KR20180118508A - 중추 신경계로의 아데노-연관 치료적 전달 - Google Patents

Abstract

중추 신경계의 질환과 연관된 유전자 산물을 코딩하는 rAAV를, 예를 들어, 상호-보정을 제공하는데 효과적인 양으로, 예를 들어, 상기 유전자 산물이 부재하거나 또는 상기 질환이 없는 포유동물에 비해 감소된 수준으로 존재하는 포유동물에게 비강내로, 척수강내로, 뇌혈관내로 또는 정맥내로 투여함으로써 상기 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

중추 신경계로의 아데노-연관 치료적 전달

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2015년 5월 15일에 출원된 미국 출원 일련 번호 62/162,174, 2015년 11월 6일에 출원된 일련 번호 62/252,055, 2016년 3월 1일에 출원된 일련 번호 62/301,980, 및 2016년 5월 3일에 출원된 일련 번호 62/331,156의 출원일의 이익을 주장하며, 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

정부 권리의 진술

본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 HD032652 및 DK094538 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

뮤코폴리사카라이드증 (MPS)은 글리코사미노글리칸 (GAG) 이화작용의 파괴에 의해 유발되어 리소솜 내 그의 축적으로 이어지는 11종의 축적 질환의 군이다 (Muenzer, 2004; Munoz-Rojas et al., 2008). 다양한 중증도의 징후는 기관비대, 골격 이형성증, 심장 및 폐 폐쇄 및 신경계 악화를 포함한다. 이두로니다제 (IDUA)의 결핍인 MPS I의 경우에, 중증도는 경도 (샤이에 증후군) 내지 중등도 (후를러-샤이에) 내지 중증 (후를러 증후군)의 범위이며, 후자는 15세까지 신경계 결핍 및 사망을 유발한다 (Muenzer, 2004; Munoz-Rojas et al., 2008). MPS에 대한 요법은 가장 부분 완화적인 것을 위해서였다. 그러나, 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)이 효능을 나타낸 후를러 증후군을 비롯한 MPS 질환의 일부가 존재한다 (Krivit, 2004; Orchard et al., 2007; Peters et al., 2003). 추가로, 점점 더 많은 MPS 질환에서, 효소 대체 요법 (ERT)이 이용가능해지고 있다 (Brady, 2006). 일반적으로, HSCT 및 ERT는 일부 문제가 치료 후에 지속되기는 하지만 (골격, 심장, 각막 혼탁), 축적 물질의 소거 및 개선된 말초 상태를 유발한다. 이들 세포 및 효소 요법의 주요 과제는 주변에 투여된 효소가 혈액-뇌 장벽을 침투하지 않으면서 신경계 징후를 해결하는데 유효성이 있어야 한다는 것이며, HSCT는 모두가 아닌 일부 MPS에 대해 이익을 갖는 것으로 밝혀졌다.

MPS I은 세포 및 분자 요법의 개발을 위해 MPS 질환에 대해 가장 광범위하게 연구된 것 중 하나였다. 동종 HSCT의 유효성은 대사 상호-보정을 가져올 가능성이 가장 크며, 이에 의해 결여 효소가 공여자-유래 세포로부터 방출되고, 후속적으로 숙주 세포에 의해 흡수되어 리소솜으로 트래픽킹되며, 여기서 효소는 리소솜 대사에 기여한다 (Fratantoni et al., 1968). GAG 축적 물질의 소거가 후속적으로 말초 기관, 예컨대 간 및 비장에서 관찰되고, 심폐 폐쇄가 경감되며 각막 혼탁이 개선된다 (Orchard et al., 2007). MPS 질환에서의 신경계 징후 출현에 대한 동종 줄기 세포 이식의 효과가 특히 중요하다. 이와 관련하여, 여러 MPS 질환의 경우에 동종 줄기 세포가 생착된 개체는 미이식 환자와 비교하여 개선된 결과에 마주한다는 증거가 존재한다 (Bjoraker et al., 2006; Krivit, 2004; Orchard et al., 2007; Peters et al., 2003). 동종 조혈 줄기 세포 이식의 신경학적 이익을 설명하는 중심 가설은 중추 신경계 내로의 공여자-유래 조혈 세포 (소교세포가 가장 가능성이 있음)의 침투이며 (Hess et al., 2004; Unger et al., 1993), 여기서 결여 효소가 생착 세포에 의해 발현되고 그 지점으로부터 효소가 CNS 조직 내로 확산되어 축적 물질의 소거에 참여한다. 따라서 CNS 조직에 제공된 효소의 수준은 뇌에 생착하는 공여자-유래 세포로부터 발현 및 방출된 그러한 양으로 제한된다. 이러한 생착은 MPS I에 대해 큰 이익을 갖지만, 그럼에도 불구하고 수용자는 정상 IQ 미만 및 신경인지 능력 장애를 계속해서 나타낸다 (Ziegler and Shapiro, 2007).

대사 교차 보정의 현상은 또한 여러 리소솜 축적 질환 (Brady, 2006), 가장 두드러지게는 MPS I에 대한 ERT의 유효성을 설명한다. 그러나, 특정한 리소솜 축적 질환 (LSD)에서 결여된 효소가 CNS에 효과적으로 도달하기 위해 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 침투하여야 한다는 요구로 인해, 리소솜 축적 질환 (LSD)의 신경계 징후에 대한 효소 요법의 유효성은 관찰되지 않았다 (Brady, 2006). 효소는 BBB를 효과적으로 횡단하기에는 거의 항상 너무 크고 일반적으로 너무 하전되어 있다. 이것은 침습적 척수강내 효소 투여에 대한 조사를 촉진하였으며 (Dickson et al., 2007), 그에 대한 유효성은 MPS I의 개 모델에서 입증되었고 (Kakkis et al., 2004) 그에 대한 인간 임상 시험은 MPS I에 대해 시작되고 있다 (Pastores, 2008; Munoz-Rojas et al., 2008). 효소 요법의 핵심 단점은 고비용 (연간 > $200,000) 및 재조합 단백질의 반복된 주입에 대한 요구를 포함한다. 척수강내 IDUA 투여의 현행 임상 시험은 효소를 3개월마다 단지 1회 주사하도록 설계되며, 이러한 투여 요법의 유효성은 불확실한 채로 남아 있다.

본 발명의 방법에 사용된 AAV 벡터는 CNS로 유전자를 전달하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 신경인지 기능장애 또는 신경계 질환을 예방, 억제 또는 치료하기 위해 AAV를 통한 CNS로의 치료 단백질의 비강내 전달을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 벡터의 비강내 전달은 전뇌 (후구)의 형질도입 및 치료 단백질의 발현을 유발하였다. 단백질은 뇌의 모든 구역으로 확산하였다. 따라서, 예를 들어, 분비 단백질을 발현하는 비강내 전달 AAV 벡터의 사용은 많은 상이한 신경계 장애, 예를 들어, MPS I, MPS II, MPS III, 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 다른 대사 질환 등의 치료를 가능하게 한다. 예를 들어, 뇌의 모든 미세절제된 부분으로부터의 추출물의 검정은 rAAV에 의해 전달된 알파-L-이두로니다제의 뇌 전반에 걸친 광범위한 분포를 나타낸다.

한 실시양태에서, rAAV는 신경인지 기능장애 또는 신경계 질환을 예방, 억제 또는 치료하기 위해 포유동물에게 척수강내로 (IT), 혈관내로 (IV), 뇌실내로 (ICV) 또는 비강내로 (IN) 전달된다. 한 실시양태에서, 비강내 투여는 CNS로의 비-침습적 직접 투여를 대사 상호-보정과 함께 유발한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역억제에 적용된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 관용에 적용된다.

한 실시양태에서, 특정한 유전자로 예방, 억제 또는 치료될 질환은 MPS I (IDUA), MPS II (IDS), MPS IIIA (헤파란-N-술파타제;술파미니다제), MPS IIIB (알파-N-아세틸-글루코사미니다제), MPS IIIC (아세틸-CoA:알파-N-아세틸-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제), MPS IIID (N-아세틸글루코사민 6-술파타제), MPS VII (베타-글루쿠로니다제), 고셔 (산 베타-글루코시다제), 알파-만노시드축적증 (알파-만노시다제), 베타-만노시드축적증 (베타-만노시다제), 알파-푸코시드축적증 (알파-푸코시다제), 시알리다제결핍증 (알파-시알리다제), 갈락토시알산증 (카텝신 A), 아스파르틸글루코사민뇨 (아스파르틸글루코사미니다제), GM1-강글리오시드증 (베타-갈락토시다제), 테이-삭스병 (베타-헥소사미니다제 서브유닛 알파), 샌드호프병 (베타-헥소사미니다제 서브유닛 베타), GM2-강글리오시드증/변이형 AB (GM2 활성화제 단백질), 크라베병 (갈락토세레브로시다제), 이염성 백질이영양증 (아릴술파타제 A), 및 알츠하이머병 (항체, 예컨대 베타-아밀로이드에 대한 항체, 또는 알츠하이머와 연관된 플라크 및 원섬유를 공격하는 효소의 발현), 또는 알츠하이머병 및 파킨슨병 (GDNF 또는 뉴르투린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경보호 단백질의 발현)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 신경계 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

따라서, 예를 들어 중추 신경계 (CNS)의 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 억제, 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물에서 상기 하나 이상의 증상을 예방, 억제, 및/또는 치료하는 방법이 기재된다. 방법은 유전자 산물, 예를 들어 치료 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 포유동물의 CNS로 전달하는 것을 포함한다. rAAV 벡터에 의해 코딩될 수 있는 표적 유전자 산물은 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-술파타제, 헤파란 술페이트 술파타제, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, 베타-헥소사미니다제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제 또는 글루코세레브로시다제, 뿐만 아니라 상기 본원에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 방법을 사용하여 예방, 억제 또는 치료될 수 있는 질환은 제I형 뮤코폴리사카라이드증 장애, 제II형 뮤코폴리사카라이드증 장애 또는 제VII형 뮤코폴리사카라이드증 장애, 뿐만 아니라 상기 열거된 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. AAV 벡터는 그것이 CNS/뇌로 전달되고 트랜스진이 대상체의 CNS/뇌에 성공적으로 형질도입되는 것을 보장하도록 다양한 방식으로 투여될 수 있다. CNS/뇌로의 전달 경로는 척수강내 투여, 두개내 투여, 예를 들어, 뇌실내 투여, 또는 측뇌실 투여, 비강내 투여, 혈관내 투여, 및 실질내 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 방법은 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 혈청형 9 (rAAV9) 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 성체 포유동물의 CNS로 전달하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 IDUA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV9 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 성체 포유동물의 CNS로 전달하는 것을 포함한다. 이들 방법은 부분적으로는 AAV9 벡터가 성체 대상체의 뇌/CNS에 치료 트랜스진을 효율적으로 형질도입하여 효소 수준을 야생형 수준으로 회복시킬 수 있다는 발견에 기초한다 (하기 도 15 참조). AAV9를 사용하여 달성한 결과는, 성체 마우스에서의 AAV9의 혈관내 전달이 광범위한 직접 뉴런 표적화를 달성하지 못한다는 것을 입증한 이전 작업 (문헌 [Foust et al., 2009] 참조), 뿐만 아니라 성체 IDUA-결핍 마우스의 CNS 내로의 AAV8-IDUA의 직접 주사가 불량한 트랜스진 발현을 유발하였다는 것을 제시한 추가의 데이터 (도 18)에 비추어 놀라운 것이다. 본원에 기재된 실시예는 리소솜 효소 알파-L-이두로니다제 (IDUA)의 결핍에 의해 유발된 유전성 대사 장애인 MPS1의 치료를 위한 전임상 모델을 사용한다. 실시예는 면역적격 성체 IDUA-결핍 마우스의 CNS 내로의 AAV9-IDUA의 직접 적용이 야생형 성체 마우스에서의 IDUA 효소 발현 및 활성과 동일하거나 그보다 더 높은 IDUA 효소 발현 및 활성을 유발하였다는 것을 입증한다 (하기 도 15 참조).

본 발명의 추가 실시양태에서, 실시예는 또한 면역억제 또는 면역관용을 유도하기 위한 병용 요법 또는 면역결핍 동물의 치료가 훨씬 더 높은 수준의 IDUA 효소 발현 및 활성을 달성할 수 있다는 것을 입증한다. 한 실시양태에서, 효소 활성을 중화하는 면역 반응을 촉진하는 유전자형을 갖는 환자 (예를 들어, 문헌 [Barbier et al., 2013] 참조)는 유전자 산물, 예컨대 IDUA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터에 추가하여 면역억제제로 치료된다.

신생 IDUA^-/- 마우스는 면역학적 나이브이다. 신생 IDUA^-/- 마우스에게의 AAV8-IDUA의 투여는 IDUA 발현을 유발하였고 (Wolf et al., 2011), 이에 따라 동물을 IDUA에 대해 관용시켰다. 본원에 기재된, 중추 신경계로의 AAV의 직접 주입에 의한 성체 (면역적격) 마우스로의 AAV-매개 유전자 전달의 적용가능성은 상이한 투여 경로를 사용하여 제시되었다. 예를 들어, AAV9-IDUA를, 면역적격이거나, 면역결핍이거나 (NODSCID/IDUA-/-), 시클로포스파미드 (CP)로 면역억제되거나, 또는 출생 시에 시작하여 인간 이두로니다제 단백질 (알두라자임)의 매주 주사에 의해 면역관용된 성체 IDUA-결핍 마우스의 측뇌실 내로의 직접 주사에 의해 투여하였다. CP 면역억제된 동물에게 또한 AAV9-IDUA를 비강내 주입에 의해, 척수강내 주사에 의해, 및 혈액-뇌 장벽을 파괴하는 만니톨과 함께 또는 그 없이 혈관 내 주입에 의해 투여하였다. 동물을 벡터 투여 후 8주에 희생시키고, 정상 및 이환된 대조군 마우스와 비교하여 IDUA 효소적 활성, 조직 글리코사미노글리칸 및 IDUA 벡터 서열을 평가하기 위해 뇌를 수거하고 미세절제하였다. 이들 연구로부터의 결과는 CNS에 직접 AAV 벡터를 투여하기 위한 위한 다수의 경로가 사용되어, 예를 들어 CNS에서 보다 높은 수준의 단백질 전달 및/또는 효소 활성을 달성하게 할 수 있다는 것을 제시한다. 추가로, 비록 뇌가 면역특권 부위이지만, 면역억제제의 투여 또는 면역관용은 AAV 투여 후에 뇌에서 발견된 활성을 증가시킬 수 있다. 투여당 보다 높은 수준의 발현 및/또는 보다 덜 침습적인 투여 경로가 임상적으로 환자에게 더 잘 맞는다.

따라서, 본 발명은 포유동물의 CNS에서 발현되는 경우에 치료 효과를 갖는 유전자 산물을 코딩하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 CNS의 질환 또는 장애 (신경계 질환)를 갖는 면역적격 포유동물이다. 본원에 사용된 "면역적격" 포유동물"은, 예를 들어 임신 동안 또는 수유를 통한 선천성 면역 및 모체로부터 유래된 면역을 갖는 신생아와 대조적으로, 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다가 항원 자극에의 노출 후에 Th1 기능의 상향조절에 의해 또는 폴리클로날 자극에 반응한 IFN-γ 생산에 의해 도출되는 연령의 포유동물이다. 면역결핍 질환을 가지고 있지 않은 성체 포유동물이 면역적격 포유동물의 예이다. 예를 들어, 면역적격 인간은 전형적으로 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월령이며, 면역결핍 질환이 없는 성체 인간을 포함한다. 한 실시양태에서, AAV는 척수강내로 투여된다. 한 실시양태에서, AAV는 두개내로 (예를 들어, 뇌실내로) 투여된다. 한 실시양태에서, AAV는 투과 증진제와 함께 또는 그 없이 비강내로 투여된다. 한 실시양태에서, AAV는 투과 증진제와 함께 또는 그 없이 혈관내로, 예를 들어 경동맥 투여에 의해 투여된다. 한 실시양태에서, AAV가 투여되는 포유동물은 면역결핍이거나, 면역관용 또는 면역 억제에 적용되어, 예를 들어 AAV가 투여되지만 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않은 상응하는 포유동물에 비해 더 높은 수준의 치료 단백질 발현을 유도한다. 한 실시양태에서, 면역 억제제가 투여되어 면역 억제를 유도한다. 한 실시양태에서, AAV가 투여되는 포유동물은 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않는다 (예를 들어, AAV 단독의 투여가 치료 효과를 제공한다).

한 실시양태에서, 본 발명은 신경인지 기능장애를 포함할 수 있는 신경계 질환을 갖는 포유동물의 중추 신경계에서의 분비 단백질을 증대시키는 방법을 제공한다. 방법은 포유동물에게 포유동물에서의 발현이 질환 또는 기능장애를 갖지만 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 투여되지 않은 포유동물에 비해 뇌 전반에 걸쳐 신경병리상태를 감소시키고/거나 신경인지를 증진시키는 분비 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 비강내로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 단백질은 신경보호 단백질, 예를 들어, GDNF 또는 뉴르투린을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 단백질은 항체, 예를 들어, 베타-아밀로이드에 결합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질은 알츠하이머병과 연관된 플라크 또는 원섬유를 절단하는 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역억제제로 치료되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 치료 단백질의 활성을 중화시키는 면역 반응을 생성할 수 있는 대상체에서, 포유동물은 면역억제제, 예를 들어, 글루코코르티코이드, 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제를 포함하는 세포증식억제제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대해 활성인 작용제, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라시클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α (종양 괴사 인자-알파) 결합제로 치료된다. 한 실시양태에서, rAAV 및 면역 억제제는 공-투여되거나 또는 면역 억제제는 rAAV 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 척수강내로 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 뇌실내로 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 rAAV1, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAA rh10, 또는 rAAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, 조성물의 투여 전에 포유동물은 면역관용된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에서의 신경인지 기능장애를 포함할 수 있는 신경계 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 포유동물에게 포유동물에서의 발현이 신경병리상태 및/또는 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 비강내로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 단백질은 신경보호 단백질, 예를 들어, GDNF 또는 뉴르투린을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 단백질은 항체, 예를 들어, 베타-아밀로이드에 결합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질은 알츠하이머병과 연관된 플라크 또는 원섬유를 절단하는 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역억제제로 치료되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 치료 단백질의 활성을 중화시키는 면역 반응을 생성할 수 있는 대상체에서, 포유동물은 면역억제제, 예를 들어, 글루코코르티코이드, 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제를 포함하는 세포증식억제제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대해 활성인 작용제, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라시클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α (종양 괴사 인자-알파) 결합제로 치료된다. 한 실시양태에서, rAAV 및 면역 억제제는 공-투여되거나 또는 면역 억제제는 rAAV 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 척수강내로 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 뇌실내로 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 rAAV1, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAVrh10, 또는 rAAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, 조성물의 투여 전에 포유동물은 면역관용된다. 한 실시양태에서, 포유동물은 알츠하이머병 또는 파킨슨병을 갖는다.

한 실시양태에서, 본 발명은 신경인지 기능장애를 포함할 수 있는 신경계 질환을 갖는 포유동물에서 중추 신경계에서의 분비 단백질의 상호-보정을 제공하는 방법을 제공한다. 방법은 포유동물에게 포유동물에서의 발현이 상호-보정을 제공하는 분비 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 유효량을 포함하는 조성물의 유효량을 비강내로, 척수강내로, 뇌혈관내로 또는 정맥내로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 단백질은 신경보호 단백질, 예를 들어, GDNF 또는 뉴르투린을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 단백질은 항체, 예를 들어, 베타-아밀로이드에 결합하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질은 알츠하이머병과 연관된 플라크 또는 원섬유를 절단하는 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역억제제로 치료되지 않는다. 한 실시양태에서, 예를 들어, 치료 단백질의 활성을 중화시키는 면역 반응을 생성할 수 있는 대상체에서, 포유동물은 면역억제제, 예를 들어, 글루코코르티코이드, 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제를 포함하는 세포증식억제제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대해 활성인 작용제, 예컨대 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라시클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α (종양 괴사 인자-알파) 결합제로 치료된다. 한 실시양태에서, rAAV 및 면역 억제제는 공-투여되거나 또는 면역 억제제는 rAAV 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 척수강내로 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 뇌실내로 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 rAAV1, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAVrh10, 또는 rAAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, 조성물의 투여 전에 포유동물은 면역관용된다.

본 발명은 중추 신경계의 질환 또는 장애와 연관된 신경인지 기능장애의 예방, 억제 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에서 상기 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 척수강내로, 예를 들어 요추 영역으로, 또는 뇌실내로, 예를 들어 측뇌실로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역적격 성체이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, 또는 AAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주, 매월 또는 2개월 이상의 간격으로 투여된다.

한 실시양태에서, 방법은 상기 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 척수강내로, 예를 들어 요추 영역으로 투여하고, 임의로 투과 증진제를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 투과 증진제는 조성물 전에 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 투과 증진제를 포함한다. 한 실시양태에서, 투과 증진제는 조성물 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역적격 성체이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 AAV-1, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV rh10 또는 AAV-9 벡터이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주, 매월 또는 2개월 이상의 간격으로 투여된다. 한 실시양태에서, AAV가 척수강내로 투여되는 포유동물은 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않는다 (예를 들어, AAV 단독의 투여가 치료 효과를 제공한다). 한 실시양태에서, AAV가 척수강내로 투여되는 포유동물은 면역결핍이거나, 면역관용 또는 면역 억제에 적용되어, 예를 들어 AAV가 척수강내로 투여되지만 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않은 상응하는 포유동물에 비해 더 높은 수준의 치료 단백질 발현을 유도한다.

한 실시양태에서, 방법은 면역적격 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 뇌실내로, 예를 들어 측뇌실로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, 또는 AAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 rAAV5 벡터가 아니다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주, 매월 또는 2개월 이상의 간격으로 투여된다. 한 실시양태에서, AAV가 뇌실내로 투여되는 포유동물은 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않는다 (예를 들어, AAV 단독의 투여가 치료 효과를 제공한다). 한 실시양태에서, AAV가 뇌실내로 투여되는 포유동물은 면역결핍이거나, 면역관용 또는 면역 억제에 적용되어, 예를 들어 AAV가 뇌실내로 투여되지만 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않은 상응하는 포유동물에 비해 더 높은 수준의 치료 단백질 발현을 유도한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 AAV를 포함하는 조성물이 투여되기 전에 유전자 산물에 대해 면역관용된다.

중추 신경계의 질환 또는 장애와 연관된 신경인지 기능장애의 예방, 억제 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에서 상기 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 방법은 상기 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량 및 투과 증진제의 유효량을 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 혈관내로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 투과 증진제를 포함한다. 한 실시양태에서, 투과 증진제는 만니톨, 글리코콜산나트륨, 타우로콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 살리실산나트륨, 카프릴산나트륨, 카프르산나트륨, 소듐 라우릴 술페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우렐 에테르 또는 EDTA를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역적격 성체이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, 또는 AAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 rAAV5 벡터가 아니다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주, 매월 또는 2개월 이상의 간격으로 투여된다. 한 실시양태에서, AAV가 혈관내로 투여되는 포유동물은 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않는다 (예를 들어, AAV의 투여가 치료 효과를 제공한다). 한 실시양태에서, AAV가 혈관내로 투여되는 포유동물은 면역결핍이거나, 면역관용 또는 면역 억제에 적용되어, 예를 들어 AAV가 혈관내로 투여되지만 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않은 상응하는 포유동물에 비해 더 높은 수준의 치료 단백질 발현을 유도한다.

한 실시양태에서, 방법은 상기 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV9 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 비강내로 투여하고, 임의로 투과 증진제를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 비강내 전달은 미국 특허 번호 8,609,088 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 투과 증진제는 조성물 전에 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 투과 증진제를 포함한다. 한 실시양태에서, 투과 증진제는 조성물 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 면역적격 성체이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주, 매월 또는 2개월 이상의 간격으로 투여된다. 한 실시양태에서, AAV가 비강내로 투여되는 포유동물은 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않는다. 한 실시양태에서, AAV가 비강내로 투여되는 포유동물은 면역관용 또는 면역 억제에 적용되어, 예를 들어 AAV가 비강내로 투여되지만 면역관용 또는 면역 억제에 적용되지 않은 상응하는 포유동물에 비해 더 높은 수준의 IDUA 단백질 발현을 유도한다.

중추 신경계의 질환과 연관된 신경인지 기능장애의 예방, 억제 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에서 상기 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다. 방법은 상기 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량 및 면역 억제제를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 시클로포스파미드를 포함한다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 글루코코르티코이드, 알킬화제 또는 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린 또는 세포독성 항생제를 포함하는 세포증식억제제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대해 활성인 작용제를 포함한다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라시클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL2-수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α (종양 괴사 인자-알파) 결합제, 예컨대 인플릭시맙 (레미케이드(Remicade)), 에타네르셉트 (엔브렐(Enbrel)) 또는 아달리무맙 (휴미라(Humira))를 포함한다. 한 실시양태에서, rAAV 및 면역 억제제는 공-투여된다. 한 실시양태에서, rAAV는 면역 억제제 전에 및 임의로 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 면역 억제제는 rAAV 전에 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV 및 면역 억제제는 척수강내로 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV 및 면역 억제제는 뇌실내로 투여된다. 한 실시양태에서, rAAV는 척수강내로 투여되고, 면역 억제제는 정맥내로 투여된다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 성체이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, 또는 AAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주, 매월 또는 2개월 이상의 간격으로 투여된다.

본 발명은 또한 중추 신경계의 질환과 연관된 신경인지 기능장애의 예방, 억제 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에서 상기 신경인지 기능장애를 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다. 질환과 연관된 유전자 산물에 대해 면역관용된 포유동물에게, 상기 포유동물의 중추 신경계에서의 발현이 상기 하나 이상의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는 유전자 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 투여한다. 한 실시양태에서, 유전자 산물은 리소솜 축적 효소이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 성체이다. 한 실시양태에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10, 또는 AAV9 벡터이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 한 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 매주 투여된다.

rAAV 벡터에 의해 코딩될 수 있는 유전자 산물은 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-술파타제, 헤파란 술페이트 술파타제, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, 베타-헥소사미니다제, 알파-갈락토시다제, 베타갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 글루코세레브로시다제, 섬유모세포 성장 인자-2 (FGF-2), 뇌 유래 성장 인자 (BDGF), 뉴르투린, 신경교 유래 성장 인자 (GDGF), 티로신 히드록실라제, 도파민 데카르복실라제 또는 글루탐산 데카르복실라제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 개시된 방법을 사용하여 예방, 억제 또는 치료될 수 있는 신경계 증상 또는 신경인지 기능장애를 나타낼 수 있는 질환은 부신백질이영양증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 안젤만 증후근, 모세혈관확장성 운동실조, 샤르코-마리-투스 증후군, 코케인 증후군, 난청, 뒤시엔느 근육 이영양증, 간질, 본태성 진전, 유약 X 증후군, 프리드라이히 운동실조, 고셔병, 헌팅톤병, 레쉬-니한 증후군, 메이플 시럽뇨 질환, 멘케스 증후군, 근긴장성 이영양증, 기면증, 신경섬유종증, 니만-픽병, 파킨슨병, 페닐케톤뇨, 프라더-윌리 증후군, 레프숨병, 레트 증후군, 척수성 근육 위축, 척수소뇌성 운동실조, 탄지에르병, 테이-삭스병, 결절성 경화증, 폰 히펠-린다우 증후군, 윌리암스 증후군, 윌슨병 또는 젤베거 증후군을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 질환은 리소솜 축적 질환, 예를 들어 리소솜 축적 효소의 결여 또는 결핍이다. 리소솜 축적 질환은 뮤코폴리사카라이드증 (MPS) 질환, 예를 들어 제I형 뮤코폴리사카라이드증, 예를 들어 후를러 증후군 및 변이형 샤이에 증후군 및 후를러-샤이에 증후군 (알파-L-이두로니다제의 결핍); 헌터 증후군 (이두로네이트-2-술파타제의 결핍); 제III형 뮤코폴리사카라이드증, 예를 들어 산필리포 증후군 (A, B, C 또는 D; 헤파란 술페이트 술파타제, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, 아세틸 CoA:알파-글루코사미니드 N-아세틸 트랜스퍼라제 또는 N-아세틸글루코사민-6-술페이트 술파타제의 결핍); 제IV형 뮤코폴리사카라이드증, 예를 들어 모르키오 증후군 (갈락토사민-6-술페이트 술파타제 또는 베타-갈락토시다제의 결핍); 제VI형 뮤코폴리사카라이드증, 예를 들어 마로토-라미 증후군 (아릴술파타제 B의 결핍); 제II형 뮤코폴리사카라이드증; 제III형 뮤코폴리사카라이드증 (A, B, C 또는 D; 헤파란 술페이트 술파타제, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, 아세틸 CoA:알파-글루코사미니드 N-아세틸 트랜스퍼라제 또는 N-아세틸글루코사민-6-술페이트 술파타제의 결핍); 제IV형 뮤코폴리사카라이드증 (A 또는 B; 갈락토사민-6-술파타제 및 베타-갈락토시다제의 결핍); 제VI형 뮤코폴리사카라이드증 (아릴술파타제 B의 결핍); 제VII형 뮤코폴리사카라이드증 (베타-글루쿠로니다제의 결핍); 제VIII형 뮤코폴리사카라이드증 (글루코사민-6-술페이트 술파타제의 결핍); 제IX형 뮤코폴리사카라이드증 (히알루로니다제의 결핍); 테이-삭스병 (베타-헥소사미니다제의 알파 서브유닛의 결핍); 샌드호프병 (베타-헥소사미니다제의 알파 및 베타 서브유닛 둘 다의 결핍); GM1 강글리오시드증 (제I형 또는 제II형); 파브리병 (알파 갈락토시다제의 결핍); 이염성 백질이영양증 (아릴 술파타제 A의 결핍); 폼페병 (산 말타제의 결핍); 푸코시드축적증 (푸코시다제의 결핍); 알파-만노시드축적증 (알파-만노시다제의 결핍); 베타-만노시드축적증 (베타-만노시다제의 결핍), 세로이드 리포푸신증, 및 고셔병 (제I형, 제II형 및 제III형; 글루코세레브로시다제의 결핍), 뿐만 아니라 장애, 예컨대 헤르만스키-푸들라크 증후군; 흑내장성 백치; 탄지에르병; 아스파르틸글루코사민뇨; 제Ia형 글리코실화의 선천성 장애; 체디악-히가시 증후군; 제1형 반상 각막 이영양증; 시스틴축적증, 신병증성; 판코니-빅켈 증후군; 파버 지방육아종증; 섬유종증; 게레오피식 이형성증; 제I형 글리코겐 축적 질환; 제Ib형 글리코겐 축적 질환; 제Ic형 글리코겐 축적 질환; 제III형 글리코겐 축적 질환; 제IV형 글리코겐 축적 질환; 제V형 글리코겐 축적 질환; 제VI형 글리코겐 축적 질환; 제VII형 글리코겐 축적 질환; 제0형 글리코겐 축적 질환; 면역골 이형성증, 쉼케 유형; 지질증; 리파제 b; 제II형 점액지질증; 변이 형태를 포함하는 제II형 점액지질증; 제IV형 점액지질증; 베타-갈락토시다제 결핍을 갖는 뉴라미니다제 결핍; 제I형 점액지질증; 니만-픽병 (스핑고미엘리나제의 결핍); 스핑고미엘리나제 결핍이 없는 니만-픽병 (콜레스테롤 대사 효소를 코딩하는 npc1 유전자의 결핍); 레프숨병; 시-블루 조직구 질환; 영아 시알산 축적 장애; 시알루리아; 다발성 술파타제 결핍증; 장쇄 지방산 산화 장애를 갖는 트리글리세리드 축적 질환; 윈체스터병; 월만병 (콜레스테롤 에스테르 히드롤라제의 결핍); 데옥시리보뉴클레아제 I-유사 1 장애; 아릴술파타제 E 장애; ATPase, H+ 수송, 리소솜, 서브유닛 1 장애; 제IIb형 글리코겐 축적 질환; Ras-연관 단백질 rab9 장애; 제1형 점상 연골이형성증, X-연관 열성 장애; 제VIII형 글리코겐 축적 질환; 리소솜-연관 막 단백질 2 장애; 멘케스 증후군; 제Ic형 글리코실화 선천성 장애; 및 시알루리아를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비이환 포유동물에서 발견된 리소솜 축적 효소의 20% 미만, 예를 들어 10% 미만 또는 약 1% 내지 5% 수준의 대체는 포유동물에서 신경계 증상, 예컨대 신경계 변성을 예방, 억제 또는 치료할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 IDUA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV9 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 면역적격 인간의 CNS로 전달하는 것을 포함한다. CNS/뇌로의 투여 경로는 척수강내 투여, 두개내 투여, 예를 들어 뇌실내 투여 또는 측뇌실 투여, 비강내 투여, 혈관내 투여 및 실질내 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

다른 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 또는 단순 포진 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

도 1. AAV9-IDUA가 뇌실내로 (ICV) 또는 척수강내로 투여된 이두로니다제-결핍 마우스에 대한 실험 설계. 면역 반응을 예방하기 위해, 동물을 시클로포스파미드 (CP)로 면역억제시키거나, 출생 시에 인간 이두로니다제 단백질 (알두라자임)의 정맥내 투여에 의해 면역관용시키거나, 또는 이두로니다제 결핍이기도 한 NOD-SCID 면역결핍 마우스에서 주사를 수행하였다. 동물을 처리후 나타낸 시간에 희생시키고, 뇌를 미세절제하고, 추출물을 이두로니다제 활성에 대해 검정하였다.
도 2. 면역결핍, IDUA 결핍 동물에서의 IDUA 활성.
도 3. ICV 경로에 의해 AAV 벡터가 투여된 면역억제된 동물에서의 IDUA 활성.
도 4. IT 경로에 의해 AAV 벡터가 투여 면역된 면역억제된 동물에서의 IDUA 활성.
도 5. AAV 벡터가 ICV 투여된 면역관용된 동물에서의 IDUA 활성.
도 6. 나란히 비교하기 위한 IDUA 활성의 모든 평균 수준의 모음.
도 7. 데이터는 뇌의 구역에 따라 군 분류된다.
도 8. 모든 4개의 시험군에 대한 다양한 뇌 절편 내 GAG 축적 물질에 대한 검정.
도 9. 실험 설계의 개략도.
도 10. 면역결핍 MPS I 마우스 내로의 AAV9-IDUA의 두개내 주입. 성체 동물에게 10¹¹개 벡터 게놈을 주사하고, 10주 후에 뇌에서 이두로니다제 발현에 대해 평가하였다. 뇌에서의 효소 활성 수준은 야생형 동물의 뇌에서보다 유의하게 더 높았고, 야생형보다 30- 내지 300-배 더 높은 범위였다.
도 11. 면역적격, IDUA 결핍 마우스에서 AAV9-IDUA의 두개내 투여. 성체 동물에게 10¹¹개 벡터 게놈을 주사하고, 시클로포스파미드 (CP)의 매주 주사에 의해 면역억제시켰다. CP 주사는 불량한 건강으로 인해 벡터 주사후 6주에 종결하였고, 동물을 주사후 8주에 희생시켰다. 뇌를 미세절제하고, IDUA 효소 활성에 대해 검정하였다.
도 12. 면역관용된 MPS I 마우스 내로의 AAV9-IDUA의 두개내 주입. MPS 1 마우스를 출생 시에 알두라자임의 단일 용량으로 관용시키거나 또는 출생 시에 출발하여 매주 다중 용량을 투여하였다. 마우스에게 4개월에 벡터를 주입하고, 주사 후 11주에 희생시켰다. 뇌를 미세절제하고, 이두로니다제 발현에 대해 분석하였다. 효소 활성은 야생형 수준보다 평균 10- 내지 1000-배 더 높은 범위였다.
도 13. 면역적격, IDUA 결핍 동물에서 AAV9-IDUA의 척수강내 투여. 성체 MPS I 마우스에게 AAV9-IDUA를 척수강내로 주사하고, 이어서 시클로포스파미드의 매주 면역억제 요법을 수행하였다. 동물을 주사후 11주에 희생시킨 다음, 뇌 및 척수를 IDUA 효소 활성에 대해 분석하였다.
도 14. 면역관용된 MPS I 마우스에서 AAV9-IDUA의 척수강내 주입. IDUA 결핍 동물을 출생 시에 알두라자임의 단일 용량으로 관용시키거나 또는 출생 시에 출발하여 매주 다중 용량을 투여하였다. 4개월령의 동물에게 AAV9-IDUA 벡터를 척수강내로 주입하고, 주사후 10주에 동물을 희생시키고, 뇌를 미세절제하고, 이두로니다제 활성에 대해 검정하였다. 뇌의 모든 부분에서 효소 활성의 회복이 있었으며, 이때 소뇌에서의 활성은 야생형 수준보다 200- 내지 1500-배 더 높은 범위였다. 후구 및 소뇌에서의 효소 활성의 수준 (점선의 우측)은 우측 Y-축에 상응한다.
도 15. 면역적격 MPS I 동물에서 AAV9-IDUA의 척수강내 주입. 대조군 MPS I 동물에게 AAV9-IDUA 벡터를 주사하였지만, 면역억제시키지도 면역관용시키지도 않았다. 동물을 벡터 주사 후 11주에 희생시킨 다음, 그의 뇌를 이두로니다제 활성에 대해 검정하였다. 효소 수준은 뇌의 모든 부분에서 야생형 수준으로 회복되었지만, 면역억제 또는 면역관용된 동물에서보다 유의하게 더 낮았다.
도 16. 두개내 또는 척수강내 AAV9 주입 후 글리코사미노글리칸 (GAG) 수준의 정상화. AAV9-IDUA를 나타낸 바와 같이 면역결핍, 면역억제 또는 면역관용된 MPS I 마우스 내로 두개내로 또는 척수강내로 주사하였다. 동물을 주사 후 8-11주에 희생시킨 다음, 뇌를 미세절제하고, GAG 수준에 대해 분석하였다. GAG 축적은 분석된 모든 군에서 야생형 수준으로 회복되었거나 또는 야생형에 근접하였다.
도 17. 뇌에서의 IDUA 벡터 카피. 미세절제된 뇌를 QPCR에 의해 IDUA 벡터 서열에 대해 분석하였다. 두개내로 및 척수강내로 주사된 마우스에서의 카피수는 도 11 및 13에 도시된 효소 활성의 수준과 상관관계가 있다.
도 18. 성체 동물 내로의 AAV8-MCI의 ICV 주입.
도 19. 면역적격, IDUA 결핍 동물에서 AAV9-IDUA의 비강내 투여. 성체 MPS I 마우스에게 AAV9-IDUA를 비강내로 주입하고, 이어서 시클로포스파미드의 매주 면역억제 요법을 수행하였다. 동물을 주사후 12주에 희생시키고, 뇌를 IDUA 효소 활성에 대해 분석하였다.
도 20. 뇌에서의 IDUA 벡터 카피. 미세절제된 뇌를 QPCR에 의해 IDUA 벡터 서열에 대해 분석하였다. 비강내로 주사된 마우스에서의 카피수는 도 19에서의 효소의 수준과 상관관계가 있다.
도 21. AAV9-IDUA의 IN 전달을 사용하는, 면역억제제 또는 관용을 동반한 프로토콜.
도 22. AAV9-IDUA의 IN 전달 후 IDUA 활성의 회복.
도 23. AAV9-IDUA의 IN 전달 후 GAG 활성.
도 24. AAV9-IDUA의 IN 전달 후 뇌에서의 IDUA 면역형광.
도 25. AAV9-GFP의 IN 전달 후 뇌에서의 GFP 면역형광.
도 26a-d. a) 톨루이딘 블루 염색. b) 대조군 이형접합 및 동형접합 MPS I 마우스 및 IDUA AAV9-MCI의 IN 전달로 처리된 마우스에서의 조직 병리상태의 요약. c) 반즈(Barnes) 미로. d) 반즈 미로 데이터.
도 27a-b. a) AAV9 벡터의 개략도. b) AAV9.hIDS 벡터의 IT 및 IV 전달에 대한 생체내 시험 군의 요약.
도 28. IT 및 IV 경로를 통해 AAV9-hIDS 벡터가 투여된 마우스의 혈장에서의 IDS 활성.
도 29. AAV9-hIDS의 IT 주사 후 CNS IDS 활성. 마우스의 각각의 군에 대해, 하기 조직에 대한 데이터가 좌측에서 우측으로 제시된다: 척수, 시상/뇌간, 소뇌, 피질, 해마, 및 선조체.
도 30a-d. a) AAV9-hIDS의 ICV 주사 후 CNS IDS 활성. 마우스의 각각의 군에 대해, 하기 조직에 대한 데이터가 좌측에서 우측으로 제시된다: 척수; 좌측 시상/뇌간, 소뇌, 피질, 해마, 선조체, 후구, 및 우측 후구, 선조체, 해마, 피질, 소뇌, 및 시상/뇌간. b) AAV9-hIDS의 ICV 주사 후 혈장에서의 IDS 활성. c) AAV9-hIDS의 ICV 주사 후 말초 기관에서의 IDS 활성. 마우스의 각각의 군에 대해, 하기 기관에 대한 데이터가 좌측에서 우측으로 제시된다: 간, 심장, 폐, 비장 및 신장. d) ICV 주사 후 GAG 함량. 마우스의 각각의 군에 대해, 하기 조직에 대한 데이터가 좌측에서 우측으로 제시된다: 척수, 나머지, 소뇌, 피질, 해마, 선조체, 및 후구.
도 31a-b. a) 반즈 미로. b) 제1일 및 제4일의 수행.
도 32. 야생형 및 MPS II 마우스의 신경계 기능의 비교.
도 33. AAV9 또는 AAVrh10을 사용하는 IV 유전자 전달을 위한 실험 설계.
도 34a-c. IV 투여 후 (a) 혈장, (b) 말초 조직 및 (c) CNS에서의 IDUA 활성의 회복.
도 35a-c. (a) 소변, (b) 말초 조직 및 (c) CNS에서의 GAG 활성
도 36a-f. 조직 절편에서의 IDUA 면역형광. a) 간. b) 심장. c) 폐. d) 시상. e) 해마. f) 소뇌.
도 37. AAV9-IDUA의 IN 주입 후 IDUA 효소 활성 수준. 높은 수준의 IDUA 효소 활성이 후구에서 관찰되고 (정상보다 10-100배 더 높음) 정상화된 (wt) 수준이 뇌의 다른 부분에서 관찰되었다.
도 38. 처리된 마우스에서의 축적 물질의 감소.
도 39a-d. (a) IDUA, (b) GFP; 및 (c) 후구 면역형광. (d) 후구에서의 후각 마커 단백질을 사용한 공동-염색.
도 40. IN 처리 마우스에서의 개선된 신경인지 기능.
도 41a-b. (a) 소뇌 및 (b) 해마에서의 신경화학 프로파일. 각각의 신경화학 프로파일에 대해, 대조군 (CTR)은 좌측 막대이고, MPS I (비처리)은 중앙 막대이고 MPS I 처리는 우측 막대이다.
도 42. AAVrh10-GFP의 IN 전달 후 맥락총 염색.

정의

본원에 사용된, "개체" (치료의 대상체에서와 같이)는 포유동물을 의미한다. 포유동물은, 예를 들어 인간; 비-인간 영장류, 예를 들어 유인원 및 원숭이; 및 비-영장류, 예를 들어 개, 고양이, 래트, 마우스, 소, 말, 양 및 염소를 포함한다. 비-포유동물은, 예를 들어 어류 및 조류를 포함한다.

용어 "질환" 또는 "장애"는 상호교환적으로 사용되며, 특정 유전자 산물, 예를 들어 리소솜 축적 효소의 결여 또는 감소된 양이 질환에서, 예를 들어 정상 수준의 적어도 1%로 보충됨으로써 치료상 유익한 효과가 달성될 수 있도록 역할을 하는 질환 또는 상태를 지칭하는 것으로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 완전히 또는 거의 완전히를 의미하며; 예를 들어, 한 성분이 "실질적으로 없는" 조성물은 상기 성분을 전혀 갖지 않거나 또는 조성물의 어떠한 관련된 기능적 특성도 그 존재에 의해 영향을 받지 않을 만큼 미량을 함유하거나, 또는 화합물이 "실질적으로 순수"하다는 것은 무시할만한 미량의 불순물만이 존재한다는 것이다.

본원의 의미 내에서 "치료하는" 또는 "치료"는 장애 또는 질환과 연관된 증상의 완화를 지칭하고, "억제하는"은 장애 또는 질환과 연관된 증상의 추가의 진행 또는 악화의 억제를 의미하고, "예방하는"은 장애 또는 질환과 연관된 증상의 예방을 지칭한다.

본원에 사용된, 본 발명의 작용제, 예를 들어 유전자 산물을 코딩하는 재조합 AAV의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 장애 또는 상태와 연관된 증상을 전반적으로 또는 부분적으로 완화하거나, 또는 상기 증상의 추가의 진행 또는 악화를 정지시키거나 늦추거나, 또는 장애 또는 상태를 예방하거나 그에 대한 예방을 제공하는 작용제의 양, 예를 들어 개체에서 하나 이상의 신경계 증상을 예방, 억제 또는 치료하는데 효과적인 양을 지칭한다.

특히, "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간에서의 유효한 양을 지칭한다. 치료 유효량은 또한, 본 발명의 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다.

본원에 사용된 "벡터" 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 그와 회합하며 시험관내 또는 생체내에서 세포에의 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개하는데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합을 의미한다. 예시된 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 및 다른 유전자 전달 비히클을 포함한다. "표적 폴리뉴클레오티드" 또는 "트랜스진"으로서 때때로 지칭되는, 전달될 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법에서의 관심 코딩 서열 (예컨대 관심 치료 단백질을 코딩하는 유전자) 및/또는 선택가능한 또는 검출가능한 마커를 포함할 수 있다.

"AAV"는 아데노-연관 바이러스이며, 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 모든 하위유형, 혈청형 및 유사형, 자연 발생 및 재조합 형태 둘 다를 커버한다. 본원에 사용된 용어 "혈청형"은 결합 특성을 기준으로 하여 다른 AAV에 의해 확인되고 그와 구별되는 AAV를 지칭하며, 예를 들어 11개 혈청형의 AAV, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 및 AAVrh10을 포함하는 AAV1-AAV11이 존재하고, 상기 용어는 동일한 결합 특성을 갖는 유사형을 포괄한다. 따라서, 예를 들어 AAV9 혈청형은 AAV9의 결합 특성을 갖는 AAV, 예를 들어 AAV9 캡시드 및 AAV9로부터 유래되거나 수득되지 않는 또는 키메라인 rAAV 게놈을 포함하는 유사형화 AAV를 포함한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 지칭하며, 또한 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")로도 지칭된다.

"AAV 바이러스"는 적어도 1종의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포로 전달될 트랜스진)를 포함하는 경우에, 전형적으로 "rAAV"로 지칭된다. AAV "캡시드 단백질"은 야생형 AAV의 캡시드 단백질, 뿐만 아니라 rAAV 게놈을 구조적으로 및/또는 기능적으로 패키징할 수 있으며 야생형 AAV에 의해 사용된 수용체와는 상이할 수 있는 적어도 1종의 특정 세포 수용체에 결합하는 AAV의 캡시드 단백질의 변형된 형태를 포함한다. 변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV의 2개 이상의 혈청형으로부터의 아미노산 서열을 갖는 것과 같은 키메라 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 AAV-2로부터의 캡시드 단백질의 부분에 융합 또는 연결된 AAV9로부터의 캡시드 단백질의 부분으로부터 형성된 캡시드 단백질, 및 AAV 캡시드 단백질에 융합 또는 연결된 태그 또는 다른 검출가능한 비-AAV 캡시드 펩티드 또는 단백질을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 예를 들어 AAV9에 대한 수용체 이외의 수용체, 예컨대 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체 분자의 부분은 AAV9 캡시드 단백질에 재조합적으로 융합될 수 있다.

"유사형화" rAAV는 AAV 캡시드 단백질 및 AAV 게놈의 임의의 조합을 갖는 감염성 바이러스이다. 임의의 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질은 상이한 혈청형의 야생형 AAV 게놈으로부터 유래되거나 수득가능한 rAAV 게놈에서, 또는 키메라 게놈, 즉 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 AAV DNA로부터 형성된 키메라 게놈, 예를 들어 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR) (상이한 혈청형으로부터의 각 ITR 또는 키메라 ITR)를 가지는 키메라 게놈인 rAAV 게놈에서 사용될 수 있다. 키메라 게놈, 예컨대 2개의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 또는 키메라 ITR을 포함하는 키메라 게놈의 사용은 전사적으로 활성인 분자간 콘카테머의 생산을 추가로 증진시킬 수 있는 방향적 재조합을 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명의 rAAV 벡터 내의 5' 및 3' ITR은 동종, 즉 동일한 혈청형으로부터의 것, 이종, 즉 상이한 혈청형으로부터의 것, 또는 키메라, 즉 1개 초과의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 서열을 갖는 ITR일 수 있다.

rAAV 벡터

임의의 혈청형의 아데노-연관 바이러스가 rAAV를 제조하는데 적합한데, 이는 다양한 혈청형이 심지어 유전자 수준에서도 기능적으로 및 구조적으로 관련되어 있기 때문이다. 모든 AAV 혈청형은 상동 rep 유전자에 의해 매개되는 유사한 복제 특성을 분명히 나타내고; 모두 일반적으로 3종의 관련 캡시드 단백질, 예컨대 AAV2에서 발현된 것을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이에 광범위한 교차-혼성화를 밝힌 헤테로듀플렉스 분석; 및 ITR에 상응하는 말단에서의 유사한 자기-어닐링 절편의 존재에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각 혈청형에서의 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있음을 시사한다. 다양한 AAV 혈청형 중에서, AAV2가 가장 통상적으로 사용된다.

본 발명의 AAV 벡터는 전형적으로 AAV에 이종인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법의 맥락에서 표적 세포에 기능을 제공하는 능력, 예컨대 특정 표현형의 발현의 상향- 또는 하향조절 때문에 전형적으로 관심의 대상이다. 이러한 이종 폴리뉴클레오티드 또는 "트랜스진"은 일반적으로 목적하는 기능 또는 코딩 서열을 제공하기에 충분한 길이를 갖는다.

이종 폴리뉴클레오티드의 전사가 의도된 표적 세포에서 요망되는 경우에, 그것은 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들어 표적 세포 내 전사의 목적하는 수준 및/또는 특이성에 좌우되면서, 그 자신 또는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다양한 유형의 프로모터 및 인핸서가 이러한 맥락에서 사용하기에 적합하다. 구성적 프로모터는 유전자 전사의 지속적인 수준을 제공하며, 치료 또는 예방 폴리뉴클레오티드가 지속적으로 발현되는 것이 요망되는 경우에 바람직할 수 있다. 유도성 프로모터는 일반적으로 유도인자의 부재 하에 낮은 활성을 나타내며, 유도인자의 존재 하에 상향조절된다. 그들은 발현이 단지 특정 시간에 또는 특정 위치에서 요망되는 경우에 또는 유도 작용제를 사용하여 발현의 수준을 적정하는 것이 요망되는 경우에 바람직할 수 있다. 프로모터 및 인핸서는 또한 조직-특이적일 수 있다: 즉, 단지 특정 세포 유형에서만 그의 활성을 나타내며, 이는 아마도 상기 세포에서 고유하게 발견된 유전자 조절 요소로 인한 것이다.

프로모터의 예시적인 예는 원숭이 바이러스 40으로부터의 SV40 후기 프로모터, 바큘로바이러스 다면체 인핸서/프로모터 요소, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV tk), 시토메갈로바이러스 (CMV)로부터의 극초기 프로모터 및 다양한 레트로바이러스 프로모터 (LTR 요소를 포함함)이다. 유도성 프로모터는 중금속 이온 유도성 프로모터 (예컨대 마우스 유방 종양 바이러스 (mMTV) 프로모터 또는 다양한 성장 호르몬 프로모터) 및 T7 RNA 폴리머라제의 존재 하에 활성인 T7 파지로부터의 프로모터를 포함한다. 예시를 들어, 조직-특이적 프로모터의 예는 다양한 서팩틴 프로모터 (폐에서의 발현을 위한 것), 미오신 프로모터 (근육에서의 발현을 위한 것) 및 알부민 프로모터 (간에서의 발현을 위한 것)를 포함한다. 매우 다양한 다른 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며 일반적으로 이용가능하고, 다수의 상기 프로모터의 서열은 서열 데이터베이스, 예컨대 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에서 이용가능하다.

번역이 또한 의도된 표적 세포에서 요망되는 경우에, 이종 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 또한 번역 (예컨대 리보솜 결합 부위 또는 "RBS" 및 폴리아데닐화 신호)을 용이하게 하는 제어 요소를 포함할 것이다. 따라서, 이종 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 1개의 코딩 영역을 포함하며, 또한 예를 들어 작동가능하게 연결된 인핸서, 리보솜 결합 부위 및 폴리-A 신호를 포함할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드는 1개의 코딩 영역, 또는 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하에 1개 초과의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 제어 요소 및 코딩 영역의 조합을 함유하는 전체 단위는 종종 발현 카세트로서 지칭된다.

이종 폴리뉴클레오티드는 AAV 게놈 코딩 영역으로 또는 그 대신에 (즉, AAV rep 및 cap 유전자 대신에) 재조합 기술에 의해 통합되지만, 일반적으로 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 영역과 나란히 플랭킹된다. 이것은 ITR이 코딩 서열로부터의 상류 및 하류 둘 다에서 직접 병렬배치로, 예를 들어 (반드시 그러한 것은 아니지만) AAV 기점의 임의의 개재 서열 없이 출현하여, 복제-적격 AAV 게놈을 재생시킬 수 있는 재조합의 가능성을 감소시킨다는 것을 의미한다. 그러나, 단일 ITR은 2개의 ITR을 포함하는 구성물과 통상적으로 연관된 기능을 수행하는데 충분할 수 있고 (예를 들어 WO 94/13788 참조), 단지 1개의 ITR을 갖는 벡터 구축물은 이에 따라 본 발명의 패키징 및 생산 방법과 함께 사용될 수 있다.

rep에 대한 천연 프로모터는 자기-조절성이며, 생산된 AAV 입자의 양을 제한할 수 있다. rep 유전자는 또한, rep가 벡터 구축물의 일부로 제공되든지 또는 개별적으로 제공되든지 간에, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. rep 유전자 발현에 의해 강하게 하향조절되지 않는 임의의 이종 프로모터가 적합하지만; rep 유전자의 구성적 발현이 숙주 세포에 대해 부정적 영향을 가질 수 있기 때문에 유도성 프로모터가 바람직할 수 있다. 매우 다양한 유도성 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예시를 들어, 중금속 이온 유도성 프로모터 (예컨대 메탈로티오네인 프로모터); 스테로이드 호르몬 유도성 프로모터 (예컨대 MMTV 프로모터 또는 성장 호르몬 프로모터); 및 T7 RNA 폴리머라제의 존재 하에 활성인 T7 파지로부터의 것과 같은 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 한 하위유형은 rAAV 벡터의 복제 및 패키징을 보완하는데 사용되는 헬퍼 바이러스에 의해 유도된 것이다. 아데노바이러스 E1A 단백질에 의해 유도가능한 아데노바이러스 초기 유전자 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터; 헤르페스바이러스 단백질, 예컨대 VP16 또는 1CP4에 의해 유도가능한 헤르페스바이러스 프로모터; 뿐만 아니라 우두 또는 폭스바이러스 유도성 프로모터를 비롯한 수많은 헬퍼-바이러스-유도성 프로모터가 또한 기재되었다.

헬퍼-바이러스-유도성 프로모터를 확인 및 시험하기 위한 방법이 기재되었다 (예를 들어 WO 96/17947 참조). 따라서, 후보 프로모터가 헬퍼-바이러스-유도성인지 아닌지의 여부 및 그들이 고효율 패키징 세포의 생성에 유용할 것인지 아닌지의 여부를 결정하기 위한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 간략하게, 한 이러한 방법은 AAV rep 유전자의 p5 프로모터를 추정 헬퍼-바이러스-유도성 프로모터로 대체하는 것을 포함한다 (관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 널리 공지된 기술, 예컨대 프로모터-없는 "리포터" 유전자에 대한 연결을 사용하여 확인됨). 이어서, 예를 들어 양성 선택 마커, 예컨대 항생제 내성 유전자에 연결된 AAV rep-cap 유전자 (p5가 대체됨)는 적합한 숙주 세포 (예컨대 하기 예시된 HeLa 또는 A549 세포)에 안정하게 통합된다. 이어서, 선택 조건 하에 (예를 들어, 항생제의 존재 하에) 비교적 잘 성잘할 수 있는 세포는 헬퍼 바이러스의 첨가 시에 rep 및 cap 유전자를 발현하기 위한 그의 능력에 대해 시험된다. rep 및/또는 cap 발현에 대한 초기 시험으로서, 세포는 Rep 및/또는 Cap 단백질을 검출하기 위해 면역형광을 사용하여 용이하게 스크리닝될 수 있다. 이어서, 패키징 능력 및 효율의 확인은 유입 rAAV 벡터의 복제 및 패키징에 대한 기능적 시험에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 마우스 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 헬퍼-바이러스-유도성 프로모터는 p5 프로모터에 대한 적합한 대체물로서 확인되었으며, rAAV 입자의 높은 역가를 생산하기 위해 사용되었다 (WO 96/17947에 기재된 바와 같음).

하나 이상의 AAV 유전자의 제거는 바람직한 어느 경우에서나 복제-적격 AAV ("RCA")를 생성하는 가능성을 감소시키기 위한 것이다. 따라서, rep, cap 또는 둘 다에 대한 코딩 또는 프로모터 서열은 이들 유전자에 의해 제공된 기능이 트랜스로, 예를 들어, 안정한 세포주로 또는 공동-형질감염을 통해 제공될 수 있기 때문에 제거될 수 있다.

생성된 벡터는 이들 기능에 "결손"이 있는 것으로 지칭된다. 벡터를 복제 및 패키징하기 위해, 결여 기능은 다양한 결여 rep 및/또는 cap 유전자 산물에 대한 필요한 기능을 함께 코딩하는 패키징 유전자 또는 그의 다수로 보완된다. 패키징 유전자 또는 유전자 카세트는 AAV ITR에 플랭킹되지 않은 한 실시양태 및 rAAV 게놈과 어떠한 실질적 상동성도 공유하지 않는 한 실시양태에 있다. 따라서, 벡터 서열과 개별적으로 제공된 패키징 유전자 사이의 복제 동안의 상동 재조합을 최소화하기 위해, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 중복을 피하는 것이 바람직하다. 상동성의 수준 및 재조합의 상응하는 빈도는 상동 서열의 길이 증가 및 그들의 공유된 동일성 수준과 함께 증가한다. 주어진 시스템에 문제를 제기할 상동성의 수준은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 이론적으로 결정되고 실험적으로 확인될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 재조합은 중복 서열이 약 25개 미만의 뉴클레오티드 서열이며 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 동일한 경우에, 또는 약 50개 미만의 뉴클레오티드 서열이며 전체 길이에 걸쳐 적어도 70% 동일한 경우에, 실질적으로 감소되거나 또는 제거될 수 있다. 물론, 훨씬 더 낮은 수준의 상동성이 재조합의 가능성을 추가로 감소시킬 것이기 때문에 바람직하다. 심지어 임의의 중복 상동성 없이도, RCA를 생성하는 일부 잔여 빈도가 존재하는 것처럼 보인다. RCA를 생성하는 빈도에 있어서 심지어 추가의 감소 (예를 들어, 비상동 재조합에 의함)는 문헌 [Allen et al., WO 98/27204]에 기재된 바와 같이 AAV의 복제 및 캡시드화 기능을 "분리"하여 얻을 수 있다.

rAAV 벡터 구축물 및 상보적 패키징 유전자 구축물은 본 발명에서 다수의 상이한 형태로 실시될 수 있다. 바이러스 입자, 플라스미드 및 안정하게 형질전환된 숙주 세포는 모두 이러한 구축물을 패키징 세포로 일시적으로 또는 안정하게 도입하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, AAV 벡터 및 상보적 패키징 유전자(들)는 존재하는 경우에 박테리아 플라스미드, AAV 입자 또는 그의 임의의 조합의 형태로 제공된다. 다른 실시양태에서, AAV 벡터 서열, 패키징 유전자(들) 또는 둘 다는 유전자 변경된 (바람직하게는 유전성으로 변경된) 진핵 세포의 형태로 제공된다. AAV 벡터 서열, AAV 패키징 유전자 또는 둘 다를 발현하기 위해 유전성으로 변경된 숙주 세포의 개발은 신뢰할만한 수준으로 발현되는 확립된 물질 공급원을 제공한다.

따라서 다양한 여러 유전자 변경된 세포가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 예시를 들어, 포유동물 숙주 세포는 안정하게 통합된 rAAV 벡터의 적어도 1개의 무손상 카피와 함께 사용될 수 있다. 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 AAV rep 유전자를 포함하는 AAV 패키징 플라스미드가 복제 기능을 공급하는데 사용될 수 있다 (미국 특허 5,658,776에 기재된 바와 같음). 대안적으로, 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 유전자를 갖는 안정한 포유동물 세포주가 복제 기능을 공급하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Trempe et al., (WO 95/13392); Burstein et al. (WO 98/23018); 및 Johnson et al. (U.S. No. 5,656,785)] 참조). 상기 기재된 바와 같은 캡시드화 단백질을 제공하는 AAV cap 유전자는 AAV rep 유전자와 함께 또는 개별적으로 제공될 수 있다 (예를 들어, 상기 언급된 출원 및 특허 뿐만 아니라 [Allen et al. (WO 98/27204)] 참조). 다른 조합이 가능하며 본 발명의 범주에 포함된다.

전달을 위한 경로

뇌 혈관계의 광대한 네트워크에도 불구하고, 중추 신경계 (CNS)로의 치료제의 전신 전달은 소분자의 98% 초과 및 대분자의 거의 100%에 대해 유효하지 않다 (Partridge, 2005). 유효성의 결여는 혈액-뇌 장벽 (BBB)의 존재로 인한 것이며, 이는 대부분의 외래 물질, 심지어 다수의 유익한 치료제가 순환성 혈액으로부터 뇌에 진입하는 것을 막는다. 전신 제공된 특정 소분자, 펩티드 및 단백질 치료제가 BBB를 거쳐 뇌실질에 도달하는 동안에 (Banks, 2008), 일반적으로 높은 전신 용량이 치료 수준을 달성하는데 필요하며, 이는 체내에서 부작용으로 이어질 수 있다. 치료제는 뇌실내 또는 실질내 주사에 의해 CNS로 직접 도입될 수 있다. 비강내 전달은 BBB를 우회하고, 비도를 신경지배하는 후각 및 삼차 신경을 따른 경로를 이용하여 치료제를 CNS에 직접 표적화한다 (Frey II, 2002; Thorne et al., 2004; Dhanda et al., 2005).

rAAV 투여의 임의의 경로는 투여된 경로 및 양이 예방적으로 또는 치료적으로 유용한 한 사용될 수 있다. 한 예에서, CNS로의 투여 경로는 척수강내 및 두개내를 포함한다. 두개내 투여는 거대 수조 또는 뇌실에 대한 것일 수 있다. 용어 "거대 수조"는 두개골과 척추 상단 사이의 개구부를 통한 소뇌 주위 및 아래 공간에의 접근을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "뇌실"은 척수의 중심관과 연속되어 있는 뇌 안의 강을 포함하는 것으로 의도된다. 두개내 투여는 주사 또는 주입을 통해 이루어지고, 두개내 투여를 위한 적합한 용량 범위는 일반적으로 단일 주사 부피 1 내지 3000 마이크로리터로 전달된 마이크로리터당 약 10³ 내지 10¹⁵개 바이러스 벡터의 감염 단위이다. 예를 들어, 마이크로리터당 바이러스 게놈 또는 벡터의 감염 단위는 일반적으로 약 10, 50, 100, 200, 500, 1000 또는 2000 마이크로리터로 전달된 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 또는 10¹⁷개 바이러스 게놈 또는 바이러스 벡터의 감염 단위를 함유할 것이다. 상기 언급된 투여량은 단지 예시적인 투여량임을 이해하여야 하고, 통상의 기술자는 이러한 투여량이 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 유효 용량은 시험관내 또는 생체내 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

본 발명의 척수강내 치료 방법에서 전달된 AAV는 척수강내 투여에 통상적으로 사용된 임의의 편리한 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 척수강내 투여는 약 1시간 동안 제제의 느린 주입을 통해 이루어질 수 있다. 척수강내 투여는 주사 또는 주입을 통해 이루어지고, 척수강내 투여를 위한 적합한 용량 범위는 일반적으로, 예를 들어 단일 주사 부피 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 또는 100 또는 그 초과 밀리리터, 예를 들어, 1 내지 10,000 밀리리터 또는 0.5 내지 15 밀리리터로 전달된 마이크로리터당 약 10³ 내지 10¹⁵개 바이러스 벡터의 감염 단위이다. 예를 들어, 마이크로리터당 바이러스 게놈 또는 벡터의 감염 단위는 일반적으로 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ 또는 10¹⁴개 바이러스 게놈 또는 바이러스 벡터의 감염 단위를 함유할 것이다.

본 발명의 비강내 치료 방법에서 전달되는 AAV는 적합한 용량 범위, 일반적으로, 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 또는 100 또는 그 초과 밀리리터, 예를 들어, 1 내지 10,000 밀리리터 또는 0.5 내지 15 밀리리터로 전달된 마이크로리터당 약 10³ 내지 10¹⁵개 바이러스 벡터의 감염 단위로 투여될 수 있다. 예를 들어, 마이크로리터당 바이러스 게놈 또는 벡터의 감염 단위는 일반적으로 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 또는 10¹⁷개 바이러스 게놈 또는 바이러스 벡터의 감염 단위, 예를 들어, 적어도 1.2 x 10¹¹개 게놈 또는 감염 단위, 예를 들어 적어도 2 x 10¹¹개 최대 약 2 x 10¹²개 게놈 또는 감염 단위 또는 약 1 x 10¹³ 내지 약 5 x 10¹⁶개 게놈 또는 감염 단위를 함유할 것이다. 한 실시양태에서, 비강내 전달에 사용된 AAV는 말단 갈락토스 잔기를 갖는 글리칸에 결합하는 것이고 한 실시양태에서 용량은 9 x 10¹⁰개보다 2 내지 8배 더 높고 1 x 10¹¹개 보다 적은 AAV8 게놈 또는 바이러스 벡터의 감염 단위이다.

요법은, 리소솜 축적 효소, 예컨대 IDUA가 발현되는 경우에, 상기 논의된 바와 같은 대상체의 뉴런 및/또는 수막 조직에 리소솜 축적 과립의 정상화를 유발한다. 축적 과립의 침착이 뉴런 및 신경교 조직으로부터 개선되어, 이에 의해 리소솜 축적 질환을 앓고 있는 개체에서 보여지는 발달 지연 및 퇴행을 완화시키는 것으로 생각된다. 요법의 다른 효과는 리소솜 축적 질환에 존재하여 고압 수두증을 유발하는 거미막 과립 근처의 뇌 수막에 리소솜 축적 과립의 정상화를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 C1-C5의 척수 근처의 경부 수막에서 또는 척수 다른 곳에서 리소솜 축적 과립의 존재로부터 유발되는 척수 압박을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 뇌의 혈관 주위에 리소솜 축적 과립의 혈관주위 축적에 의해 야기되는 낭의 치료에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 요법 또한 유리하게는 간 부피 및 요 글리코사미노글리칸 분비의 정상화, 비장 크기 및 무호흡/호흡저하 사례의 감소, 사춘기전 대상체의 키 및 성장 속도의 증가, 어깨 유연성 및 팔꿈치와 무릎 신장의 증가, 및 삼첨판 역류 또는 폐동맥판 역류의 감소를 유발할 수 있다.

본 발명의 척수강내 투여는 조성물을 요추 구역 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 이러한 투여는 볼루스 주사를 통해 이루어질 수 있다. 증상의 중증도 및 요법에 대한 대상체의 반응성에 따라, 볼루스 주사는 1주에 1회, 1개월에 1회, 6개월에 1회 또는 매년 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 척수강내 투여는 주입 펌프를 사용하여 달성된다. 통상의 기술자는 조성물의 척수강내 투여를 수행하는데 사용될 수 있는 장치를 알고 있다. 조성물은, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입에 의해 척수강내로 제공될 수 있다. 투여량 치료는 단일 용량 투여 또는 다중 용량의 형태일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

본원에 사용된 용어 "척수강내 투여"는 천두공 또는 수조 또는 요추 천자 등을 통한 측뇌실 주사를 포함하는 기술에 의해, 대상체의 뇌척수액 내로 직접 제약 조성물을 전달하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "요추 영역"은 제3 및 제4 요추 (하배부) 척추골 사이의 구역, 보다 포괄적으로는 척추의 L2-S1 영역을 포함하는 것으로 의도된다.

임의의 상기 언급된 부위에의 본 발명에 따른 조성물의 투여는 조성물의 직접 주사에 의해 또는 주입 펌프를 사용하여 달성될 수 있다. 주사의 경우에, 조성물은 액체 용액으로, 예를 들어 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액 또는 포스페이트 완충제 중에 제제화될 수 있다. 추가로, 효소는 고체 형태로 제제화될 수 있고, 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결건조 형태가 또한 포함된다. 주사는, 예를 들어 효소의 볼루스 주사 또는 연속 주입 (예를 들어, 주입 펌프 사용)의 형태일 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, rAAV는 대상체의 뇌 내로 측뇌실 주사에 의해 투여된다. 주사는, 예를 들어 대상체의 두개골에 만들어진 천두공을 통해 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 효소 및/또는 다른 제약 제제는 대상체의 뇌실 내로 외과적으로 삽입된 션트를 통해 투여된다. 예를 들어, 세번째 및 네번째로 작은 뇌실 내로의 주사가 또한 수행될 수 있을지라도, 주사는 보다 큰 측뇌실 내로 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용된 조성물은 대상체의 거대 수조 또는 요추 구역 내로의 주사에 의해 투여된다.

CNS로의 비강내 약물 전달의 기초가 되는 정확한 메카니즘이 전적으로 이해되지는 않지만, 증거의 축적체는 뇌 및 척수에 비도를 연결하는 신경을 포함하는 경로가 중요하다는 것을 입증한다. 또한 혈관계, 뇌척수액 및 림프계를 포함하는 경로는 비강에서 CNS로의 분자 수송과 관련되었다. 이들 경로의 조합이, 한 경로가 우세할 수 있을 지라도, 치료제의 특성, 제제의 특성 및 사용된 전달 장치에 따라 담당할 가능성이 있다.

치료제는 비강에서 직접 CNS로 이어지는 후각 신경 경로를 따라 비강내 투여 후 CNS에 신속하게 접근할 수 있다. 후각 신경 경로는 비강내 전달의 주요 성분이고, 이는 형광 추적자가 사상판을 횡단하는 바와 같이 후각 신경과 연관된다는 사실에 의해 입증되며 (Jansson et al., 2002), 후구 중 약물 농도는 일반적으로 관찰된 가장 높은 CNS 농도 중에 존재하고 (Thorne et al., 2004; Banks et al., 2004; Graff et al., 2005a); Nonaka et al., 2008; Ross et al., 2004; Ross et al., 2008; Thorne et al., 2008), 후각 상피 중 농도와 후구 중 농도 사이에 강한 양의 상관관계가 존재한다 (Dhuria et al., 2009a).

후각 경로는 후각 영역 내 비도의 상부 부분에서 발생하며, 여기서 후각 수용체 뉴런 (ORN)은 지지 세포 (지주 세포), 미세융모 세포 및 기저 세포 사이에 배치된다. ORN은 말초 환경에서 CNS로의 감각 정보를 전달함으로써 후각을 매개한다 (Clerico et al., 2003). 상피 밑에, 고유판은 점액 분비 보우만선, 축삭, 혈관, 림프관 및 결합 조직을 함유한다. ORN의 수상돌기는 후각 상피의 점액 층 내로 확장되고, 반면에 이들 양극 뉴런의 축삭은 비강과 두개강을 분리하는 사골의 사상판에서의 천공을 통해 및 고유판을 통해 중앙으로 확장된다. ORN의 축삭은 CSF를 함유하는 지주막하 공간을 통과하고, 후구에서 승모 세포 상에 종결된다. 그곳으로부터, 신경 돌출부는 후각로, 전후각핵, 조롱박 피질, 편도체 및 시상하부를 포함하는 다중 뇌 영역으로 확장된다 (Buck, 2000). ORN 이외에도, 그륀버그 신경절 내 비강의 전방 끝에 위치한 화학감각 뉴런은 후구 내로 이어진다 (Fuss et al., 2005; Koos et al., 2005).

ORN의 고유 특성은 CNS로의 비강내 전달에 중요한 동적 세포 환경에 기여한다. 외부 환경에서 독소와의 직접 접촉으로 인해, ORN은 후각 상피에 존재하는 기저 세포로부터 3-4주마다 재생한다 (Mackay-Sim, 2003). 후각 초성 세포 (OEC)로 칭해지는 특별한 슈반 세포-유사 세포는 ORN의 축삭을 둘러싸고, 축삭 재생, 재성장 및 재수초화에서 중요한 역할을 한다 (Field et al., 2003; Li et al., 2005a; Li et al., 2005b). OEC는 흥미롭게도 ORN의 변성 및 재생에도 불구하고 개방된 채로 남아있는 연속적인 유체-충전 신경주위 채널을 생성한다 (Williams et al., 2004).

후각 상피의 고유 환경 하에서, 비강내로 투여된 치료제가 후각 신경을 따라 세포외 또는 세포내 수송 메카니즘을 통해 CNS에 도달하는 것이 가능하다. 세포외 수송 메카니즘은 비강 상피 내 세포 사이에 분자의 신속한 이동에 관여하며, 이는 약물이 비강내 투여 후 후구 및 CNS의 다른 구역에 도달하는데 단지 수분 내지 30분을 요구한다 (Frey II, 2002; Balin et al., 1986). 수송은 가능하게는 OEC에 의해 생성된 채널 내에 벌크 흐름 메카니즘 (Thorne et al., 2004; Thorne et al., 2001)을 포함한다. 약물은 또한 인접한 축삭에서 탈분극 및 활동 전위의 축삭 전파 동안 발생한 구조적 변화에 의해 이들 채널 내에서 추진될 수 있다 (Luzzati et al., 2004). 세포내 수송 메카니즘은 수동 확산, 수용체-매개 세포내이입 또는 흡착성 세포내이입에 의한 ORN 내로의 분자의 흡수, 이어서 약물이 후구 및 다른 뇌 구역에 나타나는데 수시간 내지 수일이 걸리는 보다 느린 축삭 수송을 포함한다 (Baker et al., 1986; Broadwell et al., 1985; Kristensson et al., 1971). ORN에서의 세포내 수송은 소형 친지성 분자, 예컨대 금 입자 (de Lorenzo, 1970; Gopinath et al., 1978), 알루미늄 염 (Perl et al., 1987), 및 ORN 상의 수용체를 갖는 물질, 예컨대 WGA-HRP (Thorne et al., 1995; Baker et al., 1986; Itaya et al., 1986; Shipley, 1985)에 대해 입증되었다. 세포내 메카니즘은, 특정 치료제에 대해 중요하기는 하지만, CNS 내로의 수송의 우세한 방식일 가능성은 없다. 일부 대분자, 예컨대 갈라닌-유사 펩티드 (GALP)가 CNS 내로의 포화가능한 수송 경로를 나타내지만 (Nonaka et al., 2008), 다른 대분자, 예컨대 NGF 및 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I)의 경우에, 뇌 내로의 비강내 전달은 포화가능하지 않으며 수용체 매개되지 않는다 (Thorne et al., 2004; Chen et al., 1998; Zhao et al., 2004).

CNS에 비도를 연결하는, 종종 간과되지만 중요한 경로는 비도의 호흡 및 후각 상피를 신경지배하고 교뇌의 CNS에 진입하는 삼차 신경을 포함한다 (Clerico et al., 2003; Graff et al., 2003). 흥미롭게도, 삼차 신경의 작은 부분은 또한 후구에서 종결된다 (Schaefer et al., 2002). 비도의 호흡 영역의 세포 조성은 섬모 상피 세포가 점액 분비 배상 세포 중에 분포되어 있는 후각 영역의 조성과 상이하다. 이들 세포는 비강에서 비인두로 외래 물질과 함께 점액을 제거하는 점액섬모 소거 메카니즘에 기여한다. 삼차 신경은 삼차 신경의 안구 부분 (V1), 상악 부분 (V2) 또는 하악 부분 (V3)을 통해 비강, 구강, 안검 및 각막에서 CNS로 감각 정보를 전달한다 (Clerico et al., 2003; Gray, 1978). 삼차 신경의 안구 부분으로부터의 분지는 배측 비점막 및 코의 전방 부분에 신경지배를 제공하고, 반면에 상악 부분의 분지는 비점막의 측벽에 신경지배를 제공한다. 삼차 신경의 하악 부분은 하부 턱 및 치아로 확장되고, 이때 비강으로의 직접 신경 입력은 없다. 삼차 신경의 3개 분지는 삼차 신경절에서 함께 모이고, 중앙으로 확장되어 교뇌 수준에서 뇌에 진입하며, 뇌간의 척수 삼차신경 핵에서 종결된다. 삼차 신경의 고유 특성은, 비강내 투여 후에 미측 및 문측 뇌 구역 둘 다에 진입 지점을 생성하는 다음 2개 부위: (1) 교뇌 근처의 전방 파열공을 통해 및 (2) 후구 근처의 사상판을 통해 비도의 호흡 상피로부터 뇌에 진입한다는 것이다. 또한, 안면 및 두부를 신경지배하는 다른 신경, 예컨대 안면 신경, 또는 비강 내의 다른 감각 구조, 예컨대 그륀버그 신경절이 비강내 적용된 치료제에 대한 CNS 내로의 진입 지점을 제공할 수 있는 것 같다.

전형적으로, 비강내 투여 경로는 약물을 비점막 기저 모세 혈관 내로의 흡수를 통해 체순환에 전달하는데 이용되었다. 비점막은 매우 혈관이 많으며, 그의 혈액 공급을 경동맥에서 발생하는 상악, 안구 및 안면 동맥의 분지로부터 받는다 (Clerico et al., 2003; Cauna, 1982). 후각 점막은 안구 동맥의 소형 분지로부터 혈액을 받고, 반면에 호흡 점막은 상악 동맥의 큰 직경의 동맥 분지로부터 혈액을 받는다 (DeSesso, 1993). 혈관의 상대 밀도는 후각 점막에 비해 호흡 점막에서 더 크며, 이는 호흡 점막 영역을 혈액 내로의 흡수에 이상적인 부위로 만든다 (DeSesso, 1993). 호흡 영역에서의 혈관계는 연속 및 유창 내피의 혼합을 함유하며 (Grevers et al., 1987; Van Diest et al., 1979), 이는 소분자 및 대분자 둘 다가 비강 투여 후에 체순환에 진입하는 것을 가능하게 한다.

체순환 내로의 흡수 후에 CNS로의 전달 및 후속하는 BBB를 가로지른 수송은 특히, 대형 친수성 치료제, 예컨대 펩티드 및 단백질과 비교하여 보다 용이하게 혈류에 진입하고 BBB를 가로지르는 소형 친지성 약물에 대해 가능하다.

혈관 연관 채널 또는 혈관주위 채널을 포함하는 메카니즘이 비강내 약물의 CNS로의 전달에 관여한다는 것을 시사하는 증거가 증가하고 있다. 혈관주위 공간은 혈관의 최외각 층 및 주위 조직의 기저막에 의해 경계지어진다 (Pollock et al., 1997). 이들 혈관주위 공간은 뇌에 대한 림프계로서 작용하며, 여기서 뉴런-유래 물질은 뇌 혈관과 연관된 혈관주위 채널에 진입함으로써 뇌 간질액으로부터 소거된다. 혈관주위 수송은 확산 단독과는 대조적으로 벌크 흐름 메카니즘으로 인한 것이고 (Cserr et al., 1981; Groothuis et al., 2007), 동맥 맥동은 또한 혈관주위 수송을 위한 구동력이다 (Rennels et al., 1985; Rennels et al., 1985). 비강내로 적용된 약물은 비도에서 또는 뇌에 도달한 후에 혈관주위 공간 내로 이동할 수 있고, CNS 내에 관찰된 광범위한 분포는 혈관주위 수송 메카니즘으로 인한 것일 수 있다 (Thorne et al., 2004).

CSF를 함유하는 지주막하 공간, 후각 신경을 포괄하는 신경주위 공간 및 비강 림프를 연결하는 경로는 CSF 배액에 중요하고, 이들 동일 경로는 비강내로 적용된 치료제의 CSF 및 CNS의 다른 구역에 대한 접근을 제공한다. 여러 연구에서 뇌실 또는 지주막하 공간에서 CSF 내로 주사된 추적자가 후구의 아래쪽에 사상판을 횡단하는 후각 신경과 연관된 채널 내로 배액되며 비강 림프계 및 경부 림프절에 도달한다는 것을 기록하고 있다 (Bradbury et al., 1983; Hatterer et al., 2006; Johnston et al., 2004a); Kida et al., 1993; Walter et al., 2006a; Walter et al., 2006b). 약물은 비강내 투여 후에 이들 동일 경로를 통해 CNS에 접근할 수 있으며, 비도에서 CSF를 거쳐 뇌 간질 공간 및 뇌 전체에 걸친 분포를 위한 혈관주위 공간으로 이동한다. 이들 배액 경로는 CSF 소거의 대략 50%를 설명하는 수많은 동물 종 (양, 토끼 및 래트)에서 유의하다 (Bradbury et al., 1981; Boulton et al., 1999; Boulton et al., 1996; Cserr et al., 1992). 비도와 CSF 사이의 경로는 여전히 중요하고 인간에서 기능적이며, 이는 치료제가 비강내 전달 후에 주목할만한 정도로 혈액에 진입하지 않으면서 CSF로 직접 전달된다는 사실에 의해 입증된다 (Born et al., 2002). 수많은 비강내 연구는 약물이 비강으로부터 CSF로 직접 접근하고, 이어서 후속하여 뇌 및 척수에 분포한다는 것을 입증한다. 다수의 비강내로 적용된 분자는 CSF에 신속히 진입하고, 이러한 수송은 친지성, 분자량 및 분자의 이온화도에 좌우된다 (Dhanda et al., 2005; Born et al., 2002; Kumar et al., 1974; Sakane et al., 1995; Sakane et al., 1994; Wang et al., 2007). CSF 내로의 분포를 평가하는 것은 비강내 전달의 메카니즘에 관한 정보를 제공할 수 있다.

신경 경로를 따른 CNS로의 최적 전달은 비강의 상부 1/3의 작용제의 전달과 연관된다 (Hanson et al., 2008). 앙와위가 사용될 수 있을지라도 후각 영역을 표적화하기 위한 또 다른 위치는 머리를 숙여 앞으로 향하는 "프레잉 투 메카(praying to Mecca)" 위치 하이다. 70° 또는 90°의 헤드 각을 갖는 앙와위는 약물을 비강내 투여를 통해 전달하기 위해 비공 내로 삽입된 튜브를 사용하여 CSF로 효율적으로 전달하기에 적합할 수 있다 (van den Berg et al., (2002)).

비강내 약물 투여를 위해 점비제는 10-20분의 기간에 걸쳐 교대 비공에 1-2분마다 투여되어 용액이 비강 상피에 흡수되도록 할 수 있다 (Thorne et al., 2004; Capsoni et al., 2002; Ross et al., 2004; Ross et al., 2008; Dhuria et al., 2009a; Dhuria et al., 2009b; Francis et al., 2008; Martinez et al., 2008). 이러한 비침습적 방법은 장치를 비공 내로 삽입하는 것을 포함하지 않는다. 대신에, 점비제는 비공의 개구부에 배치되어, 개체가 점비제를 비강 내로 스니핑하게 한다. 마취된 개체에서의 다른 투여 방법은 식도를 막고 호흡 튜브를 기관 내로 삽입하여 비강 제제가 삼켜지는 것을 방지하고 호흡 곤란과 관련된 문제를 제거하는 것을 포함한다 (Chow et al., 1999; Chow et al., 2001; Fliedner et al., 2006; Dahlin et al., 2001). 가요성 튜브는 튜브 길이에 따라, 호흡 또는 후각 상피로의 소량 약물 용액의 국부 전달을 위해 비공에 삽입될 수 있다 (Chow et al., 1999; Van den Berg et al., 2003; van den Berg et al., 2004a; Banks et al., 2004; van den Berg et al., 2002; Vyas et al., 2006a; Charlton et al., 2007a; Gao et al., 2007a).

비강 전달 장치, 예컨대 스프레이, 비강 점적기 또는 무바늘 시린지가 비강의 상이한 영역에 작용제를 표적화하는데 사용될 수 있다. 옵티미스트(OptiMist)™는 폐 또는 식도에서의 침착 없이 후각 영역을 포함하는 비강으로 액체 또는 분말 비강 제제를 표적화하는 호흡 작동 장치이다 (Djupesland et al., 2006). 비아네이즈(ViaNase)™ 장치는 또한 비강의 후각 및 호흡 상피에 비강 스프레이를 표적화하는데 사용될 수 있다. 점비제는 비강 바닥에 침착되는 경향이 있으며, 신속한 점액섬모 소거에 적용되고, 반면에 비강 스프레이는 비점막의 중비도에 분포된다 (Scheibe et al., 2008).

면역 억제제 또는 면역관용제는 비경구를 포함하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 억제제 또는 면역관용제는 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해, 경구로, 척수강내로, 두개내로 또는 비강내로, 또는 지속 방출에 의해, 예를 들어 피하 이식물을 사용하여 투여될 수 있다. 면역 억제제 또는 면역관용제는 액체 담체 비히클 중에 용해 또는 분산될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 활성 물질은, 예를 들어 식물성 오일 품종, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일 등의 허용되는 비히클과 적합하게 혼합될 수 있다. 솔케탈, 글리세롤, 포르말 및 수성 비경구 제제를 사용하는 유기 조성물과 같은 다른 비경구 비히클이 또한 사용될 수 있다. 주사에 의한 비경구 적용을 위해, 조성물은 본 발명에 따른 활성 산의 수용성 제약상 허용되는 염의 수용액을, 바람직하게는 0.01-10%의 농도로 포함할 수 있으며, 임의로 또한 수용액 중 안정화제 및/또는 완충제 물질을 포함할 수 있다. 용액의 투여 단위는 유리하게는 앰플에 봉입될 수 있다.

조성물, 예를 들어 rAAV 함유 조성물, 면역 억제제 함유 조성물 또는 면역관용 조성물은 주사가능한 단위 용량의 형태일 수 있다. 이러한 주사가능한 용량을 제조하기 위해 사용가능한 담체 또는 희석제의 예는 희석제, 예컨대 물, 에틸 알콜, 마크로골, 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시이소스테아릴 알콜 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, pH 조정제 또는 완충제, 예컨대 시트르산나트륨, 아세트산나트륨 및 인산나트륨, 안정화제, 예컨대 피로아황산나트륨, EDTA, 티오글리콜산 및 티오락트산, 등장화제, 예컨대 염화나트륨 및 글루코스, 국부 마취제, 예컨대 프로카인 히드로클로라이드 및 리도카인 히드로클로라이드를 포함한다. 또한 통상의 가용화제 및 진통제가 첨가될 수 있다. 주사는 통상의 기술자에게 널리 공지된 절차에 따라 효소 또는 다른 활성물에 상기 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 상세한 논의는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용가능하다. 제약상 허용되는 제제는 수성 비히클 중에 용이하게 현탁될 수 있으며 통상의 피하 바늘을 통해 또는 주입 펌프를 사용하여 도입될 수 있다. 도입 전에, 제제는 바람직하게는 감마 방사선 또는 전자 빔 멸균으로 멸균될 수 있다.

면역 억제제 또는 면역관용제가 피하 이식물의 형태로 투여되는 경우에, 화합물은 통상의 기술자에게 공지된 서서히 분산되는 물질 중에 현탁 또는 용해되거나, 또는 삼투 펌프와 같은 일정한 구동력의 사용을 통해 활성 물질을 서서히 방출시키는 장치로 투여된다. 이러한 경우에, 연장된 기간에 걸친 투여가 가능하다.

면역 억제제 또는 면역관용제 함유 조성물이 투여되는 투여량은 폭넓은 범위 내에서 달라질 수 있고, 다양한 인자, 예컨대 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 좌우될 것이며, 개별적으로 조정되어야 할 수 있다. 1일에 투여될 수 있는 양에 대한 가능한 범위는 약 0.1 mg 내지 약 2000 mg 또는 약 1 mg 내지 약 2000 mg이다. 면역 억제제 또는 면역관용제를 함유하는 조성물은 단일 투여 단위로서 또는 다중 투여 단위로서 이들 범위 내의 용량을 제공하도록 적합하게 제제화될 수 있다. 면역 억제제를 함유하는 것 이외에도, 대상 제제는 치료 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 rAAV를 함유할 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 또 다른 의약과 조합하여 사용될 수 있다. 조성물은 통상의 형태, 예를 들어 에어로졸, 용액, 현탁액 또는 국소 적용물, 또는 동결건조 형태로 나타날 수 있다.

전형적인 조성물은 rAAV, 면역 억제제, 투과 증진제 또는 그의 조합, 및 담체 또는 희석제일 수 있는 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 예를 들어, 활성제(들)는 담체와 혼합될 수 있거나, 담체에 의해 희석될 수 있거나, 담체 내에 봉입될 수 있다. 활성제가 담체와 혼합되는 경우에, 또는 담체가 희석제로 작용하는 경우에, 담체는 활성제에 대해 비히클, 부형제 또는 배지로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체의 일부 예는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리히드록시에톡실화 피마자 오일, 땅콩 오일, 올리브 오일, 젤라틴, 락토스, 테라 알바, 수크로스, 덱스트린, 탄산마그네슘, 당, 시클로덱스트린, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 스테아르산 또는 셀룰로스의 저급 알킬 에테르, 규산, 지방산, 지방산 아민, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌, 히드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈이다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 지속 방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와의 혼합으로 포함할 수 있다.

제제는 활성제(들)와 유해하게 반응하지 않는 보조제와 혼합될 수 있다. 이러한 첨가제는 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제 및/또는 착색 물질 보존제, 감미제 또는 향미제를 포함할 수 있다. 조성물은 또한 원하는 경우에 멸균될 수 있다.

액체 담체가 사용되는 경우에, 제조물은 액체, 예컨대 수성 액체 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다. 허용되는 용매 또는 비히클은 멸균수, 링거액 또는 등장성 수성 염수 용액을 포함한다.

작용제(들)는 상기 기재된 바와 같은 적절한 용액과의 재구성에 적합한 분말로서 제공될 수 있다. 이들의 예는 동결 건조, 회전 건조 또는 분무 건조 분말, 무정형 분말, 과립, 침전물 또는 미립자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조성물은 임의로 안정화제, pH 조절제, 계면활성제, 생체이용률 조절제 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 단위 투여 형태는 개별 용기 또는 다중-용량 용기로 존재할 수 있다.

본 발명에 의해 고려되는 조성물은, 예를 들어 미셀 또는 리포솜 또는 일부 다른 캡슐화된 형태를 포함할 수 있거나, 또는 예를 들어 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리락티드-폴리글리콜리드를 사용하여 연장 방출 형태로 투여되어 장기적 저장 및/또는 전달 효과를 제공할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다.

예를 들어 폴리락트산 (PLA)의 소수성 코어 및 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜) (MPEG)의 친수성 쉘로 구성된 중합체성 나노입자는 개선된 용해도 및 CNS에 대한 표적화를 가질 수 있다. 마이크로에멀젼과 나노입자 제제 사이의 표적화에 있어서 영역 차이는 입자 크기의 차이로 인한 것일 수 있다.

리포솜은 친양쪽성 지질, 즉 인지질 또는 콜레스테롤 중 하나 이상의 지질 이중층으로 이루어진 매우 간단한 구조이다. 이중층의 친지성 모이어티는 서로를 향해 돌아 막에 내부 소수성 환경을 생성한다. 리포솜은 그들이 크기 및 기하구조에 적합된다면 지질 이중층의 비-극성 부분과 연관될 수 있는 일부 친지성 약물에 대한 적합한 약물 담체이다. 리포솜의 크기는 20 nm 내지 수 μm로 다양하다.

혼합된 미셀은 담즙 염, 인지질, 트리, 디- 및 모노글리세리드, 지방산, 유리 콜레스테롤 및 지용성 미량영양소로 구성된 효율적 세제 구조이다. 장쇄 인지질이 물에서 분산되는 경우에 이중층을 형성하는 것으로 공지된 바와 같이, 단쇄 유사체의 바람직한 상은 구형 미셀 상이다. 미셀 용액은 물 및 유기 용매에서 자발적으로 형성된 열역학적으로 안정한 시스템이다. 미셀과 소수성/친지성 약물 사이의 상호작용은 혼합된 미셀 (MM)의 형성으로 이어지고, 이는 또한 팽창 미셀로 종종 칭해진다. 인간 신체에서, 그들은 낮은 수용해도를 갖는 소수성 화합물을 포함하며 소화의 생성물, 예를 들어 모노글리세리드에 대한 저장소로서 작용한다.

지질 마이크로입자는 지질 나노- 및 마이크로구체를 포함한다. 마이크로구체는 일반적으로 약 0.2 내지 100 μm의 크기를 갖는 임의의 물질로 제조된 작은 구형 입자로서 정의된다. 200 nm 미만의 보다 작은 구체는 통상 나노구체로 칭해진다. 지질 마이크로구체는 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼과 유사한 균질 오일/물 마이크로에멀젼이며, 집중적 초음파처리 절차 또는 고압 유화 방법 (분쇄 방법)에 의해 제조된다. 천연 계면활성제 레시틴은 액체의 표면 장력을 낮추고, 이에 따라 유화제로서 작용하여 안정한 에멀젼을 형성한다. 지질 나노구체의 구조 및 조성은 지질 마이크로구체의 것과 유사하지만, 보다 작은 직경을 갖는다.

중합체성 나노입자는 폭넓게 다양한 요소에 대한 담체로서의 역할을 한다. 활성 성분은 폴리메트릭 매트릭스 중에 용해되거나 입자 표면 상에 포획 또는 흡착될 수 있다. 유기 나노입자의 제조에 적합한 중합체는 셀룰로스 유도체 및 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 그의 공중합체를 포함한다. 그의 작은 크기, 그의 큰 표면적/부피 비 및 계면의 관능화의 가능성으로 인해, 중합체성 나노입자는 이상적 담체 및 방출 시스템이다. 입자 크기가 50 nm 미만인 경우에, 그들은 다수의 생물학적 및 또한 합성 장벽 층에 의해 더 이상 입자로서 인식되지 않지만, 분자 분산 시스템과 유사한 역할을 한다.

따라서, 본 발명의 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 절차를 사용하여 개체에게 투여된 후에 활성제의 신속, 지속, 제어 또는 지연 방출 또는 그의 임의의 조합을 제공하도록 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 효소는 등장성 또는 저장성 용액 중에 존재한다. 한 실시양태에서, 수용성이 아닌 효소의 경우에, 지질 기재 전달 비히클, 예를 들어 WO 2008/049588 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것과 같은 마이크로에멀젼, 또는 리포솜이 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 제제는 에어로졸 적용을 위해 액체 담체, 예컨대 수성 담체에 용해 또는 현탁된 작용제를 함유할 수 있다. 담체는 첨가제, 예컨대 가용화제, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 계면활성제, 흡수 증진제, 예컨대 레시틴 (포스파티딜콜린) 또는 시클로덱스트린, 또는 보존제, 예컨대 파라벤을 함유할 수 있다. 예를 들어, 용해도 이외에도, 비강내 투여 후의 CNS로의 효율적 전달은 막 투과성에 좌우될 수 있다. 세포주위 수송이 크기 및 극성으로 인해 방해받는 효소의 경우에, 막 투과성을 개선하는 것은 후각 및 삼차 신경을 따른 CNS로의 세포외 수송 메카니즘을 증진시킬 수 있다. 비강 상피 내의 막 투과성을 조절하기 위한 한가지 접근법은 투과 증진제, 예컨대 계면활성제, 예를 들어 라우로일카르니틴 (LC), 담즙 염, 지질, 시클로덱스트린, 중합체 또는 치밀 접합부 조절제를 사용하는 것에 의한다.

일반적으로, 활성제는 단위 투여마다 제약상 허용되는 담체와 함께 활성 성분을 포함하는 단위 투여 형태 중에 분배된다. 통상적으로, 비강 투여에 적합한 투여 형태는 약 125 μg 내지 약 125 mg, 예를 들어 약 250 μg 내지 약 50 mg, 또는 약 2.5 mg 내지 약 25 mg의 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합하여 포함한다.

투여 형태는 매일, 또는 1일 1회 초과, 예컨대 매일 2회 또는 3회 투여될 수 있다. 대안적으로, 투여 형태는 처방 의사에 의해 바람직하다고 밝혀진 경우에, 매일보다 더 적은 빈도로, 예컨대 격일 또는 매주 투여될 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 기재될 것이다.

실시예 I

제I형 뮤코폴리사카라이드증의 뮤린 모델에서의 AAV 벡터-매개 이두로니다제 유전자 전달: CNS로의 상이한 전달 경로의 비교

제I형 뮤코폴리사카라이드증 (MPS I)은 리소솜 효소 알파-L-이두로니다제 (IDUA)의 결핍에 의해 야기된 유전성 대사 장애이다. 글리코사미노글리칸의 전신 및 비정상적 축적은 성장 지연, 기관비대, 골격 이형성증 및 심폐 질환과 연관된다. 질환의 가장 중증 형태 (후를러 증후군)를 갖는 개체는 신경변성, 정신 지체 및 조기 사망을 겪는다. MPS I에 대한 두 현행 치료 (조혈 줄기 세포 이식 및 효소 대체 요법)는 질환의 모든 중추 신경계 (CNS) 징후를 효과적으로 치료할 수는 없다.

유전자 요법에 관하여, 성체 마우스에서 AAV9의 혈관내 전달은 광범위한 직접 뉴런 표적화를 달성하지 않다는 것이 이전에 입증되었다 (문헌 [Foust et al., 2009] 참조). 이전 작업은 또한 성체 IDUA-결핍 마우스의 CNS 내로의 AAV8-IDUA의 직접 주사가 트랜스진 발현의 낮은 빈도 또는 불량한 수준을 유발하였다는 것을 제시하였다 (도 18 참조). MPS1의 치료를 위한 전임상 모델을 사용하는 하기 실시예는 놀랍게도 면역적격 성체 IDUA-결핍 마우스의 CNS 내로의 AAV9-IDUA의 직접 주사가 야생형 성체 마우스에서의 IDUA 효소 발현 및 활성과 동일하거나 그 보다 더 높은 IDUA 효소 발현 및 활성을 유발하였다는 것을 입증한다 (하기 도 15 참조).

방법

AAV9-IDUA 제조. AAV-IDUA 벡터 구축물 (MCI)은 이전에 기재되었다 (Wolf et al., 2011) (mCags 프로모터). AAV-IDUA 플라스미드 DNA는 유니버시티 오브 플로리다 벡터 코어(University of Florida Vector Core)에서 AAV9 비리온 내로 패키징되어, 밀리리터당 3 x 10¹³개 벡터 게놈의 역가를 생성하였다.

ICV 주입. 성체 Idua-/- 마우스를 케타민 및 크실라진의 칵테일 (kg당 100 mg 케타민 + 10 mg 크실라진)을 사용하여 마취하고 정위 프레임 상에 위치시켰다. AAV9-IDUA 10 마이크로리터를 해밀턴(Hamilton) 시린지를 사용하여 우측뇌실 (정위 좌표 AP 0.4, ML 0.8, 브레그마로부터 DV 2.4 mm) 내로 주입하였다. 동물을 회복을 위해 가열 패드 상의 그의 케이지로 돌려보냈다.

척수강내 주입. 어린 성체 마우스 내로의 주입은 0.2 mL 25% 만니톨의 정맥내 주사 후 20분에 L5와 L6 척추골 사이에 10 μL AAV 벡터 함유 용액의 주사에 의해 수행하였다.

면역관용. 신생 IDUA 결핍 마우스에게 5.8 μg의 재조합 이두로니다제 단백질 (알두라자임)을 함유하는 5 μL로 안면 측두 정맥을 통해 주사한 다음, 동물을 그의 케이지로 돌려보냈다.

시클로포스파미드 면역억제. 면역억제를 위해, 동물에게 AAV9-IDUA 벡터 주입 후 1일에 시작하여 시클로포스파미드를 120 mg/kg 용량으로 1주에 1회 투여하였다.

동물. 동물을 케타민/크실라진 (kg당 100 mg 케타민 + 10 mg 크실라진)으로 마취하고, 희생시키기 전에 70 mL PBS를 경심 관류하였다. 뇌를 수거하고, 얼음 상에서 소뇌, 해마, 선조체, 피질 및 뇌간/시상 ("나머지")으로 미세절제하였다. 샘플을 드라이 아이스 상에서 동결시킨 다음, -80℃에서 저장하였다. 샘플을 해동시키고, 전동 막자를 사용하여 PBS 1 mL 중에 균질화하고, 0.1% 트리톤 X-100으로 투과성이 되게 하였다. IDUA 활성은 기질로서 4MU-이두로니드를 사용하여 형광측정 검정에 의해 결정하였다. 활성은 브래드포드(Bradford) 검정 (바이오라드(BioRad))에 의해 결정된 바와 같이 단백질 mg당 단위 (1분에 생성물로 전환되는 기질 퍼센트)로서 표시된다.

조직. 조직 균질물을 에펜도르프(Eppendorf) 테이블탑 원심분리 모델 5415D (에펜도르프)를 사용하여 13,000 rpm으로 3분 동안 원심분리에 의해 청정화하고, 프로테이나제 K, DNase1 및 Rnase와 함께 밤새 인큐베이션하였다. GAG 농도는 블리스칸(Blyscan) 황산화 글리코사미노글리칸 검정 (애큐레이트 케미칼(Accurate Chemical))을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 결정하였다.

결과

도 1은 AAV가 뇌실내로 (ICV) 또는 척수강내로 (IT) 투여된 이두로니다제-결핍 마우스에 대한 실험 설계를 제시한다. 면역 반응을 예방하기 위해, 동물을 시클로포스파미드 (CP)로 면역억제시키거나, 출생 시에 인간 이두로니다제 단백질 (알두라자임)의 정맥내 투여에 의해 면역관용시키거나, 또는 이두로니다제 결핍이기도 한 NOD-SCID 면역결핍 마우스에서 주사를 수행하였다. 동물을 처리후 나타낸 시간에 희생시키고, 뇌를 미세절제하고, 추출물을 이두로니다제 활성에 대해 검정하였다.

도 2는 AAV-IDUA 벡터가 ICV 주사된 면역결핍, IDUA 결핍 동물에 대한 데이터를 예시한다. 상기 동물은 뇌의 모든 구역에서 높은 수준의 IDUA 발현 (야생형의 10 내지 100배)을 나타냈으며, 뇌간 및 시상 ("나머지")에서 가장 높은 수준이 관찰되었다.

ICV 경로에 의해 AAV 벡터가 투여된 면역억제된 동물은 면역결핍 동물과 비교하여 뇌에서 비교적 낮은 수준의 효소를 가졌다 (도 3). CP가 불량한 건강으로 인해 희생 2주 전에 중단되었기 때문에 면역억제는 이들 동물에서 손상될 수 있었다는 것을 주목한다.

도 4는 IT 경로에 의해 AAV 벡터가 투여된 면역억제된 동물에 대한 데이터를 제시한다. AAV 벡터가 ICV 투여된 면역관용된 동물은 뇌의 모든 부분에서 면역결핍 동물에서 관찰된 것과 유사한 광범위한 IDUA 활성을 나타냈으며 (도 5), 이는 면역관용 절차의 유효성을 나타낸다.

도 6은 나란히 비교하기 위한 IDUA 활성의 모든 평균 수준의 모음이고, 도 7은 뇌의 구역에 따라 군 분류된 데이터이다.

GAG 축적 물질을 모든 4개의 시험군에 대한 다양한 뇌 절편에서 검정하였다. 각 군에 대해, 뇌의 각 부분의 평균은 좌측에 제시되고, 개별 동물 각각에 대한 값은 우측에 제시된다 (도 8). IDUA 결핍 동물 (가장 좌측)은 야생형 동물 (마젠타색 막대)과 비교하여 높은 수준의 GAG를 함유하였다. GAG 수준은 AAV-처리 동물의 모든 군에서 뇌의 모든 부분에 대해 야생형 수준이거나 또는 야생형보다 낮았다. GAG 수준은 AAV9-IDUA가 척수강내로 투여된 동물의 피질 및 뇌간에서 야생형보다 유의하게는 아니지만 약간 더 높았다.

결론

결과는 선조체 및 해마에서의 IDUA 발현이 ICV 대비 IT 주사된 동물에서 더 낮기는 하였지만 전달 경로 (ICV 또는 IT)에 상관없이 뇌에서 IDUA의 높고 광범위한 분포를 제시한다. 면역결핍 마우스가 면역적격 마우스보다 더 높은 수준의 발현을 갖기 때문에 면역 반응이 있는 것처럼 보인다. ICV 주사에 관하여, CP가 초기에 중단되었을 때, IDUA 발현은 더 낮다. 추가로, 면역관용은 높은 수준의 효소 활성을 회복시키는데 효과적이었다. 또한, GAG 수준은 마우스의 모든 처리 실험군에서 정상으로 회복되었다.

실시예 II

방법

AAV9-IDUA 제조. AAV-IDUA 플라스미드는 유니버시티 오브 플로리다 벡터 코어에서 또는 유니버시티 오브 펜실베니아 벡터 코어(University of Pennsylvania vector core)에서 AAV9 비리온 내로 패키징되어, 밀리리터당 1-3 x 10¹³개 벡터 게놈의 역가를 생성하였다.

ICV 주입. 실시예 I을 참조한다.

척수강내 주입. 실시예 I을 참조한다.

면역관용. 다음 사항을 제외하고는 실시예 I에서와 같다: 다중 관용을 위해, 신생 IDUA 결핍 마우스에게 안면 측두 정맥에 제1 용량의 알두라자임을 주사하고, 이어서 6주마다 주사를 복강내로 투여하였다.

시클로포스파미드 면역억제. 실시예 I을 참조한다.

동물. 동물을 케타민/크실라진 (kg당 100 mg 케타민 + 10 mg 크실라진)으로 마취하고, 희생시키기 전에 70 mL PBS를 경심 관류하였다. 뇌를 수거하고, 얼음 상에서 소뇌, 해마, 선조체, 피질 및 뇌간/시상 ("나머지")으로 미세절제하였다. 샘플을 드라이 아이스 상에서 동결시킨 다음, -80℃에서 저장하였다.

조직 IDUA 활성. 조직 샘플을 해동시키고, 조직 균질화기에서 염수 중에 균질화하였다. 조직 균질물을 벤치탑 에펜도르프 원심분리기에서 15,000 rpm으로 4℃에서 15분 동안 원심분리에 의해 청정화하였다. 조직 용해물 (상청액)을 수집하고, IDUA 활성 및 GAG 축적 수준에 대해 분석하였다.

조직 GAG 수준. 조직 용해물을 프로테이나제 K, RNase 및 DNase와 함께 밤새 인큐베이션하였다. GAG 수준은 블리스칸 황산화 글리코사미노글리칸 검정을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분석하였다.

IDUA 벡터 카피. 조직 균질물을 문헌 [Wolf et al. (2011)]에 기재된 바와 같이 DNA 단리 및 후속 QPCR에 사용하였다.

결과

도 9는 실험 설계 및 군을 예시한다. 동물에게 AAV9-IDUA 벡터를 뇌실내 (ICV) 또는 척수강내 (IT) 주입에 의해 투여하였다. 벡터 투여는 IDUA 결핍이기도 한 NOD-SCID 면역결핍 (ID) 마우스에서, 또는 시클로포스파미드 (CP)로 면역억제시키거나, 출생 시에 인간 이두로니다제 단백질 (알두라자임)의 단일 또는 다중 주사에 의해 면역관용시킨 IDUA 결핍 마우스에서 수행하였다. 벡터로의 처리 및 희생 시간은 도 9에 나타낸 바와 같다. 모든 벡터 투여는 3-4.5개월령의 범위인 성체 동물에서 수행하였다. 동물에게 10 마이크로리터당 3 x 10¹¹개 벡터 게놈의 용량의 10 μL 벡터를 주사하였다.

도 10은 두개내 주입된, 면역결핍, IDUA 결핍 마우스에서의 IDUA 효소 활성을 제시한다. 뇌의 모든 구역에서 야생형 수준보다 30- 내지 300-배 더 높은 범위인 높은 수준의 효소 활성이 관찰되었다. 가장 높은 효소 발현은 시상 및 뇌간에서, 및 해마에서 관찰되었다.

두개내로 주사하고 시클로포스파미드 (CP)로 면역억제시킨 동물은 다른 군보다 유의하게 더 낮은 수준의 효소 활성을 입증하였다 (도 11). 그러나, 이러한 경우에 CP 투여는 동물의 불량한 건강으로 인해 희생 2주 전에 중단되어야 했다.

출생 시에 IDUA 단백질 (알두라자임)로 관용시키고 벡터를 두개내로 투여한 동물에서의 IDUA 효소 수준은 도 12에 도시된다. 모든 동물은 뇌의 모든 부분에서 면역결핍 동물에서 달성된 수준과 유사한, 야생형 수준보다 10- 내지 1000-배 더 높은 범위인 높은 효소 수준을 보였으며, 이는 면역관용 절차의 유효성을 나타낸다.

도 13은 두개내로 주사하고 매주 기준으로 CP를 투여한 마우스에서의 IDUA 효소 수준을 도시한다. IDUA의 상승된 수준이 뇌의 모든 부분에서, 특히 소뇌 및 척수에서 관찰되었다. 효소의 수준은 야생형 수준에서의 활성을 갖는 선조체 및 해마에서 가장 낮았다.

IDUA 결핍 마우스를 기재된 바와 같은 알두라자임으로 관용시키고, 벡터를 척수강내로 주사하였다 (도 14). 뇌의 모든 부분에서 광범위한 IDUA 효소 활성이 존재하였으며, 뇌간 및 시상, 후구, 척수 및 소뇌에서 가장 높은 수준의 활성을 가졌다. 도 13에서의 데이터와 유사하게, 가장 낮은 수준의 효소 활성은 선조체, 피질 및 해마에서 관찰되었다.

대조군 면역적격 IDUA 결핍 동물에게 면역억제 또는 면역관용 없이 벡터를 척수강내로 주입하였다 (도 15). 결과는 효소 활성이 야생형 수준이거나 또는 그 보다 약간 더 높더라도, 면역조절을 겪은 동물에서 관찰된 것보다 유의하게 더 낮다는 것을 나타낸다. 효소 수준의 감소는 면역조절된 동물에서 가장 높은 수준의 효소를 발현하는 구역인 소뇌, 후구 및 시상 및 뇌간에서 특히 유의하였다.

동물을 도 16에 제시된 바와 같이 GAG 축적 물질에 대해 검정하였다. 모든 군은 야생형 동물에서 관찰된 것과 유사한 GAG 수준을 갖는 GAG 축적의 소거를 입증하였다. 면역억제시키고 AAV9-IDUA 벡터를 척수강내로 주사한 동물은 피질에서 야생형보다 약간 더 높은, 그러나 비처리된 IDUA 결핍 마우스보다는 훨씬 더 낮은 GAG 수준을 가졌다.

면역관용시키고 벡터를 두개내로 또는 척수강내로 주사한 동물에서의 AAV9-IDUA 벡터의 존재를 도 16에 예시된 바와 같이 QPCR에 의해 평가하였다. 세포당 IDUA 카피는 척수강내로 주입한 동물과 비교하여 두개내로 주입한 동물에서 더 높았으며, 이는 두개내로 주사한 동물에서 관찰된 보다 높은 수준의 효소 활성과 일치하였다.

결론

IDUA의 높고 광범위한 치료 수준은 성체 마우스에서 뇌실내 및 척수강내 경로의 AAV9-IDUA 투여 후에 뇌의 모든 구역에서 관찰되었다. 효소 활성은 야생형 수준으로 회복되었거나 또는 AAV-IDUA를 척수강내로 주입한 면역적격 IDUA 결핍 동물에서 약간 더 높았다. 유의하게 더 높은 수준의 IDUA 효소는 출생 시에 IDUA 단백질의 투여에 의해 시작하여 면역관용시킨 동물에서 벡터 주사의 양쪽 경로에 대해 관찰되었다.

실시예 III

성체 면역적격 IDUA 결핍 마우스 (12주령)를 케타민/크실라진으로 마취하고, 이어서 AAV9-IDUA 벡터의 비강내 주입을 수행하였다. 벡터는 마이크로피펫을 사용하여 8회의 3 μL 점적을 비강내 비공 사이에 교대로, 각 적용 사이에 2분의 간격으로 적용하여 투여하였다. 총 2.4-7 x 10¹¹개 벡터 게놈을 벡터의 공급원에 따라 각 성체 동물에 투여하였다. AAV9-IDUA 벡터에 의해 생산된 인간 IDUA에 대한 마우스 면역 반응을 억제하기 위해, 동물을 벡터 투여 후의 날에 시작하여 매주 120 mg/kg 시클로포스파미드 투여로 면역억제시켰다. 그러나, 인간 대상체에서의 면역억제는 임의적이고 통상의 기술자는 우수한/표준 의료 실시에 따라, 언제 이를 사용하는 지를 알 것이다. 마우스를 벡터 주입후 12주에 희생시키고, 동물을 뇌에서의 IDUA 효소 발현 및 벡터 카피에 대해 검정하였다 (도 19 및 20).

실시예 IV

제I형 인간 뮤코폴리사카라이드증 (MPS I)을 위한 모델인 이두로니다제-결핍 마우스에게 AAV9-IDUA의 대략 10¹¹개 벡터 카피를 비강내로 투여하였다. 4주 후에 동물을 희생시키고 뇌를 미세절제하고 이두로니다제 효소 검정을 위해 추출하였다. 도 22에 제시된 바와 같이 (좌측은 평균 +/- 표준 편차, 우측은 개별 동물임), 높은 수준의 IDUA 효소 활성 (야생형보다 거의 100배 더 큼)을 후구에서 관찰하였으며, 효소의 야생형 수준을 뇌의 다른 모든 구역에서 관찰하였다. 도 23은 GAG 활성을 나타낸다.

유사하게 처리된 동물을 희생시키고 조직 절편을 항-IDUA 항체를 사용하여 인간 IDUA 단백질의 존재에 대해 염색하였다. 도 24에 제시된 바와 같이, 좌측에 4마리의 비강내 벡터-처리된 동물의 비강 상피 및 후구에서 관찰된 IDUA 단백질의 강건한 염색이 있는 반면에, 우측에 투여되지 않은 정상 대조군 또는 IDUA-결핍 동물에서 관찰된 염색은 없었다. AAV-MCI 처리 동물의 뇌의 다른 부분 (해마, 소뇌, 피질, 선조체, 시상 및 뇌간)에서 관찰된 염색은 없었으며, 이는 형질도입이 후구 및 비강 상피에 제한되었다는 것을 입증한다.

동물을 형질도입된 세포의 위치를 확인하는 리포터 시스템으로서 AAV9-GFP 벡터의 대략 10¹¹개 벡터 게놈으로 비강내로 처리하였다. 동물을 2주 후에 희생시키고, 조직을 수집하고 절편을 항-GFP 항체 (녹색)를 DAPI 염색 (청색)과 함께 사용하여 GFP 발현에 대해 염색하여 세포 핵을 확인하였다 (도 25). 비처리된 대조군 (후각 상피의 경우 우측 패널 및 후구의 경우 하단 패널)과 비교하여 처리된 동물의 후각 상피 (좌측 2개의 패널) 및 후구 (상단 2개의 패널) 둘 다에서 관찰된 GFP 단백질의 강건한 염색이 있었다. 뇌의 어떠한 다른 부분에서도 관찰된 GFP 염색은 없었다. 이들 결과는 IDUA 염색의 결과와 일치하고, 이는 AAV9-MCI 벡터의 비강내 투여 후 AAV 매개 유전자 전달 및 발현이 비강 상피 및 후구에 제한되었다는 것을 입증한다. 이들 결과는 IDUA의 야생형 수준이 AAV9-MCI 벡터의 비강내 투여 후 뇌의 모든 구역에서 달성되는 메카니즘으로서 전뇌에서 높은 수준에서 발현된 IDUA의 확산을 연루시킨다. 전뇌에서의 비-침습적 비강내 AAV 벡터 투여에 의한 높은 수준의 치료 단백질 발현과 뇌 전반에 걸친 후속 확산을 달성하기 위한 이 접근법은 MPS 및 관련 대사 질환의 치료뿐만 아니라, 보다 흔한 다른 신경계 장애 예컨대 파킨슨병 및 알츠하이머병의 치료에 적용가능하다.

실시예 V

제II형 뮤코폴리사카라이드증 (MPS II; 헌터 증후군)은 이두로네이트-2-술파타제 (IDS)의 결핍 및 글리코사미노글리칸 (GAG) 더마탄 및 헤파란 술페이트의 후속 축적에 의해 유발된 X-연관 열성 유전성 리소솜 축적 질환이다. 이환 개체는 소정 범위의 중증도의 물리적, 신경학상 징후, 및 단축된 기대 수명을 나타낸다. 예를 들어, 이환 개체는 소정 범위의 중증도의 징후 예컨대 기관비대, 골격 이형성증, 심폐 폐색, 신경인지 결핍, 및 단축된 기대 수명을 나타낸다. 현재 MPS II를 위한 치유법은 없다. 현행 표준 관리는 질환 진행을 관리하는데 사용되는 효소 대체 요법 (ELAPSRASE; 이두르술파제)이다. 그러나, 효소 대체 요법 (ERT)은 신경학적 개선을 유발하지 않는다. 조혈성 줄기 세포 이식 (HSCT)은 MPS II에 대해 신경학적 이익을 나타내지 않기 때문에, 현재 이 질환의 신경계 징후를 나타내는 환자를 위한 임상 수단이 없으며, 새로운 요법이 필연적으로 요구된다.

처리된 동물에서 뇌에서의 IDS 수준을 회복하고 신경인지 결핍의 출현을 예방하기 위해 MPS II 마우스의 중추 신경계로의 인간 IDS 코딩 서열 (AAV9-hIDS)의 전달을 위한 AAV9 벡터가 개발된다 (도 27a). 특히, 술파타제 활성 부위의 활성화에 필요한 인간 술파타제 변형 인자-1 (SUMF-1)과 함께 또는 없이 인간 IDS를 코딩하는 일련의 벡터를 생성하였다. 3개의 투여 경로를 이들 실험에 사용하였다: 척수강내 (IT) (도 28-29), 뇌실내 (ICV) (도 30a-d) 및 정맥내 (IV) (도 28-29). 투여 경로에 상관없이, hIDS를 단독으로 형질도입하는 AAV9 벡터로 처리된 마우스와 인간 IDS 및 SUMF-1을 코딩하는 AAV9 벡터로 처리된 마우스 사이에서 효소 수준에서의 유의한 차이가 발견되지 않았다. IT-투여된 NOD.SCID (IDS Y+) 및 C57BL/6 (IDS Y+)은 비처리된 동물과 비교할 때 뇌 및 척수에서 상승된 IDS 활성을 나타내지 않은 반면에, 혈장은 비처리된 동물보다 10-배 더 높은 (NOD.SCID) 수준 및 150-배 더 높은 (C57BL/6) 수준을 나타냈다. AAV9-hIDS가 정맥내로 투여된 IDS-결핍 마우스는 모든 기관에서 야생형과 대등한 IDS 활성을 나타냈다. 더욱이, IV 주사된 동물의 혈장은 야생형보다 100-배 더 높은 효소 활성을 나타냈다. AAV9-hIDUA ICV가 투여된 IDS-결핍 마우스는 뇌 및 말초 조직의 대부분 구역에서 야생형과 대등한 IDS 활성을 나타낸 반면에, 뇌의 일부 부분은 야생형보다 2- 내지 4-배 더 높은 활성을 나타냈다. 또한, 혈장에서의 IDS 활성은 야생형보다 200-배 더 높았다. 놀랍게도, 처리된 모든 동물의 혈장에서의 IDS 효소 활성은 주사후 적어도 12주 동안의 지속성을 나타냈고; 따라서, IDS 효소는 적어도 C57BL/6 뮤린 배경 상에서 면역원성이 아니었다. 추가의 신경행동 시험을 반즈 미로를 사용하여 수행하여 비처리된 MPS II 동물의 신경인지 결핍을 야생형 한배새끼의 것과 구별하였다. 이환 동물의 학습 능력이 한배새끼에서 관찰된 것보다 명백하게 더 느리다는 것을 발견하였다. 따라서, 반즈 미로를 MPS II 뮤린 모델에서의 이들 요법의 이익을 다루는데 사용한다 (도 31a-b 및 32). 이들 결과는 MPS II에서의 신경계 결핍을 예방하기 위한 CNS로의 AAV9 매개 인간 IDS 유전자 전달의 치료 이익의 잠재력을 나타낸다.

요약하면, AAV9-hIDS의 뇌실내 (ICV) 주사는 뇌에서의 IDS의 야생형 수준을 포함하는, IDS 효소 결핍의 전신 보정을 유발하였다. hIDS와 hSUMF-1의 공동-전달은 조직에서의 IDS 활성을 증가시키지 않았다. hIDS 발현은 WT 및 MPS II C57BL/6 마우스에서 비-면역원성이었다.

실시예 VI

제I형 뮤코폴리사카라이드증 (MPS I)은 α-L-이두로니다제 (IDUA)의 결핍에 의해 유발된 유전성 상염색체 열성 대사 질환이며, 헤파린 및 더마탄 술페이트 글리코사미노글리칸 (GAG)의 축적을 유발한다. 질환의 가장 중증 형태 (후를러 증후군)를 갖는 개체는 10세까지 신경변성, 정신 지체, 및 사망을 겪는다. 이 질환을 위한 현행 치료는 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 및 효소 대체 요법 (ERT)을 포함한다. 그러나, 이들 치료는 질환의 CNS 징후를 해결하는데 충분히 효과적이지 않다.

목적은 현행 ERT 및 HSCT를 CNS로의 IDUA 유전자 전달로 보충하여, 이에 의해 질환의 신경계 징후를 예방함으로써 중증 MPS I을 위한 요법을 개선시키는 것이다. 이 연구에서, CNS에서 IDUA 유전자의 전달 및 발현을 위해 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 정맥내로 투여된 AAV 혈청형 9 및 rh10 (AAV9 및 AAVrh10)의 능력을 시험하였다 (도 33). 4-5개월령의 성체 MPS I 동물에게 인간 IDUA 유전자를 코딩하는 AAV9 또는 AAVrh10 벡터를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주입하였다. 혈액 및 소변 샘플을 동물을 주사후 10주에 희생시킬 때까지 매주 기준으로 수집하였다. 처리된 동물에서의 혈장 IDUA 활성은 주사후 3주에 이형접합 대조군의 것보다 근접하게 1000-배 더 높다 (도 34). 뇌, 척수, 및 말초 기관을 IDUA 활성, GAG 축적의 클리어런스, 및 조직 절편의 IDUA 면역형광에 대해 분석하였다 (도 34-36). 처리된 동물은 CNS를 포함하는 모든 기관에서의 IDUA 효소 활성의 광범위한 회복을 입증하였다. 이들 데이터는 MPS I의 CNS 징후를 상쇄시키는데 있어서 전신 AAV9 및 AAVrh10 벡터 주입의 유효성을 입증한다.

실시예 VII

제I형 뮤코폴리사카라이드증 (MPS I)은 α-L-이두로니다제 (IDUA)의 결핍에 의해 유발된 진행성, 전신, 유전성 대사 질환이다. 이 질환의 가장 중증 형태 (후를러 증후군)는 10세까지 사망을 유발한다. 이 질환을 위한 현행 치료는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 리소솜 효소의 불능으로 인한 CNS 질환을 치료하는데 효과적이지 않다. 목적은 AAV-매개 유전자 전달 및 IDUA의 발현에 의해 현행 요법을 보충하고, 질환의 CNS 징후를 치료하는 것이다.

CNS 질환의 치료를 위한 비-침습적 및 효과적인 접근법은 IDUA-코딩 AAV9 벡터의 비강내 투여에 의해 이루어졌다. 성체 IDUA-결핍 마우스를 출생 시에 인간 이두로니다제로 면역관용시켜, 항-IDUA 면역 반응을 예방하였고, 3개월령에 CAGS (CMV 인핸서/β-액틴 프로모터/글로빈 인트론) 조절된 AAV9-IDUA 벡터를 비강내로 주입하였다. 주입후 3개월에 희생된 동물은 후구에서 야생형의 것의 100-배인 IDUA 효소 활성 수준을 나타냈으며, 뇌의 다른 모든 부분에서 효소의 야생형 수준을 회복하였다 (도 37). AAV9-IDUA를 사용한 비강내 처리는 또한 뇌의 모든 부분에서 조직 GAG 축적 물질의 감소를 유발하였다 (도 38). 반즈 미로를 사용한 신경인지 시험은 처리된 IDUA-결핍 마우스가 정상 대조군 동물과 상이하지 않은 반면에, 비처리된 IDUA-결핍 마우스는 유의한 학습 결핍을 나타냈다는 것을 입증하였다 (도 40). 이환되지 않은 이형접합 동물은 이 시험에서 개선된 성능을 나타낸 반면에 MPS I 마우스는 탈출 위치를 찾는데 있어서 결핍을 나타냈다. 현저하게, AAV9-IDUA로 비강내로 처리된 MPS I 마우스는 이형접합 대조군과 유사한 행동을 나타냈으며, 이는 비처리된 MPS I 동물에서 보여진 신경인지 결핍의 예방을 입증한다 (도 40d).

비강 상피 및 후구의 조직 절편에서 관찰된 강한 IDUA 면역형광 염색이 있었지만, 뇌의 다른 부분에서 염색은 관찰되지 않았다 (도 39a-b). 이는 IDUA 효소의 광범위한 분포가 후구 및 비강 상피에서의 형질도입 및 IDUA 발현의 부위로부터의 뇌의 보다 깊은 구역 내로의 효소 확산의 가장 가능성 있는 결과라는 것을 나타낸다. 뇌 전반에 걸친 접근, 전달 및 벡터 분포를 증가시키기 위해, IDUA-결핍 동물을 흡수 증진제의 비강내 주입으로 전처리하였다. 전처리 후 상이한 시점에서, 동물에게 IDUA를 코딩하는 AAV9 또는 AAVrh10 벡터를 비강내로 주입하였다. 동물을 주입후 2개월에 희생시켰고, 뇌를 미세절제하고, IDUA 효소 활성, 글리코사미노글리칸의 클리어런스, 및 IDUA 및 GFP에 대한 면역형광 염색에 대해 검정하였다. 비강내 AAV9-IDUA 투여에 대한 이러한 신규, 비-침습적 전략은 MPS I 및 다른 리소솜 질환의 CNS 징후를 치료하는데 잠재적으로 사용될 수 있다.

실시예 VIII

제I형 뮤코폴리사카라이드증 (MPS I)은 알파-L-이두로니다제 (IDUA)의 결핍에 의해 유발된 상염색체 열성 리소솜 축적 질환이며, 글리코사미노글리칸의 축적을 유발한다. 질환의 징후는 전신 장애, 및 질환의 중증 형태 (후를러 증후군), 10세까지 사망을 포함한다. 현재 사용되는 치료, 예컨대 효소 대체 요법 및 동종 조혈 줄기 세포 이식은, CNS 치료에 효과적이지 않은 것으로 보인다. 이 연구에서 본 발명자들은 MPS I의 녹아웃 마우스 모델에서 CNS로 IDUA 유전자 (AAV9-IDUA)를 형질도입하는 아데노-연관 바이러스 혈청형 9 벡터의 척수강내 전달을 사용하였다. 이 연구의 목적은 MPS I 질환과 연관된 병리학적 신경화학 변화를 예방하는 AAV-매개 유전자 요법의 능력을 평가하는 것이었다.

방법

IDUA가 결핍된 C57BL/6 녹아웃 마우스를 후를러 증후군의 널리-확립된 모델로서 사용하였다. AAV9-IDUA 벡터를 12주령의 MPS I 마우스로 척수강내로 전달하였다. AAV 투여 전에, 마우스에게 만니톨을 주사하여 혈액-뇌 장벽을 개방하고 라로니다제로 면역관용시켜 항-IDUA 면역 반응을 예방하였다. 생체내 ¹H MR 스펙트럼을 9개월령의 AAV9-IDUA 유전자 처리된 MPS I 마우스 (MPS I 처리, N = 11), 비처리된 MPS I 마우스 (MPS I, N = 12) 및 이형접합 한배새끼 (대조군, N = 12)의 해마 및 소뇌로부터 획득하였다. ¹H MRS 데이터를 FASTMAP 보정 및 VAPOR 물 억제와 조합된 초단 TE STEAM (TE = 2 ms) 국재화 서열을 사용하여 9.4T에서 획득하였다. 대사물을 기준 세트에 포함된 신속 이완 거대분자의 스펙트럼을 갖는 LC모델을 사용하여 정량화하였다. 자발적으로 호흡하는 동물을 1.0 - 1.5% 이소플루란으로 마취시켰다.

결과

이 연구에서 일관되게 달성된 스펙트럼 품질은 15종의 뇌 대사물의 신뢰할만한 정량화를 가능하게 하였다. 대조군에 비해 아스코르베이트 (Asc, +0.6 μmol/g, p = 0.003) 및 N-아세틸아스파르틸글루타메이트 (NAAG, +0.3 mol/g, p = 0.015) 농도에서의 작지만 유의한 증가를 비처리된 MPS I 마우스의 해마에서 관찰하였다. 또한, 증가된 글루타티온 수준 (GSH, +0.2 μmol/g, p = 0.054)의 경향을 관찰하였다. 비처리된 MPS I 마우스와 대조군의 소뇌 신경화학 프로파일 사이의 차이는 NAAG에서의 증가 (0.25 μmol/g, p = 0.026) 및 포스포에탄올아민에서의 감소 (PE, -0.44 μmol/g, p = 0.04)를 포함한다. AAV9-IDUA로 처리된 MPS I 마우스의 신경화학 프로파일은 대조군 마우스의 것과 현저한 유사성을 나타냈다 (도 42a-b). 처리된 MPS I 마우스의 해마에서, Asc, NAAG 및 GSH의 수준은 정상화되었고; 단지 락테이트 (Lac)만 대조군에 비해 작은 차이를 나타냈다. 처리된 MPS I 마우스의 소뇌에서, PE는 정상화되었지만 NAAG 수준은 아니었다. 처리된 및 대조군 마우스 사이의 작지만, 유의한 차이를 Asc, Lac 타우린 (Tau) 및 총 크레아틴 (Cr+PCr)에 대해 관찰하였다. Asc를 제외하고는, 처리된 MPS I 마우스에서의 대사물 농도의 변화는 항상 비처리군에서 관찰된 것과 반대였다. 또한, 비처리된 MPS I 마우스 및 대조군 사이의 유의한 변화를 나타내지 않은 다수의 대사물 (예를 들어 글루코스, 글루타메이트, NAA)의 경우에 처리된 MPS I 마우스에서 발견된 대사물 수준은 비처리된 MPS I 마우스보다 대조군에 근접하였던 것으로 보인다.

논의

비처리된 MPS I 마우스의 해마에서의 Asc의 유의하게 증가된 농도 및 증가된 GSH에 대한 경향은 리소솜 질환에서 보고된 산화성 스트레스에 대한 보호 반응을 나타낸다. 소뇌에서 PE가 감소된 반면 비처리된 MPS I 마우스의 뇌 영역 모두에서의 증가된 NAAG는 탈수초화를 나타낼 수 있다. 감소된 PE 및 증가된 NAAG의 유사한 패턴을 변경된 수초화가 확인된 철 결핍 모델에서 관찰하였다. 비처리된 MPS I 및 대조군 마우스의 것에 대한 처리된 MPS I 마우스의 해마 및 소뇌 신경화학 프로파일의 비교는 AAV9의 척수강내 전달을 사용한 CNS로의 결여 IDUA 유전자의 직접 전달 (12주령)이 이 MPS I 마우스 모델에서 신경변성 과정과 연관된 신경화학 변경을 예방하였다 (9개월령)는 것을 명백하게 입증한다. 이들 신경화학 결과는 MPS I의 마우스 모델에서 시험된 유사한 유전자 요법 접근법과 일치한다.

CNS로의 직접 AAV9-IDUA 전달에 기초한 유전자 요법은 MPS I의 이 마우스 모델과 연관된 산화성 스트레스 및 탈수초화가 예방될 수 있다는 것을 나타낸다.

참고문헌

모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 상기 명세서에서, 본 발명은 특정 바람직한 실시양태들과 관련되어 기재되었고, 다수의 상세사항이 예시의 목적으로 기술되었으나, 본 발명이 추가의 실시양태를 허용하고 본원의 특정 상세사항은 본 발명의 기본 원리로부터 벗어남 없이 상당히 달라질 수 있다는 점은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

Claims (21)

1. 리소솜 축적 질환을 갖는 포유동물에게, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 투여되지 않은 뮤코폴리사카라이드증을 갖는 포유동물에 비해 뇌 전반에 걸쳐 신경인지를 증진시키거나 또는 신경병리상태를 감소시키는데 효과적인, 리소솜 축적 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 rAAV 벡터의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 중추 신경계에서 신경인지를 증진시키거나 또는 신경병리상태를 감소시키는 방법.
2. 리소솜 축적 질환을 갖는 포유동물에게 리소솜 축적 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 신경인지 기능장애 또는 신경병리상태를 예방 또는 억제하는 방법.
3. 중추 신경계에서의 리소솜 축적 효소 결핍의 상호-보정을 필요로 하는 포유동물에게 상기 포유동물에서의 발현이 상호-보정을 제공하는 리소솜 축적 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터의 유효량을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 중추 신경계에서의 리소솜 축적 효소 결핍의 상호-보정을 제공하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 면역억제제로 치료되지 않는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 면역억제제로 치료되는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 면역 억제제가 시클로포스파미드를 포함하는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 면역 억제제가 글루코코르티코이드, 알킬화제, 항대사물, 세포독성 항생제를 포함하는 세포증식억제제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대해 활성인 작용제를 포함하는 것인 방법.
8. 제5항에 있어서, 면역 억제제가 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라시클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- (CD25-) 또는 CD3-지정 항체, 항-IL-2 항체, 시클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α (종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함하는 것인 방법.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 및 면역 억제제가 공-투여되거나 또는 면역 억제제가 rAAV 후에 투여되는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 rAAV의 투여 전에 면역관용되지 않는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 rAAV의 투여전에 면역관용되는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 면역적격 성체인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 rAAV1, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAVrh10, 또는 rAAV9 벡터인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 산물이 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-술파타제, 헤파란 술페이트 술파타제, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, 베타-헥소사미니다제, 알파-갈락토시다제, 베타갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제 또는 글루코세레브로시다제인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 알파-L-이두로니다제가 결핍된 것인 방법.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 제I형 뮤코폴리사카라이드증 장애, 제II형 뮤코폴리사카라이드증 장애 또는 제VII형 뮤코폴리사카라이드증 장애를 갖는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량이 투여되는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 매주 투여되는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 양이 성장 지연을 억제하거나, 간비장비대를 억제하거나, 심폐 질환을 억제하거나, 또는 골격 이형성증을 억제하거나, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 rAAV9 또는 rAAVrh10인 방법.

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