KR20180111454A - 야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 토마토 삽입-결실 마커 프라이머 세트 - Google Patents

야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 토마토 삽입-결실 마커 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 토마토 삽입-결실 마커 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 야생종 토마토인 솔라눔 핌피넬리포리움(S. pimpinellifolium)과 재배종 토마토인 솔라눔 리코퍼시쿰(S. lycopersicum)의 유전자 염기서열을 비교하여 12개의 토마토 염색체 각각에서 5개의 삽입-결실(Indel) 부위를 선별하였고, 상기 Indel 부위를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 야생종 토마토 솔라눔 핌피넬리포리움과 2종의 재배종 토마토(솔라눔 리코퍼시쿰 및 마이크로-톰(Micro-Tom))을 판별할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 토카토 삽입-결실 마커 프라이머 세트를 야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 프라이머 세트로 이용할 수 있다.

Description

야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 토마토 삽입-결실 마커 프라이머 세트{Primer set of tomato InDel marker for detection of wild-type tomato and cultivated-type tomato}
본 발명은 야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 토마토 삽입-결실(Indel) 마커 프라이머 세트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 야생종 토마토 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)과 2종의 재배종 토마토(솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum ) 및 마이크로-톰(Micro-Tom))를 판별하기 위한 Indel 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
농산물 시장 개방에 따라 어려움에 처해 있는 국내 농업의 발전과 식량안보 주권을 확립하기 위해서는 고품질 품종개발을 통한 종자산업 육성이 필요하다. 특히, 외국 도입 품종에 의존하고 있는 화훼, 관상, 과수, 기능성 특약용 작물 및 버섯 등 균류의 국산 품종개발 활용이 시급한 실정이다. 세계적인 환경파괴에 따른 생물 다양성의 감소와 국제식물신품종보호동맹 (UPOV) 가입에 따른 품종 로열티 강화 추세에 따라 국산 종자 및 유전자원 지적재산권 확보 필요성이 증대되고 있다. 주요 식물의 유전자 염기서열이 밝혀짐에 따라 유전자의 기능을 밝히는 기능유전체(functional genomics) 연구 소재용의 돌연변이 유전자원의 수요가 급속도로 증가하고 있어, 방사선 등을 이용한 돌연변이 육종기술로 대량의 유용 변이체의 창출과 공급이 필요한 상황이다.
농산물 시장에서 토마토는 전세계적으로 경제적으로 가장 중요한 작물 중 하나로, 원예작물 중 생산량과 소비량이 1위인 작물이며, 연간 146백만 톤이 생산되고 있다(FAO 2010). 토마토(Solanum lycopersicum L.)는 2배체(2n=24) 작물로 가지과(Solanaceae family)에 속한다. 가지과는 약 90개의 속(genus)을 가지며 종류가 다양하다(D`Arcy 1979). 일반적으로 재배되고 있는 S. lycopersicum과 야생종 S. cheesmaniae, S. chilense, S. habrochaites, S. chmielewskii, S. parviflorum, S. peruvianum, S. pimpinellifolium 등이 알려져 있다(Peralata 2000; Rick 1976). 이처럼 다양한 토마토 종류가 있으나, 재배종 토마토 및 야생종 토마토를 판별하기 위한 연구가 부족한 실정이다.
최근 분자유전학이 발달하면서 작물의 육종에 이용되는 품종이나 유전자원의 유전적 다양성과 그들간의 유연관계 분석이 유전 변이의 확대와 품종 육성 효율성 증대에 매우 효과적으로 이용되고 있다. 과거에는 형태적 및 생화학적 특성에 의하여 유전적 다양성을 평가하여 왔으나 이러한 평가방법은 유전적 특성이 가까운 근연종간에는 사용이 매우 제한적이며, 대상형질이 환경의 영향을 받기 때문에 다양성의 평가가 어려운 실정이다.
이에 따라, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Tag DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 또한, SSR (single sequence repeat) 방법은 DNA 반복배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있으나 고밀도 유전자 지도 제작에는 충분하지 않는 단점이 있다.
이에 반해 삽입-결실(insertion　or deletion: Indel) 마커를 이용한 방법은 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법으로 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하며 고밀도 유전자지도 제작도 가능하게 한다.
한편, 토마토 품종 판별을 위한 마커와 관련하여, 토마토의 SSR 마커가 미국(Broun and Tanksley. 1996), 네덜란드(Smulders et al. 1997), 독일(Areshchenkova and Ganal. 1999), 이스라엘(Suliman-pollatchek et al. 2002), 캐나다(He et al. 2003)에서 이미 개발되어 분자 육종 연구에 활용해 오고 있으며, 최근에 국제가지과 식물 유전체 컨소시엄이 조직되면서 608개 이상의 SSR 마커를 개발하여 그 결과를 공개하고 있다(Http://www.sgn.cornell.edu/). 특히 네덜란드에서는 20개의 SSR 마커를 이용하여 토마토 521 품종을 분석하여 이를 데이터베이스화한 바 있고(Bredemeijer et al. 2002), 영국에서는 토마토 품종보호 출원품종의 균일성 분석에 SSR 마커의 이용 가능성을 제시한 바 있으나(Cook et al. 2003), 이들 마커의 염기서열 자체는 공개되어 있지 않고 있는 실정이다. 우리나라의 경우 토마토의 조직배양이나 형질전환 기법에 대한 다양한 연구가 수행되어 왔으나(park et al. 2002), 분자표지인자를 이용한 품종식별에 대한 연구결과는 거의 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 토마토 품종을 구별하기 위해 효율적으로 이용될 수 있는 분자표지인자를 개발하기 위해 노력한 결과, 야생종 토마토인 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium LA1854)과 재배종 토마토인 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum cv Heinz 1706)의 유전자 염기서열을 비교하여 12개의 토마토 염색체 각각에서 5개의 삽입-결실(Indel) 부위를 선별하였고, 상기 Indel 부위를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 야생종 토마토 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)과 2종의 재배종 토마토(솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum cv M82) 및 마이크로-톰(Micro-Tom))을 판별할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 토마토 삽입-결실(Indel) 마커 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 토마토 삽입-결실(Indel) 마커 프라이머 세트를 이용하여 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토마토 삽입-결실(Indel) 마커 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 127 및 128로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 증폭한 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 삽입-결실(Indel) 마커 및 상기 마커를 증폭하는 프라이머를 이용하는 경우, 야생종 토마토 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)과 2종의 재배종 토마토(솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum) 및 마이크로-톰(Micro-Tom))의 판별이 가능하며, 특정 표현형의 원인이 되는 변이 유전자의 위치의 예측이 가능하다.
도 1은 12개의 토마토 염색체상에서 본 연구에 사용한 삽입-결실(Indel) 마커의 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 Indel 마커 프라이머를 이용한 야생종 토마토 솔라눔 핌피넬리포리움(S. pimpinellifolium) 및 재배종 토마토 솔라눔 리코퍼시쿰(S. lycopersicum cv M82)의 Indel 마커 증폭 결과를 나타낸 것으로, Indel 마커의 증폭에 주형(template)으로 사용한 게놈 DNA는 다음과 같다:
p: 야생종 토마토 S. pimpinellifolium의 게놈 DNA;
m: 야생종 토마토 S. pimpinellifolium의 게놈 DNA와 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82의 게놈 DNA 혼합물; 및
c: 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82의 게놈 DNA.
도 3은 Indel 마커 프라이머를 이용한 야생종 토마토 S. pimpinellifolium, 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82 및 재배종 토마토 마이크로-톰(Micro-Tom)의 Indel 마커 증폭 결과를 나타낸 것으로, Indel 마커의 증폭에 주형으로 사용한 게놈 DNA는 다음과 같다:
μ: 재배종 토마토 Micro-Tom의 게놈 DNA;
M8: 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82의 게놈 DNA; 및
p: 야생종 토마토 S. pimpinellifolium의 게놈 DNA.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 127 및 128로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 야생종 토마토는 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)이고, 상기 재배종 토마토는 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum) 또는 마이크로-톰(Micro-Tom)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 솔라눔 리코퍼시쿰을 판별하기 위하여, 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 125 및 126으로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 마이크로-톰을 판별하기 위하여, 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 본 발명의 상세한 설명의 표 1에 표시된 재배종 토마토 판별을 위한 삽입-결실(Indel) 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트에 해당한다.
본 발명에서 용어, "삽입-결실 마커" 또는 "Indel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기서열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 용어. "표준유전체"는 본 발명의 재배종 토마토 또는 변이된 왜성 토마토를 판별함에 있어 기준이 되는 야생종 토마토 유전체를 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서, 상기 프라이머 세트는, 표적 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 재배종 토마토 판별을 위한 삽입-결실(Indel) 마커의 증폭을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium (LA1584), S. pimpinellifolium (LA1584)) 및 재배종 토마토인 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum (cv Heinz 1706), S. lycopersicum (cv Heinz 1706))의 유전자 염기서열을 비교하여 12개의 토마토 염색체 각각에서 5개의 삽입-결실(Indel) 부위를 선별하고 표 1에 나타낸 바와 같이 상기 Indel 부위를 증폭하기 위한 64개의 프라이머 세트를 제작하였다.
또한, 상기 제작한 프라이머 세트 중 43개의 프라이머 세트를 이용하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82를 판별할 수 있음을 확인하였다(표 4).
또한, 상기 제작한 프라이머 세트 중 35개의 프라이머 세트를 이용하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 Micro-Tom을 판별할 수 있음을 확인하였다(표 5).
따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 재배종 토마토 S. lycopersicum, 및 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 재배종 토마토 Micro-Tom을 판별하기 위한 Indel 마커 프라이머 세트로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 127 및 128로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 증폭한 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 1)은 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계로, 상기 대상 시료는 품종을 판별하기 위한 토마토라면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 게놈 DNA의 추출은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 2)는 판별하고자 하는 토마토의 게놈 DNA에 대하여 상기 프라이머 세트를 사용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계로, 상기 "표적 서열"은 변이 영역에 특이적인 Indel 마커를 의미한다.
상기 단계 2)에서 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 적당한 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 야생종 토마토는 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)이고, 상기 재배종 토마토는 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum ) 또는 마이크로-톰(Micro-Tom)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 솔라눔 리코퍼시쿰을 판별하기 위하여, 상기 단계 2)에서 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 125 및 126으로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
또한, 상기 마이크로-톰을 판별하기 위하여, 상기 단계 2)에서 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 3)은 상기 증폭한 산물을 검출 및 분석하는 단계로, 상기 증폭한 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 127 및 128로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 야생종 토마토는 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)이고, 상기 재배종 토마토는 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum) 또는 마이크로-톰(Micro-Tom)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 솔라눔 리코퍼시쿰을 판별하기 위하여, 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 125 및 126으로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 마이크로-톰을 판별하기 위하여, 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 키트에는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 반응완충액을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 삽입-결실( Indel ) 마커 선별
본 발명의 마커 선별을 위하여, 야생종 토마토인 솔라눔 핌피넬리포리움 LA1584(Solanum pimpinellifolium LA1584, S. pimpinellifolium LA1584) 및 재배종 토마토인 솔라눔 리코퍼시쿰 cv Heinz 1706(Solanum lycopersicum cv Heinz 1706, S. lycopersicum cv Heinz 1706)의 유전자 염기서열을 비교하여 12개의 토마토 염색체 각각에서 5개의 삽입-결실(Indel) 부위를 선별하고 상기 Indel 부위를 증폭하기 위한 프라이머를 제작하였다.
구체적으로, 기존에 구축된 데이터베이스(https://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/tomato_150)로부터 제공되는 재배종 토마토와 야생종 토마토의 유전체 염기서열로서 S. lycopersicum cv Heinz 1706 유전체 염기서열과 S. pimpinellifolium LA1584 유전체 염기서열 비교정보상에 나타나는 Indel 위치정보(ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/tomato_150/)들을 이용하여 12개의 토마토 염색체에서 Indel 위치를 확인하였으며 데이터베이스상에서 유추되는 삽입 또는 결실 염기쌍의 길이를 크기별로 분류하였고, 염색체 위치별 Indel 사이즈가 25염기쌍 이상되는 것을 선별하였다. 그리고 Indel 위치 위아래 염기서열의 150염기쌍 이내에 프라이머를 제작하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 적절한 간격을 두고 각 염색체에서 5개의 Indel 마커를 선별하였다. 또한, 상기 선별한 Indel 마커 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 제작하여 하기 표 1에 나타내었다.
Chromo-
some
location		 Forward primer
(5'→3')
 서열번호 Reverse primer
(5'→3')
 서열번호 InDel
size (bp)
1번 염색체
1-16Mb CCTCTTTGTGACTCGTTATCCA 1 CCCGCAGACACAGTGATTAG 2 29 -
1-32Mb TGCAACATAGGGTTCTGCTG 3 TGATAGCAATGGCGTTCAAG 4 70 +
1-49Mb GAGTTCAAACTTCAATGGAGTC 5 CCCCGTAATTATGTGGTCGT 6 40 +
1-64Mb CGATAGCCATGAAAAAGCAA 7 TGAGGTGAAGGTCCAATGTG 8 35 -
1-82Mb GGCATTGAATGGTGACCCTA 9 TGCAAAACGGTCTAATCACG 10 34 -
2번 염색체
2-3Mb CAAGACAGACGGTCAGACGA 11 GTGTGTTGCCAAAGGGCTAT 12 53 +
2-15Mb GCTCCCATCAGAGATGCAAT 13 AGCTTCCATGCCTGGAGTTA 14 45 +
2-25Mb AACGACGTGTTCCAGTGTCA 15 CTTGGACGATGTCACCTGAC 16 48 +
2-33Mb TCAAACCCCGATTTGAGATT 17 GGTTAGGTATGGTCTTGGATCG 18 55 or 18 +
2-41Mb GATCCCACACGCATACACAC 19 TCAAAAGTCCCACATTGGTG 20 26 -
3번 염색체
3-11Mb CTGCTCACTTGGAGACCTGA 21 GAACCCTTCCAATGTGATGC 22 36 -
3-23Mb ATGACGCCATCCCTTCCTAT 23 GGGACGACCATGAGTTCAGA 24 33 -
3-35Mb TTTCCCCCTCTCCCTAGTGT 25 ATTCGCCAAGCTTGTTTTTG 26 34 -
3-47Mb TTTTTGAACCATGCCAAAGG 27 GGCATATCGACATTGGCTTT 28 35 +
3-58Mb AAAGCCTTTCACGACATTGA 29 CGAACAACCCCGAGAGTAAA 30 42 -
4번 염색체
4-7Mb TCAAAATAGGAATAAAGCTGATGA 31 CCTAACAACGATCGGTGAGG 32 58 -
4-23Mb TGACTACATGGTTTATGGAGACTTG 33 GAAAGGGAACGTTGATTCCA 34 40 -
4-31Mb AAGGCCCCGTTTAATTTTTG 35 CATGTTCCGATCATCCCACT 36 28 +
4-44Mb AATCCCCATGCAAGAAAAGA 37 AGGATTAGGCCATGGGATTT 38 66 -
4-56Mb GGAGCACGTGAGACTTTTGC 39 GCACTGCAGTTTTCTCTTGCT 40 69 -
5번 염색체
5-5Mb TGAGCTTCCTAGGACTTGAAGGGA 41 TCCATTTTCACATGCTACTCCAACA 42 80 -
5-24Mb CGAATCGCAATTGAGCCAAA 43 TGACGATCTTATATGCGGTAGGA 44 60 -
5-29Mb TTTGTTCAAGCAGCCAGATG 45 GACACAAGTAGCACTGCAAACA 46 33 +
5-35Mb TGCATGGAGGGTGTGTTCTTGTCC 47 TGAGCTATGAATGTTGAGGCT 48 78 +
5-47Mb AAACATTTGGGTACGACTCGCCA 49 GACATCCCAACCCACGCCCC 50 62 -
5-48Mb TGTTGGGCGGAATAACTCTT 51 CAAATAGGACTTATCTAGGGAC 52 50 +
5-61Mb TCAAGAGAACATTCTCCTCCGT 53 TTAGATGAGTTTGATGTGATCTTTT 54 85 -
6번 염색체
6-9Mb GAAAACGGGGTTAGCACTCA 55 TCATGGTTTCAAGTGTGTTGG 56 43 -
6-16Mb CCTTGGTTTCCTTGACCTTG 57 ACATGCGTGAGGAGAGGACT 58 32 +
6-26Mb CATTTCGGTAATCCATGCAA 59 TTGAACCAACCAATGCAAGA 60 44 -
6-33Mb ATATCCTTGGCCTGTGCATC 61 TCTTCAGTTTTTCCCCCAGA 62 67 +
6-41Mb CTATGTTGCTCGGGCTCTTC 63 CAGAAGTGCCAGAAGGGATT 64 66 +
7번 염색체
7-11Mb CGCTAAGACCAAAAGCATCC 65 GGCAACCAAAGGAGAACATC 66 31 -
7-22Mb TATTACCCCCGAAACAATCG 67 GGGAGGTCGAGTTGTGGTAA 68 64 +
7-34Mb TCCCTCCTTACCACTCGAAA 69 CCTTATGCTCGAGCTCTGCT 70 59 +
7-45Mb ATTCCCATCTGAGGCACTGT 71 ATGCACCGTGGAACTCTAGC 72 38 +
7-56Mb GGACCATTGTTGGACTTTGG 73 AAACAATAAAGCGCGACGAT 74 42 -
8번 염색체
8-10Mb AAGGCAAGGGCATTAAGAGG 75 GGCAAACTAAATCGCCAAGT 76 49 +
8-21Mb TCAAATGAAGAAGCGAGCAC 77 ATCGGCCTTCTTCAAAATCC 78 75 +
8-33Mb TCATTTAACCGAGCCTATGAG 79 TGGCTTTGCGAAGTGATTCT 80 47 +
8-42Mb GCAAAATGCAGAAGGAGCTA 81 GTCATGATCCGGGGAAACTA 82 49 -
8-55Mb TCACCAGTTCTCCCCTATCAA 83 TCATTCTCTATTGGCTCGAGATT 84 79 -
9번 염색체
9-7Mb AACTCCCGGACTTGGTCTCT 85 TTAATCATCCCCGGAATCAA 86 32 -
9-18Mb CTTCATCGTCATGAAACACACA 87 TTGTGAAAAATAGGGCCTCA 88 42 -
9-31Mb GGCTTTTTGTGGACTATTCTGA 89 TTGAATGTGTTTGGCCTAGGTA 90 59 +
9-41Mb TCAAAAATGTTAAAGACAAGCTTCA 91 CCCTCCTTCATGTTTAGGAAGA 92 30 +
9-57Mb GGGGTTTGGGCTAAAATCAT 93 ATGGAGATTTGGGAGGAGGT 94 26 +
10번 염색체
10-9Mb ACGACCTCACAGACTAAGAG 95 ACACAAGTGTGGGCGTCACA 96 32 +
10-19Mb CAGACAAAGGGTTCGCTTG 97 TCGGGAAGAGGAAAACTTGA 98 84 -
10-31Mb CTAAAGACACCATCCTCCCCT 99 GGTTGTCGAGATTGGGTGTT 100 34 -
10-39Mb GAGTCGTGGTGGAGGTCATT 101 AGTTTGGTGCCAAATCAAGG 102 18 or 25 +
10-49Mb CCAGCAGTTGAGGGAGTGA 103 GGTTGAAATGGCCAGACCTA 104 37 +
11번 염색체
11-1Mb TGGGTACTCTACCTTCCATTCAA 105 TCCGGCTGCCATGGAGCAAT 106 81 -
11-5Mb ACTTACGGTACTCTTTACGTAGT 107 TCATATGGCCCATTGCTCGT 108 72-
11-7Mb TATCACGAGCTCGGTTCAAA 109 GGTGGCACCTCTACAACCAT 110 55/22/19 -
11-15Mb TTGCACAGGCTAAGCATCAC 111 AGTTGGGGATCATGTGGTTG 112 38 +
11-22Mb TGAATTTGGTGCTTCGTTCA 113 CAGTTTTGCGCACATAGAGG 114 34 -
11-30Mb TGGGCGGATATACAAAAAGG 115 TGCACAAAATCGAGACCAAG 116 72 -
11-37Mb CCTTCGATCCTTGATCTCCA 117 TGAGACGCACTGTAGGAGCA 118 51 +
12번 염색체
12-14Mb CCCCCAGCTCATACATCTCTATC 119 TTTTTAGGAGGGTTATATGCACCTGT 120 41 +
12-25Mb CCCAACTTAACATACTTGATAGA 121 GTGTGCACTGGAAGTCCAAATA 122 29 -
12-35Mb CAAATCCTCAAAACTCGTTCG 123 TGTCGATGTTAATTGGTGCTC 124 32 -
12-46Mb GCGTCAAATATCAAATGTCCAC 125 ATCTACCGCATCGAATTTGC 126 77 -
12-54Mb TGGTGAATGGTTTTGATGATG 127 TGTACGTGCACTTCCTACGC 128 80 +
< 실시예 2> 삽입-결실( Indel ) 마커를 이용한 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 S. lycopersicum 판별
상기 <실시예 1>에서 선별한 Indel 마커를 이용하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 S. lycopersicum을 판별할 수 있는지 알아보기 위하여, 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 S. lycopersicum의 게놈 DNA(genomic DNA) 분리하고 상기 <실시예 1>에서 제조한 Indel 마커 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 유전형 분석(genotyping)을 위한 게놈 DNA 분리를 위하여, 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82 식물체의 어린잎 2~3장을 수확한 후 액체 질소를 처리하여 동결하고 분말화하였다. 상기 어린잎 분말에 700 ㎕의 마이크로프렙 버퍼(microprep buffer)를 첨가하고 65℃에 15분간 배양하면서 5분 간격으로 혼합하였다. 그 다음, 700 ㎕의 클로로포름:이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol = 24:1)을 첨가하고 1분간 혼합한 후 11,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 분리한 상측액에 약 60% 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 DNA가 응축될 때까지 혼합한 후, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 DNA 펠렛(pellet)를 획득하였다. 상기 획득한 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척 및 건조한 후, RNaseA가 50 mg/L 첨가된 1xTE 버퍼 50 ㎕를 첨가하고 37℃에서 120분간 두어 DNA 펠렛 내 포함된 RNA를 제거하여 야생종 토마토 및 재배종 토마토 DNA 각각을 획득하였다. 그 후, 증폭 반응에 주형(template)으로 사용하기 위하여 상기 야생종 토마토 및 재배종 토마토 DNA 각각의 농도를 측정하고 약 100 ng/㎕가 되도록 희석하였다.
그 다음, Indel 마커를 증폭하기 위하여 상기 획득한 야생종 토마토 DNA (p), 재배종 토마토 DNA (c), 및 상기 야생종 토마토 DNA 및 재배종 토마토 DNA를 1:1로 혼합한 혼합물 (m) 각각을 주형으로 하여 상기 <실시예 1>에서 제조한 Indel 마커 프라이머(표 1)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 위하여 하기 [표 2]에 기재된 반응물 조성으로 PCR 반응물을 구성하였고, 하기 [표 3]의 조건으로 PCR을 수행하여 증폭된 Indel 마커 산물을 획득하였다. 그 다음, 상기 증폭된 Indel 마커 산물은 2.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩하고, 100V에서 50-60분간 전기영동하여 증폭 밴드를 확인하였고, 상기 증폭 밴드를 비교하여 야생종 토마토와 구분되는 재배종 토마토의 Indel 마커를 확인하여 [표 4]에 나타내었다.
PCR 반응물 성분 함량(㎕)
template genomic DNA 1 (=100 ng)
10x PCR buffer 2
dNTP mix (2.5mM each) 1
Forward primer 1
Reverse primer 1
Taq polymerase 0.2
pure water 13.8
total 20
PCR 조건
95℃, 3분 1 cycle
95℃, 20초
35 cycle
58℃, 30초
72℃, 1분
72℃, 5분 1 cycle
보관 4-12℃
그 결과, 도 2 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 특정 Indel 마커 프라이머를 이용한 경우, 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 재배종 토마토 S. lycopersicum cv M82에서 각각 특이적인 밴드를 증폭하는 것을 확인하였다. 따라서, 표 4에 나타낸 본 발명의 특정 Indel 마커를 이용하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 재배종 토마토 S. lycopersicum의 구분이 가능함을 확인하였다.
Chromosome
location		 M82
구분 여부		 Chromosome
location		 M82
구분 여부
1번 염색체 7번 염색체
1-16Mb ○ 7-11Mb ○
1-32Mb ○ 7-22Mb ○
1-49Mb ○ 7-34Mb ○
1-64Mb ○ 7-45Mb ○
1-82Mb ○ 7-56Mb ○
2번 염색체 8번 염색체
2-3Mb × 8-10Mb ○
2-15Mb ○ 8-21Mb ○
2-25Mb ○ 8-33Mb ○
2-33Mb ○ 8-42Mb ○
2-41Mb × 8-55Mb ×
3번 염색체 9번 염색체
3-11Mb ○ 9-7Mb ○
3-23Mb ○ 9-18Mb ○
3-35Mb ○ 9-31Mb ×
3-47Mb ○ 9-41Mb ○
3-58Mb × 9-57Mb ○
4번 염색체 10번 염색체
4-7Mb ○ 10-9Mb ○
4-23Mb × 10-19Mb ○
4-31Mb × 10-31Mb ×
4-44Mb × 10-39Mb ○
4-56Mb ○ 10-49Mb ×
5번 염색체 11번 염색체
5-5Mb ○ 11-7Mb ×
5-24Mb ○ 11-15Mb ×
5-29Mb × 11-22Mb ×
5-48Mb × 11-30Mb ×
5-61Mb ○ 11-37Mb ×
6번 염색체 12번 염색체
6-9Mb ○ 12-14Mb ○
6-16Mb ○ 12-25Mb ○
6-26Mb ○ 12-35Mb ○
6-33Mb ○ 12-46Mb ○
6-41Mb ○ 12-54Mb ○
< 실시예 3> 삽입-결실( Indel ) 마커를 이용한 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 Micro-Tom 판별
Micro-Tom은 일반 토마토 육종과정에서 파생된 왜형토마토의 품종으로 줄기마디와 잎이 짧아서 좁은 공간과 실내에서 재배가 가능하며, 열매는 일반 방울토마토 크기이다. 특히, 이 품종은 왜성 크기의 장점으로 토마토 유전연구 및 돌연변이 육종에 많이 쓰이고 있으며, 최근에서는 관상용 토마토의 소재로 많이 쓰이고 있다. 이에, 상기 <실시예 1>에서 선별한 Indel 마커를 이용하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 Micro-Tom를 판별할 수 있는지 알아보기 위하여, 야생종 토마토 S. pimpinellifolium 및 재배종 토마토 Micro-Tom의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하고 상기 <실시예 1>에서 제조한 Indel 마커 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 유전형 분석(genotyping)을 위한 게놈 DNA 분리를 위하여, 재배종 토마토 Micro-Tom 식물체의 어린잎 2~3장을 수확한 후 액체 질소를 처리하여 동결하고 분말화하였다. 그 후, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 DNA를 획득하고 약 100 ng/㎕가 되도록 희석하였다.
그 다음, Indel 마커를 증폭하기 위하여 상기 획득한 Micro-Tom (μ), 상기 <실시예 2>에서 획득한 야생종 토마토 DNA (p), 및 상기 <실시예 2>에서 획득한 재배종 토마토 DNA (M8) 각각을 주형으로 하여 상기 <실시예 1>에서 제조한 Indel 마커 프라이머(표 1)를 이용하여 상기 <실시예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 다음, 증폭된 Indel 마커 산물은 2.5% 아가로오스 겔에 로딩하고, 100V에서 50-60분간 전기영동하여 증폭 밴드를 확인하였고, 상기 증폭 밴드를 비교하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 구분되는 재배종 토마토 Micro-Tom의 Indel 마커를 확인하여 [표 5]에 나타내었다.
그 결과, 도 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 특정 Indel 마커 프라이머를 이용한 경우, 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 재배종 토마토 Micro-Tom에서 각각 특이적인 밴드를 증폭하는 것을 확인하였다. 따라서, 표 5에 나타낸 본 발명의 특정 Indel 마커를 이용하여 야생종 토마토 S. pimpinellifolium와 재배종 토마토 Micro-Tom의 구분이 가능함을 확인하였다.
Chromosome
location		 Micro-Tom
구분 여부		 Chromosome
location		 Micro-Tom
구분 여부
1번 염색체 7번 염색체
1-16Mb ○ 7-11Mb ○
1-32Mb ○ 7-22Mb ○
1-49Mb ○ 7-34Mb ○
1-64Mb ○ 7-45Mb ○
1-82Mb ○ 7-56Mb ○
2번 염색체 8번 염색체
2-3Mb × 8-10Mb ○
2-15Mb × 8-21Mb ○
2-25Mb × 8-33Mb ○
2-33Mb ○ 8-42Mb ○
2-41Mb ○ 8-55Mb ×
3번 염색체 9번 염색체
3-11Mb × 9-7Mb ○
3-23Mb ○ 9-18Mb ○
3-35Mb ○ 9-31Mb ×
3-47Mb × 9-41Mb ○
3-58Mb ○ 9-57Mb ○
4번 염색체 10번 염색체
4-7Mb ○ 10-9Mb ○
4-23Mb × 10-19Mb ○
4-31Mb ○ 10-31Mb ×
4-44Mb ○ 10-39Mb ○
4-56Mb × 10-49Mb ×
5번 염색체 11번 염색체
5-5Mb ○ 11-7Mb ○
5-24Mb × 11-15Mb ○
5-29Mb × 11-22Mb ×
5-48Mb × 11-30Mb ×
5-61Mb × 11-37Mb ×
6번 염색체 12번 염색체
6-9Mb × 12-14Mb ×
6-16Mb × 12-25Mb ○
6-26Mb × 12-35Mb ×
6-33Mb × 12-46Mb ×
6-41Mb ○ 12-54Mb ○
<110> Industry-academic cooperation foundation wonkwang university <120> Primer set of tomato InDel marker for detection of wild-type tomato and cultivated-type tomato <130> PB2017-150 <150> KR 10-2017-0041779 <151> 2017-03-31 <160> 128 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-16Mb forward primer <400> 1 cctctttgtg actcgttatc ca 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-16Mb reverse primer <400> 2 cccgcagaca cagtgattag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-32Mb forward primer <400> 3 tgcaacatag ggttctgctg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-32Mb reverse primer <400> 4 tgatagcaat ggcgttcaag 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-49Mb forward primer <400> 5 gagttcaaac ttcaatggag tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-49Mb reverse primer <400> 6 ccccgtaatt atgtggtcgt 20 <210> 7 <211> 20 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3-23Mb forward primer <400> 23 atgacgccat cccttcctat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-23Mb reverse primer <400> 24 gggacgacca tgagttcaga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-35Mb forward primer <400> 25 tttccccctc tccctagtgt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-35Mb reverse primer <400> 26 attcgccaag cttgtttttg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-47Mb forward primer <400> 27 tttttgaacc atgccaaagg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-47Mb reverse primer <400> 28 ggcatatcga cattggcttt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-58Mb forward primer <400> 29 aaagcctttc acgacattga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-58Mb reverse primer <400> 30 cgaacaaccc cgagagtaaa 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-7Mb forward primer <400> 31 tcaaaatagg aataaagctg atga 24 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-7Mb reverse primer <400> 32 cctaacaacg atcggtgagg 20 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-23Mb forward primer <400> 33 tgactacatg gtttatggag acttg 25 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-23Mb reverse primer <400> 34 gaaagggaac gttgattcca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-31Mb forward primer <400> 35 aaggccccgt ttaatttttg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-31Mb reverse primer <400> 36 catgttccga tcatcccact 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-44Mb forward primer <400> 37 aatccccatg caagaaaaga 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-44Mb reverse primer <400> 38 aggattaggc catgggattt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-56Mb forward primer <400> 39 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7-45Mb reverse primer <400> 72 atgcaccgtg gaactctagc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7-56Mb forward primer <400> 73 ggaccattgt tggactttgg 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7-56Mb reverse primer <400> 74 aaacaataaa gcgcgacgat 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-10Mb forward primer <400> 75 aaggcaaggg cattaagagg 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-10Mb reverse primer <400> 76 ggcaaactaa atcgccaagt 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-21Mb forward primer <400> 77 tcaaatgaag aagcgagcac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-21Mb reverse primer <400> 78 atcggccttc ttcaaaatcc 20 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-33Mb forward primer <400> 79 tcatttaacc gagcctatga g 21 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-33Mb reverse primer <400> 80 tggctttgcg aagtgattct 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-42Mb forward primer <400> 81 gcaaaatgca gaaggagcta 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-42Mb reverse primer <400> 82 gtcatgatcc ggggaaacta 20 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-55Mb forward primer <400> 83 tcaccagttc tcccctatca a 21 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-55Mb reverse primer <400> 84 tcattctcta ttggctcgag att 23 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-7Mb forward primer <400> 85 aactcccgga cttggtctct 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-7Mb reverse primer <400> 86 ttaatcatcc ccggaatcaa 20 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-18Mb forward primer <400> 87 cttcatcgtc atgaaacaca ca 22 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-18Mb reverse primer <400> 88 ttgtgaaaaa tagggcctca 20 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-31Mb forward primer <400> 89 ggctttttgt ggactattct ga 22 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-31Mb reverse primer <400> 90 ttgaatgtgt ttggcctagg ta 22 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-41Mb forward primer <400> 91 tcaaaaatgt taaagacaag cttca 25 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-41Mb reverse primer <400> 92 ccctccttca tgtttaggaa ga 22 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-57Mb forward primer <400> 93 ggggtttggg ctaaaatcat 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-57Mb reverse primer <400> 94 atggagattt gggaggaggt 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-9Mb forward primer <400> 95 acgacctcac agactaagag 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-9Mb reverse primer <400> 96 acacaagtgt gggcgtcaca 20 <210> 97 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-19Mb forward primer <400> 97 cagacaaagg gttcgcttg 19 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-19Mb reverse primer <400> 98 tcgggaagag gaaaacttga 20 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-31Mb forward primer <400> 99 ctaaagacac catcctcccc t 21 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-31Mb reverse primer <400> 100 ggttgtcgag attgggtgtt 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-39Mb forward primer <400> 101 gagtcgtggt ggaggtcatt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-39Mb reverse primer <400> 102 agtttggtgc caaatcaagg 20 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-49Mb forward primer <400> 103 ccagcagttg agggagtga 19 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-49Mb reverse primer <400> 104 ggttgaaatg gccagaccta 20 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-1Mb forward primer <400> 105 tgggtactct accttccatt caa 23 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-1Mb reverse primer <400> 106 tccggctgcc atggagcaat 20 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-5Mb forward primer <400> 107 acttacggta ctctttacgt agt 23 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-5Mb reverse primer <400> 108 tcatatggcc cattgctcgt 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-7Mb forward primer <400> 109 tatcacgagc tcggttcaaa 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-7Mb reverse primer <400> 110 ggtggcacct ctacaaccat 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-15Mb forward primer <400> 111 ttgcacaggc taagcatcac 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-15Mb reverse primer <400> 112 agttggggat catgtggttg 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-22Mb forward primer <400> 113 tgaatttggt gcttcgttca 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-22Mb reverse primer <400> 114 cagttttgcg cacatagagg 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-30Mb forward primer <400> 115 tgggcggata tacaaaaagg 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-30Mb reverse primer <400> 116 tgcacaaaat cgagaccaag 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-37Mb forward primer <400> 117 ccttcgatcc ttgatctcca 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-37Mb reverse primer <400> 118 tgagacgcac tgtaggagca 20 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-14Mb forward primer <400> 119 cccccagctc atacatctct atc 23 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-14Mb reverse primer <400> 120 tttttaggag ggttatatgc acctgt 26 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-25Mb forward primer <400> 121 cccaacttaa catacttgat aga 23 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-25Mb reverse primer <400> 122 gtgtgcactg gaagtccaaa ta 22 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-35Mb forward primer <400> 123 caaatcctca aaactcgttc g 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-35Mb reverse primer <400> 124 tgtcgatgtt aattggtgct c 21 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-46Mb forward primer <400> 125 gcgtcaaata tcaaatgtcc ac 22 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-46Mb reverse primer <400> 126 atctaccgca tcgaatttgc 20 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-54Mb forward primer <400> 127 tggtgaatgg ttttgatgat g 21 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-54Mb reverse primer <400> 128 tgtacgtgca cttcctacgc 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 127 및 128로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 야생종 토마토는 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)이고, 상기 재배종 토마토는 솔라눔 리코퍼시쿰(Solanum lycopersicum) 및 마이크로-톰(Micro-Tom)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 솔라눔 리코퍼시쿰을 판별하기 위하여, 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 125 및 126으로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 마이크로-톰을 판별하기 위하여, 서열번호 19 및 20으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 107 및 108로 이루어진 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  5. 1) 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 증폭한 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 야생종 토마토는 솔라눔 핌피넬리포리움이고, 상기 재배종 토마토는 솔라눔 리코퍼시쿰 및 마이크로-톰으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 단계 2)에서 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하는 방법.
  8. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 키트에는 DNA 중합효소, dNTPs 및 반응완충액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 야생종 토마토와 재배종 토마토를 판별하기 위한 키트.
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