	1.5 2.0 2.0 0.2 0.2 0.02 0.04 3.0 15.0 0.3 2.0 미량 미량 잔량
합계	100

<15-3> 영양화장수의 제조

영양화장수를 통상의 방법에 따라 다음 표 3과 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 스테아릴 알코올 라놀린 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 광물유 스쿠알란 트리옥타노인 디메치콘 초산토코페롤 카르복시비닐폴리머 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 소듐히아루로네이트 트리 에탄올아민 방부제, 향, 색소 증류수	1.5 1.5 1.5 1.3 0.5 1.0 5.0 3.0 2.0 0.8 0.5 0.12 5.0 3.0 5.0 0.12 미량 잔량
합계	100

<15-4> 영양크림의 제조

영양크림을 통상의 방법에 따라 다음 표 4와 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 친유형 모노스테아린산글리세린 세테아릴알코올 스테아린산 밀납 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 스쿠알란 광물유 트리옥타노인 디메치콘 소듐마그네슘실리케이트 글리세린 베타인 트리에타올아민 소듐히아루로네이트 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량
합계	100

<15-5> 마사지크림의 제조

마사지 크림을 통상의 방법에 따라 다음 표 5와 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 친유형 모노스케아린산 글리세린 스테아릴알코올 스테아린산 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 이소스테아릴이소스테레이트 스쿠알란 광물유 디메치콘 히드록시에칠셀룰로오스 글리세린 트리에타올아민 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 1.5 1.5 1.0 1.5 0.6 5.0 5.0 35.0 0.5 0.12 6.0 0.7 미량 잔량
합계	100

<15-6> 에센스의 제조

에센스를 통상의 방법에 따라 다음 표 6과 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	5.0 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100

<15-7> 팩의 제조

팩을 통상의 방법에 따라 다음 표 7과 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 21의 발효 팥 추출물 폴리비닐알코올 셀룰로오스 검 글리세린 피이지1500 사이크로데스트린 DL - 판테놀 알란토인 글리시리진산모노암모늄 니코틴아미드 에탄올 피이지 40 경화피마자유 향, 색소, 방부제 증류수	3.0 15.0 0.15 3.0 2.0 0.15 0.4 0.1 0.3 0.5 6.0 0.3 미량 잔량
합계	100

16. 홍국균에 의해 발효된 팥의 추출물을 포함하는 사료 첨가제의 제조

<16-1> 사료 첨가제 1

제조예 21의 발효 팥 추출물 0.1 ~ 20 중량부, 지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01 중량부, 제 3 인산칼슘 1 ~ 20 중량부, 비타민 E 0.01 ~ 0.1 중량부, 효소 분말 1 ~ 10 중량부, 유산균 0.1 ~ 10 중량부, 바실러스(Bacillus) 배양액 0.01 ~ 10% 중량부 및 포도당 20 ~ 90 중량부를 배합하여 사료 첨가제를 제조하였다.

<16-2> 사료 첨가제 2

제조예 21의 발효 팥 추출물 24 중량부, 어성초 추출 분말 24 중량부, 유산균 1 중량부, 효모 10 중량부, 초유 1 중량부, 포도당 20 중량부 및 알팔파 가루 20 중량부를 배합하여 사료 첨가제를 제조하였다.

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (24)

1. 발효 팥으로부터 추출된 추출물로서,
   상기 발효 팥은 홍국균을 포함하는 고체 종균으로 팥을 발효시켜 얻은 산물이고 발효에 의해 발효 전보다 향상된 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성을 나타내며,
   상기 고체 종균은 고체 배지인 밀 기울 또는 쌀겨에 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 홍국균 또는 이를 포함하는 종균용 배양액을 접종하고 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 상기 고체 배지로 사용되는 밀 기울 또는 쌀겨는 수분 함량이 45~60%인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)는 기탁번호가 IFO 4480 또는 KCCM 60396인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 팥은 발아 팥인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물.
   
5. 고체 배지인 밀 기울 또는 쌀겨에 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 홍국균 또는 이를 포함하는 종균용 배양액을 접종하고 배양하여 고체 종균을 수득하는 단계;
   팥에 상기 고체 종균을 접종하고 배양하여 팥을 고상 발효시키는 단계; 및
   상기 발효된 팥으로부터 추출물을 추출하는 단계를 포함하고,
   상기 발효된 팥은 발효 전보다 향상된 항산화 활성 및 콜레스테롤 저하 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
   
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 5항에 있어서, 상기 고체 배지로 사용되는 밀 기울 또는 쌀겨는 수분 함량이 45~60%인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
   
9. 제 5항에 있어서, 상기 고체 배지에 대한 종균용 배양액의 접종량은 고체 배지 중량 대비 15~30%인 것을 특징으로 발효 팥 추출물의 제조방법.
   
10. 제 9항에 있어서, 종균용 배양액은 홍국균을 PDB 배지, Mizutani 배지 또는 S-INAE 배지에서 선택된 액상 배지에 접종하고 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
11. 삭제
12. 제 5항에 있어서, 상기 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)는 기탁번호가 IFO 4480 또는 KCCM 60396인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
13. 제 5항에 있어서, 상기 팥은 가압 및 가열에 의해 멸균된 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
14. 제 5항에 있어서, 상기 팥은 입도가 0.4~0.6㎝인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
15. 제 5항에 있어서, 상기 팥은 발아 팥인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
16. 제 15항에 있어서, 상기 발아 팥의 발아 길이는 1~5㎜인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
17. 제 5항에 있어서, 상기 고체 종균의 접종량은 팥 중량 대비 1.5~30%인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
18. 제 5항에 있어서, 상기 고체 종균의 배양 온도는 25~30℃이고, 배양 시간은 10~15일인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
19. 제 5항에 있어서, 상기 추출물은 추출 용매에 의해 추출되는 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
20. 제 19항에 있어서, 상기 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 발효 팥 추출물의 제조방법.
    
21. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 발효 팥 추출물 또는 제 5항, 제 8항 내지 제 10항 및 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 발효 팥 추출물을 포함하는 항산화용 조성물.
    
22. 제 21항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 첨가제에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
    
23. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 발효 팥 추출물 또는 제 5항, 제 8항 내지 제 10항 및 제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 발효 팥 추출물을 포함하는 중성지방 또는 콜레스테롤 저하용 조성물.
    
24. 제 23항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물 또는 사료 첨가제에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 중성지방 또는 콜레스테롤 저하용 조성물.

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