KR102136206B1 - 초음파진동 기반으로 지방에서 줄기세포를 분리하는 장치 - Google Patents

초음파진동 기반으로 지방에서 줄기세포를 분리하는 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따르는, 라이브 지방줄기세포 분리 장치는, 초음파 발생 부를 구비한 베이스 부; 상기 초음파 발생 부에서 발생된 초음파를 전달받아 진동하도록 상기 베이스 부에 구비되는 프로브; 및 상기 초음파에 의한 진동이 발생되는 상기 프로브의 일 단에 장착되며 소정의 면적과 소정의 길이를 갖도록 구비되는 보조 부재를 포함하고, 상기 보조 부재가 저장 캡 내의 지방세포들에 담겨진 후 상기 초음파 발생 부에 의해 초음파가 발생됨에 따라, 상기 보조 부재를 통하여 상기 초음파의 진동을 상기 지방세포들에 전달하여 초음파 기반으로 지방줄기세포들로 분해할 수 있다.

Description

초음파진동 기반으로 지방에서 줄기세포를 분리하는 장치{APPARATUS FOR ISOLATING ADIPOSE-DERIVED STEM CELLS BASED ON ULTRASONIC CAVITATION}
본 발명의 다양한 실시예들은 초음파를 이용하는 라이브 지방줄기세포 분리장치에 관련된 것이다.
일반적으로, 사람의 세포 지방 또는 다른 조직에서 세포를 분리하여 치료를 돕는 줄기세포 관련 분리 방법은 빠르게 성장하고 있는 분야이다. 특히, 사람의 지방세포에서 줄기세포를 분리하는 방법은 기존에 효소(콜라겐아제)를 이용해 세포를 녹이고 그로 인한 부산물을 추출하는 방법을 사용하였다. 하지만 효소(콜라겐아제)의 경우 산성이나 알카리성을 띠는 용액들과는 달리 중화가 되지 않고 효소 자체의 독성을 갖는다. 중화되지 않은 효소는 인체에 기타 다른 단백질과 지방을 녹일 수 있고, 기존의 줄기세포 분리 장비들은 이 효소(콜라겐아제)를 여러 번 세척하여 남은 효소를 없애는데 많은 시간이 소비되는 단점이 있었다.
즉, 기존의 효소(콜라겐아제)를 이용한 줄기세포 분리 방법은 인체에서 채취한 지방 및 세포를 일정 크기의 용기에 담고 거기에 효소(콜라겐아제)를 첨가하여 인체와 비슷한 온도인 38도에서 39도 사이에서 40여분간 세포를 녹인다. 그 후 녹은 세포를 원심 분리하여 줄기세포 및 기타 세포를 분리한다
여기서, 남은 효소(콜라겐아제)를 중화 하기 위하여 노말셀라인에 여러 번 세척하여 다시 줄기세포를 모으는 방법을 취하고 있다
이와 같이, 기존의 세포 분리 방법은 효소(콜라겐아제)를 썩은 지방 세포와 세포를 효소(콜라겐아제)에 의해 40분 녹인 후, 효소(콜라겐아제)를 노말셀라인에 중화한다. 이때 소용되는 시간은 20분 및 1시간 이상을 소요될 수 있다. 이는 효소 때문에 사용하여야 하는 시간이다.
삭제
선행특허문헌 : 미국 특허공개공보 제2014/0105856호 (공개일 : 2014.04.17)
따라서, 본 발명의 다양한 실시 예들에서는 효소(콜라겐아제) 대신 베이스 부의 프로브를 초음파에 의해 진동하여 세포를 분리함으로써, 기존의 효소(콜라겐아제) 를 녹이는 시간 및 중화하는 시간을 절감하도록 한 초음파 기반의 라이브 지방줄기세포 분리 장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따르는, 라이브 지방줄기세포 분리 장치는, 초음파 발생 부를 구비한 베이스 부; 상기 초음파 발생 부에서 발생된 초음파를 전달받아 진동하도록 상기 베이스 부에 구비되는 프로브 및 상기 초음파에 의한 진동이 발생되는 상기 프로브의 일 단에 장착되며 소정의 면적과 소정의 길이를 갖도록 구비되는 보조 부재를 포함하고, 상기 보조 부재가 저장 캡 내의 지방세포들에 담겨진 후 상기 초음파 발생 부에 의해 초음파가 발생됨에 따라, 상기 보조 부재를 통하여 상기 초음파의 진동을 상기 지방세포들에 전달하여 초음파 기반으로 지방줄기세포들로 분해할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시 예들에 따르면, 효소(콜라겐아제)없이 초음파에 의해 세포를 분리하여 기존의 효소(콜라겐아제)를 녹이거나 중화 시 필요한 많은 시간을 수 분(minutes)만으로 절감할 수 있다. 따라서, 지방 세포에서 세포의 분리를 효율적으로 할 수 있다.
또한, 프로브에 보조부재를 장착함으로써, 초음파 대역으로 프로브에 인가된 주파수가 보조부재의 일 단에서는 소정 범위만큼 감쇠되어 인가되는데, 이때의 주파수 값이 줄기세포를 죽이지 않고 살아있는 상태로 분리시키게 된다. 즉, 주파수 발생장치를 별도 제작하지 않고 상용 품으로 보급되고 있는 주파수 발생장치를 채용하고, 보조부재를 통하여 소정 범위만큼 주파수를 감쇠시킴으로써, 저렴하면서 라이브 줄기세포 획득이 가능한 줄기세포 분리장치를 제작할 수 있다.
도 1는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 세포 분리 장치의 구성 중 저장 캡을 나타내는 측 단면도.
도 2은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 세포 분리 장치의 구성 중 저장 캡과 베이스 부에 구비된 프로브와의 결합상태를 나타내는 측 단면도.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따르는 세포 분리 장치를 통한 초음파 기반의 세포분리를 수행하는 과정을 나타내는 사진.
도 4는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 녹은 세포를 원심 분리기를 이용하여 세포를 분리한 상태를 나타내는 도면.
도 5a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 분리 장치의 측 단면도를 나타내는 도면.
도 5b 및 도 5c는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 분리 장치가 저장 캡에 장착된 상태를 나타내는 측 단면도와 사시도.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 저장 캡과 주변 구성을 나타내는 측 단면도.
도 7a 내지 도 9b는 각 주파수 영역에서 보조부재를 포함하는 베이스 부와 포함하지 않는 일반 베이스 부를 이용하여 실험한 결과를 나타내는 화면에 대한 사진.
본 발명의 다양한 실시 예들에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명의 다양한 실시 예들에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명의 다양한 실시 예들에서 사용되는 용어는 본 발명의 다양한 실시 예들에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로 운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원 인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 다양한 실시 예들의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명의 다양한 실시 예들에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 다양한 실시 예들의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
또한, 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 지방 제거 장치 및 세포 분리 장치는 전술한 다양한 장치들 중 하나 또는 그 이상의 조합일 수 있다. 또한, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 라이브 지방줄기세포 분리 장치는 지방 제거 술 및 세포 분리에 사용되는 장치에 한정되지 않음은 당 업자에게 자명하다.
도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 라이브 지방줄기세포 분리 장치의 구성 중 저장 캡(100)(storage bottle) 을 나타내는 측 단면도 이고, 도6은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 라이브 지방줄기세포 분리 장치의 구성 중 저장 캡(100)과 베이스 부에 구비된 프로브와의 결합 상태를 나타내는 측 단면도 이다.
도 1 및 도 2을 참조하면, 초음파를 이용한 전자식 세포 분리 장치(110)의 구성을 설명하기로 한다. 세포분리 장치(110)는, 베이스 부(30), 프로브(40), 저장 캡(100)을 포함한다.
베이스 부(30)는 세포 분리 장치(110)의 본체 부(미도시 됨)에서 발생된 초음파 전기 신호를 인가 받아 초음파 진동을 발생시켜 후술하는 프로브(40)에 전달시킬 수 있도록 세포 분리 장치(110)의 본체 부(미도시 됨)와 전기적으로 연결되어 있다.
베이스 부(30)는 초음파 진동을 발생시킬 수 있도록 초음파 발생 부(30a)를 구비하고 있다.
초음파 발생 부(30a)는 압전 방식으로 초음파 진동을 발생시킬 수 있도록 압전기(Piezo electric)로 이루어져 있다. 종래의 초음파 장치의 경우, 초음파의 파장길이로 인해 지방세포와 맞닿는 프로브의 일 단 뿐만 아니라 프로브(40)의 중간에서도 초음파에 의한 진동이 발생되게 되지만, 본 발명의 일 실시예에 따르는 초음파 발생 부(30a)는 프로브(40)의 일 단(즉, 보조 부재(50)가 배치된 부분)에서만 초음파에 의한 진동이 집중적으로 발생되도록 할 수 있다. 초음파 발생 부(30a)에 포함된 진동자를 조절하여, 초음파 발생 부(30a)에서 프로브(40)의 일 단까지의 거리를 초음파의 한 파장 혹은 반(a half) 파장의 길이와 대응하도록 초음파 발생 부(30a)를 설정할 경우, 프로브(40)의 일 단에서만 초음파에 의한 진동이 발생되도록 할 수 있다. 지방세포들을 분리할 때, 프로브(40)가 일 단만 지방세포에 담기는 것이 아니라, 프로브(40)의 소정 길이만큼 지방세포에 담기게 되는데, 프로브(40)의 중간 부분에서 열이 발생되면 그 부분과 접촉하는 지방세포들이 손상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예의 위와 같은 특징은 지방세포들을 손상시키지 않고 세포벽이 살아있는 상태로 분리시키는 데에 도움을 줄 수 있다.
본 실시예에서 초음파 발생 부(30a)는 압전기를 예를 들어 설명하나 이에 한정되는 것을 아니다. 즉, 초음파 발생 부(30a)는 압전 방식 이외에 다른 방식으로 초음파를 발생하는 기기도 적용될 수 있다.
프로브(40)는 초음파 진동을 전달받아 진동하도록 베이스 부(30)에 구비되어 있다.
추가 실시예로서, 온도 센서 부(미도시)를 더 포함할 수 있으며, 온도 센서 부는 초음파 진동에 따라 프로브(40)의 상승하는 온도를 감지하도록 프로브(40)에 구비되어 있다.
추가 실시예로서, 연동 펌프 부(미도시)를 더 포함할 수 있으며, 연동 펌프 부는 베이스 부(30)와 냉각 호스(90)에 의해 연결됨과 동시에 냉각부(미도시)의 냉각수(A1)를 프로브(40)로 이송시켜 온도가 상승된 프로브(40)를 냉각시킬 수 있도록 세포 분리 장치(110)의 본체 부(미도시 됨)에 구비되어 있다.
냉각부는 연동 펌프 부와 냉각 호스(90)에 의해 연결됨과 동시에 냉각수(A1)를 공급하도록 되어 있다.
추가 실시예로서, 제어 부(미도시)를 더 포함할 수 있으며, 제어 부는 온도 센서 부(50)에서 감지된 신호를 인가 받아 기 설정된 온도에서 연동 펌프 부(60)를 구동시킬 수 있도록 되어 있다.
기 설정된 온도는 80 이상으로 이루어질 수 있다. 즉, 온도 센서 부는 프로브(40)의 온도를 감지하고, 감시된 신호를 제어 부(80)에 인가하고, 제어 부는 프로브(40)의 온도가 80 이상일 경우 연동 펌프 부를 작동시키고, 연동 펌프 부는 냉각수(A1)를 베이스 부(30)에 공급한다. 베이스 부(30)는 프로브(40)에 냉각수(A1)를 이송시켜 프로브(40)의 온도를 냉각시킬 수 있다.
또한, 베이스 부(30)의 일단에는 프로브(40)와 결합되는 프로브 결합부(31)가 구비되고, 베이스 부(30)의 타일 단에는 연동 펌프 부와 연결되도록 펌프 연결 부(32)가 구비되어 있다.
즉, 프로브 결합부(31)는 프로브(40)에 형성된 장착 부(41)와 결합되어 베이스 부(30)에 공급된 냉각수(A1)를 전달받는다. 펌프 연결 부(32)는 연동 펌프 부와 연결되어 냉각부의 냉각수(A1)를 베이스 부(30)내에 공급한다.
베이스 부(30)의 내부에는 프로브 결합부(31)와 펌프 연결 부(32)를 서로 연결시킴과 동시에 냉각수(A1)를 프로브(40)까지 이송시킬 수 있도록 냉각수 이송 로(33)가 구비되어 있다.
또한, 프로브(40)의 일단에는 프로브 결합부(31)에 장착되도록 장착 부(41)가 구비되어 있고, 프로브(40)의 타일 단에는 냉각수(A1)를 외부로 배출시킬 수 있도록 적어도 하나의 배출 홀(42)이 형성되어 있다.
즉, 프로브(40)는 베이스 부(30)에 공급되는 냉각수(A1)를 전달받아 이동시킴과 동시에 상승한 온도를 냉각시키고, 그 다음 냉각수(A1)를 배출 홀(42)들을 통해 프로브(40)의 외부로 배출시킨다.
프로브(40)의 내부에는 베이스 부(30)를 통해 유입된 냉각수(A1)를 이동시킬 수 있도록 냉각수 이동로(43)가 구비되어 있으므로, 프로브(40)의 내부로 유입된 냉각수(A1)는 냉각수 이동로(43)를 통해 이동함과 동시에 프로브(40)의 온도를 냉각시킨 후 배출홀(42)을 통해 프로브(40)의 외부로 배출된다.
냉각수(A1)는 식염수로 이루어질 수 있다. 본 실시예에서 냉각수(A1)는 식염수를 예를 들어 설명하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉 냉각수(A1)는 인체에 유해하거나 무해한 냉각수(A1)일 수 있다.
한편, 연동 펌프 부, 배출홀(42), 온도 센서 부, 냉각 부 등과 같은 프로브(40) 내에 냉각수(A1)를 공급하기 위한 구성은 세포 분리 장치의 필수 구성요소가 아닐 수도 있다.
또한, 저장 캡(100)은 지방 세포들을 담을 수 있고, 이 상태에서, 베이스 부와 결합됨과 동시에 프로브를 저장 캡(100)내에 삽입시켜 초음파 발생 부의 초음파 진동에 의해 저장 캡(100) 내의 지방 세포들을 분리시킬 수 있다.
앞서 언급한 도 1와 같이, 저장 캡(100)은, 원통형 몸체 부(101), 주입 구(102), 공기 통로(103) 및 배출구(104)를 포함할 수 있다.
원통형 몸체 부(101)내에는 지방 세포들을 담을 수 있다.
주입 구(102)는 지방 세포들을 원통형 몸체 부(101)내에 소정 분량만큼(예를 들어, 25cc) 주입하여 담도록 원통형 몸체 부(101)의 측면에 구비될 수 있다.
공기 통로(103)는 공기를 유입시키는 공기 유입구로서, 원통형 몸체 부(101)에 내부에 공기 순환을 용이하게 할 수 있도록 원통형 몸체 부(101)의 측면에 구비될 수 있다. 또는, 공기 통로(103)는 지방세포 분리를 원활하기 위한 약물이나 수분(water) 주입을 위한 기능을 수행할 수도 있다. 예를 들어, 지방세포 분리 과정 도중 저장 캡(100) 내의 물질이 뻑뻑하게 되는 순간이 발생될 수도 있다. 이때, 배출구(104)와 주입 구(102)는 튜브(108)를 통해 서로 연결되어 있기 때문에, 공기 통로(103)를 통하여 수분을 공급하여 그러한 문제를 해결할 수도 있다.
배출구(104)는 분리된 물질 혹은 저장 캡(100) 내의 물질을 외부로 배출시킬 수 있도록 원통형 몸체 부(101)의 하부에 구비되어 있다. 배출구(104)와 주입 구(102)는 튜브(108)로 서로 연결될 수 있다. 이 경우 배출구(104)와 주입 구(102)를 통해 원통형 몸체 부(101) 내의 물질들은 지속적으로 순환할 수 있다. 도 6을 참조하면, 튜브(108)는 순환펌프(107)와 연결될 수 있다. 순환펌프(107)에 의해 배출구(104)로 빠져나 온 물질이 배출구(104)보다 높은 위치에 있는 주입 구(102)로 전달될 수 있다. 만약 저장 캡(100) 내의 물질의 순환이 이루어지지 않을 경우, 프로브(40)의 초음파에 의한 진동이 발생되는 부분 근처에서만 지방세포 분리가 일어나게 되고, 그 외의 영역에서는 분리가 제대로 이루어지지 않을 수도 있다. 그러나, 튜브(108)와 순환펌프(107)에 의해 저장 캡(100) 내의 물질 순환이 이루어져 고르게 분리가 이루어질 수 있다.
초음파 발생 부의 초음파는 20KHz ~ 29 KHz 파장으로 이루어질 수 있다. 20KHz ~ 29 KHz 파장으로 갖는 초음파 발생 부는 버퍼(부스트)1~10 단계로 변환하면서 초음파의 진폭의 크기를 변화시켜 인체 유례 조직을 세포 단위로 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 지방 세포를 제외한 모든 세포의 손상 없이 지방 조직으로부터 세포 단위로 분리할 수 있다. 다시 말해, 기존의 효소(콜라겐아제)를 사용하지 않고 지방 조직으로부터 기질외혈관분획(SVF ; Stromal Vascular Fraction)을 분리할 수 있다.
도 3a 내지 도 3c를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따르는 라이브 지방줄기세포 분리장치를 이용하여 줄기세포분리를 수행하는 과정을 나타내는 사진을 확인할 수 있으며, 도 3c에 나타난 바와 같이 본 발명은 약20kHz의 주파수를 이용하여 줄기세포 분리를 수행하고 있는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 초음파 발생의 초음파를 사용하여 인체유례조직을 세포 단위로 분리하고, 지방 조직으로부터 세포를 분리하며, 지방 조직에서 지방 세포를 제외한 세포를 분리하고, 지방조직에서 기질외혈관분획(SVF)을 분리하며, 지방 조직에서 재생성세포 또는 줄기세포 또는 미성숙 전구 세포를 분리할 수 있다.
좀더 구체적으로 설명하면, 지방조직의 지방세포는 기질외혈관분획(SVF), 지방, 파이브로시스(fibrosis)(콜라겐 등과 같은 단백질 물질) 및 수분이 조직적으로 결합되어 있는 구조를 갖는다. 이때, 기질외혈관분획(SVF)은 지방줄기세포를 비롯한 다양한 세포들로 구성된다. 종래 기술의 경우, 기질외혈관분획과 콜라겐 등으로 이루어진 결합 조직에 기존 효소(콜라겐아제)를 사용하여 세포를 붙어 있도록 지탱해주는 콜라겐을 체온과 유사한 36.5도로 30분간 반응하여 녹여 주는 작업을 통해 세포 단위로 분리하는 과정을 갖는다. 이를 통해 지방줄기세포를 획득할 수 있다. 이에 본 발명은 초음파를 통해 지방 세포, 콜라겐을 파괴하여 세포 단위로 분해하는 과정을 통해 수 분만에 효율적으로 기질외혈관분획을 지방조직으로부터 획득하고, 이를 통해 지방줄기세포를 획득할 수 있다.
이 상태에서, 세포 분리 장치(110)의 조립 과정을 좀 더 구체적으로 설명하면, 먼저, 앞서 언급한 도 2과 같이, 베이스 부(30)에 프로브(40)를 결합한다. 베이스 부(30)의 일단에 구비된 프로브 결합 부(31)에 프로브(40)의 장착 부(41)를 결합한다. 세포 분리 장치의 본체 부(미도시 됨)는 본체 부의 초음파 신호를 베이스 부(30)에 인가하도록 전기적으로 연결된다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 녹은 세로를 원심 분리기를 이용하여 세포를 분리하는 상태를 나타내는 도면이다.
먼저, 저장 캡(100)의 원통형 몸체 부(101)의 측면에 형성된 주입 구(102)에 지방 세포를 25cc 주입한다.
이 상태에서, 세포 분리 장치(110)의 본체 부(미도시 됨)에 전류를 공급하고, 본체 부는 초음파 전기신호를 발생하고, 이 초음파 전기 신호는 베이스 부(30)에 구비된 초음파 발생 부(30a: 도 2에 도시됨)에 인가한다. 초음파 발생 부(30a: 도 2에 도시됨)는 압전 방식으로 초음파 진동을 발생하고, 초음파 진동은 프로브(40)에 전달함과 동시에 전후로 진동하게 된다. 프로브(40)의 전후 방향 초음파에 의한 진동으로 인해, 지방세포들이 분해될 수 있다. 이때, 프로브(40)의 일단에 초음파가 전달되고, 보조 부재(50)를 통하여 초음파에 의한 진동이 발생되며, 캐비테이션(cavitation) 과정이 수행되어 초음파 발생만으로 지방세포들로부터 지방줄기세포들(G2)을 분리시킬 수 있다. 보조 부재(50)에 대해서는 구체적으로 후술하도록 한다.
즉, 저장 캡(100)의 지방 세포는 초음파를 통해 지방, 콜라겐이 파괴되어 세포 단위로 분해될 수 있다. 다시 말해, 저장 캡(100) 내의 지방세포들은 초음파를 통해 수 분(예를 들어, 약 5분)만에 지방줄기세포로 분해될 수 있다. 이때, 주입 구(102) 부분에 설치된 필터(102a)는 파이브로시스(fibrosis)를 다른 물질로부터 분리할 수 있다. 파이브로시스는 지방 및 기질외혈관분획(SVF)을 가지(branch)와 같이 조직적으로 연결하는 것으로서, 지방줄기세포 추출에 있어 불필요한 물질이다. 그 후 원통형 몸체 부(101) 내에 남은 물질들을 별도로 채취하여 줄기세포 분리용 튜브에 옮길 수 있다. 이어서, 도 4와 같이 원심 분리기를 이용하여 밀도차 등의 원리를 통해 약 2분간 원심분리를 수행할 경우, 기질외혈관분획(SVF)을 포함하는 라이브 지방 줄기 세포(G2) 및 기타 세포(G1)로 분리할 수 있다. 원심 분리 과정을 통해 기질외혈관분획(SVF)을 포함하는 라이브 지방 줄기 세포(G2)가 가장 하단에 배치되며, 기타 세포들(G1)은 수분, 깨진 지방, 오일 등으로 구성될 수 있다.
그리고, 분리된 지방줄기세포를 주사기를 이용하여 추출할 경우, 대략 10분 혹은 그 이내에 지방 줄기 세포 분리를 완료할 수 잇다. 이와 같이 추출된 세포는 분리 키트(미도시 됨)에 넣어 세포 수를 측정한다. 즉, 셀카운터(미도시 됨)로 분리된 세포 수를 측정한다.
다시 말해, 세포와 콜라겐 결합 조직에서 기존 효소(콜라겐아제)를 사용하여 세포를 붙어 있도록 지탱해 주는 콜라겐을 체온과 유사한 36.5도로 30분간 반응하여 녹여 주는 작업을 통해 세포 단위로 분리하였으나. 본 발명은 초음파를 통해 지방 세포, 콜라겐을 파괴하여 세포 단위로 분해하는 과정을 통해 수 분만에 효율적으로 기질 외혈관분획을 지방 조직으로부터 획득할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르는 세포 분리 장치는, 베이스 부(30)의 구성 중 프로브(40)의 일 단에 보조 부재(50)를 포함할 수 있다. 보조 부재(50)는 프로브(40)보다는 작은 길이를 갖도록 형성된다. 보조 부재(50)는 프로브(40)의 일단에 장착될 때, 프로브(40)의 길이방향과는 다른 방향을 향하도록 장착될 수 있다. 예를 들어, 도10과 같이 프로브(40)의 길이방향과 수직이 되도록 장착될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
보조 부재(50)는 고체 물질로 이루어지며, 보조 부재(50)의 가장자리가 프로브(40)의 일 단으로부터 소정 거리만큼 이 격하도록 프로브(40)에 장착될 수 있다. 예를 들어, 보조 부재(50)는 도 5a 내지 도 5c와 같이 판(panel) 형으로 형성될 수 있으며, 판 형의 중심점과 프로브(40)의 일 단이 서로 결합될 수 있다. 이때, 보조 부재(50)의 가장자리들과 프로브(40)의 일 단이 이 격한 거리는 서로 동일할 수 있다. 또는, 보조 부재(50)는 복수의 막대들이 하나의 중심점에서 교차하는 형태로 형성될 수도 있으며, 막대들의 교차점과 프로브(40)의 일단이 서로 결합될 수 있다. 그 밖에, 보조 부재(50)는 프로브(40)의 일 단으로부터 이격 된 가장자리를 갖는 다양한 형상 및 면적으로 형성될 수 있다. 즉, 보조 부재(50)가 장착될 경우, 지방 조직의 세포들이 베이스 부(30)의 초음파의 영향을 받는 지점이 보조 부재(50)의 가장자리가 된다. 보조부재는 저장 캡(100) 내의 지방조직이 베이스 부(30)의 프로브(40)의 일단에서 직접적인 초음파 진동을 받지 않고 프로브(40)의 일단에서 조금 이격 된 위치에서 초음파 진동을 받도록 하는 역할을 수행할 수 있다.
보조 부재(50)는 초음파 주파수에 대한 인위적인 가변 저항 역할을 수행한다. 구체적으로, 베이스 부(30)가 프로브(40)의 일 단에서 x kHz의 주파수가 발생되도록 설계되어 있을 경우, 보조 부재(50)를 구성하는 고체 분자들은 초음파 발생 부에서 발생되어 프로브(40) 일 단까지 전파되어 오던 초음파에 대해 기존과 다른 매질 역할을 하게 될 수 있다. 다른 매질을 접함에 따라 흡수, 산란, 확산 중 적어도 하나의 과정을 거치게 되어, 일종의 초음파 주파수에 대한 저항 역할을 수행하게 될 수 있다. 그에 따라, 보조 부재(50)와 프로브(40)가 결합된 부분에서는 x kHz가 발생되지만 보조 부재(50)의 가장자리에서는 x - a kHz의 감쇠된 주파수가 발생될 수 있다.
지방줄기세포들의 세포벽이 깨지지 않는 상태로 줄기세포들을 분리하기 위해서는 적절한 주파수의 초음파 발생이 필요하다. 초음파는 사람이 들을 수 있는 가청주파수(20Hz - 20kHz)를 초과하는 대역의 주파수이므로, 초음파의 최저 주파수는 20kHz이다. 이에 따라, 종래의 초음파 발생기는 정해진 범위의 주파수 대역의 초음파만을 발생시킬 수 밖에 없으며 초음파 발생기를 구성하는 세라믹 소재의 특성상 일반적으로 20~30kHz 대역의 주파수를 최저 주파수로서 발생시킬 수 있다.
그러한 종래의 초음파는 너무 강하여 줄기세포의 세포벽뿐만 아니라 세포핵까지 부수게 된다. 30kHz를 초과하는 초음파에서는 살균 및 에멀젼(emulsion) 현상이 발생된다. 이때, 에멀젼 현상은 지방조직과 물이 섞여 줄기세포가 그 안에 갇히게 되는 현상을 의미한다. 화장품 물질들을 섞거나, 살균, 세척하는 기술들의 경우 높은 주파수 대역을 사용하는데, 세포는 물 분자보다 더 큰 입자로 구성되어 높은 주파수 대역에서는 살균/소독으로 인해 세포가 죽거나 에멀젼 현상으로 인해 분리되지 못하는 현상이 발생될 수 있다.
구체적으로, 초음파는 극히 높은 소리로 강력한 진동을 발생시키고, 그 진동은 물질을 뒤흔들게 되는데, 30kHz 이상의 초음파를 발생시키면, 초음파를 인가 받은 액체 내에서 공동현상(cavitation)이 발생된다. 공동현상은 작은 기포가 발생되고 터지게 되는 현상을 말한다. 이때, 발생되는 1000기압의 강력한 순간압력과 방전현상 때문에 초음파를 받은 물질은 기계적 작용을 받거나 화학변화를 일으켜 살균되거나 에멀젼 현상이 발생되는 것이다. 예를 들어, 박테리아는 초음파를 받으면 파괴되고, 고분자 등은 원자 간의 결합이 끊어지게 된다. 이러한 원리는 초음파 세척에 응용되고 있다.
그렇기 때문에, 종래의 의료용 초음파 발생장치는 세포분리용으로 사용되는 것이 아니라 지방세포 제거용으로 사용되어 오고 있다. 사람의 신체 내에 베이스 부(30) 형태의 기구를 다른 약물과 함께 주입하여 초음파를 발생시킬 경우, 지방세포를 분열시킬 수 있게 되는데, 이때 분열시킬 때는 지방세포의 세포벽이 살아있는지 죽어있는지 여부는 중요하지 않다. 어차피 분열된 지방세포를 흡입하여 신체 밖으로 빼내기 때문이다. 따라서, 종래의 줄기세포 분리 방법은 대부분 콜라겐아제(collagenase)와 같은 효소를 주입하여 지방줄기세포를 분리한다. 온전히 초음파 만으로 줄기세포를 분리하기에는 주파수가 너무 강하여 줄기세포가 살아남지 못하게 되기 때문이다. 혹은 종래의 초음파 장치는 지방세포들을 혼합하기 위한 용도로 초음파를 활용되며, 지방줄기세포를 얻기 위해서 결국 콜라겐아제 등의 효소가 사용될 수 밖에 없다.
그러나, 본 발명은 위 보조 부재(50)를 통하여 지방세포와 초음파가 직접 부딪히는 영역에서의 초음파 주파수를 우회적으로 줄임에 따라, 세포벽이 살아있는 상태의 지방줄기세포 분리를 위한 최적의 초음파 주파수를 설계할 수 있다. 구체적으로, 초음파의 최저 주파수보다 어느 정도 낮은 주파수를 갖는 음파를 발생시킬 수 있으며, 이는 순전히 음파에 의한 캐비테이션(cavitation)만으로 세포벽이 살아있는 지방줄기세포 분리를 가능하도록 한다. 예를 들어, 보조 부재(50)의 지방세포와 맞닿는 가장자리 영역은 가청주파수 대역의 음파가 발생될 수도 있다.
[실시예1]
베이스 부(30)를 이용하여 줄기세포 분리 실험을 수행하였다. 냉동 보관된 지방조직200cc를 36.5℃인큐베이터 수조에서 20분간 해동시킨다. 해동된 지방직에서 지방세포가 터져서 생기는 프리오일을 거즈를 사용하여 제거한다. 프리오일이 제거된 지방조직을 6개의 챔버에 각각 20cc씩 분리하여 담는다. 보조부재(50)을 장착한 베이스 부(30)를 이용한 발진자와 보조부재(50)가 없는 봉 타입(도2와 같은 끝이 뾰족한 팁부의 타입)의 일반 베이스 부(30)를 이용한 발진자에 각 3개의 시료를 사용하고 발진자 별 진동 출력(초음파 발생 부의 주파수 출력)을 20kHZ, 23kHz, 25kHz 3가지로 하여 초음파가 지방조직에 파동분리를 할 수 있도록 한다.
파동 분리의 시간은 챔버별5분으로 파동을 주고 분리된 세포수용액은 2,000rpm에서 3분간 원심분리하여 가장 비중이 높은 하부 세포 집적부(SVFs)를 채취한다. 채취된 세포 집적부에 생리식염수 10cc를 넣고 뭉쳐있는 세포를 풀어준다. 충분히 풀어준 세포는 PI염색방식의 유핵세포 계수기 ADAM-MC를 사용하여 세포의 생존율과 세포의 회수율을 비교한다.
그에 따라, 아래 표과 같은 실험결과를 확보하였다.
20 Khz 사용
발진자 세포생존율(%) 세포계수량(ea)
보조부재 포함 타입
(도 7a 참조)		 82 9.04 *10e5
일반 봉타입
(도 7b 참조)		 75 8.64 * 10e5
23Khz 사용
발진자 세포생존율(%) 세포계수량(ea)
보조부재 포함 타입
(도 8a 참조)		 78 1.50 *10e6
일반 봉타입
(도 8b 참조)		 73 8.69 * 10e5
25Khz 사용
발진자 세포생존율 (%) 세포계수량(ea)
보조부재 포함 타입
(도 9a 참조)		 89 2.38 *10e6
일반 봉타입
(도 9b 참조)		 65 1.76 * 10e6
보조부재(50)를 포함하는 타입과 일반 봉타입으로 세포분리 실험을 비교할 때, 보조부재(50)를 포함하는 타입으로 진행한 경우가 세포 생존율과 세포 회수량이 확연히 좋은 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
즉, 보조부재(50)를 포함하는 경우, 보조부재의 형상 및 구조로 인해 초음파를 부드러운 진동으로 전달시키며, 그에 따라 적절한 범위에서의 초음파 주파수의 감쇠효과가 발생되는데, 이러한 원리로 인해 세포 분리 시 세포가 죽지 않고 살아서 분리되도록 할 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명은 지방조직 분해를 촉진하는 효소나 약물을 주입하지 않고 온전히 초음파 발생만으로 지방조직을 세포벽이 깨어지지 않은 살아있는 상태의 줄기세포들로 분리할 수 있다. 이상에서 설명한 본 발명의 다양한 실시예의 지방 제거 장치와 세포 분리 장치는 전술한 실시 예 및 도면에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

Claims (14)

  1. 지방줄기세포 분리 장치에 있어서,
    초음파 발생 부를 구비한 베이스 부;
    상기 초음파 발생 부에서 발생된 초음파를 전달받아 진동하도록 상기 베이스 부에 구비되는 프로브; 및
    상기 초음파에 의한 진동이 발생되는 상기 프로브의 일 단에 장착되며 소정의 면적과 소정의 길이를 갖도록 구비되는 보조 부재를 포함하고,
    상기 보조 부재가 저장 캡 내의 지방세포들에 담겨진 후 상기 초음파 발생 부에 의해 초음파가 발생됨에 따라, 상기 보조 부재를 통하여 상기 초음파의 진동을 상기 지방세포들에 전달하여 초음파 기반으로 지방줄기세포들로 분해하며,
    상기 보조 부재는 판 형으로 형성되며, 상기 보조 부재의 중심점을 통하여 상기 프로브의 일 단에 장착됨에 따라, 상기 보조 부재의 가장자리는 상기 프로브의 일 단과 이격하되, 상기 보조 부재의 가장자리들과 상기 프로브의 일 단이 이 격한 거리가 동일하게 되도록 형성되며,
    상기 보조 부재의 가장자리에서 발생되는 진동에 의한 주파수는 상기 초음파 발생 부에서 발한 초음파의 주파수보다 낮은 것인, 지방줄기세포 분리 장치.

  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 보조 부재는 상기 초음파 발생 부에 의한 초음파의 진동이 발생되는 상기 프로브의 일 단으로부터 이격 된 위치에서 상기 지방세포들에 상기 진동을 전달하도록 형성되는 것인, 지방줄기세포 분리 장치.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 보조 부재의 가장자리에서 발생되는 진동에 의한 주파수는 사람의 가청주파수 영역에 해당하는 것인, 지방줄기세포 분리 장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방줄기세포 분리 장치는 상기 저장 캡에 지방조직을 분해를 촉진하는 효소가 주입되지 않은 상태에서 초음파 발생만으로 상기 지방세포들로부터 지방줄기세포들을 획득하는 것인, 지방줄기세포 분리 장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로브 및 보조 부재가 내부에 배치되도록 상기 베이스 부와 결합되며 지방세포들을 내부에 담는 저장 캡을 더 포함하는, 지방줄기세포 분리 장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 저장 캡은, 상단 부에 상기 베이스 부와 결합되는 개구 부를 포함하는 원통형 몸체 부;
    상기 원통형 몸체 부의 측면에 구비되어 상기 원통형 몸체 부 내로 상기 지방세포들을 주입하는 주 입구; 및
    상기 원통형 몸체 부의 하부에 구비되어 분리된 물질들을 배출시키는 배출구를 포함하는 지방줄기세포 분리 장치.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 주 입구와 배출구는
    상기 저장 캡 내의 물질이 순환되도록 튜브를 통하여 서로 연결되는 것인, 지방줄기세포 분리 장치.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 배출구에서 배출된 물질이 상기 튜브를 거쳐 상기 주입 구로 전달되도록 펌핑을 수행하는 순환 펌프를 더 포함하는, 지방줄기세포 분리 장치.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 저장 캡은,
    상기 주 입구에 배치되어, 지방세포를 구성하는 파이브로시스를 걸러내는 필터를 더 포함하는, 지방줄기세포 분리 장치.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 저장 캡은,
    상기 저장 캡 내의 물질의 세포 분리 과정 중 필요에 따라 선택적으로 다른 물질의 주입이 가능하도록 구비된 공기 유입 구를 더 포함하는, 지방줄기세포 분리 장치.
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