KR20180100802A - 데그론을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 암줄기세포 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 데그론을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 암줄기세포 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용한 리포터 단백질의 발현 분석을 통해 암줄기세포의 검출 및 분리를 효율적으로 수행할 수 있어, 기존의 암줄기세포 분리 방법에 비하여 상대적으로 저렴한 비용으로 고효율의 암줄기세포 검출 및 분리가 가능하다. 아울러, 본 발명의 재조합 백터는 암의 성장과 관련된 연구, 암의 재발 및 전이를 억제를 위한 암줄기세포 스크리닝 등 다양한 분야에서 제한 없이 활용될 수 있다는 이점이 있다.

Description

데그론을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 암줄기세포 분리 방법{Recombinant vector comprising degron and method of separating for cancer stem cell using thereof}

본 발명은 데그론을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 암줄기세포 분리 방법에 관한 것이다.

암 조직이 다른 여러 형태의 불균질 세포로 이루어져 있음은 1977년 최초의 보고 이후 현재까지 학계에서 사실로 받아들여지고 있다. 또한 수많은 암세포 중에서 암을 형성할 수 있는 능력을 가지고 있는 일부의 암세포가 존재하며, 이들이 어떤 환경적 영향에 의한 줄기세포의 돌연변이에 의해 생성된다는 암 줄기세포 가설은 이미 학계에서 많은 연구를 통하여 증명된 바 있다.

과거 연구에서 많은 연구자들이 줄기세포의 특이적 표면단백질을 표지분석법을 통해 분석하였고, 암 조직에서 줄기세포 표지인자를 발견하고 이를 이용하여 선별된 세포들에서 종양형성능력이 탁월한 일부의 세포가 존재함을 발견하고 이들을 암 줄기세포(cancer stem cells)이라 명명하였다.

현재까지의 연구 결과는 암 발생이 암 유전자의 발현 또는 돌연변이의 축적에 의한 줄기세포의 과도한 증식으로부터 기인할 가능성이 있음을 제시하고 있다. 이러한 암 줄기세포 가설은 암 치료에 있어서 지금까지 항암제가 만족할 만한 치료효과를 나타내지 못한 이유를 설명해 줄 수 있다. 즉, 암 줄기세포는 숫자가 매우 적어도 항암제에 의해 괴사된 암세포를 복구할 수 있는 능력을 보유하고 있기에 완전한 항암 치료를 위해서는 암 줄기세포의 괴사가 선행되어야 할 것이다. 그러나 지금까지의 항암제는 암세포와 암줄기세포를 구별하지 못한 관계로 상대적으로 약물 흡수에 저항을 나타내는 암 줄기세포가 일반 암세포에 비해 항암제에 의해 괴사되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 그러므로 이 가설은 암 줄기세포 특이적인 항암제의 개발이라는 새로운 개념의 종양 연구 방향을 제시할 수 있다 사료된다.

다만, 현재 암줄기세포는 암줄기세포 표지자를 인식하는 항체와 MACS 또는 유세포 분류기를 이용하여 분리하는 것이 일반적이나 이에 한계점이 존재한다. 보다 구체적으로 암세포주에 따라 다양한 암줄기세포 표지자가 발현되는 특성으로 인하여 다양한 암줄기세포 연구를 수행하게 되는 경우 다양한 항체를 필요로 하게 되는데, 이에 따라 암세포주에 맞는 표지자를 이용해야한다는 점에서 암줄기세포 연구 수행 효율이 낮아지고, 필요로 하는 비용이 증가하게 된다는 한계점이 존재한다.

이에, 본 발명자들은 보다 효율적인 암줄기세포 분리방법을 찾던 중, 데그론 단백질 및 리포터 단백질을 이용하여 암줄기세포를 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 데그론(degron) 단백질 및 리포터 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 암줄기세포 스크리닝용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 (1) 상기 재조합 세포를 암세포주에 형질주입하는 단계; 및 (2) 상기 (1)에서 형질주입된 암세포주에서 리포터 단백질의 발현을 측정하는 단계;를 포함하는 암줄기세포 스크리닝 또는 분리 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 데그론(degron) 단백질 및 리포터 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 암줄기세포 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암줄기세포 스크리닝용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 암세포주에 형질주입하는 단계; 및 (2) 상기 (1)에서 형질주입된 암세포주에서 리포터 단백질의 발현을 측정하는 단계;를 포함하는 암줄기세포 스크리닝 또는 분리 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용한 리포터 단백질의 발현 분석을 통해 암줄기세포의 검출 및 분리를 효율적으로 수행할 수 있어, 기존의 암줄기세포 분리 방법에 비하여 상대적으로 저렴한 비용으로 고효율의 암줄기세포 검출 및 분리가 가능하다. 아울러, 본 발명의 재조합 백터는 암의 성장과 관련된 연구, 암의 재발 및 전이를 억제를 위한 암줄기세포 스크리닝 등 다양한 분야에서 제한 없이 활용될 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포 분리 과정의 개략도를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포 분리한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 스피어 배양(sphere culture)을 통한 암줄기세포 분리 효율을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 소프트 아가 배양(soft agar culture)을 통한 암줄기세포 분리 효율을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 노던 블롯 및 웨스턴 블롯을 이용한 암줄기세포 표지자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 면역형광염색법으로 분석한 암줄기세포 표지자의 발현을 그래프로 나타낸 도이다.
도 8은 면역형광염색법으로 분석한 암줄기세포 표지자의 발현을 공초점 현미경으로 관찰한 결과는 나타내는 도이다.
도 9는 방사선 처리한 암줄기세포를 본 발명에 따라 분리한 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 방사선 처리를 통한 본 발명에 따른 암줄기세포 분리 여부 및 효율을 확인한 결과를 나타내는 도이다.

본 발명은 데그론(degron) 단백질 및 리포터 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 암줄기세포 스크리닝용 조성물, 키트, 및 암줄기세포의 스크리닝 또는 분리 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 데그론 단백질 및 리포터 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서 '데그론'은 단백질 분해 속도 조절에 관여하는 단백질로, 오르니틴 탈카복실화 효소인 프로테아좀 표적 단백질로서 대부분의 단백질에 존재한다. 더욱이 데그론은 진핵생물뿐만 아니라 원핵생물에서도 발견되는 단백질로 다양한 생명체에서 발견되는 단백질이다. 이러한 데그론은 단백질의 분해에 관여하는 작은 단백질인 유비퀴틴 의존성, 또는 비의존성일 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 데그론은 유비퀴틴 의존성 단백질인 것을 특징으로 하며, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적으로 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 변이체 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 데그론 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 데그론 아미노산 서열의 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 서열 중 일부가 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 이를 통해 번역된 데그론 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 데그론 단백질과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 데그론 단백질을 암호화하는 아미노산 서열 또는 염기서열은 각 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인된다.

본 발명에 있어서, ‘리포터 단백질’은 생체 내에서 추적하기 어려운 물질들을 추적하기 위하여, 특히 시각화하기 위하여 사용되는 물질로, 형광 단백질을 포함하여 반딧불이 발광효소(firfly luciferase), 레닐라 발광효소(renilla luciferase) 또는 터보FP635(TurboFP6325), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 등이 존재하며, 본 발명에서는 형광 단백질인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 '형광 단백질'은 생체 내에서 빛을 내는 단백질을 통칭하는 것으로 녹색형광단백질(GFP), 강화된녹색형광단백질(EGFP), 청색형광단백질(CFG), 황색형광단백질(YFP), 강화된황색형광단백질(EYFP), 적색형광단백질(DsRed), 변형된시트린(mCitrine), 비너스(Venus), 변형된강화된청색형광단백질(mECFP), 세루린(Cerulean), 아주리트(Azurite) 및 변형된오렌지(mOrange)일 수 있으며, 바람직하게는 녹색형광단백질이나, 데그론을 암호화하는 서열과 함께 번역되어 형광을 발현할 수 있는 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형광단백질은 예를 들어, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있다.

본 발명에 있어서 '재조합 벡터'는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 일례로 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스성 벡터, 비-바이러스성 벡터를 이용할 수 있고, 바람직하게는 비-바이러스성 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 비-바이러스성 벡터를 이용하는 경우에는 바이러스성 벡터를 이용하는 경우와 달리 의도치 않은 위치에 염색체의 삽입일 일어날 가능성이 낮다. 따라서 비-바이러스성 벡터를 이용하는 경우 세포의 신호전달체계 및 활성 관찰 결과의 정확도가 보다 높아진다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 개열 지도를 가지고, 서열번호 4로 표시되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하나, 본 발명의 암 줄기세포 분리 효과를 달성할 수 있는 벡터의 구성이라면, 이에 제한되지 않는다.

[도]

상기 재조합 벡터는 인핸서, 전사조절인자, 복제 시작점, 추가적인 리포터 유전자, 추가적인 프로모터 등을 더 포함할 수 있으며, 상기 데그론 단백질 및 리포터 단백질의 발현을 방해하지 않고, 암 줄기세포 스크리닝에 도움이 될 수 있는 구성이면 어느 것이든 더 추가할 수 있다.

본 발명은 데그론 단백질 및 리포터 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 암줄기세포 스크리닝용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, '스크리닝'은 특정한 세포를 선별하는 조작에 관한 것으로, 암줄기세포를 특이적으로 검출하는 조작에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 암줄기세포는 유방암, 결장암, 자궁경부암, 위암, 침샘암, 폐암, 식도암, 방광암, 대장암, 뇌암, 피부암, 직장암, 췌장남, 혈액암, 구강암, 전립성암, 난소암, 갑상선암 또는 중추신경암에 대한 암줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 유방암, 결장암 또는 자궁경부암에 대한 암줄기세포일 수 있으나, 암세포주별로 특이적인 표지자를 사용하는 것이 아니라 생명체 대부분에서 발견되는 단백질의 성질을 이용한 것인바 검출할 수 있는 암줄기세포가 특정 암 종류에 제한되지 않는다. 이에 따라 암세포주 별로 다른 표지자를 사용할 필요가 없어 경제적이며 효율적이라는 이점이 있다.

상기 스크리닝용 키트는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 세포 분리에 사용되는, 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

상기 스크리닝용 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.

본 발명은 암줄기세포 스크리닝 또는 분리 방법을 제공한다.

일례로 (1) 본 발명에 따른 재조합 세포를 암세포주에 형질주입하는 단계; 및 (2) 상기 (1)에서 형질주입된 암세포주에서 리포터 단백질의 발현을 측정하는 단계;를 포함하여 암줄기세포를 스크리닝 또는 분리할 수 있다.

상기 리포터 단백질은 형광 단백질을 포함하여 반딧불이 발광효소(firfly luciferase), 레닐라 발광효소(renilla luciferase) 또는 터보FP635(TurboFP6325) 등이 존재하며, 본 발명에서는 형광 단백질인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (2) 단계에서 리포터 단백질의 발현을 측정하는 방법으로는 면역형광염색법, 형광공명에너지전이, 생체 영상 확인법, 핵의학 영상 확인법, 발광 영상 확인법 또는 형광 영상 확인법을 이용할 수 있다. 다만, 형광 영상 확인법을 이용하여 리포터 단백질의 발현을 측정하는 경우 세포의 활성에 영향을 미치는 확률이 현저히 낮으므로 형광 영상 확인법을 이용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

아울러 본 발명은 (3) 단계를 더 포함할 수 있는데, 구체적으로는 상기 (2)에서 리포터 단백질의 발현을 측정한 세포주 중 상위 6%, 보다 바람직하게는 0% 초과 5% 이하의 리포터 단백질 발현 세기를 나타내는 세포를 암줄기세포로 판단하는 단계;를 더 포함하는 단계이다. 상위 6%를 경계로 리포터 단백질의 발현 세기를 나타내는 세포가 현저히 감소하며, 이 범위 내에서 상기 단백질의 발현 신호를 강하게 나타내는 세포를 암줄기세포로 판단한 후 이를 암줄기세포로서 분리할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (3)에서 확인한 암줄기세포 이후 암줄기세포 분리시에 다양한 세포 분리 방법 중의 하나인 MACS, 유세포 분리기(flow cytometry) 또는 FACSaria를 사용할 수 있고, 바람직하게는 FACSaria를 사용할 수 있으나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

상기에서 분리한 암줄기세포는 추후 암의 성질과 관련된 연구에 사용될 수 있으며, 암의 재발 및 전이 억제를 위하여 본 발명의 암줄기세포 분리 방법을 이용하는 등 본 발명은 암줄기세포와 관련된 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 데그론을 포함하는 재조합 벡터 제조

암줄기세포를 스크리닝하기 위해 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 재조합 벡터를 제조하였다. 먼저, pEGFP-c1 벡터에 종결코톤(UAA, UAG 또는 UGA)을 제외한 서열번호 2로 표시되는 데그론(degron) 단백질을 암호화하는 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 녹색 형광 단백질을 암호화하는 염기서열이 결합된 DNA인 pEGFP-oDC1를 구축하였다. 이 후 이 기술분야에 통상의 유전자 클로닝 기법을 이용하여 상기 DNA를 BamHI, XbaI 제한효소로 처리하고, 37 도의 온도에서 16 시간 동안 방치하였다. 상기 방법으로 제조된 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 재조합 벡터의 개열지도는 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 데그론을 포함하는 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포 분리

상기 실시예 1에서 제조한 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 재조합 벡터를 이용하여 암줄기세포의 분리가 가능한지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저, 대표적인 결장암 세포주인 RKO 세포주, 대표적인 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주 및 대표적인 유방암 세포주인 MCF7 세포주에 각각 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터를 형질주입하였다. 이 후 상기 세포주를 포함하는 배지에 항생물질인 G418을 0.5 내지 1 mg/ml로 첨가하였고, 상온에서 7일간 배양하여 안정한 세포주를 구축하였다. 상기 형질주입된 세포주에 4 Gy 방사선을 조사하였고, 조사한 후 상위 1 내지 1.5% 이내의 강한 녹색 형광의 신호를 나타내는 세포주를 확인하였고, 이를 세포분리기인 FACSaria 기기(BD biosciences사)를 이용하여 분리하였다. 분리 과정의 개략도를 도 2에 나타내었고, 분리한 결과는 도 3에 나타내었다.

실험예 1. 배양 분석을 통한 암줄기세포 분리 여부 및 효율 확인

본 발명의 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포의 분리 여부 및 효율을 확인하기 위하여, 암줄기세포인 RKO 세포주의 스피어 배양(sphere culture) 및 소프트 아가 분석(soft agar assay)을 수행하였다. 먼저, 스피어 배양을 위하여 이 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 상기 실시예 2에서 FACSaria 기기로 분리한 RKO 세포주 중 녹색 형광을 나타내는 암세포주와 녹색 형광을 나타내지 않는 암세포주를 암줄기세포 배지에서 배양하였다. 배양 후 7일이 경과한 후 광학 현미경으로 배양 양상을 관찰하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 FACSaria 기기로 분리한 RKO 세포주 중 녹색 형광을 나타냈던 세포주는 암줄기세포와 같이 스피어 형태로 배지에서 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 녹색 형광을 나타내는 세포주가 암줄기세포임을 의미하며, 동시에 본 발명을 통하여 암줄기세포의 검출 및 분리가 가능함을 나타낸다.

아울러, 소프트 아가 분석을 위하여 상기 실시예 2에서 FACSaria 기기로 분리한 RKO 세포주 중 녹색 형광을 나타내는 암세포주 50개 및 녹색 형광을 나타내지 않는 암세포주 50개를 소프트 아가 배지에서 배양하였다. 배양 후 14일이 경과한 후 광학 현미경으로 배지 내 세포주의 배양 양상을 관찰하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 녹색 형광을 나타내는 세포주는 녹색 형광을 나타내지 않았던 세포주에 비하여 보다 많은 수의 콜로니를 형성함을 확인할 수 있었다. 이는 녹색 형광을 나타내는 세포주가 암줄기세포임을 의미하며, 동시에 본 발명을 통하여 암줄기세포의 검출 및 분리가 가능함을 나타낸다.

실험예 2. 암줄기세포 표지자를 이용한 암줄기세포 분리 여부 및 효율 확인

2-1. 노던 블롯 및 웨스턴 블롯을 이용한 암줄기세포 표지자의 발현 비교

본 발명의 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포의 분리 효율을 확인하기 위하여, 노던 블롯(northern blot) 및 웨스턴 블롯(western blot)을 통하여 RKO 및 HeLa 암줄기세포주의 표지자인 세포 표면의 CD13와 MCF7 세포주의 표지자인 세포 내 Nanog 및 SOX2의 유전자 및 단백질 수준에서의 발현 여부를 확인하였다.

보다 구체적으로 노던 블롯 및 웨스턴 블롯은 이 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 프로토콜을 이용하였으며, 상기 실시예 2에서 분리한 형질주입한 결장암 세포주인 RKO 세포주, 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주 및 유방암 세포주인 MCF7 세포주에서 CD13, Nanog 및 SOX2의 발현 여부를 확인하였다. 16S rRNA는 mRNA에 대한 대조군으로, β-액틴은 단백질에 대한 대조군으로 사용되었다. 상기 실험 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, MCF7 세포주 중 녹색 형광을 나타내어 분리된 세포주에서 Nanog 및 SOX2의 mRNA 및 단백질 수준이 높게 발현되고, RKO 및 HeLa 세포주 중 녹색 형광을 나타내어 분리된 세포주에서 CD133의 mRNA 및 단백질 수준이 높게 발현됨을 확인됨을 알 수 있다. 이를 통해 단백질 수준 뿐만 아니라 유전자 수준에서도 암줄기세포에 특이적인 마커인 Nanog, SOX2 및 CD133의 발현이 조절됨을 확인하였으며, 상기 결과는 실시예 2에서 형광 발현 분석을 통해 분리된 세포주가 암줄기세포에 해당함을 뒷받침하고, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 암줄기세포의 검출 및 분리가 용이함을 나타낸다.

2-2. 면역형광염색법으로 분석한 암줄기세포 표지자의 발현 비교

본 발명의 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포의 분리 효율을 확인하기 위하여, 면역형광염색법을 수행하여 RKO 및 HeLa 암줄기세포주의 표지자인 세포 표면의 CD133 및 MCF7 세포주의 표지자인 세포 내 Nanog의 단백질 수준에서의 발현 여부를 확인하였다.

우선, 이 기술 분야에서 통상적으로 수행하는 면역형광법으로 실시예 2에서 분리한 형질주입된 RKO는 Nanog로, HeLa 및 MCF7 세포주는 CD133으로 염색하였고, 이 후 유세포측정기(flow cytometry; 디텍터(detector)로 FL2를 이용)를 이용하여 각 세포주에서 특이적인 마커들이 나타내는 신호를 확인한 후, 이를 그래프로 나타낸 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 상기 면역형광염색법을 수행한 세포주를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 7 및 8에 나타낸 바와 같이, MCF7 세포주에서는 Nanog의 신호가 증가하고, 특히 실시예 2에서 녹색 형광으로 분리한 세포주에서 현저하게 나타남을 확인하였다. 또한 RKO 및 HeLa 세포주에서는 CD133의 신호가 증가하고, 특히 실시예 2에서 녹색 형광으로 분리한 세포주에서 현저하게 나타남을 확인하였다. 이는 실시예 2에서 녹색 형광의 발현 분석을 통해 상기 분리한 세포주가 암줄기세포에 해당함을 뒷받침하며, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 암줄기세포의 검출 및 분리가 용이함을 나타낸다.

실험예 3. 방사선 처리를 통한 암줄기세포 분리 여부 및 효율 확인

본 발명의 재조합 벡터를 이용한 암줄기세포의 분리 효율을 확인하기 위하여 암세포에 비하여 암줄기세포에서 정상 및 저산소 환경에서의 방사선에 대한 저항성이 높다는 사실을 바탕으로 클론형성 생존 분석(clonogenic survival assay)를 통하여 암줄기세포인 RKO 세포주의 방사선 민감도를 측정하였다.

이를 위하여 먼저, 상기 실시예 2에서 제조한 형질주입된 RKO 세포주에 라이브 앤 데스 키트(Live & Death kit)를 이용하여 제작자의 메뉴얼에 따라 염색을 수행하였고, 이 후 0 내지 4 Gy 방사선을 조사하였다. 이 후 암줄기세포를 나타내는 녹색 형광을 띠는 세포 중 라이브 앤 데스 키트에 의하여 사멸한 세포를 나타내는 붉은 형광을 띠는 세포를 제외하고 방사선에 의하여 생존한 세포를 FACSaria 기기로 분리하였다. 분리한 세포는 도 9에 나타내었다. 이 후 상기 분리한 세포주에 대하여 이 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 클론형성 생존 분석(clonogenic survival assay)을 수행하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, RKO 세포주와 RKO 암줄기세포주 모두에서 정상 산소 환경과 비교하여 저산소 환경에서 방사선 저항성이 증가되며, RKO 암줄기세포주가 RKO 세포주에 비하여 보다 높은 방사선 저항성을 가짐을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 형질주입시킨 세포주 중 높은 형광 발현을 나타내는 세포가 암줄기세포이며, 이에 따라 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용하여 암줄기세포의 검출 및 분리가 용이함을 나타낸다.

종합적으로, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 이용한 리포터 단백질의 발현 분석을 통해 암줄기세포의 검출 및 분리를 효율적으로 수행할 수 있어, 기존의 암줄기세포 분리 방법에 비하여 상대적으로 저렴한 비용으로 고효율의 암줄기세포 검출 및 분리가 가능하다. 아울러, 본 발명의 재조합 백터는 암의 성장과 관련된 연구, 암의 재발 및 전이를 억제를 위한 암줄기세포 스크리닝 등 다양한 분야에서 제한 없이 활용될 수 있다는 이점이 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> Inha University Research and Business Foundation <120> Recombinant vector comprising degron and method of separating for cancer stem cell using thereof <130> 1-206p <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence coding for degron protein <400> 1 Gln Arg Pro Thr Ile Tyr Tyr Val Met Ser Gly Pro Ala Trp Gln Leu 1 5 10 15 Met Gln Gln Phe Gln Asn Pro Asp Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln 20 25 30 Asp Ala Ser Thr Leu Pro Val Ser Cys Ala Trp Glu Ser Gly Met Lys 35 40 45 Arg His Arg Ala Ala Cys Ala Ser Ala Ser Ile Asn Val 50 55 60 <210> 2 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence coding for degron protein <400> 2 cagaggccga cgatctacta tgtgatgtca gggcctgcgt ggcaactcat gcagcaattc 60 cagaaccccg acttcccacc cgaagtagag gaacaggatg ccagcaccct gcctgtgtct 120 tgtgcctggg agagtgggat gaaacgccac agagcagcct gtgcttcggc tagtattaat 180 gtgtag 186 <210> 3 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence coding for fluorescent protein <400> 3 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780 tccaccggat ctagataa 798 <210> 4 <211> 4911 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence for the entire recombinant vector <400> 4 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600 ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 660 gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 720 gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 780 ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 840 gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 900 cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 960 ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 1020 atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 1080 aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1140 gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1200 cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1260 gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1320 ctgtacaagt ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc 1380 gcgggcccgg gatcccagag gccgacgatc tactatgtga tgtcagggcc tgcgtggcaa 1440 ctcatgcagc aattccagaa ccccgacttc ccacccgaag tagaggaaca ggatgccagc 1500 accctgcctg tgtcttgtgc ctgggagagt gggatgaaac gccacagagc agcctgtgct 1560 tcggctagta ttaatgtgta gtctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta 1620 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1680 aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1740 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1800 aaactcatca atgtatctta acgcgtaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc 1860 gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc 1920 ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag 1980 tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga 2040 tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc 2100 actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa 2160 cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt 2220 agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 2280 gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2340 acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 2400 aaaaaggaag agtcctgagg cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 2460 ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 2520 gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 2580 ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 2640 cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 2700 gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 2760 ggcttttgca aagatcgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 2820 tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 2880 acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 2940 ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag acgaggcagc 3000 gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 3060 tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 3120 tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 3180 gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 3240 tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 3300 cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt 3360 cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 3420 attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 3480 ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 3540 tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 3600 agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 3660 ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc 3720 ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccctaggggg 3780 aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat gacggcaata 3840 aaaagacaga ataaaacgca cggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg ggttcggtcc 3900 cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt ggggccaata cgcccgcgtt 3960 tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac 4020 gtcggggcgg caggccctgc catagcctca ggttactcat atatacttta gattgattta 4080 aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 4140 aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 4200 ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 4260 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 4320 actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 4380 caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 4440 gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 4500 ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 4560 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 4620 cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 4680 acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 4740 ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 4800 gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 4860 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgccatgca t 4911

Claims (12)

1. 데그론(degron) 단백질 및 리포터 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는, 재조합 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 데그론 단백질은 유비퀴틴 의존성 단백질인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 데그론 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 데그론 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 리포터 단백질은 반딧불이 발광효소(firfly luciferase), 레닐라 발광효소(renilla luciferase), 터보FP635(TurboFP6325), 레닐라 발광효소, 녹색형광단백질(GFP), 강화된녹색형광단백질(EGFP), 청색형광단백질(CFG), 황색형광단백질(YFP), 강화된황색형광단백질(EYFP), 적색형광단백질(DsRed), 변형된시트린(mCitrine), 비너스(Venus), 변형된강화된청색형광단백질(mECFP), 세루린(Cerulean), 아주리트(Azurite) 및 변형된오렌지(mOrange)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 비-바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 개열 지도를 가지는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
   [도]
   

   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 포함하는, 암줄기세포의 스크리닝용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 암줄기세포는 유방암, 결장암, 자궁경부암, 위암, 침샘암, 폐암, 식도암, 방광암, 대장암, 뇌암, 피부암, 직장암, 췌장남, 혈액암, 구강암, 전립성암, 난소암, 갑상선암, 중추신경암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 암에 대한 암줄기세포인 것인, 암줄기세포 스크리닝용 조성물.
   
10. 제8항의 조성물을 포함하는, 암줄기세포 스크리닝용 키트.
    
11. (1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 암세포주에 형질주입하는 단계; 및
    (2) 상기 (1)에서 형질주입된 암세포주에서 리포터 단백질의 발현을 측정하는 단계;를 포함하는, 암줄기세포 스크리닝 또는 분리 방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    (3) 상기 (2)에서 리포터 단백질의 발현을 측정한 세포주 중 상위 0% 초과 6% 이하의 발현 세기를 나타내는 세포를 암줄기세포로 판단하는 단계;를 추가적으로 포함하는, 암줄기세포 스크리닝 또는 분리 방법.
    
    
    

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