KR20180056275A

KR20180056275A - Cd200 유전자를 이용한 면역 조절제 또는 이의 용도

Info

Publication number: KR20180056275A
Application number: KR1020160154347A
Authority: KR
Inventors: 김유진; 김혜정; 김경운
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-05-28

Abstract

본 발명은 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제에 관한 것으로, 구체적으로 상기 면역 조절제는 면역조절 관련 세포 증식억제, 염증반응의 조절, 또는 면역관련 질환의 예방 또는 치료하는 효과를 가지고 있어서, 상기 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 하는 조성물을 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용이 가능하다.

Description

CD200 유전자를 이용한 면역 조절제 또는 이의 용도 {Immunomodulator using CD200 gene and use thereof}

본 발명은 CD200 유전자 또는 단백질을 이용한 면역 조절제에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제로서, 면역조절 관련 세포 증식억제, 염증반응의 조절, 또는 면역관련 질환의 예방 또는 치료하는 효과를 가지고 있다.

현재까지 많은 화합물을 이용한 면역억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며, 상기 사이클로스포린에이가 급성 이식편대숙주병을 포함하여 자가면역질환, 장기이식거부반응, 다양한 염증질환을 치료하는 용도로 널리 쓰이고 있다. 사이클로스포린에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나 독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 단점을 가지고 있어, 저용량으로 사용하는 것을 권장하고 있다.

한편, 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 지방세포, 뼈세포 및 연골세포와 같은 여러 세포계통으로 분화할 수 있는 골수를 포함하는 전신에 존재하는 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 인간, 마우스, 쥐, 개, 염소, 토끼 및 고양이를 포함하는 다수의 종으로부터 분리되었다. 최근 간엽줄기세포가 in vitro 및 in vivo에서 여러 T 림프구 활성을 억제하여 면역조절능력을 발휘한다는 보고가 있어 이를 이용하여 면역질환을 치료하려는 연구가 시도되고 있다.

대한민국 공개특허공보 제2008-0078204호에는 수지상세포 (DC)를 중간엽 줄기세포와 공동 배양할 경우, 수지상세포의 면역억제효과가 현저하게 증가한다는 것을 발견함으로써 이를 면역억제제의 용도로 사용할 수 있다는 내용이 개시되어 있다.

그러나, 중간엽 줄기세포를 이용하여 면역관련 질환을 치료하는 기술에 대해서는 아직 많은 기술들이 개발되어 있지 않은 상태이며, 보다 효과적인 치료 효과와 체내 안전성을 도모할 수 있는 새로운 기술들의 개발이 요구되어 있는 실정이다.

CD200은 42-47 kDa 크기의 세포표면 glycoprotein이며 B 세포, T 세포, DC 세포 (Dendritic cell)와 같은 다양한 세포에서 발현하며, CD200은 염증, 종양, 면역시스템에서 매우 중요한 면역조절인자임이 알려져 있다.

현재까지 CD200 유전자가 주입된 중간엽 줄기세포를 이용하여 면역조절을 하는 기술에 관해서는 종래에 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 이용하여 보다 효과적으로 자가면역 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 연구하던 중, CD200 유전자가 주입된 중간엽 줄기세포를 Th17 세포와 함께 배양할 경우 자가면역 질환에서 중요한 Th17 세포의 증식이 현저하게 감소하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 본 발명의 목적은 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역 조절제를 유효성분으로하는 중간엽 줄기세포를 골 조직 세포로 계통분화시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 중간엽 줄기세포에 주입하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 골 조직 세포로 계통분화시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입된 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 개발하였다.

일 구현예로, 본 발명은 면역억제인자 CD200 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입된 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 제공한다.

본 발명에서, CD200 단백질을 코딩 핵산분자는 CD200 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 mRNA 서열을 의미할 수 있다.

상기 "면역억제인자"는 면역반응을 억제하는 인자로서 방사선조사, 중추성 임파조직 제거, 핵산 및 단백합성 저해제, 과잉항원 또는 항체투여, 항임파구혈청, 항생물질, 부신피질홀몬제, 이행항체의 전달부전, 진균, 세균, 바이러스, 원충 등 감염, 중독, 영양장해 등 내인자로서의 악성종양, 노화 등에 의하여 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따른 면역 조절제는 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입되어, CD200 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함한다.

상기 CD200 단백질은 42-47 kDa 크기의 세포표면 glycoprotein으로서, B 세포, T 세포, DC 세포 (Dendritic cell)와 같은 다양한 세포에서 발현하며, CD200 단백질은 T 세포 증식을 촉진하는 공동 촉진제로 작용하는 역할을 하며, 염증, 종양, 면역시스템에서 매우 중요한 면역조절인자임이 알려져 있다.

상기 CD200 단백질은 인간 (Homo sapiens) 등을 포함하는 영장류, 마우스(Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류, 개구리 (Xenopus laevis) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, C7은 인간 C7 (예컨대, NP_001004196.2. (유전자:　NM_001004196.3.)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 상기 CD200 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 중간엽 줄기 세포는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포의 한 종류로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 성체 줄기세포 중 조혈모세포는 주로 부유상태(non-adherent)로 존재하지만 중간엽 줄기 세포는 주로 부착성 세포들이다. 일 예에서, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 중간엽 줄기 세포는 포유류, 예컨대 인간 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 적용되는 대상으로부터 유래하는 중간엽 줄기 세포 (자가 유래 중간엽 줄기세포), 또는 적용되는 대상과 동종 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.

중간엽 줄기세포는 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하지만, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며 (예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있으며), 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해 분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다.

중간엽 줄기세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 중간엽 줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계 (상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다.); (2) 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 (3) 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.

상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청 (예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제 (예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일례는 CD200 단백질을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 상기 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 중간엽 줄기세포에 도입하여, CD200 단백질을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 제작할 수 있다.

생체 내에서 또는 생체 외부에서 배양되어 존재하는 중간엽 줄기세포에는 내생적으로 (endogenously) CD200 단백질을 발현하거나 발현하지 않을 수 있다.

상기 CD200 단백질을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 유효 성분으로 포함하는면역 조절제는 면역조절 관련 세포 증식억제, 염증반응의 조절, 또는 면역관련 질환의 예방 또는 치료하는 용도로 사용이 가능할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일례에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 세포에 도입된 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 면역조절 관련 세포와 배양할 경우, 예컨대 Th17 세포와 배양할 경우 Th17의 증식이 억제될 수 있고, 또한 상기 중간엽 줄기세포가 발현하는 항염증성 인자인 IDO, foxp3 및 IL-10로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 단백질의 발현이 증가하거나, 상기 중간엽 줄기세포가 발현하는 염증성 인자인 IL-6 및 IL-8 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 단백질의 발현이 감소할 수 있고, 이로써 염증반응을 감소시킬 수 있다.

본 발명에서는 상기 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터를 중간엽 줄기세포에 도입하여, CD200 단백질을 과발현하는 중간엽 줄기세포를 제작할 수 있다.

상기 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터는 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나, 리포좀 (Liposome), 양이온성 고분자 (Cationic polymer), 또는 microporator 등을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성될 수 있다.

또한, CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질 전환 및 감염시켜 CD200 단백질을 발현하도록 제작한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터)에 포함되어 체세포 내로 주입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용될 수 있는 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 CD200 단백질을 코딩 핵산분자는 CD200 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 mRNA 서열을 의미할 수 있다.

본 발명에서 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 벡터 시스템은 특정 세포에 관련된 유전자를 체세포에서 과발현시켜 직접교차분화를 유도하는 목적을 위해 사용하는 것으로서 어떠한 벡터 시스템을 사용하더라도 본 발명의 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 상기의 방법으로 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포는 일반적으로 줄기세포를 배양하는 방법을 사용하여 배양할 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법이 제한되어 있는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 따른 상기의 방법으로 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및/또는 배양될 수 있다.

적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.

상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다. 그러나 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 조직 기원 유래 줄기세포에 가장 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다.

또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 상기의 중간엽 줄기세포에 대하여적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.

본 발명은 상기와 같은 방법으로 제작한 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공한다.

상기 "면역 조절제 "란 면역요법에 사용하는 치료제이며, 생체가 항진한 면역응답능은 억제하고, 저하한 면역응답능은 부활증강하여 정상적인 면역응답능에는 아무런 영향을 주지 않는 작용을 하는 치료약제를 의미한다. 면역조절제는 크게　생물학적 물질과 합성화학약제로 분류한다. 기초실험성적을 보면　면역담당세포의 기능에는 증강적으로 작용함과 동시에 세포의 분화에도 증강, 촉진적으로 작용한다. 또한, 면역 조절제는 생체의 면역반응을 억제시키거나, 활성시키는 역할을 하며, 면역계통의 활성을 억제시키는 것을 면역 억제제라고 하고, 질병을 일으키는 특정원인에 대해 공격을 하게 유발하는 것을 면역 활성제라고 한다.

본 발명에 따른 면역 조절제는 면역조절 관련 세포 증식억제, 염증반응의 조절, 또는 면역관련 질환의 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.

또한, 본 발명은 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 포함하는 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성 성분에 의해 야기, 또는 매개된 포유류의 병리상태이다. 면역 반응의 자극 또는 중단으로 인한 질환을 포함할 수 있는데, 본원은 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환 예를 들면, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 (transplantation rejection)반응을 포함한다.

상기 면역관련 질환은 자가면역 질환, 이식편대숙주병, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가 면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어 "자가면역 질환"이란 자기관용의 유도 또는 계속적 유지에 문제가 발생하여, 자기항원에 대한 면역반응이 일어나고, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다.

본 발명에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 포함하는 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 자가 면역 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

상기 자가면역 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군 (Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군 (Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가 면역 뇌수막염, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 심상천포창, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 점액수종, 악성빈혈, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 및/또는 이식거부질환 이 포함될 수 있으며, 상기 이식거부 질환에는 인슐린 의존성 당뇨병, 크론병, 다발성 경화증, 피부경화증, 중증근육무력증, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군 및 전신홍반루푸스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 상기 중간엽 줄기세포는 골 조직 세포는 골세포 또는 연골세포로 계통분화하여 류마티스 관절염을 치료 용도로 사용될 수 있다.

본 발명은 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 포함하는 면역조절 관련 세포 증식억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제는 면역조절 관련 세포 증식억제 효과가 있을 수 있다.

본 발명에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 세포에 주입된 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 면역조절 관련 세포와 배양할 경우 면역조절 관련 세포의 증식이 억제될 수 있고, 예컨대 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 세포에 주입된 중간엽 줄기세포 또는 그 배양물을 Th17 세포와 배양할 경우 Th17 세포의 증식이 억제될 수 있다.

상기 면역조절 관련 세포는 Th17 세포, Th0세포, 및 Th1세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 구현예로, 본 발명은 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제를 포함하는 염증반응 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제는 염증 반응 조절 효과가 있을 수 있으며, 상기 염증 반응 조절 효과는 항염 관련 인자의 발현을 증가시키고, 염증 유발 관련 인자의 발현을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 항염 관련 인자는 IDO, foxp3 또는 IL-10의 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 염증 유발 관련 인자는 IL-6 또는 IL-8의 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역조절 관련 세포에서 분비되는 TNF-?(tumor necrosis factor-?), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

본 명세서에서 제공되는 유효성분 (CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포) 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 다양한 투여 경로로 투여 대상에게 투여될 수 있으며, 예컨대, 투여 대상의 병변 부위에 주입 또는 이식되거나, 혈관투여 (정맥투여 또는 동맥투여), 피하투여 등의 비경구 투여 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물, 예컨대, 류마티스 관절염 등의 자가면역 질환을 앓고 있는 포유동물 (e.g., 인간), 및/또는 상기 동물에서 유래한 (분리된) 조직, 세포 또는 이들의 배양물 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 제공되는 면역관련 질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물 또는 인간을 제외한 포유 동물일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화 된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예컨대 타입 I 당뇨병에 적용되는 경우, 복강투여가 가장 바람직하고, 이는 투여된 수지상세포가 희석되지 않고 효과적으로 췌장으로 이동할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물이 관절염 환자에 적용되는 경우에는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만, 가장 바람직하게는 국부적으로 관절내 주입으로 투여된다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³- 1 x 10¹²세포/kg 이다.

발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

다른 구현예로, 본 발명은 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 주입된 중간엽 줄기세포를 포함하는 중간엽 줄기세포를 골 조직 세포로 계통분화시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에서 골조직은 뼈를 형성하는 조직을 일컫는 용어로서, 골조직은 특수화한 섬유성　결합조직이고　골세포와 그 사이를 차지하는 풍부한　세포간질로 이루어져 있다

상기 "계통"은 공통된 조상과 유전자형이 같은 개체군을 의미하는 것이며, 보통　실험생물 중에서 공통 조상에서 유래하고 일정한 형질을 보유하면서 세대를 쌓아가는 개체군을 말한다.　 상기 "분화"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상. 즉　생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 즉, "계통분화"는 어떤 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되어 공통된 조상과 유전자형이 같은 개체군으로 형태나 기능이 변해가는 것을 의미할 수 있다.

상기 골 조직 세포는 골세포 (Osteocyte) 또는 연골세포 (Chondrocyte)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 구현예로, 본 발명은 면역억제인자 CD200 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 주입된 벡터를 중간엽 줄기세포에 주입하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 골 조직 세포로 계통분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 면역억제인자 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자가 도입된 벡터가 도입된 중간엽 줄기세포는 골 조직 세포는 골세포 또는 연골세포로 계통분화하여 류마티스 관절염을 치료 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 CD200 유전자를 중간엽 줄기세포내로 주입시킨 후 PCR과 western blotting을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 따라 CD200 유전자를 중간엽 줄기세포내로 주입시킨 후 real-time PCR을 수행하여 IDO 및 IL-10의 발현을 확인한 것을 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 본 발명의 실시예에 따라 CD200 유전자를 중간엽 줄기세포내로 주입시킨 후 osteogenesis를 유도한 세포에 대하여 real-time PCR, ALP 검사, western blotting을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 4은 본 발명의 본 발명의 실시예에 따라 CD200 유전자를 중간엽 줄기세포내로 주입시킨 후 chondrogenesis를 유도한 세포에 대하여 real-time PCR, 면역조직화학 분석, western blotting을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라 말초혈액 단핵세포를 염증성 Th17 세포 분화조건으로 자극 후 중간엽 줄기세포만 또는 CD200 유전자가 주입된 중간엽 줄기세포를 3일간 공조배양한 후 혈액세포내의 염증관여 Th17 세포의 증식 변화를 mixed lymphocytes reaction 방법을 통해 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 CD200 유전자를 중간엽 줄기세포내로 주입시킨 후 배양 상층액에서 염증성 (IL-6, IL-8) 사이토카인의 발현 변화를 ELISA 방법으로 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 CD200 유전자를 중간엽 줄기세포내로 주입시킨 후 배양 상층액에서 항염증성 인자 (IL-10, foxp3, 및 IDO)의 발현 변화를 ELISA 방법으로 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CD200 유전자의 중간엽 줄기세포에 도입

CD200의 유전자를 임상 환경에서 보다 안전하게 도입하기 위하여 비바이럴 벡터를 사용하여 하기와 같은 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에 효과적으로 유전자를 이입하였다.

비바이럴 벡터인 pEGF-C1 (clontech, Catalog #6084-1)에 CD200을 클로닝 한 후, 서열분석을 하여 CD200의 벡터에 삽입되었는지를 확인하고, 해당 벡터를 microporator (Invitrogen)를 이용하여 중간엽 줄기세포 (가톨릭세포치료사업단으로부터 구입)내로 주입시킨 후, 중간엽 줄기세포를 DMEM/F12(Gibco)에 10%FBS와 antibiotics를 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소, 습도 95% 배양기에 배양하였다. CD200 유전자를 주입한 중간엽 줄기세포에 대하여 CD200 유전자의 과발현을 확인하기 위해서 PCR 및 항-CD200 항체 (Human CD200 antibody (R&D system, USA))를 이용한 western blotting을 수행하여 유전자 발현 및 단백질 발현 수준을 각각 확인하였다 (도 1 A, B). PCR에 사용된 프라이머 염기서열은 하기 표 1에 나타나 있다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호
CD200_f	atggagaggctggtgatcaggatg	1
CD200_r	tagggctctcggtcctgattc	2

그 결과, 도 1 A, B에서 나타난 바와 같이, 비바이럴 벡터인 pEGF-C1를 사용하여 중간엽 줄기세포에 CD200 유전자를 주입했을 때 유전자 및 단백질의 과발현이 일어남을 확인할 수 있었다.

실시예 2. CD200이 도입된 중간엽 줄기세포에서 면역조절 기전의 변화

CD200의 중간엽 줄기세포에서의 과발현에 의한 면역조절 기전의 변화를 살펴보기 위해서, 실시예 1과 동일한 방법으로 CD200을 중간엽 줄기세포에 주입한 후에, 면역조전 기전에 관여하는 인자의 발현의 변화 (IDO, IL-1O)를 real-time PCR을 사용하여 확인하였다.

Real-time PCR을 위해 SYBR Green I (Roche Diagnostic, Mannheim,Germany)를 사용하였으며, Light Cycler instrument (Roche Diagnostic)로 분석하였다. Real-time PCR에 사용된 프라이머 염기서열은 하기 표 2에 나타나 있다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호
IDO_f	ACAGCGCCTTGCACGTCTA	3
IDO_r	GACCTTACGGACATCTCCAT	4
IL-10_f	CCAAGCCTTGTCTGAGATGA	5
IL-10_r	TGAGGGTCTTCAGGTTCTCC	6
b-actin-f	GAAATCGTGCGTGACATCAAAG	7
b-actin_r	TGTAGTTTCATGGATGCCACAG	8

그 결과, 도 2에서 나타난 것과 같이 CD200이 주입된 중간엽 줄기세포에서 면역조절 관련 기전에 관여하는 IDO와 IL-10의 발현이 CD200을 주입하지 않은 대조구 중간엽 줄기세포에서의 IDO와 IL-10의 발현에 비해서 각각 약 40배, 30배 증가하였다.

실시예 3. CD200이 주입된 중간엽 줄기세포에서 계열 분화의 확인

CD200의 과발현에 의해서 세포의 계열분화가 어떤 영향을 받는지 확인하기 위해서, 실시예 1에서 제작한 CD200을 주입한 중간엽 줄기세포에 대하여 osteogenesis와 chondrogenesis를 유도하였다. 중간엽 줄기세포에 대하여 osteogenesis 또는 chondrogenesis를 유도하는 방법은 하기와 같다.

중간엽 줄기세포에 골분화 유도 (osteogenesis)를 위해 골분화 유도 배지를 처리하여 14일 동안 골분화를 유도한다. 골분화 유도 배지의 조성은 다음과 같다; DMEM 10% with MSC-FBS, 10⁷ M dexamethasone, 10 mM b-glycerophosphate, and 0.3mM ascorbic acid.

연골 분화 (chondrogenesis)를 유도하기 위해서 중간엽 줄기세포를 5 X 10⁵으로 15 mL 튜브에 각각 분주한 후, 연골 분화 배지 (DMEM/F12 supplemented with 1% ITS (Gibco BRL, Green Island, N.Y., USA), 10-7M dexamethasone, 50 uM ascorbate-2-phosphate, 50 uML-proline and 1 mM sodium pyruvate)에 부유시킨 후 200 g로 30분간 centrifuge하여 21일동안 배양하였다.

Osteogenesis를 유도한 후에 CD200 유전자의 mRNA 발현을 확인하기 위해서 real-time PCR을 실시예 2와 같은 방법으로 수행하였고 그 결과는 도 3의 A에 나타나 있다. Real-time PCR에 사용된 프라이머 염기서열은 하기 표 3에 나타나 있다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호
CD200R_f	tggagaggctggtgatcagg	9
CD200R_r	catcctgggtcaccacttgc	10

상기 CD200를 도입한 중간엽 줄기세포에 대하여 osteogenesis를 유도한 후에,골세포 (Osteocyte)로 분화되었는지 여부를 확인하기 위해서 골세포 분화인자인 Runx-2의 발현을 western blot을 통해 확인하고 (도 3의 B), 알칼리성 인산가수분해효소 농도 검사 (Alkaline phosphatase, ALP)를 수행하였다. ALP염색은 세포를 4%의 파라포름알데하이드로 고정하고 ALP를 처리하여 암실에서 1hr정도 처리한 후 수세하여 현미경으로 관측하였다 (도 3의 C).

또한, Chondrogenesis를 유도한 후에 CD200 유전자의 mRNA 발현을 확인하기 위해서 real-time PCR을 실시예 2와 같은 방법으로 수행하였고 그 결과는 도 4 A에 나타나 있다. Real-time PCR에 사용된 프라이머 염기서열은 상기의 서열번호 9 및 서열번호 10이다.

상기 CD200를 도입한 중간엽 줄기세포에 대하여 chondrogenesis를 유도한 후에, 연골세포 (chondrocyte)로 분화되었는지 여부를 확인하기 위해서 연골세포 분화인자인 COL II의 발현을 western blot을 통해 확인하고 (도 4 B), 알칼리성 면역조직화학 분석을 수행하였다. 알칼리성 면역 조직화학 분서은 상기 CD200를 도입한 중간엽 줄기세포에 대하여 chondrogenesis를 유도한 후의 펠렛을 파라포름알데하이드에 고정하여 파라핀 블록으로 고정하고 슬라이드로 제작한 후, type II collagen antibody (Millipore, MAB8887)로 염색하여 확인하였다 (도 4 C).

그 결과, 도 3 및 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이, CD200의 과발현된 중간엽 줄기세포에 대하여 osteogenesis와 chondrogenesis를 유도했을 때, 대조구인 중간엽 줄기세포에 대하여 osteogenesis와 chondrogenesis를 유도했을 때와 비교하여 각각 골 분화 및 연골 분화가 촉진됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4. CD200이 도입된 중간엽 줄기세포에 의한 염증성 T세포인 Th17의 증식 억제

건강한 성인 말초 혈액 단핵세포에 대하여 CD200 유전자를 도입한 중간엽 줄기세포의 처리에 의한 면역조절 능력의 변화를 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

건강한 성인으로부터 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 혈액을 PBS (Phosphate-Buffered Saline)와 1:1로 섞어 Ficoll과 혈액+PBS을 1:4의 비율로 Ficoll층이 흐트러지지 않게 50 ml 튜브에 천천히 띠운 다음 혈액을 2000 rpm, 30분간 원심 분리하였다. Buffy coat층만을 따서 새 튜브에 담은 후 PBS로 세척하고 CD4+ T cell을 분리하기 위해 monoclonal anti-humanCD4 antibody가 붙어있는 microbeads (MicroBeads;Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 분리 후 세포 수를 세어 5 X 10⁵개씩을 48 well plate (NUNC, Denmark)에 배양하였다. Th17 세포 분화조건 (anti-CD3 1 ug/ml, anti-CD28 1 ug/ml, IL-1b 20 ng/ml, IL-6 20ng/ml, IL-23 20ng/ml, anti-IL-4 2ug/ml, anti-IFN-r 2ug/ml)으로 48시간 배양 후 12시간 전에 3H-thymidine처리하여 Thymidine Incorporation assay (PerkinElmer Life Sciences, USA) 방법으로 동위원소측정을 counts per minute (cpm)로 나타냈다.

염증성 Th17 세포 분화조건으로 자극 후 중간엽 줄기세포만 또는 CD200 주입된 중간엽 줄기세포를 3일간 공조배양한 후 혈액세포내의 염증관여 Th17 세포의 증식 변화를 mixed lymphocytes reaction 방법을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 것과 같이, Th17 분화 조건과 비교하여 중간엽 줄기세포만 공조배양한 조건에서 배양했을 때 Th17세포 증식이 억제되는 것에 비해서 Th17 분화 조건과 비교하여 CD200 주입된 중간엽 줄기세포와 공조배양했을 때 약 1.5배 Th17세포의 증식이 보다 억제되었다. (**P<0.01 vs. T cell, ##P<0.01 vs. Th17 condition).

실시예 5. CD200 주입된 중간엽 줄기세포에서 염증성, 및 항염증성 인자의 발현 변화

5-1. 염증성 사이토카인 발현 변화

상기 실시예 4에서 수행한 실험의 세포 배양액에서 sandwich ELISA를 다음과 같은 방법으로 수행하여 IL-6, IL-8의 농도를 측정하였다.

Sandwich ELISA용 96 well plate (NUNC, Denmark)에 단클론성 IL-6, IL-8 항체(R&D, USA)를 각각 4 ug/mL로 50 ul/well씩 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 차단용액 (1% (w/v) BSA/PBST)를 200 ul/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 표준시료는 재조합 IL-6, IL-8 (R&D, USA)를 이용 하여 각각 5 ng/mL~78 pg/mL 농도를 사용했다. 표준시료와 함께 측정할 분리한 환자 혈청을 50 ul/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응용기를 세척용액(0.05% (v/v) Tween 20/PBS)으로 4번 세척하고 biotinylated IL-6, IL-8 (R&D, USA) 항체 (R&D, USA)를 200 ng/mL로 희석하여 50 ul/well씩 넣어 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척용액으로 4번 세척했다. 마지막으로는 Extravidin-Alkaline phosphatase conjugate (SIGMA, USA)를 1：2,000으로 희석하여 50 ul/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고 세척 후 phosphate disodium salt hexahydrate (PNPP, Fluka)/Diethanolamine 용액 (DEA, 97Ml, NaN3 0.2 g, MgCl2H2O 0.1 g, 1차 증류수 800 ml)을 1 mg/ml 농도로 녹여 50 ul/well씩 넣어 30분 후 0.2 M NaOH로 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 6에서 나타난 것과 같이 CD200 주입된 중간엽 줄기세포 및 대조군인 중간엽 줄기세포의 배양 상층액에서 염증성 (IL-6, IL-8) 사이토카인의 발현 변화를 ELISA 방법으로 확인한 결과, CD200 주입된 중간엽 줄기세포에서 염증성 사이토카인 (IL-6, IL-8) 생성이 각각 2.5배, 3.6배로 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.

5-2. 항염증성 인자의 발현 변화

상기 실시예 4에서 수행한 실험의 세포 배양액에서 항염증성 (IL-10, foxp3, IDO) 유전자의 발현 변화를 real-time PCR을 통해 분석하였다.

CD200 주입된 중간엽 줄기세포와 그 대조군인 중간엽 줄기세포에서 항염증성 유전자 (IL-10, foxp3, IDO) 의 변화는 실시예 2와 같은 방법으로 real-time PCR을 수행하였다. Real-tiem PCR을 수행하기 위해 사용된 primer 서열은 상기의 표 2 및하기의 표 4과 같다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호
Foxp3_f	CACTGCCCCTAGTCATGGT	11
Foxp3_r	GGAGGAGTGCCTGTAAGTGG	12

그 결과, 도 7에서 나타난 것과 같이 CD200 주입된 중간엽 줄기세포에서 항염증성 인자인 IL-10, foxp3, 및 IDO 발현이 대조군인 중간엽 줄기세포의 경우보다 각각 2배, 2.5배, 및 2배 증가되어 있음을 확인하였다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Immunomodulator using CD200 gene and use thereof <130> DPP20163829KR <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD200_f <400> 1 ggaggagtgc ctgtaagtgg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD200_r <400> 2 tagggctctc ggtcctgatt c 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO_f <400> 3 acagcgcctt gcacgtcta 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO_r <400> 4 gaccttacgg acatctccat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10_f <400> 5 ccaagccttg tctgagatga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10_r <400> 6 tgagggtctt caggttctcc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin-f <400> 7 gaaatcgtgc gtgacatcaa ag 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin-r <400> 8 tgtagtttca tggatgccac ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD200R_f <400> 9 tggagaggct ggtgatcagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD200R_r <400> 10 catcctgggt caccacttgc 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3_f <400> 11 cactgcccct agtcatggt 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> roxp3_f <400> 12 ggaggagtgc ctgtaagtgg 20 <210> 13 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Glu Arg Leu Thr Leu Thr Arg Thr Ile Gly Gly Pro Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Thr Leu Leu Gly Lys Thr Thr Ile Asn Asp Tyr Gln Val Ile Arg 20 25 30 Met Pro Phe Ser His Leu Ser Thr Tyr Ser Leu Val Trp Val Met Ala 35 40 45 Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val Gln Val Val Thr Gln Asp Glu 50 55 60 Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn 65 70 75 80 Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser 85 90 95 Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu Asn His Gly Val Val Ile Gln 100 105 110 Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn 115 120 125 Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr 130 135 140 Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala 145 150 155 160 Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile Val Ser Leu His Tyr Lys Phe 165 170 175 Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala 180 185 190 Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr 195 200 205 Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu 210 215 220 His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln 225 230 235 240 Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys 245 250 255 Gly Tyr Trp Phe Ser Val Pro Leu Leu Leu Ser Ile Val Ser Leu Val 260 265 270 Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu Leu Tyr Trp Lys Arg His Arg 275 280 285 Asn Gln Asp Arg Glu Pro 290

Claims

CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 면역 조절제.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입되어 CD200 단백질 발현이 증가한 것인, 면역 조절제
제1항에 있어서, 상기 CD200 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것인, 면역 조절제.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 면역 조절제.
제1항에 있어서, 상기 면역 조절제는 면역조절 관련 세포의 증식억제, 염증반응의 조절, 또는 면역관련 질환의 예방 또는 치료하는 것인, 면역 조절제.
제5항에 있어서, 상기 면역조절 관련 세포 증식억제는 Th17 세포, Th0세포, 및 Th1세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 면역조절 관련 세포의 증식을 억제하는 것인, 면역 조절제.
제5항에 있어서, 상기 염증반응의 조절은 IL-10, foxp3, 및 IDO으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항염증 인자의 발현을 증가시키는 것인, 면역 조절제.
제5항에 있어서, 상기 염증반응의 조절은 IL-6, 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염증인자의 발현을 감소시키는 것인, 면역 조절제.
제5항에 있어서, 상기 면역관련 질환은 자가면역 질환, 이식편대숙주병, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가 면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 면역 조절제.
제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군 (Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군 (Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가 면역 뇌수막염, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 심상천포창, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 점액수종, 악성빈혈, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 면역 조절제.
CD200 단백질을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 도입한 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제11항에 있어서, 상기 면역관련 질환은 자가면역 질환, 이식편대숙주병, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가 면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군 (Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군 (Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가 면역 뇌수막염, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 심상천포창, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 점액수종, 악성빈혈, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 또는 이식거부질환인, 약학 조성물.
제11항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골 조직 세포는 골세포 또는 연골세포로 계통분화하여 류마티스 관절염을 치료하는 것인, 약학 조성물.
제11항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 약학 조성물.