KR20180091769A

KR20180091769A - 섬유화 반응 억제용 보형물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20180091769A
Application number: KR1020180015059A
Authority: KR
Inventors: 고원건; 차성호; 유병용; 허찬영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 서울대학교병원
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-08-16
Also published as: KR102051983B1

Abstract

본 발명에 따른 보형물은 기공이 형성된 표면에 다층 박막이 코팅된 보형물에 관한 것으로, 상기 보형물을 이식하게 되면 다층 박막에 의해 일차적으로 섬유화 반응을 억제시킬 수 있고, 보형물 표면에 형성된 기공에 의한 거칠기로부터 이차적으로 섬유화 반응을 예방 또는 억제시킬 수 있으므로, 보다 효과적으로 섬유화 반응을 억제하고 구형 구축을 예방할 수 있다.

Description

섬유화 반응 억제용 보형물 및 이의 제조방법{Implant for inhibiting fibrosis and method for preparing thereof}

본 발명은 다층 박막이 코팅된 보형물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 막 유화법으로 제조된 입자에 의해 기공이 형성된 보형물의 표면에 다층 박막을 코팅하여, 상기 다층 박막 및 보형물의 표면에 형성된 기공을 통해 섬유화를 예방할 수 있는 보형물에 관한 것이다.

실리콘 보형물은 유방암의 치료로 인해 유방 재건이 필요한 환자 또는 미용을 목적으로 하는 유방 성형에 쓰인다. 유방암은 현대시대에 들어 꾸준히 증가하고 있으며, 특히 한국은 OECD 국가들 중 유방암 발병률이 가장 높다. 유방 성형 역시 그 수요가 크게 증가하고 있는 추세이다. 하지만 유방 재건 또는 성형을 위해 실리콘 보형물을 삽입하게 되면 인체는 이를 외부 물질로 인식하여 면역 반응을 일으키게 된다. 이로 인해 실리콘 보형물을 인체 내 섬유로 둘러싸게 되는 섬유화 반응이 일어나고, 이는 실리콘 보형물에 의한 부작용들 가운데 가장 발생 빈도가 높은 부작용으로 보고되었다.

현재는 실리콘 보형물에 의해 발생하는 섬유화 반응을 막기 위해 보형물 이식 후 짧게는 2주, 길게는 1년까지 섬유화 억제 약물 경구 복용을 권유하고 있지만 이는 환자에게 경제적 부담과 약물에 의한 2차 부작용의 문제를 가지고 있다. 또 다른 방법으로는 표면에 기공이 존재하는 실리콘 보형물을 삽입하는 방법이 있다. 보형물 표면에 존재하는 기공에 생체 조직이 성장할 수 있도록 하여 섬유화를 감소시키는 것이다. 하지만 이러한 기공이 있는 텍스쳐 타입의 실리콘 보형물 역시 섬유화 반응을 완벽하게 방지하지 못하여 약물전달 시스템이나 생체적응 소재 등을 혼합하는 연구들이 진행되고 있다.

이에 따라, 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자들을 이용하여 실리콘 보형물의 표면을 더욱 생체에 적합하도록 개질시키는 기술들이 연구되고 있다.

한국 등록특허 제10-1288115호(2013.07.08.)

본 발명의 목적은 보형물의 이식 후 유발되는 구형 구축 및 섬유화 반응을 예방 또는 억제하기 위한 보형물 및 상기 보형물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 구형 구축을 유발하는 과도한 섬유화 반응을 억제시키기 위한 보형물의 표면 개질 방법을 연구하던 중, 기공이 형성된 표면에 다층 박막이 코팅된 보형물을 이식하게 되면 다층 박막에 의해 일차적으로 섬유화 반응을 억제시킬 수 있고, 보형물 표면에 형성된 기공에 의한 거칠기로부터 이차적으로 섬유화 반응을 예방 또는 억제시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은,

막 유화법으로 제조된 입자에 의해 표면에 기공이 형성된 보형물; 및

상기 보형물의 표면에 양이온 물질로 적층된 양이온 물질층 및 상기 양이온 물질층 상에 음이온 물질로 적층된 음이온 물질층을 포함하는 다층 박막이 코팅된 섬유화 반응 억제용 보형물을 제공한다.

이하. 본 발명의 구성을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에서, 용어 "구형 구축(capsular contracture)"은 이식된 보형물의 주변의 피막이 과도한 섬유화로 인해 두껍고 단단하게 형성되는 현상을 의미하는 것으로, 보형물 이식 시 발생하는 부작용 중 하나이다. 본 발명에 있어서, 상기 보형물은 이식 후 과도한 섬유화 반응을 억제시킴으로써 구형 구축을 예방할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "보형물"은 피부 함몰부 또는 주름 등으로 패인 부위에 이용이 가능하며, 미용 목적의 볼륨감 향상을 위해 이용 가능한 이식물을 모두 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 보형물은 유방 재건 수술 또는 미용 목적을 위한 가슴 성형 수술시 유방의 형태나 크기를 보존하는 용도의 의료용 보형물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 보형물은 실리콘 또는 폴리우레탄으로 형성되는 보형물일 수 있다. 상기 보형물은 통상의 실리콘 백 보형물, 실리콘 겔 보형물, 코헤시브 실리콘 겔 보형물 또는 폴리텍 보형물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 상기 보형물은 실리콘 보형물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 보형물의 표면에 기공을 형성하기 위해서 막 유화법으로 제조된 입자를 사용할 수 있다. 구체적으로, 보형물의 표면에 상기 입자를 부착한 후 열을 가해 입자를 녹임으로써 보형물의 표면에 기공을 형성할 수 있다. 이때, 상기 입자는 종류가 특별히 제한되는 것은 아니며 물 또는 유기용매에 쉽게 녹을 수 있는 것이라면 모두 적용할 수 있다. 또한 상기 입자는 직경이 10 내지 150㎛, 예컨대 15 내지 140㎛, 20 내지 130㎛, 25 내지 120㎛, 30 내지 110㎛, 35 내지 100㎛의 입자를 포함할 수 있다. 상기와 같은 직경의 입자를 통해 표면에 기공을 형성한 보형물을 이식하는 경우, 작고 일정한 크기의 기공으로부터 섬유화 반응을 억제할 수 있고, 이에 따라 구형 구축을 예방할 수 있다.

본 발명에 있어서, 막 유화법으로 제조된 입자는 통상의 막 유화법을 적용하여 얻은 것일 수 있다. 상기 막 유화법에서 사용되는 유화막은 예컨대, 세공 크기가 10 내지 30㎛인 막을 이용할 수 있으며, SPG(shirasu porous glass) 막을 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 상기 SPG 막을 이용한 막 유화법으로 입자를 제조하는 경우 일정한 크기의 입자가 제조 가능하므로, 상기 입자를 부착한 보형물은 균일하면서도 미세한 기공을 가질 수 있어 상기 기공으로부터 섬유화 반응의 억제 효과를 극대화시킬 수 있다.

따라서, 상기 입자로부터 보형물의 표면에 형성되는 기공은 직경이 10 내지 150㎛, 예컨대 15 내지 140㎛, 20 내지 130㎛, 25 내지 120㎛, 30 내지 110㎛, 35 내지 100㎛일 수 있으며, 입자의 크기에 따라 기공의 크기를 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 표면에 기공이 형성된 보형물의 표면에 다층 박막이 코팅된 보형물을 포함한다. 상기 다층 박막은 양이온 물질로 적층된 양이온 물질층 및 상기 양이온 물질층 상에 음이온 물질로 적층된 음이온 물질층을 포함한다.

본 발명에 있어서, 양이온 물질과 음이온 물질은 섬유화 반응을 감소시킬 수 있는 천연고분자로서, 상기 양이온 물질은 폴리 L-라이신(poly L-lysine; PLL), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI), 폴리아미도아민(polyamidoamine; PAA), 폴리아미노에스터(polyaminoester; PAE), 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트](poly[2-(N,N-dimethylamino)ethylmetacrylate]; PDMAEMA), 양이온성 셀룰로오스(cationic cellulose), 양이온성 덱스트린(cationic dextrin) 및 젤라틴(gelatin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으며, 예컨대 폴리 L-라이신일 수 있다. 상기 음이온 물질은 히알루론산(hyaluronic acid), 알지네이트(alginate), 알부민(albumin), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 소듐 알지네이트(sodium alginate), 폴리 감마-글루탐산(poly γ-glutamic acid), 폴리 아스파트산(poly aspartic acid), 폴리 스티렌 설포네이트(poly styrene sulfonate), 폴리 프탈릭 에틸렌 글리콜 에스터(poly phthalic ethylene glycol ester), 폴리 설포네이티드 아닐린(poly sulfonated aniline) 및 폴리 알릴아민 하이드로젠 클로라이드(poly allyamine hydrogen chloride)로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으며, 예컨대 히알루론산일 수 있다.

본 발명에 따른 보형물은 상기 양이온 물질층과 음이온 물질층을 층상 자기조립법을 통해 코팅하는 것일 수 있으며, 보형물의 표면에 산소로 플라즈마 처리하여 음의 전하를 띄도록 한 후, 전자기적 인력을 통해 양이온 물질층과 음이온 물질층이 스스로 결합하여 코팅된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 섬유화 반응 억제용 보형물은 상기 다층 박막 상에 약물층을 추가로 코팅하는 것일 수 있다. 상기 약물층의 약물은 보형물의 이식 시 섬유화 반응을 억제시킬 수 있는 약물을 포함할 수 있으며, 예컨대, 트라닐라스트(tranilast), 피르페니돈(pirfenidone), 마이토마이신(mitomycin), 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 제니스테인(genistein), 셀레노시스테인(selenocystine), 트리암시놀론 아세토니드(Triamcinolone acetonide), 토실산 스프라타스트(Suplatast tosilate) 및 몬테루카스트(Montelukast)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 섬유화 억제제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물층을 코팅하는 단계는 층상 자기조립법과 같이 전자기적 인력에 의해 코팅될 수 있으며, 약물이 용해된 용액에 보형물을 담지하는 것을 통해 보형물의 표면에 코팅될 수 있으나, 통상적인 코팅법을 이용하여 보형물의 표면에 코팅되는 것을 모두 포함할 수 있다.

하기 실시예에서는, 상기와 같은 실리콘 보형물(폴리디메틸실록산)의 생체적합성이 우수하고, 적은 세포 독성을 나타내며, 섬유화 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다. 또한, 마우스 모델에 상기 보형물을 이식한 결과, 보형물 표면의 미세한 기공에 의해 염증 반응이 낮게 나타났으며, 섬유화 반응에 관여하는 TGF-β, 섬유아세포(fibroblast), 근섬유아세포(myofibroblast)의 수치 역시 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은,

막 유화법으로 제조된 입자로부터 보형물의 표면에 기공을 형성하는 단계; 및

표면에 기공이 형성된 보형물 상에 양이온 물질로 적층된 양이온 물질층과 음이온 물질로 적층된 음이온 물질층을 포함하는 다층 박막을 코팅하는 단계를 포함하는 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에 있어서, 막 유화법으로 제조된 입자, 보형물 및 다층 박막은 위에 기술한 내용을 모두 적용 또는 준용할 수 있다.

구체적으로 상기 제조방법은 막 유화법으로 제조된 입자로부터 보형물의 표면에 기공을 형성하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 폴리스티렌 용액을 막에 통과시켜 중합하여 입자를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 폴리스티렌 용액은 용매 중에 폴리스티렌을 용해시켜 얻을 수 있으며, 상기 용매는 폴리스티렌을 용해할 수 있는 용매 예컨대, 메틸렌클로라이드(DCM), 아세톤(acetone), 메탄올(methanol)과 같은 유기용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 막은 세공 크기가 20 내지 50㎛인 유화막을 사용할 수 있으며, 통상의 막 유화법을 이용하여 입자를 제조할 수 있다. 구체적으로, 폴리스티렌 용액을 불연속상으로 하여 유화막에 통과시키고 연속상 내에 구형의 방울(droplet)로 분산되어 있도록 하였다. 이때, 0.5kPa 내지 3.0kPa의 압력 및 100 내지 300rpm의 교반 속도의 조건으로 유화막에 상기 폴리스티렌 용액을 통과시킬 수 있고, 이에 따라 입자의 크기를 조절할 수 있다. 상기 방울이 분산되어 있는 용액은 용매를 제거한 후 70℃ 내지 100℃에서 12 내지 36시간 동안 건조함으로써 분말 형태의 입자를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 입자로부터 보형물의 표면에 기공을 형성하는 단계는, 실리콘 또는 폴리우레탄으로 형성되는 보형물을 완전히 경화시키기 전에 보형물의 표면에 입자를 균일하게 분사하고 압력을 가하는 단계; 및 상기 보형물을 30℃ 내지 50℃에서 완전히 경화시키는 단계일 수 있다.

상기 제조방법에서, 실리콘 또는 폴리우레탄으로 형성되는 보형물은 보형물의 재질 또는 재료에 따라 경화 온도를 조절할 수 있으며, 예컨대 70℃ 내지 90℃일 수 있다.

상기 단계에서, 입자를 부착하기 전에 보형물을 완전히 경화시키게 되면 입자가 부착되기 어렵고, 보형물을 경화시키기 전에 약물 입자를 부착하게 되면 입자가 실리콘 또는 폴리우레탄에 묻히게 되므로, 실리콘 또는 폴리우레탄이 완전히 경화되기 전에 입자를 분사하는 단계를 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 상기 약물 입자는 분사한 후 압력을 가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이때 보형물에 가하는 압력은 실리콘 또는 폴리우레탄으로 형성되는 보형물의 표면에 입자가 박힐 수 있는 정도라면 제한되는 것은 아니며, 이는 보형물의 재질, 보형물이 견딜 수 있는 응력, 입자 등에 따라 통상의 기술자가 적의적절하게 압력을 조절할 수 있다.

상기와 같은 과정을 거침으로써, 입자가 보형물의 표면에 박혔다가 녹는 과정을 통해 표면에 기공을 형성할 수 있으며, 보형물에 거칠기를 부여할 수 있다.

또한, 상기 제조방법은 표면에 기공이 형성된 보형물 상에 다층 박막을 코팅하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 보형물 상에 양이온 물질을 층상 자기조립법으로 적층시켜 양이온 물질층을 형성하는 단계 및 상기 양이온 물질층 상에 음이온 물질을 층상 자기조립법으로 적층시켜 음이온 물질층을 형성하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 양이온 물질층과 음이온 물질층은 교대로 1회 이상 반복하여 다층 박막을 형성할 수 있다. 상기 보형물은 산소로 플라즈마 처리하여 표면이 음의 전하를 가지도록 처리하는 단계를 포함한다. 그 다음으로, 양의 전하를 띄는 물질(양이온 물질) 용액을 보형물의 표면에 양이온 물질이 결합되도록 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계는 양이온 물질 용액에 보형물을 5 내지 20분간 침지시킨 뒤, 워싱 용액에 5 내지 20분간 침지시키는 단계이다. 이 후, 양이온 물질이 코팅된 보형물에 음의 전하를 띄는 물질(음이온 물질) 용액을 음이온 물질이 보형물에 결합되도록 유도하여 보형물의 표면에 다층 박막을 코팅할 수 있다. 상기 단계는 음이온 물질 용액을 사용하는 것을 제외하고는 양이온 물질이 결합되도록 유도하는 단계와 동일하게 수행될 수 있다. 상기와 같은 과정을 반복하여 수행함으로써 표면에 양이온 물질층과 음이온 물질층의 다층 박막이 코팅된 보형물을 얻을 수 있다. 상기와 같이 섬유화 반응을 감소시키는 천연 고분자를 보형물의 표면에 코팅함으로써, 섬유화 반응을 일차적으로 억제시킬 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 보형물은 체내에 이식시 표면에 코팅된 다층 박막을 통해 일차적으로 섬유화 반응을 억제할 수 있고, 막 유화법으로 제조된 입자로부터 보형물의 표면에 기공이 형성되어 거칠기를 부여할 수 있어 이차적으로 섬유화 반응을 억제할 수 있으므로, 보다 효과적으로 섬유화 반응을 억제하고 구형 구축을 예방할 수 있다.

도 1 내지 3은 SPG 막의 크기(20㎛, 30㎛, 50㎛)에 따른 폴리스티렌 입자를 SEM을 통해 관찰한 사진이다.
도 4는 폴리스티렌 입자에 의해 형성된 폴리디메틸실록산(PDMS) 표면의 기공 크기를 관찰한 사진이다.
도 5는 폴리디메틸실록산 표면의 다층 박막의 두께를 ellipsometer를 이용하여 측정한 그래프이다.
도 6은 막 유화법으로 제조된 입자로부터 보형물의 표면에 기공을 형성하고, 다층 박막을 코팅하는 과정을 도시화한 것이다.
도 7은 표면에 기공을 갖는 폴리디메틸실록산, 다층 박막을 처리한 폴리디메틸실록산의 CKK-8 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 표면에 기공을 갖는 폴리디메틸실록산, 다층 박막을 처리한 폴리디메틸실록산에서 immunostaining을 통해 세포 형태를 관찰한 결과이다.
도 9는 표면에 기공을 갖는 폴리디메틸실록산, 다층 박막을 처리한 폴리디메틸실록산에서의 TGF-β 방출 정도를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 모델에 삽입할 본 발명의 실리콘 보형물(폴리디메틸실록산) in vivo 샘플이다.
도 11은 본 발명의 실리콘 보형물 샘플을 삽입한 마우스 모델의 염증 반응을 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실리콘 보형물 샘플을 삽입한 마우스 모델의 캡슐 관련 인자(TGF-β, 섬유아세포 수 및 근섬유세포 수)를 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실리콘 보형물 샘플을 삽입한 마우스 모델의 콜라겐 밀도를 측정한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실리콘 보형물 샘플을 삽입한 마우스 모델의 캡슐 두께를 측정한 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 1] 막 유화법을 이용한 입자의 제조 및 입자 크기 확인

1) 폴리스티렌 입자의 제조

하기 표 1과 같은 조건으로 SPG 막 유화법을 이용하여 약 38㎛, 72㎛, 100㎛ 입자를 제작하였다. 불연속상으로 폴리스티렌(polystyrene)을 용매 메틸렌클로라이드(methylene chloride)에 녹인 용액을 준비하고, 연속상으로 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate)이 포함된 물 20ml를 이용하여 SPG 막 유화법으로 폴리스티렌 입자를 제조하였다. 입자 내에 남아있는 용매를 제거하기 위해 입자가 분산되어 있는 연속상 용액을 2,000rpm으로 1분 동안 원심분리하여 입자를 용액과 분리한 후, 상층액을 버리고 DW를 이용하여 입자를 다시 분산시켰다. 입자가 분산된 용액은 2,000rpm으로 1분 동안 2회 원심분리하여 입자를 세척하였다. 다음으로, 입자를 80℃에서 overnight하여 건조시킴으로써 분말 형태의 입자를 얻었다.

입자 직경 (㎛)	막의 기공 크기 (㎛)	임계압력 (kPa)	불연속상 (w/v%)	연속상 (w/v%)	교반 속도 (rpm)
38	20	1.6	22.5	3	250
70	40	1.2	15	3	250
100	50	1.3	30	3	250

2) 입자의 크기 확인

1)에서 제조한 입자의 크기를 알아보기 위해, 주사전자현미경(SEM)으로 입자를 관찰하고 그 크기를 측정하였다. 도 1 내지 3은 입자의 모양 및 크기를 SEM을 통해 관찰한 결과이며, 각각의 SPG 막 크기에 따른 입자의 직경을 표 2에 나타내었다.

SPG 막	20㎛	30㎛	50㎛
입자의 직경	38.97㎛	72.25㎛	100.05㎛

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 입자의 크기는 20㎛, 30㎛, 50㎛의 친수성 막을 이용함에 따라 각각 이의 약 1.5 내지 2.5배에 해당하는 38.97㎛, 72.25㎛, 100.05㎛의 크기를 나타내는 것을 확인하였으며, SPG 막 유화법으로 제조함으로써 매우 균일한 크기 분포를 가지는 입자를 제조할 수 있음을 확인하였다. 또한, SPG 막을 이용하여 입자 제조시, 입자의 크기는 유상의 농도로 인한 점도가 가장 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.

[ 실시예 2] 보형물의 제조

1) 기공이 형성된 보형물의 제조

폴리디메틸실록산(PDMS)의 전구체인 sylgard 184 A:sylgard 184 B=10:1로 섞은 용액을 유리판 위에 일정량 도포한 뒤 80℃ 오븐에서 17분 30초 내지 18분간 일부분 경화시키고, 상기 실시예 1의 1)에서 제조한 입자를 폴리디메틸실록산에 균일하게 분사시켜 손으로 압력을 주어 입자가 폴리디메틸실록산 표면에 박힐 수 있도록 하였다. 이 후, 80℃ 오븐에서 overnight 시켜 완전히 경화시킨다. 경화가 끝난 폴리디메틸실록산은 클로로포름을 이용하여 표면에 박혀있는 폴리스티렌 입자를 녹여주어 입자가 녹으면서 박혀있던 자국으로 인해 폴리디메틸실록산에 기공을 형성하였다. 표면에 기공이 형성된 폴리디메틸실록산을 SEM을 통해 관찰한 사진을 도 4에 나타내었으며 아래 표 3에 입자에 의해 형성된 기공의 크기를 나타내었다.

SPG 막	20㎛	30㎛	50㎛
기공의 직경	37.16±1.38 ㎛	70.22±3.26 ㎛	97.64±5.21 ㎛

2) 다층 박막이 코팅된 보형물의 제조

1)에서 제조한 폴리디메틸실록산은 10분 동안 산소로 플라즈마 처리를 하여 표면이 음의 전하를 띄도록 유도하였다. 이후 DW를 NaCl 0.15mM을 녹이고, NaOH와 HCl을 이용하여 pH를 6.0~6.5로 맞춘 용액 100ml에 폴리 L-라이신 100mg을 용해한 용액에 상기 폴리디메틸실록산을 10분 동안 담지하여 전자기적 인력을 통해 보형물의 표면에 폴리 L-라이신이 코팅되도록 하였다. 이후, DW에 NaCl 0.15mM을 녹이고 NaOH와 HCl을 이용하여 pH를 6.0~6.5로 맞추어 준 워싱용액에 다시 10분 동안 폴리디메틸실록산을 침지시켰다. 폴리 L-라이신이 코팅된 보형물은 용매(상기 워싱용액) 100ml에 히알루론산 100mg을 용해한 용액에 10분 동안 침지시켜 전자기적 인력을 통해 보형물의 표면에 히알루론산을 코팅하고, 이러한 과정을 3번 반복함으로써 다층 박막이 코팅된 폴리디메틸실록산을 제조하였다. 다층 박막은 ellipsometer(Wooram, KR)를 이용하여 폴리디메틸실록산 표면의 박막 두께를 측정함으로써 확인하였다(도 5).

막 유화법으로 제조된 입자로부터 보형물의 표면에 기공을 형성하고, 다층 박막을 코팅하는 과정을 도 6에 도시화하였다.

도 5에서 볼 수 있듯이 다층 박막의 수가 증가할수록 폴리디메틸실록산 표면에 쌓인 박막의 두께가 1nm씩 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 1] 생체적합성 평가(CCK-8 assay)

대조군으로 표면에 아무 처리도 하지 않은 폴리디메틸실록산(bare PDMS), 표면에 각각 약 38㎛, 70㎛, 100㎛ 기공을 갖는 폴리디메틸실록산과, 실험군으로 각각의 표면에 PLL/HA 다층박막을 처리한 폴리디메틸실록산을 준비하였다. 각각의 샘플은 두께 1mm, 1cm ⅹ 1cm의 크기로 자른 뒤, 24-well plate에 하나씩 넣어 에탄올에 1시간 동안 담군 후 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. DMEM-high(Fetal bovine serum 10%, Penicillin streptomycin 1%) 배지를 이용하여 계대배양한 계대 8 내지 11의 NIH 3T3를 20,000cell/well의 세포밀도(cell density), 1ml 배지의 양으로 샘플 위에 seeding한 후 배양하였다. 이후 1일, 3일 차에 CCK-8 assay를 진행하였다. CCK-8 assay는 먼저 배지를 제거하고 DPBS를 이용하여 2회 세척한 후, 1ml 배지와 100㎕의 CCK-8 용액을 혼합하여 넣어주고 1시간 동안 배양시킨 뒤 100㎕ 추출하여 96-well plate에 넣어 450nm에서 흡광도(Absorbance)를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

그 결과, 생체적합성(biocompatibility)이 입증된 아무 처리도 하지 않은 폴리디메틸실록산(Bare PDMS)의 흡광도를 기준으로, 기공이 형성되어 있거나 기공이 형성되고 PLL/HA 다층 박막이 적층된 경우에서도 비슷한 정도의 흡광도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 보형물 역시 생체적합성이 있음을 확인하였다.

[실험예 2] 세포 형태 (Cell morphology) 평가(Immunostaining)

대조군으로 표면에 아무 처리도 하지 않은 폴리디메틸실록산(bare PDMS), 표면에 각각 약 38㎛, 70㎛, 100㎛ 기공을 갖는 폴리디메틸실록산과, 실험군으로 각각의 표면에 PLL/HA 다층박막을 처리한 폴리디메틸실록산을 준비하였다. 각각의 샘플은 두께 1mm, 1cm ⅹ 1cm의 크기로 자른 뒤, 24-well plate에 하나씩 넣어 에탄올에 1시간 동안 담군 후 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. DMEM-high(Fetal bovine serum 10%, Penicillin streptomycin 1%) 배지를 이용하여 계대배양한 계대 8 내지 11의 NIH 3T3를 20,000cell/well의 세포밀도(cell density), 1ml 배지의 양으로 샘플 위에 seeding한 후 배양하였다. 이후 3일차에 Immunostaining을 진행한다. Immunostaining은 먼저 배지를 제거하고 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)(v/v)에 담구어 20분 동안 세포를 고정시키고 파라포름알데하이드를 제거한 뒤, 0.2% Triton-X 100(v/v)와 1% BSA(w/v)을 DPBS에 녹인 버퍼 용액에 1시간 동안 담구어 permeabilization과 blocking을 진행하였다. 이후 용액을 제거하고 anti-vimentin(1:100 희석)과 anti-alpha smooth muscle actin(1:100 희석)을 앞서 이용한 버퍼 용액에 희석시켜 만들어주고, 세포를 이 용액에 잠기게 하여 4℃에서 24시간 동안 1차 antibody가 세포에 붙을 수 있게 하였다. 다음으로 용액을 제거하고 goat anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor® 488)(1:200 희석)와 goat anti-mouse IgG H&L(Alexa Fluor® 594)(1:200 희석)을 DPBS에 희석시킨 용액에 1시간 동안 room temperature에 놓아두어 형광체를 달아주었다. 마지막으로 핵 염색을 위해 용액을 제거하고 DAPI solution(1:1000 희석)을 DPBS에 희석시킨 용액에 3분 동안 담갔다. 각각의 단계 사이에 DPBS를 이용하여 3회씩 샘플을 세척하였다. 형광 이미지는 공초점레이저주사 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 찍었다.

그 결과, 도 8을 살펴보면 아무 처리되지 않은 bare PDMS에서 fibroblast가 무리지어 자라나는 모습이 관찰되었다. 또한 myofibroblast의 마커인 α-SMA가 발현되는 세포가 fibroblast의 마커인 vimentin을 발현되는 세포를 둘러싸고 자라는 모습이 관찰되어 fibroblast의 myofibroblast로의 분화가 fibroblast가 무리지어 자랄 때 내부로부터 진행된다는 것을 확인했다. Fibroblast가 기공이 있는 표면에서 자랄 때 여전히 무리지어 자랐지만 기공의 크기에 따라 영향을 받았다. 38㎛의 기공이 있는 표면에서는 기공을 덮고 무리지어 자랐다. 기공의 크기가 커졌을 때, 100㎛ 기공이 있는 표면에서는 기공 안에 완전히 갇힌 채로 자라는 모습이 관찰되었다. 다층 박막이 코팅된 표면에서는 fibroblast가 샘플 표면에 골고루 분포하여 자라는 형상을 보였다. 이에 따라 fibroblast가 무리지어 자랄 때 강하게 나타나는 α-SMA의 발현 강도가 약해져 myofibroblast로의 분화가 억제된 것을 확인하였다. 70 내지 100㎛의 기공과 다층박막이 코팅된 샘플에서 myofibroblast로의 분화가 가장 잘 억제되는 것을 통해 시너지 효과를 확인하였다.

[실험예 3] TGF-β 방출 평가

대조군으로 표면에 아무 처리도 하지 않은 폴리디메틸실록산(bare PDMS), 표면에 각각 약 38㎛, 70㎛, 100㎛의 기공을 갖는 폴리디메틸실록산과, 실험군으로 각각의 표면에 PLL/HA 다층 박막을 처리한 폴리디메틸실록산을 준비하였다. 각각의 샘플은 두께 1mm, 1cm ⅹ 1cm의 크기로 자른 뒤, 24-well plate에 하나씩 넣어 에탄올에 1시간 동안 담군 후 DPBS로 2회 세척하였다. DMEM-high(Fetal bovine serum 10%, Penicillin streptomycin 1%) 배지를 이용하여 계대배양한 계대 8 내지 11의 NIH 3T3를 20,000cell/well의 세포밀도(cell density), 1ml 배지의 양으로 샘플 위에 seeding한 후 배지를 갈아주지 않고 3일 동안 배양하였다. 3일 후에 배양 배지의 상층액을 얻고, 신선한 배지를 이용하여 0.5배 희석했다. 희석된 용액을 샘플로 TGF-β ELISA assay를 TGF-β Quantikine^® ELISA Kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 진행하였다. 이후 TGF-β의 양은 2배하여 보정해주었다.

그 결과 도 9를 살펴보면 섬유화를 촉진하는 대표적인 면역물질인 TGF-β 방출이 100㎛ 기공과 다층박막이 코팅된 샘플 표면에서 아무 처리되지 않은 bare PDMS와 비교했을 때 통계적으로 유의미한 감소를 나타냈다.

[실시예 3] 마우스 모델 구축

250 내지 300g의 9주령의 Sprague-Dawley rat를 이용하여 특이항원이 없는(specific antigen-free) 환경에서 물과 음식을 공급하면서 실험을 수행하였다. 실험은 Institutional Animal Care and Use Committee of Seoul national University Bundang Hospital(승인번호: BA 1608-206/045-02)에 의해 승인받은 in vivo 프로토콜을 사용하였다.

실험군은 Bare, S, M, L, Bare_LbL, S_LbL, M_LbL 및 L_LbL로 나누었으며, Bare는 표면에 아무 처리도 하지 않은 PDMS 그룹, S는 40㎛의 기공을 갖는 PDMS, M은 70㎛의 기공을 갖는 PDMS, L은 100㎛의 기공을 갖는 PDMS 그룹, LbL은 PLL/HA 다층(LbL; Layer-by-Layer) 박막을 처리한 PDMS 그룹을 나타낸다.

Rat는 등 중앙의 털을 제거한 후 2cm를 절개하여 피하 공간(subcutaneous pocket)을 만들었다. 그 다음 도 10과 같은 in vivo 샘플(2cm diameter, 양면)을 삽입하고 Nylon 4/0(Ethicon, Somerville, USA)을 이용하여 봉합한 후 70%의 알코올과 베타딘을 이용하여 소독하였다. 이때 각 그룹당 18마리의 rat에 샘플을 삽입하고 2주, 4주, 8주마다 랜덤으로 6마리씩 이산화탄소로 마취하여 희생시켰다. 분석을 위해 삽입한 실리콘 샘플과 함께 표피(epidermis), 진피(dermis) 조직을 생검하였다.

[실험예 4] 염증 반응 분석

상기 실시예 3에서 생검을 통해 얻은 파라핀 조직 블록을 4㎛의 두께로 잘라 자일렌(xylene)과 에탄올로 파라핀을 제거하였다. 25개의 슬라이드를 H&E(Haematoxylin and eosin) 염색법을 이용하여 염색하고, 200배 확대하여 얻은 이미지를 ImageJ software(ver. 1.47, National Institutes Health, Rockville, USA)를 이용하여 반-정량(semi-quantitative)으로 측정하였다. 최종적으로 VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, USA)를 이용하여 핵을 염색하고 슬라이드를 마운팅하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

그 결과, 도 11에서 보는 것과 같이, 모든 그룹에서 초기에 높은 염증 반응을 보였지만 M과 L 그룹에서 통계적으로 유의하게 낮은 염증 반응이 확인되었다. LbL 그룹 역시 LbL 코팅에 의해 코팅되지 않은 그룹에 비해 낮은 염증이 관찰되었다. 이러한 경향은 8주까지 계속 유지되어 초기 염증 반응 조절로 섬유화 반응에 관여하는 TGF-β, 섬유아세포(fibroblast), 근섬유아세포(myofibroblast)의 수치 감소를 나타내었다(나비 효과).

[실험예 5] 캡슐 관련 인자(TGF-β, 섬유아세포 및 근섬유세포 수) 측정

상기 실시예 3에서 생검을 통해 얻은 파라핀 조직 블록을 4㎛의 두께로 잘라 자일렌(xylene)과 에탄올로 파라핀을 제거하였다. 25개의 슬라이드를 면역형광염색법(immunofluorescence)을 이용하여 염색하고, 200배 확대하여 얻은 이미지를 ImageJ software(ver. 1.47, National Institutes Health, Rockville, USA)를 이용하여 반-정량(semi-quantitative)으로 측정하였다.

이때, 사용한 일차 항체는 다음과 같다:

TGF-β: anti-TGF rabbit antibody diluted 1:300,

섬유아세포(fibroblast): anti-vimentin rabbit antibody diluted 1:250,

근섬유아세포(myofibroblast): anti-α-SMA mouse antibody diluted 1:50.

이차 항체는 anti-rabbit and anti-mouse antibody diluted 1:2000를 사용하였다. 희석은 1%(w/v)의 BSA가 함유된 1X PBS와 0.1%(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 이용하였다. 최종적으로 VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, USA)를 이용하여 핵을 염색하고 슬라이드를 마운팅하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

그 결과, M과 L 그룹에서 Bare와 S 그룹에 비해 8주차에 통계적으로 유의한 TGF-β 발현 감소가 관찰되었다. 특히 LbL에 의해 TGF-β의 발현이 더욱 감소하였다.

또한, M과 L 그룹에서 Bare와 S 그룹에 비해 8주차에 통계적으로 섬유아세포 수가 유의하게 감소하였다. LbL에 의해 섬유아세포 수가 더욱 감소한 결과를 보였다. 섬유아세포 수 감소에서 마이크로 텍스쳐의 영향이 LbL의 영향보다 컸으나, 100㎛에서 LbL에 의해 섬유아세포 수가 크게 감소하는 시너지 효과를 보였다(L_LbL 그룹).

또한, M과 L 그룹에서 Bare와 S 그룹에 비해 8주차에 통계적으로 근섬유아세포 수가 유의하게 감소하였다. LbL에 의해 근섬유아세포 수가 더욱 감소하는 결과를 보였다. Bare에 비해 L_LbL 그룹에서 2주 후부터 8주까지 지속적으로 유의미하게 낮은 섬유아세포 수가 관찰되었다.

이는 70㎛ 이상의 텍스쳐(M 및 L 그룹)에서 실리콘 샘플의 micro movement가 감소하여 면역 반응이 줄어든 것으로 판단되었다. 이는 생검 과정에서 Bare나 S 그룹의 샘플에 비해 M과 L 그룹의 샘플이 조직과 좀 더 강하게 결합되어 있기 때문임을 알 수 있다. 초기(2주) 면역 반응 억제 효과에 따라 capsule-related factors 역시 감소하였다.

[실험예 6] 콜라겐 밀도 및 캡슐 두께 확인

1) 콜라겐 밀도 측정

상기 실시예 3에서 생검을 통해 얻은 파라핀 조직 블록을 4㎛의 두께로 잘라 자일렌(xylene)과 에탄올로 파라핀을 제거하였다. 25개의 슬라이드를 Masson's trichrome(MT) 방법을 이용하여 염색하고, 200배 확대하여 얻은 이미지를 ImageJ software(ver. 1.47, National Institutes Health, Rockville, USA)를 이용하여 반-정량(semi-quantitative)으로 측정하였다. 이때 파랗게 염색된 콜라겐을 측정하여 백분위로 나타내었다. 최종적으로 VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, USA)를 이용하여 핵을 염색하고 슬라이드를 마운팅하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

그 결과, 4주차 측정에서 LbL 처리된 마이크로 텍스쳐 표면에서 통계적으로 유의한 콜라겐 밀도 감소가 관찰되었다. 특히 S와 L 그룹에서 LbL에 의한 콜라겐 밀도가 크게 감소하였다. 8주차 측정에서는 M과 L 그룹에서 콜라겐 밀도가 크게 감소하였고, LbL에 의해 더욱 감소하여 시너지 효과를 보였다. 특히 L_LbL에서 가장 낮은 콜라겐 밀도를 보였다.

2) 캡슐 두께 측정

상기 실시예 3에서 생검을 통해 얻은 파라핀 조직 블록을 4㎛의 두께로 잘라 자일렌(xylene)과 에탄올로 파라핀을 제거하였다. 25개의 슬라이드를 H&E(Haematoxylin and eosin) 염색법을 이용하여 염색하고, 50배 확대하여 얻은 이미지를 ImageJ software(ver. 1.47, National Institutes Health, Rockville, USA)를 이용하여 반-정량(semi-quantitative)으로 측정하였다. 최종적으로 VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, USA)를 이용하여 핵을 염색하고 슬라이드를 마운팅하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

그 결과, Bare와 S 그룹에서 캡슐 두께는 LbL 유무와 상관없이 2주부터 8주까지 꾸준히 증가하는 반면, M과 L 그룹에서는 2주차와 비슷한 수준의 캡슐 두께가 8주차까지 유지되는 것을 보였다. 8주차에서는 M과 L 그룹에서 Bare 그룹과 비교했을 때 캡슐 두께가 유의하게 감소하는 결과가 관찰되었다.

상기 결과에 따르면 상대적으로 짧은 기간의 반응인 in vitro 실험에 비해 LbL의 영향이 작게 나타나는 것을 보였다. 이는 in vivo 환경에서 LbL이 분해되었기 때문으로 보이며, 마이크로 텍스쳐와 LbL에 의해 초기 면역(2주) 반응 억제 효과에 따라 캡슐-관련 인자(capsule-relateed factor) 역시 감소하고, 이에 따라 8주차에 콜라겐 밀도 및 캡슐 두께가 감소하는 것을 확인하였다.

Claims

막 유화법으로 제조된 입자에 의해 표면에 기공이 형성된 보형물; 및
상기 보형물의 표면에 양이온 물질로 적층된 양이온 물질층 및 상기 양이온 물질층 상에 음이온 물질로 적층된 음이온 물질층을 포함하는 다층 박막이 코팅된 섬유화 반응 억제용 보형물.
제1항에 있어서,
양이온 물질은 폴리 L-라이신(poly L-lysine; PLL), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI), 폴리아미도아민(polyamidoamine; PAA), 폴리아미노에스터(polyaminoester; PAE), 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트](poly[2-(N,N-dimethylamino)ethylmetacrylate]; PDMAEMA), 양이온성 셀룰로오스(cationic cellulose), 양이온성 덱스트린(cationic dextrin) 및 젤라틴(gelatin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 섬유화 반응 억제용 보형물.
제1항에 있어서,
음이온 물질은 히알루론산(hyaluronic acid), 알지네이트(alginate), 알부민(albumin), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 소듐 알지네이트(sodium alginate), 폴리 감마-글루탐산(poly γ-glutamic acid), 폴리 아스파트산(poly aspartic acid), 폴리 스티렌 설포네이트(poly styrene sulfonate), 폴리 프탈릭 에틸렌 글리콜 에스터(poly phthalic ethylene glycol ester), 폴리 설포네이티드 아닐린(poly sulfonated aniline) 및 폴리 알릴아민 하이드로젠 클로라이드(poly allyamine hydrogen chloride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 섬유화 반응 억제용 보형물.
제2항 또는 제3항에 있어서,
양이온 물질은 폴리 L-라이신이고, 음이온 물질은 히알루론산인 섬유화 반응 억제용 보형물.
제1항에 있어서,
다층 박막은 층상 자기조립법에 의해 보형물의 표면에 코팅되는 것인 섬유화 반응 억제용 보형물.
제1항에 있어서,
막 유화법으로 제조된 입자에 따른 기공은 직경이 10 내지 150㎛인 섬유화 반응 억제용 보형물.
제1항에 있어서,
보형물은 다층 박막 상에 약물층이 추가로 코팅된 섬유화 반응 억제용 보형물.
제7항에 있어서,
약물층은 트라닐라스트(tranilast), 피르페니돈(pirfenidone), 마이토마이신(mitomycin), 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 제니스테인(genistein), 셀레노시스테인(selenocystine), 트리암시놀론 아세토니드(Triamcinolone acetonide), 토실산 스트라타스트(Suplatast tosilate) 및 몬테루카스트(Montelukast)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는 섬유화 반응 억제용 보형물.
제1항에 있어서,
보형물은 실리콘 또는 폴리우레탄으로 형성되는 것인 섬유화 반응 억제용 보형물.
막 유화법으로 제조된 입자로부터 보형물의 표면에 기공을 형성하는 단계; 및
표면에 기공이 형성된 보형물 상에 양이온 물질로 적층된 양이온 물질층과 음이온 물질로 적층된 음이온 물질층을 포함하는 다층 박막을 코팅하는 단계를 포함하는 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.
제10항에 있어서,
막 유화법으로 제조된 입자에 따른 기공은 직경이 10 내지 150㎛인 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.
제10항에 있어서,
양이온 물질은 폴리 L-라이신(poly L-lysine; PLL), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI), 폴리아미도아민(polyamidoamine; PAA), 폴리아미노에스터(polyaminoester; PAE), 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트](poly[2-(N,N-dimethylamino)ethylmetacrylate]; PDMAEMA), 양이온성 셀룰로오스(cationic cellulose), 양이온성 덱스트린(cationic dextrin) 및 젤라틴(gelatin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.
제10항에 있어서,
음이온 물질은 히알루론산(hyaluronic acid), 알지네이트(alginate), 알부민(albumin), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 소듐 알지네이트(sodium alginate), 폴리 감마-글루탐산(poly γ-glutamic acid), 폴리 아스파트산(poly aspartic acid), 폴리 스티렌 설포네이트(poly styrene sulfonate), 폴리 프탈릭 에틸렌 글리콜 에스터(poly phthalic ethylene glycol ester), 폴리 설포네이티드 아닐린(poly sulfonated aniline) 및 폴리 알릴아민 하이드로젠 클로라이드(poly allyamine hydrogen chloride)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.
제12항 또는 제13항에 있어서,
양이온 물질은 폴리 L-라이신이고, 음이온 물질은 히알루론산인 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.
제10항에 있어서,
다층 박막은 층상 자기조립법에 의해 보형물의 표면에 코팅되는 것인 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.
제10항에 있어서,
다층 박막 상에 약물층을 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 보형물의 제조방법.
제16항에 있어서,
약물층은 트라닐라스트(tranilast), 피르페니돈(pirfenidone), 마이토마이신(mitomycin), 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 제니스테인(genistein), 셀레노시스테인(selenocystine), 트리암시놀론 아세토니드(Triamcinolone acetonide), 토실산 스프라타스트(Suplatast tosilate) 및 몬테루카스트(Montelukast)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는 섬유화 반응 억제용 보형물의 제조방법.