CN108367055A - 用于治疗性递送到中枢神经系统的腺相关物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种预防、抑制或治疗与中枢神经系统的疾病相关的一或多种症状的方法，所述方法通过在鼻内、鞘内、脑血管内或静脉内投与编码与所述疾病相关的基因产物的rAAV实现，例如针对哺乳动物，其中所述基因产物不存在或相对于未患所述疾病的哺乳动物以较低水平存在，例如使用提供交叉校正的有效量。

Description

用于治疗性递送到中枢神经系统的腺相关物
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月15日申请的美国申请第62/162,174号、2015年11月6日申请的第62/252,055号、2016年3月1日申请的第62/301,980号以及2016年5月3日申请的第62/331,156号的申请日的权益，各揭示内容以引用的方式并入本文中。
有关政府权利的声明
本发明是依据由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的HD032652和DK094538，在政府支持下进行。美国政府在本发明中享有一定权利。
背景技术
粘多糖贮积病(MPS)是由糖胺聚糖(GAG)分解代解中断，导致其在溶酶体中积累而引起的一组11种贮积疾病(穆恩泽(Muenzer),2004；穆诺兹-罗杰斯(Munoz-Rojas)等人,2008)。具有不同严重程度的表现包括内脏增大、骨骼发育不良、心脏和肺阻塞以及神经功能恶化。对于MPS I，即，艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏，严重程度范围从轻度(谢氏综合症(Scheie syndrome))到中度(贺-谢二氏(Hurler-Scheie))，乃至重度(贺氏综合症)，其中后者导致神经功能缺失并且在15岁时死亡(穆恩泽,2004；穆诺兹-罗杰斯等人,2008)。MPS疗法的最主要部分是姑息剂。然而，对于包括贺氏综合症在内的一些MPS疾病来说，同种异体造血干细胞移植(HSCT)已展现功效(克维特(Krivit),2004；奥查德(Orchard)等人,2007；彼得斯(Peters)等人,2003)。另外，对于越来越多的MPS疾病，酶替代疗法(ERT)正变得可用(布雷迪(Brady),2006)。一般来说，HSCT和ERT引起贮积物质的清除以及周围病状的改善，不过在治疗后仍遗留一些问题(骨骼、心脏、角膜混浊)。这些细胞和酶疗法中的主要难题是在处理神经系统表现方面的效用，因为在周围投与的酶不能穿透血脑屏障，并且已经发现HSCT对于一些而非全部的MPS具有益处。
对于开发细胞和分子疗法来说，MPS I是研究最充分的MPS疾病之一。同种异体HSCT的效用最可能是代谢交叉校正的结果，由此缺失的酶从供体源性细胞释放，并且随后被宿主细胞吸收并运送到溶酶体，在其中所述酶促进溶酶体代谢(弗拉托尼(Fratantoni)等人,1968)。随后观察周围器官，例如肝和脾中GAG贮积物质的清除，存在心肺阻塞的缓解以及角膜混浊的改善(奥查德等人,2007)。特别重要的是同种异体干细胞移植对MPS疾病中神经系统表现的出现的影响。就这一点而言，若干MPS疾病证实，相较于未移植的患者，移植有同种异体干细胞的个体面临改善的结果(波拉克(Bjoraker)等人,2006；克维特,2004；奥查德等人,2007；彼得斯等人,2003)。解释同种异体造血干细胞移植的神经系统益处的一个重要假设是，供体源性造血细胞(最可能是微神经胶质细胞)(赫斯(Hess)等人,2004；安格尔(Unger)等人,1993)穿透到中枢神经系统中，其中缺失的酶是由移植的细胞表达，从这一点开始，所述酶扩散到CNS组织中并且参与贮积物质的清除。因此，提供给CNS组织的酶含量局限于由移植到脑中的供体源性细胞表达和释放的量。尽管此类移植对于MPS I具有较大益处，但是接受者仍继续展现低于正常的IQ和减弱的神经认知能力(齐格勒(Ziegler)和夏皮罗(Shapiro),2007)。
代谢交叉校正现象还解释了ERT对于若干溶酶体贮积病(布雷迪,2006)，最值得注意的是MPS I的效用。然而，由于需要通过特定溶酶体贮积病(LSD)中缺失的酶来穿透血脑屏障(BBB)以便有效地到达CNS，故尚未观察到酶疗法对于溶酶体贮积病(LSD)的神经系统表现的效用(布雷迪,2006)。酶几乎总是太大并且一般带太多电荷而无法有效地穿过BBB。这就引起针对侵入性鞘内酶投与的研究(迪克逊(Dickson)等人,2007)，对于所述投与，其效用已在犬类动物MPS I模型中得到证实(卡基斯(Kakkis)等人,2004)并且正在开始针对MPS I的人类临床试验(帕斯托(Pastores),2008；穆诺兹-罗杰斯等人,2008)。酶疗法的关键缺点包括其费用庞大(>$200,000/年)并且需要重复输注重组蛋白。当前有关鞘内IDUA投与的临床试验被设计成每三个月仅注射一次酶，因此，这一给药方案的效用仍不确定。
发明内容
本发明的方法中采用的AAV载体适用于递送基因至CNS。在一个实施例中，本发明提供通过AAV鼻内递送治疗性蛋白质至CNS，例如以预防、抑制或治疗神经认知功能障碍或神经疾病。如本文所述，鼻内递送载体导致前脑(嗅球)转导和治疗性蛋白质表达。蛋白质扩散至脑的所有区域。因此，使用鼻内递送AAV载体表达例如分泌性蛋白允许治疗多种不同神经系统病症，例如MPS I、MPS II、MP SIII、其它代谢疾病，包括帕金森氏病和阿尔茨海默氏病等等。举例来说，分析来自脑所有显微解剖部分的提取物展示整个脑中广泛分布通过rAAV的α-L-艾杜糖醛酸酶递送。
在一个实施例中，rAAV经鞘内(IT)、血管内(IV)、脑室内(ICV)或鼻内(IN)递送至哺乳动物以预防、抑制或治疗神经认知功能障碍或神经疾病。在一个实施例中，鼻内投与导致通过代谢交叉校正非侵入性直接投与至CNS。在一个实施例中，哺乳动物经历免疫抑制。在一个实施例中，哺乳动物经历耐受化。
在一个实施例中，待用特定基因预防、抑制或治疗的疾病包括但不限于MPS I(IDUA)、MPS II(IDS)、MPS IIIA(乙酰肝素-N-硫酸酯酶；sulfaminidase)、MPS IIIB(α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶)、MPS IIIC(乙酰基-CoA:α-N-乙酰基-氨基葡糖苷乙酰基转移酶)、MPS IIID(N-乙酰基葡糖胺6-硫酸酯酶)、MPS VII(β-葡糖苷酸酶)、戈谢(Gaucher)(酸β-葡糖苷酶)、α-甘露糖苷贮积症(α-甘露糖苷酶)、β-甘露糖苷贮积症(β-甘露糖苷酶)、α-岩藻糖苷贮积症(α-岩藻糖苷)、唾液酸贮积症(α-唾液酸酶)、半乳糖唾液酸贮积症(组织蛋白酶A)、天冬氨酰葡糖胺尿症(天冬氨酰葡糖胺酶)、GM1-神经节苷脂贮积病(β-半乳糖苷酶)、Tay-Sachs(β-己糖胺酶亚基α)、山多夫氏病(Sandhoff)(β-己糖胺酶亚基β)、GM2-神经节苷脂贮积病/变异型AB(GM2活化剂蛋白质)、Krabbe(半乳糖脑苷脂酶)、异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A)，及其它神经系统病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病(表达抗体，如β-淀粉样蛋白的抗体，或攻击与阿尔茨海默氏病相关的斑和纤丝的酶)，或阿尔茨海默氏病和帕金森氏病(表达神经保护性蛋白质，包括但不限于GDNF或神经营养因子)。
因此，描述在有需要的哺乳动物中预防、抑制和/或治疗与中枢神经系统(CNS)疾病相关的例如一或多种症状的方法。所述方法涉及向需要治疗的哺乳动物的CNS递送包含有效量的包含编码基因产物(例如治疗性基因产物)的开放阅读框架的重组腺相关病毒(rAAV)载体的组合物。可由rAAV载体编码的目标基因产物包括但不限于α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、β-己糖胺酶、α-半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或葡糖脑苷脂酶，以及上文所揭示的那些。可使用本文所揭示的方法预防、抑制或治疗的疾病包括但不限于I型粘多糖贮积病症、II型粘多糖贮积病症或VII型粘多糖贮积病症，以及上文所列的病症。AAV载体可通过多种方式投与以确保其递送到CNS/脑，并且转基因在个体的CNS/脑中成功地转导。递送到CNS/脑的途径包括但不限于鞘内投与、颅内投与(例如脑室内投与或侧脑室投与)、鼻内投与、血管内投与以及实质内投与。
在一个实施例中，所述方法涉及向需要治疗的成年哺乳动物的CNS递送包含有效量的包含编码基因的开放阅读框架的rAAV血清型9(rAAV9)载体的组合物。在一个实施例中，所述方法涉及向需要治疗的成年哺乳动物的CNS递送包含有效量的包含编码IDUA的开放阅读框架的rAAV9载体的组合物。这些方法是部分基于发现AAV9载体可在成年个体的脑/CNS中高效地转导治疗性转基因，使酶水平恢复到野生型水平(参见图15，见下文)。鉴于先前的研究证实在成年小鼠中血管内递送AAV9无法实现广泛的直接神经元靶向(参见福斯特(Foust)等人,2009)，以及有另外的数据显示将AAV8-IDUA直接注射到成年IDUA缺陷小鼠的CNS中引起较差的转基因表达(图18)，使用AAV9获得的结果是出人意料的。本文所描述的实例使用临床前模型用于治疗MPS1，一种由溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏引起的遗传性代谢病症。所述实例证实，将AAV9-IDUA直接施用到具有免疫能力的成年IDUA缺陷小鼠的CNS中引起与野生型成年小鼠的IDUA酶表达和活性相同或比其更高的IDUA酶表达和活性(参见图15，见下文)。
在本发明的另一个实施例中，实例还证实，诱导免疫抑制作用或免疫耐受作用的辅助疗法，或免疫缺陷动物的治疗可实现甚至更高的IDUA酶表达和活性水平。在一个实施例中，除包含编码基因产物(例如IDUA)的开放阅读框架的rAAV载体以外，还用免疫抑制剂治疗具有促进中和酶活性的免疫反应的基因型的患者(参见例如巴贝尔(Barbier)等人,2013)。
新生IDUA-/-小鼠是不具有免疫能力的。向新生IDUA-/-小鼠投与AAV8-IDUA引起IDUA表达(伍尔夫(Wolf)等人,2011)，因此使动物耐受IDUA。如本文中所描述，使用不同投与途径显示了通过将AAV直接输注到中枢神经系统中实现AAV介导的基因转移对成年(具有免疫能力的)小鼠的适用性。举例来说，通过在具有免疫能力的、免疫缺陷(NODSCID/IDUA-/-)、用环磷酰胺(CP)免疫抑制或通过从出生开始每周一次注射人类艾杜糖醛酸酶蛋白质(Aldurazyme)进行免疫耐受化的成年IDUA缺陷小鼠的侧脑室中直接注射来投与AAV9-IDUA。另外，在利用和不利用甘露醇破坏血脑屏障的情况下，还通过鼻内输注，通过鞘内注射以及通过血管内输注向经CP免疫抑制的动物投与AAV9-IDUA。在投与载体之后8周时处死动物，并且收集脑并进行显微解剖以相较于正常和受影响的对照小鼠来评价IDUA酶活性、组织糖胺聚糖以及IDUA载体序列。由这些研究得到的结果显示，可采用将AAV载体直接投与CNS的众多途径，例如由此在CNS中实现较高水平的蛋白质递送和/或酶活性。此外，尽管脑是免疫赦免部位，但投与免疫抑制剂或免疫耐受化可增加投与AAV之后在脑中发现的活性。每次投与的较高水平的表达和/或侵入性不太高的投与途径在临床上更适合患者。
因此，本发明包括重组AAV(rAAV)载体的用途，当在哺乳动物的CNS中表达时，所述rAAV载体编码具有治疗作用的基因产物。在一个实施例中，哺乳动物是患有CNS疾病或病症(一种神经系统疾病)的具有免疫能力的哺乳动物。如本文所用，“具有免疫能力的”哺乳动物是在暴露于抗原刺激物之后，由Th1功能或IFN-γ制造响应于多克隆刺激物上调而引起细胞和体液免疫反应的一定年龄的哺乳动物，与具有固有的免疫性和来源于母体(例如在妊娠期间或通过哺乳)的免疫性的新生哺乳动物相对。不具有免疫缺陷性疾病的成年哺乳动物是具有免疫能力的哺乳动物的实例。举例来说，具有免疫能力的人类通常是至少1、2、3、4、5或6个月大，并且包括未患免疫缺陷性疾病的成年人类。在一个实施例中，AAV经鞘内投与。在一个实施例中，AAV是经颅内(例如脑室内)投与。在一个实施例中，AAV是在存在或不存在渗透增强剂情况下经鼻内投与。在一个实施例中，AAV是在存在或不存在渗透增强剂情况下经血管内投与，例如经颈动脉投与。在一个实施例中，投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受化或免疫抑制，例如以诱导比投与AAV但未经历免疫耐受化或免疫抑制的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。在一个实施例中，投与免疫抑制剂以诱导免疫抑制作用。在一个实施例中，投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如仅投与AAV提供治疗作用)。
在一个实施例中，本发明提供增加患有神经疾病的哺乳动物的中枢神经系统中分泌性蛋白的方法，所述神经疾病可包括神经认知功能障碍。所述方法包括向哺乳动物鼻内投与包含有效量的包含编码分泌性蛋白的开放阅读框架的重组腺相关病毒(rAAV)载体的组合物，所述分泌性蛋白在哺乳动物中的表达相对于患有疾病或功能障碍但未投与rAAV的哺乳动物减少神经病理和/或增强整个脑中的神经认知。在一个实施例中，所编码蛋白质包含神经保护性蛋白质，例如GDNF或神经营养因子。在一个实施例中，所编码蛋白质包含抗体，例如结合β-淀粉样蛋白的抗体。在一个实施例中，蛋白质是分解与阿尔茨海默氏病相关的斑或纤丝的酶。在一个实施例中，哺乳动物不经免疫抑制剂治疗。在另一实施例中，例如在可产生中和治疗性蛋白质活性的免疫反应的个体中，用免疫抑制剂治疗哺乳动物，所述免疫抑制剂为例如糖皮质激素、包括烷化剂的细胞抑制剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或作用于免疫亲和素的药剂，例如氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素、针对IL-2受体-(CD25)或CD3的抗体、抗IL-2抗体、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、类鸦片或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂共投与或免疫抑制剂在rAAV之后投与。在一个实施例中，免疫抑制剂经鞘内投与。在一个实施例中，免疫抑制剂经脑室内投与。在一个实施例中，rAAV载体是rAAV1、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAVrh10或rAAV9载体。在一个实施例中，在投与组合物之前使哺乳动物免疫耐受化。
在一个实施例中，本发明提供预防、抑制或治疗神经疾病的方法，所述神经疾病可包括哺乳动物的神经认知功能障碍。所述方法包括向哺乳动物鼻内投与包含有效量的包含编码蛋白质的开放阅读框架的重组腺相关病毒(rAAV)载体的组合物，所述蛋白质在哺乳动物中的表达预防、抑制或治疗神经病理和/或神经认知功能障碍。在一个实施例中，所编码蛋白质包含神经保护性蛋白质，例如GDNF或神经营养因子。在一个实施例中，所编码蛋白质包含抗体，例如结合β-淀粉样蛋白的抗体。在一个实施例中，蛋白质是分解与阿尔茨海默氏病相关的斑或纤丝的酶。在一个实施例中，哺乳动物不经免疫抑制剂治疗。在另一实施例中，例如在可产生中和治疗性蛋白质活性的免疫反应的个体中，用免疫抑制剂治疗哺乳动物，所述免疫抑制剂为例如糖皮质激素、包括烷化剂的细胞抑制剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或作用于免疫亲和素的药剂，例如氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素、针对IL-2受体-(CD25)或CD3的抗体、抗IL-2抗体、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、类鸦片或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂共投与或免疫抑制剂在rAAV之后投与。在一个实施例中，免疫抑制剂经鞘内投与。在一个实施例中，免疫抑制剂经脑室内投与。在一个实施例中，rAAV载体是rAAV1、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAVrh10或rAAV9载体。在一个实施例中，在投与组合物之前使哺乳动物免疫耐受化。在一个实施例中，哺乳动物患有阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
在一个实施例中，本发明提供一种在患有神经疾病的哺乳动物中提供中枢神经系统中分泌性蛋白的交叉校正的方法，所述神经疾病可包括神经认知功能障碍。所述方法包括：向哺乳动物鼻内、鞘内、脑血管内或静脉内投与有效量的组合物，所述组合物包含有效量的包含编码分泌性蛋白的开放阅读框架的重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述分泌性蛋白在哺乳动物中的表达提供交叉校正。在一个实施例中，所编码蛋白质包含神经保护性蛋白质，例如GDNF或神经营养因子。在一个实施例中，所编码蛋白质包含抗体，例如结合β-淀粉样蛋白的抗体。在一个实施例中，蛋白质是分解与阿尔茨海默氏病相关的斑或纤丝的酶。在一个实施例中，哺乳动物不经免疫抑制剂治疗。在一个实施例中，例如在可产生中和治疗性蛋白质活性的免疫反应的个体中，用免疫抑制剂治疗哺乳动物，所述免疫抑制剂为例如糖皮质激素、包括烷化剂的细胞抑制剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或作用于免疫亲和素的药剂，例如氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素、针对IL-2受体-(CD25)或CD3的抗体、抗IL-2抗体、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、类鸦片或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂共投与或免疫抑制剂在rAAV之后投与。在一个实施例中，免疫抑制剂经鞘内投与。在一个实施例中，免疫抑制剂经脑室内投与。在一个实施例中，rAAV载体是rAAV1、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAVrh10或rAAV9载体。在一个实施例中，在投与组合物之前使哺乳动物免疫耐受化。
本发明提供在有需要的哺乳动物中预防、抑制或治疗与中枢神经系统疾病或病症相关的神经认知功能障碍的方法。所述方法包括向哺乳动物鞘内(例如向腰椎区域)或脑室内(例如向侧脑室)投与包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV载体的组合物，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗神经认知功能障碍。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10或AAV9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。
在一个实施例中，所述方法包括向哺乳动物鞘内(例如向腰椎区域)投与包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV载体的组合物，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗神经认知功能障碍，并且任选地投与渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂在所述组合物之前投与。在一个实施例中，所述组合物包含渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂在所述组合物之后投与。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV-1、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV rh10或AAV-9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，经鞘内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如仅投与AAV提供治疗作用)。在一个实施例中，经鞘内投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受作用或免疫抑制作用，例如以诱导比鞘内投与AAV但未经历免疫耐受作用或免疫抑制作用的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。
在一个实施例中，所述方法包括向具有免疫能力的哺乳动物脑室内(例如向侧脑室)投与包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV载体的组合物，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗神经认知功能障碍。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10或AAV9载体。在一个实施例中，rAAV载体不是rAAV5载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，经脑室内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受化或免疫抑制(例如仅投与AAV提供治疗作用)。在一个实施例中，经脑室内投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受作用或免疫抑制作用，例如以诱导比脑室内投与AAV但未经历免疫耐受作用或免疫抑制作用的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。在一个实施例中，在投与包含AAV的组合物之前，使哺乳动物对基因产物具有免疫耐受性。
进一步提供在有需要的哺乳动物中预防、抑制或治疗与中枢神经系统疾病或病症相关的神经认知功能障碍的方法。所述方法包括向哺乳动物血管内投与组合物，所述组合物包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV载体和有效量的渗透增强剂，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗功能障碍。在一个实施例中，组合物包含渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂包含甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧化乙烯-9-月桂醇醚或EDTA。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10或AAV9载体。在一个实施例中，rAAV载体不是rAAV5载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周投与一次。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，经血管内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受作用或免疫抑制作用(例如仅投与AAV提供治疗作用)。在一个实施例中，经血管内投与AAV的哺乳动物是免疫缺陷动物，或者经历免疫耐受作用或免疫抑制作用，例如以诱导比血管内投与AAV但未经历免疫耐受作用或免疫抑制作用的相应哺乳动物高的治疗性蛋白质表达水平。
在一个实施例中，所述方法包括向哺乳动物鼻内投与包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV9载体的组合物，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗神经认知功能障碍，并且任选地投与渗透增强剂。在一个实施例中，鼻内递送可如美国专利第8,609,088号中所描述来实现，所述专利的揭示内容以引用的方式并入本文中。在一个实施例中，渗透增强剂在组合物之前投与。在一个实施例中，组合物包含渗透增强剂。在一个实施例中，渗透增强剂在组合物之后投与。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。在一个实施例中，经鼻内投与AAV的哺乳动物未经历免疫耐受作用或免疫抑制作用。在一个实施例中，经鼻内投与AAV的哺乳动物经历免疫耐受作用或免疫抑制作用，例如以诱导比鼻内投与AAV但未经历免疫耐受作用或免疫抑制作用的相应哺乳动物高的IDUA蛋白质表达水平。
还提供在有需要的哺乳动物中预防、抑制或治疗与中枢神经系统疾病相关的神经认知功能障碍的方法。所述方法包括向哺乳动物投与包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV载体和免疫抑制剂的组合物，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗。在一个实施例中，免疫抑制剂包含环磷酰胺。在一个实施例中，免疫抑制剂包含糖皮质激素、包括烷化剂的细胞抑制剂或抗代谢物，如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤或细胞毒性抗生素、抗体或作用于免疫亲和素的药剂。在一个实施例中，免疫抑制剂包含氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素、针对IL2受体-(CD25)或CD3的抗体、抗IL-2抗体、环孢素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、类鸦片或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂，如英利昔单抗(infliximab)(Remicade)、依那西普(etanercept)(Enbrel)或阿达木单抗(adalimumab)(Humira)。在一个实施例中，rAAV与免疫抑制剂共投与。在一个实施例中，rAAV在免疫抑制剂之前以及任选地在免疫抑制剂之后投与。在一个实施例中，免疫抑制剂在rAAV之前投与。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂经鞘内投与。在一个实施例中，rAAV和免疫抑制剂经脑室内投与。在一个实施例中，rAAV经鞘内投与并且免疫抑制剂经静脉内投与。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，哺乳动物是成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10或AAV9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周投与一次。在一个实施例中，所述组合物是每周一次、每月一次或间隔两个或更多个月投与。
本发明还提供在有需要的哺乳动物中预防、抑制或治疗与中枢神经系统疾病相关的神经认知功能障碍的方法。向对疾病相关的基因产物具有免疫耐受性的哺乳动物投与包含有效量的包含编码基因产物的开放阅读框架的rAAV载体的组合物，所述基因产物在哺乳动物的中枢神经系统中的表达预防、抑制或治疗所述一或多种症状。在一个实施例中，基因产物是溶酶体贮积酶。在一个实施例中，哺乳动物是成年哺乳动物。在一个实施例中，rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10或AAV9载体。在一个实施例中，哺乳动物是人类。在一个实施例中，投与多次剂量。在一个实施例中，所述组合物是每周投与一次。
可由rAAV载体编码的基因产物包括但不限于α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、β-己糖胺酶、α-半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、葡糖脑苷脂酶、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、脑源性生长因子(BDGF)、神经营养因子、神经胶质源性生长因子(GDGF)、酪氨酸羟化酶、多巴胺脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。
可展现可使用本文所揭示的方法预防、抑制或治疗的神经系统症状或神经认知功能障碍的疾病包括但不限于肾上腺脑白质营养不良、阿尔茨海默氏病、肌肉萎缩性侧索硬化、安格尔曼综合症(Angelman syndrome)、共济失调毛细血管扩张症、夏-马-图三氏综合症(Charcot-Marie-Tooth syndrome)、科凯恩氏综合症(Cockayne syndrome)、聋、杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、癫痫症、特发性震颤、脆弱X综合症、弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、戈谢氏病(Gaucher disease)、亨廷顿氏病(Huntington disease)、雷-纳二氏综合症(Lesch-Nyhan syndrome)、枫糖浆尿病、门克斯氏综合症(Menkes syndrome)、强直性肌营养不良、发作性睡病、神经纤维瘤、尼曼-皮克氏病(Niemann-Pick disease)、帕金森氏病(Parkinson disease)、苯丙酮尿症、普拉德-威利综合症(Prader-Willi syndrome)、雷夫苏姆氏病(Refsum disease)、瑞特氏综合症(Rettsyndrome)、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑失调、丹吉尔氏病(Tangier disease)、泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)、结节性硬化症、希-林二氏综合症(Von Hippel-Lindausyndrome)、威廉姆斯综合症(Williams syndrome)、威尔逊氏病(Wilson's disease)或齐薇格综合症(Zellweger syndrome)。在一个实施例中，所述疾病是溶酶体贮积病，例如溶酶体贮积酶缺乏或缺陷。溶酶体贮积病包括但不限于粘多糖贮积病(MPS)，例如I型粘多糖贮积病，例如贺氏综合症以及变化形式谢氏综合症和贺-谢二氏综合症(α-L-艾杜糖醛酸酶缺乏)；亨特氏综合症(Hunter syndrome)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏)；III型粘多糖贮积病，例如沙费利波综合症(Sanfilippo syndrome)(A、B、C或D；硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、乙酰基CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶或N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶缺乏)；IV型粘多糖贮积病，例如莫基奥综合症(Morquio syndrome)(半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶或β-半乳糖苷酶缺乏)；VI型粘多糖贮积病，例如马-兰二氏综合症(Maroteaux-Lamy syndrome)(芳基硫酸酯酶B缺乏)；II型粘多糖贮积病；III型粘多糖贮积病(A、B、C或D；硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、乙酰基CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶或N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶缺乏)；IV型粘多糖贮积病(A或B；半乳糖胺-6-硫酸酯酶和β-半乳糖苷酶缺乏)；VI型粘多糖贮积病(芳基硫酸酯酶B缺乏)；VII型粘多糖贮积病(β-葡糖苷酸酶缺乏)；VIII型粘多糖贮积病(葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶缺乏)；IX型粘多糖贮积病(透明质酸酶缺乏)；泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)(β-己糖胺酶的α亚基缺乏)；山多夫氏病(Sandhoff disease)(β-己糖胺酶的α和β亚基缺乏)；GM1神经节苷脂贮积病(I型或II型)；法布里病(Fabry disease)(α半乳糖苷酶缺乏)；异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A缺乏)；庞贝病(Pompe disease)(酸性麦芽糖酶缺乏)；岩藻糖苷贮积症(岩藻糖苷酶缺乏)；α-甘露糖苷贮积症(α-甘露糖苷酶缺乏)；β-甘露糖苷贮积症(β-甘露糖苷酶缺乏)、蜡样脂褐质沉积症和戈谢氏病(I、II以及III型；葡糖脑苷脂酶缺乏)，以及例如以下病症：赫曼斯基-普德拉克综合症(Hermansky-Pudlak syndrome)；黑蒙性白痴；丹吉尔氏病；天冬氨酰葡糖胺尿症；Ia型先天性糖基化病症；薛迪克-东氏综合症(Chediak-Higashi syndrome)；1型角膜黄斑营养不良；肾病型胱氨酸症；范科尼-比克综合症(Fanconi-Bickel syndrome)；法伯脂肪肉芽肿病(Farber lipogranulomatosis)；纤维瘤病；指端肿大型发育不良；I型糖原贮积病；Ib型糖原贮积病；Ic型糖原贮积病；III型糖原贮积病；IV型糖原贮积病；V型糖原贮积病；VI型糖原贮积病；VII型糖原贮积病；0型糖原贮积病；谢氏型免疫骨发育不良；脂沉积症；脂肪酶b；II型粘脂贮积症；II型粘脂贮积症，包括其变化形式；IV型粘脂贮积症；神经氨酸苷酶缺乏伴随β-半乳糖苷酶缺乏；I型粘脂贮积症；尼曼-皮克氏病(神经磷脂酶缺乏)；不伴随神经磷脂酶缺乏的尼曼-皮克氏病(编码胆固醇代谢酶的npc1基因缺乏)；雷夫苏姆氏病；海蓝组织细胞疾病(Sea-blue histiocytedisease)；婴儿唾液酸贮积症；唾液酸尿症；多种硫酸酯酶缺乏症；伴随长链脂肪酸氧化减弱的三酸甘油酯贮积病；温切斯特氏病(Winchester disease)；沃尔曼氏病(Wolmandisease)(胆固醇酯水解酶缺乏)；1型类脱氧核糖核酸酶I病症；芳基硫酸酯酶E病症；ATP酶H+转运溶酶体亚基1病症；IIb型糖原贮积病；Ras相关蛋白质rab9病症；1型点状软骨发育不良、X连锁隐性病症；VIII型糖原贮积病；溶酶体相关膜蛋白2病症；门克斯氏综合症；Ic型先天性糖基化病症；以及唾液酸尿症。更换小于20％，例如小于10％或约1％到5％水平的在未患病哺乳动物中发现的溶酶体贮积酶可预防、抑制或治疗哺乳动物的神经系统症状，如神经系统退化。
在一个实施例中，本文中所描述的方法涉及向需要治疗的具有免疫能力的人类的CNS递送包含有效量的包含编码IDUA的开放阅读框架的rAAV9载体的组合物。向CNS/脑的投与途径包括但不限于鞘内投与、颅内投与(例如脑室内投与或侧脑室投与)、鼻内投与、血管内投与以及实质内投与。
本发明的方法中可采用其它病毒载体，例如，如反转录病毒、慢病毒、腺病毒、胜利基森林病毒(semliki forest virus)或单纯疱疹病毒载体的病毒载体。
附图说明
图1.有关向艾杜糖醛酸酶缺陷小鼠脑室内(ICV)或鞘内投与AAV9-IDUA的实验设计。为了预防免疫反应，动物用环磷酰胺(CP)进行免疫抑制，在出生时通过静脉内投与人类艾杜糖醛酸酶蛋白质(aldurazyme)进行免疫耐受化，或在NOD-SCID免疫缺陷并且还是艾杜糖醛酸酶缺陷小鼠中进行注射。在治疗后的指定时间时处死动物，对脑进行显微解剖并分析提取物的艾杜糖醛酸酶活性。
图2.免疫缺陷、IDUA缺陷动物的IDUA活性。
图3.通过ICV途径投与AAV载体的免疫抑制动物的IDUA活性。
图4.通过IT途径投与AAV载体的免疫抑制动物的IDUA活性。
图5.ICV投与AAV载体的免疫耐受化动物的IDUA活性。
图6.汇集所有IDUA活性平均水平用于并排比较。
图7.数据是根据脑区域分组。
图8.有关全部四个测试组在不同脑部分中的GAG贮积物质的分析。
图9.实验设计的示意图。
图10.向免疫缺陷MPS I小鼠颅内输注AAV9-IDUA。成年动物注射1011个载体基因组并且在10周之后评估脑中艾杜糖醛酸酶的表达。脑中酶活性水平明显高于野生型动物脑中的酶活性水平，并且范围比野生型高30到300倍。
图11.在具有免疫能力的IDUA缺陷小鼠中颅内投与AAV9-IDUA。成年动物注射1011个载体基因组，并且通过每周一次注射环磷酰胺(CP)进行免疫抑制。由于健康状况不良，CP注射在载体注射后6周时终止，并且在注射后8周处死动物。对脑进行显微解剖并分析IDUA酶活性。
图12.向免疫耐受化的MPS I小鼠颅内输注AAV9-IDUA。在出生时投与单次剂量的Aldurazyme或从出生时开始每周投与一次多次剂量来使MPS 1小鼠耐受化。在4个月时向小鼠输注载体，并在注射之后11周时将其处死。对脑进行显微解剖并分析艾杜糖醛酸酶的表达。酶活性范围平均比野生型水平高10到1000倍。
图13.在具有免疫能力的IDUA缺陷动物中鞘内投与AAV9-IDUA。向成年MPS I小鼠鞘内注射AAV9-IDUA，随后每周一次进行环磷酰胺免疫抑制方案。在注射后11周时处死动物，并且接着分析脑和脊髓中的IDUA酶活性。
图14.在免疫耐受化的MPS I小鼠中鞘内输注AAV9-IDUA。在出生时投与单次剂量的Aldurazyme或从出生开始，每周投与一次多次剂量来使IDUA缺陷动物耐受化。在4个月大时，向动物鞘内输注AAV9-IDUA载体，并且在注射后10周时处死动物，对脑进行显微解剖并分析艾杜糖醛酸酶活性。在脑的所有部分中都存在酶活性的恢复，其中小脑中的活性范围比野生型水平高200到1500倍。嗅球和小脑中的酶活性水平(在虚线的右侧)与右边的Y轴相对应。
图15.在具有免疫能力的MPS I动物中鞘内输注AAV9-IDUA。对照MPS I动物注射AAV9-IDUA载体，但未经免疫抑制，也未经免疫耐受化。在注射载体之后11周处死动物，并且接着分析其脑中的艾杜糖醛酸酶活性。在脑的所有部分中，酶水平恢复到野生型水平，但明显低于经历免疫抑制或免疫耐受化的动物。
图16.在颅内或鞘内输注AAV9之后糖胺聚糖(GAG)水平规范化。如所指示，将AAV9-IDUA颅内或鞘内注射到免疫缺陷、经免疫抑制或经免疫耐受化的MPS I小鼠中。在注射之后8-11周时处死动物，接着对脑进行显微解剖并分析GAG水平。在所分析的所有组中，GAG贮积量恢复到野生型水平或接近野生型水平。
图17.脑中的IDUA载体拷贝数。通过QPCR分析显微解剖的脑中的IDUA载体序列。经颅内和鞘内注射的小鼠中的拷贝数与图11和13中所描绘的酶活性水平相关。
图18.在成年动物中ICV输注AAV8-MCI。
图19.在具有免疫能力的IDUA缺陷动物中鼻内投与AAV9-IDUA。向成年MPS I小鼠鼻内输注AAV9-IDUA，随后每周一次进行环磷酰胺免疫抑制方案。在注射后12周处死动物，并分析脑中的IDUA酶活性。
图20.脑中的IDUA载体拷贝数。通过QPCR分析显微解剖的脑中的IDUA载体序列。经鼻内注射的小鼠中的拷贝数与图19中的酶水平相关。
图21.使用IN递送AAV9-IDUA的免疫抑制剂或耐受化方案。
图22.IN递送AAV9-IDUA后IDUA活性的恢复。
图23.IN递送AAV9-IDUA后的GAG活性。
图24.IN递送AAV9-IDUA后脑中的IDUA免疫荧光法。
图25.IN递送AAV9-GFP后脑中的GFP免疫荧光法。
图26A至D.A)甲苯胺蓝染色。B)对照杂合和纯合MPS I小鼠以及经IN递送IDUAAAV9-MCI处理的小鼠中组织病理学的汇总。C)巴恩斯迷宫。D)巴恩斯迷宫数据。
图27A至B.A)AAV9载体的示意图。B)IT和IV递送AAV9.hIDS载体的体内测试组的汇总。
图28.通过IT和IV途径投与AAV9-hIDS载体的小鼠血浆中的IDS活性。
图29.IT注射AAV9-hIDS后的CNS IDS活性。对于各组小鼠，从左到右呈现以下组织的数据：脊髓、丘脑/脑干、小脑、皮层、海马区以及纹状体。
图30A至D.A)ICV注射AAV9-hIDS后的CNS IDS活性。对于各组小鼠，从左到右呈现以下组织的数据：脊髓、左侧丘脑/脑干、小脑、皮层、海马区、纹状体、嗅球，以及右侧嗅球、纹状体、海马区、皮层、小脑和丘脑/脑干。B)ICV注射AAV9-hIDS后血浆中的IDS活性。C)ICV注射AAV9-hIDS后外周器官中的IDS活性。对于各组小鼠，从左到右呈现以下器官的数据：肝、心、肺、脾和肾。D)ICV注射后的GAG含量。对于各组小鼠，从左到右呈现以下组织的数据：脊髓，其余部分，小脑、皮层、海马区、纹状体和嗅球。
图31A至B.A)巴恩斯迷宫。B)第1天和第4天的表现。
图32.野生型和MPS II小鼠的神经系统功能的比较。
图33.使用AAV9或AAVrh10的IV基因递送的实验设计。
图34A至C.血浆(A)、外周组织(B)和CNS(C)中以及在IV投与后IDUA活性的恢复。
图35A至C.尿液(A)、外周组织(B)和CNS(C)中的GAG活性。
图36A至F.组织切片中的IDUA免疫荧光法。A)肝。B)心脏。C)肺。D)丘脑。E)海马区。F)小脑。
图37.IN输注AAV9-IDUA后的IDUA酶活性水平。在嗅球中观测到高的IDUA酶活性水平(比正常高10到100倍)，且在脑的其余部分规范化(野生型)水平。
图38.经处理小鼠中贮积物质减少。
图39A至D.IDUA(A)，GFP(B)；以及嗅球(C)免疫荧光法。(D)与嗅球中嗅标志蛋白共染色。
图40.经IN处理小鼠中改善的神经认知功能。
图41A至B.小脑(A)和海马区(B)中的神经化学特征。对于各神经化学特征，对照(CTR)是左侧的条形，MPS I(未处理)是中间条形并且MPS I处理是右侧的条形。
图42.IN递送AAVrh10-GFP后的脉络膜神经丛染色。
具体实施方式
定义
如本文所使用，“个体”(如在治疗对象中)意思指哺乳动物。哺乳动物包括例如人类；非人类灵长类动物，例如猿和猴；以及非灵长类动物，例如狗、猫、大鼠、小鼠、牛、马、绵羊和山羊。非哺乳动物包括例如鱼和鸟类。
术语“疾病”或“病症”可互换使用，并且用于指这样一些疾病或病况，其中特定基因产物，例如溶酶体贮积酶的缺乏或量减少在所述疾病中起作用，使得通过补充例如达到至少1％的正常水平可实现治疗有益作用。
如在本文中使用的术语“实质上”意思指完全或几乎完全地；举例来说，“实质上不含”一种组分的组合物不具有所述组分或含有微量以使得所述组合物的任何相关功能特性不受所述微量的存在影响，或一种化合物为“实质上纯的”是指仅存在可忽略的微量杂质。
“治疗(Treating/treatment)”在本文中的含义内是指与病症或疾病有关的症状的缓解，“抑制”意思指抑制与所述病症或疾病有关的症状的进一步发展或恶化，并且“预防”是指与所述病症或疾病有关的症状的预防。
如本文所使用，本发明的药剂，例如编码基因产物的重组AAV的“有效量”或“治疗有效量”是指完全或部分缓解与病症或病况有关的症状，或者中断或减缓那些症状的进一步发展或恶化，或者对所述病症或病况进行预防或提供预防作用的药剂量，例如有效预防、抑制或治疗个体的一或多种神经系统症状的量。
确切地说，“治疗有效量”是指在所需的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量还是本发明化合物的治疗有益作用超过任何有毒或有害作用的量。
如本文所使用，“载体”是指大分子或大分子缔合物，其包含多核苷酸或与多核苷酸缔合并且可用于在体外或体内介导多核苷酸到细胞的递送。说明性载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体以及其它基因递送媒剂。欲递送的多核苷酸，有时称为“靶多核苷酸”或“转基因”，可包含基因疗法中的所关注的编码序列(例如编码具有治疗意义的蛋白质的基因)和/或可选择或可检测的标记物。
“AAV”是腺相关病毒，并且可用于指病毒自身或其衍生物。除非另外需要，否则所述术语涵盖所有亚型、血清型和准型，以及天然存在形式和重组形式。如本文所用，术语“血清型”是指通过其结合特性所鉴别并基于其结合特性与其它AAV相区别的AAV，例如，AAV存在十一种血清型，即AAV1到AAV11，包括AAV2、AAV5、AAV8、AAV9以及AAV rh10，并且所述术语涵盖具有相同结合特性的准型。因此，举例来说，AAV9血清型包括具有AAV9的结合特性的AAV，例如包含AAV9衣壳，以及不是源自于或获自AAV9或者呈嵌合基因组形式的rAAV基因组的准型AAV。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，又称重组AAV载体(或“rAAV载体”)。
“AAV病毒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸构成的病毒粒子。如果所述粒子包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组外的多核苷酸，例如欲递送到哺乳动物细胞中的转基因)，那么其通常称为“rAAV”。AAV“衣壳蛋白”包括野生型AAV的衣壳蛋白，以及AAV衣壳蛋白的经修饰形式，其在结构上和或功能上能够包装rAAV基因组并且结合到至少一种可能不同于野生型AAV所采用的受体的特定细胞受体。经修饰的AAV衣壳蛋白包括嵌合AAV衣壳蛋白，如具有来自两种或更多种AAV血清型的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白，例如由来自AAV9的衣壳蛋白的一部分与来自AAV-2的衣壳蛋白的一部分融合或连接所形成的衣壳蛋白，以及具有标签或其它可检测的非AAV衣壳肽或蛋白质与AAV衣壳蛋白融合或连接的AAV衣壳蛋白，例如结合除AAV9受体以外的受体(如转铁蛋白受体)的抗体分子的一部分可通过重组方式与AAV9衣壳蛋白融合。
“准型”rAAV是具有AAV衣壳蛋白与AAV基因组的任何组合的感染性病毒。来自任何AAV血清型的衣壳蛋白都可与rAAV基因组一起使用，所述rAAV基因组是源自于或获自不同血清型的野生型AAV基因组，或是嵌合基因组，即，由来自两种或更多种不同血清型的AAVDNA形成，例如嵌合基因组具有2个反向末端重复(ITR)(每一ITR来自不同血清型)或嵌合ITR。使用嵌合基因组，例如包含来自两种AAV血清型的ITR或嵌合ITR的那些，可引起定向重组，其可进一步增加转录活性分子间多联体的制造。因此，在本发明的rAAV载体内的5'和3'ITR可为同源的，即，来自同一血清型；异源的，即，来自不同血清型；或嵌合的，即，具有来自超过一种AAV血清型的ITR序列的ITR。
rAAV载体
任何血清型的腺相关病毒都适合于制备rAAV，因为各种血清型在功能上和结构上，甚至是在基因水平上是相关的。所有AAV血清型明显呈现由同源rep基因介导的类似复制特性；并且一般都带有三个相关衣壳蛋白，例如在AAV2中表达的那些衣壳蛋白。相关性程度由异双链体分析进一步说明，所述分析揭露了血清型之间沿基因组长度的广泛交叉杂交；以及在末端处存在对应于ITR的类似自粘接片段。类似的感染性模式还表明，每一血清型中的复制功能都受到类似调控控制。在各种AAV血清型中，AAV2是最常用的。
本发明的AAV载体通常包含对于AAV是异源性的多核苷酸。由于在基因疗法情形下能够向靶细胞提供功能，例如上调或下调某一表型的表达，故所述多核苷酸通常是值得关注的。此类异源多核苷酸或“转基因”一般具有足够长度以提供所需的功能或编码序列。
如本领域中所知，当在预定靶细胞中需要异源多核苷酸转录时，取决于例如靶细胞内所需的转录水平和/或特异性，其能够可操作地连接到其自身或异源启动子。多种类型的启动子和强化子适用于这一情形。组成性启动子提供持续的基因转录水平，并且在需要持续表达治疗性或预防性多核苷酸时可为优选的。诱导性启动子在不存在诱导剂情况下一般展现低活性，并且在存在诱导剂的情况下上调。只有在某些时间或某些位置需要表达时，或在需要使用诱导剂滴定表达水平时，其可为优选的。启动子和强化子还可为组织特异性的：也就是说，其仅在某些细胞类型中展现其活性，可能是因为仅在这些细胞中发现的基因调控元件。
启动子的说明性实例是来自猴病毒40的SV40晚期启动子、杆状病毒(Baculovirus)多面体强化子/启动子元件、单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)胸苷激酶(HSV tk)、来自巨细胞病毒(CMV)的即刻早期启动子，以及多种反转录病毒启动子，包括LTR元件。诱导性启动子包括重金属离子诱导性启动子(例如小鼠乳房肿瘤病毒(mMTV)启动子或各种生长激素启动子)，以及来自T7噬菌体的启动子，其在T7 RNA聚合酶存在下具有活性。作为说明，组织特异性启动子的实例包括各种表面活性素启动子(用于在肺中的表达)、肌球蛋白启动子(用于在肌肉中的表达)以及白蛋白启动子(用于在肝中的表达)。本领域中已知并且一般可使用许多其它启动子，并且许多此类启动子的序列可在序列数据库(例如基因库(GenBank)数据库)中获得。
当预定靶细胞中还需要翻译时，异源多核苷酸将优选另外包含促进翻译的控制元件(例如核糖体结合位点或“RBS”和聚腺苷酸化信号)。因此，异源多核苷酸一般包含至少一个可操作地连接到适合启动子的编码区，并且还可包含例如可操作地连接的强化子、核糖体结合位点以及聚A信号。异源多核苷酸可包含一个编码区，或受相同或不同启动子控制的超过一个编码区。含有控制元件和编码区的组合的整个单元通常称为表达盒。
异源多核苷酸是通过重组技术整合到AAV基因组编码区中或代替AAV基因组编码区(即代替AAV rep和cap基因)，但一般通过AAV反向末端重复(ITR)区域在任一侧上侧接。这意味着ITR在编码序列的上游和下游出现，呈直接毗连形式，例如(但不一定)不存在任何AAV来源的插入序列以降低重组的可能性，所述重组可能再生有复制能力的AAV基因组。然而，单个ITR可能足以执行通常与包含两个ITR的配置相关的功能(参见例如WO 94/13788)，并且仅具有一个ITR的载体构筑体，因此可以与本发明的包装和制造方法结合使用。
rep的原生启动子是自我调控型，并且可限制所产生的AAV粒子的量。rep基因还能够可操作地连接到异源启动子，无论rep是作为载体构筑体的一部分提供还是单独提供。不因rep基因表达而显著下调的任何异源启动子都是适合的；但优选诱导性启动子，因为rep基因的组成性表达会对宿主细胞具有负面影响。本领域中已知许多诱导性启动子；作为说明，包括重金属离子诱导性启动子(例如金属硫蛋白启动子)；类固醇激素诱导性启动子(例如MMTV启动子或生长激素启动子)；以及例如来自T7噬菌体的启动子，其在存在T7RNA聚合酶时具有活性。诱导性启动子的一个子类是由辅助病毒诱导的启动子，其用于补充rAAV载体的复制和包装。也已描述许多辅助病毒诱导性启动子，包括腺病毒早期基因启动子，其可由腺病毒E1A蛋白质诱导；腺病毒主要晚期启动子；疱疹病毒启动子，其可由疱疹病毒蛋白质(例如VP16或1CP4)诱导；以及牛痘或痘病毒诱导性启动子。
已描述用于鉴别和测试辅助病毒诱导性启动子的方法(参见例如WO 96/17947)。因此，本领域中已知确定候选启动子是否可由辅助病毒诱导以及其是否适用于产生高效包装细胞的方法。简单来说，一种此类方法涉及用假定的辅助病毒诱导性启动子(本领域中已知的或使用众所周知的技术鉴别的，例如连接到无启动子的“报导子”基因)置换AAV rep基因的p5启动子。接着，例如将连接到阳性可选择标记物(如抗生素抗性基因)的AAV rep-cap基因(p5被置换)稳定整合到适合的宿主细胞(如下文例示的HeLa或A549细胞)中。接着测试能够在选择条件(例如在抗生素存在下)下相对良好生长的细胞在添加辅助病毒后表达rep和cap基因的能力。作为关于rep和/或cap表达的初始测试，可使用免疫荧光法容易地筛选细胞以检测Rep和/或Cap蛋白质。接着可通过针对引入的rAAV载体的复制和包装的功能测试来确定包装能力和效率的证实。使用这一方法，已将来源于小鼠金属硫蛋白基因的辅助病毒诱导性启动子鉴别为p5启动子的适合替代物，并且用于产生高效价rAAV粒子(如WO96/17947中所描述)。
在任何情况都需要移除一或多个AAV基因以降低产生具有复制能力的AAV(“RCA”)的可能性。因此，可移除rep、cap或两者的编码或启动子序列，因为由这些基因提供的功能可反式提供，例如呈稳定系或通过共转染。
所得载体称为在这些功能方面具有“缺陷”。为了复制和包装载体，用一个或多个包装基因补充缺失的功能，所述包装基因共同编码各种缺失的rep和/或cap基因产物的所需功能。在一个实施例中，包装基因或基因盒不侧接AAV ITR，并且在一个实施例中，不与rAAV基因组共有任何实质同源性。因此，为了在复制期间使载体序列与单独提供的包装基因之间的同源重组减到最少，需要避免两个多核苷酸序列的重叠。同源性水平和相应的重组频率随着同源序列的长度和其共有的一致性水平增加而增加。如本领域中已知，可在理论上确定并且以实验方式确认将在给定系统中造成问题的同源性水平。然而，如果重叠序列是小于约25个核苷酸的序列(如果其在其整个长度内至少80％一致)，或小于约50个核苷酸的序列(如果其在其整个长度内至少70％一致)，那么通常可以实质上减少或消除重组。当然，甚至优选更低的同源性水平，因为其将进一步降低重组的可能性。看起来，即使不存在任何重叠同源性，仍存在一些残留的产生RCA的频率。如艾伦(Allen)等人,WO 98/27204所描述，可通过“拆分”AAV的复制和衣壳化功能来甚至进一步降低产生RCA(例如通过非同源重组)的频率。
rAAV载体构筑体和互补包装基因构筑体在本发明中可通过许多不同形式实施。病毒粒子、质粒及稳定转化的宿主细胞都可用于将此类构筑体短暂或稳定地引入包装细胞中。
在本发明的某些实施例中，AAV载体和互补包装基因(如果存在的话)是以细菌质粒、AAV粒子或其任何组合的形式提供。在其它实施例中，AAV载体序列、包装基因或两者是以基因改变(优选遗传改变)的真核细胞形式提供。以遗传方式改变成表达AAV载体序列、AAV包装基因或两者的宿主细胞的开发提供以可靠水平表达的物质的确定来源。
因此，在本发明的情形中，可使用多种不同的以基因方式改变的细胞。作为说明，哺乳动物宿主细胞可与稳定整合的rAAV载体的至少一个完整拷贝一起使用。可使用包含至少一个可操作地连接到启动子的AAV rep基因的AAV包装质粒提供复制功能(如美国专利5,658,776中所描述)。或者，可使用具有可操作地连接到启动子的AAV rep基因的稳定哺乳动物细胞系提供复制功能(参见例如特瑞皮(Trempe)等人,WO 95/13392)；伯斯坦(Burstein)等人(WO 98/23018)；及约翰逊(Johnson)等人(美国第5,656,785号)。提供如上文所描述的衣壳化蛋白质的AAV cap基因可与AAV rep基因一起提供或分开提供(参见例如上文引用的申请案和专利，以及艾伦等人(WO 98/27204))。其它组合是可能的并且包括在本发明的范围内。
递送路径
尽管大脑血管结构网络庞大，但将治疗剂全身递送到中枢神经系统(CNS)对于超过98％的小分子以及接近100％的大分子无效(帕特雷杰(Partridge),2005)。效用的缺乏是由于存在血脑屏障(BBB)，其阻止大部分外来物质，甚至是许多有益的治疗剂从循环的血液进入脑中。尽管全身给与的某些小分子、肽及蛋白质治疗剂通过穿过BBB而到达脑实质(班克斯(Banks),2008)，但一般需要较高的全身剂量来达到治疗水平，这会在体内引起不良作用。治疗剂可通过脑室内或实质内注射直接引入CNS中。利用沿神经支配鼻通道的嗅神经及三叉神经的路径鼻内递送绕过BBB并使治疗剂直接靶向CNS(弗雷II(Frey II),2002；索恩(Thorne)等人,2004；德汗达(Dhanda)等人,2005)。
可以采用投与rAAV的任何途径，只要所述投与途径和量在预防上或治疗上有用即可。在一个实例中，投与CNS的途径包括鞘内和颅内。颅内投与可达到小脑延髓池或脑室。术语“小脑延髓池”意图包括通过颅骨与脊柱顶部之间的开口到达小脑周围和下方间隙的入口。术语“脑室”意图包括脑中与脊髓中央管连续的腔体。颅内投与通过注射或输注进行并且颅内投与的适合剂量范围一般是在1到3000微升单次注射体积中每微升递送约103到1015个病毒载体感染单位。举例来说，在约10、50、100、200、500、1000或2000微升中每微升递送的病毒基因组或载体感染单位一般将含有约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016或1017个病毒基因组或病毒载体感染单位。应理解，前述剂量只是例示性剂量并且所属领域的技术人员应理解此剂量可变化。有效剂量可从由体外或体内测试系统得到的剂量-反应曲线外推。
本发明的鞘内治疗方法中递送的AAV可通过常用于鞘内投与的任何便利途径投与。举例来说，鞘内投与可通过在约一小时内缓慢输注调配物进行。鞘内投与通过注射或输注进行并且鞘内投与的适合剂量范围一般是例如1、2、5、10、25、50、75或100或多于100毫升，例如1到10,000毫升或0.5到15毫升单次注射体积中每微升递送约103到1015个病毒载体感染单位。举例来说，每微升病毒基因组或载体感染单位一般将含有约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个病毒基因组或病毒载体感染单位。
本发明的治疗的鼻内方法中的AAV传送可以适合的剂量范围投与，一般是例如1、2、5、10、25、50、75或100或多于100毫升，例如1到10,000毫升或0.5到15毫升中每微升递送约103到1015个病毒载体感染单位。举例来说，每微升病毒基因组或载体感染单位一般将含有约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016或1017个病毒基因组或病毒载体感染单位，例如至少1.2×1011个基因组或感染单位，例如至少2×1011个直到约2×1012个基因组或感染单位或约1×1013个到约5×1016个基因组或感染单位。在一个实施例中，用于鼻内递送的AAV是通过末端半乳糖残基结合到聚糖的AAV，并且在一个实施例中剂量比w9×1010个到小于1×1011个AAV8基因组或病毒载体感染单位高2到8倍。
如上文所论述，如果表达溶酶体贮积酶，例如IDUA，那么所述疗法引起个体的神经元和/或脑膜组织中溶酶体贮积颗粒的规范化。预期神经元和神经胶质组织中贮积颗粒的沉积得到改善，由此使在罹患溶酶体贮积病的个体中所见的发育延迟和倒退缓解。所述疗法的其它作用可包括大脑脑膜中靠近蛛网膜粒的溶酶体贮积颗粒的规范化，溶酶体贮积病中溶酶体贮积颗粒的存在引起高压脑积水。本发明的方法还可用于治疗脊髓压迫，所述脊髓压迫由颈椎脑膜中靠近脊髓中C1-C5或其它地方处的脊髓存在溶酶体贮积颗粒引起。本发明的方法也针对由脑血管周围溶酶体贮积颗粒的血管周贮积引起的囊肿的治疗。在其它实施例中，所述疗法还可有利地引起肝体积和尿中糖胺聚糖排泄的规范化、脾大小和呼吸暂停/呼吸不足事件的减少、青春前期个体高度和生长速度的增加、肩屈曲以及肘部和膝部伸展的增加，以及三尖瓣返流或肺动脉返流减少。
本发明的鞘内投与可包含将所述组合物引入腰椎区域中。任何此类投与都可通过快速注射进行。取决于症状的严重程度和个体对疗法的反应，快速注射可以每周一次、每月一次、每6个月一次或每年一次投与。在其它实施例中，鞘内投与是通过使用输注泵实现的。所属领域的技术人员知道可用于实现组合物的鞘内投与的装置。所述组合物可例如通过单次注射或连续输注经鞘内给与。应理解，剂量治疗可为单次剂量投与或多剂量形式。
如本文所用，术语“鞘内投与”意图包括通过包括经钻孔或者脑池或腰椎穿孔等进行侧脑室注射在内的技术，将医药组合物直接递送到个体的脑脊髓液中。术语“腰椎区域”意图包括在第三与第四腰椎(下背部)椎骨之间并且更包括L2-S1脊柱区域在内的区域。
向以上提到的部位中的任一处投与根据本发明的组合物可通过直接注射所述组合物或通过使用输注泵实现。对于注射，所述组合物可调配成液体溶液形式，例如于生理上相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或磷酸盐缓冲液中。此外，酶可调配成固体形式并且在即将使用之前再溶解或悬浮。还包括冻干形式。注射可例如呈快速注射或连续输注(例如使用输注泵)酶的形式。
在本发明的一个实施例中，rAAV是通过在个体的脑中进行侧脑室注射来投与。注射可例如通过在个体的颅骨中产生的钻孔进行。在另一个实施例中，酶和/或其它医药调配物是通过将分流器以手术方式插入个体的脑室中来投与。举例来说，注射可在较大的侧脑室中进行，即使在较小的第三和第四脑室中也可进行注射。在又一实施例中，用于本发明中的组合物是通过在个体的小脑延髓池或腰椎区域中注射来投与。
尽管CNS的鼻内药物递送的潜在确切机制尚未完全了解，但越来越多的证据证实，涉及连接鼻通道与脑和脊髓的神经的路径很重要。此外，涉及血管结构、脑脊髓液以及淋巴系统的路径也已经牵涉到从鼻腔到CNS的分子输送。取决于治疗剂的特性、调配物的特征以及使用的递送装置，很可能是这些路径的组合负责的，不过一条路径可能占主导地位。
治疗剂可在鼻内投与之后，沿从鼻腔直接通向CNS的嗅神经路径迅速地进入CNS。如通过荧光示踪剂与嗅神经相关联的事实证明，嗅神经路径是鼻内递送的主要组成部分，因为其跨越筛状板(简森(Jansson)等人,2002)，嗅球中的药物浓度一般是所观察的CNS浓度中最高的(索恩等人,2004；班克斯等人,2004；格拉夫(Graff)等人,2005a)；野中(Nonaka)等人,2008；罗斯(Ross)等人,2004；罗斯等人,2008；索恩等人,2008)并且在嗅上皮与嗅球中的浓度之间存在较强的正相关性(多雷阿(Dhuria)等人,2009a)。
嗅觉路径是在鼻通道的上部部分中，在嗅觉区域中产生，其中嗅觉受体神经元(olfactory receptor neuron；ORN)散布在支持细胞(支柱细胞)、微绒毛细胞以及基底细胞当中。ORN通过将来自周围环境的感觉信息传送到CNS来介导气味的感测(克拉瑞科(Clerico)等人,2003)。在上皮下方的固有层中含有分泌粘液的鲍曼氏腺(Bowman'sgland)、轴突、血管、淋巴管以及结缔组织。ORN的树突延伸到嗅上皮的粘液层中，而这些双极神经元的轴突在中心延伸穿过固有层并穿过在筛骨的筛状板中的穿孔，所述筛状板分离鼻与颅腔。ORN的轴突穿过含有CSF的蛛网膜下隙并且在嗅球中的僧帽状细胞上终止。从此处，神经突起延伸到多个脑区，包括嗅索、前嗅核、梨状皮层、扁桃体以及下丘脑(布克(Buck),2000)。除ORN以外，格吕贝内格神经节中位于鼻腔前端处的感化性神经元伸入嗅球中(福斯(Fuss)等人,2005；库斯(Koos)等人,2005)。
ORN的独特特征促成对于鼻内递送到CNS至关重要的动态细胞环境。由于与外部环境中的毒素直接接触，ORN每3-4周由位于嗅上皮中的基底细胞再生(麦凯-希姆(Mackay-Sim),2003)。称为嗅鞘细胞(OEC)的特定许旺细胞类细胞包封ORN的轴突并且在轴突再生、再生长及髓鞘再生方面具有重要作用(菲尔德(Field)等人,2003；李(Li)等人,2005a；李等人,2005b)。OEC建立连续的流体填充的神经周通道，有趣的是，这些通道保持打开，尽管存在ORN的退化和再生(威廉姆斯(Williams)等人,2004)。
鉴于嗅上皮的独特环境，鼻内投与治疗剂有可能通过沿嗅神经的细胞外或细胞内输送机制而到达CNS。细胞外输送机制涉及分子在鼻上皮中的细胞之间快速移动，使得药物在鼻内投与之后只需要数分钟到30分钟就到达嗅球和CNS的其它区域(弗雷II,2002；巴林(Balin)等人,1986)。输送很可能涉及在通过OEC产生的通道内的总体流动机制(索恩等人,2004；索恩等人,2001)。还可通过在去极化期间发生的结构变化以及相邻轴突中可能的轴突传播作用而在这些通道内推动药物(鲁扎提(Luzzati)等人,2004)。细胞内输送机制涉及通过被动扩散、受体介导的内吞作用或吸附内吞作用，随后较慢的轴突输送将分子摄取到ORN中，花费数小时到数天使药物出现在嗅球及其它脑区中(贝克(Baker)等人,1986；布洛德维尔(Broadwell)等人,1985；克里斯顿森(Kristensson)等人,1971)。已经说明亲脂性小分子，例如金粒子(德洛伦佐(de Lorenzo),1970；格匹纳斯(Gopinath)等人,1978)、铝盐(佩尔(Perl)等人,1987)，以及在ORN上具有受体的物质，例如WGA-HRP(索恩等人,1995；贝克等人,1986；伊塔亚(Itaya)等人,1986；希普利(Shipley),1985)在ORN中的细胞内输送。细胞内机制尽管对于某些治疗剂很重要，但不大可能是向CNS中进行输送的主要模式。尽管一些大分子，例如甘丙胺素样肽(GALP)展现出CNS中的可饱和输送路径(野中等人,2008)，但对于其它大分子，例如NGF及胰岛素样生长因子-I(IGF-I)，鼻内递送到脑中是不可饱和的并且不是受体介导的(索恩等人,2004；陈(Chen)等人,1998；赵(Zhao)等人,2004)。
通常被忽略但很重要的连接鼻通道与CNS的路径涉及三叉神经，其神经支配鼻通道的呼吸和嗅上皮，并且沿脑桥进入CNS(克拉瑞科等人,2003；格拉夫等人,2003)。有趣的是，一小部分三叉神经还在嗅球中终止(斯查菲(Schaefer)等人,2002)。鼻通道的呼吸区域的细胞组成不同于嗅觉区域的细胞组成，其中纤毛上皮细胞分布在分泌粘液的杯状细胞中。这些细胞有助于粘液纤毛清除机制，所述机制移除从鼻腔到鼻咽的粘液以及外来物质。三叉神经通过三叉神经的眼分支(V1)、上颌分支(V2)或下颌分支(V3)将感觉信息从鼻腔、口腔、眼睑以及角膜传送到CNS(克拉瑞科等人,2003；戈瑞(Gray),1978)。来自三叉神经的眼分支的支路提供对鼻的鼻背粘膜和前部的神经支配，而上颌分支的支路提供对鼻粘膜的侧壁的神经支配。三叉神经的下颌分支延伸到下颌和牙齿，不具有伸入鼻腔的直接神经输入。三叉神经的三个支路集合在三叉神经节处并且在脑桥水平上，在中心延伸进入脑中，在脑干中的三叉神经脊束核中终止。三叉神经的独特特征是，其在两个部位处从鼻通道呼吸上皮进入脑中：(1)通过靠近脑桥的前裂孔和(2)通过靠近嗅球的筛状板，从而在鼻内投与后于尾部和嘴侧脑区产生进口点。对面部和头部(例如面神经)或鼻腔中的其它感觉结构(例如格吕贝内格神经节)进行神经支配的其它神经也可能为向CNS中鼻内施用治疗剂提供进口点。
传统上，已利用鼻内投与途径，通过鼻粘膜下伏的毛细血管中的吸收将药物递送到全身循环中。鼻粘膜含有大量血管，从源自于颈动脉的上颌、眼以及面动脉的支路接受其血液供应(克拉瑞科等人,2003；考纳(Cauna),1982)。嗅粘膜从眼动脉的小支路接受血液，而呼吸粘膜从上颌动脉的大口径动脉支路接受血液(德塞索(DeSesso),1993)。呼吸粘膜中的相对血管密度大于嗅粘膜，使得前一区域成为血液中吸收的理想部位(德塞索,1993)。呼吸区域中的血管结构含有连续内皮和有孔内皮的混合(格雷文思(Grevers)等人,1987；范迪斯特(Van Diest)等人,1979)，使小分子和大分子在鼻投与之后进入全身循环中。
在吸收到全身循环中并且随后跨BBB输送后递送到CNS中是可能的，尤其是对于较小的亲脂性药物来说，其比较大的亲水性治疗剂(例如肽和蛋白质)更容易进入血流并穿过BBB。
新出现的越来越多的证据表明，CNS中的鼻内药物递送涉及到涉及与血管有关的通道或血管周通道的机制。血管周间隙被血管最外层和周围组织的基底膜所结合(珀尔洛克(Pollock)等人,1997)。这些血管周间隙充当脑的淋巴系统，其中神经元源性物质是通过进入与大脑血管相关联的血管周通道而从脑间质液清除。血管周输送是由总体流动机制引起，与单独扩散相对(卡瑟尔(Cserr)等人,1981；格罗特许斯(Groothuis)等人,2007)，并且动脉脉动还是血管周输送的动力(雷尼尔斯(Rennels)等人,1985；雷尼尔斯等人,1985)。鼻内施用的药物可移动到鼻通道中的血管周间隙中或之后到达脑中，并且在CNS内观察到的广泛分布可能归因于血管周输送机制(索恩等人,2004)。
连接含有CSF的蛛网膜下隙、包含嗅神经的神经周间隙和鼻淋巴管的路径对于CSF排出很重要，并且这些路径为鼻内施用的治疗剂进入CSF和CNS的其它区域提供入口。若干研究证实，在脑室或蛛网膜下隙中的CSF中注射的示踪剂排到嗅球下面与嗅神经相关联的横过筛状板的通道中，并且到达鼻淋巴系统和颈淋巴结(布莱伯利(Bradbury)等人,1983；哈特尔(Hatterer)等人,2006；约翰斯顿(Johnston)等人,2004a)；基达(Kida)等人,1993；沃尔特(Walter)等人,2006a；沃尔特等人,2006b)。药物可在鼻内投与之后通过这些路径，从鼻通道移动到CSF进入脑间质间隙和血管周间隙而进入CNS中以在整个脑中分布。这些排出路径在许多动物物种(绵羊、兔以及大鼠)中具有重要意义，占CSF清除约50％(布莱伯利等人,1981；波耳顿(Boulton)等人,1999；波耳顿等人,1996；卡瑟尔等人,1992)。如通过治疗剂在鼻内递送之后直接递送到CSF中，而不是进入血液达到明显程度的事实所证实，鼻通道与CSF之间的路径对于人类也很重要并且具有功能(伯恩(Born)等人,2002)。多项鼻内研究证实，药物从鼻腔直接进入CSF中，随后分布到脑和脊髓。许多鼻内施用的分子迅速地进入CSF，并且此输送取决于分子的亲脂性、分子量以及电离程度(德汗达等人,2005；伯恩等人,2002；库马尔(Kumar)等人,1974；萨肯(Sakane)等人,1995；萨肯等人,1994；王(Wang)等人,2007)。关于在CSF中的分布的评估可提供有关鼻内递送机制的信息。
沿神经路径向CNS的最佳递送与药剂向鼻腔上三分之一的递送有关(汉森(Hanson)等人,2008)。尽管可采用仰卧位置，但靶向嗅觉区域的另一位置是利用“麦加朝圣(praying to Mecca)”位置，其中头部向下并向前。头部角度呈70度或90度的仰卧位置可适于使用插入鼻孔中的管，通过鼻内投与递送药物，由此高效递送到CSF中(范登博格(vanden Berg)等人,(2002))。
对于鼻内药物投与，可以经10-20分钟时间投与鼻滴液，每1-2分钟交替鼻孔以使溶液能被吸收到鼻上皮中(索恩等人,2004；卡普索尼(Capsoni)等人,2002；罗斯等人,2004；罗斯等人,2008；多雷阿等人,2009a；多雷阿等人,2009b；弗朗西斯(Francis)等人,2008；马丁尼兹(Martinez)等人,2008)。这种非侵入性方法不涉及将装置插入鼻孔中。取而代之的是，将滴液放在鼻孔的开口处，使个体能将滴液吸入鼻腔中。在麻醉个体中进行的其它投与方法涉及密封食道并将呼吸管插入气管中以防止鼻调配物被吞咽，并且消除与呼吸窘迫有关的问题(周(Chow)等人,1999；周等人,2001；弗里德纳(Fliedner)等人,2006；达哈林(Dahlin)等人,2001)。取决于导管的长度，可将柔性导管插入鼻孔中以将较小体积的药物溶液局部递送到呼吸或嗅觉上皮(周等人,1999；范登博格等人,2003；范登博格等人,2004a；班克斯等人,2004；范登博格等人,2002；维亚斯(Vyas)等人,2006a；查尔顿(Charlton)等人,2007a；高(Gao)等人,2007a)。
可以采用鼻递送装置，例如喷雾器、鼻滴管或无针注射器，将药剂靶向递送到鼻腔的不同区域。OptiMistTM是一种呼吸致动装置，其将液体或粉末状鼻调配物靶向递送到鼻腔，包括嗅觉区域，而不是沉积在肺或食道中(德佩斯兰德(Djupesland)等人,2006)。还可使用ViaNaseTM装置将鼻喷雾靶向递送到鼻腔的嗅上皮和呼吸上皮。鼻滴液往往会沉积在鼻腔底部上并经历快速粘液纤毛清除，而鼻喷雾剂则分布到中鼻道的鼻粘膜中(斯查贝(Scheibe)等人,2008)。
免疫抑制剂或免疫耐受化药剂可通过包括不经肠在内的任何途径投与。在一个实施例中，免疫抑制剂或免疫耐受化药剂可通过皮下、肌肉内或静脉内注射、经口、鞘内、颅内或鼻内，或通过持续释放，例如使用皮下植入物投与。免疫抑制剂或免疫耐受化药剂可溶解或分散于液体载剂媒剂中。对于不经肠投与，宜将活性物质与可接受的媒剂，例如各种植物油，例如花生油、棉籽油等混合。也可使用其它不经肠媒剂，例如使用丙酮缩甘油、甘油、缩甲醛以及水性不经肠调配物的有机组合物。对于通过注射不经肠施用，组合物可包含合意地呈0.01-10％浓度的根据本发明的活性酸的水溶性医药学上可接受的盐以及任选使用的稳定剂和/或缓冲物质于水溶液中的水溶液。所述溶液的剂量单元宜封装在安瓿中。
所述组合物，例如含有rAAV的组合物、含有免疫抑制剂的组合物或免疫耐受化组合物可呈可注射的单位剂量形式。可用于制备此类可注射剂量的载剂或稀释剂的实例包括稀释剂，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧异硬脂醇以及聚氧化乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯；pH调节剂或缓冲剂，例如柠檬酸钠、乙酸钠以及磷酸钠；稳定剂，例如焦亚硫酸钠、EDTA、硫代乙醇酸以及硫代乳酸；等渗剂，例如氯化钠和葡萄糖；局部麻醉剂，例如盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)和盐酸利多卡因(lidocainehydrochloride)。此外，可添加常见的增溶剂和镇痛剂。注射剂可遵循所属领域的技术人员众所周知的程序，通过将此类载剂添加到酶或其它活性剂中来制备。有关医药学上可接受的赋形剂的完整论述可见于雷明顿的药物科学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)(新泽西州默克出版公司(Mack Pub.Co.,N.J.)1991)中。医药学上可接受的调配物可容易地悬浮于水性媒剂中并且通过常规皮下注射针或使用输注泵引入。在引入之前，所述调配物可优选地用γ辐射或电子束灭菌法进行灭菌。
当以皮下植入物形式投与免疫抑制剂或免疫耐受化药剂时，将化合物悬浮或溶解于所属领域的技术人员已知的缓慢分散的材料中，或以通过使用恒定动力缓慢释放活性物质的装置，例如渗透泵投与。在这些情况下，可能经较长时间段投与。
投与的含有免疫抑制剂或免疫耐受化药剂的组合物的剂量可在较宽范围内变化，并且将取决于各种因素，例如疾病的严重程度、患者的年龄等，而且可能需要单独地调整。每天可投与的量的可能范围是约0.1mg到约2000mg，或约1mg到约2000mg。含有免疫抑制剂或免疫耐受化药剂的组合物宜调配成使得其以单一剂量单元或以多剂量单元形式而提供在这些范围内的剂量。除含有免疫抑制剂以外，主题调配物可含有一或多种编码治疗性基因产物的rAAV。
本文所描述的组合物可与另一药物组合使用。所述组合物可呈常规形式，例如气雾剂、溶液、悬浮液或表面施用或呈冻干形式。
典型组合物包括rAAV、免疫抑制剂、渗透增强剂或其组合，以及医药学上可接受的赋形剂，其可为载剂或稀释剂。举例来说，活性剂可与载剂混合，或用载剂稀释，或封装在载剂内。当将活性剂与载剂混合时，或当载剂用作稀释剂时，其可为固体、半固体或液体材料，其充当活性剂的媒剂、赋形剂或介质。适合载剂的一些实例是水、盐溶液、醇、聚乙二醇、聚羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、乳糖、白土、蔗糖、糊精、碳酸镁、糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸单甘油酸酯和脂肪酸二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧化乙烯、羟基甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。类似地，载剂或稀释剂可包括此项技术中已知的任何持续释放材料，例如单独或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
调配物可与不和活性剂有害地反应的助剂混合。此类添加剂可包括润湿剂、乳化剂和悬浮剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂和/或着色物质保持剂、甜味剂或调味剂。必要时，还可对组合物进行灭菌。
如果使用液体载剂，那么制剂可呈液体形式，如水性液体悬浮液或溶液。可接受的溶剂或媒剂包括无菌水、林格氏溶液或等渗水性生理盐水溶液。
提供的药剂可呈适于用如上文所描述的适当溶液复原的粉末形式。这些粉末的实例包括但不限于冷冻干燥的粉末、旋转干燥的粉末或喷雾干燥的粉末、非晶形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。组合物可任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用率调节剂以及其组合。单位剂型可在个别容器中或在多剂量容器中。
本发明所涵盖的组合物可包括例如胶束或脂质体，或一些其它的囊封形式，或者可例如使用可生物降解的聚合物，例如聚丙交酯-聚乙交酯，以延长释放形式投与，从而提供长期储存和/或递送作用。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。
举例来说，包含疏水性聚乳酸(PLA)核心和亲水性甲氧基-聚(乙二醇)(MPEG)壳层的聚合纳米粒子可具有改善的溶解性并且靶向CNS。微乳液与纳米粒子调配物之间靶向的区域差异可归因于粒度的差异。
脂质体是由具有两亲性脂质，即，磷脂或胆固醇的一或多个脂质双层组成的极简单结构。所述双层的亲脂性部分朝向彼此并且在膜中产生内部疏水性环境。脂质体是一些亲脂性药物的适合药物载剂，如果亲脂性药物具有适合大小和几何形状，那么其可与脂质双层的非极性部分缔合。脂质体的大小在20nm到数微米间变化。
混合胶束是由胆汁盐、磷脂、三甘油酸酯、二甘油酸酯和单甘油酸酯、脂肪酸、游离胆固醇以及脂肪可溶性微量养分构成的高效清洁剂结构。由于已知长链磷脂当分散于水中时形成双层，故优选的短链类似物相是球状胶束相。胶束溶液是在水和有机溶剂中自发形成的热力学稳定系统。胶束与疏水性/亲脂性药物之间的相互作用使得形成混合胶束(MM)，通常又称为膨胀胶束。在人体内，其并入具有较低水溶解性的疏水性化合物并且充当消化产物(例如单甘油酸酯)的储集器。
脂质微米粒子包括脂质纳米球和微米球。微米球一般定义为由大小是约0.2到100μm的任何材料制成的小球状粒子。小于200nm的较小球体通常称为纳米球。脂质微米球是类似于可商购的脂肪乳液的均质油/水微乳液，并且是通过密集声波处理程序或高压乳化法(研磨法)制备。天然的表面活性剂卵磷脂减少液体的表面张力，由此充当乳化剂以形成稳定乳液。脂质纳米球的结构和组成类似于脂质微米球的结构和组成，不过直径较小。
聚合纳米粒子用作广泛多种成分的载剂。活性组分可溶解于聚合物基质中或者截留或吸附于粒子表面上。适于制备有机纳米粒子的聚合物包括纤维素衍生物和聚酯，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)以及其共聚物。由于具有小尺寸、较大的表面积/体积比和可能的界面功能，聚合纳米粒子是理想的载剂和释放系统。如果粒度低于50nm，那么其不再被许多生物障壁层以及合成障壁层识别为粒子，而是类似于分子分散系统起作用。
因此，本发明的组合物可经调配以在采用本领域中众所周知的程序投与个体之后，提供活性剂的快速、持久、受控制或延迟释放，或其任何组合。在一个实施例中，酶是呈等渗或低渗溶液形式。在一个实施例中，对于不可溶于水的酶来说，可采用基于脂质的递送媒剂，例如微乳液，如WO 2008/049588(其揭示内容是以引用的方式并入本文中)中描述的微乳液，或脂质体。
在一个实施例中，制剂可含有溶解或悬浮于液体载剂(例如水性载剂)中以供气雾剂施用的药剂。所述载剂可含有添加剂，例如增溶剂，例如丙二醇；表面活性剂；吸收增强剂，例如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精；或防腐剂，例如对羟苯甲酸酯。举例来说，除溶解性以外，在鼻内投与之后高效递送到CNS可取决于膜渗透率。对于旁细胞输送因大小和极性而受阻的酶，改善膜渗透率可增进沿嗅神经和三叉神经向CNS输送的细胞外机制。改变鼻上皮内的膜渗透率的一种方法是通过使用渗透增强剂，例如表面活性剂，例如月桂酰肉桂碱(LC)、胆汁盐、脂质、环糊精、聚合物或紧密连接调节剂。
一般而言，活性剂是以每单位剂量包括活性成分和医药学上可接受的载剂的单位剂型施配。通常，适于经鼻投与的剂型包括约125μg到约125mg，例如约250μg到约50mg，或约2.5mg到约25mg的化合物与医药学上可接受的载剂或稀释剂的混合物。
剂型可每天一次，或每天超过一次，例如每天两次或三次投与。或者，如果处方医生发现可行，那么剂型可按低于每天一次的频率投与，例如每隔一天一次或每周投与一次。
本发明将通过以下非限制性实例描述。
实例I
在I型粘多糖贮积病鼠类模型中AAV载体介导的艾杜糖醛酸酶基因递送：比较向 CNS递送的不同途径
I型粘多糖贮积病(MPS I)是由溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏引起的一种遗传性代谢病症。糖胺聚糖的全身和异常积累与生长延迟、内脏增大、骨骼发育不良以及心肺疾病有关。患有所述疾病的最严重形式(贺氏综合症)的个体遭受神经退化、智力迟钝以及早期死亡。当前用于MPS I的两种治疗方法(造血干细胞移植和酶替代疗法)无法有效地治疗所述疾病的所有中枢神经系统(CNS)表现。
就基因疗法来说，先前已展示，在成年小鼠中血管内递送AAV9不能实现广泛的直接神经元靶向(参见福斯特(Foust)等人,2009)。先前的研究还显示，将AAV8-IDUA直接注射到成年IDUA缺陷小鼠的CNS中引起较低频率或较差水平的转基因表达(参见图18)。以下使用临床前MPS1治疗模型的实例意外地展示，将AAV9-IDUA直接注射到具有免疫能力的成年IDUA缺陷小鼠的CNS中引起与野生型成年小鼠中的IDUA酶表达和活性相同或比其高的IDUA酶表达和活性(参见图15，见下文)。
方法
AAV9-IDUA制备.先前已描述AAV-IDUA载体构筑体(MCI)(伍尔夫等人,2011)(mCags启动子)。在佛罗里达大学的载体中心(University of Florida Vector Core)，将AAV-IDUA质粒DNA包装在AAV9中，得到每毫升3×1013个载体基因组的效价。
ICV输注.使用氯胺酮与甲苯噻嗪的混合液(每千克100mg氯胺酮+10mg甲苯噻嗪)使成年Idua-/-小鼠麻醉并将其放在立体定位架上。使用汉密尔顿注射器(Hamiltonsyringe)将十微升的AAV9-IDUA输注到右侧的侧脑室(立体定位座标距前囟AP 0.4，ML0.8，DV 2.4mm)。将动物放回到其笼中的加热垫上，使其恢复。
鞘内输注.在静脉内注射0.2mL的25％甘露醇之后20分钟，通过在L5与L6椎骨之间注射10μL含有AAV载体的溶液来对年轻的成年小鼠进行输注。
免疫耐受化.通过面部颞静脉向新生IDUA缺陷小鼠注射5μL含有5.8μg的重组艾杜糖醛酸酶蛋白质(Aldurazyme)，并且接着将动物放回到其笼中。
环磷酰胺免疫抑制.对于免疫抑制，从输注AAV9-IDUA载体之后一天开始，每周一次向动物投与120mg/kg剂量的环磷酰胺。
动物.用氯胺酮/甲苯噻嗪(每千克100mg氯胺酮+10mg甲苯噻嗪)使动物麻醉并且穿心灌注70mL PBS，随后将其处死。收集脑并且在冰上将其显微解剖成小脑、海马区、纹状体、皮层以及脑干/丘脑(“其余部分”)。样品在干冰上冷冻并且接着在-80℃下储存。将样品解冻并且使用机动研杵在1mL PBS中使其均质化，并用0.1％的曲通(Triton)X-100进行渗透。通过使用4MU-艾杜糖醛酸作为底物进行荧光测定分析来测定IDUA活性。如通过布拉德福分析(Bradford assay)(伯乐公司(BioRad))测定，活性是以单位每毫克蛋白质(每分钟转化成产物的底物百分比)表示。
组织.通过使用5415D型艾本德台式离心机(Eppendorf tabletop centrifuge)(艾本德公司(Eppendorf))，以13,000rpm离心3分钟使组织匀浆变澄清，并在蛋白酶K、DNA酶1以及RNA酶存在下培育过夜。根据制造商的说明书，使用Blyscan硫酸化糖胺聚糖分析(艾奎特化学公司(Accurate Chemical)测定GAG浓度。
结果
图1显示脑室内(ICV)或鞘内(IT)投与AAV的艾杜糖醛酸酶缺陷小鼠的实验设计。为了预防免疫反应，动物用环磷酰胺(CP)进行免疫抑制，在出生时通过静脉内投与人类艾杜糖醛酸酶蛋白质(aldurazyme)进行免疫耐受化，或在NOD-SCID免疫缺陷并且还是艾杜糖醛酸酶缺陷的小鼠中进行注射。在治疗后的指定时间时处死动物，对脑进行显微解剖并分析提取物的艾杜糖醛酸酶活性。
图2说明ICV注射AAV-IDUA载体的免疫缺陷、IDUA缺陷动物的数据。这些动物在脑的所有区域中展现较高的IDUA表达水平(是野生型的10到100倍)，并且在脑干和丘脑(“其余部分”)中观察到最高水平。
相较于免疫缺陷动物，通过ICV途径投与AAV载体的免疫抑制动物在脑中具有相对较低的酶水平(图3)。应注意，免疫抑制作用在这些动物中可能已经被削弱，因为CP在处死之前2周由于较差的健康状况而停用。
图4显示通过IT途径投与AAV载体的免疫抑制动物的数据。ICV投与AAV载体的免疫耐受化动物在脑的所有部分中展现广泛的IDUA活性(图5)，与在免疫缺陷动物中所观察的情形类似，指示免疫耐受化程序的效用。
图6是用于并排比较的所有平均IDUA活性水平的汇集，并且图7是根据脑区域分组的数据。
对于全部四个测试组，分析在不同脑部分中的GAG贮积物质。对于每一组，脑的每一部分的平均值显示于左侧，每一个别动物的值显示于右侧(图8)。相较于野生型动物(洋红色柱)，IDUA缺陷动物(最左侧)含有高GAG水平。在所有AAV治疗动物组中，脑的所有部分的GAG水平与野生型相同或低于野生型。在鞘内投与AAV9-IDUA的动物的皮层和脑干中，GAG水平略(但不明显)高于野生型。
结论
结果显示，不管递送途径(ICV或IT)如何，IDUA在脑中都有较高并且广泛的分布，不过相较于ICV注射，在IT注射的动物的纹状体和海马区中IDUA表达较低。看来存在免疫反应，因为免疫缺陷小鼠的表达水平高于具有免疫能力的小鼠。就ICV注射来说，当提前停用CP时，IDUA表达较低。此外，免疫耐受化有效恢复高水平酶活性。另外，在所有小鼠治疗实验组中，GAG水平均恢复正常。
实例II
方法
AAV9-IDUA制备。在佛罗里达大学载体中心，或宾夕法尼亚大学(University ofPennsylvania)载体中心，将AAV-IDUA质粒包装在AAV9病毒粒子中，得到每毫升1-3×1013个载体基因组的效价。
ICV输注。参见实例I。
鞘内输注。参见实例I。
免疫耐受化。与实例I中相同，不过：对于多次耐受化，向新生IDUA缺陷小鼠的面部颞静脉注射第一剂Aldurazyme，随后6次，每周一次腹膜内投与注射液。
环磷酰胺免疫抑制。参见实例I。
动物。用氯胺酮/甲苯噻嗪(每千克100mg氯胺酮+10mg甲苯噻嗪)使动物麻醉并且穿心灌注70mL PBS，随后将其处死。收集脑并且在冰上将其显微解剖成小脑、海马区、纹状体、皮层以及脑干/丘脑(“其余部分”)。样品在干冰上冷冻并且接着在-80℃下储存。
组织IDUA活性。将组织样品解冻并且在组织均质机中在生理盐水中将其均质化。通过在台式艾本德离心机中，在4℃下以15,000rpm离心15分钟使组织匀浆变澄清。收集组织溶解产物(上清液)并且分析IDUA活性和GAG贮积水平。
组织GAG水平。在蛋白酶K、RNA酶以及DNA酶存在下将组织溶解产物培育过夜。根据制造商的说明书，使用Blyscan硫酸化糖胺聚糖分析对GAG水平进行分析。
IDUA载体拷贝。如伍尔夫等人(2011)所描述，使用组织匀浆进行DNA分离和随后的QPCR。
结果
图9说明实验设计和分组。通过脑室内(ICV)或鞘内(IT)输注向动物投与AAV9-IDUA载体。载体投与是在兼有NOD-SCID免疫缺陷(ID)和IDUA缺陷的小鼠，或在用环磷酰胺(CP)免疫抑制，或在出生时通过单次或多次注射人类艾杜糖醛酸酶蛋白质(Aldurazyme)免疫耐受化的IDUA缺陷小鼠中进行。载体治疗和处死的时间如图9中指示。所有载体投与都是在3-4.5个月大的成年动物中进行。向动物注射10μL载体，其剂量是每10微升3×1011个载体基因组。
图10显示在经颅内输注的免疫缺陷、IDUA缺陷小鼠中的IDUA酶活性。在脑的所有区域中观察到高水平酶活性，范围是比野生型水平高30到300倍。在丘脑和脑干以及海马区中见到最高酶表达。
经颅内注射并且用环磷酰胺(CP)免疫抑制的动物展示明显低于其它组的酶活性水平(图11)。然而，在此情况下，CP投与由于动物较差的健康状况而不得不在处死前2周停用。
在出生时用IDUA蛋白质(Aldurazyme)耐受化并颅内投与载体的动物的IDUA酶水平描绘于图12中。所有动物在脑的所有部分中显示高酶水平，范围是比野生型水平高10到1000倍，类似于在免疫缺陷动物中达到的水平，指示免疫耐受化程序的效用。
图13描绘经鞘内注射并且每周投与一次CP的小鼠中的IDUA酶水平。在脑的所有部分中，尤其是在小脑和脊髓中观察到IDUA水平升高。在纹状体和海马区中酶水平最低，并且活性处于野生型水平。
如上文所描述，用Aldurazyme使IDUA缺陷小鼠耐受化，并鞘内注射载体(图14)。在脑的所有部分中存在广泛的IDUA酶活性，其中在脑干和丘脑、嗅球、脊髓以及小脑中活性水平最高。与图13中的数据类似，在纹状体、皮层以及海马区中见到最低酶活性水平。
向具有免疫能力的IDUA缺陷对照动物鞘内输注载体，不进行免疫抑制或免疫耐受化(图15)。结果指示，尽管酶活性处于野生型水平或略高于野生型水平，但其明显低于在经历免疫调节的动物中所观察到的活性。酶水平降低在小脑、嗅球以及丘脑和脑干中尤其显著，这些区域在经免疫调节的动物中具有最高酶表达水平。
如图16中所示，分析动物的GAG贮积物质。所有组都展示GAG贮积的清除，并且GAG水平类似于在野生型动物中观察到的水平。经免疫抑制并且鞘内注射AAV9-IDUA载体的动物在皮层中的GAG水平略高于野生型，但仍比未治疗的IDUA缺陷小鼠低得多。
如图16中所图示，通过QPCR评价经免疫耐受化并且颅内或鞘内注射载体的动物中AAV9-IDUA载体的存在。相较于经鞘内输注的动物，经颅内输注的动物中每个细胞的IDUA拷贝数较高，这符合在经颅内注射的动物中所见到的较高酶活性水平。
结论
在成年小鼠中经脑室内和鞘内途径投与AAV9-IDUA之后，在脑的所有区域中观察到较高、广泛和治疗性的IDUA水平。在鞘内输注AAV-IDUA的具有免疫能力的IDUA缺陷动物中酶活性恢复到野生型水平或略高于野生型水平。在从出生开始就通过投与IDUA蛋白质免疫耐受化的动物中，关于两种载体注射途径观察到明显较高的IDUA酶水平。
实例III
用氯胺酮/甲苯噻嗪使具有免疫能力的成年IDUA缺陷小鼠(12周龄)麻醉，随后鼻内输注AAV9-IDUA载体。通过用微量移液管向鼻内腔施加八滴3μL滴液来投与载体，在鼻孔之间交替施加，每次施加之间间隔2分钟。取决于载体来源，向每一成年动物投与总计2.4-7×1011个载体基因组。为了抑制小鼠对由AAV9-IDUA载体生成的人类IDUA的免疫反应，从载体投与之后当天开始，通过每周投与一次120mg/kg环磷酰胺对动物进行免疫抑制。然而，人类个体中的免疫抑制是任选选用的，并且所属领域的技术人员根据良好的/标准的医疗实践将知道何时使用免疫抑制。在载体输注后12周时处死小鼠，分析动物的脑中的IDUA酶表达和载体拷贝数(图19和20)。
实例IV
人类I型粘多糖贮积病(MPS I)模型艾杜糖醛酸酶缺陷小鼠经鼻内投与大约1011个AAV9-IDUA载体拷贝数。四周后处死动物并且对脑进行显微解剖，并提取用于艾杜糖醛酸酶酶分析。如图22中所示(平均值+/-标准差在左侧，个别动物在右侧)，在嗅球中观测到高的IDUA酶活性水平(几乎比野生型大100倍)，且在脑的所有其它区域中观测到野生型的酶水平。图23展示GAG活性。
处死以类似方式处理的动物并且使用抗IDUA抗体对组织切片染色用于检验存在人类IDUA蛋白质。如图24中所示，在左侧四个鼻内载体处理的动物的鼻上皮和嗅球中观测到存在IDUA蛋白质的稳定染色，而在右侧对照未投与的正常或IDUA缺陷动物中未观测到染色。在经AAV-MCI处理的动物脑的其余部分(海马区、小脑、皮层、纹状体、丘脑以及脑干)未观测到染色，表明转导限制于嗅球和鼻上皮。
用大约1011个AAV9-GFP载体的载体基因组作为报告基因系统鼻内处理动物，以鉴别经转导细胞的位置。两周后处死动物，收集组织，并且使用抗GFP抗体(绿色)对切片进行染色用于检验GFP表达，以及DAPI染色(蓝色)以鉴别细胞核(图25)。相比于未处理对照组(右侧图是嗅上皮并且底部图是嗅球)，经处理动物的嗅上皮(左侧两个图)和嗅球(顶部两个图)中均观测到存在稳定的GFP蛋白质染色。在脑的任何其余部分未观测到GFP染色。这些结果符合IDUA染色的结果，表明在鼻内投与AAV9-MCI载体之后，AAV介导的基因转移和表达限制于鼻上皮和嗅球。这些结果暗示在鼻内投与AAV9-MCI载体之后，因为在脑的所有区域中实现野生型IDUA水平的机制，以高水平表达的IDUA在前脑中扩散。用于通过非侵入性鼻内投与AAV载体在前脑中实现高水平治疗性蛋白质表达且后续扩散于整个脑中的这一方法不仅可适用于治疗MPS和相关的代谢疾病，并且可适用于治疗其它更加常见的神经系统病症，如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
实例V
II型粘多糖贮积病(MPS II；亨特综合症(Hunter Syndrome))是由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)缺乏以及糖胺聚糖(GAG)硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的后续积累所导致的X连锁隐性遗传性溶酶体贮积病。受影响的个体展现身体上的、与神经方面相关的以及缩短的预期寿命的表现的严重程度的范围。举例来说，受影响的个体展现如内脏增大、骨骼发育不良、心肺阻塞、神经认知缺陷以及缩短的预期寿命的表现的严重程度范围。此时MPS II没有治愈方法。当前标准治疗是酶替代疗法(ELAPSRASE；艾杜硫酶)，其用于管理疾病进展。然而，酶替代疗法(ERT)未引起神经系统改善。由于造血干细胞移植(HSCT)尚未展示对于MPSII的神经系统益处，当前对于呈现此疾病的神经系统表现的患者不存在临床依靠，并且极其需要新的疗法。
研发AAV9载体用于将人类IDS编码序列(AAV9-hIDS)递送至MPS II小鼠的中枢神经系统中，以恢复经处理动物的脑中的IDS水平，并且预防出现神经认知缺陷(图27A)。具体地说，在存在或不存在用于活化硫酸酯酶活性位点所需的人类硫酸酯酶修饰因子-1(SUMF-1)的情况下生成一系列编码人类IDS的载体。在这些实验中使用三种投与途径：鞘内(IT)(图28至29)，脑室内(ICV)(图30A至D)和静脉内(IV)(图28至29)。在仅用转导hIDS的AAV9载体处理的小鼠与用编码人类IDS和SUMF-1的AAV9载体处理的小鼠之间未发现酶水平的显著差异，不论投与途径如何。经IT投与的NOD.SCID(IDS Y+)和C57BL/6(IDS Y+)当相比于未处理动物时在脑和脊髓中未展示IDS活性升高，而血浆展示与未处理动物相比高10倍(NOD.SCID)以及高150倍(C57BL/6)水平。经静脉内投与AAV9-hIDS的IDS缺陷小鼠在所有器官中展现与野生型相当的IDS活性。此外，经IV注射动物的血浆展示比野生型高100倍的酶活性。经ICV投与AAV9-hIDUA的IDS缺陷小鼠在脑的大部分区域和外周组织中展示与野生型相当的IDS活性，而脑的一些部分展示比野生型高二到四倍的活性。此外，血浆中的IDS活性比野生型高200倍。出人意料地，在所有经处理动物的血浆中的IDS酶活性展示注射后持续至少12周，因此，IDS酶至少在C57BL/6鼠类背景中不是免疫原性的。使用巴恩斯迷宫进行额外神经行为测试，以从野生型同窝幼畜区分未处理MPS II动物的神经认知缺陷。发现受影响动物的学习能力明显短于同窝幼畜中观测到的学习能力。因此，巴恩斯迷宫用于寻找这些疗法在MPS II鼠类模型中的益处(图31A至B和32)。这些结果指示AAV9介导的人类IDS基因转移至CNS以预防MPS II中的神经功能缺失的治疗益处的潜能。
综上所述，脑室内(ICV)注射AAV9-hIDS引起IDS酶缺乏的全身性校正，包括脑中IDS的野生型水平。共递送hIDS和hSUMF-1未升高组织中的IDS活性。hIDS在WT和MPS IIC57BL/6小鼠中的表达是非免疫原性的。
实例VI
I型粘多糖贮积病(MPS I)是由α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏所导致的遗传性常染色体隐性代谢疾病，引起硫酸肝素和硫酸皮肤素糖胺聚糖(GAG)积累。患有所述疾病的最严重形式(贺氏综合症)的个体遭受神经退化、智力迟钝以及10岁时死亡。此疾病的当前治疗包括同种异体造血干细胞移植(HSCT)和酶替代疗法(ERT)。然而，这些治疗在处理所述疾病的CNS表现时不充分有效。
目标是通过用IDUA基因转移至CNS补充当前ERT和HSCT来改善重度MPS I的疗法，由此预防所述疾病的神经表现。在此研究中，测试静脉内投与的AAV血清型9和rh10(AAV9和AAVrh10)穿过血脑屏障用于在CNS中递送和表达IDUA基因的能力(图33)。4至5个月大的成年MPS I动物通过尾静脉经静脉内输注编码人类IDUA基因的AAV9或AAVrh10载体。基于每周一次收集血液和尿液样品直至在注射后第10周时处死动物。在注射后3周时经处理动物中的血浆IDUA活性接近比杂合对照组的血浆IDUA活性高1000倍(图34)。分析脑、脊髓和外周器官的组织切片的IDUA活性、GAG积累清除以及IDUA免疫荧光法(图34至36)。经处理动物在所有器官，包括CNS中展现广泛的IDUA酶活性的恢复。这些数据显示全身性AAV9和AAVrh10载体输注抵抗MPS I的CNS表现的有效性。
实例VII
I型粘多糖贮积病(MPS I)是由α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏所导致的进展性、多系统性、遗传性代谢疾病。此疾病的最严重形式(贺氏综合症)导致10岁时死亡。此疾病的当前治疗在治疗CNS疾病中是无效的，因为溶酶体酶不能穿过血脑屏障。目标是通过AAV介导的IDUA基因递送和表达补充当前疗法，并且治疗所述疾病的CNS表现。
治疗CNS疾病的非侵入性和有效方法通过鼻内投与编码IDUA的AAV9载体进行。成年IDUA缺陷小鼠在出生时用人类艾杜糖醛酸酶免疫耐受化，以预防抗IDUA免疫反应，并且在3个月大时鼻内输注CAGS(CMV强化子/β肌动蛋白启动子/血球蛋白内含子)调节的AAV9-IDUA载体。在输注后3个月时处死的动物在嗅球中展现是野生型100倍的IDUA酶活性水平，且脑的所有其余部分中野生型酶水平恢复(图37)。用AAV9-IDUA鼻内治疗还导致脑的所有部分中组织GAG贮积物质减少(图38)。使用巴恩斯迷宫的神经认知测试展现经处理IDUA缺陷小鼠并不会不同于正常对照动物，而未处理IDUA缺陷小鼠展现明显的学习力不足(图40)。未感染的杂合动物在此测试中展现改善的表现，而MPS I小鼠显示定位逃脱的不足。明显地，用AAV9-IDUA鼻内处理的MPS I小鼠展现类似于杂合对照组的行为，表明预防未处理MPS I动物中所见的神经认知缺陷(图40D)。
在鼻上皮和嗅球的组织切片中观测到强的IDUA免疫荧光法染色，但在脑的其余部分未观测到染色(图39A至B)。此指示IDUA酶的广泛分布最可能是酶从嗅球和鼻上皮中的转导和IDUA表达部位扩散至脑的较深区域的结果。为了增加达成在整个脑中的递送和载体分布，用鼻内输注吸收增强剂预处理IDUA缺陷动物。在预处理之后的不同时间点，用编码IDUA的AAV9或AAVrh10载体对动物进行鼻内输注。在输注后2个月时处死动物，进行脑显微解剖，并且分析IDUA酶活性、糖胺聚糖清除以及IDUA和GFP的免疫荧光法染色。此鼻内投与AAV9-IDUA的新颖非侵入性策略可潜在地用于治疗MPS I的CNS表现和其它溶酶体疾病。
实例VIII
I型粘多糖贮积病(MPS I)是由α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)缺乏所导致的常染色体隐性溶酶体贮积病，引起糖胺聚糖积累。所述疾病的表现包括多系统性病症，并且在所述疾病的严重形式(贺氏综合症)中，在十岁时死亡。当前使用的治疗，如酶替代疗法和同种异体造血干细胞移植似乎对于治疗CNS无效。在此研究中我们已使用鞘内递送转导IDUA基因的腺相关病毒血清型9载体(AAV9-IDUA)到患有MPS I的基因敲除小鼠模型中的CNS。此研究的目的是分析AAV介导的基因疗法预防与MPS I疾病相关的病理性神经化学变化的能力。
方法
缺乏IDUA的C57BL/6基因敲除小鼠用作良好确立的贺氏综合症模型。AAV9-IDUA载体在小鼠12周大时鞘内递送至MPS I小鼠。在AAV投与之前，对小鼠注射甘露糖醇以打开血脑屏障，并且用拉罗尼酶(laronidase)免疫耐受化以预防抗IDUA免疫反应。在9个月大时从经AAV9-IDUA基因处理MPS I小鼠(MPS I处理，N＝11)、未处理MPS I小鼠(MPS I，N＝12)和杂合同窝幼畜(对照，N＝12)的海马区和小脑获取体内1H MR谱图。在9.4T使用FASTMAP匀场和超短TE流(TE＝2ms)定位序列以及蒸气水抑制获取1H MRS数据。使用LCModel通过包括于基集中的快速松散大分子的谱图定量代谢物。自主呼吸动物用1.0-1.5％异氟醚麻醉。
结果
在此研究中不断实现的谱图品质使得定量十五种脑代谢物是可靠的。相对于对照组，在未处理MPS I小鼠的海马区中观测到小的但是显著的抗坏血酸盐(Asc，+0.6μmol/g，p＝0.003)和N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG，+0.3mol/g，p＝0.015)浓度提高。另外，已观测到谷胱甘肽水平(GSH，+0.2μmol/g，p＝0.054)增加的趋势。未处理MPS I小鼠和对照组的小脑神经化学特征之间的区别包括NAAG(0.25μmol/g，p＝0.026)增加和磷酸乙醇胺(PE，-0.44μmol/g，p＝0.04)减少。经AAV9-IDUA处理的MPS I小鼠的神经化学特征展示与对照小鼠引人注目的类似性(图42A至B)。在经处理MPS I小鼠的海马区中，Asc、NAAG和GSH水平规范化；仅乳酸盐(Lac)相对于对照展示小的差异。在经处理MPS I小鼠的小脑中，PE水平规范化，但NAAG并非如此。在经处理和对照小鼠之间观测到Asc、Lac牛磺酸(Tau)和总肌酸(Cr+PCr)的小的但显著的区别。除Asc以外，经处理MPS I小鼠中的代谢物浓度变化始终与在未处理组中观测到的那些相反。另外，对于在未处理MPS I小鼠与对照组之间未展示显著变化的多种代谢物(例如葡萄糖、谷氨酸盐、NAA)，似乎经处理MPS I小鼠中发现的代谢物水平比未处理MPS I小鼠更接近对照组。
讨论
未处理MPS I小鼠的海马区中Asc浓度的显著增加和GSH增加的趋势指示抵抗溶酶体疾病中报告的氧化应激的保护性反应。而未处理MPS I的小脑中减少的PE和两个脑区域中增加的NAAG可指示髓鞘脱失。在铁缺陷模型中观测到类似的PE减少和NAAG增加图案，其中确认改变的髓鞘形成。经处理MPS I小鼠对未处理MPS I和对照小鼠的海马和小脑神经化学特征的比较明确表明使用AAV9的鞘内递送(在12周大时)直接将缺失IDUA基因转移至CNS，预防与此MPS I小鼠模型中神经变性过程相关的神经化学变化(9个月大时)。这些神经化学结果与在MPS I的小鼠模型中测试的类似基因治疗方法一致。
基于直接递送AAV9-IDUA至CNS的基因疗法指示可预防与此MPS I小鼠模型相关的氧化应激和髓鞘脱失。
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所有出版物、专利以及专利申请都以引用的方式并入本文中。虽然在前述说明书中，已经关于本发明的某些优选实施例描述本发明，并且出于说明的目的已经阐述许多细节，但所属领域的技术人员将显而易见，本发明容许另外的实施例并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文中的某些细节可以大幅变化。

Claims (21)

1.一种在患有溶酶体贮积病的哺乳动物的中枢神经系统中促进神经认知或减少神经病理的方法，其包含：向所述哺乳动物投与包含一定量的包含编码溶酶体贮积酶的开放阅读框架的重组腺相关病毒rAAV载体的组合物，相对于未投与所述rAAV的患有粘多糖贮积病的哺乳动物，所述组合物在整个脑中有效促进神经认知或减少神经病理。
2.一种预防或抑制患有溶酶体贮积病的哺乳动物的神经认知功能障碍或神经病理的方法，其包含：向所述哺乳动物投与包含有效量的包含编码溶酶体贮积酶的开放阅读框架的重组腺相关病毒rAAV载体的组合物。
3.一种在有需要的哺乳动物中提供中枢神经系统中溶酶体贮积酶缺乏的交叉校正的方法，其包含：向所述哺乳动物投与有效量的组合物，所述组合物包含有效量的包含编码溶酶体贮积酶的开放阅读框架的重组腺相关病毒rAAV载体，所述溶酶体贮积酶在所述哺乳动物中的表达提供交叉校正。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物不经免疫抑制剂治疗。
5.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物经免疫抑制剂治疗。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫抑制剂包含环磷酰胺。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫抑制剂包含糖皮质激素、包括烷化剂的细胞抑制剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或作用于免疫亲和素的药剂。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫抑制剂包含氮芥、亚硝基脲、铂化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、放线菌素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素、针对IL-2受体(CD25)或CD3的抗体、抗IL-2抗体、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、IFN-β、IFN-γ、类鸦片或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。
9.根据权利要求6到8中任一权利要求所述的方法，其中所述rAAV和所述免疫抑制剂是共投与的或所述免疫抑制剂是在所述rAAV之后投与。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物在投与rAAV之前不经免疫耐受化。
11.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物在投与rAAV之前经免疫耐受化。
12.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物是具有免疫能力的成年哺乳动物。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的方法，其中所述rAAV载体是rAAV1、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAVrh10或rAAV9载体。
14.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其中所述基因产物是α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、β-己糖胺酶、α-半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶或葡糖脑苷脂酶。
15.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物缺乏α-L-艾杜糖醛酸酶。
17.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物患有I型粘多糖贮积病症、II型粘多糖贮积病症或VII型粘多糖贮积病症。
18.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法，其中投与多次剂量。
19.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法，其中每周投与一次所述组合物。
20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的方法，其中所述量抑制生长延迟、抑制肝脾大、抑制心肺疾病，或抑制骨骼发育不良或其任何组合。
21.根据权利要求1到20中任一权利要求所述的方法，其中所述rAAV是rAAV9或rAAVrh10。
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