BR112018008331B1 - Métodos para uso de amostra - Google Patents

Métodos para uso de amostra Download PDF

Info

Publication number
BR112018008331B1
BR112018008331B1 BR112018008331-3A BR112018008331A BR112018008331B1 BR 112018008331 B1 BR112018008331 B1 BR 112018008331B1 BR 112018008331 A BR112018008331 A BR 112018008331A BR 112018008331 B1 BR112018008331 B1 BR 112018008331B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
sample
buffer
swab
illustratively
vial
Prior art date
Application number
BR112018008331-3A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112018008331A2 (pt
Inventor
Stephanie Anne Thatcher
Jeremy Paul Green
Erik Wong Huynh
Andrew Clinton Hemmert
Jesse Linton Montgomery
Robert John Crisp
Kendall A. Rasband
Elizabeth Mary Ott Crowther
Cheryl Lynn Baird
Original Assignee
Biofire Diagnostics, Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biofire Diagnostics, Llc filed Critical Biofire Diagnostics, Llc
Publication of BR112018008331A2 publication Critical patent/BR112018008331A2/pt
Publication of BR112018008331B1 publication Critical patent/BR112018008331B1/pt

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/537—Protease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/153—Viscosity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N2001/028—Sampling from a surface, swabbing, vaporising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

PREPARAÇÃO DE AMOSTRA PARA TIPOS DIFÍCEIS DE AMOSTRA. Trata-se de dispositivos e métodos para coletar e manusear tipos difíceis de amostra. Em um aspecto da presente descrição, um método de coleta de amostra é fornecido, sendo que o método compreende coletar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental através do uso de um swab, dispor o swab com a amostra coletada em um tampão de amostra e filtrar a amostra. Em várias modalidades ilustrativas, o tampão de amostra pode incluir uma protease ou um detergente e a amostra pode ser coletada e transferida para o tampão de amostra através do uso de um swab flocado.

Description

DECLARAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício, sob 35 U.S.C. § 119(e), do pedido de patente provisório no U.S. 62/249.592, depositado em 2 de novembro de 2015, cujos conteúdos se encontram incorporados a título de referência no presente documento.
ANTECEDENTES CAMPO DA TÉCNICA
[002] As modalidades da presente descrição se referem, geralmente, a métodos e dispositivos para extrair ácidos nucleicos de uma amostra.
ANTECEDENTES
[003] Nos Estados Unidos da América, Canadá e Europa Ocidental, doenças infecciosas são responsáveis por aproximadamente 7% da mortalidade humana, enquanto em regiões em desenvolvimento, as doenças infecciosas são responsáveis por mais do que 40% da mortalidade humana. As doenças infecciosas levam a inúmeras manifestações clínicas. Dentre as manifestações evidentes comuns estão febre, pneumonia, meningite, diarreia e diarreia contendo sangue. Embora as manifestações físicas sugiram alguns patógenos e eliminem outros como o agente etiológico, inúmeros agentes causadores potenciais permanecem, e a diagnose clara frequentemente exige que inúmeros ensaios sejam executados. Técnicas de microbiologia tradicionais para diagnosticar patógenos podem levar dias ou semanas, frequentemente atrasando um curso apropriado de tratamento.
[004] Nos últimos anos, a reação em cadeia de polimerase (PCR) se tornou um método de escolha para diagnose rápida de agentes infecciosos. PCR pode ser uma ferramenta rápida, sensível e específica para diagnosticar uma doença infecciosa. Um desafio através do uso de PCR como um meio principal de diagnose são inúmeros organismos ou vírus causadores possíveis e os níveis baixos de organismo ou vírus presentes em alguns espécimes patológicos. É frequentemente não prático executar painéis grandes de ensaios de PCR, um para cada possível organismo ou vírus causador, sendo que é esperado que a maioria dos quais sejam negativos. O problema é exacerbado quando ácido nucleico de patógeno está em baixa concentração e exige um volume grande de amostra para reunir modelos de reação adequados. Em alguns casos há amostra inadequada para o ensaio para todos os possíveis agentes etiológicos. Uma solução é executar "PCR multiplex" em que a amostra é concorrentemente analisada quanto a alvos múltiplos em uma única reação. Enquanto PCR multiplex tem se provado como sendo valioso em alguns sistemas, imperfeições existem em relação a robustez de reações multiplex de nível elevado e dificuldades para análise clara de múltiplos produtos. Para resolver esses problemas, o ensaio pode ser subsequentemente dividido em múltipla PCRs secundárias. Manter reações secundárias dentro do produto primário aumenta a robustez. Sistemas fechados tal como o FilmArray® (BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, UT) reduzem o manuseio, diminuindo, assim, o risco de contaminação.
[005] A preparação de amostra é frequentemente um equilíbrio entre extração severa e condições de lise para liberar ácidos nucleicos de materiais mais difíceis tais como esporos e amostras preservadas em parafina, e condições mais suaves de lise que podem minimizar degradação de ácido nucleico, particularmente em contaminantes que se lisam mais facilmente e têm cromossomos mais longos. Seria desejável ser capaz de extrair ácidos nucleicos de materiais mais difíceis sem degradar outros ácidos nucleicos que podem estar presentes na amostra.
[006] Adicionalmente, certos tipos de amostra podem ser difíceis de manusear. Pode ser difícil introduzir uma amostra sólida, semissólida, ou viscosa para um sistema de processamento biológico. Tipos de amostra tal como esputo são difíceis de pipetar e medir, e frequentemente exigem o pré-tratamento por um período de tempo antes do processamento de amostra, ilustrativamente com calor ou ditiotreitol, para reduzir a viscosidade e auxiliar a quebrar a matriz de amostra. Adicionalmente ao esputo, outras amostras biológicas difíceis incluem, mas não estão limitadas a, muco, BAL, e outros tipos de amostra respiratória, fezes, tecido, homogenato de tecido, tecido moído, tecido integrado em formalina em parafina, osso, homogenato de osso, escaras, pus, fluido sinovial, aspirados de linfonodo, e lavagens estomacais. Amostras ambientais, ilustrativamente solo, superfícies, pós ou alimento, são frequentemente sólidos ou semissólidos e podem também apresentar desafios. Ademais, o manuseio extensivo durante pré-tratamento de amostra pode levar à contaminação cruzada, pode ser demorado, e frequentemente dilui a amostra, frequentemente levando à sensibilidade diminuída.
[007] A presente invenção trata de várias questões relacionadas à preparação de uma amostra antes de testagem adicional, por exemplo, para purificação de ácidos nucleicos de uma amostra, para análise biológica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] Em um aspecto da presente descrição, um método de coleta de amostra é fornecido, sendo que o método compreende coletar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental através do uso de um swab, dispondo o swab com a amostra coletada em um tampão de amostra, e filtrando a amostra. Em várias modalidades ilustrativas, o tampão de amostra pode incluir uma protease ou um detergente e a amostra pode ser coletada e transferida para o tampão de amostra através do uso de um swab flocado.
[009] Em outro aspecto, um método de coleta de amostra é fornecido, sendo que o método compreende coletar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental, e dispor a amostra em um tampão de amostra no tampão de amostra que compreende um detergente em uma quantidade de pelo menos 10% em volume do tampão de amostra. Modalidades ilustrativas podem incluir extrair a amostra através de um filtro.
[0010] Em um aspecto adicional, um método de coleta de amostra é fornecido, sendo que o método compreende coletar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental mediante o contato da amostra com um material que preferencialmente coleta e libera o organismo sobre a matriz de amostra, e dispor o material com a amostra coletada em um tampão de amostra. Ilustrativamente, o material é um material hidrofílico ou material adsorvente. Em uma modalidade, uma quantidade fixa do material absorve e libera reprodutivamente uma quantidade da amostra dentro de uma faixa quádrupla.
[0011] Em outro aspecto da presente descrição um frasco canulado é fornecido, sendo que o frasco canulado compreende um corpo de frasco que tem uma superfície de topo em uma extremidade, uma superfície de fundo em uma extremidade oposta e parede exterior entre as mesmas que define um volume interior de frasco, em que a superfície de topo tem uma abertura, uma cânula que se estende a partir da superfície de fundo e que tem uma primeira extremidade, uma segunda extremidade e uma superfície externa entre as mesmas que define um volume de cânula, a primeira extremidade em comunicação fluida com o volume interior de frasco, e um filtro disposto entre o corpo de frasco e a cânula, e um aditivo fornecido no frasco canulado.
[0012] Em ainda outro aspecto da presente descrição, um recipiente de amostra é fornecido, o recipiente de amostra compreende uma abertura configurada para receber uma amostra, um corpo configurado para reter um fluido, uma abertura configurada para permitir que o fluido saia, um filtro disposto entre o corpo e a saída, e um aditivo fornecido para tratar a amostra. Ilustrativamente, o aditivo pode ser fornecido seco no recipiente de amostra. Aditivos ilustrativos incluem proteases, DNAses, inibidores de DNAse, RNAses, inibidores de RNAse, e lisozimas.
[0013] Em ainda outro aspecto da presente descrição, um método para introduzir um aditivo em um sistema é fornecido, sendo que o método compreende obter o recipiente de amostra conforme descrito acima, o recipiente de amostra que retém o fluido, introduzir a amostra através da abertura no fluido, extrair o fluido através do filtro e para fora da saída.
[0014] Em um aspecto adicional, métodos para amplificar ácidos nucleicos de uma amostra direta de sangue são fornecidos, sendo que os métodos compreendem adicionar a amostra direta de sangue a um tampão de amostra, agitar com esferas o tampão de amostra, extrair os ácidos nucleicos do tampão de amostra, e amplificar os ácidos nucleicos. Ilustrativamente, tais métodos podem ser executados em um vaso de amostra fechado. Em outro método ilustrativo, as etapas são executadas sem uma ou mais dentre centrifugação, precipitação com etanol, e digestão de DNA.
[0015] Recursos e vantagens adicionais das modalidades da presente invenção serão estabelecidos na descrição a seguir ou podem ser aprendidos pela prática de tais modalidades. Os recursos e vantagens de tais modalidades podem ser realizados e obtidos por meio dos instrumentos e combinações particularmente ressaltadas nas reivindicações anexas. Esses e outros recursos se tornarão mais completamente aparentes a partir da descrição a seguir e das reivindicações anexas, ou podem ser aprendidos pela prática de tais modalidades conforme estabelecidas doravante no presente documento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0016] Com a finalidade de descrever a maneira na qual o supracitado e outras vantagens e recursos da presente invenção podem ser obtidos, uma descrição mais particular da presente invenção brevemente descrita acima será efetuada tendo como referência modalidades específicas da mesma que são ilustradas nos desenhos anexos. O entendimento de que esses desenhos ilustram apenas modalidades típicas da presente invenção e não devem, portanto, ser considerados como sendo limitantes de seu escopo, a invenção será descrita e explicada com especificidade e detalhes adicionais através do uso dos desenhos anexos em que:
[0017] A Figura 1 mostra uma bolsa flexível de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[0018] A Figura 2 é uma vista em perspectiva explodida de um instrumento para uso com a bolsa da Figura 1, incluindo a bolsa da Figura 1, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
[0019] A Figura 3 mostra uma vista em corte transversal parcial do instrumento da Figura 2, incluindo os componentes de bexiga da Figura 2, com a bolsa da Figura 1 mostrada em linhas pontilhadas, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
[0020] A Figura 4 mostra um motor usado em uma modalidade ilustrativa do instrumento da Figura 2.
[0021] A Figura 5 mostra uma estação de carregamento para carregar a bolsa da Figura 1, incluindo a bolsa da Figura 1, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
[0022] A Figura 6 mostra um frasco de amostra para carregar uma amostra na bolsa da Figura 1.
[0023] A Figura 7 mostra um frasco de hidratação para fornecer um fluido de hidratação para a bolsa da Figura 1, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
[0024] A Figura 8 mostra uma estação de carregamento comparável à Figura 5, mas exibindo uma configuração de estação de carregamento diferente e frascos para o uso com a estação de carregamento, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
[0025] A Figura 9 mostra uma porção do frasco de amostra da Figura 8 e como o frasco de amostra transiciona para o receptáculo de frasco de amostra da estação de carregamento da Figura 8, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
[0026] A Figura 10 mostra uma porção de a frasco de hidratação da Figura 8 e como o frasco de hidratação transiciona para o receptáculo de frasco de hidratação da estação de carregamento da Figura 8, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0027] Modalidades exemplificativas são descritas abaixo com referência aos desenhos anexos. Muitas formas e modalidades diferentes são possíveis sem se desviar do espírito e dos ensinamentos desta descrição e, assim, a descrição não deveria ser construída como limitada às modalidades exemplificativas estabelecidas no presente documento. Ao invés disso, essas modalidades exemplificativas são fornecidas de modo que esta descrição será minuciosa e completa, e irá transmitir o escopo da presente descrição aos versados na técnica. Nos desenhos, os tamanhos e tamanhos relativos das camadas e regiões podem ser exagerados por motivos de clareza. Numerais de referência similares se referem a elementos similares por toda a descrição.
[0028] A menos que definido de outro modo, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um indivíduo com habilidade comum na técnica a qual a presente descrição pertence. Será adicionalmente entendido que os termos, tais como os que estão definidos nos dicionários comumente usados, deveriam ser interpretados como tendo um significado que seja consistente com o seu significado no contexto do presente pedido e da técnica relevante e não deveria ser interpretado de uma forma idealizada ou extremamente formal a menos que seja expressamente definido no presente documento. A terminologia usada na descrição da presente invenção no presente documento é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não é destinada a ser limitante da presente invenção. Embora inúmeros métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática da presente descrição, apenas certos materiais e métodos exemplificativos são descritos no presente documento.
[0029] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes ou outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas a título de referência em suas totalidades. No caso de um conflito na terminologia, o presente relatório descritivo será o predominante.
[0030] Vários aspectos da presente descrição, incluindo dispositivos, sistemas, métodos, etc., podem ser ilustrados com referência a uma ou mais implantações exemplificativas. Conforme usado no presente documento, os termos "exemplificativo" e "ilustrativo" significam "que funciona como um exemplo, caso, ou ilustração", e não deveriam necessariamente ser construídos como preferencial ou vantajoso sobre outras implantações reveladas no presente documento. Adicionalmente, referência a uma "implantação" ou "modalidade" da presente descrição ou invenção inclui uma referência específica a uma ou mais modalidades da mesma, e vice-versa, e é destinada a fornecer exemplos ilustrativos sem limitar o escopo da presente invenção, que é indicado pelas reivindicações anexas ao invés da descrição a seguir.
[0031] Será notado que, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "a" incluem referências plurais a menos que o conteúdo claramente indique de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "um bloco" inclui um, dois, ou mais blocos. De maneira similar, referência a uma pluralidade de referentes deveria ser interpretada como compreendendo um referente único e/ou uma pluralidade de referentes a menos que o conteúdo e/ou contexto claramente mencione de outro modo. Assim, referência a "blocos" não necessariamente exige uma pluralidade de tais blocos. Ao invés disso, será apreciado que independente da conjugação, um ou mais blocos são contemplados no presente documento.
[0032] Conforme usado por todo este pedido de patente as palavras "poderia" e "pode" são usadas em um modo permissivo (isto é, significado que tem o potencial para), ao invés de no sentido obrigatório (isto é, significado precisa). Adicionalmente, os termos "incluindo", "que tem", "envolvendo", "contendo", "distinguido por", variantes dos mesmos (por exemplo, "inclui", "tem", "envolve", "contém", etc.), e termos similares conforme usados no presente documento, incluindo nas reivindicações, deverão ser inclusivos e/ou com significado aberto, devendo ter o mesmo significado que a palavra "compreende" e variantes da mesma (por exemplo, "que compreende" e "compreende"), e não excluindo elementos adicionais não citados ou etapas de método, ilustrativamente.
[0033] Conforme usado no presente documento, direcional e/ou termos arbitrários, tais como "topo", "fundo", "esquerda", "direita", "para cima", "para baixo", "superior", "inferior", "interno", "externo", "no interior", "no exterior", "interior", "exterior", "proximal", "distal", "para frente", "inverso", e similares podem ser usados somente para indicar direções e/ou orientações relativas e podem não ser de outro modo destinados a limitar o escopo da presente descrição, incluindo o relatório descritivo, invenção, e/ou reivindicações.
[0034] Será entendido que quando um elemento é denominado como sendo "acoplado", "conectado", ou "responsivo" a, ou "em", outro elemento, pode ser diretamente acoplado, conectado, ou responsivo a, ou em, o outro elemento, ou elementos interpostos também podem estar presente. Contrastantemente, quando um elemento é denominado como sendo "diretamente acoplado", "diretamente conectado", ou "diretamente responsivo" a, ou "diretamente em", outro elemento, não há elementos interpostos presentes.
[0035] Modalidades exemplificativas dos presentes conceitos inventivos são descritos no presente documento com referência às ilustrações em corte transversal que são ilustrações esquemáticas de modalidades idealizadas (e estruturas intermediárias) das modalidades exemplificativas. Como tal, variações dos formatos das ilustrações como um resultado, por exemplo, de técnicas de fabricação e/ou tolerâncias, devem ser esperadas. Assim, as modalidades exemplificativas dos presentes conceitos inventivos não deveriam ser construídas como limitadas aos formatos particulares das regiões ilustradas no presente documento mas devem incluir desvios de formatos que resultam, por exemplo, da fabricação. Consequentemente, as regiões ilustradas nas figuras são esquemáticas por natureza e seus formatos não são destinados a lustrar o formato real de uma região de um dispositivo e não são destinados a limitar o escopo das modalidades exemplificativas.
[0036] Será entendido que, embora os termos "primeiro", "segundo", etc. possam ser usados no presente documento para descrever vários elementos, esses elementos não deveriam ser limitados por esses termos. Esses termos são apenas usados para distinguir um elemento do outro. Assim, um "primeiro" elemento poderia ser denominado um "segundo" elemento sem se afastar dos ensinamentos das presentes modalidades.
[0037] É também entendido que várias implantações descritas no presente documento podem ser utilizadas em combinação com qualquer outra implantação descrita ou revelada, sem se afastar do escopo da presente descrição. Portanto, produtos, membros, elementos, dispositivos, aparelhos, sistemas, métodos, processes, composições, e/ou kits de acordo com certas implantações da presente descrição podem incluir, incorporar, ou de outro modo compreender propriedades, recursos, componentes, membros, elementos, etapas, e/ou similares descritos em outras implantações (incluindo sistemas, métodos, aparelhos e/ou similares) reveladas no presente documento sem se afastar do escopo da presente descrição. Assim, referência a um recurso específico em relação a uma implantação não deveria ser construída como estando limitada a aplicações apenas dentro da dita implantação.
[0038] Os cabeçalhos usados no presente documento são para propósitos de organização apenas e não são destinados a serem usados para limitar o escopo da descrição ou das reivindicações. Para facilitar o entendimento, numerais de referência similares foram usados, onde possível, para designar elementos similares comuns para as figuras. Ademais, quando possível, numeração similar dos elementos foi usada em várias figuras. Ademais, configurações alternativas de um elemento particular pode, cada um, incluir letras separadas anexas ao numeral de elemento.
[0039] O termo "cerca" é usado no presente documento para significar aproximadamente, na região de, aproximadamente, ou cerca de. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunção com uma faixa numérica, o mesmo modifica essa faixa pela qual se estendem os limiares acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. No geral, o termo "cerca" é usado no presente documento para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor estabelecido por uma variância de 5%. Quando tal faixa é expressada, outra modalidade inclui a partir de um valor particular e/ou a outro valor particular. De maneira similar, quando os valores são expressados como aproximações, pelo uso de "cerca" antecedendo, será entendido que o valor particular forma outra modalidade. Será adicionalmente entendido que os pontos de extremidade de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto de extremidade, e independentemente do outro ponto de extremidade.
[0040] A palavra "ou" conforme usado no presente documento para significar qualquer um membro de uma lista particular e também inclui qualquer combinação de membros dessa lista.
[0041] Por "amostra" entende-se um animal; uma tecido ou órgão de um animal; uma célula (ou dentro um indivíduo, tomada diretamente de um indivíduo, ou uma célula mantida em cultura ou de uma linha de célula cultivada); um lisado de célula (ou fração de lisado) ou extrato de célula; uma solução contendo uma ou mais moléculas derivadas de uma célula, material celular, ou material viral (por exemplo um polipeptídeo ou ácido nucleico); ou uma solução contendo um ácido nucleico de ocorrência não natural, que é analisado conforme descrito no presente documento. Uma amostra também pode ser qualquer fluido corporal ou excreção (por exemplo, mas não limitado a, sangue, urina, fezes, saliva, lágrimas, bílis, ou fluido cerebrospinal) que pode ou não pode conter células de hospedeiro ou de patógeno, componentes de célula, ou ácidos nucleicos.
[0042] A frase "ácido nucleico" conforme usada no presente documento se refere a um de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo de ocorrência natural ou sintético, ou DNA ou RNA ou híbrido de DNA- RNA, com filamento único ou com filamento duplo, sentido ou antissentido, que tem capacidade para se hibridizar a um ácido nucleico complementar por Pareamento de base de Watson-Crick. Ácidos nucleicos da presente invenção também podem incluir análogos de nucleotídeo (por exemplo, BrdU), e ligações de internucleosídeo diferentes de fosfodiéster (por exemplo, ácido nucleico de peptídeo (PNA) ou ligações de tiodiéster). Em particular, ácidos nucleicos podem incluir, sem limitação, DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA ou qualquer combinação dos mesmos
[0043] Por "sonda", "iniciador", ou "oligonucleotídeo" entende-se uma molécula de ácido nucleico com filamento único da sequência definida que pode ser par de base com uma segunda molécula de ácido nucleico que contém uma sequência complementar (o "alvo"). A estabilidade do híbrido resultante depende do comprimento, teor de GC, e a extensão do pareamento de base que ocorre. A extensão do pareamento de base é afetada por parâmetros tais como o grau de complementariedade entre a sonda e as moléculas-alvo e o grau de estringência das condições de hibridização. O grau de estringência de hibridização é afetado pelos parâmetros tais como temperatura, concentração de sal, e a concentração de moléculas orgânicas tal como formamida, e é determinado por métodos conhecidos por um indivíduo versado na técnica. Sondas, iniciadores, e oligonucleotídeos podem ser identificados de forma detectável, ou radioativamente, fluorescentemente, ou não radioativamente, por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica. Corantes de ligação de dsDNA podem ser usados para detectar dsDNA. É entendido que um "iniciador" é especificamente configurado para ser estendido por uma polimerase, em que uma "sonda" ou um "oligonucleotídeo" podem ou não podem ser assim configurados.
[0044] Por "corantes de ligação de dsDNA" entende-se que corantes que fluorescem de maneira diferente quando ligados ao DNA com filamento duplo do que quando ligados ao DNA com filamento único ou livre na solução, frequentemente mediante a fluorescência de modo mais forte. Embora faça-se referência aos corantes de ligação de dsDNA, é entendido que qualquer corante adequado pode ser usado no presente documento, com alguns corantes não limitantes ilustrativos descritos na patente U.S. no 7.387.887, no presente documento incorporada a título de referência. Outras substâncias produtoras de sinal podem ser usadas para detectar a amplificação e a fusão de ácido nucleico, ilustrativamente enzimas, anticorpos, etc., como são conhecidos na técnica.
[0045] Por "hibridiza especificamente" entende-se que uma sonda, iniciador, ou oligonucleotídeo reconhece e interage fisicamente (isto é, pares de base) com um ácido nucleico substancialmente complementar (por exemplo, um ácido nucleico de amostra) sob condições de estringência elevadas, e não substancialmente par de base com outros ácidos nucleicos.
[0046] Por "condições de estringência elevadas" entende-se tipicamente que ocorrem a cerca da temperatura de fusão (Tm) menos 5 °C (isto é 5° abaixo da Tm da sonda). Funcionalmente, as condições de estringência elevadas são usadas para identificar sequências de ácido nucleico que têm pelo menos 80% de identidade de sequência.
[0047] Enquanto PCR é o método de amplificação usado nos exemplos no presente documento, é entendido que qualquer método de amplificação que usa um iniciador pode ser adequado. Tais procedimentos adequados incluem reação em cadeia de polimerase (PCR); amplificação de deslocamento de filamento (SDA); amplificação com base em sequência de ácido nucleico (NASBA); amplificação de círculo rotatório em cascata (CRCA), amplificação isotérmica mediada por laço de DNA (LAMP); amplificação iniciada por iniciador quimérico e isotérmico de ácidos nucleicos (ICAN); amplificação dependente de helicase com base em alvo (HDA); amplificação mediada por transcrição (TMA), e similares. Portanto, quando o termo PCR é usado, o mesmo deveria ser entendido como incluindo outros métodos de amplificação alternativos. Para os métodos de amplificação sem ciclos distintos, o tempo de reação pode ser usado onde as medições são fabricadas em ciclos ou Cp, e tempo de reação adicional pode ser adicionado onde os ciclos de PCR adicionais são adicionados nas modalidades descritas no presente documento. É entendido que os protocolos podem ser necessários para serem ajustados consequentemente.
[0048] Embora vários exemplos no presente documento façam referência a patógenos humanos-alvo e humanos, esses exemplos são ilustrativos apenas. Métodos, kits, e dispositivos descritos no presente documento podem ser usados para detectar e sequenciar uma ampla variedade de sequências de ácido nucleico de uma ampla variedade de amostras, incluindo, humanas, veterinárias, industriais e ambientais.
[0049] Várias modalidades reveladas no presente documento usam uma bolsa de análise de ácido nucleico independente para avaliar uma amostra quanto à presença de várias substâncias biológicas, ilustrativamente antígenos e sequências de ácido nucleico, ilustrativamente em um único sistema fechado. Tais sistemas, incluindo bolsas e instrumentos para o uso com as bolsas, são revelados em mais detalhes nas patentes nos U.S. 8.394.608; e 8.895.295; e no pedido de patente no U.S. 2014-0283945, no presente documento incorporados a título de referência. No entanto, é entendido que tais bolsas são ilustrativas apenas, e a preparação de ácido nucleico e as reações de amplificação discutidas no presente documento podem ser executadas em qualquer um dentre inúmeros vasos de amostra de sistema aberto ou fechado como são conhecidos na técnica, incluindo placas com 96 cavidades, placas com outras configurações, arranjos, carrosséis, e similares, através do uso de inúmeros sistemas de purificação e amplificação de ácido nucleico, as são conhecidos na técnica. Embora os termos "cavidade de amostra", "cavidade de amplificação", "recipiente de amplificação", ou similares sejam usados no presente documento, esses termos são destinados a abranger cavidades, tubos, e vários outros recipientes de reação, como são usados nesses sistemas de amplificação. Em uma modalidade, a bolsa é usada para avaliar quanto a patógenos múltiplos. A bolsa pode incluir um ou mais blísteres usados como cavidades de amostra, ilustrativamente em um sistema fechado. Ilustrativamente, várias etapas podem ser executadas na bolsa opcionalmente descartável, incluindo a preparação de ácido nucleico, PCR multiplex de grande volume primária, diluição de produto de amplificação primário, e PCR secundária, culminando em detecção opcional em tempo real ou análise após a amplificação tal como análise de curva de fusão. Ademais, é entendido que embora as várias etapas possam ser executadas nas bolsas da presente invenção, uma ou mais dentre as etapas podem ser omitidas para certos usos, e a configuração de bolsa pode ser alterada consequentemente.
[0050] A Figura 1 mostra uma bolsa ilustrativa 510 que pode ser usada em várias modalidades, ou pode ser reconfigurada para várias modalidades. A bolsa 510 é similar à Figura 15 da patente no U.S. 8.895.295, com itens similares numerados do mesmo modo. O adaptador 590 é fornecido com canais de entrada 515a a 515i, que também funciona como reservatórios de reagente ou reservatórios de refugos. Ilustrativamente, os reagentes podem ser congelados a seco no adaptador 590 e reidratados antes do uso. Os blísteres 522, 544, 546, 548, 564, e 566, com seus respectivos canais 514, 538, 543, 552, 553, 562, e 565 são similares aos blísteres do mesmo numeral da Figura 15 da patente no U.S. 8.895.295. A zona de reação de segundo estágio 580 da Figura 1 é similar àquela do pedido de patente no U.S. 8.895.295, mas as cavidades de segundo estágio 582 de arranjo de alta densidade 581 são dispostos em um padrão um pouco diferente. O padrão mais circular do arranjo de alta densidade 581 da Figura 1 elimina as cavidades nos cantos e pode resultar em um preenchimento mais uniforme das cavidades de segundo estágio 582. Conforme mostrado, o arranjo de alta densidade 581 é fornecido com 102 cavidades de segundo estágio 582. A bolsa 510 é adequada para o uso no instrumento FilmArray® (BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, UT). No entanto, é entendido que a bolsa modalidade é ilustrativa apenas.
[0051] Embora outros recipientes possam ser usados, ilustrativamente, a bolsa 510 é formada por duas camadas de um filme plástico flexível ou outro material flexível tais como poliéster, polietileno tereftalato (PET), policarbonato, polipropileno, polimetilmetacrilato, e misturas dos mesmos que podem ser fabricados por qualquer processo conhecido na técnica, incluindo extrusão, deposição de plasma, e laminação. Folhas metálicas ou plásticos com laminação de alumínio também podem ser usados. Outros materiais de barreira são conhecidos na técnica, os quais podem ser vedados entre si para formar os blísteres e os canais. Se filme plástico for usado, as camadas podem ser ligadas entre si, ilustrativamente através de vedação por calor. Ilustrativamente, o material tem baixa capacidade de ligação de ácido nucleico.
[0052] Para as modalidades que empregam monitoramento fluorescente, filme plásticos que são adequadamente baixos em absorbância e autofluorescência nos comprimentos de onda operativos são preferenciais. Tal material poderia ser identificado mediante testagem de plásticos diferentes, diferentes plastificantes, e razões de compósito, das cavidades como diferentes espessuras do filme. Para plásticos com alumínio ou outra laminação de folha, a porção da bolsa deve ser lida por um dispositivo de detecção de fluorescência pode ser deixada sem a folha. Por exemplo, se a fluorescência for monitorada nas cavidades de segundo estágio 582 da zona de reação de segundo estágio 580 da bolsa 510, então, uma ou ambas as camadas nas cavidades 582 seriam deixadas sem a folha. No exemplo de PCR, laminados de filme compostos de poliéster (Mylar, Dupont, Wilmington DE) de cerca de 0,1219 mm (0,0048 polegada) de espessura e filmes de polipropileno de 0,025 a 0,076 mm (0,001 a 0,003 polegada) de espessura realizam a cavidade. Ilustrativamente, a bolsa 510 é fabricada a partir de um material claro com capacidade para transmitir aproximadamente de 80% a 90% de luz incidente.
[0053] Na modalidade ilustrativa, os materiais são movidos entre os blísteres pela aplicação de pressão, ilustrativamente pressão pneumática, sobre os blísteres e canais. Consequentemente, nas modalidades que empregam pressão, o material de bolsa ilustrativamente é flexível o suficiente para permitir que a pressão tenha o efeito desejado. O termo "flexível" é usado no presente documento para descrever uma característica física do material de bolsa. O termo "flexível" é definido no presente documento definido como prontamente deformável pelos níveis de pressão usados no presente documento sem rachar, quebrar, fissurar ou similares. Por exemplo, folhas finas de plástico, tais como envoltório Saran™ e bolsas Ziploc®, assim como folha fina de metal, tal como folha de alumínio, são flexíveis. No entanto, apenas certas regiões dos blísteres e canais precisam ser flexíveis, até nas modalidades que empregam pressão pneumática. Ademais, apenas um lado dos blísteres e canais precisa ser flexível, enquanto os blísteres e canais são prontamente deformáveis. Outras regiões da bolsa 510 podem ser fabricadas a partir de um material rígido ou podem ser reforçadas com um material rígido.
[0054] Ilustrativamente, um filme plástico é usado para a bolsa 510. Uma folha de metal, ilustrativamente alumínio, ou outro material adequado, pode ser moído ou de outro modo cortado, para criar um molde que tem um padrão de superfícies elevadas. Quando ajustado em uma prensa pneumática (ilustrativamente A-5302-PDS, Janesville Tools Inc., Milton WI), ilustrativamente regulada em uma temperatura operacional de 195 °C, a prensa pneumática funciona como uma prensa de impressão, que funde as superfícies de vedação do filme plástico apenas aonde o molde entra em contato como o filme. Vários componentes, tais como iniciadores de PCR (ilustrativamente manchado no filme e seco), substratos de ligação de antígeno, esferas magnéticas, e esferas de silicato de zircônio podem ser vedados dentro de vários blísteres conforme a bolsa 510 é formada. Reagentes para o processamento de amostra podem ser manchados no filme antes da vedação, ou coletiva ou separadamente. Em uma modalidade, os trifosfatos de nucleotídeo (NTPs) são manchados no filme separadamente da polimerase e dos iniciadores, eliminando essencialmente a atividade da polimerase até que a reação esteja hidratada por uma amostra aquosa. Se a amostra aquosa tiver sido aquecida antes da hidratação, isso cria as condições para uma verdadeira PCR hot-start e reduz ou elimina a necessidade de componentes químicos dispendiosos para hot-start.
[0055] A bolsa 510 pode ser usada de uma maneira similar àquela descrita na patente no U.S. 8.895.295. Em uma modalidade ilustrativa, uma amostra que compreende uma mistura de 300 μl a ser testada (100 μl) e tampão de lise (200 μl) é injetada em uma porta de injeção (não mostrada) no adaptador 590 próximo ao canal de entrada 515a, e a mistura de amostra é extraída para o canal de entrada 515a. Água também é injetada em uma segunda porta de injeção (não mostrada) do adaptador 590 adjacente ao canal de entrada 515i, e é distribuída através de um canal (não mostrado) fornecido no adaptador 590 e, através disso hidrata até onze reagentes diferentes, cada um dos quais foi previamente fornecido em forma seca nos canais de entrada 515b a 515i a d. Esses reagentes ilustrativamente podem incluir reagentes de PCR congelados a seco, reagentes de extração de DNA, soluções de lavagem, reagentes de imunoensaio, ou outras entidades químicas. Ilustrativamente, os reagentes são para a extração de ácido nucleico, PCR multiplex de primeiro estágio, diluição da reação de multiplex, e preparação dos reagentes de PCR de segundo estágio, assim como reações de controle. Na modalidade mostrada na Figura 1, tudo que precisa ser injetado é a solução de amostra em uma porta de injeção e água na outra porta de injeção. Após a injeção, as duas portas de injeção podem ser vedadas. Para mais informações sobre as várias configurações de bolsa 510 e de adaptador 590, consulte a patente no U.S. 8.895.295, já incorporada a título de referência.
[0056] Após a injeção, a amostra é movida a partir do canal de injeção 515a para o blíster de lise 522 através do canal 514. O blíster de lise 522 é fornecido com esferas ou partículas 534, tal como esferas de cerâmica, e é configurado para submeter a vórtice através de impacto através do uso de lâminas ou pás giratórias fornecidas dentro do instrumento FilmArray®. Moagem por esfera, mediante agitação ou submeter a vórtice a amostra na presença de partículas de lise tal como esferas de silicato de zircônio (ZS) 534, é um método eficaz para formar um lisado. É entendido que, conforme usado no presente documento, termos tais como "lise", "lisar", e "lisado" não são limitados às células em ruptura, mas que tais termos incluem a interrupção de partículas não celulares, tal como vírus.
[0057] A Figura 4 mostra um motor de agitação com esferas 819, que compreende lâminas 821 que podem ser montadas em um primeiro lado 811 do membro de apoio 802, do instrumento 800 mostrado na Figura 2. As lâminas podem se estender através de uma fenda 804 para entrar em contato com a bolsa 510. É entendido, no entanto, que o motor 819 pode ser montado nas outras estruturas do instrumento 800. Em uma modalidade ilustrativa, o motor 819 é um motor Mabuchi RC- 280SA-2865 DC (Chiba, Japão), montado no membro de apoio 802. Em uma modalidade ilustrativa, o motor é ativado em 5.000 a 25.000 rpm, mais ilustrativamente de 10.000 a 20.000 rpm, e ainda mais ilustrativamente de aproximadamente 15.000 a 18.000 rpm. Para o motor Mabuchi, foi constatado que 7.2V fornece rpm suficiente para a lise. É entendido, no entanto, que a velocidade real pode ser um pouco mais lenta quando as lâminas 821 estão impactando a bolsa 510. Outras tensões e velocidades podem ser usadas para a lise dependendo do motor e das pás usados. Opcionalmente, pequenos volumes controlados de ar podem ser fornecidos na bexiga 822 adjacente ao blíster de lise 522. Foi constatado que em algumas modalidades, preencher parcialmente a bexiga adjacente com um ou mais pequenos volumes de ar auxilia o posicionamento e o apoio do blíster de lise durante o processo de lise. Alternativamente, outra estrutura, ilustrativamente uma junta de vedação rígida ou maleável ou outra estrutura de retenção ao redor do blíster de lise 522, pode ser usada para restringir a bolsa 510 durante a lise. É também entendido que o motor 819 é ilustrativo apenas, e outros dispositivos podem ser usados para moer, agitar, ou submeter a vórtice a amostra.
[0058] Assim que as células tiverem sido adequadamente lisado, a amostra é movida através do canal 538, do blíster 544, e do canal 543, para o blíster 546, em que a amostra é misturada com uma substância de ligação de ácido nucleico, tal como esferas magnéticas revestidas com sílica 533. A mistura é deixada incubando por um período de tempo apropriado, ilustrativamente aproximadamente 10 segundos a 10 minutos. Um ímã retrátil localizado dentro do blíster adjacente ao instrumento 546 captura as esferas magnéticas 533 da solução, formando um pélete contra a superfície interior do blíster 546. O líquido é, então, movido para fora do blíster 546 e de volta através do blíster 544 e para dentro do blíster 522, que é agora usado como um receptáculo de refugo. Um ou mais tampões de lavagem de um ou mais dentre os canais de injeção 515c a 515e são fornecidos através do blíster 544 e do canal 543 para o blíster 546. Opcionalmente, o ímã é retraído e as esferas magnéticas 533 são lavadas mediante a movimentação das esferas para frente e para trás a partir dos blísteres 544 e 546 através do canal 543. Assim que as esferas magnéticas 533 são lavadas, as esferas magnéticas 533 são recapturadas no blíster 546 mediante a ativação do ímã, e a solução de lavagem é, então, movida para o blíster 522. Esse processo pode ser repetido conforme necessário para lavar o tampão de lise e detritos de amostra das esferas magnéticas de ligação de ácido nucleico 533, ilustrativamente incluindo 3 ou mais lavagens, embora uma lavagem pode ser suficiente para algumas modalidades reveladas no presente documento e inúmeras lavagens estão dentro do escopo desta descrição.
[0059] Após lavar, tampão de eluição armazenado no canal de injeção 515f é movido para o blíster 548, e o ímã é retraído. A solução é ciclada entre os blísteres 546 e 548 através do canal 552, quebrando o pélete de esferas magnéticas 533 no blíster 546 e permitindo que os ácidos nucleicos capturados se desassociem das esferas e entrem na solução. O ímã é, assim, novamente ativado, capturando as esferas magnéticas 533 no blíster 546, e a solução de ácido nucleico eluída é movida para dentro do blíster 548.
[0060] PCR master mix de primeiro estágio do canal de injeção 515g é misturada com a amostra de ácido nucleico no blíster 548. Opcionalmente, a mistura é misturada forçando a mistura entre 548 e 564 através do canal 553. Após diversos ciclos de misturação, a solução está contida no blíster 564, em que um pélete de iniciadores de PCR de primeiro estágio é fornecido, pelo menos um conjunto de iniciadores para cada alvo, e a PCR multiplex de primeiro estágio é executada. Se alvos de RNA estiverem presentes, uma etapa de RT pode ser executada antes ou simultaneamente com a PCR multiplex de primeiro estágio. A temperatura de PCR multiplex de primeiro estágio ciclando no instrumento FilmArray® é ilustrativamente executada por 15 a 20 ciclos, embora outros níveis de amplificação possam ser desejáveis, dependendo das exigências da aplicação específica. A PCR master mix de primeiro estágio pode ser qualquer uma de vários master mixes, como são conhecidos na técnica. Em um exemplo ilustrativo, a PCR master mix de primeiro estágio pode ser qualquer um dos produtos químicos revelados no documento US2015/0118715, incorporado no presente documento a título de referência, para o uso com protocolos de PCR que levam 20 segundos ou menos por ciclo.
[0061] Após a PCR de primeiro estágio ter avançado pelo número desejado de ciclos, a amostra pode ser diluída, ilustrativamente forçando-se a maioria da amostra de volta para dentro do blíster 548, deixando apenas uma quantidade pequena no blíster 564, e adicionando-se PCR master mix de segundo estágio do canal de injeção 515i. Alternativamente, um tampão de diluição de 515i pode ser movido para o blíster 566 e, então, misturado com a amostra amplificada no blíster 564 mediante a movimentação dos fluidos para frente e para trás entre os blísteres 564 e 566. Se desejado, a diluição pode ser repetida diversas vezes, através do uso de tampão de diluição dos canais de injeção 515j e 515k, ou canal de injeção 515k pode ser reservado para sequenciar ou para outra análise após a PCR e, então, adicionar PCR master mix de segundo estágio do canal de injeção 515h em uma parte ou toda a amostra amplificada diluída. É entendido que o nível de diluição pode ser ajustado mediante a alteração do número de etapas de diluição ou mediante a alteração da percentagem da amostra descartada antes da mistura com o tampão de diluição ou PCR master mix de segundo estágio que compreende componentes para a amplificação, ilustrativamente uma polimerase, dNTPs, e um tampão adequado, embora outros componentes possam ser adequados, particularmente para métodos de amplificação diferentes de PCR. Se desejado, essa mistura da amostra e PCR master mix de segundo estágio podem ser pré-aquecidas no blíster 564 antes do movimento para as cavidades de segundo estágio 582 para amplificação de segundo estágio. Tal pré-aquecimento pode tornar óbvia a necessidade de um componente de hot-start (anticorpo, químico, ou de outro modo) na mistura de PCR de segundo estágio.
[0062] A PCR master mix ilustrativa de segundo estágio é incompleta, carecendo pares de iniciadores, e cada uma das 102 cavidades de segundo estágio 582 é pré-carregada com um par de iniciadores de PCR específico. Se desejado, PCR master mix de segundo estágio pode carecer de outros componentes de reação, e esses componentes podem ser pré-carregados nas cavidades de segundo estágio 582 nas cavidades. Cada par de iniciadores pode ser similar a ou idêntico a um par de iniciadores de PCR de primeiro estágio ou pode ser disposto dentro do par de iniciadores de primeiro estágio. O movimento da amostra do blíster 564 para as cavidades de segundo estágio 582 completa a mistura de reação de PCR. Assim que o arranjo de alta densidade 581 é preenchido, as reações de segundo estágio individuais são vedadas em seus respectivos blísteres de segundo estágio por inúmeros meios, como é conhecido na técnica. Maneiras ilustrativas de preencher e vedar o arranjo de alta densidade 581 sem contaminação cruzada são discutidas na patente no U.S. 8.895.295, já incorporada a título de referência. Ilustrativamente, as várias reações nas cavidades 582 do arranjo de alta densidade 581 são simultaneamente termicamente ciclados, ilustrativamente com um ou mais dispositivos de efeito peltier, embora outros meios para ciclagem térmica são conhecidos na técnica.
[0063] Em certas modalidades, PCR master mix de segundo estágio contém o corante de ligação de dsDNA LCGreen® Plus (BioFire Diagnostics, LLC) para gerar um sinal indicativo de amplificação. No entanto, é entendido que esse corante é ilustrativo apenas, e que outros sinais podem ser usados, incluindo outros corantes de ligação de dsDNA e sondas que são identificadas fluorescentemente, radioativamente, quimioluminescentemente, enzimaticamente, ou similares, conforme são conhecidos na técnica. Alternativamente, as cavidades 582 do arranjo 581 podem ser fornecidas sem um sinal, com resultados relatados através de processamento subsequente.
[0064] Quando a pressão pneumática é usada para mover materiais dentro da bolsa 510, em uma modalidade uma "bexiga" pode ser empregada. O conjunto de bexiga 810 que tem uma porção mostrada nas Figuras 2 a 3, inclui uma placa de bexiga 824 que aloja uma pluralidade de bexigas infláveis 822, 844, 846, 848, 864, e 866, sendo que cada uma das quais pode ser individualmente inflável, ilustrativamente por uma fonte de gás comprimido. Visto que o conjunto de bexiga 810 pode ser submetido ao gás comprimido e usado múltiplas vezes, o conjunto de bexiga 810 pode ser fabricado a partir de material mais forte ou mais espesso do que a bolsa. Alternativamente, as bexigas 822, 844, 846, 848, 864, e 866 podem ser formadas a partir de uma série de placas presas entre si com juntas, vedações, válvulas e pistões. Outras disposições estão dentro do escopo da presente invenção.
[0065] O sucesso das reações de PCR secundárias é dependente do modelo gerado pela reação de primeiro estágio de multiplex. Tipicamente, PCR é executada através do uso de DNA com alta pureza. Métodos tais como extração de fenol ou kits de extração de DNA comerciais fornecem DNA com alta pureza. Amostras processadas através da bolsa 510 podem exigir que acomodações sejam fabricadas para compensar uma preparação menos pura. PCR pode ser inibida por componentes de amostras biológicas, o que é um potencial obstáculo. Ilustrativamente, PCR hot-start, concentração mais alta de enzima taq polimerase, ajustes na concentração de MgCl2, ajustes na concentração de iniciador, e adição de adjuvantes (tais como DMSO, TMSO ou glicerol) opcionalmente podem ser usados para compensar pela pureza inferior de ácido nucleico. Enquanto questões de pureza são provavelmente uma preocupação com amplificação de primeiro estágio, é entendido que ajustes similares podem ser fornecidos na amplificação de segundo estágio também.
[0066] Quando a bolsa 510 é disposta dentro do instrumento 800, o conjunto de bexiga 810 é pressionado contra uma face da bolsa 510, de modo que se uma bexiga particular for inflada, a pressão irá forçar o líquido para fora do blíster correspondente na bolsa 510. Adicionalmente às bexigas correspondentes a muitos dos blísteres da bolsa 510, o conjunto de bexiga 810 pode ter atuadores pneumáticos adicionais, tais como bexigas ou pistões acionados pneumaticamente, correspondentes a vários canais da bolsa 510. As Figuras 2 a 3 mostram uma pluralidade ilustrativa de pistões ou vedações rígidas 838, 843, 852, 853, e 865 que correspondem aos canais 538, 543, 553, e 565 da bolsa 510, assim como vedações 871, 872, 873, 874 que minimizam o fluxo de retorno no adaptador 590. Quando ativadas, as vedações rígidas 838, 843, 852, 853, e 865 formam válvulas de compressão para comprimir e fechar os canais correspondentes. Para confinar o líquido dentro de um blíster particular da bolsa 510, as vedações rígidas são ativadas sobre os canais levando para e a partir do blíster, de modo que os atuadores funcionem como válvulas de compressão para comprimir os canais e fechar os mesmos. Ilustrativamente, para misturar dois volumes de líquido em blísteres diferentes, a atuador de válvula de compressão que veda o canal de conexão é ativado, e as bexigas pneumáticas sobre os blísteres são alternativamente pressurizadas, forçando o líquido para frente e para trás através do canal que conecta os blísteres para misturar o líquido nos mesmos. Os atuadores de válvula de compressão podem ter vários formatos e tamanhos e podem ser configurados para comprimir mais do que um canal ao mesmo tempo. Embora os atuadores pneumáticos sejam discutidos no presente documento, é entendido que outras maneiras de fornecer pressão para a bolsa são contempladas, incluindo vários atuadores eletromecânicos, tais como motores escalonados lineares, cames acionados por motor, pás rígidas acionadas pneumaticamente, forças hidráulicas ou eletromagnéticas, cilindros, braços oscilantes e, em alguns casos, molas engatilhadas. Adicionalmente, há inúmeros métodos de fechar de forma reversível ou irreversível os canais adicionalmente à aplicação de pressão normal ao eixo geométrico do canal. Esses incluem torcer a bolsa através do canal, vedação por calor, rolagem em um atuador, e inúmeras válvulas físicas vedadas no canal tais como válvulas borboleta e válvulas de esfera. Adicionalmente, dispositivos pequenos de efeito peltier ou outros reguladores de temperatura podem ser dispostos de modo adjacente aos canais e ajustados em uma temperatura suficiente para congelar o fluido, formando eficazmente uma vedação. Também, enquanto o projeto da Figura 1 é adaptado para um instrumento automatizado que conta com elementos de atuador posicionados sobre cada um dos blísteres e canais, também é contemplado que os atuadores poderiam permanecer imóveis, e a bolsa 510 poderia ser transicionada em uma ou mais dimensões de modo que um pequeno número de atuadores poderia ser usado para diversas estações de processamento incluindo interrupção de amostra, captura de ácido nucleico, PCRs de primeiro e segundo estágios, e outras aplicações da bolsa 510 tais como imunoensaio e imuno-PCR. Cilindros que agem nos canais e blísteres poderiam se provar particularmente úteis em uma configuração em que a bolsa 510 é transladada entre as estações. Assim, enquanto os atuadores pneumáticos são usados nas modalidades presentemente reveladas, quando o termo "atuador pneumático" é usado no presente documento, é entendido que outros atuadores e outras maneiras de fornecer pressão podem ser usados, dependendo da configuração da bolsa e do instrumento.
[0067] Outros instrumentos da técnica anterior ensinam PCR dentro de um recipiente flexível vedado. Consulte, por exemplo, as patentes nos U.S. 6.645.758 e 6.780.617, e o pedido de patente no U.S. 2014/0038272, incorporados no presente documento a título de referência. No entanto, incluindo a lise de célula dentro do vaso de PCR vedado pode aprimorar a facilidade e segurança de uso, particularmente se a amostra a ser testada contiver um risco biológico. Nas modalidades ilustradas no presente documento, o refugo de lise de célula, assim como o de todas as outras etapas, permanece dentro da bolsa vedada. No entanto, é entendido que os conteúdos da bolsa poderiam ser removidos para testes adicionais.
[0068] A Figura 2 mostra um instrumento ilustrativo 800 que poderia ser usado com a bolsa 510. O instrumento 800 inclui um membro de apoio 802 que poderia formar uma parede de um invólucro ou ser montado dentro de um invólucro. O instrumento 800 pode também incluir um segundo membro de apoio (não mostrado) isto é opcionalmente móvel em relação ao membro de apoio 802, para permitir a inserção e extração da bolsa 510. Ilustrativamente, uma tampa pode cobrir a bolsa 510 assim que bolsa 510 tiver sido inserida no instrumento 800. Em outra modalidade, ambos os membros de apoio podem ser fixados, com a bolsa 510 mantida em seu lugar por outros meios mecânicos ou por pressão pneumática.
[0069] No exemplo ilustrativo, os aquecedores 886 e 888 são montados no membro de apoio 802. No entanto, é entendido que essa disposição é ilustrativa apenas e que outras disposições são possíveis. Placa de bexiga 810, com bexigas 822, 844, 846, 848, 864, 866, vedações rígidas 838, 843, 852, 853, vedações 871, 872, 873, 874 formam o conjunto de bexiga 808 que pode ilustrativamente ser montado em uma estrutura de apoio móvel que pode ser movida em direção à bolsa 510, de modo que os atuadores pneumáticos são dispostos em contato com a bolsa 510. Quando a bolsa 510 é inserida no instrumento 800 e o membro móvel de apoio é movido em direção ao membro de apoio 802, os vários blísteres da bolsa 510 estão em uma posição adjacente às várias bexigas do conjunto de bexiga 810 e as várias vedações do conjunto 808, de modo que a ativação dos atuadores pneumáticos pode forçar o líquido de um ou mais dos blísteres da bolsa 510 ou pode formar válvulas de compressão com um ou mais canais da bolsa 510. A relação entre os blísteres e canais da bolsa 510 e as bexigas e vedações do conjunto 808 é ilustrada em mais detalhes na Figura 3.
[0070] Cada atuador pneumático é conectado à fonte de ar comprimido 895 através das válvulas 899. Embora apenas diversas mangueiras 878 são mostradas na Figura 2, é entendido que cada encaixe pneumático é conectado através de uma mangueira 878 à fonte de gás comprimido 895. A fonte de gás comprimido 895 pode ser um compressor, ou, alternativamente, fonte de gás comprimido 895 pode ser um cilindro de gás comprimido, tal como um cilindro de dióxido de carbono. Cilindros de gás comprimido são particularmente úteis se portabilidade for desejada. Outras fontes de gás comprimido estão dentro do escopo da presente invenção.
[0071] O conjunto 808 é ilustrativamente montado em um membro de móvel de apoio, embora seja entendido que outras configurações são possíveis.
[0072] Diversos outros componentes do instrumento 810 são também conectados à fonte de gás comprimido 895. Um ímã 850, que é montado em um segundo lado 814 do membro de apoio 802, é ilustrativamente instalado e retraído através do uso de gás da fonte de gás comprimido 895 através da mangueira 878, embora outros métodos de mover o ímã 850 sejam conhecidos na técnica. O ímã 850 tem a sua sede no recesso 851 no membro de apoio 802. É entendido que o recesso 851 pode ser uma passagem através do membro de apoio 802, de modo que o ímã 850 pode entrar em contato com o blíster 546 da bolsa 510. No entanto, dependendo do material do membro de apoio 802, é entendido que o recesso 851 não precisa se estender através de todo o membro de apoio 802, enquanto o ímã 850 é instalado, o ímã 850 é próximo o suficiente para fornecer um campo magnético suficiente no blíster 546, e quando o ímã 850 é retraído, o ímã 850 não significativamente afeta quaisquer esferas magnéticas 533 presentes no blíster 546. Embora faça-se referência ao ímã em retração 850, é entendido que um eletroímã pode ser usado e o eletroímã pode ser ativado e desativado mediante o controle do fluxo de eletricidade através do eletroímã. Assim, embora este relatório descritivo discuta a extração ou retração do ímã, é entendido que esses termos são amplos o suficiente para incorporar outras maneiras de extração do campo magnético. É entendido que as conexões pneumáticas podem ser mangueiras pneumáticas ou tubagens de ar pneumático, reduzindo assim o número de mangueiras ou válvulas exigidas.
[0073] Os vários pistões pneumáticos 868 de arranjo de pistão pneumático 869 são também conectados à fonte de gás comprimido 895 através das mangueiras 878. Enquanto apenas duas mangueiras 878 são mostradas, que conectam pistões pneumáticos 868 à fonte de gás comprimido 895, é entendido que cada um dos pistões pneumáticos 868 são conectados à fonte de gás comprimido 895. Doze pistões pneumáticos 868 são mostrados.
[0074] Um par de dispositivos de aquecimento/resfriamento, ilustrativamente aquecedores Peltier, são montados em um segundo lado 814 de apoio 802. Aquecedor de primeiro estágio 886 é posicionado para esquentar e resfriar os conteúdos do blíster 564 para PCR de primeiro estágio. Aquecedor de segundo estágio 888 é posicionado para esquentar e resfriar os conteúdos dos blísteres de segundo estágio 582 da bolsa 510, para PCR de segundo estágio. É entendido, no entanto, que esses aquecedores poderiam ser também usados para outros propósitos de aquecimento, e que outros aquecedores podem ser incluídos, conforme apropriado para a aplicação particular.
[0075] Quando detecção fluorescente é desejada, um arranjo óptico 890 pode ser fornecido. Conforme mostrado na Figura 2, o arranjo óptico 890 inclui uma fonte de luz 898, ilustrativamente uma fonte de luz de LED filtrada, luz branca filtrada, ou iluminação laser, e uma câmera 896. A câmera 896 ilustrativamente tem uma pluralidade de fotodetectores, sem do que cada um correspondente a uma cavidade de segundo estágio 582 na bolsa 510. Alternativamente, a câmera 896 pode realizar imagens que contêm todas as cavidades de segundo estágio 582, e a imagem pode ser dividida em campos separados correspondentes a cada uma das cavidades de segundo estágio 582. Dependendo da configuração, o arranjo óptico 890 pode ser imóvel, ou o arranjo óptico 890 pode ser disposto em movedores fixados a um ou mais motores e movido para obter sinais de cada cavidade individual de segundo estágio 582. É entendido que outras disposições são possíveis.
[0076] Conforme mostrado, um computador 894 controla as válvulas 899 de fonte de ar comprimido 895 e, assim, controla todas as pneumáticas do instrumento 800. O computador 894 também controla os aquecedores 886 e 888, e o arranjo óptico 890. Cada um desses componentes é conectado eletricamente, ilustrativamente através de cabos 891, embora outras conexões físicas ou sem fio estejam dentro do escopo da presente invenção. É entendido que o computador 894 pode ser alojado dentro do instrumento 800 ou pode ser externo ao instrumento 800. Ademais, o computador 894 pode incluir placas de circuito integrado que controlam alguns ou todos os componentes, e pode incluir também um computador externo, tal como um PC do tipo desktop ou do tipo laptop, para receber e exibir dados do arranjo óptico. Uma interface, ilustrativamente uma interface de teclado, pode ser fornecida incluindo teclas para inserir informações e variáveis tais como temperaturas, tempos de ciclo, etc. Ilustrativamente, uma tela 892 também é fornecida. A tela 892 pode ser uma tela de LED, LCD, ou outro tipo de tela, por exemplo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: PCR DE ALTA DENSIDADE
[0077] Em um exemplo, é conhecido que ensaios de imunofluorescência padrão comerciais para o vírus respiratório comum pode detectar sete vírus: adenovírus, PIV1, PIV2, PIV3, RSV, Influenza A, e Influenza B. Um painel mais completo ilustrativamente incluiria ensaios para outros vírus incluindo: coronavírus, metapneumovírus humano, rinovírus, e enterovírus diferente de HRV. Para vírus altamente variáveis tais como Adenovírus ou HRV, é desejável usar múltiplos iniciadores para se direcionar a todas as ramificações da linhagem do vírus (ilustrativamente 4 iniciadores externos e 4 iniciadores internos, respectivamente). Para outros vírus tal como coronavírus, há 4 linhagens distintas (229E, NL63, OC43, HKU1) que não variam de uma estação para outra, mas já divergiram suficientemente que separar conjuntos de iniciadores é exigido. O painel respiratório FilmArray® (BioFire Diagnostics, LLC de Salt Lake City, UT) inclui Adenovírus, Coronavírus HKU1, Coronavírus NL63, Coronavírus 229E, Coronavírus OC43, Metapneumovírus humano, Rinovírus/Enterovírus humano, Influenza A, Influenza A/H1, Influenza A/H3, Influenza A/H1-2009, Influenza B, Parainfluenza Vírus 1, Parainfluenza Vírus 2, Parainfluenza Vírus 3, Parainfluenza Vírus 4, e Vírus Sincicial Respiratório. Adicionalmente a esses vírus, o painel respiratório FilmArray® inclui três bactérias: Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumonia, e Mycoplasma pneumonia. O arranjo de alta densidade 581 tem capacidade de acomodar tal painel em uma única bolsa 510. Outros painéis estão disponíveis para FilmArray®, sendo que cada um realiza ensaio em pelo menos 20 patógenos.
EXEMPLO 2: CARREGAMENTO DE BOLSA
[0078] A Figura 5 mostra uma estação de carregamento 600. Conforme mostrado, a bolsa 510 da Figura 1 foi carregada na fenda 610 da estação de carregamento 600, de modo que apenas o adaptador 590 da bolsa 510 é visível. Conforme mostrado, a estação de carregamento 600 é fornecida com um receptáculo de frasco de amostra 602 para ter frasco de amostra 650 e receptáculo de frasco de hidratação 604 para ter frasco de hidratação 670. No entanto, é entendido que os receptáculos e frascos são para auxiliar o fluxo de trabalho e são ilustrativos apenas. Outras configurações e usos com outras bolsas e outros dispositivos estão dentro do escopo desta descrição.
[0079] Uma amostra é pipetada ou de outro modo carregada no frasco de amostra 650. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, dependendo do fluxo de trabalho, frasco de amostra 650 pode já conter um tampão ou outro fluido 652 para receber a amostra biológica, ou o operador pode adicionar a amostra biológica em um tampão apropriado para o frasco de amostra 650. Opcionalmente, o tampão pode ser fornecido em uma ampola separada, com uma quantidade apropriada de tampão repartido. De maneira similar, o frasco de hidratação 670 pode ser pré-carregado com água, tampão, ou outro fluido 672, ou o operador pode carregar o frasco de hidratação 670 com tal fluido.
[0080] Adaptador ilustrativo 590 inclui uma porta de injeção 541 ilustrativamente formada próximo à segunda superfície 595 do adaptador 590. Conforme mostrado, a porta de injeção 541 é localizado na abertura de injeção de amostra 563, que é configurada para receber um vaso de transferência canulado através da primeira superfície 594 do adaptador 590, tal como uma seringa canulada. Nessa configuração ilustrativa, a porta de injeção 541 é protegida de punção acidental e não é aberta até que um vaso de transferência canulado seja disposto na abertura de injeção de amostra 563. De maneira similar, o adaptador ilustrativo 590 inclui uma segunda porta de injeção 588 ilustrativamente formada próxima à segunda superfície 595 do adaptador 590, e é localizada na abertura de injeção de fluido de hidratação 583, que é configurada de maneira similar à abertura de injeção de amostra 563. Conforme configurado nessa modalidade ilustrativa, porta de injeção 541 é para receber a amostra a ser testada, cuja amostra será movida para a câmara 592a ou diretamente para dentro do blíster de lise 522 (Figura 1), e a segunda porta de injeção 588 é configurada para receber o fluido de hidratação 672 (exibida na Figura 7), tais como água ou tampão, em que o fluido de hidratação 672 será movido para as câmaras 592b a 592l, para movimento subsequente através dos canais de entrada 515b a 515I. É entendido que a disposição das portas de injeção 541 e 588 e aberturas 563 e 583 é ilustrativa e outras configurações estão dentro do escopo desta descrição.
[0081] O frasco ilustrativo de amostra 650, como melhor mostrado na Figura 6, é dotado de uma superfície de topo 662, um corpo de frasco 654, e uma cânula 655, em uma disposição similar a muitas seringas canuladas. Nessa modalidade ilustrativa, ao invés do êmbolo encontrado em muitas seringas canuladas, frasco de amostra 650 é fornecido com uma tampa 658 que se estende através da superfície de topo 662 para vedar o corpo 654. Ilustrativamente, o operador verteria, pipetaria, inseriria swab, espatularia o material sólido ou semissólido, ou, de outro modo, transferiria um fluido e/ou outros materiais através da abertura 657 na superfície de topo 662 e no corpo de frasco 654.
[0082] Dependendo do tipo de amostra a ser testada, o frasco de amostra 650 pode ser fornecido com um filtro 646, ilustrativamente localizado no ou próximo à superfície hexagonal de fundo 666 do corpo de frasco 654. Conforme mostrado, o filtro 646 é retido no lugar por um anel em O 644. No entanto, é entendido que o filtro 646 pode ser retido no lugar por adesivo, por soldagem, por ser ajustado por pressão no lugar, ou por outros meios, como são conhecidos na técnica. Quando a cânula 655 é inserida na abertura de injeção de amostra 563 e a amostra é extraída na bolsa 510, a material de amostra é filtrada conforme é puxada através do filtro 646 e para dentro da cânula 655. Embora a seleção de material de filtro depende do tipo de amostra e tamanho de partícula, filtros adequados para várias amostras biológicas incluem meio com sopro em fusão de polipropileno Ultipleat absoluto com Pall de 100 μm e filtro com rede de polipropileno de 80 μm Millipore. A maioria dos filtros de seringa são projetados para excluir organismos de um certo tamanho, removendo dessa maneira os organismos do filtrato. Diferente de tais filtros pré-existentes, esses filtros ilustrativos foram escolhidos com base em suas habilidades para excluir particulados grandes encontrados nas fezes, solo, pó, etc., enquanto permite organismos-alvo (por exemplo, organismos bacterianos, vírus, fúngicos de protozoários) de aproximadamente 60 μm em diâmetro ou menos passem através do filtro. Também, o material de filtro ilustrativo é inerte (isto é, não ligam o organismo ou ácido nucleico) e é relativamente resistente à entupimento. É entendido que esses filtros ilustrativos foram escolhidos para amostras e incluem protozoários como organismos-alvo (para cima a cerca de 60 μm). Visto que algumas configurações de bolsa podem testar apenas quanto a alvos menores, filtros com um tamanho menor de poro podem ser desejados, tais como filtros com tamanhos de poro de 1 a 10 μm para bactérias e fungos, e tamanhos de poro de menos do que 1 μm se apenas partículas virais devem ser detectadas. Obviamente, o filtro de tamanho de poro maior pode ainda ser usado para filtrar alvos menores. Tais filtros podem ser particularmente úteis para tipos de amostra que tem uma quantidade de matéria particulada maior, tal como solo, fezes, e pó que podem entupir o sistema de fluido. Ademais, é entendido que o tamanho de poro é escolhido com base nos materiais a serem filtrados, e que outros tamanhos de poro estão dentro do escopo da presente invenção.
[0083] É entendido que um ou mais componentes úteis para preparação de amostra podem ser fornecidos secos no corpo de frasco 654. Tais aditivos podem incluir agentes de tamponamento, estabilizantes, proteases, DNAses, inibidores de DNAse, RNases, inibidores de RNase, lisozimas, agentes de redução e similares. Alternativamente, tais componentes podem ser incluídos no tampão de amostra, ou podem ser adicionados a jusante, após a amostra ter saído do frasco 650 para processamento adicional. É entendido que a seleção de tais aditivos depende do tipo de amostra e no processamento adicional desejado. Aditivos que auxiliam a reduzir a viscosidade ou auxiliam a solubilidade, para permitir que a amostra passe através do filtro 646 são particularmente úteis.
[0084] Conforme mostrado, a tampa de fundo 664 é fornecida com uma porção hexagonal 666, que é configurada para encaixar no receptáculo de frasco de amostra conformado de forma hexagonal 602. Enquanto a porção hexagonal 666 e o receptáculo de frasco de amostra são hexagonais na modalidade ilustrativa, é entendido que outros formatos podem ser usados, e que os formatos hexagonais outros formatos conectados ou interligados podem ser fornecidos para auxiliar o operador a remover a tampa de fundo 664. Alternativamente, o operador pode remover a tampa de fundo 664 por outros meios, tais como através do uso das duas mãos para girar a tampa de fundo 664 do corpo de frasco 654. A tampa de fundo 654 pode ser ajustada por pressão, rosqueada no, ou de outro modo fixada ao corpo de frasco 654.
[0085] Na modalidade ilustrativa, a tampa de fundo 664 é fornecida com uma sede 648, através da qual uma extremidade de fundo 659 da cânula 655 se estende na sede 648. Ilustrativamente, a extremidade de fundo 659 da cânula 655 se encaixa firmemente na sede 648, de modo que a sede 648 fornece uma vedação impermeável ao ar ao redor da extremidade de fundo aberto 659 da cânula 655. Opcionalmente, respiros 649 são fornecidos entre a tampa de fundo 664 e o corpo de frasco 654.
[0086] Voltando-se agora para a Figura 7, o frasco de hidratação 670 pode ser configurado de maneira similar ao frasco de amostra 650. No entanto, pode ser desejável pré-carregar o frasco de hidratação 670 com fluido de hidratação 672 e pré-vedar o fluido de hidratação 672 no frasco de hidratação 670, conforme mostrado na Figura 7. O frasco de hidratação ilustrativo 670, conforme mostrado na Figura 7, é dotado de uma superfície de topo 682, um corpo de frasco 674, e uma cânula 675, em uma disposição similar àquela do frasco de amostra 650. No entanto, a lingueta 680 da tampa 678 do frasco de hidratação ilustrativo 670 já é ajustada por pressão na abertura 677 da superfície de topo 682, e a tampa 678 pode ser vedada à superfície de topo 682, prevenindo, desse modo, a abertura do frasco de hidratação 670. Essa disposição é ilustrativa apenas, e é entendido que outras maneiras de vedar o fluido de hidratação 672 dentro do frasco de hidratação 670 são comtempladas no presente documento. Ilustrativamente, o corpo de frasco 674 e a cânula 675 podem ser fornecidos completamente cheios ou essencial e completamente cheios de fluido, de modo que o manuseio ou a rotação do frasco de hidratação 670 não permitirá que o ar entre na cânula 675. Alternativamente, algum ar 685 ou outro gás pode estar presente dentro do corpo de frasco 674, e o operador pode manter o corpo de hidratação em uma posição vertical para impedir que o ar entre na cânula 675. Em ainda outra modalidade alternativa, o ar 685 pode ser fornecido sob pressão, e a remoção da tampa de fundo 684 resultaria no fluido de hidratação sendo forçado através da cânula 675. Conforme mostrado, o frasco de hidratação 670 não é fornecido com um filtro, embora um possa ser fornecido, se desejado.
[0087] A tampa de fundo 684 pode ser fornecida para reter qualquer fluido que possa gotejar da cânula 675, assim como impedir a contaminação do fluido de hidratação 672 na cânula 675. Um limpador 683 pode ser fornecido na tampa de fundo 684 para limpar o fluido em excesso do fundo da cânula 675. O formato cônico do limpador 683 pode também auxiliar na retenção de gotejamentos na tampa de fundo 684 durante manuseio e disposição subsequentes. Na modalidade ilustrativa, a tampa de fundo 684 é fornecida com uma porção hexagonal 686 para encaixar com o receptáculo de frasco de hidratação conformado de modo hexagonal 604, embora outros formatos sejam possíveis, conforme discutido acima, em relação ao frasco de amostra 650. A porção hexagonal 686 do frasco de hidratação 670 e receptáculo de frasco de hidratação conformado de modo hexagonal 604 podem ser de dimensões diferentes e/ou formatos diferentes do que a porção hexagonal 666 do frasco de amostra 650 e receptáculo de frasco de amostra conformado de modo hexagonal 602, de modo que apenas o frasco de amostra 650 irá prontamente se encaixar no receptáculo de frasco de amostra 602 e apenas o frasco de hidratação 670 irá prontamente se encaixar no receptáculo de frasco de hidratação 604, para reduzir a chance de o operador confundir o frasco de amostra 650 e o frasco de hidratação 670, de modo que os fluidos apropriados são injetados através das portas 541 e 588. Adicionalmente, o frasco de amostra 650 e a abertura de injeção 563 podem ser parcialmente ou totalmente fornecidos em uma cor específica correspondente, ilustrativamente vermelho, embora o frasco de hidratação 670 e a abertura de injeção 583 possam ser parcialmente ou totalmente fornecidos em uma cor diferente específica correspondente, ilustrativamente azul, para fornecer ao operador auxílio visual no fornecimento dos fluidos apropriados nas portas 541 e 588. Para minimizar adicionalmente o risco de inserir o líquido errado na abertura de injeção errada, o diâmetro da cânula 655 pode diferir do diâmetro da cânula 675, e os diâmetros da abertura de injeção de amostra 563 e o da abertura de injeção de fluido de hidratação 583 podem, de maneira similar, diferirem. Outras configurações estão dentro do escopo desta descrição.
[0088] Retornando à Figura 5, ilustrativamente, para carregar a bolsa 510, o operador colocaria o frasco de amostra 650 no receptáculo de frasco de amostra 602 e o frasco de hidratação 670 no receptáculo de frasco de hidratação 604 na estação de carregamento 600. A bolsa 510 também seria disposta na fenda 610. A amostra seria disposta no interior do tampão de amostra 652 de qualquer maneira adequada para o tipo de amostra, incluindo a inserção de um swab 630, pipetagem de uma amostra de fluido, gotejamento de sangue de um paciente diretamente no corpo de frasco, e disposição de uma amostra sólida ou semissólida tal como fezes no corpo de frasco, com vórtice opcional ou outra misturação, como é o padrão na técnica. Dependendo do tipo de amostra e ácidos nucleicos-alvo desejados, o tampão de amostra pode conter um ou mais aditivos ou estabilizantes, ilustrativamente para tratar uma amostra biológica ou ambiental, tais como proteases, DNases, inibidores de DNase, RNases, inibidores de RNase, lisozimas e similares. Adicional ou alternativamente, esses aditivos podem ser fornecidos na bolsa 510. Preferencialmente antes de submeter ao vórtice ou à misturação, o operador fecharia o frasco de amostra 650 dispondo a lingueta 660 da tampa 658 através da abertura 657. A lingueta de Inserção 660 pressuriza o ar contido dentro do corpo de frasco 654. Ilustrativamente, a lingueta 660 tem um volume igual ao ou maior do que o volume da cânula 655. Ilustrativamente, quando a tampa de fundo 664 é removida, a vedação impermeável ao ar entre a sede 648 e a extremidade de fundo 659 da cânula 655 é quebrada e, substancialmente, todo o ar é forçado para fora da cânula 655. Se o volume da lingueta 660 for maior do que o volume da cânula 655, isso auxiliaria a garantir que a quantidade máxima de ar é deslocado da cânula 655. Qualquer sobrefluxo na quantidade de fluido forçada para dentro e potencialmente através da cânula 655 pode ser capturado na tampa de fundo 664 e removido do fundo da cânula 655 pelo limpador 663. Por completa ou essencialmente preencher a cânula completamente 655, a quantidade de bolhas na bolsa 510 através do carregamento da bolsa é minimizado. Um ou mais respiros 649 podem auxiliar a separação da tampa de fundo 664 do frasco de hidratação 650.
[0089] Visto que a tampa de fundo 664 é fornecida com uma porção hexagonal 666, que é configurada para encaixar no receptáculo de frasco de amostra conformado de forma hexagonal 602, o operador pode facilmente girar a tampa de fundo 654 enquanto a tampa de fundo está engatando o receptáculo 602 expondo, assim, a cânula 655. A cânula 655 é, então, inserida na abertura de injeção de amostra 563 e é empurrada para dentro da abertura porta de injeção 541. Um vácuo dentro da bolsa 590 (ou pressão reduzida dentro da bolsa em relação à pressão atmosférica ou pressão fora da bolsa) ilustrativamente força a amostra através do filtro (se presente), com ou sem pressão do corpo de frasco, que pode ser usada para extrair a amostra na bolsa 510, ilustrativamente na câmara 592a no adaptador 590, para movimento subsequente na câmara de lise 522. Por garantir que a cânula 655 está substancialmente preenchida com fluido 652, a quantidade de ar ou de outro gás movido a partir do frasco de amostra 650 na bolsa 510 é minimizada minimizando, assim, o tamanho e a quantidade de bolhas. Ademais, quando uma seringa da técnica anterior com um êmbolo é usada e o vácuo dentro da bolsa 590 extrai o fluido, o êmbolo é extraído para baixo da seringa equilibrando, assim, a pressão dentro da seringa. Na modalidade das Figuras 5 a 6, visto que a abertura no topo de cada um dos corpos de frasco é vedada, quando o vácuo de dentro da bolsa 590 extrai o fluido do frasco, o frasco também irá experienciar pressão negativa e pode desgaseificar a amostra e extrair algumas bolhas de ar restantes para fora da bolsa 590. A cânula 655 é, então, removida da abertura de injeção de amostra 563 e o frasco de amostra 650 e a tampa de fundo 664 são dispostos de acordo com os protocolos. Visto que o corpo de frasco 654 está sob pressão negativa, conforme a cânula 655 é removida, bolhas de ar que poderiam ser coletadas próximo à porta de injeção 541 podem ser extraídas para fora da bolsa 510 reduzindo, assim, as bolhas de ar na bolsa.
[0090] De maneira similar, o operador gira a tampa de fundo 684 do frasco de hidratação 670 expondo, assim, a cânula 675. Se os conteúdos do frasco de hidratação 670 forem fornecidos sob pressão, uma quantidade pequena de fluido de hidratação pode vazar para fora da tampa de fundo 684 quando a cânula 675 é separada da sede 692. Um ou mais respiros 693 podem auxiliar na separação da tampa de fundo 684 do frasco de hidratação 670. A cânula 675 é, então, inserida na abertura de hidratação de injeção 583 e é empurrada para dentro da abertura porta de injeção 588. Vácuo dentro do adaptador 590 pode ser usado para extrair o fluido de hidratação na bolsa 510, ilustrativamente nas câmaras 592b a 592l, para o movimento subsequente em vários blísteres da bolsa 510. A cânula 675 é removida da abertura de hidratação de injeção 583, a bolsa 510 é removida da estação de carregamento 600 e disposta no instrumento 800, e a execução é iniciada. É entendido que a remoção dos frascos é ilustrativa apenas. Se a configuração do instrumento e frascos permitir, os frascos podem ser inseridos permanentemente nas portas de injeção se tornando, assim, parte do sistema fechado da bolsa e minimizando a contaminação da amostra. Em tal modalidade, uma barra de vedação pode não ser necessária.
[0091] Na modalidade ilustrativa do frasco de amostra 650 discutida acima, a lingueta 660 tem um volume igual a ou maior do que o volume da cânula 655. Em uma modalidade exemplificativa em que a bolsa 510 tem um volume de preenchimento de 1 ml, o corpo de frasco 654 pode ser fornecido com 1,5 ml do fluido de amostra 652 e o volume de 1 ml de ar 645 acima do fluido de amostra. Assim, o ar é 40% do volume do corpo de frasco 654. No entanto, é entendido que outras percentagens de ar podem ser usadas, incluindo 10%, 20%, 30% 50%, 60%, 70%, 80%, e as quantidades entre. Quando a lingueta 660 é inserida através da abertura 657, o ar acima do fluido de amostra é comprimido, ilustrativamente por cerca de 50%, mas a compressão na faixa de 40 a 60%, 30 a 70%, 20 a 80%, e 10 a 90% são todas possíveis. É entendido que a escolha de volume de ar e fluido de amostra depende do tamanho da amostra, diâmetro da cânula, se a remoção dos frascos antes de executar a reação fluídica é desejada, e de inúmeros outros fatores. Por exemplo, amostras dispostas em espátulas ou swabs podem precisar de um volume significativamente maior de fluido de amostra, independente do volume de preenchimento do sistema fluídico.
[0092] Os corpos de frasco Ilustrativos 654 e 674 são cilíndricos. No entanto, visto que esses frascos ilustrativos são fornecidos sem êmbolos, é entendido que os corpos de frasco não precisam ter seções em corte transversal circulares, e que qualquer formato de corpo está dentro do escopo da presente invenção.
[0093] As Figuras 8 a 10 mostram uma modalidade alternativa para a estação de carregamento 600 e os frascos 650, 670, com numerais similares indicando partes similares. A estação de carregamento 700, conforme mostrada na Figura 8, pode ser similar à estação de carregamento 600, com o receptáculo de frasco de amostra 702 e o receptáculo de frasco de hidratação 704, e a fenda 710 para receber a bolsa 510, similar àquela mostrada na Figura 1. No entanto, de acordo com pelo menos uma modalidade, o formato e a localização dos receptáculos são significativamente diferentes entre a estação de carregamento 600 e a estação de carregamento 700. Por exemplo, em pelo menos uma modalidade, em comparação aos receptáculos 602, 604 da estação de carregamento 600, os receptáculos 702 e 704 são mais próximos da bolsa 510. Com essa distância reduzida, há menos oportunidades para acontecer gotejamentos através da bolsa de carregamento 510. Ademais, como melhor visualizado nas Figuras 9 a 10, a tampa de fundo 764 do frasco de amostra 750 é fornecida com quatro aletas relativamente curtas 767 que se encaixam dentro das quatro fendas correspondentes 703 do receptáculo de frasco de amostra 702, e a tampa de fundo 784 do frasco de hidratação 770 é fornecida com duas aletas relativamente mais longas 787 que se encaixam dentro de duas fendas correspondentes 705 do receptáculo de frasco de hidratação 704. Essas aletas substituem as porções hexagonais 666 e 686 dos frascos 650 e 670, respectivamente. O número maior de aletas 767 na tampa de fundo 764 impede que o frasco de amostra 750 seja disposto no receptáculo de frasco de hidratação 704, e as aletas mais longas 787 da tampa de fundo 784 impedem que o frasco de hidratação 770 seja disposto no receptáculo de frasco de amostra 702. No entanto, é entendido que o uso de aletas de diferentes tamanhos e números é ilustrativo apenas, e que diferentes sistemas de chaveamento estão dentro do escopo desta descrição. Conforme discutido acima em relação ao carregamento da estação 600, os receptáculos 702, 704 da estação de carregamento 700 podem ser usados para auxiliar a rotação das tampas de fundo 764, 784 de seus respectivos corpos de frasco 754, 774, para auxiliar com o processo de carregamento.
[0094] Embora os frascos de amostra 650, 750 e os frascos de hidratação 670, 770 sejam usados no exemplo ilustrativo para carregar a bolsa 510, é entendido que esses frascos de carregamento são adequados para carregar qualquer uma das bolsas reveladas no presente documento. Os mesmos também são adequados para carregar outro dispositivo fluídico ou microfluídico, especialmente dispositivos fluídicos que são configurados para extrair líquido no dispositivo fluídico através do uso de vácuo ou sucção.
EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE AMOSTRA
[0095] Nessa modalidade ilustrativa, as amostras de infecções do trato respiratório inferior (LRTI) são usadas. No entanto, é entendido que os presentes métodos podem ser adequados para outros tipos de amostra, incluindo, mas não limitados a, tipos de amostra biológicas e ambientais difíceis de processar, e é particularmente útil para qualquer tipo de amostra, isto é, seletivamente ligada e, então, liberada do material de coleta. LRTIs são afecções comuns, mas a identificação do agente etiológico pode ser difícil como um resultado de técnicas de diagnóstico tendenciosas e características de inibição de espécimes. O "Padrão-Ouro" atual para identificação de patógeno é cultura bacteriana, que é altamente subjetiva, carece de sensibilidade, e é um método de triagem incompleto, visto que a cultura tem capacidade apenas para identificar patógenos passíveis de cultura, em que patógenos não passíveis de cultura permanecem não detectados. Espécimes de LRTI incluem múltiplos tipos de espécime tais como como lavagem broncoalveolar (BAL), mini-BAL, lavagens bronquiais, esputo, e aspirados endotraqueais (ETAs), em que todos os quais têm características desafiadoras únicas e frequentes. Espécimes de esputo e ETA podem ser difíceis de manipular, podem ser lentas para processar, e podem ser altamente inibidoras dos métodos de detecção molecular. Adicionalmente, os patógenos de LRTI incluem bactérias, vírus e organismos fúngicos gram-positivos e gram-negativos, frequentemente exigindo inúmeros métodos de processamento de amostra.
[0096] Esputo é uma matriz de amostra semissólida, com viscosidade e particulados variáveis. BALs podem ter uma viscosidade similar a uma solução salina limpa ou podem ter uma viscosidade similar ao esputo, ambas as quais podem apresentar desafios de processamento. Dificuldades incluem espécimes não pipetáveis, volumes de pipetagem imprecisos devido à viscosidade variável, bolsões de ar, retração, remanentes e espumação durante a injeção de bolsa ou manipulação de amostra. Com a alta viscosidade, pode ser difícil isolar patógenos da matriz de amostra. Adicionalmente, atividade de RNase encontrada em tais amostras pode afetar a detecção de RNA. Com tais tipos de amostra, uma combinação de lises físicas e químicas pode ser eficaz.
[0097] A amostra de esputo pode ser obtida através do uso de qualquer meio adequado, incluindo tendo o paciente expectorado em um vaso de coleta adequado ou induzindo o paciente a produzir um espécime. A maioria dos métodos de detecção de patógeno usam um sistema de transferência de volume que pode ser difícil de usar com esputo ou outras amostras viscosas. Tipicamente, a amostra é pré- tratada para liquefazer a amostra para pipetagem subsequente. Em uma modalidade ilustrativa, swabs são usados para transferir a amostra, reduzindo ou eliminando a necessidade de uma etapa de pré- tratamento. Enquanto pipeta, outros swabs, e outros dispositivos de transferência podem ser usados para transferir a amostra, o uso de swab flocado fornece um método simples e fácil para introduzir um espécime em um sistema de teste enquanto minimiza questões com manipulação de espécime. Um swab adequado é o FLOQSwabs™ (Copan Diagnostics, Murrieta, CA). Esse swab flocado ilustrativo é hidrofílico e é adequado para cavidade para coletar patógenos. Para tais amostras viscosas, ilustrativamente que tem uma viscosidade de 3 mPa^s (3 cP) ou maior, ou amostras sólidas ou semissólidas, o swab flocado pode preferencialmente coletar o organismo sobre o material sólido. O swab flocado pode também preferencialmente liberar o organismo sobre o material de matriz de amostra. Outros materiais que preferencialmente coletam e liberam o organismo sobre a matriz de amostra podem ser usados para transferir a amostra e é entendido que um formato de swab é apenas ilustrativo.
[0098] Em uma modalidade ilustrativa, o swab 630 pode ser disposto na amostra coletada do paciente ou pode ser disposta em uma amostra ambiental. O swab 630, então, pode ser disposto diretamente no tampão de amostra 652 no frasco de amostra 650. O tampão de amostra 652 pode ser qualquer tampão, dependendo do tipo de amostra. Conforme mostrado na Figura 6, se desejado, a ponta do swab 630 pode ser quebrada e a tampa 658 pode ser usada para fechar o corpo de frasco 654. A presença da ponta de swab 630 dentro do corpo de frasco 654 não deveria afetar significativamente o uso do frasco 650. O frasco 650 pode ser agitado, ilustrativamente por inversão três vezes, ou agitado mais vigorosamente ilustrativamente por 10 segundos, para liberar quaisquer patógenos que estão presentes do swab 630. Alternativamente, o swab 630 pode ser girado no tampão de amostra 652 e, então, o swab 630 pode ser removido do frasco 650. Enquanto não estando ligado à teoria, acredita-se que swabs flocados podem preferencialmente coletar células, organismos, e vírus sobre matrizes de amostra e, então, podem reter uma porção das matrizes de amostra tal como material de esputo viscoso enquanto pelo menos libera organismos e vírus. No entanto, é entendido que outros swabs ou dispositivos de transferência podem ser usados em várias modalidades. Ilustrativamente, qualquer material de transferência que coleta e libera seletivamente a amostra desejada sobre a matriz de amostra pode ser usado para concentrar a amostra. Tais materiais incluem swabs, escovas, esponjas, filtros, utensílios, laços, papel, ou outro material adsorvente que liga e libera seletivamente a amostra desejada e pode ser disposto em contato com a amostra durante a transferência da amostra para análise.
[0099] Assim, foi constatado que tal swab flocado é adequado tanto para coleta quanto para a liberação de patógenos nas amostras viscosas tal como amostras de LRTI, e o swab flocado fornece um volume de coleta bem uniforme. Um único swab FLOQSwabs™ coleta aproximadamente de 150 a 300 μl da amostra, incluindo tipos de amostra com viscosidade mais alta tal como esputo, de uma maneira bem reproduzível. Outros materiais que coletam reproduzívelmente amostras viscosas com uma faixa de volume de amostra pequena, ilustrativamente uma faixa de volume de dupla até quádrupla, estão dentro do escopo da presente invenção. É entendido que uma faixa de volume de amostra é a faixa de volumes que um material de coleta de amostra coleta de forma reproduzível, de modo que uma faixa dupla ilustrativa é de 150 a 300 μl e uma faixa quádrupla ilustrativa é de 150 a 600 μl, embora outras faixas, incluindo outras faixas quádruplas e duplas estejam dentro do escopo da presente invenção. Exemplos ilustrativos incluem swabs que são dimensionados para coletar de 50 a 150 μl, assim como de 300 a 1.000 μl da amostra, e possivelmente de 5 a 10 ml, embora seja entendido que essas faixas são ilustrativas e que outras faixas de tamanho sejam possíveis. Embora tais swabs possam ser usados para coletar espécimes de um paciente, em uma modalidade ilustrativa, o swab é usado para coletar o espécime de uma maneira reproduzível e para transferir a amostra de um vaso de coleta adequado para outro vaso para o processamento adicional. No entanto, é entendido que outros materiais de coleta e transferência adequados podem ser usados com várias modalidades reveladas no presente documento, como são conhecidas na técnica.
[00100] É conhecido na técnica o pré-tratamento de amostras difíceis por um período de tempo. Por exemplo, esputo pode ser tratado com ditiotreitol (DTT) e/ou calor por 15 minutos ou mais, algumas vezes 30 minutos ou mais. Um tampão de amostra 652 pode ser usado que pode parcial ou completamente liquefazer espécimes semelhantes a esputo, ilustrativamente sem tal pré-tratamento. Tampões conhecidos na técnica frequentemente usam detergentes em quantidades de 10% ou menos em volume. Um tampão de amostra ilustrativo 652 de acordo com a presente invenção pode conter 10% ou mais de detergente, ilustrativamente 12%, 15%, 18%, 20% ou mais de detergente. Detergentes adequados incluem detergentes não iônicos, iônicos e zwitteriônico podem ser usados. Em uma modalidade ilustrativa, um detergente não iônico tal como 15% de Triton-X pode ser usado. Outros detergentes não limitantes incluem Tween-20, SDS, e NP-40. Foi constatado que essa concentração mais alta de detergente pode reduzir ou eliminar a necessidade de um pré-tratamento tal como aquecimento da amostra ou um pré-tratamento de mistura de DTT, antes da extração de ácido nucleico. Assim, a amostra pode ser processada com apenas 5 minutos ou menos, 2 minutos ou menos, um minuto ou menos, ou até sem um tempo de retenção. No entanto, é entendido que um pré- tratamento pode ser desejável com alguns tipos de amostra. O tampão de amostra 652 pode também conter um composto de guanídio, tal como cloridrato de guanidina. Em um exemplo ilustrativo, o tampão é ácido, ilustrativamente com um pH de cerca de 2 a cerca de 6. Em certos métodos de preparação de amostra, ilustrativamente quando o tipo de amostra é sangue ou um componente de sangue, um álcool tal como isopropanol é usado no tampão de amostra 652. No entanto, outros tampões de amostra podem ser livres de álcool. Foi constatado que em várias modalidades ilustrativas que empregam detergentes em uma concentração de 10% ou mais, ilustrativamente 15%, o álcool pode ser omitido do tampão de amostra 652.
[00101] Conforme discutido acima, o frasco de amostra 650 pode ser fornecido com um filtro 646. Quando a cânula 655 é inserida na abertura de injeção de amostra 653 e a amostra é extraída na bolsa 510, o material de amostra é filtrado conforme o mesmo é empurrado através do filtro 646 e para o interior da cânula 655. Tal filtro 646 pode se entupir com amostras viscosas tal como esputo. Em algumas modalidades, o frasco de amostra 650 pode ser fornecido com uma protease, tal como Proteinase K, ou a protease pode ser, de outro modo, fornecida no frasco de amostra 650 ou pode ser adicionada junto com o tampão de amostra 652. Se a protease for fornecida em forma seca, a introdução do tampão de amostra 652 reidrata a protease, e a introdução da amostra no tampão de amostra 652 permite que a protease inicie a quebra das proteínas na amostra, até antes da amostra ser transferida na bolsa 510 e alcançar o blíster de lise 522. A ação da protease pode auxiliar na redução da viscosidade da amostra, melhorando a capacidade da amostra de passar através do filtro 646, ou melhorar outras etapas de processamento a jusante. Assim, mais patógenos podem ser liberados da amostra com protease presente no frasco de amostra 650. No entanto, em algumas modalidades através do uso de uma protease, pode ser desejável adicionar a protease no interior do tampão de amostra diretamente ou adicionar a protease mais tarde no processo, ilustrativamente secando o mesmo no canal de entrada 515b, enquanto em outras modalidades, a protease pode ser omitida.
[00102] Entende-se que é preferencial transferir os patógenos através do uso de um swab flocado, concentração de detergente mais alta, filtragem através de um filtro 646 na presença de uma protease, ou uma combinação dos mesmos pode tornar óbvia a necessidade de um pré-tratamento por calor ou DTT e pode quebrar tais amostras viscosas de modo suficiente. Tais amostras podem, então, estar prontas para uma etapa subsequente de lise, seguida por PCR ou outro teste.
[00103] Embora a descrição ilustrativa supracitada foque no esputo e outros tipos de amostra de LRTI, é entendido que os métodos e dispositivos acima podem ser usados com uma ampla variedade de tipos de amostra, particularmente, mas não limitado a, tipos difíceis de amostra. Adicionalmente ao esputo, BAL, e outros tipos de amostra de LRTI, outras amostras biológicas difíceis incluem, mas não estão limitadas a, muco, fezes, tecido, homogenato de tecido, tecido moído, tecido integrado em formalina em parafina, osso, homogenato de osso, escaras, pus, fluido sinovial, aspirados de linfonodo, e lavagens estomacais. Amostras ambientais, ilustrativamente solo, superfícies, pós ou alimento, também podem apresentar desafios. A transferência através do uso de um swab flocado ou outro meio de transferência que preferencialmente coleta e libera patógenos permite a coleta relativamente consistente dos patógenos, até de amostras que são difíceis de pipetar ou medir com precisão. Um tampão de amostra que liquefaz parcial ou completamente a matriz de amostra pode ser usado. Extrair a amostra através de um filtro, ilustrativamente na presença de concentrações mais altas de detergente ou aditivos para auxiliar na preparação de amostra, ajuda a quebrar a matriz de amostra para fornecer uma amostra em um formato adequado para processamento adicional.
EXEMPLO 4: AMOSTRAS DIRETAS DE SANGUE
[00104] Nessa modalidade, as amostras diretas de sangue são usadas para análise de RNA hospedeiro. Conforme usado no presente documento, "sangue direto" significa sangue amostras que não foi cultivado. Amostras Ilustrativas diretas de sangue incluem sangue integral direto de um organismo hospedeiro, ilustrativamente um ser humano, uma fração de sangue integral (por exemplo plasma, ou soro), sangue integral coletado em uma solução anticoagulante (por exemplo EDTA, Citrato), ou sangue integral coletado em uma solução estabilizadora de RNA. É entendido que resposta de hospedeiro a doenças infecciosas, agudas e/ou crônicas resultou em mudanças na produção de certas moléculas de RNA, incluindo, mas não limitado a, RNA ribossômico, RNA mensageiro (mRNA), RNA longo não codificante, ou RNA de interferência pequeno. Tais mudanças na produção de RNA podem ser usadas para indicar a fonte da doença do hospedeiro. O RNA e uma amostra direta de sangue é geralmente purificado com métodos de extração automatizados ou manuais dotados de centrifugação, lavagem, adição de tampões otimizados, proteína e digestões de ácido nucleico, frequentemente com lavagens e eluição adicionais. Em muitos métodos da técnica anterior, tudo isso é completado através do uso de equipamento separado da ferramenta de diagnóstico molecular de ponto de extremidade e frequentemente exige 90 minutos ou mais. As amostras purificadas resultantes são, então, manualmente adicionadas a um sistema de diagnóstico molecular de ponto de extremidade tais como um microarranjo de cDNA ou um instrumento de qPCR. O processo para purificar amostras de RNA hospedeiro frequentemente exigem um tempo significativo, equipamento externo e manipulação de amostra, sendo que todos os quais podem influenciar a qualidade e integridade da amostra. Uma abordagem alternativa é a de adicionar a amostra direta de sangue (ilustrativamente em qualquer dentre as formas definidas acima) diretamente a um tampão de amostra 652. Um tampão de amostra ilustrativo contém um agente caotrópico que auxilia na recuperação e ligação de ácidos nucleicos, enquanto reduz RNAses similares a proteína que podem degradar RNA. Ilustrativamente, a razão da amostra direta de sangue para o tampão de amostra está em uma faixa de 1 a 8 a 1 a 1, mais especificamente em uma faixa de 1 a 5 a 1 a 1,67, embora seja entendido que outras razões são possíveis. Essa amostra pode, então, ser carregada diretamente na bolsa 510, conforme discutido acima. O RNA hospedeiro é extraído e purificado dentro do sistema fechado, conforme discutido acima, ilustrativamente com apenas misturação mínima no frasco 650 ou sem qualquer manipulação adicional pelo usuário. Tal preparação de amostra pode ser completada sem qualquer ou com todas as etapas envolvendo centrifugação, precipitação com etanol, e digestão de DNA. Assim, a amostra pode ser processada com apenas 2 minutos ou menos e não exige equipamento externo da ferramenta de diagnóstico molecular de ponto de extremidade.
[00105] Um exemplo dessa aplicação é a detecção de mudanças de RNA hospedeiro em resposta a uma infecção por influenza. Cem microlitros de (100 μl) amostra de sangue integral coletada e uma solução estabilizadora de RNA de acordo com as instruções do fabricante foi adicionada ao tampão de amostra 652, ilustrativamente o tampão de amostra fornecido com o painel respiratório FilmArray (BioFire Diagnostics, LLC). Ilustrativamente, de 300 a 900 μl, ou 2 a 5 vezes o volume da amostra do tampão de amostra pode ser usado. Essa mistura foi, então, injetada na bolsa descartável 510. A extração de amostra, purificação, transcrição reversa, e dois estágios de reação em cadeia de polimerase resultaram em medições de RNA hospedeiro significativamente regulado de modo ascendente em resposta à infecção viral em relação a um controle saudável. Todo o processo de purificação de amostra e análise de qPCR levou menos do que 70 minutos.
[00106] Um exemplo adicional dessa aplicação é a detecção de RNA hospedeiro de sangue integral coletado em uma solução anticoagulante (EDTA). Cem microlitros (100 μl) dessa amostra de sangue integral foram adicionados a 800 μl do mesmo tampão de amostra. Essa mistura foi, então, injetada na bolsa 510. A extração de amostra, purificação, transcrição reversa, e dois estágios de reação em cadeia de polimerase resultaram nas medições de RNA hospedeiro. Todo o processo de purificação de amostra e a análise de qPCR levaram menos do que 70 minutos.
[00107] Esses exemplos demonstraram que ácidos nucleicos, ilustrativamente ácidos nucleicos com alto número de cópias incluindo mas não limitado a várias moléculas de RNA, bactérias, vírus, ou outros micro-organismos, podem ser extraídos das amostras diretas de sangue através do uso apenas de lise, ilustrativamente lise química e/ou mecânica, e purificação de ácido nucleico, ilustrativamente por ligação a e eluição de um substrato de sílica, ilustrativamente não mais do que 5 lavagens, ou não mais do que 3 lavagens, mas tão poucas quanto uma lavagem está dentro do escopo da presente invenção. Esses ácidos nucleicos podem ser extraídos e preparados sem centrifugação ou digestão enzimática, e sem muitas etapas de enxague repetidas. Também conforme demonstrado, esses ácidos nucleicos extraídos são adequados como modelo para amplificação subsequente.
[00108] A presente invenção pode ser realizada de outras formas específicas sem se afastar de seu espírito ou características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativa e não restritiva. O escopo da presente invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas ao invés de pela descrição anterior. Embora certas modalidades e detalhes tenham sido incluídos no presente documento e na descrição de invenção fixada para propósitos de ilustrar a invenção, será aparente aos versados na técnica que várias mudanças nos métodos e aparelhos revelados no presente documento podem ser fabricadas sem se afastar do escopo da presente invenção, que é definido nas reivindicações anexas. Todas as mudanças que estiverem dentro do significado e da faixa de equivalência das reivindicações devem ser abrangidas dentro de seu escopo.

Claims (27)

1. Método para uso de amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: usar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental, contatando a amostra com um swab, dispor o swab com a amostra coletada em um tampão de amostra, transferindo assim uma ou mais porções da amostra para o tampão de amostra, e filtrar a amostra, em que não há etapa de pré-tratamento superior a 2 minutos, e em que o tampão de amostra compreende um detergente em uma quantidade de 10% ou mais em volume do tampão de amostra.
2. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma substância que tem uma viscosidade de 3 cP ou maior.
3. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a substância é escarro.
4. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente colocar a amostra no tampão de amostra em contato com uma protease.
5. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o swab é um swab flocado.
6. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra foi coletada a partir de um recipiente de amostra sem pipetagem, e o swab é configurado para absorver e liberar uma quantidade da amostra dentro de uma faixa de volume quádrupla.
7. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o swab é configurado para absorver e liberar a amostra da substância biológica ou ambiental dentro de uma faixa de volume dupla.
8. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de uso compreende coletar a amostra de um recipiente de amostra sem pipetar e a quantidade de amostra absorvida e liberada está entre 150 μL e 1000 μL.
9. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão de amostra compreende um detergente em uma quantidade de 12% ou mais em volume do tampão de amostra.
10. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão de amostra compreende 15% de Triton-X em volume do tampão de amostra.
11. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de filtragem compreende extrair a amostra através de um filtro na presença de uma protease.
12. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma matriz de amostra e um patógeno, em que o swab retém a matriz de amostra enquanto seletivamente libera o patógeno no interior do tampão de amostra.
13. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que não há tempo de espera para uma etapa de pré-tratamento.
14. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é escarro, e o escarro não é tratado por calor ou tratado com DTT antes de uma etapa de disposição.
15. Método para uso de amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: usar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental, contatar a amostra com um swab, e dispor o swab compreendendo a amostra em um tampão de amostra, transferindo assim uma ou mais porções da amostra para o tampão de amostra, em que o tampão de amostra compreende um detergente em uma quantidade de 10% ou mais em volume do tampão de amostra.
16. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente extrair a amostra através de um filtro.
17. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a amostra é sangue ou um produto de sangue.
18. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma matriz de amostra e um ou mais patógenos, e a etapa de filtragem separa a matriz de amostra do patógeno.
19. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa de filtragem separa a matriz de amostra do patógeno sem uma etapa de pré- tratamento maior do que 5 minutos.
20. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tampão tem um pH de 2 a 6.
21. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa de coleta compreende colocar uma matriz de amostra contendo a amostra em contato com um material que preferencialmente coleta e libera o organismo sobre a matriz de amostra.
22. Método para uso de amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: usar uma amostra que compreende uma substância biológica ou ambiental, contatar a amostra com um material que preferencialmente coleta e libera o organismo sobre a matriz de amostra, e dispor o material com a amostra coletada em um tampão de amostra, transferindo assim uma ou mais porções da amostra para o tampão de amostra, em que o tampão de amostra compreende um detergente em uma quantidade de 10% ou mais em volume do tampão de amostra.
23. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o material é um material hidrofílico.
24. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que uma quantidade fixa do material absorve e libera reprodutivamente uma quantidade da amostra dentro de uma faixa quádrupla.
25. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o material é adsorvente e é selecionado dentre o grupo que consiste em um swab, escova, esponja, filtro, utensílio, laço e papel.
26. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda filtrar a amostra.
27. Método para uso de amostra, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda submeter ácidos nucleicos da amostra coletada a condições de amplificação.
BR112018008331-3A 2015-11-02 2016-11-01 Métodos para uso de amostra BR112018008331B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562249592P 2015-11-02 2015-11-02
US62/249,592 2015-11-02
PCT/US2016/059928 WO2017079167A1 (en) 2015-11-02 2016-11-01 Sample preparation for difficult sample types

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112018008331A2 BR112018008331A2 (pt) 2018-10-30
BR112018008331B1 true BR112018008331B1 (pt) 2022-09-06

Family

ID=58635347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112018008331-3A BR112018008331B1 (pt) 2015-11-02 2016-11-01 Métodos para uso de amostra

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11175205B2 (pt)
EP (2) EP3353278B1 (pt)
JP (3) JP7126445B2 (pt)
KR (1) KR20180080241A (pt)
CN (2) CN115181781A (pt)
AU (1) AU2016350734B2 (pt)
BR (1) BR112018008331B1 (pt)
CA (1) CA3003172A1 (pt)
CL (1) CL2018001156A1 (pt)
ES (1) ES2862224T3 (pt)
HK (1) HK1252952A1 (pt)
SG (1) SG11201802946WA (pt)
WO (1) WO2017079167A1 (pt)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9522396B2 (en) 2010-12-29 2016-12-20 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Apparatus and method for automatic detection of pathogens
US20160296945A1 (en) 2013-03-15 2016-10-13 Ancera, Inc. Systems and methods for active particle separation
WO2014145765A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Ancera, Inc. Systems and methods for bead-based assays in ferrofluids
WO2016210348A2 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Ancera, Inc. Background defocusing and clearing in ferrofluid-based capture assays
US9933445B1 (en) 2016-05-16 2018-04-03 Hound Labs, Inc. System and method for target substance identification
EP3490694A4 (en) * 2016-07-31 2020-04-15 Ancera Corp. MULTI-LAYER DISPOSABLE CARTRIDGE FOR FERROFLUID BASED ASSAYS AND METHOD OF USE
WO2018175411A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Nanocellect Biomedical, Inc. Systems, apparatuses, and methods for cell sorting and flow cytometry
WO2018217929A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Biofire Defense, Llc Systems and methods for point of use evacuation of an array
US20200245899A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Hound Labs, Inc. Mechanical Breath Collection Device
US11977086B2 (en) 2019-03-21 2024-05-07 Hound Labs, Inc. Biomarker detection from breath samples
CN110157702A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地 一种用于提取珊瑚rna样品的采集操作台
US11933731B1 (en) 2020-05-13 2024-03-19 Hound Labs, Inc. Systems and methods using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy for detecting tetrahydrocannabinol
EP4158056A4 (en) * 2020-05-29 2024-07-24 Univ Rockefeller METHOD AND SYSTEM FOR RNA ISOLATION FROM SMALL VOLUME SELF-COLLECTED SAMPLES
EP4168247A4 (en) * 2020-06-18 2024-06-26 NanoCellect Biomedical, Inc. MICROFLUIDIC SYSTEMS AND METHODS FOR SORTING PARTICLES
CN111822282B (zh) * 2020-07-24 2021-07-20 惠州法路源基因科技有限公司 一种取样拭子植绒设备
US11806711B1 (en) 2021-01-12 2023-11-07 Hound Labs, Inc. Systems, devices, and methods for fluidic processing of biological or chemical samples using flexible fluidic circuits
CN113136412A (zh) * 2021-04-22 2021-07-20 浙江珂瑞康生物医疗科技有限公司 用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液
WO2023144713A1 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 S.D. Sight Diagnostics Ltd Sample carrier for use with a bodily sample

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6645758B1 (en) 1989-02-03 2003-11-11 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Containment cuvette for PCR and method of use
US6780617B2 (en) 2000-12-29 2004-08-24 Chen & Chen, Llc Sample processing device and method
US20040209331A1 (en) 2001-07-16 2004-10-21 Kirk Ririe Thermal cycling system and method of use
EP1436405A4 (en) 2001-08-20 2006-01-04 Whatman Inc CLEANING AND OBTAINING DNA FROM HIGH-PARTICLES AND SOLIDS SAMPLES
AU2003217552A1 (en) 2002-02-19 2003-09-09 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
JP4286157B2 (ja) * 2003-01-21 2009-06-24 デンカ生研株式会社 メンブレンアッセイ法
US20040157219A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
EP2402089A1 (en) * 2003-07-31 2012-01-04 Handylab, Inc. Processing particle-containing samples
US7387887B2 (en) 2004-04-20 2008-06-17 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US8986614B2 (en) 2010-02-23 2015-03-24 Rheonix, Inc. Self-contained biological assay apparatus, methods, and applications
EP3556868A1 (en) 2005-05-09 2019-10-23 BioFire Diagnostics, LLC Self-contained biological analysis
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US8652782B2 (en) * 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
ES2809168T3 (es) 2006-11-15 2021-03-03 Biofire Diagnostics Llc Análisis biológico autónomo de alta densidad
EP2326727B1 (en) * 2008-08-15 2016-05-04 Litmus Rapid-B LLC Flow cytometry-based systems and methods for detecting microbes
NZ711257A (en) * 2009-02-03 2017-05-26 Netbio Inc Nucleic acid purification
WO2012015926A2 (en) * 2010-07-27 2012-02-02 Northwestern University Devices and methods for filtering blood plasma
WO2012027302A2 (en) * 2010-08-21 2012-03-01 The Regents Of The University Of California Systems and methods for detecting antibiotic resistance
WO2012050787A1 (en) 2010-09-29 2012-04-19 Ibis Biosciences, Inc. Fungal nucleic acid extraction
IT1403618B1 (it) * 2011-01-05 2013-10-31 Copan Italia Spa Procedimento per realizzare un dispositivo per il prelievo ed il trasferimento di campioni per biologia molecolare
CN104159559B (zh) * 2011-11-10 2018-01-02 拜奥法尔诊断有限责任公司 装填管瓶
EP2835646B1 (en) 2012-04-05 2019-07-17 Tauns Co., Ltd. Method for immunological detection of mycobacterium tuberculosis complex
US9808798B2 (en) * 2012-04-20 2017-11-07 California Institute Of Technology Fluidic devices for biospecimen preservation
PL3539666T3 (pl) 2012-05-24 2022-01-31 University Of Utah Research Foundation Urządzenie do ekstremalnej pcr
EP2684947A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-15 Biocartis SA A method for filtering a biological sample
EP4067505A1 (en) * 2013-03-15 2022-10-05 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for nucleic acid extraction
US10093918B2 (en) * 2014-06-04 2018-10-09 Lucigen Corporation Sample collection and analysis devices

Also Published As

Publication number Publication date
US11175205B2 (en) 2021-11-16
CL2018001156A1 (es) 2018-11-23
JP2022008815A (ja) 2022-01-14
AU2016350734A1 (en) 2018-06-14
EP3353278A4 (en) 2019-03-06
CN115181781A (zh) 2022-10-14
JP2019502098A (ja) 2019-01-24
JP2023085281A (ja) 2023-06-20
CN108473931A (zh) 2018-08-31
EP3789503B1 (en) 2024-04-10
WO2017079167A1 (en) 2017-05-11
US20170122851A1 (en) 2017-05-04
EP3353278A1 (en) 2018-08-01
BR112018008331A2 (pt) 2018-10-30
SG11201802946WA (en) 2018-05-30
ES2862224T3 (es) 2021-10-07
US20220034770A1 (en) 2022-02-03
EP3789503A1 (en) 2021-03-10
EP3789503C0 (en) 2024-04-10
HK1252952A1 (zh) 2019-06-06
KR20180080241A (ko) 2018-07-11
CA3003172A1 (en) 2017-05-11
AU2016350734B2 (en) 2021-04-08
EP3353278B1 (en) 2021-03-10
CN108473931B (zh) 2022-07-19
JP7126445B2 (ja) 2022-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112018008331B1 (pt) Métodos para uso de amostra
JP5782384B2 (ja) 未処理試料から核酸を単離するための自己完結型装置および精製方法
AU2017235971B2 (en) Nucleic Acid Purification
US20240043941A1 (en) Systems, methods, and apparatuses for concentration and identification of a microorganism from blood
AU2013205155A1 (en) Nucleic acid purification

Legal Events

Date Code Title Description
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 01/11/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS