KR20180116159A - 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 정제 방법 - Google Patents

양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 유사항체의 불순물을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유사항체의 생산과정에서 생긴 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 분리하고, 양이온 교환 크로마토그래피의 용출용액을 사용하여 목적 항체절편만을 높은 순도와 수율로 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 정제 방법{Method of Purifying Analogous Antibody Using Cation Exchange Chromatography}
본 출원은 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 유사항체의 불순물을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유사항체의 생산과정에서 생긴 불순물인 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 제거하고, 양이온 교환 크로마토그래피의 용출용액을 사용하여 목적 유사항체절편만을 높은 순도와 수율로 정제하는 방법에 관한 것이다.
유사항체를 박테리아를 이용하여 생산하는 과정에서 여러 유형의 아형과 유사항체의 단일절편이 생성된다. 이런 제품 외의 불순물들은 최적의 클론을 제작하고 발효 공정의 개선연구를 통해 최대한으로 줄이는 방법을 고안해야 한다. 그러나 목적한 최적의 제품을 만들어 내기 위해서는 정제 공정에서 대부분 제거할 수 있는 연구를 해야하며, 보관 중에서 더 이상 증가하지 않게 하는 조건을 찾아야 한다.
단백질 치료제의 대표적인 물질인 단일 클론 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 능력과 관련된 모든 부분에서 체내에 사용이 가능하기 때문에 치료제 개발에 굉장히 매력적인 도구가 되고 있다.
단일 클론 항체 또한 세포 내 발현 과정 중 여러 유형의 아형이 생성되는데, 이러한 아형 중에서도 제품 관련 불순물이 생성되지 않고 약효를 최대한으로 갖도록 하기 위해서는 클론선택과 배양 공정 개발을 통해 이를 해결해야 한다. 하지만 이후에도 제품 관련 불순물의 아형이 남아 있는 경우 정제 공정 중 또는 보관 중 더 이상 증가하지 않도록 노력해야 한다.
제품 관련 불순물은 제품과 매우 유사한 속성을 가지고 있어 정제 공정에서 사용되는 크로마토그래피를 통한 분리가 매우 어렵지만, 최근에 기술이 발달함에 따라 정제 공정 개발을 통해서도 이러한 제품 관련 불순물을 제거하려는 시도를 하고 있다(한국공개특허 제10-2013-0064803호).
본 발명자들은 유사항체의 불순물의 분리방법으로, 본 출원에 기재된 특정 용출용액을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 제품외의 불순물을 대부분 제거할 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원이 해결하고자 하는 과제는 양이온 교환 크로마토그래피와 최적화된 용출용액을 이용하여 목적 항체절편을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, (a) 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 평형용액 (equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계; (b) 세척 용액으로 세척하는 단계; 및 (c) pH 4.9 이상부터 pH 5.2 이하 범위의 pH를 갖는 아세트산 나트륨 용출용액을 이용해 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼으로부터 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 제거하는 단계를 포함하는, 목적 항체절편의 정제 방법을 제공하는 것이다.
기존에 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 대표적인 항체절편 의약품인 라니비주맙을 높은 순도로 분리하였으나, 많은 불순물의 함유로 인하여 임상실험시 염증을 유발하여 임상 배치에 실패한 경우가 보고되었다. 이는, 단순히 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 순도가 높은 항체절편을 분리하였다고 하더라도, 최적화된 정제조건을 찾지 못하면 실제 임상단계에서 문제를 일으킬 수 있음을 시사하는 것이다. 그러나, 본 출원은 용출용액의 최적화를 통해 불필요한 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 효과적으로 분리하고, 고순도를 갖는 목적 항체절편을 정제하는 방법을 규명하였다는 점에서 의의가 크다고 할 수 있다.
특히, 유사항체 바이오시밀러의 제조에 본 출원의 방법을 적용하는 경우, 대조약과 동일 또는 대응하는 조성으로 주활성 항체절편 및 아형 항체절편을 포함하는 유사항체절편을 제조할 수 있다.
상기 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면, 다음과 같다. 먼저 (a) 단계는 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료를 평형용액 (equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계이다.
본 출원에서 용어, "유사항체의 혼합액을 포함하는 시료"는 유사항체를 생산하는 세포의 배양 상등액 또는 상기 세포의 파쇄물로부터 부분 정제된 시료로서, 주활성 항체절편, 아형 항체절편을 모두 포함하는 유사항체의 혼합액을 포함하는 부분 정제된 시료를 의미한다. 상기 부분 정제는 여과 과정을 수행하였으나 목적 유사항체절편 외의 다른 단백질, 구체적으로는 유사항체 단일절편 또는 유사항체 아형 등이 존재하는 상태를 의미한다.
상기 용어, "주활성 항체절편"은 본 출원의 항체 집단에 포함되는 주요 구성요소로서, 항체절편 중에서 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형(modification)되어 생물학적 활성이 낮아지지 않은 상태의 항체절편, 즉 산성 또는 염기성 아형 항체절편이 아닌 항체절편을 의미한다. 상기 주활성 항체절편은 목적하는 항체절편의 품질을 조절하기 위해 가장 중요한 구성요소로, 항체의 구성요소 중 생물학적 활성이 가장 높은 항체절편이다.
상기 용어, “아형 항체절편”은 주활성 항체절편의 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형된 항체절편을 의미하며, 산성 아형 항체절편 및 염기성 아형 항체절편을 포함한다. 그 예로, 아미노산 중 아스파라긴 (Asparagine)이 탈아민되어 아스파테이트(Aspatate)가 된 아형 항체절편, 아미노산 중 메치오닌(methionine)이 산화되어 메치오닌셀페이트 (Methionine sulfate)가 된 아형 항체절편 등이 있다. 또한, 중쇄의 N 말단에 글루타메이트(glutamate)가 존재하는 경우, 상기 글루타메이트가 오각형 링 구조를 형성하여 파이루글루타메이트 (Pyruglutamate)로 변형된 아형 항체절편을 포함한다. 상기 아형 항체절편들은 박테리아 세포와 같은 숙주 세포에서 항체절편을 생성하는 경우에 높은 비율로 숙주세포 배양액에 포함되어 있어, 크로마토그래피와 같은 과정을 통하여 제거되어 목적하는 비율로 항체절편에 포함되어야 한다.
본 출원에서 사용된 "이온 교환 크로마토그래피"는 이온을 서로 교환하는 크로마토그래피 물질을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 구체적으로, '이온을 서로 교환하는 크로마토그래피 물질'은 고분자 물질에 작용기 (functional group)을 결합시킨 것으로 극성, 비극성 용액중에 녹아있는 이온성 물질을 서로 교환하여 정제하는 물질을 의미한다. 또한, 이온 교환 크로마토그래피는 교환기에 따라 이온교환 효율 및 목적이 다르며 양이온을 교환하는 경우 양이온 교환수지 (cation exchange resin)라 하며, 음이온을 교환하는 경우 음이온 교환수지 (anion exchange resin)라 한다.
본 출원에서의 목적상 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용할 수 있다. 구체적으로, "양이온 교환 크로마토그래피 컬럼"은 양이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 의미하며, 본 출원에서는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 유사항체 아형 및 불순물 등을 제거할 수 있다. 양이온 교환 수지는 술폰산기 (S)와 카복시메틸기 (CM)으로 구분할 수 있으며, 각기 성질에 따라 유효 pH, 교환 효율, 재생효율 및 이온흡착성 등이 다르다. 또한, 양이온 교환 수지는 수용액 속의 양이온과 자신의 양이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지로서, 항체의 경우 등전점이 높으므로 등전점 값 이하의 pH 완충용액에서는 양이온을 띠게 된다. 따라서, 상기 양이온을 띠는 항체를 흡착할 수 있는 양이온 교환 수지를 이용하여 항체 집단의 품질을 높일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 구체적으로는 COO- 또는 SO3의 작용기를 가지고 있는 컬럼을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 카복시메틸(CM), 프락토젤(fractogel), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S) 등을 사용할 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 카복시메틸 세파로오스(CM sepharose) 또는 프락토젤(fractogel) COO-를 사용할 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계의 항체의 혼합액을 포함하는 시료는 적재 전에 pH 4.5 이상부터 pH 5.5이하 범위의 pH를 갖는 평형용액으로 칼럼을 평형시키는 것일 수 있다. 상기 (a) 단계에서의 평형용액은 5 mM 이상부터 50 mM 이하 범위의 염농도를 갖는 것일 수 있으며, 상기 평형용액은 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 및 시트르산 나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법은 상기 (a) 단계 이전에 이온교환 크로마토 그래피, 농축 및 투석 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 항체 또는 항체절편의 1차적인 불순물을 제거하고 시료의 농도를 높이기 위한 것이다. 구체적으로 상기 (a) 단계 이전에 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 농축 및 투석을 진행하고, 음이온 크로마토그래피로 정제하는 단계를 미리 수행한 후, 양이온 교환 친화성 크로마토그래피에 적재(loading)할 수 있다. 1차적인 불순물을 제거하고 시료의 농도를 높이기 위한 작업이라면 제한되지 않고 적용될 수 있다. 일예로 상기 (a) 단계 이전에 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료를 CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계를 미리 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적 유사항체절편의 정제 방법에서, (b) 단계는 세척용액으로 세척하는 단계로, 시료가 적재된 크로마토그래피에 세척용액을 적용하는 단계이다.
상기 세척용액의 pH 값은, 상기 유사항체 단일절편의 pI 값 초과부터 상기 목적 유사항체절편의 pH 값 미만의 범위를 가지는 것을 포함하는 것 일 수 있다. 구체적으로, pI로 측정된 값보다 1.0 정도 낮고 유사항체 단일절편의 pI값보다는 높은 pH를 가지는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, pH는 6.7 이상부터 7.3 이하 범위의 pH를 갖을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 세척용액의 염농도는 5 mM 이상부터 25 mM 이하 범위인 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
유사항체절편의 경우 등전점이 높으므로 pH를 낮춘 산성 조건에서 응집이 되지 않는 반면, 일반적으로 유사항체절편보다 등전점이 낮은 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료의 경우 pH를 낮춘 산성 조건에서 전하가 제거되어 반 데르 발스(van der waals) 힘에 의해 응집될 수 있다. 따라서, 본 출원에서 정제하고자 하는 유사항체절편의 등전점보다 낮음과 동시에 상기 유사항체 단일절편의 등전점보다는 높은 pH값을 사용할 수 있다. 즉, 상기 pH는 정제하고자 하는 유사항체절편의 등전점1.0 보다 작은 값일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 세척용액은 인산 나트륨, 염화나트륨, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), Bis-Tris (2-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol), MOPS (3-Morpholinopropane-1-sulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상 상기 (b) 단계에서 세척용액에 의하여 분리되는 물질은 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형일 수 있다.
본 출원의 용어 "유사항체 아형"은 산성 아형 및/또는 염기성 아형일 수 있다. 유사항체 생성물에는 여러 유사항체 아형들이 존재하므로, 바이오시밀러를 제조하기 위해서는 대조약과 가장 유사하게 품질을 만드는 것이 동등성 입증 측면에서 중요하다. 상기 아형 항체절편들은 주활성 항체절편의 몇 개의 아미노산의 변형된 형태로, 주활성 항체절편, 산성 아형 항체절편 및 염기성 아형 항체절편 간에 전하(charge)의 미세한 차이가 있다. 따라서, 이 전하 차이를 이용하여 아형 항체절편을 분리할 수 있다. 다만, 상기 전하차는 단지 몇 개의 아미노산에 의한 미세한 차이이므로 분리를 위해서는 매우 세밀한 조건설정이 필요하다. 따라서, 본 출원의 양이온 교환 컬럼은 상기 산성 아형 항체절편 및 염기성 아형 항체절편의 효과적인 제거를 할 수 있다.
본 출원에서 상기 정제 방법은 상기 (a) 또는 (b) 이후에 재평형용액으로 재평형화를 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 재평형용액은 pH 4.9 이상부터 pH 5.2 이하 범위의 pH를 갓을 수 있으며, 염농도는 1 mM 이상부터 5 mM 이하의 범위인 것일 수 잇으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적 항체절편의 정제 방법에서, (c) 단계는 pH 4.9 이상부터 pH 5.2 이하 범위의 pH를 갖는 아세트산 나트륨 용출용액을 이용해 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼으로부터 목적 유사항체절편을 회수하는 단계일 수 있다.
상기 용출용액은 pH 4.9 이상부터 pH 5.2 이하 범위의 pH를 갖는 것일 수 있으며, 염농도는 85 mM 이상부터 110 mM 이하 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용출용액의 pH가 4.9 미만인 경우에는 목적 유사항체절편이 분리되지 않고, 용출용액에서 유사항체 단일절편 또는 유사항체 아형 등의 불순물이 분리되는 문제점이 있고, pH 5.2 초과인 경우 목적하는 유사항체절편이 전혀 분리되지 않는 문제점이 있어 바람직하지 않다.
또한, 상기 용출용액은 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "목적 유사항체절편"은 분리하고자 하는 단백질의 한 종류로서, '목적 단백질'과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상 목적 유사항체절편은 상기 정제 방법에 의해 유사항체 단일절편 또는 유사항체 아형이 제거된 것으로 상기 불순물들과 목적 유사항체 절편이 분리되었는지 여부는 CEX-HPLC과 SDS-PAGE, CE-SDS를 통하여 확인할 수 있으나, 유사항체의 산성 및 염기성 아형과 단일 항체 절편을 확인할 수 있는 것이면 이에 제한되지 않는다. 또한, 최적의 용출용액 농도를 설정하여 이량체 및 다량체가 대부분 분리된 것은 SE-HPLC 분석을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
유사항체 단일절편은 scFv 형태 또는 중사슬 단일 사슬, 경사슬 단일 사슬 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
항체 절편의 종류로는 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 등을 모두 포함한다. 상기 Fv는 이중디설파이드 Fv(dsFv) 및 단쇄 Fv(scFv) 형태를 모두 포함한다. Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다.
항체절편은 Fv, scFv 및 Fab와 같이 항체 중 항원과의 결합에 필수적인 일부 절편만을 사용하여 구성되는 것을 의미하며, 표적과 특이적으로 결합해 약효를 나타내기 때문에 단백질 치료제로 많이 사용되고 있다. 또한, Fc가 없는 Fab는 당체나 당화가 존재하지 않기 때문에 당의 종류에 따라 치료효과에 영향이 없는 것으로 알려져 있다. 그러나, 항체와 달리 불순물들과 분자량 차이가 크지 않아 정제 공정에서 크로마토그래피를 이용한 분리가 어렵다. 본 출원의 목적상 정제된 항체절편은 Fab 형태의 라니비주맙 항체 절편, 또는 다양한 Fab일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "불순물"은 목적하는 단백질 이외의 어떠한 물질이어도 포함되며, 그 예로는 아형, 이량체, 다량체, 단일 항체 절편, 숙주 유래 DNA, 숙주 유래 단백질, 내독소 등을 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질의 순도는 용출용액으로부터 정제 후 HPLC 분석을 통해 측정할 수 있으며, 구체적으로 CEX-HPLC를 사용하여 분석 할 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.
또한, 본 출원의 정제 방법으로 정제된 목적 유사항체절편은 치료용 단백질로 사용될 수 있다. 본 출원에서 사용된 용어 "치료용 단백질"은 통상적으로 바이오 의학에 사용되는 단백질을 총칭하는 개념으로서, 다양한 생리활성을 가지는 것을 의미한다. 상기 생리활성은 유전표현과 생리기능을 조정하여 생체 내에서 기능조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아 주는 역할을 하는 것으로서, 일반적인 단백질 치료제를 포함할 수 있다.
본 출원에서 상기 치료용 단백질은 생체 내에서 생리활성을 가지는 것이면 제한없이 포함하나, 그 예로서 항체 절편, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상 상기 정제방법을 이용하는 경우, 고순도의 목적 유사항체절편을 분리할 수 있다. 본 출원의 목적상 어떠한 종류의 크로마토그래피를 이용하여 낮은 순도로 분리된 목적 유사항체 혼합액을 포함하는 시료라도 상기 정제방법을 이용하는 경우, 고 순도의 분리된 목적 유사항체절편을 얻을 수 있다. 일 예로 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리된 92%의 순도를 갖는 목적 유사항체절편을 본 출원의 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제방법으로 재 정제하는 경우, 순도가 99% 이상인 목적 유사항체절편을 분리할 수 있다.
본 출원은 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 유사항체의 불순물을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유사항체의 생산과정에서 생긴 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 양이온 교환 크로마토그래피의 완충 용액을 사용하여 높은 순도와 수율로 정제할 수 있다. 그러므로 본 출원의 방법은 박테리아 발효로부터 유전자 재조합 기술로 생산된 유사항체를 정제하는데 응용될 수 있다.
도 1은 본 출원의 실험수행 절차를 나타낸 것이다.
도 2a는 용출용액이 110 mM의 농도일 때 최적의 분리능을 가지는 것을 확인한 것이며, 목적 단백질이 분리됨을 확인한 것이다.
도 2b는 유사항체 아형 및 유사항체 단일절편의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 순도가 98% 이상임을 확인한 것이다.
도 2c는 5mM 내지 300mM 용출용액을 농도 구배로 용출한 결과를 나타내는 것이다. 구체적으로 1번은 유사항체 단일절편(single chain)을 나타내는 것이고, 도 2c의 2번은 산성 아형 항체절편(acidic variants)을 나타내는 것이다.
도 2d는 도 2c의 결과를 SDS-PAGE를 통해 확인한 것이다.
도 3a는 용출용액이 110 mM의 농도일 때 최적의 분리능을 가지는 것을 확인한 것이며, 목적 유사항체절편이 분리됨을 확인한 것이다.
도 3b는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 98% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 4a는 친화성 수지의 종류가 바뀌어도 동일한 용출용액의 pH 및 염농도조건에서 분리능이 유지됨을 확인한 것이다.
도 4b는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 98% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 5a는 용출용액의 조건를 다르게 하였을 때 분리능이 있는지 여부를 확인한 것이다.
도 5b는 도 5a의 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 98% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 5c는 세척용액은(44 mM 아세트산 나트륨, pH 5.2)을 이용하여 분리된 물질을 CEX-HPLC로 분석한 결과이다.
도 6a는 용출용액의 조건(20 mM 히스티딘-염산, 30 mM 염화나트륨, pH 5.7 완충용액)를 다르게 하였을 때 분리능이 있는지 여부를 확인한 것이다.
도 6b는 도 6a의 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 산성 아형절편과 염기성 아형절편이 제대로 분리 되지 않은 것을 확인한 것이다.
도 6c, 도 6d, 도 6e는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CE-SDS로 분석한 결과로서, 각각 대조군, 비교예 1 및 실험예 2의 결과를 나타낸다.
도 6f, 도 6g는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 SE-SDS로 분석한 결과로서, 각각 대조군, 비교예 1 및 실험예 2의 결과를 나타낸다.
도 7은 용출용액의 조건를 다르게 하였을 때 분리능이 있는지 여부를 확인한 것이다.
이하, 본 출원의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 출원을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 출원의 내용이 한정되는 것은 아니다.
조건 실험예 1 실험예 2 실험예 3 실험예 4 비교예 1 비교예 2
친화성 크로마토그래피(실시예1) 수지 CH-1 CH-1 Kappa CH-1 CH-1 CH-1
양이온 크로마토그래피 수지 Capto SP ImpRes Capto SP ImpRes Capto SP ImpRes Capto SP ImpRes Capto SP ImpRes Capto SP ImpRes
평형버퍼
염종류 및 농도		 50 mM아세트산나트륨 50 mM아세트산나트륨 50 mM아세트산나트륨 50 mM아세트산나트륨 20 mM 히스티딘, 30 mM 염화나트륨 50 mM아세트산나트륨
평형버퍼pH pH 4.5 pH 4.5 pH 4.5 pH 4.5 pH 5.2 pH 4.5
재평형버퍼염종류 및 농도 5 mM아세트산나트륨 5 mM아세트산나트륨 5 mM아세트산나트륨 - 20 mM 히스티딘, 30 mM 염화나트륨 5 mM 아세트산나트륨
재평형버퍼pH pH 4.9 pH 4.9 pH 4.9 - pH 5.2 -
세척버퍼염종류 및 농도 25 mM MOPS 25 mM MOPS 25 mM MOPS 44 mM아세트산나트륨 - 25 mM MOPS
세척버퍼pH pH 7.0 pH 7.0 pH 7.0 pH 5.2 - pH 7.0
용출용액염종류 및 농도 5 mM아세트산나트륨부터 300 mM 아세트산 나트륨 (0%~100% 선형 농도 구배) 110 mM아세트산나트륨 110 mM아세트산나트륨 85 mM아세트산나트륨 20 mM 히스티딘, 30 mM 염화나트륨 5 mM아세트산나트륨부터 300 mM 아세트산 나트륨 (0%~100% 선형 농도 구배)
용출용액pH pH 4.9 pH 4.9 pH 4.9 pH 5.2 pH 5.7 pH 4.5
결과 세척버퍼에서 단일절편 및 산성 아형분리, 용출공정에서 불순물 대부분 제거된 항체절편 얻음 (도 2) 세척버퍼에서 단일절편 및 산성 아형분리, 용출공정에서 불순물 대부분 제거된 항체절편 얻음 (도 3) 세척버퍼에서 단일절편 및 산성 아형분리, 용출공정에서 불순물 대부분 제거된 항체절편 얻음 (도 4) 세척버퍼에서 단일절편만 분리, 용출공정에서 불순물 대부분 제거된 항체절편 얻음 (도 5) 단일절편 및 항체 아형 분리 못함 (도 6) 세척버퍼에서 단일절편 및 산성 아형분리, 용출 공정에서 불순물이 분리되고, 항체절편은 나오지 않음
(도 7)
항체절편은 항체와 달리 고순도로 정제하는데 어려움이 있다. 본 출원에서는 고순도의 항체절편을 정제하기 위하여 친화성 크로마토그래피 정제 공정을 수행하고(실시예 1), 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 정제 공정을 수행하였다(실시예 2).
실시예 1: 친화성 크로마토그래피를 이용한 유사항체의 정제
친화성 크로마토그래피는 실험예 3의 경우를 제외하고 중사슬 친화성 크로마토그래피를 적용하였다. 중사슬 친화성 크로마토그래피란 항체의 일부분인 중사슬과 특이적으로 결합할 수 있는, 즉 중사슬 친화성 수지를 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 실시예 1에서는 중사슬 친화성 수지의 일 예로 CaptureSelectTM CH-1 XL Affinity Matrix (Thermo Fisher, 이하 CH-1으로 지칭한다.)를 사용한 경우를 예로 들었으나, 중사슬 수지의 예가 이에 제한지는 않으며, 중사슬과 특이적으로 결합할 수 있는 수지이면 어떤 것이든 사용 가능할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 중사슬 친화성 수지로 CH-1을 사용한 친화성 크로마토그래피를 CH-1 친화성 크로마토그래피로 지칭할 수 있다.
친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출은 산성 조건에서 (50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5±0.1) 수행하였다. 용출용액은 전도도가 3.5±0.3 mS/cm인 것을 사용하였으며, 제균필터를 이용해 용출용액을 필터링한 후 필터링된 용출 용액을 양이온 크로마토그래피에 적재하였다. CH-1 친화성 크로마토 그래피를 이용하여 정제된 절편은 약 92-93% 순도를 가질 수 있으며, 이하 이를 전제로 개시된 출원을 설명하도록 한다.
또한, 본 출원의 정제 방법이 실질적인 효과를 가질 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 대표적인 항체절편 의약품인 라니비주맙(Ranibizumab)을 정제 대상으로 선정하였다.
실시예 2: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체절편의 정제
실험예 1: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체절편의 정제 조건 설정(용출용액의 조건 설정)
실시예 1에서 CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 (Capto SP ImpRes, GE Healthcare)에 적재하여 유사항체절편을 분리하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
*크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto SP ImpRes
- 유속: 90 cm/h
- 평형: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재평형: 5 mM 아세트산 나트륨, pH 4.9 완충용액
- 세척: 25 mM MOPS, pH 7.0 완충용액
- 용출: 5 mM ~ 300 mM 아세트산 나트륨, pH 4.9 완충용액 선형 농도 구배
양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었다. CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료는 재평형을 거쳐 세척하였다.
세척용액은 완충용액 (25 mM MOPS, pH 7.0)을 이용하는 방식을 도입하였다. 세척용액에서 분리되는 물질을 CEX-HPLC로 분석하였으며, 그 결과는 도 2c를 통해 알 수 있다. 구체적으로 도 2c의 1번은 항체 단일 절편(single chain)을 나타내는 것이고, 도 2c의 2번은 산성 아형 항체 절편(acidic variants)을 나타내는 것이다. 또한, 상기 물질을 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과도 CEX-HPLC 결과와 동일하게 나타남을 확인하였다(도 2d).
이어서, 다시 재평형을 거치고 용출 조건을 설정하기 위해 5mM 내지 300mM 아세트산 나트륨을 사용하여 선형 농도 구배로 용출하였다. 이 후, 자외선의 최고점부터 최고점의 30% 지점까지의 제품을 수집하였고, 그 외의 부분은 나누어 수집하여 CEX-HPLC로 분석 후에 결과 확인 후 추가로 제품에 포함하거나 하지 않았다.
상기 시험을 통해 용출용액은 110 mM의 농도에서 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다 (도 2a). 상기 정제방법을 통해 얻은 유사항체 아형 및 단일절편을CEX-HPLC로 분석한 결과, 98% 이상의 제품 순도를 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 2b). 또한, 산성 아형 항체절편과 염기성 아형 항체절편 및 유사항체 단일절편이 대부분 분리된 것 역시 확인할 수 있었다. 최종 공정 수율 역시 CEX-HPLC로 분석한 결과 61%로 확인하였다.
실험예 2: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 아형 및 단일절편의 정제 조건 설정(용출용액의 적정 염농도 )
실시예 1에서 CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 (Capto SP ImpRes, GE Healthcare)에 적재하여 유사항체절편을 분리하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
*크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto SP ImpRes
- 유속: 90 cm/h
- 평형: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재평형: 5 mM 아세트산 나트륨, pH 4.9 완충용액
- 세척: 25 mM MOPS, pH 7.0 완충용액
- 용출: 110 mM 아세트산 나트륨, pH 4.9 완충용액
실험예 1에서 설정된 110 mM 농도의 용출용액이 목적 유사항체절편의 정제에 적절한지 확인하고자 하였다.
양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었다. CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료는 재평형을 거쳐 세척하였다.
세척용액은 실험예 1과 동일하게 완충용액 (25 mM MOPS, pH 7.0)을 사용하였다. 이어서, 다시 재평형을 거치고 110nM 아세트산 나트륨 용출용액을 사용하여 용출하였다. 이 후, 자외선의 최고점부터 최고점의 30% 지점까지의 제품을 수집하였고, 그 외의 부분은 나누어 수집하여 CEX-HPLC로 분석 후에 결과 확인 후 추가로 제품에 포함하거나 하지 않았다.
상기 시험을 통해 용출용액은 110 mM의 농도에서 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다 (도 3a). 상기 정제방법을 통해 얻은 유사항체절편을 CEX-HPLC로 분석한 결과, 98% 이상의 제품 순도를 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 3b). 또한, 산성 아형과 염기성 아형 및 유사항체 단일절편이 대부분 분리 된 것 역시 확인하였다.
실험예 3: 친화성 수지의 변화에 따른 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체절편의 정제
실험예 2와 달리 친화성 크로마토그래피 칼럼의 종류를 다르게 하였을 때, 양이온 교환크로마토그래피를 이용한 정제에서 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다. 구체적으로 친화성 크로마토그래피 칼럼을 CH-1 친화성 수지가 아닌 Kappa 친화성 수지를 이용하여 정제한 시료를 양이온 교환 크로마토그래피 수지 (Capto SP ImpRes, GE Healthcare)에 적재하였을 때 동일하게 유사항체절편을 분리하는지 확인하고자 시험을 진행했다.
*크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto SP ImpRes
- 유속: 90 cm/h
- 평형: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재평형: 5 mM 아세트산 나트륨, pH 4.9 완충용액
- 세척: 25 mM MOPS, pH 7.0 완충용액
- 용출: 110 mM 아세트산 나트륨, pH 4.9 완충용액
친화성 크로마토그래피에서 Kappa 친화성 수지를 이용하여 정제한 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 유사항체는 재평형을 거쳐 세척하였다.
세척용액은 실험예 2와 동일하게 완충용액 (25 mM MOPS, pH 7.0)을 사용하였다. 이어서, 다시 재평형을 거치고 용출하였는데, 용출은 자외선의 최고점부터 최고점의 30% 지점까지의 제품을 수집하였고, 그 외의 부분은 나누어 수집하여 CEX-HPLC로 분석 후에 결과 확인 후 추가로 제품에 포함하거나 하지 않았다.
용출용액은 실험예 2를 토대로 110 mM 농도의 아세트산 나트륨을 사용하였으며, 상기 농도에서 역시 최적의 분리능을 가지는 것을 재확인하였다 (도 4a). 상기 정제방법을 통해 얻은 유사항체절편을 CEX-HPLC로 분석한 결과, 98% 이상의 제품 순도를 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 4b). 또한, 산성 아형과 염기성 아형 및 유사항체 단일절편이 대부분 분리된 것 역시 확인할 수 있었다.
실험 결과, 친화성 크로마토그래피 칼럼의 종류를 CH-1 친화성 수지가 아닌 Kappa 친화성 수지를 사용하여 불순물인 유사항체 단일절편과 산성 아형양이 상대적으로 증가한 경우라도, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 목적하는 항체 절편을 분리할 수 있음을 확인하였다.
다시 말해, 친화성 크로마토그래피 칼럼의 종류에 상관없이 양이온 교환 크로마토그래피의 최적화된 용출용액 조건으로 목적하는 항체 절편을 고순도 정제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 아형 및 단일절편의 정제 조건 설정(용출용액의 범위 설정)
실험예 1에서 CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 (Capto SP ImpRes, GE Healthcare)에 적재하여 유사항체절편을 분리하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
*크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto SP ImpRes
- 유속: 90 cm/h
- 평형: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 세척: 44 mM 아세트산 나트륨, pH 5.2 완충용액
- 용출: 85 mM 아세트산 나트륨, pH 5.2 완충용액
일반적으로, pH에 따라 단백질이 가지고 있는 charge가 달라지게 되므로 그에 따라 염농도도 달라지게 된다. 본 출원에서 용출용액의 상한범위를 정하고자 pH 및 아세트산 나트륨의 염농도를 다르게 하여 실험을 수행하였다.
CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료는 세척 과정을 거쳐 용출하였다. 용출은 자외선의 최고점부터 최고점의 50% 지점까지의 제품을 수집하였으며, 그 외의 부분은 나누어 수집하여 CEX-HPLC로 분석 후에 결과 확인 후 추가로 제품에 포함하거나 하지 않았다.
세척용액은 완충용액 (44 mM 아세트산 나트륨, pH 5.2)을 이용하였다. 세척용액에서 분리되는 물질을 CEX-HPLC로 분석한 결과 세척 과정에서 유사항체 단일절편이 제거됨을 확인할 수 있었다 (도 5c). 세척용액으로 사용한 44 mM 아세트산 나트륨은 이어서 용출 과정에서 사용되는 용출용액과 종류 및 농도가 동일한데, 세척 과정에서 유사항체 단일절편이 제거되었을 뿐, 목적하는 유사항체절편이 용출되지 않았으며, 이로부터 용출용액은 44 mM보다 큰 농도를 가지는 아세트산 나트륨을 사용하는 것이 바람직함을 추론할 수 있었다.
용출용액은 85 mM 아세트산 나트륨을 사용했고, 이 농도에서 목적하는 유사항체절편이 용출되는 것을 확인하였다 (도 5a). 실험예 4에 따른 정제방법을 통해 얻은 유사항체절편을 CEX-HPLC로 분석한 결과, 98% 이상의 제품 순도를 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 5b). 또한, 최종 공정 수율은 CEX-HPLC로 분석한 결과 39%로 확인할 수 있었으며, 실험예 2의 수율이 61%인 것과 비교하여 세척 과정에서 산성 아형 항체절편은 제거되지 않고 유사항체 단일절편만 제거됨을 확인할 수 있었다 (도 5c). 이를 통해 산성 아형 항체절편이 용출용액에 포함되어, 순도 측면에서는 문제가 없었으나, 수율적인 측면에서 제품으로 포함할 수 있는 물질의 양이 감소됨을 알 수 있었다.
비교예 1: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 유사항체 아형 및 단일절편의 다른 정제 조건
실시예 1에서 CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 (Capto SP ImpRes, GE Healthcare)에 적재하여 정제공정을 진행하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
*크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto SP ImpRes
- 유속: 90 cm/h
- 평형: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재평형: 20 mM 히스티딘-염산, 30 mM 염화나트륨, pH 5.2 완충용액
- 용출: 20 mM 히스티딘-염산, 30 mM 염화나트륨, pH 5.7 완충용액
실험예 1 내지 실험예 4에서 사용한 용출버퍼의 종류, pH 및 염농도를 다르게 하였을 때도 본 출원에서 목적하는 목적 단백질이 잘 분리되는지 확인하고자 하였다.
또한, 본 출원의 정제 방법이 실질적인 효과를 가질 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 항체절편 의약품인 루센티스(라니비주맙)를 대조군으로 선정하였다.
CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 유사항체는 재평형을 거쳐 용출하였는데, 용출은 자외선의 최고점부터 최고점의 30% 지점까지의 제품을 수집하였고, 그 외의 부분은 나누어 수집하여 CEX-HPLC로 분석 후에 결과 확인 후 추가로 제품에 포함하거나 하지 않았다.
용출용액은 20 mM 히스티딘-염산, 30 mM 염화나트륨, pH 5.7 완충용액을 사용했고, 상기 조건에서 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다 (도 6a). 상기 정제방법을 통해 얻은 유사항체절편을 CEX-HPLC로 분석한 결과, 불순물인 산성 아형과 염기성 아형 항체절편이 제대로 분리되지 않은 것을 확인하였다(도 6b).
또한, CE-SDS로 분석한 결과 실험예 2에서는 유사항체 단일절편이 대부분 제거된 것을 확인할 수 있었지만, 비교예 1에서는 유사항체 단일절편의 양이 2%정도 여전히 존재하는 것을 도 6c (대조군), 도 6d (비교예 1), 도 6e (실험예 2)를 통해 확인하였다.
또한, SE-HPLC로 분석한 결과에서도 마찬가지로 실험예 2에서는 이량체 및 다량체가 대부분 제거된 것을 확인할 수 있었지만, 비교예 1에서는 이량체 및 다량체가 여전히 존재하는 것을 도면 6f (비교예 1 및 대조군), 6g (실험예 2 및 대조군)을 통해 확인하였다.
따라서, 본 출원에서 설정한 양이온 교환 크로마토그래피의 용출용매의 조건을 변경하는 경우, 불순물인 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 분리하지 못하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 출원의 정제방법을 이용하는 경우, 불순물이 대부분 제거된 순도 높은 항체 절편을 얻을 수 있음을 알 수 있다.
비교예 2: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 pH 구배에 따른 정제방법 (용출용액의 범위 설정의 확인)
실시예 1에서 CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 (Capto SP ImpRes, GE Healthcare)에 적재하여 정제공정을 진행하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
*크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto SP ImpRes
- 유속: 90 cm/h
- 평형: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 적재: 최대 30 g 단백질/L 수지 부피
- 재평형: 5 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 완충용액
- 세척: 25 mM MOPS, pH 7.0 완충용액
- 용출: 5 mM 내지 300 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5
비교예 2 실험에서는 본 출원의 정제 공정에 적용되는 용출용액의 pH 값 하한범위를 정하고자 pH 4.5를 가지는 아세트산 나트륨의 염농도 구배를 통해 실험을 수행하였다.
양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었다. CH-1 친화성 크로마토그래피로 정제하여 얻어진 용출용액을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료는 재평형을 거쳐 세척하였다. 세척용액은 완충용액 (25 mM MOPS, pH 7.0)을 이용하는 방식을 도입하였다. 세척용액에서 분리되는 물질을 CEX-HPLC로 분석하였으며, 그 결과 세척버퍼에서 유사항체 단일절편 및 산성 아형 항체절편이 분리됨을 확인하였다.
이어서, 다시 재평형을 거치고 용출 조건을 설정하기 위해 용출용액은 pH 4.5, 5mM 내지 300mM 아세트산 나트륨을 사용하여 선형 농도 구배로 용출하였다. 이 후, 자외선의 최고점부터 최고점의 30% 지점까지의 제품을 수집하였고, 그 외의 부분은 나누어 수집하여 CEX-HPLC로 분석 후에 결과 확인 후 추가로 제품에 포함하거나 하지 않았다.
상기 정제방법을 통해 불순물인 유사항체 아형 및 유사항체 단일절편은 분리되었으나 목적 유사항체절편이 용출이 되지 않는 결과를 토대로 pH의 하한범위를 설정할 수 있었다 (도면 7).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. (a) 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료를 평형용액 (equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계;
    (b) 세척 용액으로 세척하는 단계; 및
    (c) pH 4.9 이상부터 pH 5.2 이하 범위의 pH를 갖는 아세트산 나트륨 용출용액을 이용해 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼으로부터 목적 유사항체절편을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 유사항체절편의 정제 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 용출용액은 85 mM 이상부터 110 mM 이하 범위의 염농도를 갖는 것인, 정제 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (b) 또는 (c) 단계로부터, 유사항체 단일절편 및 유사항체 아형을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 유사항체의 혼합액을 포함하는 시료는 적재 전에 pH 4.5 이상부터 pH 5.5 범위의 pH를 갖는 평형용액으로 칼럼을 평형시키는 것인, 정제 방법
  5. 제4항에 있어서,
    상기 평형용액은 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 및 시트르산 나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 평형용액은 5mM 이상부터 50 mM 이하 범위의 염농도를 갖는 것인, 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 이전에 친화성 크로마토 그래피, 이온교환 크로마토그래피, 및 농축 또는 투석하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정제 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 또는 (b) 단계 후, 재평형용액으로 재평형화를 하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정제 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 세척용액의 pH 값은, 상기 유사항체 단일절편의 pI 값 초과부터 상기 목적 유사항체절편의 pH 값 미만의 범위를 가지는 것을 포함하는 것인, 정제 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 세척용액은 5mM 이상부터 25 mM 이하 범위의 염농도를 갖는 것인, 정제 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 세척용액은 인산 나트륨, 염화나트륨, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), Bis-Tris (2-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol), 및 MOPS (3-Morpholinopropane-1-sulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 정제된 목적 유사항체절편은 치료용 단백질인 것인, 정제 방법.
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