KR20180080241A - 어려운 시료 타입을 위한 시료 준비 - Google Patents
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Abstract
어려운 시료 타입의 수집 및 취급을 위한 장치 및 방법이 제공된다. 본 개시의 일 양태에서, 시료 수집 방법이 제공되고, 방법은 스왑을 이용하여 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 수집하는 단계, 수집된 시료를 갖는 스왑을 시료 완충액에 배치하는 단계, 및 시료를 여과시키는 단계를 포함한다. 다양한 예시적인 구체예에서, 시료 완충액은 프로테아제 또는 디터전트를 포함할 수 있으며, 뭉쳐진 스왑을 이용하여 시료는 수집되고, 시료 완충액으로 전달될 수 있다.
Description
우선권 기술
본 출원은 35 U.S.C.§119(e)하에서 2015년 11월 2일에 출원된 미국 임시 출원 제62/249,592호의 이익을 주장하고, 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
1. 기술분야
본 개시의 구체예는 전반적으로 시료로부터 핵산을 추출하는 장치 및 방법에 관한 것이다.
2. 배경
미국, 캐나다 및 서유럽에서 전염병은 인간 사망률의 약 7%를 차지하지만 개발 도상국에서는 감염성 질환이 인간 사망률의 40% 이상을 차지한다. 감염성 질환은 다양한 임상적 징후(clinical manifestation)로 이어진다. 공통된 명백한 징후 중에는 발열, 폐렴, 수막염, 설사 및 혈액을 동반하는 설사가 있다. 신체적 징후는 몇 가지 병원체을 시사하고 병인체(etiological agent)로서 다른 것들을 제거하지만, 다양한 잠재적인 원인 인자(causative agent)들이 남아있으며, 명확한 진단은 대개 다양한 분석이 수행될 것을 요구한다. 병원체을 진단하기 위한 전통적인 미생물 기법은 수일 또는 수주를 소요할 수 있고, 자주 적절한 치료 과정을 지연시킨다.
최근에, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)은 감염 인자의 신속한 진단을 위한 선택 방법이 되었다. PCR은 감염성 질환을 진단하기 위한 신속하고, 민감하며, 특이적인(specific) 도구일 수 있다. 진단의 주요 수단으로서 PCR을 사용하는 것에 대한 문제는 일부 병리학적 표본에 있는 가능한 원인성 개체(causative organisms) 또는 바이러스의 다양성 및 개체 또는 바이러스의 낮은 수준이다. 대부분은 음성(negative)일 것으로 예상이 되는, 가능한 원인성 개체나 바이러스 각각에 대해 하나씩, 다수의 PCR 분석(large panels of PCR assays)을 실행하는 것은 대개 비실용적이다. 병원체 핵산이 낮은 농도이고 적절한 반응 템플릿을 수집하기 위해 많은 양의 시료가 필요할 때 문제가 악화된다. 일부 경우에, 모든 가능한 병인체에 대해 분석하기에 부적절한 시료가 있다. 해결책은 시료가 단일 반응에서 다수의 표적(target)에 대해 동시에 분석되는 "다중 PCR(multiplex PCR)"을 실행하는 것이다. 다중 PCR은 일부 시스템에서 유익한 것으로 입증되었지만, 고수준 다중(high level multiplex) 반응의 강인성(robustness) 및 복수의 산물의 명확한 분석에 대한 어려움과 관련하여 단점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 분석은 이어서 복수개의 2차 PCR로 분할될 수 있다. 1차 산물 내에서 중첩 2차 반응(nesting secondary reaction)은 강인성을 증가시킨다. FilmArray®(BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, UT)와 같은 폐쇄 시스템(closed system)은 취급(handling)을 줄여, 오염 위험을 감소시킨다.
시료 준비는 종종 더 단단한 재료, 예를 들면 포자 및 파라핀 보존 시료로부터 핵산의 방출을 위한 강한 추출 및 용해 조건과 핵산의 분해, 특히 쉽게 용해되고 더 긴 염색체를 갖는 오염물 중 핵산의 분해를 최소화시킬 수 있는 더 온화한 용해 조건 사이의 균형이다. 시료에 존재할 수 있는 다른 핵산을 분해하지 않으면서 더 단단한 물질로부터 핵산을 추출할 수 있는 것이 바람직할 것이다.
또한, 특정 시료 타입은 취급하기 어려울 수 있다. 생물학적 처리 시스템에 고체, 반-고체 또는 점성 시료를 도입하기가 어려울 수 있다. 객담(sputum)과 같은 시료 타입은 피펫팅 및 측정이 어렵고, 점도를 낮추고 시료 매트릭스(sample matrix)를 부수기 위해, 종종 시료 처리에 앞서 일정 기간 동안, 예를 들면 열 또는 디티오트레이톨(dithiothreitol)에 의한 전처리가 필요하다. 객담 외에, 다른 어려운 생물학적 시료는 점액, BAL 및 기타 호흡기 시료 타입, 대변, 조직, 조직 균질액(tissue homogenate), 분쇄된 조직(ground tissue), 파라핀 처리 포르말린 포매 조직(paraffin treated formalin embedded tissue), 뼈, 뼈 균질물(bone homogenate), 딱지(eschars), 고름(puss), 활액(synovial fluid), 림프절 흡인물(lymph node aspirate) 및 위 세척액(stomach washing)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 환경적 시료, 토양, 표면, 분말 또는 식품은 종종 고체 또는 반고체이며 문제를 야기할 수도 있다. 더욱이, 시료 전처리 동안의 광범위한 취급은 교차 오염(cross-contamination)을 초래할 수 있고, 시간 소모적일 수 있으며, 종종 시료를 희석시켜, 종종 감소된 감도(sensitivity)를 초래한다.
본 발명은 생물학적 분석을 위해, 예를 들면, 시료로부터 핵산을 정제하기 위한 추가 시험 전, 시료를 준비하는 것과 관련된 다양한 문제를 다룬다.
발명의 요약
본 개시의 일 양태에서, 시료 수집 방법이 제공되며, 이 방법은 스왑(swab)을 이용하여 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 수집하는 단계, 수집된 시료를 갖는 스왑을 시료 완충액에 배치하는 단계, 및 시료를 여과시키는 단계를 포함한다. 다양한 예시적인 구체예에서, 시료 완충액은 프로테아제(protease) 또는 디터전트(detergent)를 포함할 수 있으며, 시료는 뭉쳐진 스왑(flocked swab)을 이용하여 수집되고, 시료 완충액으로 전달(transfer)될 수 있다.
또 다른 양태에서, 시료 수집 방법이 제공되며, 방법은 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 수집하는 단계, 및 시료를 시료 완충액에 배치하는 단계로서, 시료 완충액은 시료 완충액의 부피 기준으로 10% 이상의 양으로 디터전트를 포함하는 것인 단계를 포함한다. 예시적인 구체예(illustrative embodiment)는 필터를 통해 시료를 통과시키는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 시료 수집 방법이 제공되며, 이 방법은 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 시료 매트릭스보다 개체를 우선적으로 수집하고 방출하는 물질과 접촉시키는 것에 의해 시료를 수집하는 단계, 및 수집된 시료를 갖는 물질을 시료 완충액에 배치하는 단계를 포함한다. 예시적으로, 이 물질은 친수성 물질 또는 흡착성(adsorbent) 물질이다. 일 구체예에서, 이 물질의 고정된 양은 4 배 범위 내에서 재현성 있게 상당한 양의 시료(an amount of the sample)를 흡수하고 방출한다.
개시의 다른 양태에서, 캐뉼라가 달린 바이알(cannulated vial)로서, 캐뉼라가 달린 바이알은 일 말단에 상부 표면(top surface), 반대 말단에 하부 표면(bottom surface) 및 그 사이에 내부 바이알 부피(interior vial volume)를 정의하는 외벽(exterior wall)을 갖고, 상부 표면은 개구부(opening)를 갖는 것인 바이알 본체, 하부 표면으로부터 연장되고, 제 1 말단, 제 2 말단, 및 그 사이에 캐뉼라 부피를 정의하는 외부 표면을 갖고, 제 1 말단은 내부 바이알 부피와 유체 소통(fluid communication)하는 것인 캐뉼라, 및 바이알 본체와 캐뉼라 사이에 배치된 필터를 포함하는 것인 캐뉼라가 달린 바이알, 및 캐뉼라가 달린 바이알에 제공된 첨가제가 제공된다.
본 개시의 또 다른 양태에서, 시료 용기(sample container)가 제공되며, 시료 용기는 시료를 수용하도록 구성된 개구부(opening), 유체를 유지하도록 구성된 본체, 시료가 유출될 수 있도록 구성된 개구부, 본체와 유출 개구부(exit) 사이에 배치된 필터, 및 시료를 처리하기 위해 제공된 첨가제를 포함한다. 예시적으로, 첨가제는 시료 용기에 건조된 상태로 제공될 수 있다. 예시적인 첨가제는 프로테아제, DNA 분해효소(DNAse), DNA 분해효소 억제제, RNA 분해효소(RNAse), RNA 분해효소 억제제 및 리소자임을 포함한다.
개시의 또 다른 양태에서, 첨가제를 시스템에 도입하는 방법이 제공되며, 이 방법은 전술된 시료 용기를 수득하는 단계, 시료 용기가 유체를 유지(holding)하는 단계, 개구부를 통해 시료를 유체(fluid)로 도입하는 단계, 필터를 통해 유체를 통과시키고, 및 유출 개구부로 빼내는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 직접적인 혈액 시료로부터 핵산을 증폭시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 직접적인 혈액 시료를 시료 완충액에 첨가하는 단계, 시료 완충액을 비드 비팅(bead beating)하는 단계, 시료 완충액으로부터 핵산을 추출하는 단계 및 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 예시적으로 그러한 방법들은 폐쇄된 시료 용기(closed sample vessel) 내에서 수행될 수 있다. 다른 예시적 방법에서, 단계들은 하나 이상의 원심분리, 에탄올 침전 및 DNA 분해(DNA digestion) 없이 수행된다.
본 발명의 구체예의 부가적인 특징 및 장점은 다음의 설명에서 설명되거나 그러한 구체예들의 실시에 의해 습득될 수 있다. 이러한 구체예의 특징 및 장점은 첨부된 청구항에서 특별히 언급된 기구들 및 조합에 의해 획득되고 실현될 수 있다. 이들 및 기타 특징들은 이하의 설명 및 첨부된 청구항으로부터 보다 완전히 명백해지거나, 또는 후술되는 그러한 구체예들의 실시에 의해 습득될 수 있다.
상세한 설명
이하, 첨부된 도면을 참조하여 예시적인 구체예가 설명된다. 본 개시의 사상(spirit) 및 교시(teachings)를 벗어나지 않으면서 다수의 다른 형태 및 구체예가 가능하고, 따라서 개시는 본 명세서에서 설명된 예시적인 구체예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이러한 예시적인 구체예들은 본 개시가 철저하고 완전하고, 개시의 범위를 당업자에게 전달하도록 제공된다. 도면에서 크기 및 층 및 영역의 상대적 크기는 명확성을 위해 과장될 수 있다. 동일한 참조 번호는 설명 전반에 걸쳐 동일한 요소를 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학용어 포함)는 본 개시와 관련된 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 문맥에서의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 본 명세서에 명시적으로 정의되어 있지 않은 이상 이상적이거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안되는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 설명에서 사용된 전문 용어(terminology)는 특정 구체예만을 설명하기 위한 목적이며, 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 기술된 것과 동등하거나 유사한 다수의 방법 및 재료가 본 개시의 실시에 사용될 수 있지만, 특정 예시적인 재료 및 방법만이 본 명세서에 기술된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 또는 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로서 포함된다. 용어의 불일치(conflict)가 있는 경우 본 명세서가 우선한다.
장치, 시스템, 방법 등을 포함하는 본 개시의 다양한 양태는 하나 또는 이상의 예시적인 구현을 참조하여 설명될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "예시적인(exemplary)" 및 "설명적인(illustrative)"은 "예(example), 사례(instance), 실례(illustration)로서 역할을 하는"을 의미하고, 본 명세서에 개시된 다른 구현보다 선호되거나 유리한 것으로 필연적으로 해석되어서는 안된다. 또한, 본 개시 또는 발명의 "구현(implementation)" 또는 "구체예(embodiment)"에 대한 언급은 그의 하나 이상의 구체예에 대한 특정 참조를 포함하고, 그 반대도 마찬가지이며, 발명의 범위를 제한하지 않는 설명적인 실시예를 제공하도록 의도되며, 발명의 범위는 하기 설명에 의해서라기 보다는 첨부된 청구항에 의해 명시된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다는 것이 주목될 것이다. 따라서, 예를 들면, "타일(a tile)"에 대한 언급은 하나, 둘 또는 그 이상의 타일들을 포함한다. 유사하게, 대상의 복수에 대한 언급은 내용 및/또는 문맥이 다르게 명확히 지시하지 않는 한, 단일 대상 및/또는 복수의 대상들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서,"타일들(tiles)"에 대한 언급은 복수의 그러한 타일들을 반드시 요구하지 않는다. 대신에, 접합(conjugation)과 무관하게 하나 또는 그 이상의 타일이 본 명세서에서 고려된다고 이해될 것이다.
본 출원 전체에 걸쳐 사용된 단어 "할 수 있다(can)" 및 "일 수 있다(may)"는 강제적인 의미(의무(must)의 의미) 보다는 임의의 의미(가능성을 갖는다는 의미)로 사용된다. 또한, 용어 "포함하는(including)", "갖는(having)", "수반하는(involving)", "함유하는(containing)", "특징으로 하는(characterized by)", 그의 변형(예를 들면, "포함한다(includes)", "갖는다(has)", "수반한다(involves)", "함유한다(contains)" 등) 및 청구항을 포함하여 본 명세서에서 사용된 유사한 용어는 포괄적이고 및/또는 개방형(open-ended) 이며, 단어 "포함하는(compising)" 및 그의 변형(예를 들면 "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)")과 동일한 의미를 가지며, 예시적으로, 추가적인, 기재되지 않은(un-recited) 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용된,“상부(top)", "bottom(하부)" "좌(left)", "우(right)", "위(up)", "아래(down)", "위쪽의(upper)," "아래쪽의(lower)", "내부의(inner)", "외부의(outer)", "내부의(internal)", "외부의(external)", "내부(interior)", "외부(exterior)", "근위(proximal)", "원위(distal)", "정방향(forward)", "역방향(reverse)" 등과 같은 방향성 및/또는 임의의 용어는 단지 상대적인 방향 및/또는 배향(orientation)을 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 달리 명세서, 발명 및/또는 청구항을 포함하는 본 개시의 범위를 제한하도록 의도되는 것은 아니다.
구성 요소가 다른 구성 요소에 "결합된(coupled)", "연결된(connected)", 또는 "대응하는(responsive)" 또는 "위에(on)" 있는 것으로 표현될 때, 그것은 다른 구성 요소와 직접 결합되거나, 연결되거나, 또는 대응되거나 또는 위에 있거나, 개재 요소(intervening elements)가 존재할 수도 있다고 이해될 것이다. 대조적으로, 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 결합된(directly coupled)", "직접 연결된(directly connected)", "직접 대응되는(directly responsive)" 또는 "직접 위에(directly on)" 있는 것으로 표현될 때, 개재 요소는 존재하지 않는다.
본 발명의 개념의 예시적인 구체예는 예시적인 구체예의 이상적인 구체예(및 중간 구조)의 개략도인 단면도(schematic illustration)를 참조하여 본 명세서에서 설명된다. 따라서, 예를 들면 제조 기법 및/또는 허용오차(tolerance)의 결과로서 예시(illustration)의 형태으로부터의 변형이 예측된다. 따라서, 본 발명의 개념의 예시적인 구체예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되나, 예를 들면 제조로부터 비롯되는 형상의 편차(deviation)를 포함해야 한다. 따라서 도면들에 도시된 영역들은 속성상 개략적이고, 그들의 형상은 장치의 영역의 실제 형상을 설명하기 위한 것은 아니며, 예시적인 구체예의 범위를 한정하도록 의도되지않는다.
용어 "제 1(first)", "제 2(second)" 등은 다양한 요소를 설명하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있지만, 이들 요소는 이들 용어에 의해 제한되어서는 안 되는 것으로 이해될 것이다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 것과 구별하기 위해서만 사용된다. 그러므로 "제 1" 요소는 본 구체예의 교시(teaching)를 벗어나지 않으면서 "제 2" 요소로 지칭될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 설명된 다양한 구현은 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서, 설명되거나 개시된 다른 구현들와 조합하여 활용될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 개시의 특정 구현예에 따른 제품, 부재(member), 요소, 장치, 기구, 시스템, 방법, 공정, 조성물, 및/또는 키트는 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 시스템, 방법, 기구 및/또는 동종물을 포함하는 다른 구현예에서 설명된 특성, 특징, 성분, 부재, 요소, 단계 및/또는 동종물을 함유, 통합(incorporate), 또는 달리 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현과 관련하여 특이적인 특징(specific feature)에 대한 언급은 상기 구현 내에서만의 적용으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 표제는 단지 구조적인 목적(organizational purpose)을 위한 것이며, 설명 또는 청구항의 범위를 제한하는데 사용되도록 의도되지 않는다. 이해를 돕기 위해 가능한 경우, 도면들에 공통된 동일 요소들을 지칭하기 위해 동일한 참조 번호들이 사용되었다. 또한, 가능한 경우 다양한 도면에서 구성 요소에 대한 동일 번호 부여(like numbering)가 사용되었다. 또한, 특정 구성 요소의 대안적 구성은 각각 구성 요소의 번호에 첨부된 개별적인 문자를 포함할 수 있다.
용어 "약(about)"은 본 명세서에서 대체로(approximately), 부근에(in the region of), 거의(roughly) 또는 대략(around)을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 명시된 수치 값의 위와 아래 경계를 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 언급된 값의 위와 아래의 수치를 5 %의 분산만큼, 수정하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 그러한 범위가 표현될 때, 다른 구체예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행하는 "약"의 사용에 의해 값이 근사값으로 표현될 때, 특정 값은 또다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 또한 각 범위의 종료점(endpoint)은 다른 종료점과 관련해서 및 다른 종료점에 관계없이 모두 유의한 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 단어 "또는(or)"은 특정 목록의 하나의 일원(member)를 의미하고 또한 그 목록의 일원들의 조합을 포함한다.
"시료(sample)"는 동물; 동물의 조직 또는 기관; 세포(피험자 내에서, 피험자에서 직접 채취되거나, 또는 배양물 중 유지된 세포 또는 배양된 세포주로부터의 세포); 세포 용해물(또는 용해물 분획(lysate fraction)) 또는 세포 추출물; 세포, 세포성 물질 또는 바이러스성 물질로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 분자(예를 들면, 폴리펩티드 또는 핵산)를 포함하는 용액; 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 분석되는 비-천연(non-naturally occurring) 핵산을 포함하는 용액을 의미한다. 또한, 시료는 숙주 또는 병원체 세포, 세포 성분 또는 핵산을 포함하거나, 또는 포함하지 않을 수 있는 체액 또는 배설물(예를 들면, 혈액, 소변, 대변, 타액, 눈물, 담즙 또는 뇌척수액이나, 이에 한정되지 않음)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 어구 "핵산(nucleic acid)"은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 의해 상보적인 핵산으로 혼성화될 수 있는, DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드, 단일가닥 또는 이중가닥, 센스(sense) 또는 안티센스(antisense)에 관계없이 천연 또는 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 의미한다. 본 발명의 핵산은 또한 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analog)(예를 들면, BrdU) 및 비-포스포디에스테르 신터뉴클레오시드 결합(non-phosphodiester internucleoside linkages)(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA) 또는 티오에스테르 결합)을 포함할 수 있다. 특히, 핵산은 한정없이, DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
"프로브(probe)", "프라이머(primer)" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 상보적인 서열(complementary sequence)을 포함하는 제 2 핵산 분자("표적(target)")와 염기쌍을 이룰 수 있는 정의된 서열의 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 결과적으로 형성된 하이브리드의 안정성은 발생하는 염기쌍의 길이, GC 함량, 및 정도에 의존한다. 염기쌍 형성의 정도는 프로브와 표적 분자 사이의 상보성의 정도 및 혼성화 조건의 엄격성(stringency)의 정도와 같은 파라미터에 의해 영향을 받는다. 혼성화 엄격도(degree of hybridization stringency)는 온도, 염 농도, 및 포름아미드(formamide)와 같은 유기 분자의 농도와 같은 파라미터에 의해 영향을 받고, 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정된다. 프로브, 프라이머, 및 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 방사성, 형광성, 또는 비-방사성(non-radioactively) 중 어느 하나로 검출 가능하게 표지될 수 있다. dsDNA 결합 염료가 dsDNA를 검출하는데 사용될 수 있다. "프라이머"는 폴리머라제(polymerase)에 의해 연장되도록 특이적으로 구성되고(configured), "프로브" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 이와 같이 구성될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 것으로 이해된다.
"dsDNA 결합 염료(dsDNA binding dyes)"는 단일 가닥 DNA에 결합되거나 용액 중에 유리될 때보다 이중 가닥 DNA에 결합될 때 통상적으로 형광을 더 강하게 발생시키는 것에 의해 차등적으로 형광을 발생시키는 염료를 의미한다. dsDNA 결합 염료에 대해 언급되더라도, 본 명세서에서 적합한 염료가 사용될 수 있고, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,387,887호에 일부 비-제한적인 예시적인 염료가 기재된 것으로 이해된다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들면 효소, 항체 등, 핵산 증폭 및 용융(melting)을 검출하기 위해, 기타 신호 생성 물질(signal producing substances)을 사용할 수 있다.
“특이적으로 혼성화한다(specifically hybridizes)"는 것은 높은 엄격성 조건하에서 프로브, 프라이머, 또는 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 상보적인 핵산(예를 들면 시료 핵산)을 인식하고, 물리적으로 상호작용하며(즉, 염기쌍 형성), 다른 핵산과 실질적으로 염기쌍을 이루지 않는 것을 의미한다.
“높은 엄격성 조건(high stringency conditions)"은 대략 용융 온도(melting temperature)(Tm) 마이너스 5℃(예를 들면, 프로브의 Tm 보다 5℃ 아래)에서 전형적으로 발생하는 것을 의미한다. 기능적으로, 높은 엄격성 조건은 80%이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 식별(identify)하는데 사용된다.
PCR은 본 명세서의 실시예에서 사용되는 증폭 방법이지만, 프라이머를 사용하는 증폭 방법이 적합할 수 있다고 이해된다. 그러한 적절한 과정은 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR); 가닥 변위 증폭(strand displacement amplification)(SDA); 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)(NASBA); 캐스케이드 롤링 서클 증폭(cascade rolling circle amplification)(CRCA), DNA의 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification of DNA)(LAMP); 핵산의 등온 및 키메라 프라이머-개시 증폭(isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)(ICAN); 표적 기반 헬리카제 의존성 증폭(target based-helicase dependent amplification)(HDA); 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification)(TMA) 등을 포함한다. 따라서, PCR이라는 용어가 사용되는 경우에, 다른 대체 증폭 방법을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 별개의 사이클이 없는 증폭 방법에 있어서, 측정이 사이클 또는 Cp로 이루어지는 경우에 반응시간이 이용될 수 있고, 부가적인 PCR 사이클이 본 명세서에 기술된 구체예에서 추가되는 경우, 부가적인 반응 시간이 추가될 수 있다. 따라서 프로토콜이 적절히 조정되어야 할 필요가 있을 수 있다고 이해된다.
본 명세서의 다양한 실시예가 인간 표적 및 인간 병원체를 언급하나, 이러한 실시예는 단지 예시일 뿐이다. 본 명세서에서 기술된 방법, 키트, 및 장치는 인간, 수의학적(veterinary), 산업적 및 환경적 시료를 포함하는 매우 다양한 시료로부터 매우 다양한 핵산 서열을 검출하고 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 다양한 구체예는, 예시적으로 단일 폐쇄 시스템에서, 예시적으로 항원 및 핵산 서열과 같은 다양한 생물학적 물질의 존재에 대해 시료를 분석하기 위한 자가-함유 핵산 분석 파우치(self-contained nucleic acid analysis pouch)를 사용한다. 파우치와 함께 사용하기 위한 기구 및 파우치를 포함하는 이러한 시스템이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,394,608호; 및 제8,895,295호; 및 미국 특허 출원 제2014-0283945호에 보다 상세히 개시된다. 그러나 이러한 파우치는 단지 예시적인 것이며, 본 명세서에서 논의된 핵산 제조 및 증폭 반응은 당 업계에 공지되어 있는 다양한 핵산 정제 및 증폭 시스템을 사용하여, 96-웰 플레이트, 기타 배열의 플레이트, 어레이, 캐러셀(carousel) 등을 포함하는, 당 업계에 공지된 다양한 개방형 또는 폐쇄형 시스템 시료 용기 중 임의의 용기에서 수행될 수 있다고 이해된다. 본 명세서에서 용어 "시료 웰(sample well)", "증폭 웰(amplification well)", "증폭 용기(amplification container)" 등이 사용되지만, 이들 용어는 이러한 증폭 시스템에서 사용되는 웰, 튜브, 및 다양한 기타 반응 용기를 포함하도록 의도된다. 하나의 구체예에서 파우치는 복수개의 병원체를 분석(assay)하는데 사용된다. 파우치는 예를 들면 폐쇄 시스템에서, 시료 웰로서 사용되는 하나 또는 그 이상의 블리스터(blister)를 포함할 수 있다. 예시적으로, 용융-곡선 분석과 같은 증폭 후 분석 또는 선택적인 실시간 검출(detection)로 완결되는, 핵산 제조, 1차 대용량 다중 PCR(primary large volume multiplex PCR), 1차 증폭 산물의 희석, 및 2차 PCR을 포함하는 다양한 단계가 선택적 일회용 파우치(optionally disposable pouch)에서 수행될 수 있다. 또한, 다양한 단계가 본 발명의 파우치에서 수행될 수 있지만, 특정 용도에 대해 하나 또는 그 이상의 단계가 생략될 수 있으며, 그에 따라 파우치 구성이 변경될 수 있다고 이해된다.
도 1은 다양한 구체예에서 사용될 수 있거나 다양한 구체예들을 위해 재구성될 수 있는 예시적인 파우치(510)을 도시한다. 파우치(510)는 미국 특허 제8,895,295호의 도 15와 유사하며, 동일한 항목은 동일한 번호가 부여된다. 피트먼트(fitment)(590)에 입구 채널(515a 내지 515l)이 제공되고, 시약 저장소(reagent reservoirs) 또는 폐기물 저장소로도 작용한다. 예시적으로, 시약은 피트먼트(590)에서 동결 건조되고 사용 전에 재수화(rehydrated)될 수 있다. 각각의 채널(514, 538, 543, 552, 553, 562, 및 565)을 갖는 블리스터(522, 544, 546, 548, 564 및 566)는 미국 특허 제8,895,295호의 도 15의 동일 번호의 블리스터와 유사하다. 도 1의 제 2 단계 반응 영역(Second-stage reaction zone)(580)은 미국 특허 제8,895,295호의 것과 유사하지만, 고밀도 어레이(581)의 제 2 단계 웰(582)은 다소 다른 패턴으로 배열된다. 도 1의 고밀도 어레이(581)의 보다 원형의 패턴(more circular pattern)은 모서리에서 웰을 제거하여 제 2 단계 웰(582)의 보다 균일한 충전(filling)을 가져올 수 있다. 도시된 바와 같이, 고밀도 어레이(581)에 102 개의 제 2 단계 웰(582)이 제공된다. 파우치(510)는 필름 어레이(FilmArray®) 기구(BioFire Diagnostics, LLC, UT, Salt Lake City)에서의 사용에 적합하다. 그러나, 파우치 구체예는 단지 예시적인 것으로 이해된다.
다른 용기가 사용될 수 있지만, 예시적으로, 파우치(510)는 압출(extrusion), 플라즈마 침착(plasma deposition) 및 라미네이션(lamination)을 포함하는, 당 업계에 공지된 공정(process)에 의해 제조될 수 있는 폴리에스테르, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트 및 이들의 혼합물과 같은 유연한 플라스틱 필름 또는 기타 유연한 재료의 2개의 층으로 형성될 수 있다. 금속 포일(Metal foils) 또는 알루미늄 적층물lmamination)을 갖는 플라스틱도 사용될 수 있다. 블리스터 및 채널을 형성하도록 함께 밀봉될 수 있는 기타 배리어(barrier) 재료가 당 업계에 공지되어 있다. 플라스틱 필름이 사용되는 경우, 층들은 예시적으로 가열 밀봉에 의해, 함께 결합될 수 있다. 예시적으로, 그 재료는 낮은 핵산 결합능(nucleic acid binding capacity)을 갖는다.
형광 모니터링을 사용하는 구체예에 대해서, 작동 파장(operative wavelength)에서 자가-형광(auto-fluorescence) 및 흡광도가 적절하게 낮은 플라스틱 필름이 바람직하다. 그러한 재료는 상이한 플라스틱, 상이한 가소제(plasticizer) 및 합성 비율(composite ratio) 및 필름의 상이한 두께를 시험함으로써 확인될 수 있다. 알루미늄 또는 기타 포일 적층물(foil lamination)을 갖는 플라스틱의 경우, 형광 검출 장치에 의해 판독될 파우치 부분은 포일없이 남겨질 수 있다. 예를 들면, 형광이 파우치(510)의 제 2 단계 반응 영역(580)의 제 2 단계 웰(582)에서 모니터링되는 경우, 웰(582)에서 하나의 층 또는 두 개의 층 모두가 포일없이 남게 된다. PCR의 예에서, 약 0.0048 인치(0.1219 mm) 두께의 폴리에스테르(Mylar, Dupont, Wilmington DE) 및 0.001-0.003 인치(0.025-0.076 mm) 두께의 폴리프로필렌 필름으로 구성된 필름 적층물이 잘 수행된다. 예시적으로, 파우치(510)는 입사광의 약 80% 내지 90%를 투과시킬 수 있는 투명한 물질로 제조된다.
예시적인 구체예에서, 재료는 블리스터 및 채널 상에 압력, 예시적으로 공압(pneumatic pressure)의 적용에 의해 블리스터들 사이에서 이동된다. 따라서, 압력을 사용하는 구체예에서, 파우치 재료는 예시적으로 압력이 원하는 효과를 가질 수 있도록 충분히 유연하다. 용어 "유연한(flexible)"은 본 명세서에서 파우치의 재료의 물리적 특성을 설명하기 위해 사용된다. 용어 "유연한(flexible)"은 본 명세서에서 크래킹(cracking), 파괴(breaking), 잔금(crazing) 등을 일으키지 않고 본 명세서에서 사용되는 압력의 수준(level)에 의해 용이하게 변형 가능한 것으로 정의된다. 예를 들어, Saran™ 랩(wrap) 및 Ziploc® 백(bag)과 같은 얇은 플라스틱 시트 및 알루미늄 포일과 같은 얇은 금속 포일도 유연하다. 그러나, 공압을 사용하는 구체예에서도, 블리스터 및 채널의 특정 영역만 유연할 필요가 있다. 또한, 블리스터 및 채널이 쉽게 변형가능한 한, 블리스터 및 채널의 한쪽면만이 유연할 필요가 있다. 파우치(510)의 다른 영역은 강성 재료(rigid material)로 만들어질 수 있거나, 강성 재료(rigid material)로 보강될 수 있다.
예시적으로, 플라스틱 필름이 파우치(510)에 사용된다. 금속, 예시적으로, 알루미늄 또는 다른 적절한 재료의 시트가 돋아진 표면(raised surface)의 패턴을 갖는 주형(die)을 생성하기 위해 밀링(mill)되거나 달리 절단될 수 있다. 195℃의 작동 온도에서 예시적으로 조절되는 공압 프레스(pneumatic press)(예를 들면, A-5302-PDS, Janesville Tool Inc., Milton WI)에 장착될 때, 공압 프레스는 인쇄 프레스처럼 작동하여, 주형이 필름과 접촉하는 곳에서만 플라스틱 필름의 밀봉 표면을 녹여준다. 파우치(510)가 형성됨에 따라, PCR 프라이머(예시적으로 필름상에 스팟팅(spotted)되고 건조됨), 항원 결합 기질(antigen binding substrate), 자성 비드(magnetic bead) 및 지르코늄 실리케이트 비드(zirconium silicate bead)와 같은 다양한 성분이 다양한 블리스터 내부에 밀봉될 수 있다. 시료 처리를 위한 시약은 밀봉 전에, 집합적으로 또는 개별적으로 필름에 스팟팅될 수 있다. 일 구체예에서, 뉴클레오티드 트리-포스페이트(NTP)가 폴리머라제 및 프라이머와 별도로 필름 상에 스팟팅되어, 반응이 수성 시료에 의해 수화될 때까지 폴리머라제의 활성을 본질적으로 제거한다. 수성 시료가 수화 전에 가열되면, 이는 진정한 핫-스타트 PCR(hot-start PCR)을 위한 조건을 생성하고 고가의 화학적 핫-스타트 성분에 대한 필요성을 줄이거나 제거한다.
파우치(510)는 미국 특허 제8,895,295호에 기술된 것과 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 시험될 시료(100 ㎕) 및 용해 완충액(200 ㎕)을 포함하는 300 ㎕ 혼합물이 입구 채널(515a) 근처의 피트먼트(590) 내의 주입 포트(도시되지 않음)에 주입되고, 시료 혼합물이 입구 채널(515a)로 이동된다. 물은 또한 입구 채널(515l)에 인접한 피트먼트(590)의 제 2 주입 포트(도시되지 않음)에 주입되고, 피트먼트(590)에 제공된 채널(도시되지 않음)을 통해 분배되고, 그에 의해 이전에 각각 입구 채널(515b 내지 515l)에서 건조 형태로 제공된 최대 11종의 상이한 시약을 수화시킨다. 이들 시약은 예시적으로 동결 건조된 PCR 시약, DNA 추출 시약, 세척 용액, 면역 분석 시약 또는 기타 화학 물질(chemical entities)을 포함할 수 있다. 예시적으로, 시약은 핵산 추출, 1 단계 다중 PCR, 다중 반응액의 희석, 및 2 단계 PCR 시약의 준비 및 대조군 반응을 위한 것이다. 도 1에 도시된 구체예에서, 주입될 필요가 있는 모든 것은 하나의 주입 포트 중 시료 용액 및 나머지 주입 포트 중 물이다. 주입 후에, 2 개의 주입 포트는 밀봉될 수 있다. 파우치(510) 및 피트먼트(590)의 다양한 구성에 대한 더 많은 정보는 이미 참조로 포함된 미국 특허 제8,895,295호를 참조한다.
주입 후에, 시료는 주입 채널(515a)에서 채널(514)을 통해 용해 블리스터(lysis blister)(522)로 이동된다. 용해 블리스터(522)에 세라믹 비드와 같은 비드 또는 입자(534)가 제공되고, FilmArray® 기구 내에 제공되는 회전 블레이드(rotating blades) 또는 패들(paddle)을 사용한 충격(impaction)을 통해 볼텍싱(vortexing)되도록 구성된다. 지르코늄 실리케이트(zirconium silicate)(ZS) 비드(534)와 같은 용해 입자의 존재 하에 시료를 진탕(shaking)하거나 볼텍싱(vortexing) 하는 것에 의한 비드-밀링(bead-milling)은 용해물을 형성하는 효과적인 방법이다. 본 명세서에 사용된, "용해하다(lyse)", "용해(lysing)" 및 "용해물(lysate)"과 같은 용어는 세포의 파열(rupturing cell)에 한정되지 않으나, 그러한 용어는 바이러스와 같은 비-세포 입자의 파열를 포함하는 것으로 이해된다.
도 4는 도 2에 도시된 기구(800)의 지지 부재(support member)(802)의 제 1 면(811) 상에 장착될 수 있는 블레이드(821)를 포함하는 비드 비팅 모터(bead beating motor)(819)를 도시한다. 블레이드는 슬롯(804)을 통해 파우치(510)와 접촉하도록 연장될 수 있다. 그러나, 모터(819)는 기구(800)의 다른 구조물 상에 장착될 수 있는 것으로 이해된다. 예시적인 일 구체예에서, 모터(819)는 지지 부재(802) 상에 장착된 Mabuchi RC-280SA-2865 DC 모터(Chiba, Japan)이다. 하나의 예시적인 구체예에서, 모터는 5,000 내지 25,000 rpm, 보다 예시적으로 10,000 내지 20,000 rpm, 및 더욱 예시적으로는 약 15,000 내지 18,000 rpm으로 회전된다. Mabuchi 모터의 경우, 7.2V가 용해를 위한 충분한 rpm을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 블레이드(821)가 파우치(510)에 충돌할 때, 실제 속도는 다소 더 느릴 수 있는 것으로 이해된다. 사용된 모터 및 패들에 따라 다른 전압 및 속도가 용해에 이용될 수 있다. 선택적으로, 제어된 작은 부피의 공기가 용해 블리스터(522)에 인접한 블래더(822) 내로 공급될 수 있다. 일부 구체예에서, 인접한 블래더를 하나 또는 그 이상의 작은 부피의 공기를 충진시키는 것이 용해 공정 동안, 용해 블리스터의 배치 및 지지를 보조한다는 것이 확인되었다. 대안적으로, 다른 구조, 예시적으로, 용해 블리스터(522) 주위의 강성 또는 유연한 개스킷(compliant gasket) 또는 기타 유지 구조(retaining structure)가 용해 중에 파우치(510)를 구속하는데(restrain) 사용될 수 있다. 또한, 모터(819)는 단지 예시적인 것이고, 기타 장치가 시료를 밀링(milling), 진탕(shaking) 또는 볼텍싱(vortexing)하기 위해 사용될 수 있다고 이해된다.
일단 세포가 적절하게 용해되면, 시료는 채널(538), 블리스터(544) 및 채널(543)을 통해 블리스터(546)로 이동되고, 시료는 실리카 코팅된 자성 비드(silica-coated magnetic beads)(533)와 같은 핵산 결합 물질과 혼합된다. 혼합물은 적당한 길이의 시간 동안, 예시적으로 약 10 초 내지 10 분 동안, 인큐베이션되게 할 수 있다. 블리스터(546)에 인접한 기구 내에 위치하는 인입 가능한 자석(retractable magnet)은 용액으로부터 자성 비드(533)를 포획하여 블리스터(546)의 내부 표면에 대해 펠렛을 형성한다. 그 다음, 액체는 블리스터(546)의 밖으로 이동되고 블리스터(544)를 통해 다시 블리스터(522)로 이동되며, 블리스터(522)가 이제 폐기물 리셉터클(receptacle)로서 사용된다. 하나 또는 그 이상의 주입 채널(515c 내지 515e)로부터의 하나 또는 그 이상의 세척 완충액이 블리스터(544) 및 채널(543)을 통해 블리스터(546)에 제공된다. 선택적으로, 자석은 철수되고(retracted) 자성 비드(533)는 비드를 채널(543)을 통해 블리스터(544 및 546)로부터 전후로 이동시킴으로써 세척된다. 일단 자성 비드(533)가 세척되면, 자성 비드(533)는 자석의 활성화에 의해 블리스터(546)에 재포획되고, 그 후에, 세척 용액은 블리스터(522)로 이동된다. 이 과정은 핵산 결합 자성 비드(533)로부터 용해 완충액 및 시료 잔해(debris)를 세척하기 위해 필요한 만큼 반복될 수 있으며, 예시적으로는 3회 또는 그 이상의 세척을 포함하고, 1회의 세척이 본 명세서에 개시된 일부 구체예에 충분할 수 있지만, 임의의 횟수의 세척이 본 개시의 범위 내에 속한다.
세척 후에, 주입 채널(515f)에 저장된 용출 완충액(elution buffer)이 블리스터(548)로 이동되고, 자석은 원 위치로 돌아간다(retracted). 용액은 채널(522)을 통해 블리스터(546 및 548)간에 순환되어, 블리스터(546)에서 자성 비드(533)의 펠렛을 파괴하고 포획된 핵산이 비드로부터 분리되어 용액으로 들어가게 한다. 자석이 다시 한번 활성화되어 블리스터(546)에서 자성 비드(533)를 포획하고 용출된 핵산 용액은 블리스터(548)내로 이동된다.
주입 채널(515g)로부터의 제 1 단계 PCR 마스터 믹스(PCR master mix)는 블리스터(548)에서 핵산 시료와 혼합된다. 선택적으로 채널(553)을 통해 548과 564 간에 혼합물을 미는(force)것에 의해 혼합물이 섞인다. 수회의 혼합의 사이클 후에, 용액은 각 표적에 대한 하나 이상의 프라이머 세트인 제 1 단계 PCR 프라이머의 펠렛이 제공되는 블리스터(564)에 담기고, 제 1 단계 다중 PCR이 수행된다. RNA 표적이 존재한다면, 제 1 단계 다중 PCR 전에 또는 동시에 RT 단계가 수행될 수 있다. 특정 적용의 요건에 따라 다른 수준의 증폭이 바람직할 수 있지만, FilmArray® 기구에서 제 1 단계 다중 PCR 온도 순환(temperature cycling)은 예시적으로 15-20 회 사이클 동안 수행된다. 제 1 단계 PCR 마스터 믹스는 당 업계에 공지된 다양한 마스터 믹스일 수 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 제 1 단계 PCR 마스터 믹스는 사이클당 20 초 이하가 소요되는 PCR 프로토콜과 함께 사용하기 위한, 본 명세서에 참조로 포함된 US2015/0118715에 개시된 화학(chemistries)일 수 있다.
제 1 단계 PCR이 원하는 횟수의 사이클 동안 진행된 후, 예시적으로 대부분의 시료를 블리스터(548)로 다시 밀어 넣고, 블리스터(564) 내에 소량만 남기고, 및 주입 채널(515i)로부터 온 제 2 단계 PCR 마스터 믹스를 첨가하여, 시료가 희석될 수 있다. 대안적으로, 515i로부터의 희석 완충액이 블리스터(566)로 이동되고, 블리스터(564 및 566) 사이에서 유체를 전후로 이동시킴으로써 블리스터 (564)에서 증폭된 시료와 혼합될 수 있다. 필요하다면, 희석이 주입 채널(515j 및 515k)로부터의 희석 완충액을 사용하여 여러 번 반복될 수 있거나, 또는 주입 채널(515k)이 시퀀싱 또는 다른 PCR-후 분석(post-PCR analysis)을 위해 남겨질 수 있고, 이어서 주입 채널(515h)로부터의 제 2 단계 PCR 마스터 믹스를 희석된 증폭 시료의 일부 또는 전부에 첨가할 수 있다. 희석 단계의 횟수를 변경하거나 또는 희석용 완충액 또는 증폭용 성분,예시적으로 다른 성분이 특히 비-PCR 증폭 방법에 대해서는 적합할 수 있으나, 폴리머라제, dNTP 및 적합한 완충액을 포함하는 제 2 단계 PCR 마스터 믹스와 혼합하기 전에 제거되는 시료의 백분율을 변경함으로써, 희석 수준이 조정될 수 있는 것으로 이해된다. 원하는 경우, 시료 와 제 2 단계 PCR 마스터 믹스의 혼합물은 제 2 단계 증폭을 위해 제 2 단계 웰(582)로 이동하기 전에 블리스터(564)에서 예열될 수 있다. 그러한 예열(preheating)은 제 2 단계 PCR 혼합물 중 핫-스타트 성분(항체, 화학적 또는 기타)의 필요성을 제거할 수 있다.
예시적인 제 2 단계 PCR 마스터 믹스는 프라이머 쌍이 없어서 불완전하고, 102개의 제 2 단계 웰(582) 각각에 특이적인 PCR 프라이머 쌍이 미리 로딩된다. 원한다면, 제 2 단계 PCR 마스터 믹스는 다른 반응 성분이 없을 수 있으며, 이들 성분도 제 2 단계 웰(582)에 미리 로딩될 수 있다. 각각의 프라이머 쌍은 제 1 단계 PCR 프라이머 쌍과 유사하거나 동일할 수 있거나 제 1 단계 프라이머 쌍 내에서 중첩될(nested) 수 있다. 블리스터(564)로부터 제 2 단계 웰(582)로의 시료의 이동이 PCR 반응 혼합물을 완료한다. 고밀도 어레이(581)가 채워지면, 개별적인 제 2 단계 반응이 당 업계에 공지된 바와 같이 임의의 수의 수단에 의해 개별적인 제 2 단계 블리스터에 밀봉된다. 교차 오염 없이 고밀도 어레이(581)를 채우고 밀봉하는 예시적인 방법이 이미 참조로 포함된 미국 특허 제8,895,295호에서 논의되었다. 예시적으로, 고밀도 어레이(581)의 웰(582) 중 다양한 반응액이, 열 순환(thermal cycling)을 위한 다른 수단들이 당 업계에 공지되어 있지만, 예시적으로 하나 이상의 펠티에 소자(peltier devices)들에 의해, 동시에 열 순환(thermal cycled)된다.
특정 구체예에서, 제 2 단계 PCR 마스터 믹스는 증폭을 나타내는 신호를 생성하기 위해 dsDNA 결합 염료 LCGreen® Plus (BioFire Diagnostics, LLC)를 포함한다. 그러나, 이 염료는 단지 예시적인 것이며, 당 업계에 공지된 바와 같이 형광적으로(fluorescently), 방사성으로(radioactively), 화학 발광적으로(chemiluminescently), 효소(enzymatically) 등으로 표지된 프로브 및 다른 dsDNA 결합 염료를 포함한 다른 신호가 사용될 수 있다고 이해된다. 대안적으로, 어레이(581)의 웰(582)은 신호 없이 제공될 수 있으며, 결과는 후속 처리를 통해 보고된다.
공압이 파우치(510) 내의 물질을 이동시키는데 사용될 때, 일 구체예에서 "블래더(bladder)"가 사용될 수 있다. 그의 일부가 도 2-3에 도시된 블래더 조립체(810)는 복수의 팽창 가능한(inflatable) 블래더(822, 844, 846, 848, 864 및 866)를 수용하는 블래더 플레이트(bladder plate)(824)를 포함하며, 각각의 블래더는 예시적으로, 압축 기체 공급원(compressed gas source)에 의해 개별적으로 팽창할 수 있다. 블래더 조립체(810)는 압축된 가스에 노출되어 여러 번 사용될 수 있기 때문에, 블래더 조립체(810)는 파우치보다 더 강하거나 두꺼운 재료로 제조될 수 있다. 대안적으로, 블래더(822, 844, 846, 848, 864 및 866)는 개스킷(gasket), 실(seal), 밸브(valve) 및 피스톤(piston)과 함께 고정된(fastened) 일련의 판으로부터 형성될 수 있다. 다른 배열도 본 발명의 범위 내에 있다.
2 차 PCR 반응의 성공은 다중 1 차 반응에 의해 생성된 주형에 의존적이다. 전형적으로, PCR은 고순도의 DNA를 사용하여 수행된다. 페놀 추출 또는 상업용 DNA 추출 키트와 같은 방법이 고순도의 DNA를 제공한다. 파우치(510)를 통해 처리된 시료는 덜 순수한 제제(preparation)를 보상하기 위한 보완(accommodation)이 요구될 수 있다. PCR은 생물학적 시료의 성분에 의해 저해될 수 있고, 이는 잠재적 장애이다. 예시적으로, 핫 스타트 PCR, taq 폴리머라제 효소의 더 높은 농도, MgCl2 농도의 조정, 프라이머 농도의 조정 및 보조제(예를 들면, DMSO, TMSO 또는 글리세롤)의 첨가가 더 낮은 핵산 순도를 보상하기 위해 선택적으로 이용될 수 있다. 순도 문제는 1 단계 증폭에 대해 더 많은 우려가 될 수 있지만, 유사한 조정이 2 단계 증폭에서도 제공될 수 있다고 이해된다.
파우치(510)가 기구(800) 내에 배치되는 경우, 블래더 조립체(810)는 파우치(510)의 일면에 대해 밀착되어, 특정 블래더가 팽창하면, 압력이 파우치(510)에서 대응하는 블리스터로부터 액체를 밀어낼 것이다. 파우치(510)의 다수의 블리스터에 대응하는 블래더 외에, 블래더 조립체(810)는 파우치(510)의 다양한 채널에 대응하는, 블래더 또는 공압-구동 피스톤(pneumatically-driven pistons)과 같은 추가의 공압 액츄에이터(pneumatic actuators)를 가질 수 있다. 도 2 및 도 3은 피트먼트(590)로의 역류를 최소화하는, 실(seal)(871,872,873,874) 및 파우치(510)의 채널(538, 543, 553 및 565)에 대응하는 예시적인 복수의 피스톤 또는 하드 실(hard seal)(838, 843, 852, 853 및 865)을 도시한다. 활성화되면, 하드 실 (hard seal)(838, 843, 852, 853 및 865)이 핀치 밸브를 형성하여 해당 채널을 핀치-오프(pinch off)하고 폐쇄한다. 파우치(510)의 특정 블리스터 내에 액체를 가두기 위해, 하드실이 블리스터로 왕래하는(to and from) 채널에 대해 활성화 되어, 액츄에이터가 채널을 집어서 폐쇄하는 핀치 밸브로서 기능한다. 예시적으로, 상이한 블리스터 중 2 부피(two volumes)의 액체를 혼합하기 위해, 연결 채널을 밀봉하는 핀치 밸브 액츄에이터가 작동되고, 블리스터에 대한 공압 블래더가 번갈아 가압되어 블리스터를 연결하는 채널을 통해 액체를 전후로(back and forth) 보내어 그 안에 액체를 혼합한다. 핀치 밸브 액츄에이터(pinch valve actuator)는 다양한 형상 및 크기일 수 있으며, 한번에 둘 이상의(more than one) 채널을 핀치 오프하도록 구성될 수 있다. 본 명세서에서 공압 액츄에이터가 논의되지만, 선형 스테퍼 모터(linear stepper motor), 모터-구동 캠(motor-driven cam), 공압식, 유압식 또는 전자기력으로 구동되는 리지드 패들(rigid paddles driven by pneumatic, hydraulic or electromagnetic forces), 롤러, 로커 암(rocker-arms) 및 경우에 따라 코킹된 스프링(cocked spring)과 같은 다양한 전기기계식 액츄에이터를 포함한, 파우치에 압력을 제공하는 다른 방법이 고려될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 채널의 축에 수직으로 압력을 가하는 것 외에도 가역적 또는 비가역적으로 채널을 폐쇄하는 다양한 방법이 있다. 이들은 채널을 가로 지르는 주머니의 꼬임(kinking the bag across the channel), 열-밀봉(heat-sealing), 액츄에이터 롤링(rolling an actuator), 및 버터플라이 밸브(butterfly valve) 및 볼 밸브(ball valve)와 같이 채널로 밀봉된 다양한 물리적 밸브를 포함한다. 또한, 소형 펠티에 소자 또는 다른 온도 조절기가 채널에 인접하여 배치될 수 있고, 유체를 동결시키기에 충분한 온도로 설정되어 효과적으로 실(seal)을 형성할 수 있다. 또한, 도 1의 디자인은 각각의 블리스터 및 채널 위에 배치된 액츄에이터 소자를 갖는(featuring) 자동화된 기구를 위해 개조되나, 액츄에이터가 정지된 상태(stationary)로 유지될 수 있고, 소수의 액츄에이터가 시료 파쇄(sample disruption), 핵산 포획(nucleic-acid capture), 제 1 및 제 2 단계 PCR, 및 면역 분석 및 면역-PCR과 같은 파우치(510)의 다른 적용을 포함하는 여러 처리 스테이션에 대해 사용될 수 있도록, 파우치(510)가 1 차원 또는 2 차원으로 변이(transition)될 수 있다는 것도 고려된다. 채널 및 블리스터에 작용하는 롤러는 파우치(510)가 스테이션들 사이에서 이동되는(translated) 구성에서 특히 유용한 것으로 판명될 수 있다. 따라서, 현재 개시된 구체예들에서 공압 액츄에이터가 사용되는 반면에, "공압 액츄에이터"라는 용어가 본 명세서에 사용되는 경우, 파우치 및 기구의 구성에 따라, 다른 액츄에이터 및 다른 압력 제공 방법이 사용될 수 있다고 이해된다.
다른 선행 기술 기기는 밀봉된 유연한 용기(sealed flexible container) 중의 PCR을 교시한다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 인용된 미국 특허 제6,645,758호 및 제6,780,617호 및 미국 특허 출원 제2014/0038272호를 참조한다. 그러나 밀봉된 PCR 용기(sealed PCR vessel)내에 세포 용해를 포함시키는 거은, 특히 시험할 시료에 생물학적 위험(biohazard)이 포함할 수 있는 경우, 사용 용이성 및 안전성을 향상시킬 수 있다. 본 명세서에 예시된 구체예에서, 세포 용해로부터의 폐기물 및 모든 다른 단계로부터의 폐기물은 밀봉된 파우치 내에 남아있다. 그러나, 파우치 내용물은 추가 시험을 위해 제거될 수 있다고 이해된다.
도 2는 파우치(510)와 함께 사용될 수 있는 예시적인 기구(800)를 나타낸다. 기구(800)는 케이싱(casing)의 벽을 형성하거나 케이싱 내에 장착될 수 있는 지지 부재(802)를 포함한다. 기구(800)는 또한 파우치(510)의 삽입 및 철수(withdrawal)를 허용하도록 하기 위해 지지 부재(802)에 대해 선택적으로 이동 가능한 제 2지지 부재(도시되지 않음)를 포함할 수 있다. 예시적으로, 파우치(510)가 기구(800) 내로 삽입되면, 뚜껑(lid)이 파우치(510)를 덮을 수 있다. 다른 구체예에서, 두 지지 부재가 모두 고정될 수 있으며, 파우치(510)는 다른 기계적 수단에 의해 또는 공기 압력에 의해 제 위치에 유지된다.
예시적인 실시예에서, 히터(886 및 888)는 지지 부재(802) 상에 장착된다. 그러나, 이러한 배열은 단지 예시적인 것이며 다른 배열이 가능한 것으로 이해된다. 블래더 플레이트(810)는, 블래더(822, 844, 846, 848, 864, 866), 하드 실(838, 843, 852, 853), 실(871, 872, 873, 874)과 함께 블래더 조립체(808)를 형성하고, 이는 공압 액츄에이터가 파우치(510)와 접촉하도록 배치되도록 파우치(510)쪽으로 이동될 수 있는 가동(moveable) 지지 구조물 상에 예시적으로 장착될 수 있다. 파우치(510)가 기구(800)에 삽입되고 가동 지지 부재가 지지 부재(802)를 향해 이동될 때, 파우치(510)의 다양한 블리스터는 블래더 조립체 (810)의 다양한 블래더 및 조립체(808)의 다양한 실(seal)에 인접한 위치에 있어서, 공압 액츄에이터의 활성화는 파우치(510)의 블리스터들 중 하나 또는 그 이상으로부터 액체를 밀어내거나 파우치(510)의 하나 또는 그 이상의 채널과 핀치 밸브를 형성할 수 있다. 파우치(510)의 블리스터 및 채널 과 조립체(808)의 실 및 블래더 사이의 관계가 도 3에 보다 상세히 도시된다.
각각의 공압 액츄에이터는 밸브(899)를 통해 압축 공기 공급원(895)에 연결된다. 수개의 호스(878)들만이 도 2에 도시되어 있지만, 각각의 공압 피팅(fitting)은 호스(878)를 통해 압축 기체 공급원(895)에 연결되는 것으로 이해된다. 압축 기체 공급원(895)은 압축기(compressor)일 수 있거나, 또는 대안적으로 압축 기체 공급원(895)은 이산화탄소 실린더와 같은 압축 기체 실린더일 수 있다. 압축 기체 실린더는, 휴대성이 필요한 경우에 특히 유용하다. 압축 기체의 다른 공급원이 본 발명의 범위 내에 있다.
조립체(808)는 예시적으로 가동 지지 부재 상에 장착되지만, 다른 구성도 가능하다고 이해된다.
또한, 기구(810)의 여러 다른 구성 요소가 압축 기체 공급원(895)에 연결된다. 지지 부재(802)의 제 2면(814) 상에 장착된 자석(magnet)(850)은 자석(850)을 이동시키는 다른 방법이 당 업계에 공지되어 있으나, 예시적으로, 호스(878)를 통해 압축 기체 공급원(895)으로부터 기체를 사용하여 배치(deploy)되고 철수된다(retract). 자석(850)은 지지 부재(802)의 리세스(recess)(851)에 놓인다. 자석(850)이 파우치(510)의 블리스터(546)와 접촉할 수 있도록, 리세스(851)가 지지 부재(802)를 통과하는 통로일 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 자석(850)이 배치되는 경우, 자석(850)이 블리스터(546)에서 충분한 자기장을 제공하기에 충분히 가깝고, 자석(850)이 철수되는 경우, 자석(850)이 블리스터(546)에 존재하는 자기 비드(533)에 유의하게 영향을 미치지 않는한, 지지 부재(802)의 재료에 따라, 리세스(851)는 지지 부재(802)를 통해 끝까지 연장할 필요가 없는 것으로 이해된다. 자석(850)의 철수가 언급되나, 전자석이 사용될 수 있고, 전자석을 통한 전기의 흐름을 제어함으로써 전자석이 활성화 및 비활성화될 수 있다고 이해된다. 따라서, 이 명세서는 자석의 회수(withdrawing) 또는 철수(retracting)를 논의하지만, 이들 용어는 자기장을 회수하는 다른 방법을 포함하기에 충분히 넓은 것으로 이해된다. 공압 연결은 공압 호스(pneumatic hose) 또는 공압 공기 매니폴드(pneumatic air manifold)일 수 있어서, 필요한 호스 또는 밸브의 수를 감소시키는 것으로 이해된다.
공압식 피스톤 어레이(869)의 다양한 공압 피스톤(868)은 또한 호스(878)를 통해 압축 기체 공급원(895)에 연결된다. 공압 피스톤(868)을 압축 기체 공급원(895)에 연결하는 단지 2 개의 호스(878)가 도시되어 있지만, 각각의 공압 피스톤(868)이 압축 기체 공급원(895)에 연결되는 것으로 이해된다. 12 개의 공압 피스톤(868)이 도시되어 있다.
한 쌍의 가열/냉각 장치, 예시적으로 펠티에 히터(Peltier heater)가 지지체(802)의 제 2면(814) 상에 장착된다. 제 1 단계 히터(heater)(886)는 제 1 단계 PCR을 위한 블리스터(564)의 내용물을 가열 및 냉각시키도록 위치된다. 제 2 단계 히터(888)는 제 2 단계 PCR을 위한 파우치(510)의 제 2 단계 블리스터(582)의 내용물을 가열 및 냉각하도록 위치된다. 그러나, 이들 히터는 다른 가열 목적으로도 사용될 수 있고, 특정 용도에 적절하게 다른 히터가 포함될 수 있는 것으로 이해된다.
형광 검출이 요구될 때, 광학 어레이(optical array)(890)가 제공될 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 광학 어레이(890)는 광원(898), 예시적으로 필터링된(filtered) LED 광원, 필터링된 백색광 또는 레이저 조명(illumination) 및 카메라(896)를 포함한다. 카메라(896)는 예시적으로 파우치(510)의 제 2 단계 웰(582)에 각각 대응하는, 복수의 광 검출기(photodetector)를 갖는다. 대안적으로, 카메라(896)는 제 2 단계 웰(582) 모두를 포함하는 이미지들을 찍을 수 있고, 이미지는 제 2 단계 웰(582)의 각각에 대응하는 개별 필드(field)들로 분할될 수 있다. 구성(configuration)에 따라, 광학 어레이(890)는 정지될 수 있거나, 광학 어레이(890)는 하나 또는 그 이상의 모터에 부착된 이동자(mover) 상에 배치되고 각각의 개별 제 2 단계 웰(582)로부터 신호를 얻도록 이동될 수 있다. 다른 배열이 가능한 것으로 이해된다.
도시된 바와 같이, 컴퓨터(894)가 압축 기체 공급원(895)의 밸브(899)를 제어하고, 따라서 기구(800)의 모든 공압(pneumatic)을 제어한다. 컴퓨터(894)는 또한 히터(886 및 888) 및 광학 어레이(890)를 제어한다. 다른 물리적 또는 무선 연결이 본 발명의 범위 내에 있음에도 불구하고, 이들 구성 요소 각각은, 예시적으로, 케이블(891)을 통해 전기적으로 연결된다. 컴퓨터(894)는 기구(800) 내에 수용되거나 기구(800)의 외부에 있을 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 컴퓨터(894)는 구성 요소의 일부 또는 전부를 제어하는 내장형 회로 보드(built-in circuit board)를 포함할 수 있으며, 광학 어레이로부터 데이터를 수신하고 표시하기 위해 데스크탑 또는 랩탑 PC와 같은 외부 컴퓨터를 포함할 수 있다. 온도 및 사이클 시간 등과 같은 정보 및 변수를 입력하기 위한 키를 포함하는 인터페이스, 예시적으로 키보드 인터페이스가 제공될 수 있다. 예시적으로, 디스플레이(892)가 또한 제공된다. 디스플레이(892)는 예를 들어, LED, LCD 또는 다른 그러한 디스플레이일 수 있다.
본 발명의 전술된 장점 및 특징 및 기타 장점 및 특징이 얻어질 수 있는 방식을 설명하기 위해, 간략하게 전술된 본 발명의 더 상세한 설명이 첨부된 도면에 도시된 특정 구체예를 참조하여 제공될 것이다. 이들 도면은 본 발명의 전형적인 구체예만을 도시하는 것으로 이해되고, 그러므로 그 범위를 제한하는 것으로 간주지 않는 것으로 이해하면서, 본 발명은 하기와 같은 첨부된 도면의 사용을 통해 추가적인 특이성 및 세부 사항으로 설명되고 묘사될 것이다:
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 유연한 파우치(flexible pouch)를 도시한다.
도 2는, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 1의 파우치를 포함한, 도1의 파우치와 함께 사용하기 위한 기구의 분해 사시도(exploded perspective view)이다.
도 3은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 점선으로 표시된 도 1의 파우치와 도 2의 블래더 구성요소(bladder component)를 포함하는 도 2의 기구의 부분 단면도를 도시한다.
도 4는 도 2의 기구의 하나의 예시적인 구체예에서 사용되는 모터를 도시한다.
도 5는, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 1의 파우치를 포함한, 도 1의 파우치를 로딩하기 위한 로딩 스테이션(loading station)을 도시한다.
도 6은 도 1의 파우치에 시료를 로딩하기 위한 시료 바이알을 도시한다.
도 7은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 1의 파우치에 수화 유체를 제공하는 수화 바이알(hydration vial)을 도시한다.
도 8은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서,도 5와 비교할 수 있으나, 로딩 스테이션과 함께 사용하기 위한 상이한 로딩 스테이션 구성 및 바이알을 보여주는 로딩 스테이션을 도시한다.
도 9는, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 8의 시료 바이알의 일부분 및 시료 바이알이 도 8의 로딩 스테이션의 시료 바이알 리셉터클(receptacle)에 연결되는 방식을 도시한다.
도 10은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라, 도 8의 수화 바이알의 일부분 및 수화 바이알이 도 8의 로딩 스테이션의 수화 바이알 리셉터클에 연결되는 방식을 도시한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 유연한 파우치(flexible pouch)를 도시한다.
도 2는, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 1의 파우치를 포함한, 도1의 파우치와 함께 사용하기 위한 기구의 분해 사시도(exploded perspective view)이다.
도 3은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 점선으로 표시된 도 1의 파우치와 도 2의 블래더 구성요소(bladder component)를 포함하는 도 2의 기구의 부분 단면도를 도시한다.
도 4는 도 2의 기구의 하나의 예시적인 구체예에서 사용되는 모터를 도시한다.
도 5는, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 1의 파우치를 포함한, 도 1의 파우치를 로딩하기 위한 로딩 스테이션(loading station)을 도시한다.
도 6은 도 1의 파우치에 시료를 로딩하기 위한 시료 바이알을 도시한다.
도 7은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 1의 파우치에 수화 유체를 제공하는 수화 바이알(hydration vial)을 도시한다.
도 8은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서,도 5와 비교할 수 있으나, 로딩 스테이션과 함께 사용하기 위한 상이한 로딩 스테이션 구성 및 바이알을 보여주는 로딩 스테이션을 도시한다.
도 9는, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라서, 도 8의 시료 바이알의 일부분 및 시료 바이알이 도 8의 로딩 스테이션의 시료 바이알 리셉터클(receptacle)에 연결되는 방식을 도시한다.
도 10은, 본 발명의 예시적인 구체예에 따라, 도 8의 수화 바이알의 일부분 및 수화 바이알이 도 8의 로딩 스테이션의 수화 바이알 리셉터클에 연결되는 방식을 도시한다.
실시예 1: 고밀도 PCR(HIGH DENSITY PCR)
하나의 실시예에서, 일반적인 호흡기 바이러스에 대한 표준 상업적 면역 형광 분석이 7가지 바이러스를 검출할 수 있는 것으로 알려져 있다: 아데노바이러스(adenovirus), PIV1, PIV2, PIV3, RSV, 인플루엔자 A(Influenza A) 및 인플루엔자 B(Influenza B). 보다 완전한 패널(complete panel)은 예시적으로 코로나바이러스(coronavirus), 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 및 비-HRV 엔테로바이러스(non-HRV enterovirus )를 포함한, 기타 바이러스에 대한 분석을 포함할 것이다. 아데노바이러스 또는 HRV와 같이 매우 가변적인 바이러스에 대해서, 바이러스 계통의 모든 분지를 표적으로 하는 복수의 프라이머(예시적으로 각각 4 개의 외부 프라이머 세트 및 4 개의 내부 프라이머 세트)를 사용하는 것이 바람직하다. 코로나 바이러스와 같은 기타 바이러스에는 대해서, 한 시즌에서 다른 시즌까지 변하지 않지만, 4가지 다른 계통(229E, NL63, OC43, HKU1)이 존재하나 이들은 별도의 프라이머 세트가 필요하기에 충분할 정도로 갈라진다. FilmArray® 호흡기 패널(BioFire Diagnostics, LLC of Salt Lake City, UT)은 아데노 바이러스, 코로나 바이러스 HKU1, 코로나 바이러스 NL63, 코로나 바이러스 229E, 코로나 바이러스 OC43, 인간 메타뉴모바이러스, 인간 리노 바이러스/엔테로바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 A/H1, 인플루엔자 A/H3, 인플루엔자 A/H1-2009, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자 바이러스 1, 파라인플루엔자 바이러스 2, 파라인플루엔자 바이러스 3, 파라인플루엔자 바이러스 4 및 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus)을 포함한다. 이 바이러스들 외에도, FilmArray® 호흡기 패널은 세가지 박테리아를 포함한다: 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia), 및 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia). 고밀도 어레이(581)는 그러한 패널을 단일 파우치(510)에 수용할 수 있다. FilmArray®에 대해 다른 패널을 사용할 수 있으며, 각각 20개 이상의 병원체를 분석한다.
실시예 2: 파우치 로딩(POUCH LOADING)
도 5는 로딩 스테이션(600)을 도시한다. 도시된 바와 같이, 도 1의 파우치(510)는 파우치(510)의 피트먼트(590)만이 보이도록 로딩 스테이션(600)의 슬롯(610)에 적재되었다. 도시된 바와 같이, 로딩 스테이션(600)에 시료 바이알(650)을 유지(hold)하는 시료 바이알 리셉터클(602) 및 수화 바이알(670)을 유지하는 수화 바이알 리셉터클(604)이 제공된다. 그러나, 리셉터클 및 바이알은 작업 흐름(workflow)을 돕기 위한 것이며 단지 예시적인 것으로 이해된다. 다른 파우치 및 다른 장치에 의한 사용 및 다른 구성이 본 개시의 범위 내에 속한다.
시료를 피펫팅하거나 또는 다른 방법으로 시료 바이알(650)에 로딩한다. 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 작업 흐름에 따라, 시료 바이알(650)은 이미 생물학적 시료를 수용하기 위한 완충액 또는 다른 유체(652)를 포함할 수 있거나, 조작자는 시료 바이알(650)에 적절한 완충액 중 생물학적 시료를 첨가할 수 있다. 선택적으로, 완충액은 적절한 양의 완충액이 배분된 별도의 앰플로 제공될 수 있다. 유사하게, 수화 바이알(670)에 물, 완충액 또는 기타 유체(672)가 미리 로딩될 수 있거나, 조작자가 수화 바이알(670)에 그러한 유체를 로딩할 수 있다
예시적인 피트먼트(590)는 피트먼트(590)의 제 2 표면(595) 근처에 예시적으로 형성된 주입 포트(541)를 포함한다. 도시된 바와 같이, 피트먼트(590)의 제 1 표면(594)을 통해 캐뉼라가 달린 이송 용기(cannulated transfer vessel), 예를 들면 주입 포트(541)는 캐뉼라가 달린 주사기(cannulated syringe)를 수용하도록 구성된 시료 주입 개구부(injection opening)(563)에 위치된다. 이 예시적인 구성에서, 주입 포트(541)는 우연한 천공(accidental puncture)으로부터 보호되고, 캐뉼라가 달린 이송 용기가 시료 주입 개구부(563)에 배치될 때까지 개방되지 않는다. 유사하게, 예시적인 피트먼트(590)는 피트먼트(590)의 제 2 표면(595) 근처에 예시적으로 형성된 제 2 주입 포트(588)를 포함하고, 시료 주입 개구부(563)와 유사하게 구성된 수화 유체 주입 개구부(583)에 위치한다. 이 예시적인 구체예에서 구성된 바와 같이, 주입 포트(541)는 시험될 시료를 수용하기 위한 것이고, 시료는 챔버(592a)로 또는 직접적으로 용해 블리스터(522)(도 1)로 이동되며 제 2 주입 포트(588)는 물 또는 완충액과 같은 수화 유체(672)(도 7에 표시됨)를 수용하도록 구성되고, 수화 유체(672)는 입구 채널(515b 내지 515l)을 통한 후속 이동을 위해 챔버(592b 내지 592l)로 이동될 것이다. 주입 포트(541 및 588) 및 개구부(563 및 583)의 배열은 예시적인 것이며, 다른 구성이 본 발명의 개시의 범위 내에 있다고 이해된다.
예시적인 시료 바이알(650)은, 도 6에 가장 잘 도시된 바와 같이, 많은 캐뉼라가 달린 주사기와 유사한 배열로, 상부 표면(top surface)(662), 바이알 본체(vial body)(654) 및 캐뉼라(655)로 구성된다. 이 예시적인 구체예에서, 다수의 캐뉼라가 달린 주사기에서 발견되는 플런저(plunger)보다, 시료 바이알(650)에 본체(654)를 밀봉하기 위해 상부 표면(662)까지 연장되는 캡(658)이 제공된다. 예시적으로, 조작자는 상부 표면(662)의 개구부(657)를 통해 및 바이알 본체(654)로 고체 또는 반고체 재료를 붓거나(pour), 피펫팅하거나, 스왑(swab)을 삽입하거나, 스쿠핑(scoop)하거나, 또는 다른 방법으로 유체 및/또는 다른 물질을 전달할 것이다.
시험될 시료의 타입에 따라, 시료 바이알(650)에 예시적으로 바이알 본체(654)의 육각형의 하부 표면(666)에 또는 그 근처에 필터(646)가 제공될 수 있다. 도시된 바와 같이, 필터(646)는 o-링(644)에 의해 제 위치에서 유지된다. 그러나, 필터(646)는 접착제에 의해, 용접에 의해, 위치에 압입 끼워맞춤(press-fit into place)에 의해, 또는 당 업계에 공지된 다른 수단에 의해 제 위치에서 유지될 수 있다고 이해된다. 캐뉼라(655)가 시료 주입 개구부(563)에 삽입되고 시료가 파우치(510) 내로 이동될 때, 시료 물질은 필터(646)를 통해 및 캐뉼라(655)로 당겨질 때 여과된다. 필터 재료의 선택은 시료 타입과 입자 크기에 따라 다르지만, 다양한 생물학적 시료에 적합한 필터는 Pall 100 ㎛ Absolute Ultipleat Polypropylene Melt Blown Media 및 Millipore 80 ㎛ Polypropylene Net Filter를 포함한다. 대부분의 주사기 필터는 일정 크기의 개체를 배제하여 여과액에서 그러한 개체를 제거하도록 설계된다. 그러한 기존의 필터와는 다르게, 이러한 예시적인 필터는 대변, 흙, 분말 등에서 발견되는 더 큰 미립자(particulates)를 배제하면서, 직경이 약 60 ㎛ 또는 그 미만인 표적 개체(예를 들면, 세균, 바이러스, 원생동물 및 곰팡이 개체)가 필터를 통과할 수 있게 하는 능력에 기초하여 선택되었다. 또한, 예시적인 필터 재료는 불활성(inert)(즉, 개체 또는 핵산에 결합하지 않음)이고 막힘(clogging)에 상대적으로 저항력이 있다. 이러한 예시적인 필터는 표적 개체(최대 약 60 ㎛)로서 원생 동물을 포함하는 시료를 위해 선택된 것으로 이해된다. 일부 파우치 구성은 더 작은 표적에 대해서만 시험할 수 있기 때문에, 세균 및 곰팡이에 대해 1 - 10 ㎛의 구멍 크기를 갖는 필터와 오직 바이러스성 입자만 검출되는 경우, 1 ㎛ 미만의 구멍 크기를 갖는 필터와 같은 더 작은 구멍 크기를 갖는 필터가 필요할 수 있다. 물론 더 큰 구멍 크기의 필터가 여전히 더 작은 표적을 통과시키는데 사용될 수 있다. 이러한 필터는 유체 시스템을 막을 수 있는 토양, 대변 및 분말과 같은, 다량의 미립 물질(particulate matter)을 갖는 시료 타입에 특히 유용할 수 있다. 또한, 구멍 크기는 여과될 물질에 기초하여 선택되고, 다른 구멍 크기는 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 이해된다.
시료 준비에 유용한 하나 이상의 성분이 바이알 본체(654)에 건조되어 제공될 수 있다고 이해된다. 이러한 첨가제는 완충제(buffering agent), 안정화제(stabilizer), 프로테아제(protease), DNA 분해효소, DNA 분해효소 억제제, RNA 분해효소, RNA 분해효소 억제제, 리소자임(lysozyme), 환원제(reducing agent) 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이러한 성분은 시료 완충액에 포함될 수 있거나, 시료가 추가 처리를 위해 바이알(650)을 나간 후에, 후속(downstream)에 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제의 선택은 시료 타입 및 원하는 추가 처리에 의존적인 것으로 이해된다. 시료가 필터(646)를 통과 할 수 있도록 점도를 감소시키는 것을 돕거나 용해도를 보조하는(aid in solubility) 첨가제가 특히 유용하다.
도시된 바와 같이, 하부 캡(bottom cap)(664)은 육각형 모양의 시료 바이알 리셉터클(602)에 끼워지도록 구성된 육각형 부분(hexagonal portion)(666)과 함께 제공된다. 예시적인 구체예에서 육각형 부분(666) 및 시료 바이알 리셉터클이 육각형인 반면, 다른 형상이 사용될 수 있고, 육각형 또는 다른 결합(mating) 또는 맞물림(interlocking) 형태가 조작자가 하부 캡(664)을 제거하는 것을 보조하도록 제공될 수 있다고 이해된다. 대안적으로, 조작자는 바이알 본체(654)로부터 하부 캡(664)을 비틀기 위해 두 손을 사용하는 것과 같은 다른 수단에 의해 하부 캡(664)을 제거할 수 있다. 하부 캡(654)은 바이알 본체(654)에 압입되거나(press-fit on), 끼워지거나(threaded onto), 다른 방법으로 부착될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 하부 캡(664)에 시트(seat)(648)가 제공되며, 캐뉼라(655)의 하단부(bottom end)(659)가 시트(648) 내로 연장된다. 예시적으로, 캐뉼라(655)의 하단부(659)는 시트(648)에 단단히 끼워져, 시트(648)가 캐뉼라(655)의 개방된 하단부(659) 주위에 밀봉(airtight seal)을 제공한다. 선택적으로, 통풍구(vent)(649)가 하부 캡(664)과 바이알 본체(654) 사이에 제공된다.
이제 도 7로 전환하면, 수화 바이알(670)은 시료 바이알(650)과 유사하게 구성될 수 있다. 그러나, 도 7에 도시된 바와 같이, 수화 바이알(670)을 수화 유체(672)로 미리 로드(preload )하고 수화 바이알(670) 중 수화 유체(672)를 미리 밀봉하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 수화 바이알 (670)은 도 7에 도시된 바와 같이, 시료 바이알(650)의 것과 유사한 배열로 상부 표면(682), 바이알 본체(674) 및 캐뉼라(675)로 구성된다. 그러나, 예시적인 수화 바이알(670)의 캡(678)의 설부(tongue)(680)는 이미 상부 표면(682)의 개구부(677)에 압입되어 있고, 캡(678)은 상부 표면(682)에 밀봉되어 수화 바이알(670)의 개방(opening)을 방지할 수 있다. 이러한 배열은 단지 예시적인 것이고, 수화 바이알(670) 내의 수화 유체(672)를 밀봉하는 다른 방법이 본 명세서에서 구상되는(envisioned) 것으로 이해된다. 예시적으로, 수화 바이알(670)의 취급 또는 회전이 공기가 캐뉼라(675)로 들어가는 것을 허용하지 않도록. 바이알 본체(674) 및 캐뉼라(675)는 유체로 완전히 채워지거나 필수적으로 완전히 채워져서 제공될 수 있다. 대안적으로, 일부 공기(685) 또는 다른 기체가 바이알 본체(674) 내에 존재할 수 있고, 조작자는 공기가 캐뉼라(675)로 들어가는 것을 방지하기 위해, 수화 본체를 수직으로 유지할 수 있다. 또 다른 대안적인 구체예에서, 공기(685)는 압력 하에서 제공될 수 있고, 하부 캡(684)의 제거는 수화 유체가 캐뉼라(675)를 통해 강제로 들어가도록 한다. 도시된 바와 같이, 수화 바이알(670)에 필터가 제공되지 않지만, 원한다면 하나가 제공될 수 있다.
캐뉼라(675)로부터 방울로 흐를수 있는(drip) 유체를 유지하고, 캐뉼라(675) 내의 수화 유체(672)의 오염을 방지하도록 하부 캡(684)이 제공될 수 있다. 와이퍼(wiper)(683)는 캐뉼라(675)의 하부로부터 과도한 유체를 닦기 위해 하부 캡(684)에 제공될 수 있다. 와이퍼(683)의 원뿔 형태는 또한 후속 취급 및 처리 동안 하부 캡(684)에 방울을 유지하는 것을 도울 수 있다. 예시적인 구체예에서, 하부 캡(684)에 육각형 형태의 수화 바이알 리셉터클(604)과 결합(mating)하기 위한 육각형 부분(686)이 제공되지만, 시료 바이알(650)에 대해서는 전술된 바와 같이 다른 형태가 가능하다. 수화 바이알(670)의 육각형 부분(686) 및 육각 형태의 수화 바이알 리셉터클(604)은 시료 바이알(650)의 육각형 부분(666)및 육각형 형태의 시료 바이알 리셉터클(602)과 상이한 치수(dimension) 및/또는 상이한 형태를 가질 수 있어서, 시료 바이알(650)만이 시료 바이알 리셉터클(602)에 용이하게 끼워지고 수화 바이알(670)만이 수화 바이알 리셉터클(604)에 용이하게 끼워져서, 조작자가 시료 바이알(650) 및 수화 바이알(670)을 혼동할 위험을 감소시키고, 적절한 유체가 포트(541및 588)를 통해 주입된다. 또한, 포트(541 및 588)에 적절한 유체를 제공하도록 시각적 지원을 조작자에게 제공하기 위하여, 시료 바이알(650) 및 주입 개구부(563)는 부분적으로 또는 전체적으로 어울리는(matching) 특정 색, 예를 들어 적색으로 제공될 수 있으며, 수화 바이알(670) 및 주입 개구부(583)는 부분적으로 또는 전체적으로 상이하게 어울리는 특정 색, 예시적으로 청색으로 제공될 수 있다. 잘못된 주입 개구부로 잘못된 액체를 삽입할 위험을 최소화하기 위해, 캐뉼라(655)의 직경은 캐뉼라(675)의 직경과 다를 수 있으며, 시료 주입 개구부(563) 및 수화 유체 주입 개구부(583)의 직경은 마찬가지로(similarly) 다를 수 있다. 다른 구성은 본 개시의 범위 내에 속한다.
도 5로 돌아가서 예시적으로, 파우치(510)를 로딩하기 위해, 조작자는 시료 바이알(650)을 시료 바이알 리셉터클(602)에 배치하고 수화 바이알(670)을 로딩 스테이션(600)의 수화 바이알 리셉터클(604)에 배치할 것이다. 스왑(630)의 삽입, 유체 시료의 피펫팅, 환자로부터의 혈액의 바이알 본체로의 직접 적하(dripping), 및 대변과 같은 고체 또는 반고체 시료의 바이알 본체로의 배치를 포함한 시료 타입에 적합한 방식으로, 당 업계의 표준인 선택적인 볼텍싱 또는 기타 혼합과 함께 시료를 시료 완충액(652)에 배치할 것이다. 시료 타입 및 원하는 표적 핵산에 따라, 시료 완충액은 예시적으로, 생물학적 또는 환경적 시료를 처리하기 위한, 하나 또는 그 이상의 첨가제 또는 안정화제, 예를 들면 프로테아제, DNA 분해효소, DNA 분해효소 억제제, RNA 분해효소, RNA 분해효소 억제제, 리소자임 등을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이들 첨가제가 파우치(510)에 제공될 수 있다. 바람직하게는 볼텍싱 또는 혼합 전에, 조작자는 개구부(657)를 통해 캡(658)의 설부(660)를 배치하는 것에 의해 시료 바이알(650)을 폐쇄할 것이다. 설부(660)의 삽입은 바이알 본체(654) 내에 함유된 공기를 가압한다. 예시적으로, 설부(660)는 캐뉼라(655)의 부피와 동일하거나 더 큰 부피를 갖는다. 예시적으로, 하부 캡(664)이 제거될 때, 캐뉼라(655)의 하단부(659)와 시트(648) 사이의 공기 밀봉이 부서지고, 실질적으로 모든 공기가 캐뉼라(655) 밖으로 배출된다. 설부(660)의 부피가 캐뉼라(655)의 부피보다 크다면, 그것은 최대량의 공기가 캐뉼라(655)로부터 나오는 것을 보장하는데 도움을 줄 것이다. 캐뉼라(655) 내로 그리고 잠재적으로 캐뉼라(655)를 통해 통과되는 유체의 양의 넘침(overflow)은 하부 캡(664)에 포획되고 와이퍼(663)에 의해 캐뉼라(655)의 하부로부터 제거될 수 있다. 캐뉼라(655)를 완전히 또는 필수적으로 완전히 채움으로써, 파우치의 로딩시, 파우치(510) 내의 기포(bubble)의 양이 최소화된다. 하나 또는 그 이상의 통풍구(649)는 수화 바이알(650)로부터 하부 캡(664)의 분리를 도울 수 있다.
하부 캡(664)에 육각형 형태의 시료 바이알 리셉터클(602)에 끼워지도록 구성된 육각형 부분(666)이 제공되기 때문에, 조작자는 하부 캡이 리셉터클 (602)과 맞물려 있는 동안에 하부 캡(654)을 쉽게 비틀어 열 수(twist off) 있어서, 그것에 의하여 캐뉼라(655)를 노출시킬 수 있다. 그 다음, 캐뉼라(655)가 시료 주입 개구부(563) 내로 삽입되고 밀어 넣어져 주입 포트(541)를 개방한다. 용해 챔버(522)로의 뒤이은 이동을 위해, 파우치(590) 내부의 진공(또는 파우치 외부의 압력 또는 대기압에 비해 파우치 내부의 감압)이 바이알 본체로부터의 압력의 존재 또는 부재 하에, 예시적으로 시료를 필터(존재한다면)를 통해 통과시키고, 시료를 파우치(510)로, 예시적으로 피트먼트(590)의 챔버(592a) 이동시키는데 사용될 수 있다. 캐뉼라(655)가 실질적으로 유체(652)로 채워지도록 보장함으로써, 시료 바이알(650)로부터 파우치(510)로 이동되는 공기 또는 다른 기체의 양이 최소화되고, 그에 의해 기포의 크기 및 양이 최소화된다. 또한, 플런저를 가진 종래 기술의 주사기가 사용되고 파우치(590) 내부의 진공이 유체를 끌어당길 때, 플런저는 주사기 아래로 당겨져서 주사기 내부의 압력을 평형 상태로 만든다. 도 5 및 도 6의 구체예에서, 각각의 바이알 본체의 상부의 개구부가 밀봉되기 때문에, 파우치(590)의 내부로부터의 진공이 바이알로부터 유체를 끌어당길 때, 바이알은 또한 음압(negative pressure)을 경험할 것이고, 시료를 탈기(degas)시키고 잔류하는 공기 기포를 파우치(590)로부터 끌어낼 수 있다. 그 이후에, 캐뉼라(655)는 시료 주입 개구부(563)로부터 회수되고 시료 바이알(650) 및 하부 캡(664)은 프로토콜에 따라 처리된다. 바이알 본체(654)가 음압 하에 있기 때문에, 캐뉼라(655)가 회수될 때, 주입 포트(541) 주변에서 수집될 수 있는 기포가 파우치(510)로부터 빠져나와 파우치 내의 기포를 더욱 감소시킬 수 있다.
유사하게, 조작자는 수화 바이알(670)로부터 하부 캡(684)을 비틀어 열어서 캐뉼라(675)를 노출시킨다. 수화 바이알(670)의 내용물이 압력 하에 제공되면, 캐뉼라(675)가 시트(692)로부터 분리될 때 소량의 수화 유체가 하부 캡(684)으로 새어 나올 수 있다. 하나 또는 그 이상의 통풍구(693)가 하부 캡(684)과 수화 바이알(670)의 분리를 도울 수 있다. 그 후에, 캐뉼라(675)가 수화 주입 개구부(583) 내로 삽입되고 밀어 넣어져 주입 포트(588)를 개방한다. 파우치(510)의 다양한 블리스터로의 뒤이은 이동을 위해, 피트먼트(590) 내부로부터의 진공이 수화 유체를 파우치(510), 예를 들어 챔버(592b-592l)로 끌어당기는데 사용될 수 있다. 캐뉼라(675)가 수화 주입 개구부(583)로부터 제거되고, 파우치(510)가 로딩 스테이션(600)으로부터 제거되고 기구(800)내에 배치되며, 전개(run)가 시작된다. 바이알의 제거는 단지 예시적인 것으로 이해된다. 기구 및 바이알의 구성이 허락한다면, 바이알은 주입 포트에 영구적으로 삽입될 수 있고, 그에 의해 파우치의 폐쇄 시스템의 일부가 되고 시료의 오염을 최소화할 수 있다. 이러한 구체예에서, 실 바(seal bar)는 필요하지 않을 수 있다.
전술된 시료 바이알(650)의 예시적인 구체예에서, 설부(660)는 캐뉼라(655)의 부피와 동일하거나 더 큰 부피를 갖는다. 파우치(510)가 1 ㎖의 충전 부피(fill volume)를 갖는 예시적인 일 구체예에서, 바이알 본체(654)에 1.5 ㎖의 시료 유체(652) 및 시료 유체 위의 1 ㎖ 부피의 공기(645)가 제공될 수 있다. 따라서, 공기는 바이알 본체(654)의 부피의 40%이다. 그러나 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 그 사이의 양을 포함한 다른 비율의 공기가 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 설부(660)가 개구부(657)를 통해 삽입될 때, 시료 유체 위의 공기는 예시적으로, 약 50% 압축되지만, 40-60%, 30-70%, 20-80% 및 10-90%의 범위에서 압축이 모두 가능하다. 공기 및 시료 유체의 부피의 선택은 시료의 크기, 캐뉼라의 직경, 유체 반응(fluidic reaction)을 수행하기 전에 바이알의 제거가 요구되는지 여부, 및 다수의 기타 인자에 의존하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 스쿠핑된(scooped) 또는 스왑된(swabbed) 시료는 유체 시스템의 충전 부피에 관계없이, 유의성 있게 더 많은 양의 시료 유체가 필요할 수 있다.
예시적인 바이알 본체(654 및 674)는 원통형(cylindrical)이다. 그러나, 이러한 예시적인 바이알은 플런저없이 제공되기 때문에, 바이알 본체는 원형 단면(cross-section)을 가질 필요가 없고, 임의의 본체 형태가 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 이해된다.
도 8 내지 도 10은 로딩 스테이션(600) 및 바이알(650, 670)에 대한 대안적인 구체예를 도시하며, 동일 번호가 유사한 부분을 지시한다. 도 8에 도시된 바와 같이, 로딩 스테이션(700)은 로딩 스테이션(600)과 유사할 수 있고, 도 1에 도시된 것들과 유사하게, 시료 바이알 리셉터클(702) 및 수화 바이알 리셉터클(704) 및 파우치(510)를 수용하기 위한 슬롯(710)을 갖는다. 그러나, 하나 이상의 구체예에 따르면, 리셉터클의 형태 및 위치는 로딩 스테이션(600)과 로딩 스테이션(700) 사이에서 상당히 상이하다. 예를 들면, 하나 이상의 구체예에서, 로딩 스테이션(600)의 리셉터클(602, 604) 대비, 리셉터클(702, 704)은 파우치(510)에 더 가깝다. 이러한 감소된 거리로 인해, 로딩 파우치(510) 위로 점적(drip)이 발생할 기회가 줄어든다. 또한, 도 9 - 10에 가장 잘 도시된 바와 같이, 시료 바이알(750)의 하부 캡(764)에 시료 바이알 리셉터클(702)의 4 개의 매칭(matching) 슬롯(703) 내에 끼워지는 4 개의 상대적으로 짧은 핀(relatively short fins)(767)과 함께 제공되고, 수화 바이알(770)의 하부 캡(784)에 수화 바이알 리셉터클(704)의 2 개의 매칭 슬롯(705) 내에 끼워지는 2 개의 상대적으로 긴 핀(relatively longer fins)(787)이 함께 제공된다. 이 핀은 각각 바이알(650 및 670)의 육각형 부분(666 및 686)을 대체한다. 하부 캡(764)상의 더 많은 수의 핀(767)은 시료 바이알(750)이 수화 바이알 리셉터클(704)에 배치되는 것을 방지하고, 하부 캡(784)의 더 긴 핀(787)은 수화 바이알(770)이 시료 바이알 리셉터클(702)에 배치되는 것을 방지한다. 그러나, 상이한 크기 및 개수의 핀의 사용은 단지 예시적인 것이며, 상이한 키 시스템(keying system)은 본 개시의 범위 내에 있다고 이해된다. 로딩 스테이션(600)과 관련하여 전술된 바와 같이, 로딩 스테이션(700)의 리셉터클(702, 704)은 로딩 과정을 돕기 위해 그들 각각의 바이알 본체(754, 774)로부터 하부 캡(764, 784)을 비틀어 여는 것을 보조하기 위해 사용될 수 있다.
시료 바이알(650, 750) 및 수화 바이알(670, 770)이 파우치(510)의 로딩을 위해 예시적인 실시예에서 사용되나, 이들 로딩 바이알은 본 명세서에 개시된 파우치 중 하나의 로딩에 적합하다고 이해된다. 이들은 또한 다른 유체 또는 미세 유체 장치(fluidic or microfluidic device), 특히 진공 또는 흡입(suction)을 사용하여, 유체 장치로 액체를 끌어당기도록 구성된 유체 장치를 로딩하는데 적합하다.
실시예 3: 시료 준비(SAMPLE PREPARATION)
본 예시적인 구체예에서, 하부 기도 감염(lower respiratory tract infections)(LRTI)으로부터의 시료가 사용된다. 그러나, 본 방법은 처리하기 어려운(difficult-to-process) 생물학적 및 환경적 시료 타입을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다른 시료 타입에 적합할 수 있고, 수집 물질(collection material)에 선택적으로 결합된 후 그로부터 방출되는 시료 타입에 특히 유용하다. LRTI는 일반적인 질환이지만 편향된 진단 기법과 억제성 표본 특징(inhibitory specimen characteristics)의 결과로, 병인체(etiological agent)의 식별이 어려울 수 있다. 병원체(pathogen) 식별을 위한 현재의 "최적 표준(Gold Standard)"은 박테리아 배양이고, 배양은 단지 배양성 병원체(culturable pathogen)를 식별할 수 있는 반면, 비 배양성 병원체(non-culturable pathogen)는 감지되지 않기 때문에, 이는 감도가 부족하며 불완전한 스크리닝 방법이다. LRTI 표본은 기관지 폐포 세척액(broncho-alveolar lavage)(BAL), 미니-BAL, 기관지 세척액, 객담 및 기관 흡인물(endotracheal aspirates)(ETA)과 같은 여러 표본 타입을 포함하고, 이들 모두는 고유하고 종종 까다로운 특징을 갖는다. 객담 및 ETA 표본은 조작이 어려울 수 있고, 처리가 느려질 수 있으며 분자 검출 방법에 대해 매우 억제적일 수 있다. 또한, LRTI 병원체는 그람 양성균 및 그람 음성균, 바이러스 및 곰팡이 개체를 포함하며, 종종 다양한 시료 처리 방법이 필요하다.
객담은 가변 점도(variable viscosity) 및 미립자를 갖는 반-고체 시료 매트릭스(matrix)이다. BAL은 깨끗한 식염수와 비슷한 점도를 가질 수 있거나 객담과 비슷한 점도를 가질 수 있으며, 둘 다 처리상의 어려움을 나타날 수 있다. 어려움은 피펫팅할 수 없는 표본(un-pipetable specimen), 가변 점도로 인한 부정확한 피페팅 부피, 공기 주머니(air pocket), 풀-백(pull-back), 잔여물(remnants) 및 파우치 주입 또는 시료 조작 동안 포밍(foaming)을 포함한다. 점도가 높으면 시료 매트릭스에서 병원균을 분리하는 것이 어려울 수 있다. 또한, 이러한 시료에서 발견된 RNase 활성이 RNA 검출에 영향을 줄 수 있다. 이러한 시료 타입의 경우 물리적 및 화학적 용해의 조합이 효과적일 수 있다.
객담 시료는 환자가 적절한 수집 용기 내로 객담을 뱉거나 환자가 표본을 생성하도록 유도하는 것을 포함하는 적절한 수단을 사용하여 얻어질 수 있다. 대부분의 병원체 검출 방법은 객담 또는 기타 점성이 있는 시료와 함께 사용하기가 어려울 수 있는 부피 전달 시스템(volume transfer system)을 사용한다. 전형적으로, 시료는 후속 피펫팅을 위해 시료를 액화시키도록 전처리된다. 하나의 예시적인 구체예에서, 시료를 옮기기 위해 스왑이 사용되어 전처리(pre-treatment) 단계의 필요성을 줄이거나 없앨 수 있다. 시료를 옮기기 위해, 피펫, 다른 스왑 및 기타 전달 장치(transfer device)가 사용될 수 있지만, 뭉쳐진 스왑(flocked swab)의 사용은 표본 조작에 따른 문제를 최소화하면서 표본을 시험 시스템에 도입하는 간단하고 쉬운 방법을 제공한다. 하나의 적합한 스왑은 FLOQSwabs™(Copan Diagnostics, Murrieta, CA)이다. 이 예시적인 뭉쳐진 스왑은 친수성이고 병원체를 수집하는데 매우 적합하다. 예시적으로 점도가 3 cP 또는 그 이상인 점성을 갖는 시료, 또는 고체 또는 반고체 시료의 경우, 뭉쳐진 스왑은 고체 재료보다 우선적으로(preferentially) 개체를 수집할 수 있다. 뭉쳐진 스왑은 시료 매트릭스 재료에 비해 개체를 우선적으로 방출할 수도 있다. 시료 매트릭스보다 개체를 우선적으로 수집하고 방출하는 다른 재료가 시료를 옮기기 위해 사용될 수 있으며 스왑 포맷은 단지 예시적이라고 이해된다.
하나의 예시적인 구체예에서, 스왑(630)은 환자로부터 수집된 시료에 배치되거나 환경적 시료에 배치될 수 있다. 그 후 스왑(630)은 시료 바이알(650) 내의 시료 완충액(652)에 직접 배치될 수 있다. 시료 완충액(652)은 시료 타입에 따라 임의의 완충액일 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 원한다면, 스왑(630)의 팁이 분리되고 캡(658)이 바이알 본체(654)를 닫는데 사용될 수 있다. 바이알 본체(654) 내의 스왑 팁(630)의 존재는 바이알(650)의 사용에 유의성 있게 영향을 미치면 안된다. 스왑(630)으로부터 존재하는 병원균을 방출하기 위해 바이알(650)은 예시적으로 3 회 반전시킴으로써 진탕되거나, 예시적으로 10 초 동안 보다 격렬하게 흔들릴 수 있다. 대안적으로, 스왑(630)이 시료 완충액(652)에서 저어질(swirled) 수 있고, 그 이후에 스왑(630)은 바이알(650)로부터 제거될 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, 뭉쳐진 스왑은 시료 매트릭스보다 세포, 개체 및 바이러스를 우선적으로 수집할 수 있으며, 그 후에 적어도 개체 및 바이러스를 방출하면서, 점성의 객담 물질과 같은 시료 매트릭스의 일부를 보유할 수 있다고 믿어진다. 그러나, 다양한 구체예에서 다른 스왑 또는 전달 장치가 사용될 수 있다고 이해된다. 예시적으로, 시료를 농축시키기 위해, 시료 매트릭스에 대해 원하는 시료를 선택적으로 수집 및 방출하는 전달 물질이 사용될 수 있다. 이러한 물질은 원하는 시료와 선택적으로 결합 및 방출하고 분석을 위해 시료의 전달 동안 시료와 접촉하여 배치될 수 있는 스왑, 브러쉬, 스폰지, 필터, 기구(utensil), 루프(loop), 종이 또는 기타 흡착성(adsorbent) 물질을 포함한다.
따라서, 그러한 뭉쳐진 스왑은 LRTI 시료와 같은 점성이 있는 시료에서 병원체의 수집 및 방출에 적합하고, 뭉쳐진 스왑은 상당히 균일한 수집 부피(volume)를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 단일 FLOQSwabs™ 스왑은 객담과 같이 더 높은 점성의 시료 타입을 포함한, 시료의 약 150 ~ 300 ㎕를 상당히 재현성 있는 방법으로 수집한다. 작은 시료 부피 범위, 예시적으로 2 배 내지 4 배의 부피 범위를 갖는 점성시료를 재현 가능하게 수집하는 다른 물질도 본 발명의 범위 내에 있다. 시료 부피 범위는 예시적으로 2 배 범위가 150 내지 300 ㎕이고 예시적인 4 배 범위가 150 내지 600 ㎕가 되도록, 시료 수집 재료가 재생 가능하게 수집하는 부피 범위이고, 다른 2 배 및 4 배 범위를 포함하는 다른 범위는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해된다. 예시적인 예는 50 내지 150 ㎕, 및 300 내지 1000 ㎕의 시료 및 가능한 한 5 내지 10 ㎖를 수집하기 위한 크기의 스왑을 포함하지만, 이들 범위는 예시적이고 다른 크기의 범위가 가능하다고 이해된다. 이러한 스왑은 환자로부터 표본을 수집하는데 사용될 수 있지만, 하나의 예시적인 구체예에서, 이러한 스왑은 재현성 있는 방법으로 표본을 수집하고 추가의 처리를 위해 적절한 수집 용기에서 다른 용기로 시료를 옮기기 위해 사용된다. 그러나, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 다른 적합한 수집 및 전달 물질이 본 명세서에 개시된 다양한 구체예와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
일정 기간 동안 어려운 시료를 전처리하는 것은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 객담은 디티오트레이톨(DTT) 및/또는 열로 15 분 또는 그 이상, 때로는 30 분 또는 그 이상 처리할 수 있다. 예시적으로 그러한 전처리 없이, 시료 완충액(652)이 객담 유사 표본을 부분적으로 또는 완전히 액화시키는데 사용될 수 있다. 당 업계에 공지된 완충액은 종종 10% 또는 그 미만의 양의 디터전트를 사용한다. 본 발명에 따른 하나의 예시적인 시료 완충액(652)은 10% 또는 그 이상의 디터전트, 예시적으로 12%, 15%, 18%, 20% 또는 그 이상의 디터전트를 포함할 수 있다. 비-이온성(non-ionic), 이온성(ionic), 및 쌍이온성(zwitterionic) 디터전트를 포함한 적합한 디터전트가 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 구체예에서, 15% 트리톤-X와 같은 비-이온성 디터전트가 사용될 수 있다. 다른 비 제한적인 디터전트는 Tween-20, SDS 및 NP-40을 포함한다. 이러한 더 높은 농도의 디터전트는 핵산 추출 전에 시료의 가열 또는 DTT 혼합물 전처리 같은 전처리의 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 시료는 단지 5 분 또는 그 미만으로, 2 분 또는 그 미만으로, 1 분 또는 그 미만으로, 또는 심지어 대기 시간(hold time) 없이 처리될 수 있다. 그러나 일부 시료 타입에서는 전처리가 바람직할 수 있는 것으로 이해된다. 시료 완충액(652)은 또한 구아니딘 히드로클로라이드와 같은 구아니디움 화합물을 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 실시예에서, 완충액은 산성이며, 예시적으로 약 2 내지 약 6의 pH를 갖는다. 특정 시료 제조 방법에서, 예시적으로 시료 타입이 혈액 또는 혈액 성분일 때 이소프로판올과 같은 알콜이 시료 완충액(652)에 사용된다. 그러나, 다른 시료 완충액은 무 알코올(alcohol-free)일 수 있다. 10% 또는 그 이상, 예시적으로는 15%의 농도에서 디터전트를 사용하는 다양한 예시적 구체예에서, 알코올은 시료 완충액(652)에서 생략될 수 있음이 밝혀졌다.
전술된 바와 같이, 시료 바이알(650)에 필터(646)가 제공될 수 있다. 캐뉼라(655)가 시료 주입 개구부(653)에 삽입되고 시료가 파우치(510) 내로 끌어당겨질 때, 시료 물질은 필터(646)를 통해서 캐뉼라(655)로 여과된다. 이러한 필터(646)는 객담과 같은 점성 시료로 막힐 수 있다. 일부 구체예에서, 시료 바이알(650)에 프로테아제 K와 같은 프로테아제가 제공될 수 있거나, 또는 프로테아제가 달리 시료 바이알(650)로 제공되거나 시료 완충액(652)과 함께 첨가될 수 있다. 프로테아제가 건조된 형태로 제공되면, 시료 완충액(652)의 도입은 프로테아제를 재수화시키고, 시료 완충액(652)으로의 시료의 도입은 시료가 파우치(510)로 전달되고 용해 블리스터(522)에 도달하기 전에도 프로테아제가 시료 내의 단백질을 분해하기 시작할 수 있게 한다. 프로테아제의 작용은 시료의 점도를 감소시키는 것을 도울 수 있고, 그에 의하여 필터(646)를 통과하는 시료의 능력을 향상 시키거나 다른 하류(downstream) 처리 단계를 개선한다. 따라서, 바이알(650) 내에 존재하는 프로테아제에 의해 시료로부터 더 많은 병원체가 유리될(liberated) 수 있다. 그러나, 프로테아제를 사용하는 일부 구체예에서, 프로테아제를 시료 완충액에 직접 첨가하거나 프로테아제를 예를 들어 진입 채널(515b)에 나중에 과정에 첨가하는 것이 바람직할 수 있지만, 다른 구체예에서, 프로테아제는 생략될 수 있다.
뭉쳐진 스왑, 더 높은 디터전트 농도, 프로테아제의 존재 하에서 필터(646)를 통한 여과 또는 이들의 조합을 사용하여 병원체를 우선적으로 전달하는 것은 열 또는 DTT 전처리에 대한 필요성을 없애고 그러한 점성 시료를 충분히 분해할 수 있다고 이해된다. 그 후, 이러한 시료는 후속 용해 단계, 이어서 PCR 또는 다른 시험를 위해 준비될 수 있다.
전술된 예시적인 설명은 객담 및 다른 LRTI 시료 타입에 초점을 맞추고 있지만, 전술된 방법 및 장치는 다양한 시료 타입, 특히, 그에 한정되지는 않으나 어려운 시료 타입에, 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 객담, BAL 및 기타 LRTI 시료 타입 외에도 다른 어려운, 생물학적 시료는 점액, 대변, 조직, 조직 균질액(tissue homogenate), 분쇄된 조직(ground tissue), 파라핀 처리 포르말린 포매 조직(paraffin treated formalin embedded tissue), 뼈, 뼈 균질물(bone homogenate), 딱지(eschars), 고름(puss) 활액(synovial fluid), 림프절 흡인물(lymph node aspirate), 및 위 세척액을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예시적으로 토양, 표면, 분말 또는 식품도 문제(challenges)를 제기할 수 있다. 병원체를 우선적으로 수집하여 방출하는 뭉쳐진 면봉이나 다른 전달 수단을 사용하여 옮기는 것은 정확하게 피펫팅이나 측정이 어려운 시료에서도 비교적 일관적인 병원체 수집을 가능하게 한다. 시료 매트릭스를 부분적으로 또는 완전히 액화시키는 시료 완충액이 사용될 수 있다. 예시적으로 시료의 제조에 도움이 되는 보다 높은 농도의 디터전트 또는 첨가제의 존재 하에, 필터를 통해 시료를 통과시키는 것은 시료 매트릭스를 분해하여 추가 처리에 적합한 형식으로 시료를 제공할 수 있게 한다.
실시예 4 : 직접적인 혈액 시료(DIRECT BLOOD SAMPLES)
이 구체예에서, 직접적인 혈액 시료가 숙주 RNA 분석을 위해 사용된다. 본 명세서에 사용된, "직접적인 혈액(direct blood)"은 배양되지 않았던 혈액 시료를 의미한다. 예시적인 직접적인 혈액 시료는 숙주 개체, 예시적으로 인간으로부터의 직접적인 전혈(whole blood), 전혈 분획(예를 들면, 혈장 또는 혈청), 항응고제 용액(anticoagulant solution)(예를 들면, EDTA, 구연산염(Citrate))에서 수집된 전혈, 또는 RNA 안정화 용액에서 수집된 전혈을 포함한다. 감염성, 급성 및/또는 만성 질환에 대한 숙주 반응은 rRNA(ribosomal RNA), mRNA(messenger RNA), lncRNA(long noncoding RNA) 또는 siRNA(small interfering RNA)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 특정 RNA 분자의 생산에 변화를 초래하는 것으로 이해된다. 이러한 RNA 생산의 변화는 숙주의 질환의 원인(source)을 나타내는데 이용될 수 있다. 직접적인 혈액 시료에서의 RNA는 일반적으로 원심 분리, 세척, 최적화된 완충액의 첨가, 단백질 및 핵산 분해(digest)로 구성되고 종종 추가적인 세척 및 용출(elution)을 포함하는 자동 또는 수동 추출 방법으로 정제된다. 많은 선행 기술 방법에서, 이것은 종점(end point) 분자 진단 도구와는 분리된 장비를 사용하여 모두 완료되며 종종 90 분 또는 그 이상을 필요로 한다. 그 이후에, 결과로서 생기는 정제된 시료를 cDNA 마이크로어레이 또는 qPCR 장치와 같은 종점 분자 진단 시스템에 수동으로 첨가한다. 숙주 RNA 시료를 정제하는 과정은 상당한 시간, 외부 장비 및 시료 조작이 필요하고, 이들 모두는 시료의 무결성(integrity)과 품질에 영향을 미칠 수 있다. 대안적인 접근법은 시료 완충액(652)에 직접적인 혈액 시료(예시적으로 앞서 정의된 형태)를 직접 첨가하는 것이다. 예시적인 시료 완충액은 RNA를 분해할 수 있는 RNA 분해효소(RNAses)와 같은 단백질을 감소시키면서 핵산의 결합 및 회수(recovery)를 보조하는 카오트로픽 제제(chaotropic agent)를 포함한다. 예시적으로, 직접적인 혈액 시료 대 시료 완충액의 비율은 1:8 내지 1:1의 범위, 보다 구체적으로는 1:5 내지 1:1.67의 범위에 있지만, 다른 비율도 가능하다고 이해된다. 그 후에, 전술된 바와 같이, 시료는 파우치 (510)에 직접적으로 로딩될 수 있다. 예시적으로는 바이알(650)에서 최소한의 혼합만으로 또는 추가적인 사용자 조작 없이 숙주 RNA는 전술된 바와 같이 폐쇄 시스템 내에서 추출되고 정제된다. 이러한 시료 제조(sample prep)는 원심 분리, 에탄올 침전 및 DNA 분해와 관련된 단계의 일부 또는 전부가 없이 완료될 수 있다. 따라서 시료는 단지 2 분 이내에 처리될 수 있으며 종점 분자 진단 도구의 외부 장비(external equipment)가 필요하지 않다.
이 적용의 실시예는 인플루엔자 감염에 대응한 숙주 RNA 변화의 검출이다. 제조사 지시에 따라 RNA 안정화 용액에서 수집된 100 ㎕의 전혈 시료를 시료 완충액(652), 예시적으로 FilmArray 호흡 패널(BioFire Diagnostics, LLC)과 함께 제공된 시료 완충액에 첨가하였다. 예시적으로, 300 내지 900 ㎕ 또는 시료의 부피의 2-5 배의 시료 완충액이 사용될 수 있다. 그 후에, 이 혼합물을 일회용 파우치(510)에 주입하였다. 시료 추출, 정제, 역전사(reverse-transcription) 및 2 단계의 중합 효소 연쇄 반응은 건강한 대조군에 비해 바이러스 감염에 대응하여 유의성 있게 상향 조절된 숙주 RNA의 측정을 가져왔다. 시료 정제 및 qPCR 분석의 전체 과정은 70 분 미만이 소요되었다.
이 응용의 또 다른 실시예는 항응고제 용액(EDTA)에서 수집된 전혈로부터의 숙주 RNA의 검출이다. 이 전혈 시료 100 ㎕을 동일한 시료 완충액 800 ㎕에 첨가하였다. 그 후에, 이 혼합물을 파우치(510)에 주입하였다. 시료 추출, 정제, 역전사 및 중합 효소 연쇄 반응의 두 단계로 숙주 RNA의 측정을 결과로 얻었다. 시료 정제 및 qPCR 분석의 전체 과정은 70 분 미만이 소요되었다.
이들 실시예는 다양한 RNA 분자, 박테리아, 바이러스 또는 다른 미생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 핵산,예시적으로 높은 카피 수의 핵산이 용해,예시적으로 화학적 및/또는 기계적 용해 및 핵산 정제(예시적으로 실리카 기질로의 결합 및 그로부터의 용출, 예시적으로 5 회 이하의 세척 또는 3 회 이하의 세척이나 단지 1 회의 세척이 본 발명의 범위 내에 있다)만을 사용하여 직접적인 혈액 시료로부터 추출될 수 있다. 이들 핵산은 원심 분리 또는 효소 분해(enzymatic digestion) 없이, 및 다수의 반복된 세척 단계 없이 추출되고 제조될 수 있다. 또한 입증된 바와 같이, 이 추출된 핵산은 후속 증폭을 위한 주형(template)으로 적합하다.
본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 기술된 구체예들은 모든 면에서 제한적이지 않고 단지 예시적인 것으로 간주된다. 그러므로, 본 발명의 범위는 전술한 설명보다는 첨부된 청구항에 의해 표시된다. 특정 구체예 및 세부 사항, 본 명세서 및 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 첨부된 발명의 개시에 포함되었지만, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 방법 및 장치의 다양한 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 청구항의 균등물의 범위 및 의미 내에 있는 모든 변경은 그 범위 내에 포함된다.
510: 파우치(pouch)
515a 내지 515l: 주입채널(entry channel)
522, 544, 546, 548, 564 및 566: 블리스터(blister)
514, 538, 543, 552, 553, 562, 및 565: 채널(channel)
533: 자성 비드(magnetic bead)
541, 588: 포트(port)
563: 시료 주입 개구부(injection opening)
580: 제 2 단계 반응 영역(second-stage reaction zone)
581: 고밀도 어레이(high density array)
582: 제 2 단계 웰(second-stage well)
583: 수화 유체 주입 개구부(hydration fluid injection opening)
590: 피트먼트(fitment)
592b 내지 592l: 챔버(chamber)
594: 피트먼트의 제 1 표면(first surface of fitment), 595: 피트먼트의 제 2 표면(second surface of fitment)
600: 로딩 스테이션(loading station)
602: 시료 바이알 리셉터클(sample vial receptacle), 604: 수화 바이알 리셉터클(hydration vial receptacle)
610: 슬롯(slot)
630: 스왑(swab), 652: 시료 완충액(sample buffer)
644: o-링(o-ring), 645: 공기(air), 646: 필터(filter), 648: 시트(seat), 649:통풍구(vent)
650: 시료 바이알(sample vial), 670: 수화 바이알(hydration vial)
654: 바이알 본체(vial body), 655: 캐뉼라(cannula), 657: 개구부(opening), 658: 캡(cap)
659: 캐뉼라의 하단부(bottom end)
660: 설부(tongue)
662: 상부 표면(top surface), 663: 와이퍼(wiper), 664: 하부 캡(bottom cap)
666: 육각형의 하부 표면(hexagonal bottom surface)
670: 수화 바이알(hydration vial), 672: 수화 유체(hydration fluid), 674: 바이알 본체(vial body), 675: 캐뉼라(cannul), 677: 개구부(opening), 678: 캡(cap), 680: 설부(tongue), 682: 상부 표면(top surface), 683: 와이퍼(wiper), 684: 하부 캡(bottom cap), 685: 공기(air),686: 육각형 부분(hexagonal portion), 692: 시트(seat), 693: 통풍구(vent)
700: 로딩 스테이션(loading station), 702 및 704: 리셉터클(receptacle), 703 및 705: 슬롯(slot)
750: 시료 바이알(sample vial), 764 및 784: 하부 캡(bottom cap), 767: 상대적으로 짧은 핀(relatively short fins), 770: 수화 바이알(hydration vial), 787: 상대적으로 긴 핀(relatively longer fins)
800: 기구(instrument),804: 슬롯(slot), 808:블래더 조립체(bladder assembly)
802: 지지 부재(support member), 811: 지지 부재의 제 1면(first side of support member), 814: 지지 부재의 제 2면(second side of support member)
810: 블래더 조립체(bladder assembly)
819: 모터(motor)
821: 블레이드(blade)
822, 844, 846, 848, 864, 866; 블래더(bladder)
824: 블래더 플레이트(bladder plate)
838, 843, 852, 853 및 865; 하드 실(hard seal)
850:자석(magnet), 851: 리세스(recess)
868: 공압 피스톤(pneumatic piston), 869: 공압식 피스톤 어레이(pneumatic piston array)
871,872,873,874: 실(seal)
878: 호스(hose)
886 및 888: 히터(heater)
890: 광학 어레이(optical array)
891: 케이블(cable), 892:디스플레이(display), 894: 컴퓨터(compute), 895: 압축 기체 공급원(compressed air source), 896: 카메라(camera), 898:광원(light source)
899: 밸브(valve)
515a 내지 515l: 주입채널(entry channel)
522, 544, 546, 548, 564 및 566: 블리스터(blister)
514, 538, 543, 552, 553, 562, 및 565: 채널(channel)
533: 자성 비드(magnetic bead)
541, 588: 포트(port)
563: 시료 주입 개구부(injection opening)
580: 제 2 단계 반응 영역(second-stage reaction zone)
581: 고밀도 어레이(high density array)
582: 제 2 단계 웰(second-stage well)
583: 수화 유체 주입 개구부(hydration fluid injection opening)
590: 피트먼트(fitment)
592b 내지 592l: 챔버(chamber)
594: 피트먼트의 제 1 표면(first surface of fitment), 595: 피트먼트의 제 2 표면(second surface of fitment)
600: 로딩 스테이션(loading station)
602: 시료 바이알 리셉터클(sample vial receptacle), 604: 수화 바이알 리셉터클(hydration vial receptacle)
610: 슬롯(slot)
630: 스왑(swab), 652: 시료 완충액(sample buffer)
644: o-링(o-ring), 645: 공기(air), 646: 필터(filter), 648: 시트(seat), 649:통풍구(vent)
650: 시료 바이알(sample vial), 670: 수화 바이알(hydration vial)
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660: 설부(tongue)
662: 상부 표면(top surface), 663: 와이퍼(wiper), 664: 하부 캡(bottom cap)
666: 육각형의 하부 표면(hexagonal bottom surface)
670: 수화 바이알(hydration vial), 672: 수화 유체(hydration fluid), 674: 바이알 본체(vial body), 675: 캐뉼라(cannul), 677: 개구부(opening), 678: 캡(cap), 680: 설부(tongue), 682: 상부 표면(top surface), 683: 와이퍼(wiper), 684: 하부 캡(bottom cap), 685: 공기(air),686: 육각형 부분(hexagonal portion), 692: 시트(seat), 693: 통풍구(vent)
700: 로딩 스테이션(loading station), 702 및 704: 리셉터클(receptacle), 703 및 705: 슬롯(slot)
750: 시료 바이알(sample vial), 764 및 784: 하부 캡(bottom cap), 767: 상대적으로 짧은 핀(relatively short fins), 770: 수화 바이알(hydration vial), 787: 상대적으로 긴 핀(relatively longer fins)
800: 기구(instrument),804: 슬롯(slot), 808:블래더 조립체(bladder assembly)
802: 지지 부재(support member), 811: 지지 부재의 제 1면(first side of support member), 814: 지지 부재의 제 2면(second side of support member)
810: 블래더 조립체(bladder assembly)
819: 모터(motor)
821: 블레이드(blade)
822, 844, 846, 848, 864, 866; 블래더(bladder)
824: 블래더 플레이트(bladder plate)
838, 843, 852, 853 및 865; 하드 실(hard seal)
850:자석(magnet), 851: 리세스(recess)
868: 공압 피스톤(pneumatic piston), 869: 공압식 피스톤 어레이(pneumatic piston array)
871,872,873,874: 실(seal)
878: 호스(hose)
886 및 888: 히터(heater)
890: 광학 어레이(optical array)
891: 케이블(cable), 892:디스플레이(display), 894: 컴퓨터(compute), 895: 압축 기체 공급원(compressed air source), 896: 카메라(camera), 898:광원(light source)
899: 밸브(valve)
Claims (55)
- 스왑(swab)을 이용하여 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 수집하는 단계,
상기 수집된 시료를 갖는 스왑을 시료 완충액에 배치하는 단계, 및
상기 시료를 여과시키는 단계를 포함하는, 시료 수집 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액 중 시료와 프로테아제를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 스왑은 뭉쳐진 스왑(flocked swab)인 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수집 단계는 피펫팅(pippeting) 없이 시료 용기(sample vessel)로부터 시료를 수집하는 것을 포함하고, 상기 스왑은 4배 부피 범위 내에서 상당한 양의 시료(an amount of the sample)를 흡수하고 방출하도록 구성되는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 스왑은 2배 부피 범위 내에서 상기 생물학적 또는 환경적 물질로부터 시료를 흡수하고 방출하도록 구성되는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 물질은 3 cP 또는 그 이상의 점도를 갖는 물질인 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 점성 물질은 객담인 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 시료 완충액의 부피 기준으로 10% 이상의 양으로 디터전트를 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 시료 완충액의 부피 기준으로 12% 이상의 양으로 디터전트를 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 시료 완충액의 부피 기준으로 12% 내지 18% 범위의 양으로 디터전트를 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 시료 완충액의 부피 기준으로 15% 트리톤-X(Triton-X)를 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 여과시키는 단계는 프로테아제의 존재 하에 필터를 통해 시료를 통과시키는 것을 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 알코올을 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 알코올을 포함하지 않는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 시료 매트릭스(sample matrix) 및 병원체를 포함하고, 상기 스왑은 우선적으로 상기 시료 매트릭스를 보유하고, 우선적으로 상기 병원체를 상기 시료 완충액으로 방출시키는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 5 분 초과의 전처리 단계가 없는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 2 분 초과의 전처리 단계가 없는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 시료는 객담이고, 상기 객담은 상기 배치하는 단계 전에 열 처리되지 않거나 DTT로 처리되지 않는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 시료 완충액은 비-이온성 디터전트, 이온성 디터전트, 쌍이온성 디터전트, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 디터전트를 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 또는 환경적 시료는 어려운 시료 타입인 것인 시료 수집 방법.
- 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 수집하는 단계; 및
상기 시료를 시료 완충액에 배치하는 단계로서, 상기 시료 완충액은 시료 완충액의 부피 기준으로 10% 이상의 양으로 디터전트를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 시료 수집 방법. - 청구항 21에 있어서, 필터를 통해 상기 시료를 통과시키는 단계를 더 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 시료 완충액 중 시료를 프로테아제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 시료는 혈액 또는 혈액 산물(blood product)인 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 24에 있어서, 상기 시료 완충액은 알코올을 포함하지 않는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 시료는 시료 매트릭스 및 하나 이상의 병원체를 포함하고, 여과시키는 단계는 상기 시료 매트릭스를 상기 병원체로부터 분리하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 여과시키는 단계는 5분 초과의 전처리 단계 없이, 상기 시료 매트릭스를 상기 병원체로부터 분리하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 시료는 객담이고, 상기 객담은 상기 배치하는 단계 전에 열 처리되지 않는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 완충액은 약 2 내지 약 6의 pH를 갖는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 수집하는 단계는 상기 시료를 포함하는 시료 매트릭스를, 시료 매트릭스보다 개체를 우선적으로 수집하고 방출하는 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하는 시료를 시료 매트릭스보다 개체를 우선적으로 수집하고 방출하는 물질과 접촉시키는 것에 의해 시료를 수집하는 단계, 및
상기 수집된 시료를 갖는 물질을 시료 완충액에 배치하는 단계를 포함하는, 시료 수집 방법. - 청구항 31에 있어서, 상기 물질은 친수성 물질인 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 32에 있어서, 상기 물질의 고정된 양이 4 배 범위 내에서 재현성 있게 상당한 양의 시료를 흡수하고 방출하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 물질은 스왑으로 제공되는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 물질은 흡착성(adsorbent)이고, 스왑, 브러쉬, 스폰지, 필터, 기구(utensil), 루프(loop), 및 종이로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 31에 있어서, 상기 시료를 여과시키는 단계를 더 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 청구항 31에 있어서, 상기 수집된 시료로부터의 핵산을 증폭 조건에 적용하는 단계를 더 포함하는 것인 시료 수집 방법.
- 캐뉼라가 달린 바이알(cannulated vial)로서,
일 말단에 상부 표면(top surface), 반대 말단에 하부 표면(bottom surface), 및 그 사이에, 내부 바이알 부피를 정의하는 외벽(exterior wall)을 갖고, 상기 상부 표면은 개구부를 갖는 것인 바이알 본체(vial body),
상기 하부 표면으로부터 연장되고, 제1 말단, 제2 말단, 및 그 사이에, 캐뉼라(cannula) 부피를 정의하는 외부 표면(outer surface)를 갖고, 상기 제1 말단은 상기 내부 바이알 부피와 유체 소통(fluid communication)하는 것인 캐뉼라, 및
상기 바이알 본체와 캐뉼라 사이에 배치된 필터, 및
상기 캐뉼라가 달린 바이알에 제공된 첨가제를 포함하는 것인 캐뉼라가 달린 바이알. - 청구항 38에 있어서, 상기 첨가제는 건조된 형태로 제공되는 것인 캐뉼라가 달린 바이알.
- 청구항 38에 있어서, 상기 첨가제는 핵산의 안정화를 위해 사용되는 물질 또는 시료 용해를 개시하기 위해 사용되는 물질의 성분인 것인 캐뉼라가 달린 바이알.
- 청구항 38에 있어서, 상기 첨가제는 프로테아제인 것인 캐뉼라가 달린 바이알.
- 시료를 수용하도록 구성된 개구부(opening),
유체를 유지하도록 구성된 본체,
상기 시료가 유출될 수 있도록 구성된 개구부,
상기 본체와 상기 유출 개구부(exit) 사이에 배치된 필터, 및
상기 시료를 처리하기 위해 제공된 첨가제를 포함하는, 시료 용기. - 청구항 42에 있어서, 상기 첨가제는 상기 시료 용기 중에 건조된 상태로 제공되는 것인 시료 용기.
- 청구항 43에 있어서, 상기 첨가제는 프로테아제, DNA 분해효소(DNAse), DNA 분해효소 억제제, RNA 분해효소(RNAase), RNA 분해효소 억제제, 환원제 및 리소자임(lysozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 시료 용기.
- 하기를 포함하는, 직접적인 혈액 시료(direct blood sample)로부터 핵산을 증폭시키는 방법:
(a) 상기 직접적인 혈액 시료를 시료 완충액에 첨가하는 단계,
(b) 상기 시료 완충액을 비드 비팅(bead beating)하는 단계,
(c) 상기 시료 완충액으로부터 핵산을 추출하는 단계,
(d) 상기 핵산을 증폭시키는 단계. - 청구항 45에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)가 폐쇄된 시료 용기 내에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)는 원심분리, 에탄올 침전, 및 DNA 분해(DNA digestion) 없이 수행되는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 핵산은 숙주 RNA인 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 직접적인 혈액 시료는 RNA 안정화 용액(RNA stabilized solution)에 수집되는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 직접적인 혈액 시료는 비-RNA 안정화 용액(non-RNA stabilizing solution)에 수집되는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 직접적인 혈액 시료는 단계 (a) 전에 분리되고, 혈액 분획이 이용되는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에 시료를 여과시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 핵산은 높은 카피수로 제공되는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 핵산은 미생물로부터 유래된 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 추출하는 단계 후에 상기 핵산을 세척하는 단계를 더 포함하고, 상기 세척하는 단계는 3 회 이하의 세척을 포함하는 것인 방법.
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