KR20180087707A - 산성화된 해수 노출에 대응하는 거품돌산호 유전자 및 이를 이용한 해양 환경변화 진단키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산성화된 해수 노출에 대응하는 거품돌산호(Alveopora japonica) 유전자 및 이를 이용한 해양 환경변화 진단키트에 관한 것으로, 구체적으로 산성화된 해수에 대응하는 거품돌산호 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 키트는 기후변화에 따른 해수의 산성도 변화에 따라 발현량이 변화하는 거품돌산호의 특정 유전자군을 사용하므로, 산성화된 해수에 대한 노출 여부를 확인하기 위한 바이오 센서 및 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 산성화된 해수 노출에 대응하는 거품돌산호(Alveopora japonica) 유전자 및 이를 이용한 해양 환경변화 진단키트에 관한 것이다.
산업혁명 이후 인간 활동에 의해 대기 중 이산화탄소 농도가 100 ppm 이상 증가하였으며, 증가된 대기 중 이산화탄소의 약 1/4 가량은 해양에서 흡수됨으로써, 해양은 매우 중요한 이산화탄소 흡수원이다. 해양으로 흡수된 이산화탄소는 해수 내에서 탄산(H2CO3)을 형성하고 추가적으로 흡수된 이산화탄소에 의해 해수의 산성도가 증가된다.
해양의 산성화로 인해 해수의 산성도(수소이온농도)가 증가하면 해수 내의 탄산이온(CO3 2-) 농도가 감소하기 때문에 탄산계 골격으로 이루어진 해양생물에 큰 영향을 미친다. 이와 같이 해양의 산성화로 인해 표층해수의 탄산이온 농도가 지속적으로 감소하여 탄산염이 불포화 상태에 이르면 탄산염 골격을 이용하는 생물종들은 더 이상의 생명활동을 지속하지 못하고 멸종할 가능성이 있다.
지금도 해양에서 해수의 산성화가 해양 생물들에게 영향을 주는 것이 다양하게 감지되고 있으며, 이러한 추세로 가면 몇 세기 내로 열대해양에서는 산호가 사라질 것이며 대부분의 극지해역에서는 석회화 생물의 골격 형성이 어려워질 것으로 예측된다.
2014년을 기준으로 하여, 인류가 배출한 이산화탄소 양은 약 323억 톤으로 2010년에 비해 약 17억 톤 증가하였으며, 배출된 이산화탄소 양이 생태계의 임계점을 넘어서면 다시 돌이킬 수 없는 심각한 생태계의 변화가 초래될 것이다. 최근에 우리나라 동해에서도 산업혁명 이후에 급속한 산성화가 진행되고 있음이 보고되었다. 이는 한국 근해에서도 해양 산성화가 심각하게 진행되고 있으며, 이는 앞으로 탄산칼슘을 골격으로 하는 생물상의 서식지가 줄어들 수 있음을 암시한다. 따라서 지역적인 규모에서 생태계 변화를 사전에 감지할 수 있는 생물학적 예보 시스템을 개발하는 것이 시급하다.
산호류는 다양한 해양 생물들의 서식처로 이용되는 등 요람과 같은 역할을 하고 있으나, 기후 변화로 인한 해수온 상승 및 산성화에 따라 종 다양성 및 개체군이 급격히 감소하고 있다. 또한, 인간의 간섭으로 인한 서식지 파괴가 급격히 진행 중에 있어 산호류를 보전하기 위한 생태적인 모니터링과 더불어 분자생물학적 수준에서의 연구 접근이 필요하다.
국내의 산호 연구는 1970년대 분류학적 연구를 시작으로 계통·진화/공생·생활사/증식·보전 등의 연구가 진행되었으나, 해양 산성화나 기후 변화와 관련된 연구는 아직 시작 단계에 머물러 있다.
한편, 거품돌산호(Alveopora japonica)는 제주도 전 연안에 널리 분포하며, 수심 15 내지 20 m 근처의 조하대 암반이나 큰 바위덩이 표면에서 비교적 흔하게 발견되는 경산호류로서, 제주도 이외의 남해 해역에서는 일부 발견된다. 분류학적으로 자포동물문, 산호충강, 돌산호목, 버섯돌산호아목, 구멍돌산호과에 속하며, 군체형으로 산호체 내에 공생 와편모충류를 갖고 있는 조초산호이다. 촉수와 몸통의 색상에는 변이가 있어서 밝은 초록색에서부터 어둡고 탁한 황갈색에 이르기까지 비교적 다양하다. 각 폴립에는 12개의 촉수를 가지며, 촉수를 활짝 펼쳤을 때의 직경은 약 1 cm 전후이고, 촉수에 비치는 빛의 반사각에 따라 형광빛을 내기도 한다. 촉수를 움츠린 상태의 산호체는 계란크기의 덩어리 모양이며, 산호협은 다공성으로 망상이고 마치 벌집을 연상시킨다. 본 산호종은 해양수산부 보호대상해양생물로 지정되어 있지 않지만, 국제적으로는 "멸종위기에 처한 야생동식물종의 국제거래에 관한 협약(CITES)"에 의해 국제거래가 제한되고 있다.
유전자 발현 변화를 이용한 생태계의 건강성 평가방법은 환경 내 다양한 변화요인에 대한 분자생물학적 기술의 접목으로 매우 빠른 속도로 발전하고 있는 유전체적인 기술을 대입시켜 외부 환경 스트레스에 대한 생물 내 반응을 분자수준에서 진단하여 위해도 또는 건강도 등을 평가하는 방법이다.
생물을 이용하여 유해성의 여부를 가늠하는 기존의 방법들(돌연변이 여부/행동이상/사망률/효소 활성도 등)은 스트레스 물질에 이미 노출된 생물에게 나타난 변화를 측정하는 방법들로서 노출된 자극의 정도가 상당히 높은 수준이어야 측정이 가능하다. 한편, 유전자 발현 변화를 이용한 평가방법은 외부 자극을 받고 난 후, 유전자 정보가 단백질로 넘어가는 전사수준에서 나타난 변화를 이용하여, 생물이 받고 있는 스트레스 수준을 평가하는 방법이다. 상기 방법은 매우 작은 외부의 자극까지도 감지해 낼 수 있다는 장점이 있어 적은 양의 환경 변화나 외부 자극에 장기간 노출되었을 때의 생물반응에 대한 결과까지도 예측해 볼 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화를 이용한 평가방법에 사용되는 유전자 바이오 마커는 그 특이성에 의해 외부 자극의 존재 여부 및 연관성을 나타내고, 생태계의 다양한 환경변화에 대한 장기적 영향 및 그 환경 내 생물의 건강성까지 평가할 수 있게 한다.
이에, 본 발명자들은 산성화된 해수에 대응하는 생태계 변화를 사전에 감지할 수 있는 생물학적 예보 시스템을 개발하기 위해 노력하던 중, 경산호류인 거품돌산호의 유전자 중 산성화된 해수에 대해 특이적으로 발현량이 변화하는 유전자군을 규명하였고, 상기 유전자군이 해수의 산성도 변화 정도 및 이에 따른 해양 생태계의 변화를 파악할 수 있는 바이오 센서로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 거품돌산호의 유전자를 이용한 산성화된 해수에 대한 노출여부 확인용 마이크로어레이 및 이를 이용한 산성화된 해수에 대한 노출여부를 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 모든 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 거품돌산호의 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이(microarray)를 제공한다: 서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle).
또한, 본 발명은 1) 산성화된 해수에 노출된 실험군인 거품돌산호와 대조군인 거품돌산호에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지 하는 단계; 3) 단계 2)의 각각 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계; 4) 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및 5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 유전자 발현정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 산성화된 해수에 노출된 실험군인 거품돌산호와 대조군인 거품돌산호에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 RNA를 하기 각각의 유전자에 상보적이며 유전자 증폭이 가능한 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계: 서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle); 및 3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 제 1항의 마이크로어레이를 포함하는 거품돌산호의 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트(kit)를 제공한다.
아울러, 본 발명은 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 모든 프라이머 쌍을 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다: 서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle).
본 발명의 산성화된 해수에 대응하는 거품돌산호 유래 유전자 및 이를 이용한 해양 생태계 진단 키트는 기후변화에 따른 해수의 산성도 변화에 따라 발현량이 변화하는 거품돌산호의 특정 유전자군을 사용하므로, 산성화된 해수에 대한 노출 여부를 확인하기 위한 바이오 센서 및 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 산성화된 해수(pH 7.5) 또는 정상해수(pH 8.0)에 노출된 거품돌산호의 유전자를 이용하여 마이크로어레이 실험을 수행하고, 2배 이상 차등 발현된 유전자들 중 공통 유전자를 그룹화하여 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 모든 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 거품돌산호의 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이(microarray)를 제공한다:
서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle).
상기 유전자는 거품돌산호로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 산성화된 해수는 pH 6 내지 7.7, 보다 구체적으로는 pH 6.5 내지 7.6일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 산성화된 해수는 pH 7.5일 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 산성화된 해수에 노출된 실험군인 거품돌산호와 대조군인 거품돌산호에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계; 3) 단계 2)의 각각 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계; 4) 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및 5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 유전자 발현정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 산성화된 해수에 노출된 실험군인 거품돌산호와 대조군인 거품돌산호에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 RNA를 하기 각각의 유전자에 상보적이며 유전자 증폭이 가능한 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계:서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자 (cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자 (alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자 (DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle); 및 3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이를 포함하는 거품돌산호의 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
상기 산성화된 해수는 pH 6 내지 7.7, 보다 구체적으로는 pH 6.5 내지 7.6일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 산성화된 해수는 pH 7.5일 수 있다.
상기 키트는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질 (streptavidin-like phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescent) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTP 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약 및 세척 완충용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 반응시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트를 제공한다: 서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자 (cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자 (alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자 (synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase), 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle).
상기 산성화된 해수는 pH 6 내지 7.7, 보다 구체적으로는 pH 6.5 내지 7.6일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 산성화된 해수는 pH 7.5일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 거품돌산호를 산성화된 pH의 해수에서 배양한 후, 상기 배양된 거품돌산호의 유전자로부터 cDNA를 합성하여 발현량이 변화하는 유전자들을 조사하였다.
구체적으로, pH 7.5에서 배양된 거품돌산호의 조직에서 분리된 mRNA를 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA를 형광 표지하고 이를 이용하여 마이크로어레이를 제작하였다. 제작한 마이크로어레이를 스캔한 뒤 이를 분석한 결과, 대조군을 기준으로 실험군에서 발현량이 증가 또는 감소하는 유전자 20종(표 2 참조)을 확인하였다. 또한, 실험군에서 2배 이상 차등 발현한 상기 유전자들 중 공통 유전자를 그룹화하였다(도 1 참조).
기후의 변화는 해수의 산성도 변화를 유발하고 이러한 환경의 변화에 따라 해양 생물은 생리 및 대사의 변화를 일으킨다. 그러므로 해양 생물인 거품돌산호 유래 유전자 발현량의 변화를 확인함으로써 외부 환경 변화에 따른 스트레스 및 건강 상태를 확인할 수 있고, 상기 발현이 변화된 유전자를 생체지표로서 이용가능하다. 따라서, 상기 유전자들은 해수의 산성도 변화에 따른 산성화된 해수에 대한 노출 여부의 확인을 위한 마이크로어레이 및 키트로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
거품돌산호의
배양 및 산성화된 해수에의 노출
본 발명자들은 제주 연안 해역에서 거품돌산호 시료를 채취한 뒤, 실험군의 거품돌산호는 pH 7.5의 해수에 노출하여 24시간 동안 배양하였고 대조군의 거품돌산호는 자연해수(pH 8.0)에서 24시간 동안 배양하였다.
<
실시예
2>
거품돌산호의
cDNA의 합성
상기 <실시예 1>에서 산성화된 해수에 노출된 거품돌산호의 유전자변화를 측정하기 위하여, 본 발명자들이 개발한 방법으로 RNA를 분리하였다.
구체적으로, 상기 실험군 및 대조군의 거품돌산호 조직을 막자사발에서 액체질소를 이용하여 분말로 만들고, 용해(lysis) 용액[35 mM EDTA, 0.7 M LiCl, 7% SDS, 200 mM Tris-Cl(pH 9.0)] 700 ㎕를 첨가하여 균질화시켰다. 상기 균질화된 시료에 동량의 페놀 용액을 첨가하고 잘 섞은 후, 10분간 원심분리하고 상층액을 취해 새 튜브로 옮겼다. 여기에 총 용량의 1/3의 8 M 염화리튬(LiCl)을 첨가 및 혼합하고, 이를 4℃에서 2시간 이상 방치하였다. 상기 방치한 시료를 약 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 취하여 300 ㎕의 DEPC-처리수에 녹이고, 이의1/10 용량의 3 M 아세트산나트륨(pH 5.2)과 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 약 30분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 침전물을 취하였다. 상기 침전물에 70% 에탄올 용액 50 ㎕를 넣어 5분간 원심분리한 뒤, 에탄올 용액을 제거하고 침전된 RNA를 건조시켜, 건조된 RNA를 적당량의 DEPC-처리수에 용해하였다.
그 다음, 분리한 거품돌산호 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 추출에는 Tri-reagent(Molecular Research Center Inc.)를 이용하였으며, 추출된 RNA를 주형으로 역전사효소를 이용하여 실험군과 대조군의 cDNA를 합성하였다.
<
실시예
3> 산성화에 의한
거품돌산호
유전자 변화 측정
<3-1>
혼성화
(hybridization) 및 스캐닝(scanning)
<실시예 2>에서 합성된 거품돌산호 cDNA를 이용하여 마이크로어레이(microarray) 실험을 다음과 같이 수행하였다.
구체적으로, 형광물질인 Cy3-CTP 및 Cy5-CTP가 라벨링된 cDNA 시료를 PCR 정제키트(PCR purification kit, Qiagen, 독일)를 사용하여 정제하고, 증류수로 용출하였다. 정제된 형광표지-cDNA 시료를 혼성화 완충액(hybridization buffer)[3x SSC, 0.3% SDS, 50% 포름아미드(formamide), 20 μg Cot-1 DNA, 20 μg yeast tRNA]에 첨가하고, microcon YM-30으로 농축하여 혼성화 혼합물을 만들었다. 상기 혼성화 혼합물을 95℃로 3분 동안 가열하여 변성시키고 12,000 g에서 30초간 원심분리하여 온도를 떨어뜨렸다. 제조된 거품돌산호 마이크로어레이에 커버슬립을 덮고, 변성시킨 혼성화 혼합물을 파이펫팅(pipetting)으로 섞었다. 마이크로어레이를 GT-Hyb 챔버(chamber)에 넣고 65℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 혼성화가 끝난 후, 챔버에서 마이크로어레이를 꺼내어 세척하고, 이를 돌려서 건조시키고 스캐닝(scanning)할 때까지 암실에서 보관하였다. 실험이 완료된 거품돌산호 마이크로어레이를 엑손 진픽스 4000B 스캐너(Axon Instrument, 미국)를 사용하여 스캔하였다. 진픽스 Pro 6.0 프로그램에서, 스캔 이미지로부터 각 점을 그리딩파일(gridding file)을 이용하여 그리딩하고, 정량화하여 각 점의 Cy5/Cy3 강도 및 비율 등의 분석값이 포함된 GPR 파일을 얻었다.
<3-2> 자료분석
진픽스 프로 프로그램에서 얻어진 GPR 파일로부터, 분석 프로그램인 진스프링 7.3.1(GeneSpring 7.3.1, Agilent Technologies, 미국)을 이용하여 아래와 같이 분석을 수행하였다. 표준화(normalization)는 LOWESS(locally weighted regression scatterplot smoothing)를 이용하여 수행하였고, 신뢰할 수 있는 유전자(reliable gene)는 중앙값의 합이 배경보다 낮거나 각 화소 값의 표준편차가 유의하지 않은 점을 플래그 아웃(flag-out)함으로써 유의미한 유전자를 얻었다. 또한, 유의미한 유전자는 평준화된 비율 값이 2배 이상 차이를 보이는 점만을 선별하였다.
그 결과, 유전자들 중 실험군에서 2배 이상 차등발현된 공통 유전자를 그룹화한 것을 도 1에 나타내었다(도 1).
<
실시예
4> 산성화에 의해 발현 변화된 유전자의 동정
<실시예 3>에서 유의미하게 발현 변화를 보인 20종의 유전자의 서열을 넥스트 제네레이션 시퀀싱(next-generation sequencing) 기법을 사용하여 확인하였다.
구체적으로, poly(A) RNA를 얻고, oligo(dT) 또는 랜덤 헥사머(random hexamer)를 이용하여 첫 번째 가닥을 합성한 후, 첫 번째 가닥에서 상보적인 두 번째 가닥을 얻어 cDNA를 합성하였다. cDNA 이중가닥을 부분적으로 절단을 하여, 3' 말단에 데옥시아데닌(deoxyadenine) 염기를 덧붙이고, 일루미나(illumina) 어댑터를 이용하여 접합한 뒤, PCR 방법으로 증폭한 다음 증폭된 산물을 사이즈별로 선별하고 및 염기서열을 분석하였다. 얻어진 염기서열 부분은 대조군의 유전자를 이용하여 발현체의 전체지도를 얻기 위해 정렬(align)하였다. 상기 PCR 증폭에 사용된 검출용 프라이머의 염기서열을 하기의 표 1에 나타내었다.
| 번호 | 유전자 이름 | 프라이머 (5'→3') |
서열번호 | PCR 크기 (bp) |
| 1 | Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D | F-TGGGCGAAACATTTACTTCC | 서열번호 21 | 191 |
| R-TCCCAATCATCCAGTGTGAA | 서열번호 22 | |||
| 2 | Aquaporin AQPcic | F-TTTACTGTATGCGCCAGCAC | 서열번호 23 | 194 |
| R-TACACCCAATGATGCTTCCA | 서열번호 24 | |||
| 3 | Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C | F-ATGGACGTTTCCTCCACAAG | 서열번호 25 | 188 |
| R-ATGGCGTCCAGATCAAACTC | 서열번호 26 | |||
| 4 | Myosin-2 essential light chain | F-GGCAAAGTGGAATCCTCAAA | 서열번호 27 | 217 |
| R-CGCTGTCGAAGACACGTAAA | 서열번호 28 | |||
| 5 | Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 | F-AGTGTTCACGCAAACACCAG | 서열번호 29 | 162 |
| R-ACTCCAATCGCATCAGCAC | 서열번호 30 | |||
| 6 | Myosin light chain kinase family member 4 | F-TTTGCGTTAGCAAAGACAGC | 서열번호 31 | 169 |
| R-CCGACACTCCACATGTCTGT | 서열번호 32 | |||
| 7 | Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A | F-GGCACCCATACTTTCCTCAA | 서열번호 33 | 233 |
| R-TTTTGGGAGGACTGGAACAC | 서열번호 34 | |||
| 8 | Actin | F- TCAAAATCATTGCTCCACCA | 서열번호 35 | 104 |
| R-TTCAGCCTTGCTAATCCACA | 서열번호 36 | |||
| 9 | Microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1 | F-AGAAGGCGGAGTTCATTCCT | 서열번호 37 | 185 |
| R-ATGCTGCTCCAACATGACTG | 서열번호 38 | |||
| 10 | DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5 | F-TTGCTCACACCACCATGATT | 서열번호 39 | 182 |
| R-AATCAGGTCCACATGGGAAA | 서열번호 40 | |||
| 11 | Solute carrier organic anion transporter family member 4A1 | F-CCTGCAATTGGCTTTTTGAT | 서열번호 41 | 171 |
| R-AGCAAGCAATGGAAGGCTAA | 서열번호 42 | |||
| 12 | Melanotransferrin | F-ATGCGAGTATTCATTTTCCTTACA | 서열번호 43 | 150 |
| R-AAGGTAATCAGTCCAATCTGACAA | 서열번호 44 | |||
| 13 | DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3 | F-TTGGGTGCAAATTGAGAACA | 서열번호 45 | 190 |
| R-TTGATCATCCGAGCATTTGA | 서열번호 46 | |||
| 14 | Protein phosphatase 1K | F-CGATGCAGTATGGCTCAAAA | 서열번호 47 | 220 |
| R-TTTCCTTTGTGCCAGTGAGA | 서열번호 48 | |||
| 15 | Synaptotagmin-14 | F-CGTCCACAGAAGACAGCAAA | 서열번호 49 | 211 |
| R-TCGATAACGTGTCGCTTCAG | 서열번호 50 | |||
| 16 | ATP-dependent RNA helicase DDX60-like | F-GAGCGTATTCGACGCCTAAA | 서열번호 51 | 159 |
| R-CTCCTCCAGGGAACAACTGA | 서열번호 52 | |||
| 17 | Receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma | F-GGAAGACTTCAAGGCTCACG | 서열번호 53 | 174 |
| R-CGACTGTGGTCAAATGCTGT | 서열번호 54 | |||
| 18 | RNA helicase SDE3 | F-TCCAGTGCAGCTCATTTGAC | 서열번호 55 | 241 |
| R-CACATGGCAAGGGAGGTTAT | 서열번호 56 | |||
| 19 | L-asparaginase | F-CAATGTACGTGGGCTTTGAA | 서열번호 57 | 248 |
| R-GTGGAAAATGGGAAGGGACT | 서열번호 58 | |||
| 20 | Myosin essential light chain, striated adductor muscle | F-GGCTATGTCTCCAAGGCTGA | 서열번호 59 | 158 |
| R-CCAGCCATCACCTTCTTGAT | 서열번호 60 |
그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 발현량이 유의적으로 변화한 유전자를 동정하였다.
| 번호 | 유전자 이름 | 서열번호 | 발현 변화량 |
| 1 | Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D | 서열번호 1 | 10.50 |
| 2 | Aquaporin AQPcic | 서열번호 2 | 9.20 |
| 3 | Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C | 서열번호 3 | 5.69 |
| 4 | Myosin-2 essential light chain | 서열번호 4 | 3.21 |
| 5 | Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 | 서열번호 5 | 3.19 |
| 6 | Myosin light chain kinase family member 4 | 서열번호 6 | 2.90 |
| 7 | Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A | 서열번호 7 | 2.81 |
| 8 | Actin | 서열번호 8 | 2.77 |
| 9 | Microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1 | 서열번호 9 | 2.74 |
| 10 | DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5 | 서열번호 10 | 2.53 |
| 11 | Solute carrier organic anion transporter family member 4A1 | 서열번호 11 | 2.41 |
| 12 | Melanotransferrin | 서열번호 12 | 2.34 |
| 13 | DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3 | 서열번호 13 | 2.19 |
| 14 | Protein phosphatase 1K | 서열번호 14 | 2.18 |
| 15 | Synaptotagmin-14 | 서열번호 15 | 2.18 |
| 16 | ATP-dependent RNA helicase DDX60-like | 서열번호 16 | 2.06 |
| 17 | Receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma | 서열번호 17 | -2.77 |
| 18 | RNA helicase SDE3 | 서열번호 18 | -2.77 |
| 19 | L-asparaginase | 서열번호 19 | -3.90 |
| 20 | Myosin essential light chain, striated adductor muscle | 서열번호 20 | -4.06 |
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation
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same
<130> 2016P-12-019
<160> 60
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D
<400> 1
atgaaaacag atgcacagca aagaaactcc atgtcagcaa gcccctctcc tggttccaaa 60
aaagtgtgtt ttgcagactt tgtaggcctc aaactcgagt tcgtcaaaac aataactccg 120
tgtagcagtg atgacaactt gacctgctcg gcggccggtc tcgtcaatac atggaagcgg 180
aatcactgtg acatcaataa caatgtcttg cttgggaagt gggcgaaaca tttacttccg 240
tgctttgtta tcccatcgaa aacggagagt tttatggtgc gcgtctttga ccagaatgtt 300
tgcctcgagg acatcgcttg cgcgaacttt gtggtaaccg gagttattcg ggtaacaaat 360
ttatcgtacg cgaaggaagt gactgttcga ttcacactgg atgattggga ctcctttaga 420
gacatttggg ctgattatat gtcgtcttgc tccgacggta aaaccgacaa gtttagcttc 480
cgaataacag tgcctttcga ttttgatgtg catagataca tgtgctttgc agtccggtac 540
aaagtcatga atcaggagtt ctgggataat aatcatacta gaaattatca tatacagtgt 600
ttggaggtga aaaggggttc ctgctttaat aattatacca attttgaaca ctga 654
<210> 2
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aquaporin AQPcic
<400> 2
atgaaaattc tacttgtatc tgagatgaag agcctccatt tctgggcaag tgccttggtg 60
gagctgatcg caaccttctt tttcattttc ctgaccactg gtaccaccat tacttggaaa 120
ataagctatc ctccatcaac agaattaatt tctctgtcct tcgggttcag catagcaacc 180
ctggctatgt gtagtttgca tctaagcggt ggacacatca accctgcagt aactattgcc 240
atgatggcca ttagaaaagt caccatcctg cgaggcgtaa cctatgttat ttttcaactg 300
gtcggaggta tcgcgggctc agctgtcctg aaattcataa caccagaggc aaaacgtggg 360
acccttggtg cgactgtccc aggccccgaa gtgactccgg cgcaggcagt tggtgttgag 420
atactgctga cattcctcct cgtgtttact gtatgcgcca gcaccgactc caaaaggcta 480
cactacggtt atgaggttcc attatctatt ggattatgcg tggctgtctg tcacttcatc 540
gggattggat ttaccggatg tggaataaat cctgctcgtt cttttggtcc ggccgtggta 600
atgaacaaac ctgaaatatg gaagcatcat tgggtgtatt gggtcgggcc cattggtgga 660
gccttagttg cagcggtcct atatcaggtg atatttcggg cccgtgagga aactggcccc 720
acctccaaca acgatgtgga gatgagtcac gattcgaagt tgtga 765
<210> 3
<211> 513
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C
<400> 3
atggacgttt cctccacaag acagagacag actgggaaag catacaggat aaagtcatgt 60
ccgcagccat tcgatttgat ctttcaaatt gcgtgttgta aggactcctc tgactgtgaa 120
ttcactgagg cgagaaagat tatagagctt ttccgtcaaa atggagaaga gtttgatctg 180
gacgccataa gcgcctctgg tatgactgct ctcacacagt gtgttcttga tggtaactta 240
cagagtgtaa aggctttgat tgcgctcgga gccaatgtga acaagaaaga cggacaaggt 300
agcacggcct tgcattacgc agctagcgag ggatacgttg acatcgtcaa atgtttgctt 360
gactgtgatg ctaacgcgag agctctaaat cgtcaagaac agatgccttt agacgtagct 420
gatggagagg aaatacaaaa actcttgtca cgtaaaagta aaatcttccg ttctgccagt 480
aaggtactga ctcgtcaaac cagcttgccg tga 513
<210> 4
<211> 453
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin-2 essential light chain
<400> 4
atggcaagca cactgaccga tcgggagatg gacgaattac gcgataattt tggtctttat 60
gatacggtgg gcgacggcaa agtggaatcc tcaaacatgg gtcagatgct gcgatcggtc 120
ggattaaacc cgacacaagc cgaagtcgaa aaggtagtga aagagatcga ccctcaagga 180
aacaagagga tatcattcga ggaatttgtg ccagtggttc tgtcgcttcg tacgcgcacc 240
cacaaatacg gtcaagacgt ttttatcgac agtttacgtg tcttcgacag cgatggttcg 300
ggcgcgatca gctccggaga gcttcgtcat gttctcacaa gcttgggtga aaagttaaaa 360
gacgaagatg tagataccct tactcagggt ttcgaggaca acactggtct tataaactac 420
gaggaatttg ttaaaagcgt catgaacggt taa 453
<210> 5
<211> 234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin-2 essential light chain
<400> 5
gtcaatgaca acgctccagt gttcacgcaa acaccagaat tcacgatcag agaggaccat 60
agggccaaca taaactccgg tgtcggaacc atccaggcaa cagatgccga catgccggga 120
ccaaacagtg aaatctttta ctatgtgaca agtggtgctg gtgctgatgc gattggagtt 180
gtatctagaa ctggactggt gtatttgatg agaaacgtgg attacgaaaa cgtc 234
<210> 6
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin light chain kinase family member 4
<400> 6
cacatgcaca gcaagaacat tgttcacttg gatctaaagc ctgagaacat tgtttgcgtt 60
agcaaagaca gctgggatat caaactgatt gactttggat tggcgcaaga gcttgttcct 120
ggagttcgaa tgaaagcact gaagggaact cctgagttta tggcccctga agcggtgaat 180
tttgaagcaa tcacattagc aacagacatg tggagtgtcg gggtaata 228
<210> 7
<211> 960
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A
<400> 7
atggctgcaa aatatgtcaa gctgaacaac ggagaaaaga tgccactaat tggtttagga 60
acctggaaat ctaaaaaagg gaaagcaagc aaagcagtga agcttgccct gcactatgga 120
taccgacaca ttgattgtgc acatatctat ttcaacgaag ctgaaattgg tgaagcatta 180
aatgaagtat ttcaagagga aaatctgaaa cgtgaagacc tcttcatcac ttcaaaactt 240
tggtcgaata gccatgcccc agaggatgtt cttcctgcct gtcagacaac attgaaaaat 300
cttcagatag attacttgga tctctacctg attcatatgc cattggcttt ctcaaaagcg 360
tccatgcgac ctcgatgcat agctgacggt gtcctcggat attcacccca acgtattgca 420
aagacgtggg aggccatgga acaacttgtg gaacaagggc tttgtaaagc tattggaatc 480
tcaaatttta cgataaaaaa aacagcaaat cttcttgaga ctgccaagat agtaccagct 540
tgtaaccaag tggaatggca cccatacttt cctcaaccgg ccttaaagaa attcagtgac 600
agcaaaggga ttgtaataac tgcttattct cctctgggat cacctgatcg accttatcca 660
gacaagcaag atcttcccat cctacttaat gacccagttc tgaagaatat cgccgaaaaa 720
cataaaacaa cagttggttt ggttgcttta gcgtggggga ttacctatgg tgttccagtc 780
ctcccaaaag ccgtgtctga gagtcatatc caagagaatc taaaagccct tgacgtgaaa 840
ctagatgaag acgacatgga agcgattaaa aacattggaa cccggtaccg gtatatcaag 900
attagttgga tgttcaagcc ggatgaagtt ccaaaggatc tatgggacgg agaggattga 960
960
<210> 8
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Actin
<400> 8
atcaaaatca ttgctccacc agagaggaag tactctgtct ggattggtgg ttctattcta 60
gcttcactgt ccaccttcca gcagatgtgg attagcaagg ctgaatatga tgagtctgga 120
ccatctattg tgcacaggaa gtgcttctaa 150
<210> 9
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1
<400> 9
cacggcttct ttggtgggat tgactgggaa aatcttctgc gccagaaggc ggagttcatt 60
ccttcactgg aaggggaaga cgacacaagc tactttgatt ctcgcagtga ccgatacagc 120
cacgacttca tcagcgacga ggaagatggc gacgacgaag ctttccagtc ccccttcgaa 180
aatttcacgt ccacggcccc ccgattctca gtcatgttgg agcagcatca gcagagcttt 240
gaggag 246
<210> 10
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5
<400> 10
tcagtcaaca gttcaagacg ttctttttca ccttcgcatt tgcaatattt actaattcta 60
aagcttgctc acaccaccat gattattcca attcgttgtt ttacttgtgg aaaagtaatc 120
ggaaacaagt gggaaacata tcttggtctt cttcaagcag agtacactga aggggatgct 180
ttagatgccc tgggattgaa aagatattgc tgccgaagaa tgctcctttc ccatgtggac 240
ctgattgaaa aacttctaaa ttatgctcca ttagaaaagt ag 282
<210> 11
<211> 2073
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Solute carrier organic anion transporter family member 4A1
<400> 11
atgcacgaag aaagaatgga gagtgcgttc gaaatccaaa gacacgtgag cgatcagtac 60
gatctggaca tcgaaagcga agagttcaga cccgcgtgtg gattgtcaac atggagaccc 120
agatttttgc aacggtttgc aaaggcgaaa tggtttctcg tttttcaatg ctggtttgtt 180
atcgctcagg gtatgattgt atcagggcta tctggagttg ttatttcttc gcttgaaaga 240
cgattctctt tgaaaactaa cgaagttggt gccattgtta gttgttacga catagccgct 300
gcaatcatgg ctgttcttgt aagctactac ggccatcatc acaaacccaa gtggctggga 360
actggagctt ttatcctagg aattggatgc tttttattcg ctctcccaca cgttctggtt 420
gggagatatg agcctggctc cagcggaaca aatctttgca cttcaaatga cggttctgca 480
gaggtagtgt gcaagagttc agtatggttt cacattcttg ctttcatcat agccgagttt 540
ttcattgggg ttggtgctac ccctgtgtac attttaggac catcatatat tgatgaaaac 600
gtcaagcaca ctacttcagg gttgttcctt ggaattatgt atgctgcctc aacattaggt 660
cctgcaattg gctttttgat gggaggagag ttccttgaca tttatgttga tattaaacag 720
ccagacggtg tgaatcttac accagaagac tctaacttta ttggagcatg gtggcttggt 780
tacattgttg gtggtcttct atctattttg gttagccttc cattgcttgc ttttcctcaa 840
gaacttccag gcacccctga aattcgagct gaaaaacaag actatactga ttatatgaag 900
gatgacaaca tgcctcacac tttacaacaa cttctaccga tgttaaagtc ccttcttaca 960
aataaaccat ttgtattcat agctttggca ggaacctttg aaggatttgc tgttagtgga 1020
ttttcaacat ttatgcctaa atttgtagaa acacaatttc atgtctctcc tggccaagct 1080
gcaacataca ctggtattgt agtggtaaca ggtggttgct ctggtatgct gtttggtgga 1140
tatcttatca aacgaatgaa gtggacttgt gataaaataa tcaaggcagc ttttattatt 1200
gcctcatttg caacgctgtg gacttttgga atgttttttg gttgctctaa cagaacattc 1260
attggtgtta cccaaccata tctcaacagt tccagttctg cacttggtag tataagatca 1320
tcatgtaatg ccgcctgcaa ctgtgatgtg aagttctttt cacctctttg ttcacaagaa 1380
gatcaactga cattttattc tccttgtttt gctggttgtt cagcagacaa tttacttggt 1440
gacaaaagtt atcaaaactg tagctgtttt ccagttccat caagtgaagg tattcaagga 1500
agtgggtgca taccagaatg caattcgctt attccatttc tgttttttct ctttggtctc 1560
atgattttca cattctccaa caatattcct gcaaccacag ctacattaag gtgtgttcct 1620
gagagtcaag ggtcccttgc acttggtatc acccagctaa taatacggat tttagccttt 1680
atacctgctc ctattgtctt tggttatatc attgattctg cttgccgttt acatcaggaa 1740
gatccttgtg atccacaggc tgaaagaaat tgtctggaat atgatgctga tctattcagg 1800
tatttgatgg tggcagtcgg tagcatattt aaggcattct ctgcaatttc ctttttcttc 1860
gcatggaaga cttacaagct tcctaattta acacacagac aggactccac cccaagtgat 1920
gtcgcttctc aagtaaccct tgtggatggc cttgttccca aggaaaaatt ggagatacag 1980
tgtgtcccag ccgtgcaact cattaatgtt gaaaattcct cctcagggaa ggtagaagat 2040
gataagtgta acatgaaagt aacatacgtt taa 2073
<210> 12
<211> 171
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Melanotransferrin
<400> 12
atgcgagtat tcattttcct tacaattgca aagctaactg aactctcaag gcgaattctt 60
ttgagactat tctggtgtcg gaatacatgg aatattaatt ttaccaaatt tttgaaacga 120
atttcgttgt cagattggac tgattacctt actgttaatt ttatgggcta a 171
<210> 13
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Melanotransferrin
<400> 13
aatccatcgt ggttgctgca gttgccatat tggaaatata tctcgaactt ctttcgtttt 60
attaaatcaa taaaacagcg aagatttaat ataatgccat tcgcaaacca accaagtatc 120
aaaatcctag agctaacgga agagaatgtc aagtttgtga tagagaacac agaccttagt 180
atggctaatg gcctccgaag aatatttatt gccgaaacgc caacgatagc aatagattgg 240
gtgcaaattg agaacaacac ctctgtgcta catgacgagt ttattgctca cagactagga 300
ttgatacctt tgataagtga tgatgttgta gatcgtttga cttattctcg tgattgtact 360
tgtgatgagt tttgtccaga ctgttctgtt gagctgaaac tagaagtcaa atgctcggat 420
gatcaaacaa gacatgtcac aacgagagat ctaatctctt cggacccaag agttattccg 480
gctacttcaa gacaccatga tgatgaaagc actgaatatg gtgaacaaga tgacatcttg 540
atagttaagc ttcgtaaaag ccaggaactg aagcttcggg catttgctaa aaagggcttt 600
gcaaaggaac atgccaaatg gaatccaaca gctggagtag catttgagta tgaccccgac 660
aatgcattga ggcacactac gtacccaaga ccggaggaat ga 702
<210> 14
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1K
<400> 14
atgcgcgatg cagtatggct caaaagacaa tgtcactgta atagttattc ccctgagatt 60
atgggggaag tatcgttcac agcaggtttc aaaagaacac agcttgttga aaaatataag 120
attcaattgt atgtaatgtt acaaaaaaaa catccatggt cttcttcata ccttgcaagc 180
aaagtttacc atctggagga gatcctctca ctggcacaaa ggaaagaaga agccttagct 240
tgcagggtat cttcttcaca gcctgttatg actaagtctt ga 282
<210> 15
<211> 1260
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synaptotagmin-14
<400> 15
atgtcgaaaa cggacgccga cacgggcacc aaaaaatctg tgtccctttt tgcgttgttc 60
cgatgctgtt tcaaaggtca atggagacca actgttcaaa gaaaaagcgg tgcatacgat 120
gcaaaggacg ctcctccaac ggcagaagag ggaaaggaag ctttggacaa tgaaaaacct 180
ggctccaaat ctaatgattt agaattagaa tacagtgaca aacctgatcc agcagaaccg 240
tttgtctctc ccagcgacga atacaaaccg agcttcgacg aagctagtac tgcgtctgtc 300
gtgccttcca gtgttggaag cgaagaagat caggcaagtt acgacgcgcc aagcaacatc 360
caacttgtac aaaatgacgg gacagcacac ccgcgtgatg tcgggacggg cggacgactc 420
agtctccagt ttatctacga tcctgagaca tccaagatga cactgactat cgtgggcttg 480
gagtttcccc ctttccaaaa ttggaagatg gacgatttgg aagtgagctg catgctgttg 540
cctgttcgac agcatagttt tcgtgtgcgt cccaagaagt tcaaagaccc atttacaatg 600
gttctgacac ccaaagagcg aattaagcaa atgtcccttc gctttcggct gtacgatcat 660
cgcgcaattt caaagcacat gattggtcaa ggtgttgtga atctcgtgga agtgaagttg 720
ggaccagaag cagtgactat agcattggaa ctgaacatac ctgagaccta tgcaattgat 780
tcccgctacg ttacaagcat cacgggtgaa agcaagcaaa cgtccacaga agacagcaaa 840
cccgaactct tgctctcttt ggagtaccgc gccttgacaa ggaagcttat tgccgaggtt 900
atcaagaccc gcaatctcgg gcttctaaat aactccaagc cgcaggacgt tgctgttgag 960
ttgaagctgg ttggcgaaga caacacaatt ctgcgagttt gtcgaaccac gctgaagcga 1020
cacgttatcg acgctgaatt caacgaaatg tttatgttcc gtgtaacgta cgagaagcta 1080
gccatggtca gtgtaatctt cacattgtat cgcgtgggcg aaagacgagc caagagagaa 1140
aatattggtg aagtgtgctt tggaaaacag tccagcagtt accaacagca aaatcattgg 1200
aatgatattg taaagggaag cgagcgagtc tttacacagt ggcatccttt gtttaaataa 1260
1260
<210> 16
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probable ATP-dependent RNA helicase DDX60-like
<400> 16
atggatgtag ttcccatcct tcgtgtggag cgtattcgac gcctaaattc ttacgccctg 60
gacttcttta agcatggatc cgctaaagta atcgagagag aaaacagaat cagagcaggg 120
gaggctttcg ctaagttgaa ggacttttgc ctaaccatca aatcaatcag ttgttccctg 180
gaggagctag gaacagaaag cgacaacgtg gtgcgtgcct ttaagcagct ggcggcagag 240
tttcaagata aattcgaaga acagtttcct cgctattag 279
<210> 17
<211> 486
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma
<400> 17
gagatgaagg agaaagaggc ggggtttcag gaccccctgg acgtcccctt tgagccgagt 60
ggagctgttt ccgtggaaga cttcaaggct cacgtggaga agtatgatgc caagaggcag 120
ctgctatttc aggaggagtt tgagtggatt acgaagaact ctccctggca tgacgccagt 180
gctagcgagg atgagcgcaa tgactccaag aacagataca gcaacatcac agcatttgac 240
cacagtcgag ttaagctgaa ggagaaacct ggcgtggagt gttccgacta catcaatgct 300
aactttatca ccggctacaa tggtcctcgt gagtacattg cctcccaagg tcccctggag 360
aagactgtgg aggacttctg gcggatggtg tgggagcagg ccaccacaac catcatcatg 420
ctcaccaatg tggtggagct gggaaagatg aagtgcactc agtactggcc caacagcaac 480
acgacc 486
<210> 18
<211> 606
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probable RNA helicase SDE3
<400> 18
atcatggacg agggtgctca gtctcgagag ccagaggctc tagcagcact ggtgctggct 60
gatgtagaca cctgcatcat aatagcaggg gaccaccagc aggttggtcc tcaagtagca 120
gtgtacaaca aggtggccag agaggaaggt cttggcacat ctctgcttga gcgcctcttc 180
tcaatctaca aaagtatcaa tgccaaacat tcctccactc tactgaccaa ctatcgctgc 240
caccccagta tcctgatgct ggcctccagc ctcttctatg agtgcactct gctcagcagg 300
agcgacagca aggctctccc ttcggctcct ttccccattg tgttccagtg cagctcattt 360
gacagggaat gcttcgccaa ttcccctgct gaggacgtgg aggaggctga gattcttgtc 420
agcaaaatgc ttgatttcat tcagagtgac tggccaaaaa gtgagaaaca gacgtccatt 480
gggctcctgg ctagtacccg aaaacagacg tcatgcttga aaaggtgctt tcttcaagag 540
tgtcaaagga gaaggtgtca ccaaataacc tcccttgcca tgtggagacc attccaactt 600
acttaa 606
<210> 19
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Putative L-asparaginase
<400> 19
atgggaccag cagccgcaat gtacgtgggc tttgaatcta ctgtgagccg taaagatgcc 60
aagctcctaa gtatagttac tatgcaccat ccactctggc cttggattgc tgatcagctc 120
attaaggacg ttaacccgga aaacccgtat tacagttggt tcaaagacaa caagcctgac 180
gcaaatcaca aaagccactt ggaacagttt gttcatcgct tcttcaaacc agaggataaa 240
gacaagtccc ttcccatttt ccaccaaggg ttggttaatg agctcaactt cttcaacgat 300
gcctgcggtg aacctctgta ttatggaaaa tcagtttata tttag 345
<210> 20
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin essential light chain, striated adductor muscle
<400> 20
gaaggtcaag gctatgtctc caaggctgag gttatccaca tgctcacttg catgggtgag 60
cgttgttctg attcatcaat tgaccagatc tttaagatga cggacaccac tgaagacttg 120
gatggaaaca ttaagtatga agattttatc aagaaggtga tggctggtgg tggtaactaa 180
180
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D F
<400> 21
tgggcgaaac atttacttcc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D R
<400> 22
tcccaatcat ccagtgtgaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aquaporin AQPcic F
<400> 23
tttactgtat gcgccagcac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aquaporin AQPcic R
<400> 24
tacacccaat gatgcttcca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C F
<400> 25
atggacgttt cctccacaag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C R
<400> 26
atggcgtcca gatcaaactc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin-2 essential light chain F
<400> 27
ggcaaagtgg aatcctcaaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin-2 essential light chain R
<400> 28
cgctgtcgaa gacacgtaaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 F
<400> 29
agtgttcacg caaacaccag 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2 R
<400> 30
actccaatcg catcagcac 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin light chain kinase family member 4 F
<400> 31
tttgcgttag caaagacagc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin light chain kinase family member 4 R
<400> 32
ccgacactcc acatgtctgt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A F
<400> 33
ggcacccata ctttcctcaa 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A R
<400> 34
ttttgggagg actggaacac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Actin F
<400> 35
tcaaaatcat tgctccacca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Actin R
<400> 36
ttcagccttg ctaatccaca 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1 F
<400> 37
agaaggcgga gttcattcct 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1 R
<400> 38
atgctgctcc aacatgactg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5 F
<400> 39
ttgctcacac caccatgatt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5 R
<400> 40
aatcaggtcc acatgggaaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Solute carrier organic anion transporter family member 4A1 F
<400> 41
cctgcaattg gctttttgat 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Solute carrier organic anion transporter family member 4A1 R
<400> 42
agcaagcaat ggaaggctaa 20
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Melanotransferrin F
<400> 43
atgcgagtat tcattttcct taca 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Melanotransferrin R
<400> 44
aaggtaatca gtccaatctg acaa 24
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3 F
<400> 45
ttgggtgcaa attgagaaca 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3 R
<400> 46
ttgatcatcc gagcatttga 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1K F
<400> 47
cgatgcagta tggctcaaaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein phosphatase 1K R
<400> 48
tttcctttgt gccagtgaga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synaptotagmin-14 F
<400> 49
cgtccacaga agacagcaaa 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synaptotagmin-14 R
<400> 50
tcgataacgt gtcgcttcag 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATP-dependent RNA helicase DDX60-like F
<400> 51
gagcgtattc gacgcctaaa 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATP-dependent RNA helicase DDX60-like R
<400> 52
ctcctccagg gaacaactga 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma F
<400> 53
ggaagacttc aaggctcacg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma R
<400> 54
cgactgtggt caaatgctgt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA helicase SDE3 F
<400> 55
tccagtgcag ctcatttgac 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA helicase SDE3 R
<400> 56
cacatggcaa gggaggttat 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-asparaginase F
<400> 57
caatgtacgt gggctttgaa 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-asparaginase R
<400> 58
gtggaaaatg ggaagggact 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin essential light chain, striated adductor muscle F
<400> 59
ggctatgtct ccaaggctga 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myosin essential light chain, striated adductor muscle R
<400> 60
ccagccatca ccttcttgat 20
Claims (12)
- 하기 모든 유전자의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 거품돌산호의 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이(microarray):
서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle).
- 제 1항에 있어서, 상기 유전자가 거품돌산호(Alveopora japonica)로부터 유래된, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이.
- 제 1항에 있어서, 상기 산성화된 해수가 pH 6 내지 7.7인, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 마이크로어레이.
- 1) 산성화된 해수에 노출된 실험군인 거품돌산호와 대조군인 거품돌산호에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지 하는 단계;
3) 단계 2)의 각각 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이와 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이를 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이에 집적된 유전자 발현정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC, RITC 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법.
- 1) 산성화된 해수에 노출된 실험군인 거품돌산호와 대조군인 거품돌산호에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를 하기 각각의 유전자에 상보적이며 유전자 증폭이 가능한 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하는 단계:
서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle); 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인 방법.
- 제 1항의 마이크로어레이를 포함하는 거품돌산호의 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트(kit).
- 제 7항에 있어서, 상기 산성화된 해수가 pH 6 내지 7.7인, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트.
- 제 7항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질, 화학형광물질 및 화학발광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질을 추가적으로 포함하는, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트.
- 제 7항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTP 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약 및 세척 완충용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 반응시약을 추가적으로 포함하는, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트.
- 하기 각각의 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 모든 프라이머 쌍을 포함하는 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트:
서열번호 1로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D), 서열번호 2로 기재되는 유전자(aquaporin AQPcic), 서열번호 3으로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C), 서열번호 4로 기재되는 유전자(myosin-2 essential light chain), 서열번호 5로 기재되는 유전자(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 2), 서열번호 6으로 기재되는 유전자(myosin light chain kinase family member 4), 서열번호 7로 기재되는 유전자(alcohol dehydrogenase [NADP(+)] A), 서열번호 8로 기재되는 유전자(actin), 서열번호 9로 기재되는 유전자(microtubule-associated serine/threonine-protein kinase 1), 서열번호 10으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunit RPABC5), 서열번호 11로 기재되는 유전자(solute carrier organic anion transporter family member 4A1), 서열번호 12로 기재되는 유전자 (melanotransferrin), 서열번호 13으로 기재되는 유전자(DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB3), 서열번호 14로 기재되는 유전자(protein phosphatase 1K), 서열번호 15로 기재되는 유전자(synaptotagmin-14), 서열번호 16으로 기재되는 유전자(ATP-dependent RNA helicase DDX60-like), 서열번호 17로 기재되는 유전자(receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma), 서열번호 18로 기재되는 유전자(RNA helicase SDE3), 서열번호 19로 기재되는 유전자(L-asparaginase) 및 서열번호 20으로 기재되는 유전자(myosin essential light chain, striated adductor muscle).
- 제 11항에 있어서, 상기 산성화된 해수가 pH 6 내지 7.7인, 산성화된 해수에 대한 노출 여부 확인용 키트.
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