KR20180103088A - 분기 혼합기들 및 그 사용 및 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

원환체 혼합 엘리먼트들을 통해 분기된(bifurcated) 유체 흐름을 갖는 유체 혼합기가 개시된다. 혼합기는 딘 와류(Dean vortexing)에 의해 적어도 부분적으로 동작한다. 따라서, 혼합기는 딘 와류 분기 혼합기(Dean Vortex Bifurcating Mixers; DVBM)라고 한다. DVBM은 최적화된 마이크로유체 혼합의 목표를 달성하기 위해 혼합기들을 형성하는 유체 채널들의 딘 와류 및 비대칭 분기를 활용한다. 개시된 DVBM 혼합기는 두 개 이상의 유체들을 혼합하는 것이 소망되는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 공지된 임의의 유체(예를 들어, 마이크로유체) 장치에 통합될 수 있다. 개시된 혼합기들은 주사기들, 펌프들, 입구들, 출구들, 비-DVBM 혼합기들, 히터들, 분석기들(assays), 검출기 및 이와 유사한 것들을 포함하는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 공지된 임의의 유체 엘리먼트들과 결합될 수 있다.

Description

분기 혼합기들 및 그 사용 및 제조 방법
본 출원은 2016년 1월 6일자로 출원된 미국 특허 출원 제 62/275,630 호의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 여기에서 참조로 포함된다.
최근의 개발물들 산업적 관련 유속(예를 들어, 10 - 12 mL/분)에서 나노입자들을 제조하는데 사용되는 고성능 마이크로유체 혼합기들로 나타났다. 이러한 혼합기들은 약물 개발 시장에서 상당한 채택률을 보이지만, 현재 사용되는 혼합기들은 제조가 어렵고 특정한 성능 제한이 있다. 동시에, 훨씬 작은 체적들(대략 100 마이크로리터)로 동작할 수 있는 혼합기 시장이 있다. 체적 손실에 따라, 기존 혼합기들을 동작시키는 데 필요한 높은 유속은 이러한 어플리케이션에 적합하지 않다. 한 가지 해결책은 더 작은 단위를 갖는 SHM(Staggered Herringbone Mixer)와 같은 기존 기술들을 소형화하는 것이다. 하지만, 이러한 장치는 50μm 미만의 피쳐를 필요로 하고, 이는 사출 성형 툴들을 가공하기 위해 전통적으로 사용되는 도구들(플라스틱 마이크로유체 장치들의 대량 생산의 바람직한 방법)을 사용하여 제작하기 어려울 것이다.
기존의 마이크로유체 혼합기들을 소형화하는 것이 본질적으로 어렵다는 관점에서, 마이크로유체 혼합기 사용의 상업적 확장을 계속하기 위해서는 저렴한 제조를 가능하게 하는 새로운 혼합기 설계가 필요하다.
이 요약은 상세한 설명에서 이하 더 설명되는 단순화된 형태의 개념들의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 주제의 주요 피쳐들을 식별하기 위한 것이 아니며, 청구된 주제의 범위를 결정하는 데 도움을 주기 위한 것이 아니다.
본원의 특정 실시예들에서는 효율적인 혼합기들로서 동작하는 마이크로유체 장치들의 새로운 구성들이 개시된다. 특정 실시예들에서, 이러한 새로운 혼합기들은 사출-성형 툴링을 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 장치의 저렴하고 효율적인 제조를 가능하게 한다.
일 측면에서, 적어도 제1 액체 및 제2 액체를 혼합하기 위한 딘 와류에 의해 동작하는 혼합기가 제공되고, 상기 혼합기는 직렬로 배열된 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들(toroidal mixing elements)로 통하는 유입 채널을 포함하고, 상기 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들은 상기 유입 채널의 하류에 있는 제1 원환체 혼합 엘리먼트, 및 제1 넥 영역(neck region)을 통해 상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트와 유체 연통하는 제2 원환체 혼합 엘리먼트를 포함하고, 상기 제1 원환체 엘리먼트는 상기 유입 채널과 상기 제1 넥 영역 사이의 제1 넥 각도(neck angle)를 정의한다.
또 다른 측면에서, 여기에서 개시된 혼합기들을 사용하는 방법들이 제공된다. 일 실시예에서, 방법은 혼합된 용액을 제조하기 위해 여기에서 개시된 바와 같은 혼합기를 통해 제1 액체 및 제2 액체를 흘려(예를 들어, 추진 또는 가압하여) 제1 액체를 제2 액체와 혼합하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 혼합기들을 제조하는 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 엔드밀(endmill)을 사용하여 마스터 몰드(master mold)를 형성하는 단계를 포함하는 방법이 제공되고, 마스터 몰드는 여기에서 개시된 실시예들에 따라 DVBM 혼합기들을 형성하도록 구성된다.
전술한 측면들 및 여기에서 개시된 주제의 많은 부수적인 이점들은 첨부된 도면과 함께 고려될 때, 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이며, 더욱 쉽게 이해될 것이다:
도 1은 여기에서 개시된 실시예들에 따라 2 개의 액체들을 혼합하는 예시적인 딘 와류 분기 혼합기들(Dean Vortex Bifurcating Mixers; DVBM)의 현미경 사진이다.
도 2 내지 도 4는 여기에서 개시된 실시예들에 따른 DVBM 혼합기들의 부분들의 개략도이다.
도 5는 여기에서 개시된 실시예들에 따른 예시적인 DVBM 혼합기를 도시한다.
도 6은 여기에서 개시된 실시예들에 따른 DVBM 혼합기의 일부의 개략도이다.
도 7은 다양한 넥 각도들에서 예시적인 DVBM에서 측정된 혼합 시간을 그래프로 도시한다.
도 8은 예시적이고 비교된 DVBM 혼합기들의 측정된 혼합 시간을 그래프로 도시한다.
도 9는 스태거링된 헤링본 혼합기 및 2 개의 예시적인 DVBM 혼합기에 대한 입자 사이즈 및 다분산성 지수(polydispersity index; PDI)의 비교를 그래프픽적으로 도시한다.
도 10은 혼합 전에 DVBM 혼합기의 현미경 사진이다. 이러한 이미지는 이미지 분석을 위한 "템플릿" 역할을 한다.
도 11은 동작 중인 DVBM 혼합기의 현미경 사진이고, 이미지의 오른쪽 끝에 황색 액체를 형성하도록 맑고 청색 액체가 혼합된다(즉, 혼합이 완료 됨).
도 12는 허프 서클 변환(Hough Circle Transform)을 사용하여 검출된 원들을 나타내는 현미경 사진이다.
도 13a-13c는 혼합기들의 처리된 템플릿 및 데이터 이미지들이다.
도 14는 마스크가 적용된 템플릿 이미지이다.
도 15는 마스크가 적용된 데이터(혼합) 이미지이다.
도 16은 백색의 카운트된 픽셀들을 갖는 데이터(혼합) 이미지이다.
도 17은 여기에서 개시된 실시예들에 따라 대표적인 DVBM에 의해 제조된 리포좀들(liposomes)의 사이즈 및 PDI 특성을 그래프로 도시한다.
도 18은 여기에서 개시된 실시예들에 따라 대표적인 DVBM에 의해 제조된 에멀젼 캡슐화된(emulsion encapsulated) 치료 용 입자의 사이즈 및 PDI 특성들을 그래픽으로 나타내고, 그렇지 않은 유사한 조성물의 에멀젼 함유 비-치료 용 입자와의 비교를 나타낸다.
도 19는 여기에서 개시된 실시예들에 따라 대표적인 DVBM에 의해 제조된 폴리머 나노입자들의 사이즈 및 PDI 특성들을 그래프로 도시한다.
유체가 구부러진 채널을 통해 흐를 때, 구심력 및 이 위치에서의 유체의 더 높은 속도로 인해 채널의 중앙을 향하는 유체가 외부로 밀려난다(비-슬립 경계 조건들(no-slip boundary conditions)으로 인해 발생 함). 이러한 힘들의 작용은 딘 와류(droan vortexing)로 알려진 형태로 채널에 유체의 회전을 수직으로 야기한다.
원환체 혼합 엘리먼트들을 통해 분기된 유체 흐름을 갖는 유체 혼합기들이 개시된다. 혼합기들은 딘 와류(Dean vortexing)에 의해 적어도 부분적으로 동작한다. 따라서, 혼합기는 딘 와류 분기 혼합기들("DVBM")이라고 한다. DVBM은 최적화된 마이크로유체 혼합의 목표를 달성하기 위해 혼합기들을 형성하는 유체 채널들의 딘 와류 및 비대칭 분기를 활용한다. 개시된 DVBM 혼합기들은 2 개 이상의 유체를 혼합하는 것이 소망되는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 공지된 임의의 유체(예를 들어, 마이크로유체) 장치에 통합될 수 있다. 개시된 혼합기들은 주사기들, 펌프들, 유입구들, 유출구들, 비-DVBM 혼합기들, 히터들, 분석기들(assays), 검출기 및 이와 유사한 것들을 포함하는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 공지된 임의의 유체 엘리먼트들과 결합될 수 있다.
제공된 DVBM 혼합기들은 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들(여기에서 "원환체 혼합기들"로도 지칭 됨)을 포함한다. 여기에서 사용되는 "원환체(toroid)"는 원환체 혼합기의 유입구와 유출구 사이에서 원환체의 원주를 정의하는 2 개의 "레그(leg)" 채널들을 갖는 일반적으로 원형인 구조를 지칭한다. 원환체 혼합기들은 특정 실시예들에서 원형이다. 다른 실시예들에서, 원환체 혼합기들은 완벽하게 원형이 아니고 대신 타원형 또는 비-정형(non-regular shape)을 가질 수 있다.
일 측면에서, 적어도 제1 액체 및 제2 액체를 혼합하기 위해 딘 와류(dan vortexing)에 의해 동작하는 혼합기가 제공되고, 상기 혼합기는 직렬로 배열된 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들로 통하는 유입 채널을 포함하고, 상기 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들은 상기 유입 채널의 하류에 있는 제1 원환체 혼합 엘리먼트를 포함하고, 제1 넥 영역을 통해 상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트와 유체 연통하는 제2 원환체 혼합 엘리먼트를 포함하며, 상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트는 상기 유입 채널과 상기 제1 넥 영역 사이의 제1 넥 각도를 정의한다.
DVBM에서, 2 개(또는 그 이상)의 유체들이 각각은 2 개(또는 그 이상)의 유체들 중 하나가 혼합되는 2 개(또는 그 이상)의 분리된 유입구들로부터, 예를 들어 유입 채널을 통해, 혼합기로 들어간다. 두 유체들은 하나의 영역으로 흘러 들어가서 처음에 결합되지만, 다른 길이들의 두 구부러진 채널들로 흘러 들어가는 경로에서 분기된다. 이러한 2 개의 구부러진 채널들은 여기에서 원환체 혼합기의 "레그(leg)"라고 지칭한다. 상이한 길이들은 상이한 임피던스들(임피던스는 압력/유속(예를 들어, (PSI * min)/mL로서 정의 됨)을 갖는다. 일 실시예에서, 제2 레그와 비교된 제1 레그에서의 임피던스의 비율은 약 1:1에서 약 10:1이다. 이 불균형은 더 많은 유체가 다른 레그보다 한쪽 레그에 들어가게 야기한다. 임피던스의 불균형은 두 레그의 체적 비율을 초래하고, 이러한 비율은 임피던스 비율과 매우 유사하다. 따라서, 일 실시 예에서, 제2 레그에 비해 제1 레그에서 체적 흐름의 비율은 약 1:1에서 약 10:1이다. 임피던스(또는 길이 * 점도 당 임피던스)는 장치 동작과 상당히 독립적이다.
레그의 단면이 동일할 경우, 상이한 길이에 의해 상이한 임피던스가 회득되고 혼합이 발생한다. 실제 1:1 임피던스가 있는 경우, 체적들은 레그 사이에서 동일하게 나뉘지만, 혼합은 여전히 딘 와류(Dean vortexing)에 의해 발생한다; 하지만, 이러한 상황에서 분기의 이익은 완전히 활용되지 않는다.
일련의 4 개의 원환체 혼합기들을 갖는 예시적인 DVBM이 도 1에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 혼합기의 채널들(예를 들어, 레그들)은 대략 균일한 위도의 단면 영역(예를 들어, 높이 및 너비)이다. 채널들은 표준 너비 및 높이 측정들을 사용하여 정의될 수 있다. 일 실시예에서, 채널들은 약 100 마이크론 내지 500 마이크론의 너비 및 약 50 마이크론 내지 200 마이크론의 높이를 갖는다. 일 실시예에서, 채널들은 약 200 마이크론 내지 약 400 마이크론의 너비와 약 100 마이크론 내지 약 150 마이크론의 높이를 갖는다. 일 실시예에서, 채널들은 약 100 마이크론 내지 약 1 ㎜의 너비와 약 100 마이크론 내지 약 1 ㎜의 높이를 갖는다. 일 실시예에서, 채널들은 약 100 마이크론 내지 약 2 ㎜의 너비와 약 100 마이크론 내지 약 2 ㎜의 높이를 갖는다.
다른 실시예에서, 채널 영역들은 개별 원환체 내에서 또는 원환체 쌍 내에서 가변한다. 유체 역학적 직경(hydrodynamic diameter)은 종종 마이크로유체 채널 단위들을 특성화하는 데 사용된다. 여기에서 사용되는 유체 역학적 직경은(2*너비*높이)/(너비 + 높이)와 같이 채널 너비 및 높이 단위를 사용하여 정의된다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 20 마이크론 내지 약 2 ㎜의 유체 역학적 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 20 마이크론 내지 약 1mm의 유체 역학적 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 20 마이크론 내지 약 300 마이크론의 유체 역학적 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 113 마이크론 내지 약 181 마이크론의 유체 역학적 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 150 마이크론 내지 약 300 마이크론의 유체 역학적 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 1mm 내지 약 2mm의 유체 역학적 직경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기의 채널들은 약 500 마이크론 내지 약 2 ㎜의 유체 역학적 직경을 갖는다.
일 실시예에서, 혼합기는 마이크로유체 혼합기이고, 여기서 원환체 혼합 엘리먼트의 레그들은 미세 유체 치수를 갖는다.
층류(laminar flow)를 유지하고 마이크로유체 장치들의 용액들의 운동을 예측 가능하고 반복 가능한 방법으로 유지하기 위해, 시스템들은 낮은 레이놀즈 수에서 유동을 지원하도록 설계되었다. 일 실시예에서, 제1 혼합기는 2000 미만의 레이놀즈 수에서 제1 용액 및 제2 용액을 혼합하도록 사이징되고 구성된다. 일 실시예에서, 제1 혼합기는 1000 미만의 레이놀즈 수에서 제1 용액과 제2 용액을 혼합하도록 사이징되고 구성된다. 일 실시예에서, 제1 혼합기는 900 미만의 레이놀즈 수에서 제1 용액과 제2 용액을 혼합하도록 사이징되고 구성된다. 일 실시예에서, 제1 혼합기는 500 미만의 레이놀즈 수에서 제1 용액 및 제2 용액을 혼합하도록 사이징되고 구성된다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 여기에 개시된 실시예들을 보다 잘 설명하기 위해 예시적인 장치들이 제공된다. 도 2는 DVBM에서 채널 길이를 변경함으로써 획득되는 임피던스 차이를 도식적으로 나타낸다. 이 경우, 4가지 상이한 경로 길이들이 있다: 경로 A에 대한 La, 경로 B에 대한 Lb, 경로 C에 대한 Lc, 및 경로 D에 대한 Ld. 그러므로, 첫 번째 원환체에 대한 임피던스 비율은 Lb : La 및 Lc : Ld가 된다. 도 3은 DVBM에서 채널 너비를 변화시킴으로써 획득된 임피던스 차이를 도식적으로 나타낸다. 이 경우, 4가지 상이한 채널 너비들이 있다: 경로 A에 대한 wa, 경로 B에 대한 wb, 경로 C에 대한 wc, 및 경로 D에 대한 wd. 그러므로, 첫 번째 원환체 쌍의 임피던스 비율은 (대략) wa : wb 및 wc : wd가 된다.
도시된 혼합기들은 레그들에 의해 생성된 유체에 대해 4 개의 "경로"(A-D)를 따라 유체가 흐를 4 개의 "레그들"(A-D)로 각각 정의된 2 개의 원환체 혼합 엘리먼트들을 포함한다. 장치들에서 생성된 경로들로 인한 임피던스 불균형은 더 많은 유체가 경로 B(레그 B 내)보다 경로 A(레그 A 내)를 통과하게 한다. 이러한 구부러진 채널들은 딘 와류를 유도하도록 설계되었다. 이러한 구부러진 채널들을 빠져 나갈 때, 유체는 다시 재결합되고 두 번째 분기에 의해 분리된다. 이전과 같이, 이러한 분할은 임피던스가 다른 2 개의 채널들로 향하지만; 이번에는 임피던스의 비율이 반전되었다. 도 2에서, 경로 C(레그 C를 통과 함)는 경로 D(레그 D를 통과 함)보다 더 작은 임피던스를 갖고 경로 A와 동일하다. 마찬가지로, 경로 D 및 경로 B가 매치될 것이다. 결과적으로, 경로 C는 경로 A와 경로 B로 부터의 유체들이 모두 포함된다. 교류 임피던스로 향하는 이러한 분기의 패턴이 여러 사이클에 걸쳐 반복될 때, 두 유체들은 함께 "반죽(kneaded)"되고 (예를 들어, 도 1의 색상 변화들에 의해 시각적으로 도시 됨), 두 유체 사이의 접촉 영역이 증가하여 혼합 시간이 감소된다. 이 반죽은 엇갈린 헤링본 혼합기(Staggered Herringbone Mixer SHM)에 의해 사용되는 것과 동일한 메커니즘이지만, 단순하고 평면 구조들을 사용하여 수행한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 원환체 혼합 엘리먼트의 2 개의 레그들의 길이는 2 개의 레그들의 채널들의 너비의 중심선을 통해 정의된 원환체의 전체 둘레로 결합된다. 레그들이 만나는 두 지점들(예를 들어, 원환체 혼합 엘리먼트의 유동 경로의 시작 및 끝)은 유입구, 유출구 또는 넥을 통과하는 중심선이 원환체와 만나는 지점에 의해 정의된다. "결합된 흐름(combined flow)"라인이 "경로들"를 충족시키는 도 2를 참조하라.
채널의 주어진 길이에 대한 압력 손실은 다음 방정식에 의해 주어진다:
Figure pct00001
여기서
Figure pct00002
및
Figure pct00003
너비 w 및 높이 h의 채널에 대하여 (여기서 h <w),
Figure pct00004
여기서 μ는 유체 점도이고 L은 채널 길이이다. 이러한 식에서 임피던스 비율은 h가 일정하게 유지되면, L(도 2) 또는 w(도 3) 중 임의의 것을 변경하여 획득될 수 있음이 분명하다.
"내부 반경(inner radius)" (R)이라는 용어는 원환체 피쳐의 내부의 반경으로 정의된다. 도 4는 원환체 혼합 엘리먼트의 내부 반경(R)을 도식적으로 나타낸다.
원환면의 외부 반경은 내부 반경을, 반경이 측정되는 레그 채널의 너비를 더한 값으로 정의된다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 특정 실시예에서 원환체의 2 개의 레그들은 동일한 레그들을 갖고; 다른 실시예들에서는 2 개의 다리들이 상이한 폭들을 갖는다. 따라서, 단일 원환체는 측정 위치에 따라 반경이 다를 수 있다. 이러한 실시예에서, 외부 반경은 원환체 주위의 외부 반경의 평균에 의해 정의될 수 있다. 가변-반경 원환체의 가장 큰 반경은 원환체의 중심의 반대 측에 있는 가장 먼 포인트들을 연결하는 선의 길이의 절반으로 정의된다.
일 실시예에서, 혼합기는 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들("원환체들")을 포함한다. 　 일 실시예에서, 복수의 원환체들 모두 거의 동일한 반경을 갖는다. 　 일 실시예에서, 모든 원환체들이 거의 동일한 반경을 갖는 것은 아니다. 일 실시예에서, 혼합기는 하나 이상의 원환체들의 쌍들을 포함한다.　일 실시예에서 원환체들의 쌍 내의 2 개의 원환체들은 거의 동일한 반경을 갖는다. 다른 실시예에서, 2 개의 원환체들은 상이한 반경을 갖는다. 일 실시예에서, 혼합기는 제1 쌍 및 제2 쌍을 포함한다. 일 실시예에서, 제1 쌍의 원환체들의 반경은 제2 쌍의 원환체들의 반경과 거의 동일하다. 다른 실시예에서, 제1 쌍의 원환체들의 반경은 제2 쌍의 원환체들의 반경과 거의 동일하지 않다.
여기에서 개시된 혼합기는 혼합기를 통해 이동되는 2 개 이상의 액체들을 적절하게 혼합하기 위해 2 개 이상의 원환체들을 포함한다. 특정 실시예에서, 혼합기는 쌍으로 함께 연결된 두 개의 원환체들인 기본 구조를 포함한다(예를 들어, 도 5에 도시된 바와 같이). 두 개의 원환체들은 넥 각도에서 넥에 의해 연결된다. 일 실시예에서, 혼합기는 1 내지 10 쌍의 원환체들(즉, 2 내지 20 원환체들)을 포함하고, 여기서 상기 쌍들은 임피던스, 구조 및 혼합 능력의 관점에서 거의 동일한 특성들(각 쌍의 2 개의 원환체들은 상이할 수 있음)을 갖는 것으로 정의된다. 일 실시예에서, 혼합기는 2 내지 8 쌍의 원환체들을 포함한다. 일 실시예에서, 혼합기들은 2 내지 6 쌍의 원환체들을 포함한다.
다른 실시예에서, 원환체들이 쌍으로 배열되는지의 여부에 관계없이, 혼합기는 2 내지 20 개의 원환체들을 포함한다.
도 5는 원환체들의 일련의 반복 쌍들, 4 쌍의 총 8개의 원환체들을 포함하는 대표적인 혼합기이다. 각 쌍에서, 제1 원환체는 길이가 a와 b 인 "레그들"을 갖고, 제2 원환체에서 레그들은 길이 c와 d를 갖는다. 일 실시예에서, 길이들 a 및 c는 동일하고 b 및 d는 동일하다. 또 다른 실시예에서, a : b의 비율은 c : d와 동일하다. 도 5의 혼합기는 균일한 채널 너비, 원환체 반경, 넥 각도(120 도) 및 넥 길이를 갖는 혼합기의 예시이다.
원환체들의 레그들의 길이들은 원환체들의 쌍 간에 동일하거나 다를 수 있다. 도 2 및 도 6을 참조하면, 적어도 하나의 원환체의 2 개의 레그들은 상이하여, 넥 각도를 생성한다. 일 실시예에서 혼합기의 제1 원환체의 레그들은 0.1mm 내지 2mm이다. 다른 실시예에서, 혼합기 내의 원환체들의 모든 레그들은 이 범위 내에 있다.
가장 간단한 형태로, 딘 와류를 사용하는 혼합기는 원환체들 사이에 임의의 "넥" 없이 일련의 원환체들을 포함한다. 하지만, 이러한 단순한 개념은 2 개의 원환체들이 만나는 날카로운 "나이프-에지(knife-edge)" 피쳐를 초래한다. 표준 가공 기법을 사용하여 이러한 특성을 위한 금형을 가공할 수는 없다. 이를 극복하기 위한 가장 간단한 두 가지 방법은 이러한 피쳐에 반경을 도입하거나 (여기서, 반경은 사용된 엔드 밀의 반경과 동일 함), 원환체들 사이에 채널 영역 또는 "넥"을 생성하는 것이다. 혼합 속도 (아래의 예시적인 장치 테스트 및 결과 섹션 참조)의 측정에 의해 나타내지는 바와 같이, 이들 변형들 모두는 감소된 혼합 성능을 초래한다. 이러한 성능 저하는 다음 원환체에 들어가기 위해 유체가 강제로 생성되는 방향의 갑작스러운 변화의 손실 때문이다. 이러한 성능 저하를 극복하기 위해, DVBM은 원환체들 사이에 각진 "넥"을 사용한다.
넥 각은 각각의 원환체의 유입구 채널과 유출구 채널의 중심을 통과하는 선들로 정의된 각각의 원환체의 중심에 관하여 형성된 가장 짧은 각도로 정의된다. 도 6은 개시된 실시예들에서 넥 각도의 측정을 도식적으로 나타낸다.
각각의 원환체들의 쌍은 그것들 간의 넥 각도에 따라 구성된다.　유입구 또는 유출구 채널(즉, 복수의 원환체들의 시작 또는 단부에서의 원환체)에 인접한 원환체들에서, 넥 각도는 유입구 또는 유출구 채널이 그 원환체에 대한 넥인 것으로 가정하여 정의된 각도이다.
일 실시예에서, 넥 각도는 장치의 각각의 원환체에 대해 거의 동일하다. 다른 실시예에서, 모든 원환체가 동일한 넥 각도를 갖지 않도록 복수의 넥 각도들이 있다.
일 실시예에서, 넥 각도는 0도 내지 180도이다. 다른 실시예에서, 넥 각도는 90 도 내지 180 도 이다. 다른 실시예에서, 넥 각도는 90 내지 150도이다. 다른 실시예에서, 넥 각도는 100 내지 140도 이다. 다른 실시예에서, 넥 각도는 110 내지 130도 이다. 다른 실시 예에서, 넥 각도는 약 120도 이다.
도 6을 참조하면, 넥 길이는 곡선의 방향이 변하는 인접한 원환체들 상의 포인트들 사이의 거리로 정의된다.
일 실시예에서, 넥 길이는 혼합기를 제조하는데 사용되는 엔드 밀의 곡률 반경의 적어도 2 배이다. 일 실시예에서, 넥은 적어도 0.05mm 길이이다. 일 실시 예에서, 넥은 적어도 1mm 길이이다. 일 실시예에서, 넥은 적어도 0.2mm 길이이다. 일 실시예에서, 넥은 적어도 0.25mm 길이이다. 일 실시예에서, 넥은 적어도 0.3mm 길이이다. 일 실시예에서, 넥은 0.05mm 내지 2mm 길이이다. 일 실시예에서, 넥은 0.2 mm 내지 2 mm 길이이다.
혼합기를 형성하는데 사용되는 재료와 관련하여, 유체 장치를 형성하는데 사용될 수 있는 미래에 공지되거나 개발된 임의의 물질이 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 혼합기는 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, COC, COP, PDMS, 폴리스티렌, 나일론, 아크릴, HDPE, LDPE, 다른 폴리올레핀 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리머를 포함한다. 비-고분자 재료는 또한 전통적인 실리카-계 유리, 금속 및 세라믹과 같은 무기 유리를 포함하여 혼합기들을 제조하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 복수의 혼합기가 동일한 "칩(chip)"(즉, 복수의 혼합기들을 포함하는 단일 기판)에 포함된다. 이러한 실시예에서, DVBM 혼합기는 각각 유입구 및 유출구 채널로 시작하고 끝나는 복수 개의 원환체 혼합 엘리먼트들로 간주된다. 따라서, 다중 혼합기들을 갖는 칩은 병렬 또는 직렬 구성으로 배열된 다중 DVBM 혼합기들(각각 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들을 포함 함)을 갖는 실시예를 포함한다. 다른 실시예에서, 복수의 혼합기들은 하나 이상의 DVBM 혼합기들 및 하나의 비-DVDB 혼합기(예를 들어, SHM)를 포함한다. 혼합기 유형들을 결합함으로써, 각각의 유형의 혼합기의 강점들을 단일 장치에서 활용할 수 있다.
사용 방법
또 다른 측면에서, 여기에서 개시된 혼합기를 사용하는 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 방법은 혼합된 용액을 제조하기 위해 여기에서 개시된 바와 같은 혼합기(즉, DVBM)를 통해 제1 액체 및 제2 액체를 흐르게함으로써(예를 들어, 추진 또는 가압하여), 제1 액체를 제2 액체와 혼합하는 단계를 포함한다. 이러한 방법들은 DVBM 장치들 및 그 성능을 정의하는 맥락에서 본원의 다른 곳에서 상세하게 설명된다. 개시된 혼합기는 2 개 이상의 액체 증기가 비교적 낮은 체적들(예를 들어, 마이크로유체-레벨)에서 혼합되는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 공지된 임의의 혼합 적용에 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 혼합기는(DVBM을 포함하는) 복수의 혼합기들을 포함하는 보다 큰 장치에 통합되고, 상기 방법은 상기 혼합된 용액을 형성하기 위해 상기 복수의 혼합기들을 통해 상기 제1 액체 및 상기 제2 액체를 유동시키는 단계를 더 포함한다. 이러한 실시예는 단일 장치 상에 더 높은 혼합 체적들을 생성하기 위해 혼합기들의 병렬화에 관한 것이다. 이러한 병렬화는 참조로서 통합된 특허 문헌들에서 논의된다.
일 실시예에서, 제1 액체는 제1 용매를 포함한다. 일 실시예에서, 제1 용매는 수용액이다. 일 실시예에서, 수용액은 한정된 pH의 완충액이다.
일 실시예에서, 제1 액체는 제1 용매 내에 하나 이상의 거대 분자들을 포함한다.
일 실시예에서 거대 분자는 핵산이다. 또 다른 실시예에서, 거대 분자는 단백질이다. 추가의 실시예에서 거대 분자는 폴리 펩타이드이다.
일 실시예에서, 제1 액체는 제1 용매 내에 하나 이상의 저 분자량 화합물들을 포함한다.
일 실시예에서, 제2 액체는 제2 용매 내에 지질 입자 형성 물질들(lipid particle-forming materials)을 포함한다.
일 실시예에서, 제2 액체는 제2 용매 내에 폴리머 입자-형성 물질들을 포함한다.
일 실시예에서, 제2 액체는 제2 용매 내에 지질 입자-형성 물질들 및 하나 이상의 거대 분자들을 포함한다.
일 실시예에서, 제2 액체는 제 2 용매 내에 지질 입자-형성 물질 및 하나 이상의 저 분자량 화합물을 포함한다.
일 실시예에서, 제2 액체는 제2 용매 내에 폴리머 입자-형성 물질들 및 하나 이상의 거대 분자들을 포함한다.
일 실시예에서, 제2 액체는 제2 용매 내에 폴리머 입자-형성 물질들 및 하나 이상의 저 분자량 화합물들을 포함한다.
일 실시예에서, 혼합된 용액은 제1 액체와 제2 액체를 혼합함으로써 제조된 입자들을 포함한다. 일 실시예에서, 입자들은 지질 나노입자들 및 폴리머 나노입자들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제조 방법
또 다른 측면에서, 혼합기들를 제조하는 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 엔드 밀을 사용하여 마스터 몰드를 형성하는 단계를 포함하는 방법이 제공되고, 상기 마스터 몰드는 여기에 개시된 실시예들에 따라 DVBM 혼합기들을 형성하도록 구성된다. 어떠한 실시예들에서 마스터를 제조하기 위해 엔드 밀을 사용하지만, 다른 실시예들에서 마스터는 리소그래피 또는 전기주조를 포함하는 기술들을 사용하여 형성된다. 이러한 실시예들에서, R은 특정 기술이 허용하는 최소 피쳐 사이즈이다.
장치가 사출 성형을 사용하여 제조되고 사출 성형 인서트가 밀링에 의해 제조되는 경우에, 원환체 혼합 엘리먼트의 내부 반경들(R)은 혼합기를 형성하기 위해 주형을 제조하는데 사용되는 엔드 밀의 반경보다 크거나 동일하다. 대량 생산을 위해, 엠보싱, 주조, 몰딩 또는 임의의 다른 복제 기법에 의해 수행되거나, 마스터(예를 들어, 몰드)가 제조될 필요가 있다. 이러한 마스터는 정밀 밀을 사용하여 가장 쉽게 제작된다. 밀링(milling) 동안, 엔드 밀로 알려진 고속, 회전 커팅 툴이 특정 부분들을 제거하고 원하는 피쳐들을 형성하기 위해 고체 물질(강판과 같은)의 조각을 통과한다. 따라서 엔드 밀의 반경은 형성될 임의의 피쳐의 최소 반경을 정의한다. 마스터들은 또한 리소그래피(lithography), 전기주조(electroforming) 또는 다른 것들과 같은, 다른 기법들에 의해 제조될 수 있고, 이러한 경우에 선택한 기법의 분해능은 원환체의 최소 내부 반경을 정의할 것이다. 일 실시예에서, 혼합기의 내부 반경은 0.1mm 내지 2mm이다. 일 실시예에서, 혼합기의 내부 반경은 0.1mm 내지 1mm이다.
정의
마이크로유체
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "마이크로유체(microfluidic)"는 마이크로-스케일의 단위(즉, 1mm 보다 작은 단위)를 갖는 적어도 하나의 채널을 포함하는 유체 샘플을 제조(예를 들어, 유동, 혼합 등)하기 위한 시스템 또는 장치를 지칭한다.
치료 물질
여기에서 사용된 용어 "치료 물질(therapeutic material)"은 약리학적 활성을 제공하거나, 그렇지 않으면 질병의 진단, 치유, 완화, 이해, 치료 또는 예방에 직접적인 영향을 주거나, 또는 생리적 기능들의 복원, 교정 또는 수정에 직접적인 영향을 주고자 물질로 정의 된다. 치료 물질은 소분자 약물, 핵산, 단백질, 펩티드, 다당류, 무기 이온 및 방사성 핵종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
나노입자들
여기에서 사용된 용어 "나노입자들(nanoparticles)"은 치료 물질을 캡슐화하는데 사용되고, 250 나노 미터 미만의 최소 단위를 갖는 하나 이상의 성분 물질(예를 들어, 지질, 폴리머 등)을 포함하는 균질 입자로 정의된다. 나노입자들은 지질 나노입자들 및 폴리머 나노입자들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일 실시예에서, 상기 장치는 지질 나노입자들을 형성하도록 구성된다. 일 실시예에서, 상기 장치는 폴리머 나노입자들을 형성하도록 구성된다. 일 실시예에서, 지질 나노입자를 형성하기 위한 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 폴리머 나노입자들을 형성하기 위한 방법이 제공된다.
지질 나노입자들
일 실시예에서, 지질 나노입자들을 다음을 포함한다:
(a) 코어(core); 및
(b) 상기 코어를 감싸는 쉘(shell), 상기 쉘은 인지질(phospholipid)을 포함한다.
일 실시예에서, 코어는 지질(예를 들어, 지방산 트리글리세라이드(fatty acid triglyceride))를 포함하고 고체이다. 또 다른 실시예에서, 코어는 액체(예를 들어, 수성)이고 입자는 리포좀(liposomes)과 같은 소포(vesicle)이다. 일 실시 예에서, 코어를 둘러싸고 있는 쉘은 단일 층이다.
전술한 바와 같이, 일 실시예에서, 지질 코어는 지방산 트리글리세라이드를 포함한다. 적합한 지방산 트리글리세라이드는 C8-C20 지방산 트리글리세리드를 포함한다. 일 실시예에서, 지방산 트리글리세리드는 올레산 트리글리세라이드(oleic acid triglyceride)이다.
지질 나노입자는 코어를 둘러싸는 인지질을 포함하는 쉘을 포함한다. 적합한 인지질은 디아실 포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholines), 디아실포스파티딜에탄올아민(diacylphosphatidylethanolamines), 세라미드(ceramides), 스핑고미엘린(sphingomyelins), 디하이드로스핑고미엘린(dihydrosphingomyelins), 세팔린(cephalins) 및 세레브로시드(cerebrosides.)를 포함한다. 일 실시예에서, 인지질은 C8-C20 지방산 디아실포스파티딜콜린이다. 대표적인 인지질은 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine)(POPC)이다.
특정 실시예에서, 인지질 대 지방산 트리글리 세라이드의 비율 20:80 (몰 : 몰) 내지 60:40 (몰 : 몰)이다. 바람직하게는, 트리글리 세라이드는 40 % 초과 80 % 미만의 비율로 존재한다.
특정 실시예에서, 나노입자는 스테롤을 더 포함한다. 대표적인 스테롤은 콜레스테롤을 포함한다. 일 실시예에서, 인지질 대 콜레스테롤의 비율은 55:45 (몰 : 몰)이다. 대표적인 실시예에서, 나노입자는 55-100 % POPC 내지 최대 10mol % 의 PEG-지질을 포함한다.
다른 실시예에서, 발명의 지질 나노입자들은, 대표적 예시들로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파이드산(phosphatidic acid), 팔미토일올레오일포스파티디콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), 리소포스파티디콜린(lyosphosphatidylcholine), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine), 및 디리노올레오일포스파티딜콜린(dilinoleoylphosphatidylcholine)인 포스포글리세라이드(phosphoglycerides)를 포함하는 하나 이상의 다른 지질을 포함할 수 있다. 스핑고지질(sphingolipid) 및 글리코스핀고지질 (glycosphingolipid)과 같은 인이 결핍된 다른 화합물이 유용한다. 트리아실글리세롤(Triacylglycerols)도 유용하다.
본 발명의 대표적인 나노입자들은 약 10 내지 약 100 nm의 직경을 갖는다. 하부 직경 제한은 약 10 내지 약 15 nm이다.
본 발명의 제한 사이즈 지질 나노입자들은 치료제 및/또는 진단 제제들로서 사용되는 하나 이상의 저 분자량 화합물들을 포함할 수 있다. 이러한 제제들은 일반적으로 입자 코어 내에 포함된다. 본 발명의 나노입자들은 매우 다양한 치료제 및/또는 진단 제제들을 포함할 수 있다.
적절한 저 분자량 화합물 제제들은 화학요법 제제들(즉, 항-신생물제들(anti-neoplastic agents)), 마취제들(anesthetic agents), 베타-아드레날린성 차단제들(beta-adrenaergic blockers), 항-고혈압제제들(anti-hypertensive agents), 항-우울제들(anti-depressant agents), 항-경련제들(anti-convulsant agents), 항-구제제들(anti-emetic agents), 항-히스타민제들(antihistamine agents), 항-부정맥제들(anti-arrhythmic agents) 및 항-말라리아제들(anti-malarial agents)을 포함한다.
대표적인 항신생물제들은 독소루비신(doxorubicin),　다우노루비신(bleomycin), 마이토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 스트렙토조신(streptozocin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 메클로레타민(mechlorethamine), 하이드로클로라이드(hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 트리에틸렌티오포스포르아미드(triethylenethiophosphoramide), 카마 스틴(carmaustine), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 플루러유러시(fluorouracil), 히드 록시우레아(hydroxyurea,), 티오구아닌(thioguanine), 시타 라빈(cytarabine), 플룩슈누딘(floxuridine), 데카르바진(decarbazine), 시스플라틴(cisplatin), 프로카르바진(procarbazine), 비노렐빈(vinorelbine), 시프로플록사시온(ciprofloxacion), 노르플록사신(norfloxacin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 벡사로틴(bexarotene), 테니포시드(teniposide), 트레티노인(tretinoin), 이소트레티노인(isotretinoin), 시롤리무스(sirolimus), 풀베스트트란트(fulvestrant), 발루 비신(valrubicin), 빈데신(vindesine), 류코보린(leucovorin), 이리노테칸(irinotecan), 카페시타빈(capecitabine), 겜시타빈(gemcitabine), 미톡산트론 하이드로 클로라이드(mitoxantrone hydrochloride), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 카보플라틴(carboplatin), 에스트라스틴틴(estramustine), 및 그것의 약학적으로 허용 가능한 염류들을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 지질 나노입자들은 핵산 지질 나노입자들이다. 용어 "핵산-지질 나노입자들(nucleic acid-lipid nanoparticles)"은 핵산을 함유하는 지질 나노입자들을 의미한다. 지질 나노입자들은 하나 이상의 양이온성 지질들, 하나 이상의 제2 지질들 및 하나 이상의 핵산들을 포함한다.
양이온성 지질. 지질 나노입자들은 양이온성 지질을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "양이온성 지질(cationic lipid)"은 pH가 이온화 가능한 지질 군의 pK보다 낮아질 때 양이온성이거나 양이온성(양성자화)이 되지만, 높은 pH 값에서는 점진적으로 중성이 되는 지질을 지칭한다. pK 이하의 pH에서, 지질은 음으로 하전된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 결합할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "양이온성 지질(cationic lipid)"은 pH 감소 시 양전하를 가정하는 양성 이온성 지질을 포함한다.
용어 "양이온성 지질"은 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 넷 양전하를 운반하는 다수의 지질 종들 중 임의의 것을 지칭한다. 이러한 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride)(DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride)(DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide)(DDAB); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride)(DOTAP); 3-(N―(N′,N′-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤(3-(N―(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol)(DC-Chol) 및 N-(1,2- 다이마이리스틸옥시프로프-3-일)-N(N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N), N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide)(DMRIE)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 여기에서 사용될 수 있는 다수의 양이온성 지질의 시판용 제제가 이용 가능하다. 이것은 예를 들어 LIPOFECTIN
Figure pct00005
(GIBCO/BRL, 그랜드 아일랜드(Grand Island), 뉴욕으로부터의, DOTMA 및 1,2-디올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-3-phosphoethanolamine)(DOPE)을 포함하는 시판되는 양이온성 리포좀들); LIPOFECTAMINE
Figure pct00006
(GIBCO/BRL으로부터의 N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페민카르복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(N-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride)(DOSPA) 및 (DOPE)를 포함하는 시판되는 양이온성 리포좀들); 및 TRANSFECTAM
Figure pct00007
(프로메가 코프(Promega Corp.), 매디슨(Madison), WI로부터의 에탄올 중 디옥타데실아미도글리실 카복시스페르민(dioctadecylamidoglycyl carboxyspermine)(DOGS)을 포함하는 시판되는 양이온성 지질들)을 포함한다. 다음 지질들은 양이온성이고 생리학적 pH 이하에서 양전하를 띤다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-딜리노일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane)(DLinDMA), 1,2-딜리노레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane)(DLenDMA).
일 실시예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 여기에서 유용한 적합한 아미노 지질들은 WO 2009/096558에 기술된 것들을 포함하고, 그 전체가 여기에서 참조로서 인용된다. 대표적인 아미노 지질들은 1,2-딜리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(l,2-dilinoleyoxy-3-(dimethylamino)acetoxypropane)(DLin-DAC), 1,2-딜리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(1,2-dilinoleyoxy-3-morpholinopropane)(DLin-MA), 1,2-딜리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(l,2-dilinoleoyl-3-dimethylaminopropane)(DLinDAP), l,2-딜리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(l,2-dilinoleylthio-3-dimethylaminopropane)(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(l-linoleoyl-2-linoleyloxy-3-dimethylaminopropane)(DLin-2-DMAP), 1,2-딜리놀레이옥시-3-트리메틸아미노프로판 염화물 염(l,2-dilinoleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt)(DLin-TMA·Cl), 1,2-딜리놀레일-3-트리메틸아미노 프로판 염화물 염(l,2-dilinoleoyl-3-trimethylaminopropane chloride salt)(DLin-TAP·Cl), 1,2-딜리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노(l,2-dilinoleyloxy-3-(N-methylpiperazino)propane)(DLinAP), 3-(N,N-딜리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(3-(N,N-dilinoleylamino)-l,2-propanediol)(DOAP), l,2-딜리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(l,2-dilinoleyloxo-3-(2-N,N-dimethylamino)ethoxypropane)(DLin-EG-DMA), 및 2,2-딜리놀레이1-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[l,3]-dioxolane)(DLin-K-DMA)을 포함한다.
적합한 아미노 지질들은 하기 화학식을 갖는 것들을 포함한다:
Figure pct00008
여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 독립적이고 선택적으로 치환된 C10-C24 알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C10-C24 알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C10-C24 알키닐(alkynyl) 또는 선택적으로 치환된 C10-C24 아실(acyl)이다.
R3 및 R4는 동일하거나 상이하고, 독립적이고 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환 된 C2-C6 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐이고, 또는 R3 및 R4는 4 내지 6 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택된 1 또는 2 개의 헤테로 원자들의 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 링을 형성하도록 결합할 수 있고;
R5는 부재하거나 존재하고, 존재하는 경우 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
m, n 및 p는 동일하거나 상이하고 독립적으로 0 또는 1이고, 단 m, n 및 p는 동시에 0이 아니며;
q는 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
Y 및 Z는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 O, S 또는 NH이다.
하나의 실시 양태에서, R1 및 R2는 각각 리놀레일이고, 아미노 지질은 딜리놀레일 아미노 지질이다. 일 실시예에서, 아미노 지질은 딜리놀레일 아미노 지질이다.
대표적인 유용한 딜리놀레일 아미노 지질은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00009
여기서, n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.
일 실시예에서, 양이온성 지질은 DLin-K-DMA이다. 일 실시예에서, 양이온성 지질은 DLin-KC2-DMA(상기 DLin-K-DMA, 여기서 n은 2 임)이다.
다른 적합한 양이온성 지질들은 대략 생리학적 pH에서 넷 양성 전하를 띠고 있는 양이온성 지질들을 포함하고, 상기 구체적으로 기술된 것 이외에, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride)(DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N-N-트리에틸암모늄 클로라이드(N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N-N-triethylammonium chloride)(DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide)(DDAB); N-(2,3- 디오릴옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride)(DOTAP); 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 염화물 염(1,2-dioleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt)(DOTAP·Cl); 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일)콜레스테롤(3β-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol)(DC-Chol), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N-2-(스페민카르복사미도)에틸)-N,N-(1-(2,3-디오레오일옥시)프로필)-N-2-(스페민카르복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트(N-(1-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N-2-(sperminecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylammonium trifluoracetate)(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 카르복시페르민(dioctadecylamidoglycyl carboxyspermine)(DOGS), 1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium propane)(DODAP), N,N-디메틸-2,3-디올레오일옥시)프로필아민(N,N-dimethyl-2,3-dioleoyloxy)propylamine)(DODMA) 및 N-(1,2-디마이리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide)(DMRIE)을 포함한다. 또한, 예를 들어 LIPOFECTIN(GIBCO/BRL으로부터 이용 가능한 DOTMA 및 DOPE 포함), 및 LIPOFECTAMINE(GIBCO/BRL로부터 이용 가능한 DOSPA 및 DOPE를 포함)과 같이, 다수의 양이온성 지질들의 상업용 표본이 사용될 수 있다.
양이온성 지질은 지질 입자 내에 약 30 내지 약 95 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 일 실시예에서, 양이온성 지질은 지질 입자 내에 약 30 내지 약 70 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 일 실시예에서, 양이온성 지질은 지질 입자 내에 약 40 내지 약 60 몰 퍼센트의 양으로 존재한다.
일 실시예에서, 지질 입자는 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 핵산만을 포함한다("구성된다").
제2 지질들. 특정 실시예에서, 지질 나노입자들은 하나 이상의 제2 지질들을 포함한다. 적합한 제2 지질들은 그의 형성 동안 나노입자들의 형성을 안정화시킨다.
"지질(lipid)"이란 용어는 지방산의 에스테르(esters)이고, 물에 불용성이지만 많은 유기 용매에 용해되는 것을 특징으로 하는 유기 화합물 군을 지칭한다. 지질들은 일반적으로 적어도 세 가지 클래스들로 나뉜다: (1) 왁스뿐만 아니라 지방 및 오일을 포함하는 "단순 지질들(simple lipids)"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질(compound lipids)"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질(derived lipids)".
적합한 안정화 지질들은 중성 지질들 및 음이온성 지질들을 포함한다.
중성 지질들. 용어 "중성 지질(neutral lipid)"은 생리학적 pH에서 비하전성(uncharged) 또는 중성 양성(neutral zwitterionic) 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. 대표적인 중성 지질들은 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholines), 디아실포스파티딜에탄올아민(diacylphosphatidylethanolamines), 세라마이드(sphingomyelins), 스핑고미엘린(sphingomyelins), 디하이드로스핀고마이린(dihydrosphingomyelins), 세팔린(cephalins), 및 세레브로시드(cerebrosides)를 포함한다.
예시적인 지질들은, 예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine)(DSPC), 디올레오일포스파티콜린(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine)(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol)(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol)(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(dioleoyl-phosphatidylethanolamine)(DOPE), 팔미토일올레일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine)(POPC) 및 디올레일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)(DOPE-mal), 디팔미트오일 포스파티딜 에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine)(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(dimyristoylphosphoethanolamine)(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoyl-phosphatidylethanolamine)(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(16-O-monomethyl PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1-trans PE, 1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine)(SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine)(transDOPE)을 포함한다.
일 실시예에서, 중성 지질은 1,2-디스테아오일-Sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DSPC)이다.
음이온성 지질. 용어 "음이온성 지질(anionic lipid)"은 생리학적 pH에서 음전하를 띠는 지질을 의미한다. 이러한 지질들은 포스파티딜 글리세롤(phosphatidylglycerol), 카디오리핀(phosphatidylglycerol), 디아실포스파티딜세린(diacylphosphatidylserine), 디아실포스파티딘 산(diacylphosphatidic acid), N-도데카노일포스파티딜에탄올-아민(N-dodecanoylphosphatidylethanol-amines), N-숙시닐포스파티딜에탄올아민(N-succinylphosphatidylethanolamines), N-글루타릴포스파티딜에탄올아민(N-glutarylphosphatidylethanolamines), 리실포스파티딜글리세롤(lysylphosphatidylglycerols), 팔미토일올레일포스파티딜글리세롤(palmitoyloleyolphosphatidylglycerol)(POPG) 및 중성 지질들에 결합된 다른 음이온성 변형 군들을 포함한다.
다른 적합한 지질들은 당지질들(예를 들어, 모노시아로간리오시드(monosialoganglioside) GM1)을 포함한다. 다른 적합한 제2 지질들은 콜레스테롤과 같은 스테롤들을 포함한다.
폴리에틸렌 글리콜-지질(Polyethylene glycol-lipids). 특정 실시예에서, 제2 지질은 폴리에틸렌 글리콜-지질(polyethylene glycol-lipid)이다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질들은 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민(PEG-modified phosphatidylethanolamine), PEG-변형 포스파티딕 산(PEG-modified phosphatidic acid), PEG-변형 세라미드(PEG-modified ceramides)(예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형 디알킬아민(PEG-modified dialkylamines), PEG-변형 디아실글리세롤(PEG-modified diacylglycerols), PEG-변형 디알킬글리세롤(PEG-modified dialkylglycerols)을 포함한다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질들은 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA 및 PEG-s-DMG를 포함한다. 일 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-디메틸옥시프로필-3-아민(N-[(methoxy poly(ethylene　glycol)2000)carbamyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amine)(PEG-c-DMA)이다. 일 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG이다.
특정 실시예에서, 제2 지질은 지질 입자 내에 약 0.5 내지 약 10 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 일 실시예에서, 제2 지질은 지질 입자 내에 약 1 내지 약 5 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 일 실시예에서, 제2 지질은 지질 입자 내에 약 1 몰 퍼센트로 존재한다. 핵산(Nucleic Acids). 본 발명의 지질 나노입자들은 핵산의 전신 또는 국소 전달에 유용하다. 여기에서 기술된 바와 같이, 핵산은 그것의 형성 동안 지질 입자 내로 혼입된다.
여기에서 사용된 용어 "핵산(nucleic acid)"은 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미한다. 최대 50 개의 뉴클레오티드를 함유하는 단편은 일반적으로 올리고뉴클레오티드라고 불리고, 더 긴 단편은 폴리뉴클레오티드라고 불린다. 특정 실시예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 20-50 뉴클레오티드 길이이다. 본 명세서의 문맥에서, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 및 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 자연적으로 발생하는 염기(bases), 당(sugars) 및 인터슈가(intersugr)(백본(backbone)) 결합들로 구성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 모노머(nucleoside monomers)의 폴리머 또는 올리고머를 지칭한다. 용어들 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"및 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 유사하게 기능하는 비-천연 발생 단량체 또는 이의 일부들 포함하는 폴리머 또는 올리고머를 포함한다. 그러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 증가된 세포 섭취 및 뉴클레아제 존재 하에서의 증가된 안정성과 같은 특성 때문에 종종 천연 형태보다 바람직하다. 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보누클레오티드(deoxyribooligonucleotides) 또는 리보올리고뉴클레오티드(ribooligonucleotides)로 분류된다. 데옥시리보누클레오티드는이 당의 5'및 3'탄소에서 인산염에 공유 결합된 데옥시보제(deoxyhbose)라 불리는 5-탄소 당으로 이루어져 교대로 분지되지 않은 폴리머를 형성한다. 리보 올리고뉴클레오티드는 5-탄소 당이 리보스인 유사한 반복 구조로 구성되어있다. 여기에서 따른 지질 입자 내에 존재하는 핵산은 공지된 임의의 형태의 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 핵산은 단일-가닥(stranded) DNA 또는 RNA, 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 이중-가닥 DNA의 예시들은 구조 유전자, 조절 및 종결 영역을 포함하는 유전자 및 바이러스 또는 플라스미드 DNA와 같은 자체 복제 시스템을 포함한다. 이중-가닥 RNA의 예시들은 siRNA 및 기타 RNA 간섭 시약이 있다. 단일-가닥 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 리보 자임(ribozymes), 마이크로 RNA, mRNA 및 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시예에서, 폴리핵 산은 안티센스 올리고뉴클레오티드다. 특정 실시예들에서, 핵산은 안티센스 핵산, 리보 자임, tRNA, snRNA, snoRNA, siRNA, shRNA, saRNA, tRNA, rRNA, piRNA, ncRNA, miRNA, mRNA, lncRNA, sgRNA, tracrRNA, 미리 응축된 DNA(pre-condensed DNA), ASO 또는 앱타머(aptamer)이다. .
"핵산(nucleic acids)"이라는 용어는 또한 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 변형된 리보 뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 포스페이트-당-백본 올리고뉴클레오티드, 다른 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analogs) 및 이들의 조합을 지칭하고, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 적절하게는, 이중 가닥 및 단일 가닥 시퀀스 모두의 함유 부분들일 수 있다. (27)
여기에서 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 하기 용어들을 포함하고, 이것은 아래와 같이 정의된다: 뉴클레오티드 염기(nucleotide base), 뉴클레오티드 유사체 및 유니버설 뉴클레오티드.
여기에서 사용된 용어 "뉴클레오티드 염기"는 치환되거나 치환되지 않은 모(parent) 방향족 환 또는 고리를 지칭한다. 일부 실시예에서, 방향족 고리는 하나 이상의 질소 원자를 함유한다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 염기는 적절하게 상보적인 뉴클레오티드 염기와 함께 왓슨-크릭(Watson-Crick) 및/또는 호그스틴 수소 결합(Hoogsteen hydrogen bonds)을 형성할 수 있다. 예시적인 뉴클레오티드 염기 및 그의 유사체는 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 2,6-디아미노퓨린(2,6-diaminopurine), 아데닌(adenine)(A), 에테노아데닌(ethenoadenine), N6-2-이소펜테닐아데닌(N6-2-isopentenyladenine)(6iA), N6-2-이소펜테닐-2-메틸티오아데닌(N6-2-isopentenyl-2-methylthioadenine)(2ms6iA), N6-메틸아데닌(N6-methyladenine), 구아닌(guanine)(G), 이소구아닌(isoguanine), N2-디메틸구아닌(N2-dimethylguanine)(dmG), 7-메틸구아닌(7-methylguanine)(7mG), 2-티오피리미딘(2-thiopyrimidine), 6-티오 구아닌(6-thioguanine)(6sG) 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 O6-메틸구아닌(O6-methylguanine)같은 퓨린; 7-디아자아데닌(deazaadenine)(7-deaza-A) 및 7-디아바구아닌(7-deazaguanine)(7-deaza-G)와 같은 7-디아자-퓨린(7-deaza-purines); 시토신(cytosine)(C), 5-프로피닐시토신(5-propynylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 티민(thymine)(T), 4-티오티민(4-thiothymine)(4sT), 5,6-디하이드로티민(5,6-dihydrothymine), O4-메틸티민(O4-methylthymine), 우라실(uracil)(U), 4-티오우라실(4-thiouracil)(4sU) 및 5,6-디하이드로우라실(5,6-dihydrouracil)(디하이드로 우라실; D(dihydrouracil; D)); 니트로인돌(nitroindole) 및 4-메틸인돌(4-methylindole)과 같은 인돌(indoles); 니트로피롤(nitropyrrole)과 같은 피롤(pyrroles); 성운(nebularine); 염기(base)(Y)를 포함 하지만 이에 한정되지 않는다; 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 염기는 유니버셜 뉴클레오티드 염기이다.
부가적으로 예시적인 뉴클레오티드 염기는 1989 년, Fasman, 1989, 생화학 및 분자 생물학 실용 안내서(Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology), pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, Fla. 및 그의 인용 문헌에서 찾을 수 있다. 유니버셜 염기의 다른 예시는 예를 들어 Loakes, N.A.R. 2001, 29 권 : 2437-2447 및 Seela N. A. R. 2000, vol 28 : 3224-3232에서 찾을 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "뉴클레오시드"는 오탄당 당(pentose sugar)의 C-1' 탄소에 공유 결합된 뉴클레오티드 염기를 갖는 화합물을 말한다. 일부 실시예에서, 결합은 헤테로 방향족 고리 질소를 통해 이루어진다. 전형적인 오탄당 당은, 하나 이상의 탄소 원자들은 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 -R, -OR, -NRR 또는 할로겐족들 중 하나 이상으로 치환되고, 여기서 각 R은 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬 또는 (C5-C14) 아릴인 이러한 오탄당을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 오탄당 당은 포화되거나 불포화될 수 있다. 예시적인 오탄당 당 및 그의 유사체는 리보스, 2'-데옥시리보오스(2'-deoxyribose), 2'-(C1-C6)알콕시리보스(2'-(C1-C6)alkoxyribose), 2'-(C5-C14)아릴옥시리보스(2'-(C5-C14)aryloxyribose), 2',3'-디데옥시리보스(2',3'-dideoxyribose), 2',3'-디데하이드로리보스(2',3'-didehydroribose), 2'-데옥시-3'할로리보스(2'-deoxy-3'-haloribose), 2'-데옥시-3'-플루오로리보스(2'-deoxy-3'-fluororibose), 2'-데옥시-3'-클로로리보스(2'-deoxy-3'-chlororibose), 2'-데옥시-3'-아미노리보스(2'-deoxy-3'-aminoribose), 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알킬리보스(2'-deoxy-3'-(C1-C6)alkylribose), 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알콕시리보스(2'-deoxy-3'-(C1-C6)alkoxyribose) 및 2'데옥시-3'-(C5-C14)아릴옥시리보스(2'-deoxy-3'-(C5-C14)aryloxyribose)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 예를 들어, 2'-O-메틸, 4'-.알파.-아노머성 뉴클레오티드, 1'-.알파.-아노머성 뉴클레오티드(Asseline (1991) Nucl. Acids Res.19 : 4067-74), 2'-4'- 및 3'-4'-결합 및 기타 "고정된"또는 "LNA" 이중 고리 당 변형(WO 98/22489; WO 98/39352; WO 99/14226)을 참조한다. "LNA"또는 "고정된 핵산"은 리보스 고리가 2'-산소와 3'- 또는 4'- 탄소 사이의 메틸렌 연결에 의해 고정되도록 구조적으로 고정된 DNA 유사체이다. 결합에 의해 부과된 형태 제한은 종종 상보적인 서열에 대한 결합 친화도를 증가시키고 그러한 더플렉스(duplexes)의 열적 안정성을 증가시킨다.
당은 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), 알릴옥시(allyloxy), 이소프로폭시(isopropoxy), 부톡시(butoxy), 이소부톡시(isobutoxy), 메톡시에틸(methoxyethyl), 알콕시(alkoxy), 페녹시(phenoxy), 아지도(azido), 아미노(azido), 아미노(amino), 알킬아미노(alkylamino), 플루오로(fluoro), 클로로(chloro) 및 브로모(bromo)와 같은 2'- 또는 3'- 위치에서 변형을 포함한다. 뉴 클레오시드 및 뉴클레오티드는 L 배열 이성질체(configurational isomer)(L-형태)뿐만 아니라, 천연 D 배열 이성질체(D-형태)를 포함한다(Beigelman, 미국 특허 제6,251,666호, Chu, 미국 특허 제5,753,789호, Shudo, EP0540742; Garbesi(1993) Nucl. Acids Res. 21:4159-65; Fujimori(1990) J. Amer. Chem. Soc. 112:7435, Urata, (1993) 핵산 심포지엄(Nucleic Acids Symposium) Ser. No. 29:69-70). 핵 염기가 퓨린, 예를 들어, A 또는 G 인 경우, 리보스 당은 핵산 염기의 N9-위치에 부착된다. 핵 염기가 피리미딘, 예를 들어 C, T 또는 U 일 때, 오탄당은 핵 염기의 N1-위치에 부착된다(Kornberg 및 Baker, (1992) DNA 복제, 제2판, 프리맨, 샌프란시스코, 캘리포니아).
뉴클레오시드의 하나 이상의 오탄당 탄소는 포스페이트 에스테르로 치환될 수 있다. 일부 실시예에서, 인산 에스테르는 오탄당의 3'- 또는 5'- 탄소에 결합된다. 일 실시예에서, 뉴클레오시드는 뉴클레오티드 염기가 퓨린, 7- 데아자퓨린, 피리미딘, 유니버설 뉴클레오티드 염기, 특정 뉴클레오티드 염기 또는 그의 유사체인 뉴클레오티드이다.
여기에서 사용된 용어 "뉴클레오티드 유사체(nucleotide analog)"는 오탄당 당 및/또는 뉴클레오시드의 뉴클레오티드 염기 및/또는 하나 이상의 인산 에스테르가 그 각각의 유사체로 대체될 수 있는 실시예를 나타낸다. 일부 실시예에서, 전형적인 오탄당 당 유사체들은 상술된 것들이다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 유사체는 상술한 바와 같이 뉴클레오티드 염기 유사체를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 예시적인 포스페이트 에스테르 유사체는 알킬포스포네이트(alkylphosphonates), 메틸포스포네이트(methylphosphonates), 포스포로아미데이트(phosphoramidates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포로티오에이트(phosphorodithioates), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioates), 포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoates), 포스포로디셀레노에이트(phosphorodiselenoates), 포스포로아닐로티오에이트(phosphoroanilothioates), 포스포로아닐리데이트(phosphoroanilidates), 포스포로아미데이트(phosphoroamidates), 보론포스페이트(boronophosphates)를 포함하지만 이에 한정되지는 않고, 연관된 반대이온들(counterions)을 포함할 수 있다. 다른 핵산 유사체 및 염기는 예를 들어 인터칼레이팅 핵산(INTRA, Christensen and Pedersen, 2002) 및 AEGIS 염기(Eragen, 미국 특허 제5,432,272호)를 포함한다. 다양한 핵산 유사체에 대한 추가적인 설명은 또한 예를 들어(Beaucage 등, 사면체(Tetrahedron) 49(10):1925 (1993) 및 그것의 참조 문헌; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl 등, Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger 등, Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai 등, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger 등, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); 및 Pauwels 등, Chemica Scripta 26:141 91986)), 포스포로티오에이트(Mag 등, Nucleic Acids Res.19:1437 (1991); 및 미국 특허 제5,644,048 호)에서 찾을 수 있다. 다른 핵 유사체는 포스포로디티오에이트(Briu 등, J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989), O-메틸포포로아미다이트 결합체(Eckstein, 올리고뉴클레오타이드 및 유사체 : 실용적 접근 옥스포드 대락 프레스(Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford University Press) 참조), 양성 백본을 갖는 것들(Denpcy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 6097 (1995); 비-이온 백본(미국 특허 제5,386,023호, 제5,386,023호, 제5,637,684호, 제5,602,240호, 제5,216,141호 및 제4,469,863호. Kiedrowski 등, Angew. Chem. Int. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger 등, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger 등, 뉴클레오시드 & 뉴클레오티드(Nucleoside & Nucleotide) 13:1597 (194) : 2장 및 3장, ASC 심포지엄 시리즈(Symposium Series) 580, "안티센스 연구(Antisense Research)의 탄수화물 변형", Ed. S. Sanghui 및 P. Dan Cook; Mesmaeker 등, 생물학 & 약용 화학(Bioorganic & Medicinal Chem.) Lett. 4:395 (1994); Jeffs 등, J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); 사면체(Tetrahedron) Lett. 37:743 (1996)) 및 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호 및 6장 및 7장, ASC 심포지엄 시리즈 580, "안티센스 연구에서의 탄수화물 변형", Ed. S. Sanghui and P. Dan Cook 에 기술된 것을 포함하는 비-리보스 백본을 포함한다. 하나 이상의 탄소고리 당을 함유하는 핵산은 또한 핵산의 정의 내에 포함된다(Jenkins 등, Chem. Soc. Rev. (1995) pp169-176 참조). 몇몇 핵산 유사체는 또한 Rawls, C & E News 1997년 6월 6일, 35면에 기술되어있다.
여기에서 사용된 용어 "일반적인 뉴클레오티드 염기(universal nucleotide base)" 또는 "유니버설 염기(universal base)"는 질소 원자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 방향족 고리 반족(aromatic ring moiety)을 의미한다. 일 실시 예에서, 유니버셜 염기는 유니버셜 뉴클레오티드를 만들기 위해 오탄당 당의 C-1' 탄소에 공유 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 유니버셜 뉴클레오티드 염기는 다른 뉴클레오티드 염기와 특이적으로 수소 결합하지 않는다. 일부 실시예에서, 보편적 인 뉴클레오티드 염기는 특정 뉴클레오타이드 염기를 포함하여 뉴클레오타이드 염기와 수소 결합한다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 염기는 소수성 스태킹에 의해 동일한 핵산 가닥에 기초하여 인접 뉴클레오티드 염기와 상호 작용할 수 있다. 유니버설 뉴클레오티드는 데옥시-7-아자인돌 트리포스페이트(deoxy-7-azaindole triphosphate)(d7AITP), 데옥시이소카보스티릴 트리포스페이트(deoxyisocarbostyril triphosphate)(dICSTP), 데옥시프로피닐이소카보닐트리포스페이트(deoxymethyl-7-azaindole triphosphate)(dPICSTP), 데옥시ImPy 트리포스페이트(deoxyImPy triphosphate)(dImPyTP), 데옥시PP 트리포스페이트(deoxyPP triphosphate)(dPPTP) 또는 데옥시프로피닐-7-아자인돌 트리포스페이트(deoxypropynyl-7-azaindole triphosphate)(dP7AITP)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 유니버설 염기의 추가의 예시들은 특히, 공개된 미국 특허 출원 제10/290672호 및 미국 특허 제6,433,134호에서 찾을 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 및 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 상호교환 가능하게 사용되고, 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 결합체들, 예를 들어, 3'-5' 및 2'-5', 역 결합, 예를 들어, 3'-3' 및 5'-5', 가지 구조들 또는 인터뉴클레오티드 유사체들에 의해 연결된 2'-데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 및 리보뉴클레오티드(RNA)를 포함하는 뉴클레오티드 단량체들의 단일-가닥 및 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 H+, NH4+, 트리알킬암모늄, Mg2+, Na+ 등과 같은 연관된 반대 이온들을 갖는다. 폴리뉴클레오타이드는 전적으로 데옥시리보뉴클레오티드, 전적으로 리보뉴클레오티드, 또는 그것의 화학적 혼합물들로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 인터뉴클레오티드, 핵 염기 및/또는 당 유사체로 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 몇 단량체 단위, 예를 들어 당해 기술 분야에서 올리고 뉴클레오타이드로보다 빈번하게 언급되는 경우 3 내지 40 개의 단량체 단위로부터 수천 개의 단량체 뉴클레오타이드 단위의 크기 범위이다. 다르게 표시되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드 시퀀스가 표현될 때마다, 뉴클레오티드는 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 순서이고, 달리 언급하지 않는 한, "A"는 데옥시아데노신, "C"는 데옥시시토신, "G"는 데옥시구아노신, 및 "T"는 티미딘을 나타낸다.
여기에서 사용된 것과 같이, "핵 염기"는 핵산 기술을 이용하거나 펩티드 핵산 기술을 이용하여 핵산에 특이적으로 결합할 수있는 폴리머를 생성하는 사람들에게 일반적으로 알려진 자연 발생 핵산 및 비-자연 발생 이종 반족(non-naturally occurring heterocyclic moieties)을 의미한다. 적합한 핵염기의 비-제한적인 예시들은 다음을 포함한다: 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 5-프로피닐-우라실, 2-티오-5-프로피닐우라실, 5-메틸시토신, 슈도이소시토신, 2-티오우라실 및 2-티오티민, 2-아미노퓨린, N9-(2-아미노-6-클로로퓨린), N9-(2,6-디아미노퓨린), 히폭산틴, N9-(7-데아자-구아닌), N9-(7-데자아-8-아자-구아닌) 및 N8-(7-데아자-8-아자)-아데닌). 적합한 핵 염기의 다른 비-제한적인 예시들은 Buchardt 등의 (WO92/20702 또는 WO92/20703)의 도 2(A) 및 도 2(B)에 도시된 뉴클레오염기를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "뉴클레오염기 시퀀스"는 뉴클레오염기-함유 서브유닛들을 포함하는 폴리머의 임의의 세그먼트 또는 둘 이상의 세그먼트(예를 들어, 둘 이상의 올리고머 블록의 집합체 핵염기 시퀀스)의 집합체를 의미한다.　적합한 폴리머 또는 폴리머 세그먼트의 비-제한적인 예시들은 올리고데옥시뉴클레오티드(예를 들어, DNA), 올리고리보뉴클레오티드(예를 들어, RNA), 펩티드 핵산(PNA), PNA 키메라, PNA 조합 올리고머, 핵산 유사체 및/또는 핵산 모방체를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "폴리뉴클레오티드 가닥"는 뉴클레오염기 서브유닛들을 포함하는 완전한 단일 폴리머 가닥을 의미한다. 예를 들어, 이중 가닥된 핵산의 단일 핵산 가닥은 폴리 클레오티드 가닥이다.
본원에 사용된 것과 같이, "핵산"은 뉴클레오염기 시퀀스-함유 폴리머 또는 뉴클레오티드 또는 그의 유사체로부터 형성된 백본을 갖는 폴리머 세그먼트다.
바람직한 핵산은 DNA 및 RNA이다.
여기에서 사용된 것과 같이, "펩티드 핵산" 또는 "PNA"를 지칭하는 핵산은 또한 둘 이상의 PNA 서브유닛(잔기(residues))를 포함하지만, 미국 특허 제5,739,282호, 제5,727,675 호, 제 5,623,049 호, 제 5,714,331 호, 제 5,718,262 호, 제 5,736,336 호, 제 5,773,571 호, 제 5,766,855 호, 제 5,786,461 호, 제 5,837,459 호, 제 5,891,625 호, 제 5,972,610 호, 제 5,986,053 호 및 제 6,107,470 호에서 펩티드 핵산으로 언급되거나 청구된 올리고머 또는 폴리머 세그먼트 중 임의의 것을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 핵산 서브유닛(또는 그의 유사체)를 포함하지 않는 임의의 올리고머 또는 폴리머 세그먼트(예를 들어, 블록 올리고머)의미할 수 있다; 이들 모두는 본원에 참고로 인용된다. 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 또한 다음의 문헌에 기술된 핵산 유사체의 2 개 이상의 서브유닛을 포함하는 임의의 올리고머 또는 폴리머 세그먼트에도 적용된다: Lagriffoul 등, 생물유기화학 & 의료 화학 문헌(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters), 4: 1081-1082 (1994); Petersen 등, 생물유기화학 & 의료 화학 문헌, 6: 793-796 (1996); Diderichsen 등, Tett. Lett. 37: 475-478 (1996); Fujii 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 637-627 (1997); Jordan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 687-690 (1997); Krotz 등, Tett. Lett. 36: 6941-6944 (1995); Lagriffoul 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1081-1082 (1994); Diederichsen, U., 생물유기화학 & 의료 화학 문헌, 7: 1743-1746 (1997); Lowe 등, J. Chem. Soc. 퍼킨 트랜스. 1, (1997) 1: 539-546; Lowe 등 J. Chem. Soc. Perkin Trans 11: 547-554 (1997); Lowe 등, J. Chem. Soc. 퍼킨 트랜스. 11: 555-560 (1997); Howarth 등, J. Org. Chem. 62: 5441-5450 (1997); Altmann, K-H 등, 생물유기화학 & 의료 화학 문헌, 7: 1119-1122 (1997); Diederichsen, U., 생물유기화학 & 의료 화학 문헌, 8: 165-168 (1998); Diederichsen 등, Angew. Chem. Int. Ed., 37: 302-305 (1998); Cantin 등., Tett. Lett., 38: 4211-4214 (1997); Ciapetti 등, Tetrahedron, 53: 1167-1176 (1997); Lagriffoule 등, Chem. Eur. J., 3: 912-919 (1997); Kumar 등, Organic Letters 3(9): 1269-1272 (2001); 및 WO96/04000에 개시된Shah 등의 펩티드-기반 핵산 모방체(Peptide-Based Nucleic Acid Mimics)(PENAMS).
폴리머 나노입자들
용어 "폴리머 나노입자들"은 치료 물질을 함유하는 폴리머 나노입자들을 의미한다. 폴리머 나노입자들은 다음을 포함하는 광범위한 물질들을 사용하여 개발되었지만, 이에 한정되지는 않는다: 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리락티드(polylactide), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리(락티드-코글리코라이드)(poly(lactide-coglycolide)), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리 메타 크릴 레이트(polymethacrylates), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리라이신(polylysine), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 같은 합성 호모 폴리머(homopolymers); 폴리(락티드-코글리콜라이드)(poly(lactide-coglycolide)), 폴리(락티드)-폴리(에틸렌 글리콜)(poly(lactide)-poly(ethylene glycol)), 폴리(락티드-코-글리콜라이드)-폴리(에틸렌 글리콜)(poly(lactide-co-glycolide)-poly(ethylene glycol)), 폴리(카프로 락톤)-폴리(에틸렌 글리콜)(poly(caprolactone)-poly(ethylene glycol))과 같은 합성 공중합체(synthetic copolymers); 셀룰로오스(cellulose), 키틴(chitin) 및 알지네이트(alginate)와 같은 천연 폴리머뿐만 아니라 폴리머-치료 물질 접합체(polymer-therapeutic material conjugates).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리머"는 함께 결합된 다수의 유사한 유닛으로부터 주로 또는 완전히 형성된 통상적으로 고 분자량의 화합물들을 의미한다. 이러한 폴리머들은 수많은 천연, 합성 및 반합성 폴리머들 중 임의의 것을 포함한다.
"천연 폴리머"라는 용어는 자연으로부터 유래된 임의의 수의 폴리머 종을 의미한다. 이러한 폴리머들은 다당류, 셀룰로오스, 키틴 및 알지네이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"합성 폴리머"라는 용어는 자연에서 발견되지 않는 여러 가지 합성 폴리머 종을 의미한다. 이러한 합성 폴리머는 합성 호모 폴리머 및 합성 코 폴리머를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
합성 호모 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리카프로락톤, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리라이신 및 폴리에틸렌이민을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"합성 공중합체(Synthetic copolymer)"는 둘 이상의 합성 호모폴리머 서브유닛들로 구성된 임의의 수의 합성 폴리머 종들을 의미한다. 이러한 합성 공중합체는 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리(락티드)-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락티드-코-글리콜 라이드)-폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(카프로락톤)-폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하지만 이네 한정되지는 않는다.
용어 "반합성 폴리머(semi-synthetic polymer)"는 천연 폴리머들의 화학적 또는 효소적 처리에 의해 유도된 임의의 수의 폴리머들을 의미한다. 이러한 폴리머들은 카르복시메틸 셀룰로오스, 아세틸화 카르복시메틸 셀룰로오스, 시클로덱스트린, 키토산 및 젤라틴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "폴리머 접합체"는 하나 이상의 분자 종을 폴리머에 공유 결합 또는 비-공유 결합시킴으로써 제조된 화합물을 의미한다. 이러한 폴리머 접합체는 폴리머-치료 물질 접합체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
폴리머-치료 물질 접합체는 하나 이상의 접합 분자 종이 치료 물질인 폴리머 접합체를 지칭한다. 이러한 폴리머-치료 물질 접합체는 폴리머-약물 접합체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"폴리머-약물 접합체"는 임의의 수의 약물 종에 접합된 임의의 수의 폴리머 종을 나타낸다. 이러한 폴리머 약물 접합체는 아세틸 메틸셀룰로오스-폴리에틸렌 글리콜-도세탁셀을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "약"은 달리 지시되지 않는한 연관된 값이 플러스 또는 마이너스 5퍼센트(+/- 5 %)만큼 수정될 수 있고 개시된 실시예의 범위 내에서 유지될 수 있음을 나타낸다.
참조로서 포함
호환 가능한 마이크로유체 혼합 방법 및 장치는 하기 참조 문헌에 개시되어있다. 본원에 개시된 혼합기는 이들 참고 문헌에 개시된 임의의 혼합 장치에 혼입될 수 있거나 또는 이들 참고 문헌에 개시된 임의의 조성물을 혼합하는데 사용될 수 있다:
(1) 2009년 11월 4일자로 출원된 USSN 61/280510의 이익을 주장하는 PCT/CA2010/001766의 계속 출원인 미국 특허 출원 제13/464690호;
(2) 2011년 10월 25일자로 출원된 USSN 61/551,366의 이익을 주장하는 PCT/CA2012/000991의 계속 출원인, 미국 특허 출원 제14/353,460 호;
(3) 2013년 3월 15일자로 출원된 USSN 61/798,495의 이익을 주장하는 2014년 3월 14일 출원된 PCT/US2014/029116(WO 2014/172045, 2014년 10월 23일 공개);
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(5) 2013년 10월 16일에 출원된 USSN 61/891,758의 이익을 주장하는 PCT/US2014/060961;
(6) 2015년 2월 24일에 출원된 미국 임시 출원 제 62/120,179호; 및
(7) 2015년 4월 28일 출원된 미국 임시 출원 제62/154,043호, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다.
하기의 예시는 설명된 실시예들을 예시하기위한 것이지 제한하는 것은 아니다.
예시
예시 1: DVBM 장치 테스트 및 결과
2 개의 유체 유입구와 1 개의 유출구가 있는 장치를 테스트 용으로 제작되었다. 4 가지 개념이 테스트되었다. 4가지 디자인은 아래의 표 1에 요약되었다. 혼합기 유형 1-3의 경우, 임피던스 불균형은 원환체들 양 측면의 너비를 변경하여 생성된다(도 3). DVBM은 원환체들을를 통과하는 경로 길이를 변경함으로써 임피던스 불균형을 달성한다. 모든 테스트 장치의 입구 채널 너비는 140 μm이고 높이는 105 μm이다(유체 역학적 직경은 120 μm, 길이 당 임피던스*점도는 약 6.9 * 10^-5/um^4 이다).
표 1: 다양한 마이크로유체 혼합기 디자인의 구성.
Figure pct00010
성능을 최적화하기 위해 옵셋 각도가 120°, 140°, 160° 및 180°인 4 개의 예시적인 DVBM 혼합기 세트가 프로토 타입되었다. 혼합 속도는 일련의 유속에 대해 광학적으로 측정되었다(도 7). 이 테스트로부터 옵셋 각도가 혼합 속도를 높이기 위한 매개 변수이며 120°가 최적의 각도임을 확인했다. 이와 같이 120°의 DVBM을 혼합기들 유형 1-3과 비교하기 위해 사용했다.
명시야 입체경(bright field stereoscope)을 사용하여 샘플을 영상화하였다. 혼합을 시각화하기 위해 125 mM NaAc와 "BTB"(bromothymol blue)를 함유한 1M NaOH가 시약으로 사용되었다. 혼합 시간은 컬러 CCD로 혼합기를 이미징하고 채널을 가로 질러 노랑색 분포가 있는 지점을 위치시킴으로써 계산되었다. 장치의 혼합 시간은 유체가 완전히 혼합되는 지점에 도달하기 위해 필요한 시간이 소요되었다. 혼합 시간을 측정하는 데 사용된 실험 기술에 대한 자세한 내용은 첨부를 참조한다.
도 8은 유형 1 내지 3 및 예시적인 DVBM의 성능이 일련의 입력 유속(혼합 시간에 의해 측정된)과 다르다는 것을 나타낸다. 혼합기 유형 1과 3은 모두 10 ml/min 이하에서 유형 2 나 DVBM보다 느리게 혼합된다(예상된 바와 같이). 흥미롭게도 120° 옵셋을 갖는 바람직한 DVBM은 실제로 그것을 초과하는 낮은 유속에서 유형 2혼합기의 성능을 회복한다. 이것은 예기치 않은 것이고 명백하지 않다.
지질 나노입자들(아래 섹션에서 통합된 참조들에서 형성된 유형의)은 120도 및 180도의 예시적인 DVBM 혼합기 모두에서 제조되었다. 간단히, POPC 및 콜레스테롤의 지질 조성을 에탄올에 55:45의 몰 비율로 용해시켰다. 최종 지질 농도는 16.9 mM이었다. 상업적 나노어셈블리 벤치탑 마이크로 유체 카트리지(commercial NanoAssemblr Benchtop Microfluidic Cartridge)(SHM을 사용함), 120도의 예시적인 DVBM 및 180도의 예시적인 DVBM에서 2 내지 10 ml/분의 유속을 시험하였고, 그 결과는 아래 도 9에 도시되었다. 예시적인 DVBM 장치 모두 카트리지와 동일한 크기 대 유량을 나타냈다. 그러나, 낮은 유속에서, 예시적인 DVBM 혼합기는 카트리지보다 작고 덜 분산된 입자를 만들었다.
도 9는 스태거링된 헤링본 혼합기 및 2 개의 DVBM 설계에 대한 입자 사이즈 및 PDI의 비교이다. 특히 더 높은 유속에서, 예시적인 DVBM 혼합기뿐만 아니라 SHM 혼합기도 수행된다는 것을 알 수 있다.
혼합 시간 계산
다음 장비가 사용되었다:
암스코프 카메라(Amscope Camera)
암스코스 현미경(Amscope Microscope)
백색/흑색 백 플레이트(White/Black Back Plate)
PTFE 튜빙(tubing) 1/32''
딘 와류 혼합 장치들(Dean Vortex Mixing Devices)(글라스 슬라이드(Glass Slide) 상의 PDMS)
PetriDish 페트리 접시(PetriDish)
Stainless Steel Weights 스테인레스 스틸 중량(Stainless Steel Weights)
데이터는 56 개의 LED 조명기와 백색베이스 플레이트가 부착된 암스코프 현미경(Amscope Microscope)을 사용하여 수집되었다. 중량이 부착된 페트리 접시도 조정 장치 위치를 쉽게하기 위해 리코딩 영역에 넣었다. 125 mM NaAc 및 BTB를 포함하는 1M NaOH를 3:1 비율로 혼합하고; 완전한 혼합은 용액이 균일한 강도 분포로 황색으로 변하는 지점으로 결정되었다. 딘 와류 혼합기를 움직이지 않고 동일한 유속의 모든 이미지를 촬영했다(처리 방법 참조). 색상 변경을 보다 잘 감지하기 위해 색상 채도를 최대로 설정하여 이미징 소프트웨어를 수동으로 조정했다. 도 10은 혼합 전에 DVBM 혼합기의 현미경 사진이다.
도 11은 작동중인 DVBM 혼합기의 현미경 사진이고, 맑고 청색 액체가 혼합되어 이미지의 오른쪽 끝에 황색 액체를 형성한다(즉, 혼합이 완료 됨).
처리 방법
로(raw) 이미지는 Python과 OpenCV 3.0을 사용하는 프로그램이 회전하고, 가운데에 맞추고, 그것을 스티치하는데 사용되는 폴더로 들어간다. 템플릿 이미지가 처음 처리되고(허프 서큰 변환(Hough Circle Transform)(도 12 참조)을 사용하여 이미지 내에서 변환 계산의 기초로 사용된 원을 감지 함), 이후 후속 이미지는 템플릿과 동이한 변환이 수행되었다. 이 과정에서 반경도 계산되어 마이크로 미터 단위로 이미지의 픽셀 영역을 결정하는데 사용되었다.
도 13a-13c는 혼합기의 처리된 템플릿 및 데이터 이미지이다. 도 13a는 DVBM 템플릿 이미지이다. 도 13b는 혼합 동안의 DVBM 이미지이다. 도 13c는 비-DVBM 혼합기의 템플릿 이미지이다.
계산 방법 및 알고리즘
템플릿 이미지 채널은 특정 색상 임계 값(이 경우 파란색의 강도)에 대한 각 픽셀의 값을 확인한 다음 해당 값이 임계값 범위 내에 있지 않은 경우 픽셀 색상을 검정색으로 변경하여 감지되었다. 이 방법을 통해 혼합기의 채널만 포함된 마스크가 적용되었다. 이후 혼합 이미지가 업로드되고 동일한 마스크가 적용되었다. 혼합 점을 시각적으로 확인한 다음 계산 범위를 입력했다. 이 범위까지 채널 내의 픽셀 수를 세고 흰색으로 표시했다. 체적은 이전에 결정된 픽셀 영역 및 장치 내의 채널 높이로부터 계산되었다. 총 혼합 부피가 계산되면, 장치를 혼합한 유속으로 나누어서 혼합 시간을 결정하였다.
도 14는 마스크가 적용된 템플릿 이미지이다. 도 15는 마스크가 적용된 데이터(혼합) 이미지이다. 도 16은 백색으로 카운트된 픽셀을 갖는 데이터(혼합) 이미지이다.
DVBM을 이용한 리포좀 제조
우리는 도 17에 요약된 바와 같이, 좁은 PDI를 갖는 100 nm 미만의 리포좀성 소포를 제조했다. 도 17은 본원에 개시된 실시예에 따라 대표적인 DVBM에 의해 제조된 리포좀의 사이즈 및 PDI 특성을 그래프로 도시한다. 그것의 데이터는 넥 길이가 0.25mm, 넥 각도가 120도, 내부 반경이 0.16, 채널 너비 및 높이가 80 마이크론이고 유속 비율이 약 2:1(수성:지질)인 DVBM 장치에서 생성되었다. 지질 조성은 순수한 POPC 리포좀 또는 POPC:콜레스테롤(Cholesterol)(55:45)-함유 리포좀이었다. 초기 지질 혼합 농도는 50 mM이었다. 수성상은 PBS 완충액을 포함 하였다.
재료 및 방법: POPC(1-팔미토일-2-올레오일-Sn-글리세로-3-포스포콜린)은 미국 Avanti Polar Lipids, Inc로부터 제조되었다. 콜레스트롤, 트리올레인(Triolein), C-6(Coumarin-C6), DMF(Dimethyl Formamide), PVA, [Poly (Vinyl alcohol), Mowiol
Figure pct00011
4-88] 및 PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)는 미국 Sigma-Aldrich에서 생산했다. 에탄올은 캐나다의 Green Field Specialty Alchols Inc에서 구입했다. PLGA, Poly(lactic co-glycolic acid)는 미국 폴리 체 테크 (PolyciTech)에서 제조되었다.
다음 용액을 카트리지의 각 웰들(wells)에 분배하였다. 수성 시약 웰에 36 μL PBS, 수집 웨? PBS 48 μL, 마지막으로 칩을 통해 혼합하기 직전에 에탄올의 50mM 지질 혼합의 12 μL를 유기 시약 웰에 잘 넣는다. 시약 용액은 마이크로 혼합되었다. 생성된 입자를 PBS로 1:1로 희석 하였다.
DVBM을 사용하는 유화액 생산
도 18에 요약된 바와 같이, 좁은 PDI를 갖는 크기가 100nm 이하인 유화액를 제조했다. 도 18("POPC:트리올레인(Triolein)(60:40)")은 개시된 실시예에 따라 대표적인 DVBM에 의해 생성된 리포솜의 크기 및 PDI 특성을 그래프로 도시한다. 이 데이터는 넥 길이가 0.25mm, 넥 각도가 120°, 내부 반경이 0.16, 및 채널 너비 및 높이가 80 마이크론이고 유속 비율이 약 2:1 인 DVBM 장치(수성:지질 혼합)상에서 제조되었다. 지질 조성은 POPC:트리올레인(Triolein)(60:40)이었다. 초기 지질 혼합 농도는 50 mM이었다. 수성상은 PBS 완충액을 포함 하였다.
재료 및 방법: 리포솜과 관련하여 상기 기술된 것과 동일하다.
DVBM을 이용한 유화액의 치료제 캡슐화
도 18에 예시된 바와 같이, 우리는 모델 소수성 약물, Coumarin-6을 100 nm 이하의 입자 크기 및 좁은 PDI를 갖는 유화액의 제조 동안 캡슐화 하였다. 도 18("POPC-트리올레인(60:40):C6")은 본원에 개시된 실시예에 따라 대표적인 DVBM에 의해 제조된 캡슐화된 치료제, Coumarin-6의 크기 및 PDI 특성, 및 다른 유사한 조성을 갖는 비-치료제-함유 입자와 비교를 그래프로 도시한다. 이 데이터는 넥 길이가 0.25mm, 넥 각도가 120°, 내부 반경이 0.16, 채널 너비 및 높이가 80마이크론이고 유속 비율이 약 2:1 인 DVBM 장치(수성:지질 혼합)상에서 제조되었다. 지질 혼합 조성물은 0.024 wt/wt의 D/L(약물/지질) 비를 갖는 POPC:트리올레인(60:40) 50mM 및 Coumarin-6을 DMF로 사용하였다. 수성상은 PBS 완충액을 포함하였다. Coumarin-6없이 형성된 "유화제만"의 나노 입자는 크기와 PDI가 본질적으로 동일하다.
재료 및 방법: 리포솜과 관련하여 상기 기술된 것과 동일하다.
DVBM을 사용하여 형성된 폴리머 나노입자들
우리는 도 19에 요약된 바와 같이 좁은 PDI를 갖는 200 nm 이하의 크기의 유화제를 생성했다. 도 19는 본원에 개시된 실시예에 따라 대표적인 DVBM에 의해 생성된 폴리머 나노입자들의 크기 및 PDI 특성을 그래프로 도시한다. 이 데이터는 넥 길이 0.25mm, 넥 각도 120°, 내부 반경 0.16, 채널 너비 및 높이 80 마이크론 및 약 2:1의 유속 비율(수성:폴리머 혼합물)을 갖는 DVBM 장치상에서 생성되었다. 폴리머 혼합물은 아세토니트릴 중 폴리(락틱-코-글리콜 산)(poly(lactic-co-glycolic acid)("PLGA") 20 mg/mL를 포함한다. 수성상은 PBS 완충액을 포함 하였다.
재료 및 방법: 리포좀과 관련하여 전술한 바와 동일한 재료. 다음 용액을 카트리지의 각 웰에 분배 하였다. 수성 시약 웰에 MilliQ 물 36 μL 2 % PVA wt/vol, 수집 웰에 MilliQ 물 48 μL, 마지막으로, 칩을 통해 혼합하기 직전에 아세토니트릴 중 20 mg/mL PLGA 12 μL를 유기 시약 웰에 넣었다. 시약 용액은 마이크로 혼합되었다. 생성된 입자는 MilliQ 물로 1:1로 희석한다.
예시적인 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
독점적인 소유권 또는 권리가 청구되는 본 발명의 실시예들은 다음과 같이 정의된다:

Claims (24)

  1. 적어도 제1 액체 및 제2 액체를 혼합하도록 구성된 혼합기에 있어서, 상기 혼합기는 직렬로 배열된 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들(toroidal mixing elements)로 통하는 유입 채널을 포함하고, 상기 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들은 상기 유입 채널의 하류에 있는 제1 원환체 혼합 엘리먼트, 및 제1 넥 영역(neck region)을 통해 상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트와 유체 연통하는 제2 원환체 혼합 엘리먼트를 포함하고, 상기 제1 원환체 엘리먼트는 상기 유입 채널과 상기 제1 넥 영역 사이의 제1 넥 각도(neck angle)를 정의하는
    혼합기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 넥 각도는 0도 내지 180도인
    혼합기.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 넥 영역은 0.05mm 이상의 길이를 갖는
    혼합기.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 혼합 엘리먼트들은 약 20마이크론 내지 약 2mm의 유체 역학적 직경(hydrodynamic diameter)을 갖는 채널들을 포함하는
    혼합기.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기는 1000보다 작은 레이놀즈 수(Reynolds number)에서 상기 제1 액체 및 상기 제2 액체를 혼합하도록 사이징되고 구성되는
    혼합기.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기는 2 개 이상의 혼합기들을 병렬로 포함하고, 각각의 혼합기는 복수의 원환체 혼합 엘리먼트들을 갖는
    혼합기.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트 및 상기 제2 원환체 혼합 엘리먼트는 혼합 쌍을 정의하고, 상기 혼합기는 복수의 혼합 쌍들을 포함하고, 각각의 혼합 쌍은 넥 각도에서 넥 영역에 의해 결합되는
    혼합기.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트는 제1 길이의 제1 레그(leg)와 제2 길이의 제2 레그를 갖고; 상기 제2 원환체 혼합 엘리먼트는 제3 길이의 제1 레그와 제4 길이의 제2 레그를 갖는
    혼합기.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1 길이는 상기 제2 길이보다 큰
    혼합기.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제3 길이는 상기 제4 길이보다 큰
    혼합기.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제2 길이에 대한 상기 제1 길이와 비율은 상기 제4 길이에 대한 상기 제3 길이의 비율과 거의 동일한
    혼합기.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제1 원환체 혼합 엘리먼트는 제1 임피던스를 갖는 제1 레그와 제2 임피던스를 갖는 제2 레그를 갖고; 상기 제2 원환체 혼합 엘리먼트는 제3 임피던스를 갖는 제1 레그와 제4 임피던스를 갖는 제2 레그를 갖는
    혼합기.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제1 임피던스는 상기 제2 임피던스보다 큰
    혼합기.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 제3 임피던스는 상기 제4 임피던스보다 큰
    혼합기.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 제2 임피던스에 대한 상기 제1 임피던스의 비율은 상기 제4 임피던스에 대한 상기 제3 임피던스의 비율과 거의 동일한
    혼합기.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 혼합기는 2 개 내지 20 개의 원환체 혼합 엘리먼트들을 직렬로 포함하는
    혼합기.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 믹서는 1 내지 10 쌍의 원환체 혼합 엘리먼트들을 직렬로 포함하는
    혼합기.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 원환체 혼합 엘리먼트들은 약 0.1mm 내지 약 2mm의 내측 반경을 갖는
    혼합기.
  19. 제1 액체와 제2 액체를 혼합하는 방법에 있어서,
    혼합된 용액을 제조하도록 제1항 내지 제18항에 따른 혼합기를 통해 상기 제1 액체 및 상기 제2 액체를 유동시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 혼합기는 복수의 혼합기들을 포함하는 마이크로유체 장치에 통합되고, 상기 방법은 상기 혼합된 용액을 형성하기 위해 상기 복수의 혼합기들을 통해 상기 제1 액체 및 상기 제2 액체를 유동시키는 단계를 더 포함하는
    방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 제1 액체는 제1 용매 내의 핵산을 포함하는
    방법.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 제2 액체는 제2 용매 내의 지질 입자-형성 물질들(lipid particle-forming materials)을 포함하는
    방법.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 혼합된 용액은 상기 제1 액체와 상기 제2 액체를 혼합하여 생성된 입자들을 포함하는
    방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 입자들은 지질 나노 입자들 및 폴리머 나노입자들로 구성되는 군으로부터 선택되는
    방법.
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