KR20180072177A - 줄기세포의 유효성분 추출장치 및 이를 이용한 추출방법 - Google Patents

줄기세포의 유효성분 추출장치 및 이를 이용한 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유효성분 추출장치 및 이를 이용한 추출방법에 관한 것으로, 추출장치의 구성은, 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부와, 상기 몸체부 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부와, 상기 제 1용기부에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부 부내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부와, 상기 제 2용기부 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부와, 상기 몸체부 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브와, 상기 몸체부 내부에서 공기를 흡입하는 펌프를 포함하여 구성될 수 있다.

Description

줄기세포의 유효성분 추출장치 및 이를 이용한 추출방법{A Stem Cell Active Constituent Extracting Apparatus and A Stem Cell Active Extracting Method Using that}
본 발명은 줄기세포 유효성분 추출장치 및 이를 이용한 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포 내의 유효인자의 수집율을 높일 수 있는 줄기세포 유효성분 추출장치 및 이를 이용한 추출방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포 중 성체 줄기세포는 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있으며, 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하는 것이기 때문에 면역거부반응도 적기 때문에 이를 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.
성체 줄기세포를 바로 주입하는 형식은 면역거부반응 등의 이유로 본인의 것에 제한된다. 그래서 줄기세포를 주입하는 방법 대신에 줄기세포를 배양할 때 얻어진 배양액을 사용하기도 한다. 줄기세포 배양에 의한 배양액에는 성장인자 및 세포활성물질 등과 같은 줄기세포의 유효성분이 함유되어 있다.
하지만 이러한 배양액은 성장인자 및 세포활성물질 이외에도 소혈청 및 항생제 등 배양할 때 필요한 기타 첨가제들이 함유되어 있어 이러한 성분들이 주입될 경우 원하는 기능이나 효능 이외에 원하지 않는 부정적 작용을 할 수 있다.
뿐만 아니라 줄기세포를 배양한 배양액은 줄기세포 유효성분은 원하는 효과를 얻기에는 그 함유량이 너무 낮고 충분한 함유량을 얻기에는 시간과 노력이 과도히 소요된다는 문제점이 있다.
공개특허 제10-2014-154754호
본 발명의 목적은, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 줄기세포 성분추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 것으로, 본 발명인 줄기세포 유효성분 추출장치는, 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부와, 상기 몸체부 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부와, 상기 제 1용기부에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부 부내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부와, 상기 제 2용기부 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부와, 상기 몸체부 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브와, 상기 몸체부 내부에서 공기를 흡입하는 펌프를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 제 1용기부에는 얼음이 적재되는 것을 특징으로 한다.
그리고, 본 발명의 다른 실시예인 줄기세포 유효성분 추출방법은, 제 1항의 추출장치의 제 1용기부에 얼음을 적재하고, 상기 제 2용기부에 줄기세포를 투입하는 제 1단계와, 펌프를 구동시켜 상기 몸체부 내부를 진공으로 만드는 제 2단계와, 파쇄부를 구동시켜 저초음파로 상기 줄기세포를 파쇄하는 제 3단계와, 상기 제 3단계의 파쇄물을 원심분리하는 제 4단계와, 상기 원심분리된 상기 추출물을 3중 필터로 필터링하는 제 5단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상술한 본 발명의 구성에 따르면, 줄기세포의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있는 효과를 제공한다.
도 1은 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 추출장치를 보인 도면.
도 2는 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분을 추출하기 위한 필터구조를 보인 도면.
이하, 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 추출장치의 바람직한 실시예가 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
먼저, 본 발명인 줄기세포 유효성분 추출장치는 도 1에 도시된 바와 같이,
내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부(10)와, 상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부(12)와, 상기 제 1용기부(12)에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부(12) 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부(14)와, 상기 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부(16)와, 상기 몸체부(10) 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브(18)와, 상기 몸체부(10) 내부에서 공기를 흡입하는 펌프(20)를 포함하여 구성될 수 있다.
먼저, 본 발명인 추출장치에는 몸체부(10)가 마련된다. 상기 몸체부(10)는 도 1에 도시된 바와 같이, 내부에 밀폐된 공간이 마련되어 외부와 내부가 차단되도록 한다.
상기 몸체부(10) 내부에는, 제 1용기부(12)가 마련된다. 상기 제 1용기부(12)는 내부에 공간이 마련되고 상부가 개방되도록 형성된다. 상기 제 1용기부(12)에는 얼음이 적재되어 아래에서 설명될 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포의 온도를 낮게 만드는 역할을 한다.
상기 제 1용기부(12) 내부에는 제 2용기부(14)가 마련된다. 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12)와 마찬가지로 내부에 공간이 마련되고 상부가 개방되도록 형성된다. 특히, 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12) 보다 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12) 내부에 적재될 수 있다. 상기 제 2용기부(14)에는 줄기세포가 적재될 수 있다.
그리고, 본 발명에는 파쇄부(16)가 더 마련될 수 있다. 상기 파쇄부(16)는 상기 제 2용기부(14) 내부에 적재되는 줄기세포를 초음파를 이용하여 파쇄하는 역할을 한다.
또한, 본 발명에는 외부와 공기가 유동되는 유로가 마련되며, 상기 유로를 통한 공기의 흐름을 선택적으로 차단하는 밸브(18)가 마련된다. 상기 유로의 타단에는 펌프(20)가 마련되어 상기 몸체부(10) 내부의 공기를 외부로 배출시켜 상기 몸체부(10) 내부를 진공 상태로 만들 수 있다.
그리고, 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 주출장치를 이용하여 줄기세포에서 유효성분을 추출하는 방법에 대해 설명한다.
먼저 준비된 줄기세포를 배지 내에서 배양한다. 여기서 줄기세포는 인체의 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 중 어느 하나에서 추출할 수 있다. 추출되는 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것이다.
배지는 줄기세포 배양에 많이 사용되고 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium) 중 적어도 어느 하나를 사용할 수 있다. 또한 배지에는 FBS(Fetal Bovine Serum), human serum, penicillin 및 streptomycin 중 적어도 어느 하나가 첨가될 수 있으며, 필요할 때에는 추가로 비타민, 아미노산, 지질 또는 성장인자와 같은 영양분을 더 추가할 수 있다. FBS 또는 human serum은 각각 5 내지 20%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.1 내지 5% 비율로 첨가되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 비율은 FBS 또는 human serum은 각각 8 내지 15%, penicillin 또는 streptomycin는 각각 0.5 내지 2%이다.
배지의 배양 환경은 70 내지 95%의 습도, 20 내지 50℃의 온도 및 1~20% CO2 에서 이루어지는 것이 바람직하며, 경우에 따라서 이러한 환경은 임의로 변경 가능하다.
줄기세포를 배양하는 단계에서는 계대배양이 이루어질 수 있다. 배지가 담긴 플레이트에 줄기세포가 성장하여 80 내지 90%의 밀도를 가지면 플레이트에서 줄기세포를 일부 수득하여 다른 배지가 담긴 플레이트로 옮겨서 다시 줄기세포의 성장이 이루어지게 한다. 초대배양을 할 때 혈액을 제거하지 않았을 경우 계대배양을 하면서 상기 혈액을 제거할 수 있다.
줄기세포를 얻기 위해 배지를 제거한다. 줄기세포의 배양은 계대배양 단계가 이루어질 때마다 큰 플레이트(plate)로 옮겨 사용할 수 있으며 지름이 10cm 이상의 플레이트에 계대배양이 되면 배지를 제거하여 줄기세포를 수득하는 것이 바람직하다. 10cm 플레이트보다 작은 플레이트에서도 상기 줄기세포를 수득할 수 있지만 작은 플레이트에서는 줄기세포가 배양되는 양이 적기 때문에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 없다. 따라서 10cm 이상의 플레이트에서 줄기세포를 얻는 것이 작업 효율을 높이는 방법 중 하나이다.
플레이트 내의 배지를 제거한 후 trypsin/EDTA를 첨가하여 분리한다. 줄기세포는 플레이트 내에 긴 막대형상으로 부착되어 있는데 여기에 trypsin/EDTA를 첨가할 경우 줄기세포의 단백질 결합을 끊어 줄기세포가 플레이트에 서 떨어진다. 플레이트에서 떨어진 줄기세포는 긴 막대형상에서 동그란 형상으로 말리게 된다. trypsin/EDTA는 단백질의 결합을 끊을 뿐만 아니라 세포를 괴사를 일으키기 때문에 플레이트에 첨가한 다음 2~3방울 남기고 trypsin/EDTA를 플레이트에서 제거한 후 줄기세포만을 획득한다. trypsin/EDTA의 농도는 0.1 내지 0.3%인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 trypsin/EDTA 대신 스크래퍼로 긁어서 직접 회수할 수도 있다. 플레이트에서 분리된 줄기세포를 trypsin/EDTA를 완전히 제거하여 순수하게 얻기 위해 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 여러 번 워싱한다.
줄기세포를 등장성 캐리어 액체에 분산시켜 삼투압을 유지한 상태에서 줄기세포의 수를 카운팅한다. 등장성캐리어 액체는 생리식염수, PBS(phosphate buffer saline)와 같은 버퍼(buffer)를 사용하는 것이 일반적이며 이들뿐만 아니라 링거액으로 사용되는 하트만 솔루션(hartmann solution) 및 하트만 덱스(hartmann glucose)등 영양분이 함유되어 있는 캐리어 액체를 사용 가능하다.
배양된 줄기세포를 플레이트에서 분리한 후, 파쇄가 가능하도록 줄기세포에 등장성 캐리어 액체를 첨가한 후, 줄기세포가 파쇄 가능하도록 유동되면 줄기세포를 파쇄한다.
등장성 캐리어 액체를 제거한 후 저장성 증량제를 첨가하여 줄기기세포를 분산시킨다. 저장성 증량제는 캐리어 액체처럼 등장성 용액을 사용하지 않고 물, 증류수와 같이 줄기세포에 비해 삼투압이 낮은 용액을 사용한다. 이들을 사용할 경우 빠른 시간 내에 줄기세포가 팽창한다. 줄기세포를 처리하는 프로세스상의 조건에 따라서 줄기세포를 오래 방치해 두어야 하는 경우 0.45% 이하의 식염수 등과 같이 물 또는 증류수보다 염분의 양이 많은 저장성 용액을 사용할 수 있다.
저장성 증량제는 줄기세포에 비해 삼투압이 낮기 때문에 줄기세포에 증량제를 첨가할 경우 줄기세포는 증량제를 흡수하여 부풀게 되고 세포막이 얇아진다. 증량제는 종류에 따라서 30초 내지 2분정도 방치하여 줄기세포를 충분히 팽창시키는 것이 바람직하다. 증량제에는 1ml 당 줄기세포의 수가 104 내지 107 개 함유되는 것이 바람직하다.
초음파 등의 파쇄 에너지가 줄기세포에 가해지면 이미 세포막이 충분히 팽창해 있으므로 줄기세포는 용이하게 파쇄된다. 그러므로 적은 에너지로 단시간 내 효과적인 세포막 파쇄가 가능하며, 세포 내부의 성장인자 등 유효성분이 파괴되는 것을 방지할 수 있다. 이 때 적합한 초음파의 강도는 통상의 세포파쇄의 경우에 비해 현저히 낮은 초음파로도 적절한 결과를 얻을 수 있다.
줄기세포의 파쇄과정은 복수 회의 단위 파쇄가 휴지시간을 사이에 두고 간헐적으로 수행된다. 휴지시간을 사이에 두지 않고 연속적으로 줄기세포를 파쇄할 경우 파쇄 열에 의해 줄기세포가 손상될 수 있다. 휴지시간은 줄기세포와 증량제가 냉각되게 하며, 그 동안 파쇄가 완전히 이루어졌는지 현미경을 통해 확인할 수 있다. 현미경을 통해 줄기세포가 전부 파쇄된 것을 확인하면 파쇄를 종료한다. 과도한 파쇄는 세포막뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질까지 파괴시킬 우려가 있다. 각 단위파쇄는 파쇄효율과 과열방지를 고려하여 2 내지 7초 동안 수행되는 것이 바람직하며, 휴지시간은 3초 이상인 것이 바람직하다.
특히, 본 발명인 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하는 경우, 저온의 진공상태에서 저주파의 초음파를 이용할 수 있어, 기존의 조건보다 훨씬 낮은 충격인 5kHz 이하의 강도에도 파쇄할 수 있어, 유효성분이 손상되는 것을 방지할 수 있게 된다.
그리고, 파쇄 단계로부터 최종적으로 줄기세포 성분 추출물을 분리하여 얻는다. 상기 단계에서 얻어지는 저장성 증량제와 줄기세포 파쇄 혼합물에는 줄기세포 내용물인 다양한 성장인자, 세포활성물질과 함께 세포막 잔여물이 존재한다. 그 중 줄기세포 성분 추출물에 필요한 성장인자 및 세포활성물질은 수득하고, 필요하지 않은 세포막 잔여물은 제거한다. 면역글로불린(immunoglobulin)에 의해 발생할 수 있는 면역거부반응을 방지하기 위해서는 파괴된 세포막은 제거하는 것이 바람직하다.
세포막 잔여물의 제거는 필터링에 의해 이루어질 수 있지만 주로 원심분리를 이용한다. 원심분리는 성장인자 및 세포활성물질에 비해 크기가 큰 세포막 잔여물을 하부에 가라앉게 하여 상부의 성장인자 및 세포활성물질만을 회수 가능하다.
원심분리는 800 내지 1500G에서 수행되는 것이 바람직하다. 800G보다 낮을 경우에는 세포막 잔여물이 가라앉지 않아 분리가 용이하지 못하며, 1500G보다 높을 경우에는 세포막 잔여물뿐만 아니라 성장인자 및 세포활성물질이 함께 가라앉아 수득할 수 있는 양이 줄어든다.
또한, 이때, 원심분리시 도 2에 도시된 바와 같은 각각 다른 분자량을 통과할 수 있는 필터(32, 34, 46)가 장착된 필터부를 이용하여, 줄기세포 파쇄 혼합물을 걸러낼 수 있다.
특히, 상기 원심분리에 의한 필터링 공정을 여러번 반복하여, 세포벽 등에 잔존하고 있는 유효인자들을 최대한 추출할 수 있게 된다.
그러면, 아래의 표 1에 나타난 바와 같이, 기존의 줄기세포추출물(본원발명의 줄기세포추출장치를 사용하지 않고, 본원발명의 원심분리필터를 사용하지 않은 경우)에 비해, 총단백질량이 6번의 실험결과 종전의 방식에 비해 1.5배 이상 많아 유효물질이 더 많이 추출된 것으로 확인할 수 있다.
1 2 3 4 5 6 평균
종전의 방식 58.28 56.29 55.97 56.05 56 55.73 56.39
본원발명의 방식 96.97 95.46 96.83 96.01 96.46 96.94 96.45
(단위: ㎍/㎖)
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
10: 몸체부 12: 제 1용기부
14: 제 2용기부 16: 파쇄부
18: 밸브 20: 펌프
30: 필터부

Claims (3)

  1. 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부;
    상기 몸체부 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부;
    상기 제 1용기부에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부 부내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부;
    상기 제 2용기부 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부;
    상기 몸체부 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브; 및
    상기 몸체부 내부에서 공기를 흡입하는 펌프;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 유효성분 추출장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1용기부에는 얼음이 적재되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 유효성분 추출장치.
  3. 제 1항의 추출장치의 제 1용기부에 얼음을 적재하고, 상기 제 2용기부에 줄기세포를 투입하는 제 1단계;
    펌프를 구동시켜 상기 몸체부 내부를 진공으로 만드는 제 2단계;
    파쇄부를 구동시켜 저초음파로 상기 줄기세포를 파쇄하는 제 3단계;
    상기 제 3단계의 파쇄물을 원심분리하는 제 4단계;
    상기 원심분리된 상기 추출물을 3중 필터로 필터링하는 제 5단계;
    를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 유효성분 추출방법.

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