KR20180114191A - 아마니틴 콘주게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 표적 결합 부분; 및 (c) 임의로, 상기 아마톡신과 상기 표적 결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 콘주게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 콘주게이트를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

아마니틴 콘주게이트
본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 표적 결합 부분(target-binding moiety); 및 (c) 임의로, 상기 아마톡신과 상기 표적 결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 콘주게이트(conjugate)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 콘주게이트를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
아마톡신은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides) 버섯에서 발견되는 8개 아미노산으로 구성된 환형 펩타이드이다(도 1 참조). 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA 의존성 RNA 중합효소 II를 특이적으로 저해하고, 이에 의해, 영향을 받은 세포의 전사 및 단백질 생합성도 저해한다. 세포에서의 전사의 저해는 성장 및 증식의 정지를 야기한다. 아마니틴과 RNA 중합효소 II의 복합체는 공유 결합되어 있지는 않지만 매우 견고하다(KD = 3nM). 상기 효소로부터의 아마니틴의 해리는 매우 느린 과정이어서, 영향을 받은 세포의 회복은 일어나기 어렵게 된다. 전사의 저해가 너무 오래 지속되면, 세포는 예정된 세포사(아폽토시스)를 겪게 될 것이다.
종양 치료를 위한 세포독성 부분으로서의 아마톡신의 사용은, 다이아조화를 통해 Trp(아미노산 4; 도 1 참조)의 인돌 환에 부착된 링커를 사용하여 항Thy 1.2 항체를 α-아마니틴에 커플링시킴으로써 1981년에 이미 검토되었다(Davis & Preston, Science 213 (1981) 1385-1388). Davis 및 Preston은 부착 부위를 7' 위치로 동정하였다. Morris 및 Venton도 역시 7' 위치에서의 치환이 세포독성 활성을 유지하는 유도체를 초래함을 실증하였다(Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419-430).
특허 출원 EP 1 859 811 A1(2007년 11월 28일에 공개됨)에는, β-아마니틴의 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자가 알부민에 또는 모노클로널 항체 HEA125, OKT3 또는 PA-1에 직접적으로, 즉 링커 구조 없이 커플링된 콘주게이트가 기재되었다. 또한, 유방암 세포(MCF-7), 버킷 림프종 세포(Raji) 및 T-림프종 세포(Jurkat)의 증식에 대한 이들 콘주게이트의 저해 효과가 제시되었다. 아마이드, 에스터, 에터, 싸이오에터, 다이설파이드, 유레아, 싸이오유레아, 탄화수소 부분 등과 같은 요소를 포함하는 링커를 비롯한 링커의 사용이 시사되었지만, 그와 같은 구성체(construct)는 실제로 제시되지 않았고, 아마톡신 상의 부착 부위와 같은 더 이상의 상세는 제공되지 않았다.
특허 출원 WO 2010/115629 및 WO 2010/115630(모두 2010년 10월 14일에 공개됨)에는, 항EpCAM 항체, 예를 들어 인간화 항체 huHEA125와 같은 항체가, (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, (ii) 아마톡신 아미노산 4의 6' C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자를 통해, 각각의 경우 직접적으로 또는 항체와 아마톡신 사이에 링커를 개재하여 아마톡신에 커플링되어 있는 콘주게이트가 기재되어 있다. 시사된 링커는 아마이드, 에스터, 에터, 싸이오에터, 다이설파이드, 유레아, 싸이오유레아, 탄화수소 부분 등과 같은 요소를 포함한다. 또한, 유방암 세포(세포주 MCF-7), 췌장암(세포주 Capan-1), 결장암(세포주 Colo205) 및 담관암(세포주 OZ)의 증식에 대한 이들 콘주게이트의 저해 효과가 제시되었다
특허 출원 WO 2012/119787에는, 아마톡신과 그들의 표적인 포유동물 세포의 DNA 의존성 RNA 중합효소 II의 상호작용을 방해함이 없이, 표적 결합 부분이, 아미노산 4인 트립토판 상의 추가적인 부착 부위, 즉 위치 1'-N에서 링커를 개재하여 상기 아마톡신에 부착될 수 있음이 기재되어 있다.
아마톡신은 항체 분자와 같은 큰 생체 분자 운반체와 커플링된 경우에는 비교적 비독성이라는 것, 및 생체 분자 운반체가 절단 제거된 후에만 그들의 세포독성 활성을 발휘한다는 것이 알려져 있다. 특히 간세포에 대한 아마톡신의 독성에 비추어 볼 때, 표적화 종양 요법을 위한 아마톡신 콘주게이트는 혈장 내 투여 후에 고도로 안정하게 유지되고, 표적 세포에서의 내재화 후에 아마톡신의 방출이 일어나는 것이 가장 중요하다. 이와 관련하여, 콘주게이트 안정성의 약간의 개선은 치료적 접근법을 위한 아마톡신 콘주게이트의 치료 범위 및 안전성에 극적인 결과를 가져올 수도 있다.
특허 출원 WO 2012/041504에는, 결합 분자에 대한 링커로서 유레아 부분을 사용한, 아마톡신과 결합 분자의 콘주게이트가 기재되어 있다. 이러한 결합은 에스터 결합보다 현저히 더 안정한 것으로 증명될 수 있었다.
이와 같이, 치료적 용도를 위한, 아마톡신에 기초한 콘주게이트의 개발에 있어서는 이미 현저한 진전이 이루어져 왔다. 그러나, 본 발명자들은 α- 및 β-아마톡신에 기초한 구성체가 혈장 내의 스트레스 조건하에서는 충분히 안정하지 않고, 상당한 정도의 가교 결합된 생성물을 초래함을 발견하였다(도 2 내지 4 참조). 그러나, 인간에게 투여하기 위한 치료적 분자로서의 사용을 위해서는, 고도로 독성인 아마톡신을 포함하는 콘주게이트의 안정성이 가장 중요하다.
따라서, 개선된 안정성을 갖는 아마톡신 변이체가 여전히 크게 요구되고 있다. 이 문제에 대한 해결책, 즉 기본적인 아마톡신 구조를 형성하는 8개 아미노산 잔기의 골격에 대한 특정 개변의 동정은 선행 기술에 의해 제공도 시사도 되어 있지 않다.
본 발명은 (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 갖는 아마톡신의 변이형이 스트레스 조건하에서의 증가된 안정성 및 개선된 치료 지수를 나타낸다는 예기치 않은 관찰에 기초하고 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 표적 결합 부분; 및 (c) 임의로, 상기 아마톡신과 상기 표적 결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 콘주게이트에 관한 것이다. 특히, (c)의 임의의 링커가 존재하고 이는 절단 가능한(cleavable) 링커이다.
제 2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 환자의 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 콘주게이트로서, 특히 상기 암은 유방암, 췌장암, 담관암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병, 및 악성 림프종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 콘주게이트에 관한 것이다.
제 4 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; 및 (c) 상기 아마톡신을 표적 결합 부분에 연결하기 위한 반응성 기를 가지는 링커 부분, 특히 절단 가능한 링커를 포함하는 구성체에 관한 것이다.
도 1은 상이한 아마톡신의 구조식을 나타낸다. 굵은 글꼴의 번호(1 내지 8)는 아마톡신을 형성하는 8개 아미노산의 표준적인 넘버링을 나타낸다. 아미노산 1, 3 및 4에 있어서의 원자의 표준적인 표시도 또한 나타나 있다(각각 그리스 문자 α부터 γ, 그리스 문자 α부터 δ, 번호 1'부터 7'까지).
도 2는 항아마니틴 웨스턴 블롯에서의 스트레스 테스트 실험의 결과를 나타낸다. 트라스투주맵-아마니틴 콘주게이트(Her-30.0643; 6'-OH를 통한 라이신 콘주게이션; 안정한 링커)를 PBS, pH 7.4 중에서 37℃에서 5일 동안 인큐베이트하여, 광범위한 쇄간 및 쇄내 가교 결합을 유도하였다. 항체 쇄의 가교 결합은 유리 시스테인의 첨가에 의해 방지될 수 있었다.
도 3은 α-아마니틴이 PBS 완충액, pH 7.4에서 시스테인과 강한 반응성을 나타냄을 보여준다. 37℃의 PBS, pH 7.4 중의 1mg/mL α-아마니틴 10mg/mL 시스테인 24시간, 48시간 및 6일 후 RP-HPLC C18.
도 4는 β-아마니틴이 PBS 완충액, pH 7.4에서 시스테인과 강한 반응성을 나타냄을 보여준다. 37℃의 PBS, pH 7.4 중의 1mg/mL β-아마니틴 10mg/mL 시스테인 24시간, 48시간 및 6일 후 RP-HPLC C18.
도 5는 아미노산 4("아마닌")에서의 6'-데옥시 변이체가 시스테인과 감소된 반응성을 나타냄을 보여준다. 37℃의 PBS, pH 7.4 중의 1mg/mL 아마닌 10mg/mL 시스테인 24시간, 48시간 및 6일 후 RP-HPLC C18.
도 6 및 도 7은 이중 데옥시 변이체 HDP 30.2105(아미노산 4에서의 6'-데옥시 및 아미노산 8에서의 S-데옥시; R3 = -OR5이고 각 R5 = H인 화학식 I)가 시스테인과의 반응성이 전혀 없음을 보여준다. 37℃의 PBS, pH 7.4 중의 1mg/mL HDP 30.2105, 10mg/mL 시스테인 24시간, 48시간 및 6일 후 RP-HPLC C18; * 불순물.
도 8은 AA4-6-OH 부분에 절단 가능한 링커를 갖는 알파-아마니틴 유도체 HDP 30.1699, AA1 γ-위치에 절단 가능한 링커를 갖는 베타-아마니틴 유도체 HDP 30.2060 및 AA1 γ-위치에 절단 가능한 링커를 갖는 이중 데옥시 아마톡신 변이체 HDP 30.2115를 나타낸다.
도 9는 0, 4 및 10일 동안 인간 혈장, 마우스 혈장 및 인산염 완충 식염수(PBS) 중 37℃에서 인큐베이션 후 T-D265C 항체에 콘주게이트된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 토끼로부터의 폴리클로널 항아마니틴 항체 및 양고추냉이 퍼옥시다제에 콘주게이트된 항토끼 항체를 사용하여 검출을 행하였다. HDP 30.1699 및 HDP 30.2060은 상당한 가교 결합을 나타내고 아마톡신 부분이 소실되었다. 이중 데옥시 아마니틴 변이체 HDP 30.2115는 높은 안정성을 나타내고 가교 결합이 유의하게 감소되고 있다.
도 10은 T-D265C 항체에 콘주게이트된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 세포독성을 나타낸다. 시험 항목을 인간 혈장 중에서 37℃에서 0 및 4일 동안 인큐베이트하였다. 세포독성 분석을 SKBR-3 세포에 대해 96시간 동안 수행하였다. 4일의 혈장 스트레스 부여 후, HDP 30.1699 및 HDP 30.2060에 기초한 ADC는 세포독성이 현저히 소실되는 반면, 탈산소화된 유도체 HDP 30.2115는 여전히 피코몰 활성을 나타낸다
도 11은 T-D265C 항체에 콘주게이트된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 세포독성을 나타낸다. 시험 항목을 마우스 혈장 중에서 37℃에서 0 및 4일 동안 인큐베이트하였다. 세포독성 분석을 SKBR-3 세포에 대해 96시간 동안 수행하였다. 혈장 스트레스 부여 후, HDP 30.1699 및 HDP 30.2060에 기초한 ADC는 세포독성이 현저히 소실되는 반면, 탈산소화된 유도체 HDP 30.2115는 거의 변화하지 않고 그대로이다.
도 12는 T-D265C 항체에 콘주게이트된 아마톡신 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.2060 및 HDP 30.2115의 세포독성을 나타낸다. 시험 항목을 PBS 중에서 37℃에서 0 및 4일 동안 인큐베이트하였다. 세포독성 분석을 SKBR-3 세포에 대해 96시간 동안 수행하였다. 모든 ADC가 비효소적 환경에 대해 적절한 안정성을 나타낸다.
도 13은 Raji s.c 이종이식 모델 - 단일 용량 실험에서의 상이한 chiBCE19-D265C 항체-아마톡신 콘주게이트의 항종양 활성을 비교한다. 링커 및 톡신 구조에 따라, 항종양 활성에 있어서의 유의한 차이가 관찰되었다. 데옥시-아마닌 변이체 chiBCE19-30.2115(아미노산 4에서의 6'-데옥시 및 아미노산 8에서의 S-데옥시)는 모든 아마톡신 ADC의 최상의 항종양 활성을 나타내었고, 상응하는 절단 가능한 링커 ADC chiBCE19-30.1699(6'-OH를 통한 라이신 콘주게이션; 아미노산 8에서의 S=O)보다 유의하게 더 양호한 치료 지수를 가졌다.
도 14는 전신성 Raji 종양 모델 - 단일 용량 실험에서의 Kaplan Meier 생존율 분석을 나타낸다. 간단히 말하면, 200μL PBS/마우스 중의 2.5x106 Raji(인간 버킷 림프종) 종양 세포를 0일째에 정맥내 접종하였다. 종양 세포 접종 후 3일째에 치료(단일 용량, iv)를 개시하였다. 데옥시-아마닌 변이체 chiBCE19-30.2115(아미노산 4에서의 6'-데옥시 및 아미노산 8에서의 S-데옥시)는 α-아마니틴 유도체 HDP 30.1699, HDP 30.0880 및 HDP 30.0643뿐만 아니라 상응하는 MMAE 유도체보다 더 우수한 생존율을 나타내었다.
본 발명을 이하에서 상세하게 설명하기에 앞서, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않고 이들은 변경될 수도 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
특히, 본원에서 사용되는 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and K
Figure pct00001
lbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 및 첨부의 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, "포함하다"라는 단어, 및 "포함하는" 및 "포함한다"와 같은 변형은 기재된 정수, 조성물 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 군의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 부가적인 정수, 조성물 또는 단계, 또는 정수들, 조성물들 또는 단계들의 군도 또한 임의로 존재할 수 있고, 이는 부가적인 정수, 조성물 또는 단계, 또는 정수들, 조성물들 또는 단계들의 군이 존재하지 않는 실시양태를 포함한다. 이러한 후자의 실시양태에서, 용어 "포함하는"은 "로 이루어지는"과 동일하게 사용된다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 여러 문서가 인용되고 있다. 여기에서 인용된 모든 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조자의 사양서, 지시서, GenBank 수탁 번호 서열 제출서 등을 포함함)는, 상기 또는 하기 여부에 관계없이, 각각의 특허법하에서 가능한 정도로 그 전제가 참조에 의해 여기에 원용된다. 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시에 선행할 권리가 없음을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
이하, 본 발명을 더 설명한다. 이하의 구절에서는, 본 발명의 상이한 양태를 보다 상세하게 정의한다. 그와 같이 정의된 각각의 양태는 명확하게 반대의 표시가 없는 한, 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수도 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타내진 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 나타내진 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수도 있다.
본 발명은 (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 갖는 아마톡신의 변이형이 스트레스 조건하에서의 증가된 안정성 및 개선된 치료 지수를 나타낸다는 예기치 않은 관찰에 기초하고 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 표적 결합 부분; 및 (c) 임의로, 상기 아마톡신과 상기 표적 결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 콘주게이트에 관한 것이다. 특히, (c)의 임의의 링커가 존재하고 이는 절단 가능한 링커이다.
Zhao et al., ChemBioChem 16 (2015) 1420 - 1425에는 그러한 다이-데옥시 아마톡신 코어의 합성이 보고되었다. 그러나, Zhao 등의 방법은 4종의 상이한 부분입체 이성질체의 혼합물이 생성되었고, 그 중 1종만이 천연 생성물의 원하는 독성을 나타내었다. 따라서, Zhao 등에 의해 완전히 정확하게 동정된 바와 같이, 순수한 형태의 단일 독성 부분입체 이성질체의 생성은 여전히 핵심적인 필요성을 나타내고 있다(Zhao et al. loc. cit., p. 1424, 왼쪽 컬럼). Zhao 등은 그러한 결과를 달성하기 위한 잠재적인 경로의 목록을 길게 제안하였지만, 주어진 제안은 연구 수행을 위한 안내에 지나지 않는다. 게다가, Zhao 등은 합성 변이체가, 상응하는 천연 생성물의 독성을 본질적으로 유지하고 있음을 확인할 수 있었고, 그들의 새로운 화합물의 어떠한 이점도 제시하고 있지 않으며, 특히 본 발명에 따른 다이-데옥시 코어를 갖는 아마톡신 유도체가 혈장 내의 스트레스 조건하에서 증가된 안정성을 나타내고 가교 결합 생성물을 초래하지 않는다는 어떠한 교시나 어떠한 시사도 제공하고 있지 않다. 따라서, Zhao 등은 그러한 연구 활동을 위해 필요한 노력에 착수할 당업자에게 어떠한 특별한 인센티브도 제공하고 있지 않다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 구조 I을 갖는 콘주게이트에 관한 것이다.
Figure pct00002
여기에서:
R2는 S이고;
R3은 -NHR5, -NH-OR5, 및 -OR5로부터 선택되고;
R4는 H이며;
이때 R5 중 하나는 -Ln-X(여기에서, L은 링커, 특히 절단 가능한 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, X는 표적 결합 부분임)이고, 나머지 R5는 H이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "아마톡신"은, 아마니타(Amanita)속으로부터 단리되고 Wieland, T. and Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185-260)에 기재된 바와 같은, 8개 아미노산으로 구성된 모든 환형 펩타이드를 포함하며, 이는 (i) (즉, 아미노산 잔기 트립토판의 인돌 부분이 6' 위치에 산소 함유 치환기를 갖지 않고, 특히 6' 위치가 수소 원자를 가짐) 및 (ii) (즉, 자연 발생하는 아마톡신의 싸이오에터 설폭사이드 부분이 설파이드에 의해 치환되어 있음)에 따른 특이적 위치를 포함하고, 또한 그들의 모든 화학 유도체; 추가로 그들의 모든 반합성 유사체; 추가로 천연 화합물(환형, 8개 아미노산)의 마스터 구조에 따라 빌딩 블록으로부터 구축된 그들의 모든 합성 유사체, 추가로 하이드록실화 아미노산 대신에 비하이드록실화 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가로 모든 합성 또는 반합성 유사체를 포함하며, 각각의 경우, 임의의 그러한 유도체 또는 유사체는 전술한 위치 (i) 및 (ii)를 적어도 가지고, 포유동물 RNA 중합효소 II를 저해함으로써 기능적으로 활성이다.
기능적으로, 아마톡신은 포유동물 RNA 중합효소 II를 저해하는 펩타이드 또는 뎁시펩타이드로서 정의된다. 바람직한 아마톡신은 상기에서 정의된 바와 같은 링커 분자 또는 표적 결합 부분과 반응할 수 있는 작용기(예를 들어, 카복실기 또는 카복실산 유도체, 예를 들면 카복사마이드 또는 하이드록삼산, 아미노기, 하이드록시기, 싸이올 또는 싸이올 포착 기)를 갖는 것들이다. 본 발명의 콘주게이트에 특히 적합한 아마톡신은 도 1에 나타낸 바와 같은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마눌닌 또는 아마눌린산의 다이-데옥시 변이체, 또는 아마닌, 아마닌아마이드, γ-아마닌 또는 γ-아마닌아마이드의 모노-데옥시 변이체뿐만 아니라, 그들의 염, 화학 유도체, 반합성 유사체 및 합성 유사체이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 콘주게이트는 90% 초과, 특히 95% 초과의 순도를 갖는다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "순도"는 존재하는 콘주게이트의 총량을 지칭한다. 예를 들어, 90% 초과의 순도는 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 조성물 1mg에 90% 초과, 즉 900μg 초과의 그러한 콘주게이트가 존재하는 것을 의미한다. 잔부, 즉 불순물은 미반응 출발 물질 및 기타 반응 물질, 용매, 절단 생성물 및/또는 부생성물을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 조성물은 100mg 초과, 특히 500mg 초과, 보다 특히 1g 초과의 그러한 콘주게이트를 포함한다. 따라서, 선행 기술의 콘주게이트의 복합 제제에, 예를 들어 자연 발생하는 설폭사이드의 부분적인 환원으로 인해 틀림없이 존재할 수 있는 미량의 본 발명의 콘주게이트는 명백히 배제된다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 결합 부분"은 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본원의 문맥에서 바람직한 표적 결합 부분은 (i) 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 항체 유사 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "표적 결합 부분"은 전형적으로 40 000Da(40kDa) 이상의 분자량을 갖는다.
본원에서 사용되는 경우, 제 1 화합물(예를 들어, 항체)은, 제 2 화합물(예를 들어, 표적 단백질과 같은 항원)에 대한 해리 상수 KD가 100μM 이하, 특히 50μM 이하, 특히 30μM 이하, 특히 20μM 이하, 특히 10μM 이하, 특히 5μM 이하, 보다 특히 1μM 이하, 보다 특히 900nM 이하, 보다 특히 800nM 이하, 보다 특히 700nM 이하, 보다 특히 600nM 이하, 보다 특히 500nM 이하, 보다 특히 400nM 이하, 보다 특히 300nM 이하, 보다 특히 200nM 이하, 보다 더 특히 100nM 이하, 보다 더 특히 90nM 이하, 보다 더 특히 80nM 이하, 보다 더 특히 70nM 이하, 보다 더 특히 60nM 이하, 보다 더 특히 50nM 이하, 보다 더 특히 40nM 이하, 보다 더 특히 30nM 이하, 보다 더 특히 20nM 이하, 보다 더 특히 10nM 이하인 경우, 상기 제 2 화합물에 "특이적으로 결합"하는 것으로 간주된다.
본원의 문맥에서, 용어 "표적 분자" 및 "표적 에피토프"는 표적 결합 부분에 의해 특이적으로 결합되는 항원 및 항원의 에피토프를 각각 지칭한다. 특히, 표적 분자는 종양 관련 항원, 특히 비종양 세포의 표면과 비교하여 증가된 농도로 및/또는 상이한 입체 배치로 하나 이상의 종양 세포형의 표면 상에 존재하는 항원 또는 에피토프이다. 특히, 상기 항원 또는 에피토프는 하나 이상의 종양 세포형의 표면 상에 존재하지만, 비종양 세포의 표면 상에는 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, 표적 결합 부분은 PSMA, CD19, CD269, sialyl Lewisa, HER-2/neu 및 상피 세포 부착 분자(EpCAM)로부터 선택되는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 상기 항원 또는 에피토프는 자가면역 질환에 관여하는 세포 상에서 우선적으로 발현된다. 특정한 이러한 실시양태에서, 표적 결합 부분은 IL-6 수용체(IL-6R)의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 또는 그의 항원 결합 단편"은 면역 글로불린 분자, 및 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 따라서, 용어 "그의 항원 결합 단편"은 기능적인 항원 결합 도메인을 적어도 포함하는 항체의 단편을 지칭한다. 또한, 예를 들어, 표적 분자에, 예를 들면 PSMA, CD19, CD269, sialyl Lewisa, Her-2/neu 및 EpCAM으로부터 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 파지 디스플레이를 포함하는 기법을 통해 선택되는, 면역 글로불린 유사 단백질도 포함된다. 본 발명의 면역 글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역 글로불린 분자일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체 및 그의 항원 결합 단편"은 폴리클로널, 모노클로널, 1가, 이중특이성, 헤테로콘주게이트, 다중특이성, 인간, 인간화(특히 CDR 그래프트화), 탈면역화 또는 키메라 항체, 1본쇄 항체(예를 들어 scFv), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 다이아바디 또는 테트라바디(Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993) 6444-8), 나노바디, 항이디오타입(anti-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항Id 항체를 포함함), 및 상기의 어느 것의 에피토프 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 본 발명의 인간 항원 결합 항체 단편이고, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 1본쇄 Fvs(scFv), 1본쇄 항체, 다이설파이드 결합된 Fvs(dsFv), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 1본쇄 항체를 포함하는 항원 결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로, 또는 힌지 영역, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 또한 가변 영역(들)과 힌지 영역, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합을 또한 포함하는 항원 결합 단편도 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 사용 가능한 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 유래의 것일 수 있다. 특히, 항체는 인간, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 유래의 것이다. 항체가 인간 또는 쥐과 유래의 것인 특히 바람직하다. 본원에서 사용되는 "인간 항체"는 인간 면역 글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 또한 예를 들면 Kucherlapati 및 Jakobovits에 의한 미국 특허 제5,939,598호에 기재된 바와 같은, 인간 면역 글로불린 라이브러리로부터, 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린에 대해 유전자 도입된 동물로부터 단리되고 내인성 면역 글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다.
용어 "항체 유사 단백질"은 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 (예를 들어, 루프의 돌연변이 유발에 의해) 조작된 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항체 유사 단백질은 단백질 스캐폴드에 양 말단에서 부착된 적어도 하나의 가변 펩타이드 루프를 포함한다. 이 이중 구조적 제약은 항체 유사 단백질의 결합 친화성을 항체의 것에 필적하는 수준으로 크게 증가시킨다. 가변 펩타이드 루프의 길이는 전형적으로 10 내지 20개 아미노산으로 이루어진다. 스캐폴드 단백질은 양호한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 특히, 스캐폴드 단백질은 소형의 구상 단백질이다. 항체 유사 단백질은 어피바디, 안티칼린 및 설계된 안카이린 반복 단백질을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다(검토를 위해서는, Brody and Gold, J Biotechnol. 74 (2000) 5-13 참조). 항체 유사 단백질은 돌연변이체의 대형 라이브러리로부터 유도될 수 있고, 예를 들어 대형 파지 디스플레이 라이브러리로부터 패닝될 수 있으며, 규칙적 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체 유사 결합 단백질은 구상 단백질 내의 표면 노출 잔기의 조합 돌연변이 유발에 의해 얻어질 수 있다.
용어 "핵산 앱타머"는, 표적 분자에 결합하도록, 반복된 라운드의 시험관 내 선택 또는 SELEX(지수함수적 농축에 의한 리간드의 계통적 진화)를 통해 조작된 핵산 분자를 지칭한다(검토를 위해서는 Brody and Gold, J Biotechnol. 74 (2000) 5-13 참조). 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 앱타머는 개변체, 예를 들어 2'-플루오린 치환된 피리미딘과 같은 개변된 뉴클레오타이드를 함유할 수도 있다.
본 발명의 문맥에서 "링커"는 링커의 일단에 각각 부착되어 있는 2개의 성분을 연결시키고 있는 구조를 지칭한다. 링커가 결합인 경우, 항체에의 아마톡신의 직접 연결은 RNA 중합효소 II와 상호 작용하는 아마톡신의 능력을 저하시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 2개 성분 간의 거리를 증가시키고, 이들 성분 간, 예를 들어 본 발명의 경우에는 항체와 아마톡신 간의 입체적 방해를 경감시킨다. 특정 실시양태에서, 링커는 그의 골격 내에 1 내지 30개의 원자(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 원자)의 연속 쇄를 갖고, 즉 링커의 길이는 아마톡신 부분과 항체 사이의 원자 또는 결합의 수에 의해 측정되는 최단 연결부로서 정의되며, 여기에서 링커 골격의 한쪽 측은 아마톡신과 반응되어 있고, 다른 쪽 측은 반응에 이용 가능하거나 또는 항체와 반응되어 있다. 본 발명의 문맥에서, 링커는 특히, 임의로 치환된, C1-20-알킬렌, C1-20-헤테로알킬렌, C2-20-알켄일렌, C2-20-헤테로알켄일렌, C2-20-알킨일렌, C2-20-헤테로알킬렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르알킬렌, 또는 헤테로아르알킬렌기이다. 링커는 카복사마이드, 에스터, 에터, 싸이오에터, 다이설파이드, 유레아, 싸이오유레아, 탄화수소 부분 등과 같은 하나 이상의 구조적 요소를 함유할 수도 있다. 링커는 또한 이들 구조적 요소 중 둘 이상의 조합을 포함할 수도 있다. 이들 구조적 요소의 각각은 링커 내에 1회보다 많이, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 존재할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 다이설파이드 결합을 포함할 수도 있다. 링커는 단일 단계에서 또는 2 이상의 후속 단계에서 아마톡신 및 항체에 부착되어야 한다는 것이 이해된다. 그를 위해서, 링커는, 특히 근위 및 원위 말단에 2개의 기를 가지게 될 것이며, 이는 (i) 연결될 성분들 중 하나에 존재하는 기, 특히 아마톡신 또는 표적 결합 펩타이드 상의 활성화된 기에의 공유 결합을 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 아마톡신 상의 기와 공유 결합을 형성하도록 활성화되어 있거나 또는 활성화될 수 있는 기이다. 따라서, 화학 기는 링커의 원위 및 근위 말단에 있고, 그것이 그러한 커플링 반응, 예를 들어 에스터, 에터, 유레테인, 펩타이드 결합 등의 결과인 것이 바람직하다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 C, O, N 및 S로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개의 원자, 특히 2 내지 18개의 원자, 보다 특히 5 내지 16개의 원자, 보다 더 특히 6 내지 15개의 원자의 선형 쇄이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 원자의 적어도 60%는 C 원자이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 원자는 단일 결합에 의해 연결된다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알켄일렌, 헤테로알켄일렌, 알킨일렌, 헤테로알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르알킬렌 또는 헤테로아르알킬렌기이고, 여기에서 상기 링커는 임의로 치환된다.
용어 "알킬렌"은, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 기를 포함하는, 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 2가의 직쇄 포화 탄화수소기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 알킬렌기는 저급 알킬렌기일 수 있다. 용어 "저급 알킬렌"은 1 내지 6개의 탄소 원자, 특정 실시양태에서는 1 내지 5개 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기를 지칭한다. 알킬렌기의 예에는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2-CH2-), n-프로필렌, n-뷰틸렌, n-펜틸렌 및 n-헥실렌이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "알켄일렌"은 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 2가의 직쇄 기를 지칭하고, 여기에서 탄소-탄소 결합 중 적어도 하나는 이중 결합인 한편, 그 밖의 결합은 단일 결합 또는 추가의 이중 결합일 수 있다. 본원에서 용어 "알킨일렌"은, 탄소-탄소 결합 중 적어도 하나가 삼중 결합인 한편, 그 밖의 결합이 단일, 이중 또는 추가의 삼중 결합일 수 있는, 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 기를 지칭한다. 알켄일렌 기의 예에는 에텐일렌(-CH=CH-), 1-프로펜일렌, 2-프로펜일렌, 1-뷰텐일렌, 2-뷰텐일렌 및 3-뷰텐일렌 등이 포함한다. 알킨일렌기의 예에는 에틴일렌, 1-프로핀일렌, 2-프로핀일렌 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬렌"은 임의의 안정한 단환 또는 다환계의 일부인 2가 환을 지칭하는 것으로 의도되고, 여기에서 그러한 환은 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖지만 헤테로원자는 갖지 않으며, 또한 그러한 환은 완전히 포화되어 있고, 용어 "사이클로알켄일렌"은 임의의 안정한 단환 또는 다환계의 일부인 2가 환을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기에서 그러한 환은 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖지만 헤테로원자는 갖지 않고, 또한 그러한 환은 적어도 부분적으로 불포화되어 있다(그러나 임의의 아릴렌 환을 제외함). 사이클로알킬렌의 예에는 사이클로프로필렌, 사이클로뷰틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌 및 사이클로헵틸렌이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 사이클로알켄일렌의 예에는 사이클로펜텐일렌 및 사이클로헥센일렌이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클로알킬렌" 및 "헤테로사이클로알켄일렌"은 임의의 안정한 단환 또는 다환계의 일부인 2가 환를 지칭하는 것으로 의도되고, 여기에서 그러한 환은 3 내지 약 12개의 원자를 가지며, 또한 그러한 환은 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자, 특히 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어지고, 헤테로사이클로알킬렌은 완전히 포화되어 있는 그러한 환을 지칭하며, 헤테로사이클로알켄일렌은 적어도 부분적으로 불포화되어 있는 환을 지칭한다(그러나 임의의 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 환을 제외함).
용어 "아릴렌"은 임의의 안정한 단환 또는 다환계의 일부인 2가 환 또는 환계를 의미하는 것으로 의도되고, 여기에서 그러한 환 또는 환계는 3 내지 20개의 탄소 원자를 갖지만 헤테로원자는 갖지 않으며, 그 환 또는 환계는, 페닐렌을 비롯한, "4n+2" π 전자 규칙에 의해 정의되는 방향족 부분으로 이루어진다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴렌"은 임의의 안정한 단환 또는 다환계의 일부인 2가 환 또는 환계를 지칭하고, 여기에서 그러한 환 또는 환계는 3 내지 20개의 원자를 가지며, 그 환 또는 환계는 "4n+2" π 전자 규칙에 의해 정의되는 방향족 부분으로 이루어지고, 탄소 원자 및 하나 이상의 질소, 황 및/또는 산소 헤테로원자를 함유한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "치환된"은, 나타낸 원자의 정상 원자가, 또는 치환되어 있는 기의 적절한 원자의 정상 원자가가 초과되지 않고, 치환이 안정한 화합물을 초래하는 것을 조건으로 하여, 링커의 골격에 존재하는 하나 이상의 수소가, 나타낸 기(들)로부터의 선택으로 치환되어 있는 것을 나타내도록 의도된다. 용어 "임의로 치환된"은 링커가 비치환되거나, 또는 본원에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 치환기로, 본원에서 정의된 바와 같이 치환된 것을 의미하도록 의도된다. 치환기가 케토(또는 옥소, 즉 =O)기, 싸이오 또는 이미노기 등인 경우, 링커 골격 원자 상의 2개의 수소가 치환된다. 예시적인 치환기에는, 예를 들면, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 아실, 아로일, 헤테로아로일, 카복실, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시, 아로일옥시, 헤테로아로일옥시, 알콕시카보닐, 할로젠, (싸이오)에스터, 사이아노, 포스포릴, 아미노, 이미노, (싸이오)아미도, 설프하이드릴, 알킬싸이오, 아실싸이오, 설폰일, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 나이트로, 아지도, 퍼플루오로알킬(예를 들어 트라이플루오로메틸)을 포함하는 할로알킬, 할로알콕시, 알킬설판일, 알킬설핀일, 알킬설폰일, 알킬설폰일아미노, 아릴설포노아미노, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 알킬카복시, 알킬카복사마이드, 옥소, 하이드록시, 머캅토, 아미노(임의로, 예를 들어 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의해 모노- 또는 다이-치환됨), 이미노, 카복사마이드, 카바모일(임의로, 예를 들어 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의해 모노- 또는 다이-치환됨), 아미디노, 아미노설폰일, 아실아미노, 아로일아미노, (싸이오)유레이도, (아릴싸이오)유레이도, 알킬(싸이오)유레이도, 사이클로알킬(싸이오)유레이도, 아릴옥시, 아르알콕시, 또는 -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR, 또는 -N(R)S(O)2R(여기에서 n은 1 내지 4이고, R은 수소, -알킬, -알켄일, -알킨일, -사이클로알킬, -사이클로알켄일, -(C-결합-헤테로사이클로알킬), -(C-결합-헤테로사이클로알켄일), -아릴 및 -헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되고, 다중 치환도가 허용된다. 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 등과 같은 치환기, 또는 -OH, -NHR 등과 같은 작용기가, 적절한 경우에는 그 자체가 치환될 수 있음은 당업자에 의해 이해될 것이다. 또한, 적절한 경우에는, 치환된 부분 자체도 역시 치환될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 이하의 부분: 다이설파이드(-S-S-), 에터(-O-), 싸이오에터(-S-), 아민(-NH-), 에스터(-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카복사마이드(-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 유레테인(-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 유레아 부분(-NH-C(=O)-NH-) 중 하나로부터 선택되는 부분을 포함한다.
링커 L은 알킬렌, 알켄일렌, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알켄일렌, 헤테로알킨일렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아르 알킬렌 및 헤테로아르알킬렌의 목록으로부터 선택되는 다수의 m개의 기를 포함하고, 여기에서 각 기는 임의로 독립적으로 치환될 수 있으며, 링커는 이하의 부분: 다이설파이드(-S-S-), 에터(-O-), 싸이오에터(-S-), 아민(-NH-), 에스터(-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카복사마이드(-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 유레테인(-NH-C(=O)-O- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 유레아 부분(-NH-C(=O)-NH-)을 추가로 포함하고, 여기에서 m = n+1이다. 특정 실시양태에서, m은 2이고 n은 1이거나, 또는 m은 3이고 n은 2이다. 특정 실시양태에서, 링커는 2 또는 3개의 비치환된 알킬렌기, 및 그 비치환된 알킬렌기를 연결하는, 각각 1 또는 2개의 다이설파이드, 에터, 싸이오에터, 아민, 에스터, 카복사마이드, 유레테인 또는 유레아 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 헤테로아릴렌기를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 C 원자는 독립적으로, 임의로 치환된 메틸렌기(-CH2-)의 일부이다. 특정한 이러한 실시양태에서, 임의의 치환기는 할로젠 및 C1-6-알킬, 특히 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, 링커 L은 안정한 링커이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "안정한 링커"는 (i) 효소의 존재하에, 및 (ii) 세포내 환원 환경에서 안정한 링커를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 안정한 링커는 (i) 효소 절단 가능한 하부구조, 및/또는 (ii) 다이설파이드기를 함유하지 않는다. 특정한 이러한 실시양태에서, 링커는 12개 이하의 원자, 특히 2 내지 10개, 보다 특히 4 내지 9개, 가장 특히 6 내지 8개 원자의 길이를 갖는다.
특정한 다른 실시양태에서, 링커는 절단 가능한 링커이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "절단 가능한 링커"는 (i) 효소에 의해 절단 가능하거나, 또는 (ii) 환원 가능한 링커인 링커를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 그 용어는 효소에 의해 절단 가능한 링커만을 지칭한다(환원 가능한 링커를 지칭하지는 않는다).
본 발명의 문맥에서, 용어 "효소에 의해 ... 절단 가능한 링커"는 효소에 의해, 특히 카텝신(Cathepsin) B와 같은 라이소솜 펩티다제에 의해 절단될 수 있는 링커로서, 내재화 후에 표적화 항체에 콘주게이트된 톡소 카고(toxin cargo)의 세포내 방출을 초래하는 링커를 지칭한다(Dubowchik et al., Bioconjug Chem. 13 (2002) 855-69 참조). 특정 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit 및 Val-Cit로부터 선택되는 다이펩타이드를 포함하고, 특히 여기에서, 절단 가능한 링커는 다이펩타이드와 아마톡신 사이에 p-아미노벤질(PAB) 스페이서를 추가로 포함한다.
특정한 이러한 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조 L1-L*-L2
Figure pct00003
를 포함하고, 여기에서 L1은 L*을 아마톡신에 연결시키는 링커의 일부이며, 특히 여기에서 L1은 -NH- 또는 -O- 기, 특히 -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-O- 또는 -C(=O)-O- 기를 개재하여 L*에 연결되고,
L2는 L*을 표적 결합 부분에 연결시키는 링커의 일부이며, 특히 여기에서 L1은 -(CH2)m- 부분(m은 1 내지 8, 특히 1 내지 5로부터 선택되는 정수임)을 개재하여, 또는 -(CH2CH2O)n- 부분(n은 1 내지 3, 특히 1 내지 2로부터 선택되는 정수임)을 개재하여 L*에 연결된다.
특정한 다른 이러한 실시양태에서, L*은 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00004
특정 실시양태에서, 링커 L1은 C, O, N 및 S로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 원자, 특히 1 내지 3개의 원자, 보다 특히 1 내지 2개의 원자, 보다 더 특히 단지 1개의 원자의 선형 쇄이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 원자의 적어도 50%는 C 원자이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 원자는 단일 결합에 의해 연결된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "환원 가능한 링커"는 세포내 환원 환경에서 절단될 수 있는 링커, 특히 다이설파이드기를 함유하는 링커로서, 세포내 환원 환경에 의해 내재화 후에 표적 결합 부분에 콘주게이트된 톡소 카고의 세포내 방출을 초래하는 링커를 지칭한다(Shen et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 10905-10908 참조). 특정 실시양태에서, 환원 가능한 연결기는 부분
Figure pct00005
을 포함하고, 여기에서 R1 내지 R4는 독립적으로 H 및 메틸로부터 선택된다.
특정한 이러한 실시양태에서, 이러한 절단 가능한 링커는 20개 이하의 원자, 특히 6 내지 18개, 보다 특히 8 내지 16개, 가장 특히 10 내지 15개 원자의 길이를 갖는다. 특정한 이러한 실시양태에서, 본 발명에 따른 아마톡신과 절단 가능한 다이설파이드기를 연결하는 링커의 부분은 3 또는 4개의 C 원자, 특히 3개의 C 원자의 선형 쇄이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 3 또는 4개의 C 원자는 단일 결합에 의해 연결된다. 특정 실시양태에서, 링커는 n-프로필렌기이다.
특정 실시양태에서는, 상기 링커가 존재하고, 하기로부터 선택되는 화학식 I의 아마톡신 내의 위치에 한쪽 측에서 연결된다:
(i) R3 = -NHR5인 화학식 I의 콘주게이트의 경우, 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자에서 아마이드기의 질소 원자(아마이드 결합);
(ii) R3 = -OR5인 화학식 I의 콘주게이트의 경우, 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자에서 산기의 산소 원자(에스터 결합);
(iii) R3 = -NHOR5인 화학식 I의 콘주게이트의 경우, 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자에서 히드록삼산기의 산소 원자;
(iv) 특히 에스터 결합, 에터 결합 또는 유레테인 결합을 개재하여, 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자에서 하이드록시기의 산소 원자; 또는
(v) 아미노산 4의 환 질소.
특정한 이러한 실시양태에서는, 상기 링커가 존재하고, 상기에 나타낸 (ii) 내지 (v)로부터 선택되는 화학식 I의 아마톡신 내의 위치에 한쪽 측에서 연결된다. 특정 실시양태에서는, 상기 링커가 존재하고, 상기에 나타낸 (ⅳ) 내지 (v)로부터 선택되는 화학식 I의 아마톡신 내의 위치에 한쪽 측에서 연결된다.
표적 결합 부분에의 링커의 커플링은 당해 기술 분야, 특히 항체-약물 콘주게이트(ADC) 분야의 당업자에게 주지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 링커는 유레아 부분을 개재하여 표적 결합 부분에 연결된다(...-링커-NH-C(=O)-NH-표적 결합 부분). 그러한 특정 실시양태에서, 유레아 부분은 라이신 측쇄의 아미노기와 같은, 표적 결합 부분에 원래 존재하는 1차 아민과, 카밤산 유도체 ...-링커-NH-C(O)-Z(여기에서 Z는 1차 아민으로 치환될 수 있는 이탈기임)의 반응으로부터 생성된다.
특정한 다른 실시양태에서는, 상기 링커가 존재하고 싸이오에터 부분을 개재하여 표적 결합 부분에 연결된다(...-링커-S-표적 결합 부분). 따라서, 이러한 실시양태에서, 본 발명은 일반식:
Dideoxyxamatoxin - L - X* - S - Tbm
의 콘주게이트에 관한 것으로, 여기에서 Dideoxyxamatoxin은 본 발명에 따른 아마톡신이고, L은 링커이고, X*는 싸이올 반응성 기에의 싸이올기의 커플링으로부터 생성되는 부분이고, S는 상기 싸이올기, 특히 아미노산 잔기 시스테인의 싸이올기의 황 원자이며, Tbm은 표적 결합 부분, 특히 상기 아미노산 잔기 시스테인을 포함하는 항체 또는 기능성 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 잔기 시스테인은 (i) CL, CH1, CH2 및 CH3으로부터 선택되는 항체 도메인 내에 위치하고; (ii) 상기 항체 도메인의 서열에 가장 가까운 상동성을 나타내는 생식계열 서열이, 시스테인과는 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 위치에 위치하며; (iii) 용매에 노출되는 위치에 위치한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "싸이올 반응성 기"는, 특히 6.0 내지 8.0 범위의 pH값에서, 보다 특히 6.5 내지 7.5 범위의 pH값에서, 예를 들면 항체의 유리 시스테인의 싸이올기와 선택적으로 반응하는 기를 지칭한다. 특히, 용어 "선택적으로"는 싸이올 반응성 기를 포함하는 분자와 적어도 하나의 유리 시스테인 잔기를 포함하는 항체의 커플링 반응의 10% 미만이, 라이신 잔기와 같은, 항체의 비시스테인 잔기와의 커플링 반응인 것을 의미하고, 특히 5% 미만, 보다 특히 2% 미만이다. 특정 실시양태에서, 싸이올 반응성 기는 브로모아세트아마이드, 아이오도아세트아마이드, 말레이미드, 3 위치에 이탈기, 특히 -Br, 및 치환된 싸이올로부터 선택되는 이탈기를 갖는 말레이미드(예를 들면, US 9,295,729 참조), 4 위치에 이탈기, 특히 -Br, 및 치환된 싸이올로부터 선택되는 이탈기를 갖는 1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온(예를 들면, US 9,295,729 참조), 메틸설폰일 벤조싸이아졸, 메틸설폰일 페닐테트라졸, 메틸설폰일 페닐옥사다이아졸(Toda et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52 (2013) 12592-6 참조), 3-아릴프로피오나이트릴(Kolodych et al, Bioconjugate Chem. 2015, 26, 197-200 참조), 및 5-나이트로-피리딘-2-일-다이설파이드(...-L-S-S-(5-나이트로-피리딘-2-일)로부터 선택된다..
특정 실시양태에서, 링커에 연결되는 한쪽 측에 있는 상기 위치 또는 작용기로서, 표적 결합 부분에 존재하는 위치 또는 작용기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있는 위치 또는 작용기는, 하나의 표적 결합 부분에 또는 2개의 표적 결합 부분에 존재하는 2개의 싸이올기와 반응할 수 있는 부분이다. 특정 실시양태에서, 싸이올 반응성 기는 3 및 4 위치에 2개의 이탈기를 갖는 말레이미드이고, 이는 특히 3,4-다이브로모말레이미드, 3,4-비스(아릴싸이오)-말레이미드, 특히 3,4-다이페닐싸이오-말레이미드, 및 3,4-비스(헤테로아릴싸이오)-말레이미드, 특히 3,4-비스(2-피리딘일-설판일)-말레이미드로부터 선택되는 것이다. 특정한 다른 실시양태에서, 싸이올 반응성 기는 4 및 5 위치에 2개의 이탈기를 갖는 1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온이고, 이는 특히 4,5-브로모-1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온, 4,5-비스(아릴싸이오)-1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온, 특히 4,5-다이페닐싸이오-1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온, 및 4,5-비스(헤테로아릴싸이오)-1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온, 특히 4,5-비스(2-피리딘일-설판일)-1,2-다이하이드로피리다진-3,6-다이온으로부터 선택되는 것이다.
특정 실시양태에서, 싸이올 반응성 기에의 싸이올기의 커플링으로부터 생성되는 부분은, 하나의 황 원자가 항체의 시스테인 잔기로부터 유래되는, 싸이올 치환된 아세트아마이드; 싸이올 치환된 석신이미드; 싸이올 치환된 석시남산; 싸이올 치환된 헤테로아릴, 특히 싸이올 치환된 벤조싸이아졸, 싸이올 치환된 페닐테트라졸 및 싸이올 치환된 페닐옥사다이아졸; 및 다이설파이드로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 싸이올 반응성 기에의 싸이올기의 커플링으로부터 생성되는 부분은 싸이올-치환된 석신이미드이다.
특정 실시양태에서, 단락 [0070]의 일반식에 존재하는 부분 L-X*-S 중의 링커 L은 하기 부분의 군으로부터 선택된다:
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)3-S-S-(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -(CH2)3-S-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S- (Tbm 측)
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
(다이데옥시아마톡신 측) -CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S- (Tbm 측);
여기에서, 다이펩타이드 서열에 인접한 -NH- 및 -CO-는 각각 다이펩타이드의 카복시- 및 아미노-말단에의 아마이드 결합을 형성하는 링커의 아미노 및 카보닐 부분을 나타낸다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "싸이올 반응성 기에의 싸이올기의 커플링으로부터 생성되는 부분"은 (i) 시스테인 잔기의 황 원자에 의한, 싸이올 반응성 기에 존재하는 이탈기 Y, 예를 들면 브로모 아세트아마이드기, 아이오도 아세트아마이드, 4,6-다이클로로-1,3,5-트라이아진-2-일아미노기, 알킬설폰 또는 헤테로아릴설폰의 친핵성 치환; (ii) 싸이올 반응성 기, 예를 들면 말레이미드의 활성화된 이중 결합에의, 시스테인 잔기의 HS기의 부가; 또는 (iii) 시스테인 잔기의 황 원자와의, 예를 들면 이탈기로서의 피리딘-2-싸이올, 5-나이트로피리딘-2-싸이올 또는 메테인설피네이트와의, 활성화된 다이설파이드 또는 메테인싸이오설포네이트의 다이설파이드 교환; (iv) 시스테인 잔기의 황 원자와, 싸이올 반응성 기의 일부인 반응성 부분 간의 안정한 결합을 초래하는 임의의 다른 화학 반응으로부터 생성되는 구조를 지칭한다.
싸이올기의 커플링으로부터 생성되는 주요 부분은 임으로 더 유도체화될 수 있고, 예를 들어, 말레이미드로부터 생성되는 석신이미딜 싸이오에터는 하기 일반 구조의 석시남산 싸이오에터로 가수분해될 수 있다:
Figure pct00006
또는
Figure pct00007
.
특정한 다른 실시양태에서, 부위 특이적 커플링은 표적 결합 부분에 존재하는 다이설파이드 브리지를 환원시키고, 2개의 시스테인 잔기를 Dideoxyxamatoxin - L - X* 구성체에 존재하는 브리지화 부분 X*와 반응시킴으로써 달성될 수 있다(Badescu et al. Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (2014) 1124-1136 참조).
유사한 실시양태에서, 부위 특이적 커플링은 표적 결합 부분에 존재하는 다이설파이드 브리지를 환원시키고, 2개의 시스테인 잔기를 Dideoxyxamatoxin - L - X* 구성체(특히 여기에서 X*는
Figure pct00008
임)에 존재하는 브리지화 부분 X*와 반응시킴으로써 달성될 수 있다(Bryden et al., Bioconjug Chem, 25 (2014) 611-617; Schumacher et al., Org Biomol Chem, 2014, 7261-7269 참조).
특정한 다른 실시양태에서, 커플링은 링커에 존재하는 아미노기를, 트랜스아미나제를 통해, 표적 결합 부분에 존재하는 글루타민 잔기에 위치 특이적으로 커플링시킴으로써, 특히 항체의 글루타민 Q295에 커플링시킴으로써 달성된다.
Figure pct00009
특정 실시양태에서, 커플링은 N-글리칸 측쇄를 포함하는 표적 결합 부분에의 부위 특이적 콘주게이션에 의해 달성된다. 특히, N-글리칸 측쇄는 효소적으로 분해될 수 있고, 이어서 아지도-갈락토스에 의해 트랜스-글리코실화될 수 있다. 클릭 화학을 이용하여, 이러한 개변된 표적 결합 부분은 적절히 개변된 구성체 Dideoxyxamatoxin - L - X*에 커플링될 수 있고, 여기에서 X*는 예를 들면 다이벤조-사이클로옥틴(DIBO) 또는 C-C 삼중 결합을 포함하는 유사 부분이다. 예를 들면, 구성체 Dideoxyxamatoxin-L-NH2는 하이드록시 석신이미드 부분의 친핵성 치환에 의해 DIBO-SE
Figure pct00010
에 커플링될 수 있다. 그 후, 생성된 DIBO-개변된 링커 구성체는 전술한 아지도 유도체에 커플링될 수 있다. 대체 실시양태에서, 표적 결합 부분은 클릭 화학을 가능하게 하는 비천연 아미노산의 혼입에 의해, 특히 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF)의 혼입에 의해 개변될 수 있다.
특정 실시양태에서, - L - X* 중의 링커 L은 C, O, N 및 S로부터 독립적으로 선택되는 적어도 5개, 특히 적어도 10개, 보다 특히 10 내지 20개의 원자, 특히 10 및 18개의 원자, 보다 특히 10 내지 16개의 원자, 보다 더 특히 10 내지 15개의 원자의 선형 쇄이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 원자의 적어도 60%는 C 원자이다. 특정 실시양태에서, 선형 쇄 중의 원자는 단일 결합에 의해 연결된다.
대체 실시양태에서, 표적 결합 부분에 존재하는 위치 또는 작용기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있는 위치 또는 작용기는 에틴일기는 아니거나, 또는 보다 일반적으로는 알킨일기는 아니거나, 또는 1,3-쌍극자 환화 첨가에서 1,3 쌍극자와 반응할 수 있는 기는 아니다(클릭 화학).
특정한 다른 실시양태에서, 표적 결합 부분에의 Dideoxyxamatoxin - L - X* 구성체의 부위 특이적 결합은, 케토기를 포함하는 비천연 아미노산, 특히 p-아세틸페닐알라닌(pAcPhe)을 표적 결합 부분 내로 혼입하고, 이러한 개변된 표적 결합 부분을 Dideoxyxamatoxin - L - X* 구성체(여기에서 X*는 하이드록실아민 부분임)과 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
추가의 실시양태에서는, 폼일기가 폼일글리신 생성 효소(FGE)에 의해 도입될 수 있고, 이 효소(FGE)는 인식 서열 CxPxR 중의 시스테인기에 대해 고도로 선택성이어서 알데하이드 태그를 생성한다. 이러한 알데하이드 태그는 Dideoxyxamatoxin - L - X* 구성체(특히 여기에서 X*는
Figure pct00011
임)에 존재하는 적절한 기 X*와 반응할 수 있다(Agarwal et al., Bioconjugate Chem 24 (2013) 846-851 참조).
제 2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 환자의 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 콘주게이트로서, 특히 상기 암은 유방암, 췌장암, 담관암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병, 및 악성 림프종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 콘주게이트에 관한 것이다.
본원에서 사용되는, 질환 또는 장애를 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음의 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료되는 장애(들)에 특징적인 증상의 발증을 제한 또는 예방하는 것; (c) 치료되는 장애(들)에 특징적인 증상의 악화를 억제하는 것; (d) 이전에 장애(들)가 있었던 환자의 장애(들)의 재발을 제한 또는 예방하는 것; (e) 이전에 장애(들)에 대해 증상을 나타냈던 환자에서 증상의 재발을 제한 또는 예방하는 것.
본원에서 사용되는 치료는 본 발명에 따른 콘주게이트 또는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기에서 "투여하는" 것은 생체내 투여뿐만 아니라, 생체외 조직, 예를 들면 정맥 이식편에의 직접 투여를 포함한다.
특정 실시양태에서는, 치료적 유효량의 본 발명의 콘주게이트가 사용된다.
"치료적 유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 치료제의 양이다. 주어진 치료제의 유효량은 약제의 성질, 투여의 경로, 치료제를 받는 동물의 크기 및 종, 및 투여의 목적과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 각각의 개별적 경우에서의 유효량은 당업계의 확립된 방법에 따라 숙련자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 아마톡신을 포함하거나, 또는 아마톡신과 표적 결합 부분의 본 발명의 콘주게이트를 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 활택제, 유동촉진제(glidant), 붕괴제, 흡착제; 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
"약학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되어 있거나, 또는 미국 약전이나 동물, 보다 특히 인간에서의 사용을 위한 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거되어 있는 것을 의미한다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 전신 투여되는 의약의 형태로 사용된다. 이것에는 비경구제가 포함되고, 이는 특히 주사제 및 주입제를 포함한다. 주사제는 앰풀의 형태로 또는 소위 사용 준비가 된(ready-for-use) 주사제, 예를 들어 즉시 사용할 수 있는(ready-to-use) 주사기 또는 일회용 주사기로서, 그리고 그에 더하여, 다중 발출용의 천공 가능한 플라스크 내에 제제화된다. 주사제의 투여는 피하(s.c.), 근육내(i.m.), 정맥내(i.v.) 또는 피내(i.c.) 적용의 형태일 수 있다. 특히, 결정의 현탁액, 용액, 나노입자, 또는 예를 들어 하이드로졸과 같은 콜로이드 분산계로서 각각 적합한 주사 제제를 제조하는 것이 가능하다.
주사용 제제는 또한, 수성 등장 희석제로 용해 또는 분산될 수 있는 농축물로서 제조될 수 있다. 주입제는 또한 등장 용액, 지방 에멀션, 리포솜 제제 및 마이크로 에멀션의 형태로 조제될 수도 있다. 주사제와 유사하게, 주입 제제는 또한 희석용 농축물의 형태로 조제될 수도 있다. 주사용 제제는 또한 예를 들어 미니-펌프에 의해, 입원 환자 및 외래 요법 둘 다에서 영구적인 주입제의 형태로 적용될 수도 있다.
비경구 약물 제제에, 예를 들면 알부민, 혈장, 증량제, 표면 활성 물질, 유기 희석제, pH 영향 물질, 착화 물질 또는 중합체성 물질을, 특히 단백질 또는 중합체로의 본 발명의 표적 결합 부분 톡신 콘주게이트의 흡착에 영향을 주는 물질로서 첨가하는 것이 가능하거나, 또는 이들을, 주사 기구 또는 포장 재료, 예를 들면 플라스틱 또는 유리와 같은 재료로의 본 발명의 표적 결합 부분 톡신 콘주게이트의 흡착을 감소시킬 목적으로 첨가할 수도 있다.
표적 결합 부분을 포함하는 본 발명의 아마톡신은 비경구제 등 내의 마이크로담체 또는 나노입자에, 예를 들면 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트, 폴리글라이콜레이트, 폴리아미노산 또는 폴리에터 유레테인을 기재로 하는 미세 분산된 입자에 결합될 수 있다. 비경구 제제는 또한, 본 발명의 표적 결합 부분 톡신 콘주게이트가 각각 미세 분산 형태, 분산 형태 및 현탁 형태로 도입되는 경우에는, 예를 들어 "다중 단위 원리(multiple unit principle)"에 기초하여 데포 제제로서 변형되거나, 또는 본 발명의 표적 결합 부분 톡신 콘주게이트가 제제 내에, 예를 들어 후속적으로 이식되는 정제 또는 로드제 내에 봉입되는 경우에는, 의약 중의 결정의 현탁액으로서 또는 "단일 단위 원리(single unit principle)"에 기초하여 변형될 수 있다. 단일 단위 및 다중 단위 제제에서의 이들 이식물 또는 데포 약은 예를 들어 락트산과 글라이콜산의 폴리에스터, 폴리에터 유레테인, 폴리아미노산, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 다당류 등과 같은 소위 생분해성 중합체로 흔히 이루어진다.
비경구제로서 제제화되는 본 발명의 약학 조성물의 제조 중에 첨가되는 보조제 및 담체는 특히 멸균수(aqua sterilisata(sterilized water)), pH값에 영향을 주는 물질, 예를 들어 유기 혹은 무기 산 또는 염기뿐만 아니라 이들의 염 등, pH값을 조절하기 위한 완충 물질, 등장화를 위한 물질, 예를 들어 염화 나트륨, 탄산 수소 나트륨, 글루코스 및 프럭토스 등, 계면 활성제(tenside) 및 표면 활성제(surfactant) 각각, 및 유화제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소비탄의 지방산의 부분 에스터(예를 들면, Tween®) 또는 예를 들어 폴리옥시에틸렌의 지방산 에스터(예들 들면, Cremophor®) 등, 지방유, 예를 들어 땅콩유, 대두유 또는 피마자유 등, 지방산의 합성 에스터, 예를 들어 에틸 올레에이트, 아이소프로필 미리스테이트 및 중성 오일(예를 들면, Miglyol®) 등뿐만 아니라, 중합체성 보조제, 예를 들어 젤라틴, 덱스트란, 폴리바이닐피롤리돈 등, 유기 용매의 용해도를 증가시키는 첨가제, 예를 들어 프로필렌 글라이콜, 에탄올, N,N-다이메틸아세트아마이드, 프로필렌 글라이콜 등, 또는 착체 형성 물질, 예를 들어 시트르산염 및 유레아 등, 보존제, 예를 들어 벤조산 하이드록시프로필 에스터 및 메틸 에스터, 벤질 알코올 등, 산화방지제, 예를 들어 아황산 나트륨 등, 및 안정화제, 예를 들어 EDTA 등이다.
바람직한 실시양태에서 현탁제로서 본 발명의 약학 조성물을 제제화하는 경우, 본 발명의 표적 결합 부분 톡신 콘주게이트의 경화를 방지하는 증점제, 또는 침강물의 재현탁성을 확보하는 계면 활성제 및 고분자 전해질, 및/또는 착체 형성제, 예를 들면 EDTA 등이 첨가된다. 각종 중합체와의 활성 성분의 복합체를 얻는 것도 가능하다. 이러한 중합체의 예로는 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리스타이렌, 카복시메틸 셀룰로오스, Pluronics® 또는 폴리에틸렌 글라이콜 소비트 지방산 에스터가 있다. 본 발명의 표적 결합 부분 톡신 콘주게이트는 또한 예를 들어 사이클로덱스트린과의 포접 화합물의 형태로 액체 제제에 혼입될 수도 있다. 특정 실시양태에서는, 분산제가 추가적인 보조제로서 첨가될 수 있다. 동결 건조물의 제조를 위해서는, 만나이트, 덱스트란, 사카로스, 인간 알부민, 락토스, PVP 또는 각종 젤라틴과 같은 스캐폴딩제(scaffolding agent)를 사용할 수 있다.
제 4 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; 및 (c) 상기 아마톡신을 표적 결합 부분에 연결하기 위한 반응성 기를 가지는 링커 부분을 포함하는 구성체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 구조 II를 갖는 구성체에 관한 것이다.
Figure pct00012
여기에서:
R2는 S이고;
R3은 -NHR5, -NH-OR5, 및 -OR5로부터 선택되고;
R4는 H이며;
이때 R5 중 하나는 -L-Y(여기에서 L은 링커이고, Y는 상기 구성체를 표적 결합 부분에 연결하기 위한 반응성 기임)이다.
실시예
이하에서, 본 발명을 비한정적인 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다:
1. 합성 다이데옥시 전구체 분자 K의 합성
다이데옥시 전구체 분자 K의 합성은 WO 2014/009025에서 실시예 5.5에 기재되어 있다.
Figure pct00013
화합물 K를 7N 메탄올성 NH3 용액(3.0ml)으로 처리하고 밤새 교반함으로써 탈보호할 수도 있다.
2. 합성 다이데옥시 전구체 HDP 30.2105의 합성
아미노산 1에서 카복사마이드기 대신에 -COOH기를 포함하는 대안적인 다이데옥시 전구체 분자를 합성하고(HDP 30.1895), 탈보호하여 HDP 30.2105를 얻을 수 있다.
Figure pct00014
단계 1: 4-하이드록시-피롤리딘-1,2-다이카복실산 2-알릴 에스터 1-(9H-플루오렌-9-일메틸) 에스터(HDP 30.0013)
Figure pct00015
FmocHypOH(10.0g, 28.3mmol)를 80% MeOH 100ml에 현탁시키고, Cs2CO3(4.6g, 14.1mmol)을 첨가하였다. 현탁액을 완전히 용해될 때까지 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축 건조하고, DMF 100ml에 용해시켰다. 알릴브로마이드(1.6ml, 3.6g, 29.7mmol)를 적가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 증류 제거하고, 잔류물을 tert-뷰틸메틸 에터에 용해시켰다. 침전물을 여과하고, 투명한 용액을 컬럼 크로마토그래피 전에 셀라이트 상에 흡수시켰다. 화합물을 n-헥세인/에틸 아세테이트 구배로 220g 실리카 겔 상에서 정제하였다.
수율: 11.5g, 100%
단계 2: 수지 부하(HDP 30.0400)
Figure pct00016
다이클로로에테인 40ml 중의 1,3-다이하이드로-2H-피란-2-일-메톡시메틸 수지(5.0g, 1.0mmol/g THP-수지)의 현탁액에 HDP 30.0013(5.0g, 14.1mmol), 피리디늄 4-톨루엔설포네이트(1.33g, 5.3mmol)를 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 냉각 후, 수지를 여과하고, 다이클로로에테인, 다이메틸폼아마이드, 아세토나이트릴, 다이클로로메테인 및 tert-뷰틸메틸에터로 충분히 세정하였다.
부하량은 0.62mmol/g(탈보호 후 플루오렌 메틸기의 UV 분광법에 의해 측정됨)이었다.
단계 3: 고체상 전구체 합성(HDP 30.1894)
Figure pct00017
수지 전처리:
HDP 30.0400(0.5g, 0.31mmol)을 N,N-다이메틸바비투르산(483mg, 3.1mmol) 및 Pd(PPh3)4(69mg, 0.06mmol)로 처리하였다. 수지를 실온에서 밤새 진탕시켰다. 그 후, 수지를 다이클로로메테인, N-메틸-2-피롤리돈, 아세토나이트릴, 다이클로로메테인 및 tert-뷰틸메틸에터로 충분히 세정하고, 감압하에 건조하였다.
커플링 절차:
모든 반응 물질 및 시약을 1% Triton-X100을 함유하는 다이클로로메테인/N-메틸-2-피롤리돈(용매 A)에 용해시켰다.
HDP 30.0477(257mg, 0.38mmol)을 3.0ml의 용매 A에 용해시키고, 3.0ml의 0.2N 용액 PyBOP(333mg, 0.63mmol, 2.0eq), 3.0ml의 0.2N 용액 HOBt(130mg, 0.63mmol, 2.0eq) 및 439μl의 DIEA(4.0eq)를 첨가하였다. 반응물을 마이크로파 조사(20W, CEM 마이크로파 반응기)에 의해 8분 동안 50℃로 가열하고, 커플링 후 N-메틸-2-피롤리돈으로 세정하였다.
탈보호:
탈보호는 N-메틸-2-피롤리돈 중의 20% 피페리딘 6.0ml를 50℃에서 8분 동안 첨가하여 수행하였다. 수지를 N-메틸-2-피롤리돈으로 세정하였다.
(주: 최종 아미노산의 커플링 후 탈보호 없음)
모든 다른 아미노산을 상기 프로토콜에 따라 커플링하였는데, 가중치를 이하에 나타낸다:
0.63mmol, 498mg Fmoc Asp(OAII)OH
0.63mmol, 738mg Fmoc Cys(Tri)OH
0.63mmol, 375mg Fmoc GlyOH
0.63mmol, 445mg Fmoc IleOH
0.63mmol, 375mg Fmoc GlyOH
0.38mmol, 242mg N-Boc-HPIOH(HDP 30.0079)
4,5-다이아세톡시-2-아미노-3-메틸-펜탄산 tert-뷰틸 에스터; 하이드로클로라이드(HDP 30.0477)는 WO 2014/009025에 기재된 바와 같이 합성하였다.
N-Boc-HPIOH(HDP 30.0079)는 Zanotti, Giancarlo; Birr Christian; Wieland Theodor; International Journal of Peptide & Protein Research 18 (1981) 162-8에 따라 제조하였다.
단계 4: HDP 30.1895
Figure pct00018
수지로부터의 제거 및 B환 형성
수지를 5% 트라이아이소프로필실레인을 함유하는 트라이플루오로아세트산 10ml와 함께 30분 동안 진탕시키고, 최종적으로 50ml 플라스크 내로 용출시켰다. 수지를 메탄올(각각 10ml)로 2회 세정하였다. 합친 용출물을 진공에서 농축시키고, 2-4ml의 메탄올에 재현탁시켰다. 메탄올성 용액을 펩타이드 침전을 위해 차가운 다이에틸 에터 50ml에 2회 적하하였다. 원심분리 후, 침전물을 다이에틸 에터(2회)로 세정하고, 감압하에 건조하였다. 백색 침전물을 약 4-5ml의 메탄올(100mg당 0.5ml)에서 가용화시키고, 분취용 역상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 실행마다 약 100mg의 조질 침전물을 정제하였다. 분획을 질량 분광법에 의해 분석하고, 합치고, 메탄올을 감압하에 증류 제거하였다. 수성 상을 동결 건조하였다.
수율: 24.4mg, 23.7μmol
질량 분석: [M+H]+, 1030.5
A환 형성
상기 동결 건조된 중간체를 다이메틸폼아마이드 25ml에 용해시키고, 다이페닐포스포릴아자이드(63μl, 1185μmol, 5eq) 및 다이아이소프로필에틸아민(201μl, 1185μmol, 5eq)으로 처리하였다. 반응물을 밤새(20시간) 교반하였다. 전환을 역상 크로마토그래피에 의해 모니터링하고, 최종적으로 물 100μl로 켄칭하였다. 혼합물을 감압 농축하고, 메탄올 1-2ml에 재용해시켰다. 다이에틸 에터 20ml에 적가하는 것에 의해 생성물의 침전을 수행하였다. 침전물을 다이에틸 에터로 2회 세정하고, 감압하에 건조하였다. 다음 단계는 추가의 정제 없이 수행하였다.
질량 분석: [M+Na]+, 1034.6
에스터 탈보호:
조질의 환화 생성물에 다이클로로메테인 2.5ml, 다이에틸바비투르산(22.3mg, 118.5μmol) 및 Pd(PPh3)4(27mg, 23.7μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 RP-HPLC에 의해 모니터링할 수 있다. 완전히 전환 후, 혼합물을 냉각된 다이에틸 에터 20ml에 적가하고, 침전물을 다이에틸 에터로 2회 세정하였다. 감압하에 건조한 후, 침전물을 메탄올(1.0ml)에 용해시키고, 분취용 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
수율: 15.0mg
질량 분석: [M+H]+, 972,3; [M+Na]+, 994.5
단계 5: HDP 30.2105
Figure pct00019
HDP 30.1895(15.0mg, 15.3μmol)를 7N 메탄올성 NH3 용액(3.0ml)에 용해시키고, 밤새 교반하였다. 전환율을 질량 분광법에 의해 체크하였다. 완전히 전환 후, 반응물을 진공 농축시키고, 80% tert-뷰탄올에 현탁시키고, 동결 건조하였다. 생성물을 분취용 HPLC에 의해 정제하였다.
수율: 12.1mg
질량 분석: [M+H]+, 888,0; [M+Na]+, 910.2
3. 합성 다이데옥시 전구체 HDP 30.2115의 합성
Figure pct00020
절단 가능한 링커와 함께 싸이올 반응성 기를 포함하는 다이데옥시 전구체 분자는 하기와 같이 7 단계로 실시예 2의 생성물로부터 합성할 수 있다:
단계 1: Fmoc-Val-OSu(HDP 30.1343)
Figure pct00021
이 화합물은 R. A. Firestone 등의 US 6,214,345에 따라 제조한다. 0℃의 테트라하이드로퓨란(200ml) 중 Fmoc-Val-OH(20.24g; 59.64mmol) 및 N-하이드록시석신이미드(6.86g = 1.0eq.)를 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(12.30g; 1.0eq.)로 처리하였다. 혼합물을 아르곤 분위기하에 실온에서 6시간 동안 교반하고, 그 후 고체 다이사이클로헥실 유레아(DCU) 부산물을 여과 제거하고, THF로 세정하고, 용매를 회전 증발기에 의해 제거하였다.
잔류물을 다이클로로메테인 300ml에 용해시키고, 얼음욕에서 1시간 동안 냉각하고, 다시 여과하여 추가적인 DCU를 제거하였다. 다이클로로메테인을 증발시키고, 고체 발포체(26.51g)를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: Fmoc-Val-Ala-OH(HDP 30.1414)
Figure pct00022
단계 2의 생성물은 P.W. Howard 등의 US 2011/0256157과 유사하게 제조한다. 물 150ml 중 L-알라닌(5.58g, 1.05eq.) 및 탄산 수소 나트륨(5.51g, 1.1eq.)의 용액을 조제하고, 테트라하이드로퓨란 225ml 중 HDP 30.1343(26.51g, 최대 59.6mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 50시간 동안 교반하였다. 출발 물질의 소비 후, 용액을 0.2M 시트르산 240ml와 에틸 아세테이트 200ml 사이에서 분배시켰다. 수성 층을 분리하고 에틸 아세테이트(3 x 200ml)로 추출하였다. 합친 유기 층을 물 및 염수(각각 300ml)로 세정하고, 건조하고(MgSO4), 용매를 약 200ml까지 증발시켰다. 이 시점에서 순수한 생성물이 침전되었고 이를 여과 분별하였다. 모액을 증발 건조하고, 잔류물을 MTBE 100ml로 1시간 교반하여 추가적인 결정질 물질을 얻었다. 생성물의 수확물 2개를 합쳐 18.01g(74%)의 백색 분말을 얻었다. (m.p.: 203-207℃)
MS (ESI+) [M+Na]+ 실측치: 410.94; 계산치: 411.19 (C23H27N2O5)
[M+Na]+ 실측치: 433.14; 계산치: 433.17 (C23H27N2O5)
[2M+H]+ 실측치: 842.70; 계산치: 843.36 (C46H52N4NaO10)
단계 3: Fmoc-Val-Ala-PAB-NHBoc(HDP 30.1713)
Figure pct00023
단계 2의 생성물 HDP 30.1414(1.76g; 4.28mmol) 및 4-[(N-Boc)아미노메틸]아닐린(1.00g; 1.05eq.)을 무수 테트라하이드로퓨란 26ml에 용해시켰다. 2-에톡시-N-(에톡시카보닐)-1,2-다이하이드로퀴놀린(EEDQ 1.11g; 1.05eq.)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하고, 빛으로부터 보호하였다. 진행 중인 반응에 의해, 초기에 투명했던 용액으로부터 젤라틴성 물질이 형성된다. 40시간 후, 반응 혼합물을 25ml의 tert-뷰틸메틸 에터(MTBE)로 희석하고, 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 침전물을 흡인으로 여과 분별하고, MTBE로 세정하고, 진공 건조하여 2.30g(수율 85%)의 백색 고체를 얻는다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.87 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (q, J = 8.4, 7.9 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.45 - 7.23 (m, 7H), 7.17 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.44 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.17 (m, 3H), 3.96 - 3.89 (m, 1H), 2.01 (hept, J = 6.9 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 170.84, 170.76, 156.04, 155.63, 143.77, 143.69, 140.60, 137.41, 134.99, 127.50, 127.26, 126.93, 125.22, 119.95, 118.97, 77.60, 65.62, 59.95, 48.86, 46.62, 42.93, 30.28, 28.16, 19.06, 18.10, 18.03.
단계 4: H-Val-Ala-PAB-NHBoc(HDP 30.1747)
Figure pct00024
단계 3의 화합물 HDP 30.1713(1.230g, 2.00mmol)을 100ml 플라스크에 넣고, 40ml의 다이메틸폼아마이드(DMF)에 용해시켰다. 다이에틸 아민(7.5ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응을 TLC(클로로폼/메탄올/HOAc 90:8:2)에 의해 모니터링하였다. 출발 물질의 소비(30분) 후, 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 40ml의 신선한 DMF와 함께 공증발시켜 미량의 다이에틸 아민을 제거하였다. 조질 생성물을 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
MS (ESI+) [MH]+ 실측치: 393.26; 계산치: 393.25 (C20H33N4O4)
[M+Na]+ 실측치: 415.35; 계산치: 415.23 (C20H32N4NaO4)
[2M+H]+ 실측치: 785.37; 계산치: 785.49 (C40H65N8O8)
단계 5: BMP-Val-Ala-PAB-NHBoc(HDP 30.2108)
Figure pct00025
조질의 단계 4의 생성물 HDP 30.1747(최대 2.00mmol)을 DMF 40ml에 용해시키고, 3-(말레이미도)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터(BMPS 532mg, 1.0eq.) 및 N-에틸다이아이소프로필아민(510μl, 1.5eq.)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 출발 물질의 소비 후(HDP 30.1747(TLC: 클로로폼/메탄올/HOAc 90:8:2), 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 미세 현탁액이 형성될 때까지(1시간) MTBE 50ml와 함께 교반하였다. 침전물을 흡입으로 여과 분별하고, MTBE로 세정하고, 건조하였다. 조질 생성물(1.10g)을 20ml의 다이클로로메테인/메탄올(1:1)에 용해시키고, 규조토(15g)를 첨가하고, 용매를 스트리핑 제거하였다. 고체 물질을 80g 실리카 겔 컬럼의 정부에 놓고, 다이클로로메테인 중 0-10% 메탄올의 선형 구배로 용출시켰다. 생성물 분획을 합치고 증발시켜 비결정질 고체 793㎎(2 단계에 걸쳐 73%)을 얻었다.
MS (ESI+) [M+Na]+ 실측치: 566.24; 계산치: 566.26 (C27H37N5NaO7)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.29 - 7.23 (m, 1H), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.98 (s, 2H), 4.39 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 8.4, 6.7 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.67 - 3.56 (m, 2H), 2.49 - 2.41 (m, 2H), 1.96 (h, J = 6.8 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 170.80, 170.63, 170.60, 169.72, 155.65, 137.45, 134.94, 134.44, 127.26, 118.95, 77.62, 57.71, 48.92, 42.95, 33.96, 33.64, 30.17, 28.17, 19.02, 18.06, 17.82.
단계 6: BMP-Val-Ala-PAB-NH2 (HDP 30.2109)
Figure pct00026
단계 5의 생성물 HDP 30.2108(400mg, 736μmol)을 트라이플루오로아세트산 4,000μl에 용해시키고, 2분 동안 교반하였다. 이어서, 휘발성 물질을 실온에서 증발시키고, 잔류물을 톨루엔 4,000μl와 함께 2회 공증발시켰다. 잔류물을 5,000μl의 1,4-다이옥세인/물(4:1)에 용해시키고, 액체 질소 중에서 고화시키고, 동결 건조하였다: 410mg(정량적)의 무색 분말
MS (ESI+) [M+Na]+ 실측치: 415.35; 계산치: 466.21 (C22H29N5NaO5)
[2M+H]+ 실측치: 887.13; 계산치: 887.44 (C44H59N10O10)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (s, 1H), 8.13 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 - 7.60 (m, 2H), 7.41 - 7.34 (m, 2H), 6.98 (s, 2H), 4.39 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 8.2, 6.6 Hz, 1H), 3.97 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.69 - 3.58 (m, 2H), 2.49 - 2.40 (m, 2H), 1.96 (h, J = 6.8 Hz, 1H), 1.32 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 171.24, 170.78, 170.72, 169.85, 158.12 (q, J = 33.2 Hz, TFA), 158.25, 157.99, 157.73, 139.19, 134.53, 129.45, 128.52, 119.02, 116.57 (q, J = 296.7 Hz, TFA), 57.78, 49.08, 41.90, 34.00, 33.68, 30.21, 19.07, 18.16, 17.76.
단계 6: HDP 30.2115
Figure pct00027
HDP 30.2105(15.0mg, 16.5μmol)를 HDP 30.2109(25.2μmol, 1.5eq)의 0.1M 용액 429μl, 0.1M TBTU(25.2μmol, 1.5eq) 492μl 및 0.2M DIEA(49.1μmol, 3.0eq) 492μl로 실온에서 처리하였다. 반응을 RP-HPLC에 의해 모니터링하였다. 완료 후, 반응물을 100μl의 H2O로 켄칭하고, 15분 동안 교반하고, 분취용 RP-HPLC 상에 주입하였다.
수율: 12.2mg, 56%
질량 분석: 1313.2 [M+H]+, 1335.5 [M+Na]+
4. 합성 다이데옥시 전구체 HDP 2179의 합성
4.1 HDP 30.2179의 합성
Figure pct00028
4.2 HDP 30.2007의 합성
Figure pct00029
EP 15000 681.5에 따라 제조된 HDP 30.1960 770.0mg(1.96mmol), N-하이드록시프탈이미드 319.2mg(1.96mmol) 및 트라이페닐포스핀 513.3(1.96mmol)을 40ml의 건조 테트라하이드로퓨란에 용해시켰다. 아르곤하에, 톨루엔(40%) 중의 에틸 다이아조카복실레이트 용액 889.2μl(1.96mmol)를 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 증발 건조하였다. 고체 잔류물을 용리액으로서 CHCl3으로부터 CHCl3/MeOH(30/1)의 구배로 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하였다. 조질의 HDP 30.2007을 황색 고체로서 얻었다. 조질 생성물을 용리제로서 n-헥세인으로부터 n-헥세인/에틸 아세테이트/메탄올(10/10/1)의 구배로 실리카 겔 컬럼 상에서 추가로 정제하였다. HDP 30.2007을 백색 고체로서 얻었다. 수율: 270.0mg(22%).
MS (ESI+) 실측치: 561.14 [M+Na]+; 계산치: 561.24 (C28H34N4NaO7)
MS (ESI+) 실측치: 1099.70 2 [M+Na]+; 계산치: 1099.48 (C56H68N8NaO14)
4.3 HDP 30.2011의 합성
Figure pct00030
HDP 30.2007 270.0mg(0.50mmol)을 다이클로로메테인 16ml에 현탁시켰다. 아르곤하에, 하이드라진 수화물 50.3μl(1.04mmol)를 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 및 실온하에 24시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 고체를 다이클로로메테인으로 세정하였다. 여액을 증발시키고, 잔류물을 고진공하에 건조하였다. HDP 30.2011을 백색 고체로서 얻고, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 수율: 199.0mg(97%).
MS (ESI+) 실측치: 431.50 [M+Na]+; 계산치: 431.24 (C20H32N4NaO5)
4.4 HDP 30.2177의 합성
Figure pct00031
HDP 30.2105 20.59mg(23.17μmol)을 건조 다이메틸폼아마이드(DMF) 1,200ml에 용해시켰다. 용액을 아르곤으로 퍼징하고, 무수 다이메틸폼아마이드(DMF)에 용해된 HDP 30.2011 18.85mg(46.10μmol), 무수 다이메틸폼아마이드(DMF) 450ml에 용해된 PyBOP(벤조트라이아졸-1-일-옥시트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 24.05mg(46.10μmol) 및 DMF 중의 N-에틸-다이아이소프로필아민(DIPEA) 용액 86.20μl(82.30mmol)(DMF 500μl에 용해된 DIPEA 100μl)로 처리하였다. 반응 혼합물을 아르곤하에 실온에서 교반하였다. 5시간 후, 반응 용량을 차가운 메틸-t-뷰틸 에터(MTBE)로 희석하였다. 백색 침전물을 원심분리하고, 차가운 MTBE로 세정하였다. 조질 고체를 95% H2O/5% MeOH로부터 95% MeOH/5% H2O의 구배 및 15ml/분의 유속으로 RP18 HPLC(LunaTM 10μ, 250x21mm, Phenomenex®, 290nm)에 의해 정제하였다. 17.5분에 생성물 분획을 수집하고, 증발시키고, 수중에서 동결 건조하여 13.84mg(47%)의 HDP 30.2177을 백색의 비결정질 고체로서 얻었다.
MS (ESI+) 실측치: 1278.45 [MH]+; 계산치: 1277.58 (C59H83N13O17S)
MS (ESI+) 실측치: 1300.84 [M+Na]+; 계산치: 1300.58 (C59H83N13NaO17S)
4.5 HDP 30.2179의 합성
Figure pct00032
HDP 30.2177 13.84mg(10.82μmol)을 트라이플루오로아세트산(TFA) 2,000μl에 용해시키고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 과잉의 TFA를 33℃의 수욕 온도에서 회전 증발기로 제거하고, 잔류물을 메탄올 5ml로 처리하고, 증발 건조하였다. 유상 잔류물을 고진공하에서 건조하여 백색 고체를 형성하였다. 상기 고체를 건조 다이메틸폼아마이드(DMF) 1,700μl에 용해시키고, N-선신이미딜-3-말레이미도프로피오네이트(BMPS) 5.77mg(21.67μmol)으로 처리하였다. 75.40μl의 DIPEA 용액(건조 DMF 450μl 에 용해된 DIPEA 50μl)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤하에서 5시간 동안 교반하고, 차가운 MTBE 20ml로 처리하였다. 침전물을 원심분리하고, 차가운 MTBE로 세정하고, 건조하였다. 조질 생성물을 95% H2O/5% MeOH로부터 95% MeOH/5% H2O의 구배 및 15ml/분의 유속으로 RP18 HPLC(LunaTM 10μ, 250×21mm, Phenomenex®, 290nm)에 의해 정제하였다. 14.5분에 생성물 분획을 수집하고, 증발시키고, 수중에서 동결 건조하여 7.40mg(51%)의 HDP 30.2179를 백색의 비결정질 고체로서 얻었다.
MS (ESI+) 실측치: 1351.50 [M+Na]+; 계산치: 1351.55 (C61H80N14NaO18S)
또한, 아미노산 1에서 카복사마이드기 대신에 -CO-NHOH기를 포함하는 대안적인 다이데옥시 전구체 분자를, 예를 들면 표준적인 응축 조건(PyBOP, DCC, 혼합 무수물 등)에서 카복실레이트 전구체 HDP 30.2105를 O-벤질 하이드록실아민과 반응시킴으로써 합성할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 HDP 30.2105의 O-벤질 하이드록삼산 유도체의 벤질기는 촉매적 수소화 분해 조건(Pd/H2)에서 쉽게 제거될 수 있어, 유리 -CO-NHOH기를 형성한다. 그 후, 이 산성 하이드록사믹 작용기는 상이한 할로젠화 또는 O-토실레이트화된 알킬-링커 빌딩 블록을 갖는 -CO-NHOR로 알킬화할 수 있다. 이 알킬화는 LiOH, NaOH, KO-t-Bu 또는 다른 적합한 염기를 이용한 염기성 조건에서 수행한다.
5. 합성 다이데옥시 전구체 HDP 30.2191의 합성
Figure pct00033
안정한 링커를 갖는 싸이올 반응성 기를 포함하는 다이데옥시 전구체 분자는 하기와 같이 실시예 2의 생성물로부터 합성할 수 있다:
실시예 2의 생성물(HDP 30.2105) 11.00mg(12.39μmol)을 123.9μl의 건조 DMF에 용해시켰다. 이어서, DMF(123.9μl, 각각 10eq.) 중 N-하이드록시선신이미드 및 다이아이소프로필카보다이이미드의 1M 용액을 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, DMF 중 N-(2-아미노에틸)말레이미드 트라이플루오로아세테이트 염의 1M 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 0℃에서 10ml의 MTBE에 적가하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 추가 10ml의 MTBE로 세정하였다. 잔류물을 5-100% 메탄올의 구배로 C18 컬럼 상의 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 증발시키고, t-뷰탄올/물로부터 동결 건조하여 9.27mg(54%)의 표제 화합물을 무색 분말로서 얻었다
MS (ESI+) [MH]+ 실측치: 1010.3; 계산치: 1010.4 (C45H60N11O14S)
[M+Na]+ 실측치: 1032.5; 계산치: 1032.39 (C45H59N11NaO14S)
6. 합성 다이데옥시 전구체 HDP 30.2157의 합성
환원 가능한 링커를 갖는 싸이올 반응성 기를 포함하는 다이데옥시 전구체 분자는 하기와 같이 실시예 2의 생성물로부터 합성할 수 있다:
단계 1:
Figure pct00034
실시예 2의 생성물(HDP 30.2105) 11.36mg(12.97μmol)을 512μl의 건조 DMF에 용해시켰다. 이어서, DMF(512μl, 4eq.) 및 DIPEA 8.70μl(4eq.) 중 PyBOP의 0.1M 용액을 첨가하였다. 1분 후, 다이클로로메테인 중 3-[(트라이페닐메틸)설판일]프로판-1-아민의 0.1M 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가 3.5시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 0℃에서 10ml의 MTBE에 적가하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 추가 10ml의 MTBE로 세정하였다. 잔류물을 5-100% 메탄올의 구배로 C18 컬럼 상의 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 증발시키고, t-뷰탄올/물 4:1로부터 동결 건조하여 9.52mg(62%)의 생성물을 비결정질 고체로서 얻었다.
MS (ESI+) [M+Na]+ 실측치: 1225.30; 계산치: 1225.48 (C61H74N10NaO12S2)
단계 2:
Figure pct00035
단계 1의 생성물(9.52mg, 7.91μmol)에 트라이플루오로아세트산 중 2,2'-다이싸이오비스(5-나이트로피리딘), DTNP(79,1μl, 5eq.)의 0.5M 용액을 첨가하였다. 4분 후, 반응 혼합물을 0℃에서 10ml의 MTBE에서 침전시켰다. 생성된 고체를 원심분리에 의해 수집하고, 추가 10ml의 MTBE로 세정하였다. 조질 생성물을 0.05 TFA를 갖는 5-100% 메탄올의 구배로 C18 컬럼 상의 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발시키고, 잔류물을 2ml의 t-뷰탄올/물 4:1로부터 동결 건조하여 7.48mg(85%)의 HDP 30.2157을 담황색 분말로서 얻었다.
MS (ESI+) 1146.97 [M+H]+, 1169.17 [M+Na]+
7. 콘주게이트 chiBCE19-D265C-30.2115의 합성
10mg chiBCE19-D265C에의 HDP 30.2115의 콘주게이션
PBS 완충액 중의 10mg Thiomab chiBCE19-D265C를 HDP 30.2115에의 콘주게이션에 사용한다.
항체 용액을 1mM EDTA로 조정한다:
2ml 항체 용액(10.0mg) + 20μl 100mM EDTA, pH 8.0
항체량: 10mg = 6.8 x 10-8mol
항체와 40eq. TCEP의 반응에 의한 시스테인의 탈캡핑:
- 2ml 항체 용액(6.8x10-8mol) + 54.5μl 50mM TCEP 용액(2.72 x 10-6mol)
- 진탕기 상에서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이트한다.
- 슬라이드-A-라이저 투석 카세트(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 20'000 MWCO에서 2.0l 1x PBS, 1mM EDTA, pH 7.4에서 4℃에서 2회 연속 투석. 1회째의 투석은 약 4시간, 2회째의 투석은 밤새
- 아미콘 울트라 원심분리 필터(Amicon Ultra Centrifugal Filters) 50'000 MWCO를 사용하여 약 4.0ml로 농축한다.
항체와 20eq. 데하이드로아스코브산(dhAA)의 반응에 의한 산화:
- 약 2ml 항체 용액(6.8 x 10-8mol + 27.2μl의 신선한 50mM dhAA 용액(1.36 x 10-6 mol)
- 진탕기 상에서 실온에서 3시간 동안 인큐베이트한다.
6eq. HDP 30.2115를 사용한 아마니틴과의 콘주게이션 및 25eq. N-아세틸-L-시스테인에 의한 켄칭:
70μl DMSO에서 0.7mg HDP 30.2115를 가용화시킴 = 10μg/μl
- 약 2ml 항체 용액(= 9.5mg; 6.46 x 10-8mol) + 50.9μl HDP 30.2115(=509μg; 3.88 x 10-7mol).
- 실온에서 1시간 동안 인큐베이트한다.
- 16μl 100mM N-아세틸-L-시스테인(1.62 x 10-6mol)을 첨가하여 켄칭한다.
- 실온에서 15분(또는 4℃에서 밤새) 인큐베이트한다.
- 1 x PBS, pH 7.4로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 각 반응 혼합물을 정제한다. 파라필름 상의 브래드포드(Bradford) 시약으로 단백질 함유 분획을 동정하고, 단백질 함유 분획을 합친다.
- 각 항체 용액을 2.0l PBS, pH 7.4 및 슬라이드-A-라이저 투석 카세트 20'000 MWCO에서 4℃에서 밤새 투석한다.
동일한 단백질 농도로 조정된 네이키드(naked) 항체 vs. ADC를 사용한 UV-스펙트럼(280nm 및 310nm에서의 흡수)에 의한 단백질 농도 및 약물-항체 비(DAR)의 측정.
단백질 농도를 5.0mg/ml(3.4 x 10-5M)로 조정하고, 여과에 의해 멸균 상태로 한다. 4℃에서 보존한다.
8. 콘주게이트 chiBCE19-D265C-30.2179의 합성
10mg chiBCE19-D265C에의 HDP 30.2179의 콘주게이션
PBS 완충액 중의 Thiomab chiBCE19-D265C 10mg을 HDP 30.2179에의 콘주게이션에 사용한다.
항체 용액을 1mM EDTA로 조정한다:
2ml 항체 용액(10.0mg) + 20μl 100mM EDTA, pH 8.0
항체량: 10mg = 6.8 x 10-8mol
항체와 40eq. TCEP의 반응에 의한 시스테인의 탈캡핑:
- 2ml 항체 용액(6.8 x 10-8mol) + 54.5μl 50mM TCEP 용액(2.72 x 10-6mol)
- 진탕기 상에서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이트한다.
- 슬라이드-A-라이저 투석 카세트 20'000 MWCO에서 2.0l 1x PBS, 1mM EDTA, pH 7.4에서 4℃에서 2회 연속 투석. 1회째의 투석은 약 4시간, 2회째의 투석은 밤새
- 아미콘 울트라 원심분리 필터 50'000 MWCO를 사용하여 약 4.0ml로 농축한다.
항체와 20eq. 데하이드로아스코브산(dhAA)의 반응에 의한 산화:
- 약 2ml 항체 용액(6.8 x 10-8mol) + 27.2μl의 신선한 50mM dhAA 용액(1.36 x 10-6mol)
- 진탕기 상에서 실온에서 3시간 동안 인큐베이트한다.
6eq. HDP 30.2179를 사용한 아마니틴과의 콘주게이션 및 25eq. N-아세틸-L-시스테인에 의한 켄칭:
70μl DMSO에서 0.7mg의 HDP 30.2179를 가용화시킴 = 10μg/μl
- 약 2ml 항체 용액(= 9.5mg; 6.46 x 10-8mol) + 51.5μl HDP 30.2179(=515μg; 3.88 x 10-7mol).
- 실온에서 1시간 동안 인큐베이트한다.
- 16μl 100mM N-아세틸-L-시스테인(1.62 x 10-6mol)을 첨가하여 켄칭한다.
- 실온에서 15분(또는 4℃에서 밤새) 인큐베이트한다.
- 1x PBS, pH 7.4로 평형화된 PD-10 컬럼으로 각 반응 혼합물을 정제한다 단백질 함유 분힉을 파라필름 상에서 브래드포드 시약으로 동정하고, 단백질 함유 분획물을 합친다.
- 각 항체 용액을 2.0l PBS, pH 7.4 및 슬라이드-A-라이저 투석 카세트 20'000 MWCO에서 4℃에서 밤새 투석한다.
동일한 단백질 농도로 조정된 네이키드 항체 vs. ADC를 사용한 UV-스펙트럼(280nm 및 310nm에서의 흡수)에 의한 단백질 농도 및 약물-항체 비(DAR)의 측정.
단백질 농도를 5.0mg/ml(3.4 x 10-5M)로 조정하고, 여과에 의해 멸균 상태로 한다. 4℃에서 보존한다.
9. 30mg DIG-D265C에의 HDP 30.2115의 콘주게이션
5.0mg/ml로 PBS 중에서 시스테인 조작된 항체 30mg을 HDP 30.2115에의 콘주게이션에 사용한다.
- 항체 용액을 1mM EDTA로 조정한다:
- 6ml 항체 용액(30mg) + 60μl 100mM EDTA, pH 8.0
항체량: 2.05 x 10-7mol
항체와 40eq. TCEP의 반응에 의한 시스테인의 탈캡핑:
- 항체 용액 6ml(2.05 x 10-7mol) + 164μl 50mM TCEP 용액(8.21 x 10-6mol)
- 37℃에서 3시간 동안 인큐베이트한다.
- 슬라이드-A-라이저 투석 카세트 20'000 MWCO에서 2.0l 1x PBS, 1mM EDTA, pH 7.4에서 4℃에서 2회 연속 투석에 의해 TCEP로부터 각 항체 용액을 정제한다. 1회째의 투석은 약 4시간, 2회째의 투석은 밤새.
항체와 20eq. 데하이드로아스코브산(dhAA)의 반응에 의한 산화:
- 약 6ml 항체 용액(2.05 x 10-7mol) + 82μl의 신선한 50mM dhAA 용액(4.1 x 10-6mol)
- 실온에서 3시간 동안 인큐베이트한다.
6eq. HDP 30.2115를 사용한 아마니틴과의 콘주게이션 및 25eq. N-아세틸-L-시스테인에 의한 켄칭:
200μl DMSO에서 2.0mg HDP 30.2115를 가용화시킴 = 10μg/μl
- 약 6ml 항체 용액(= 약 29mg, 1.98 x 10-7mol) + 156μl HDP 30.2115(=1563μg, 1.19 x 10-6mol).
- 실온에서 1시간 인큐베이트한다.
- 49.6μl 100mM N-아세틸-L-시스테인(4.96 x 10-6mol)을 첨가하여 켄칭한다.
- 실온에서 15분(또는 4℃에서 밤새) 인큐베이트한다.
- 약 3분 동안 전속으로 원심분리하고, 상청액을 취하고, 분취용 FPLC를 위해 체적을 정확히 측정한다.
- 1x PBS, pH 7.4(1.0ml/min)로 평형화된, HiLoad 16/600-Superdex 200 pg 및 평형화 XK-16 컬럼을 사용하여 분취용 FPLC(
Figure pct00036
)에 의해 각 반응 혼합물을 정제한다. 280nm에서의 자외선 흡수로 분획을 수집한다.
- 항체 용액을 1 x 3.0l PBS, pH 7.4 및 슬라이드-A-라이저 투석 카세트 20'000 MWCO에서 4℃에서 밤새 투석한다.
동일한 단백질 농도로 조정된 네이키드 항체 vs. ADC를 사용한 단백질 농도의 측정.
단백질 농도를 5.0mg/ml(= 3.42 x 10-5M)로 조정하고, 여과에 의해 멸균 상태로 한다. 4℃에서 보존한다.

Claims (7)

  1. (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 표적 결합 부분; 및 (c) 상기 아마톡신과 상기 표적 결합 부분을 연결하는 절단 가능한 링커를 포함하는 콘주게이트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    구조 I을 갖는 콘주게이트.
    Figure pct00037

    여기에서:
    R2는 S이고;
    R3은 -NHR5, -NH-OR5, 및 -OR5로부터 선택되고;
    R4는 H이며;
    이때 R5 중 하나는 -Ln-X(여기에서, L은 절단 가능한 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, X는 표적 결합 부분임)이고, 나머지 R5는 H이다.
  3. (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; (b) 표적 결합 부분; 및 (c) 임의로, 상기 아마톡신과 상기 표적 결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 콘주게이트.
  4. 제 3 항에 있어서,
    구조 I을 갖는 콘주게이트.
    Figure pct00038

    여기에서:
    R2는 S이고;
    R3은 -NHR5, -NH-OR5, 및 -OR5로부터 선택되고;
    R4는 H이며;
    이때 R5 중 하나는 -Ln-X(여기에서, L은 링커이고, n은 0 및 1로부터 선택되고, X는 표적 결합 부분임)이고, 나머지 R5는 H이다.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 콘주게이트를 포함하는 약학 조성물.
  6. 환자의 암의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 콘주게이트로서, 특히 상기 암은 유방암, 췌장암, 담관암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병, 및 악성 림프종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 콘주게이트.
  7. (a) (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4; 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신; 및 (c) 상기 아마톡신을 표적 결합 부분에 연결하기 위한 반응성 기 Y를 가지는 절단 가능한 링커 부분을 포함하는 구성체.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017219025A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cells
AU2017380099A1 (en) 2016-12-23 2019-06-13 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amanitin antibody conjugates
IL268058B2 (en) 2017-01-20 2023-09-01 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for depleting cd137 plus cells
WO2019034175A1 (zh) * 2017-08-18 2019-02-21 四川百利药业有限责任公司 一种非天然鹅膏毒肽类抗体偶联物
KR20190043031A (ko) * 2017-10-17 2019-04-25 한국화학연구원 아마톡신 유도체 및 이의 제조방법
EP3703676A4 (en) * 2017-11-04 2021-12-15 Advanced Proteome Therapeutics, Inc. COMPOSITION AND PROCESS FOR MODIFYING POLYPEPTIDES
CN111867621A (zh) * 2018-01-18 2020-10-30 美真达治疗公司 用于耗尽cd134+细胞的组合物和方法
JP2021521202A (ja) * 2018-04-13 2021-08-26 ハイデルベルク ファルマ リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 固形腫瘍の治療のための標的化されたアマトキシン複合体
CA3101943A1 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Magenta Therapeutics, Inc. Therapeutic methods using antibody drug conjugates (adcs)
AU2019312200A1 (en) * 2018-07-23 2021-02-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Use of anti-CD137 antibody drug conjugate (ADC) in allogeneic cell therapy
WO2020127968A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Marino Stephen F Protein-drug conjugate comprising a monomeric form of proteinase 3
AU2020263959A1 (en) 2019-04-24 2021-11-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
KR20220011640A (ko) 2019-05-23 2022-01-28 하이델베르크 파마 리서치 게엠베하 절단 가능한 링커를 가진 항체 약물 접합체
EP3792250A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-17 Pure Bioorganics SIA Synthesis of alpha-amanitin and its derivatives
WO2021004973A1 (en) * 2019-07-05 2021-01-14 Pure Bioorganics Sia Synthesis of a-amanitin and its derivatives
AR120218A1 (es) * 2019-10-15 2022-02-02 Heidelberg Pharma Res Gmbh Conjugados de amatoxina y anticuerpo específico de linfocitos b
JP2023529455A (ja) * 2020-06-09 2023-07-10 ハイデルベルク ファルマ リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング チオエーテル含有ペプチドの合成方法
EP4240424A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Heidelberg Pharma Research GmbH Composition comprising a combination of immune checkpoint inhibitor and antibody-amatoxin conjugate for use in cancer therapy
CN116615219A (zh) * 2020-12-22 2023-08-18 中外制药株式会社 包括利用混合溶剂的冷冻干燥工序的药品的制造方法
CA3208117A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Torsten HECHLER B-lymphocyte specific amatoxin antibody conjugates
US20240165257A1 (en) 2022-11-01 2024-05-23 Heidelberg Pharma Research Gmbh Anti-gucy2c antibody and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014043403A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-20 Agensys, Inc. Amatoxin derivatives and cell-permeable conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US6613879B1 (en) 1999-05-14 2003-09-02 Boehringer Ingelheim Pharma Kg FAP-activated anti-tumour compounds
ES2371085T3 (es) 2006-05-27 2011-12-27 Faulstich, Heinz, Dr. Utilización de conjugados de amatoxinas o falotoxinas con macromoléculas para la terapia tumoral y de la inflamación.
CL2009000505A1 (es) 2008-03-05 2010-01-15 Biocryst Pharm Inc Compuestos derivados de triciclos nitrogenados, inhibodores de polimerasas de adn y arn virales; composicion farmaceutica que los comprende; y uso en el tratamiento de infecciones virales y cancer.
TW200942243A (en) 2008-03-05 2009-10-16 Biocryst Pharm Inc Antiviral therapeutic agents
KR20110140124A (ko) 2009-04-08 2011-12-30 하인즈 파울스티히 암치료용 아미톡신-활성 표적 결합 부위
EP3485912A1 (en) 2009-04-08 2019-05-22 Faulstich, Heinz, Dr. Amatoxin-armed therapeutic cell surface binding components designed for tumour therapy
BR112012003089A2 (pt) 2009-08-10 2016-08-16 Ucl Business Plc ligação covalente reversível de moléculas funcionais
US20110256157A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
ES2402254T3 (es) 2010-09-30 2013-04-30 Heidelberg Pharma Ag Conjugados de amatoxinas con ligadores mejorados
EP2497499A1 (en) 2011-03-10 2012-09-12 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin-conjugates with improved linkages
JP6321633B2 (ja) 2012-06-04 2018-05-09 ノバルティス アーゲー 部位特異的標識法およびそれによって生成される分子
EP2684865A1 (en) 2012-07-13 2014-01-15 Heidelberg Pharma GmbH Methods for synthesizing amatoxin building block and amatoxins
MA37975B2 (fr) 2012-09-11 2021-03-31 Genzyme Corp Inhibiteurs de synthase de glucosylcéramide
HRP20230623T1 (hr) 2012-09-12 2023-09-29 Genzyme Corporation Polipeptidi koji sadrže fc domenu s promijenjenom glikozilacijom i smanjenom efektorskom funkcijom
CN105377304B (zh) * 2014-03-10 2018-05-15 海德堡医药有限责任公司 鹅膏毒肽衍生物
US10842882B2 (en) * 2015-03-09 2020-11-24 Heidelberg Pharma Gmbh Amatoxin-antibody conjugates
US11166912B2 (en) 2016-03-03 2021-11-09 Ctt Pharma Inc. Orally administrable composition

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014043403A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-20 Agensys, Inc. Amatoxin derivatives and cell-permeable conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase

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