KR20180055831A - 폴리알콕시 지방족 화합물 - Google Patents

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Abstract

하기 구조식 (I)을 갖는 폴리알콕시 지방족 화합물이 제공된다:
Figure pct00023
(I)
상기 식에서, R1은 지방족 기이고; R2는 H 또는 치환된 또는 비치환된 하이드로카빌기이고; n은 0 내지 5이고; X1은 S 또는 NH이고; X2는 O, S 또는 NH이고; R3은 하기 구조식 (II) 및 구조식 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기이다:

Description

폴리알콕시 지방족 화합물
종종 단백질의 수용액을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 수용액은 장시간 안정한 상태로 유지되는 것이 바람직하다. 안정성의 부족은 예를 들어 단백질의 변성 또는 단백질 분자의 응집 과정 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
미국 특허 제5,635,461호에는 하기 화학식을 갖는 음이온성 계면활성제가 기재되어 있다:
Figure pct00001
단백질의 수용액에 개선된 안정성을 제공하는 계면활성제를 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 계면활성제와 단백질의 혼합물을 제공하는 것이 바람직하며, 여기서 혼합물은 단백질의 수용액을 형성할 수 있고, 용액은 양호한 안정성을 갖는다.
다음은 본 발명에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태는 하기 구조식 (I)을 갖는 폴리알콕시 지방족 화합물이다:
Figure pct00002
(I)
상기 식에서, R1은 지방족 기이고; R2는 H 또는 치환 또는 비치환된 하이드로카빌기이고; n은 0 내지 5이고; X1은 S 또는 NH이고; X2는 O, S 또는 NH이고; R3은 하기 구조식 (II) 및 구조식 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기이다:
Figure pct00003
n이 2 이상인 경우, 다양한 X1 기는 서로 상이하거나 또는 서로 동일하거나 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. n이 2 이상인 경우, 다양한 R2 기는 서로 상이하거나 또는 서로 동일하거나 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명의 제2 양태는 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 폴리알콕시 지방족 화합물을 포함하는 조성물로서, 상기 폴리알콕시 지방족 화합물에 대한 상기 단백질의 중량비는 0.05:1 내지 200:1이고, 상기 폴리알콕시 지방족 화합물은 하기 구조식 (I)을 갖는다:
Figure pct00004
(I)
상기 식에서, R1은 지방족 기이고; R2는 H 또는 치환 또는 비치환된 하이드로카빌기이고; n은 0 내지 5이고; X1은 S 또는 NH이고; X2는 O, S 또는 NH이고; R3은 하기 구조식 (II) 및 구조식 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기이다:
Figure pct00005
본원에 사용된 하기의 용어는 문맥에 달리 명시되지 않는 한 지정된 정의를 갖는다.
폴리알콕시 화합물은 구조식 -(-A-O)m-(여기서, m은 3 이상이고, A는 비치환된 알킬기임)을 갖는 하나 이상의 기를 함유하는 화합물이다. A 기는 선형, 분지형, 환형 또는 이들의 조합일 수 있다. 다양한 -(-A-O)- 기 중 다양한 A 기는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
지방족 화합물은 하나 이상의 지방족 기를 함유하는 화합물이다. 지방족 기는 8개 이상의 탄소 원자를 함유하는 기이며, 이들 각각은 기 중 하나 이상의 다른 탄소 원자에 결합된다. 폴리알콕시 지방족 화합물은 폴리알콕시 화합물이면서 지방족 화합물인 화합물이다.
하이드로카빌 기는 수소 및 탄소 원자를 함유하는 기이다. 비치환된 하이드로카빌 기는 단지 수소 및 탄소 원자만을 함유한다. 치환된 하이드로카빌 기는 수소 및 탄소 이외의 하나 이상의 원자를 함유하는 하나 이상의 치환기를 함유한다.
폴리머성 기는 보다 작은 화학 반복 단위의 반응 생성물로 이루어진 비교적 큰 기이다. 폴리머성 기의 수 평균 분자량은 500 이상이다. 폴리머성 기는 선형, 분지형, 별형, 루프형, 과분지형, 가교결합형 또는 이들의 조합인 구조를 가질 수 있으며; 폴리머성 기는 단일 유형의 반복 단위("호모폴리머성 기")를 가질 수 있거나 또는 하나 초과 유형의 반복 단위("코폴리머성 기")를 가질 수 있다. 코폴리머성 기는 랜덤으로, 순서대로, 블록으로, 다른 배열로, 또는 이들의 임의의 혼합물 또는 조합으로 배열된 다양한 유형의 반복 단위를 가질 수 있다.
서로 반응하여 폴리머성 기의 반복 단위를 형성할 수 있는 분자는 본원에서 "모노머"로 알려져 있다. 이렇게 형성된 반복 단위는 본원에서 모노머의 "중합 단위"로 알려져 있다. 하나 이상의 폴리머성 기를 함유하는 화합물은 폴리머이다.
단백질은 중합 단위가 아미노산의 중합된 단위인 폴리머이다. 아미노산은 펩타이드 결합으로 서로 결합되어 있다. 단백질은 하나 이상의 아미노산으로 된 20개 이상의 중합 단위를 함유한다. 단백질이라는 용어는 선형 폴리펩티드 사슬뿐만 아니라 폴리펩티드 사슬을 함유하는 보다 복잡한 구조를 포함한다.
단백질 분자가 용해된 개별 분자의 형태로 연속 액체 매질 전체에 분포되어 있는 경우, 단백질은 액체 매질에서의 용액으로 (또는 동의어로 액체 매질에 용해된 것으로) 간주된다. 연속 액체 매질이 연속 액체 매질의 중량을 기준으로 60 중량% 이상의 양의 물을 함유하는 경우, 단백질은 물에 용해된 것으로 간주된다.
화학적 기는, pH 값이 4.5 내지 8.5이면, 화학적 기가 상기 pH 값에서 물과 접촉할 때, 존재하는 화학적 기의 50 몰% 이상이 이온 형태로 존재하는 이온성 기이다.
완충제는 (i) 양성자를 수용하여 그 화합물의 공액 산을 형성할 수 있는 능력을 가지며 그 화합물의 공액 산이 9 미만의 pKa를 갖는 화합물, 또는 (ii) 양성자를 방출하는 능력을 가지며 5보다 큰 pKa를 갖는 화합물이다.
비율이 본원에서 X:1 이상이라고 할 때, 상기 비율은 Y:1(여기서 Y는 X보다 크거나 같음)을 의미한다. 예를 들어 비율이 3:1 이상이면, 그 비율은 3:1 또는 5:1 또는 100:1일 수 있지만 2:1일 수는 없다. 유사하게, 비율이 본원에서 W:1 이하라고 할 때, 상기 비율은 Z:1(여기서 Z는 W보다 작거나 같음)을 의미한다. 예를 들어 비율이 15:1 이하라고 하면, 그 비율은 15:1 또는 10:1 또는 0.1:1일 수 있지만 20:1일 수는 없다.
본 발명의 조성물은 하기 구조식 (I)의 폴리알콕시 지방족 화합물이다:
Figure pct00006
(I)
상기 식에서, R1은 지방족 기이고; R2는 H 또는 치환 또는 비치환된 하이드로카빌기이고; n은 0 내지 5이고; X1은 O, S 또는 NH이고; X2는 O, S 또는 NH이고; R3은 하기 구조식 (II) 및 구조식 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기이다:
Figure pct00007
바람직하게는, R1은 치환 또는 비치환된 지방족 기이다. 치환된 지방족 기 중에서, 바람직한 치환기는 하이드록실이다. 보다 바람직하게는, R1은 비치환된 지방족 기이고; 보다 바람직하게는, R1은 비치환된 알킬기이다. 바람직하게는, R1은 선형이다. 바람직하게는, R1은 9개 이상의 탄소 원자를 가지며; 보다 바람직하게는 10개 이상이다. 바람직하게는, R1은 22개 이하의 탄소 원자를 가지며; 보다 바람직하게는 20개 이하; 보다 바람직하게는 18개 이하; 보다 바람직하게는 16개 이하이다.
바람직하게는, X1은 NH이다. 바람직하게는, X2는 O 또는 NH이고; 보다 바람직하게는 NH이다.
바람직하게는, R2는 20개 이하의 원자를 가지며; 보다 바람직하게는 15개 이하이다. 바람직하게는, R2가 수소가 아닌 경우, R2는 하나 이상의 탄소 원자를 함유한다. 바람직하게는, R2는 수소 또는 비치환된 탄화수소 기이고; 보다 바람직하게는, R2는 수소, 비치환된 알킬기 또는 유일한 치환기가 비치환된 방향족 탄화수소 기인 알킬기이다. 비치환 알킬기 중에서, 메틸이 바람직하다. 유일한 치환기가 비치환된 방향족 탄화수소 기인 알킬기 중에서, -CH2-(C6H5)가 바람직하고, 여기서 -(C6H5)는 벤젠 고리이다. 바람직하게는, R2는 하기 구조식 (IV)를 갖는 화합물이 20개의 표준 생물학적 아미노산 중 하나가 되도록 선택된다:
Figure pct00008
(IV)
바람직하게는, R3은 600 이상, 보다 바람직하게는 800 이상의 수 평균 분자량을 갖는다. 바람직하게는, R3은 수 평균 분자량이 10,000 이하; 보다 바람직하게는 5,000 이하; 보다 바람직하게는 3,000 이하; 보다 바람직하게는 2,500 이하; 보다 바람직하게는 2,000 이하; 보다 바람직하게는 1,500 이하이다. 바람직하게는, 기 R3는 구족식 (II)와 (III)의 통계적 코폴리머 또는 구조식 (II)와 (III)의 블록 코폴리머이고; 보다 바람직하게는 기 R3는 구조식 (II)와 (III)의 통계적 코폴리머이다. 바람직하게는, R3은 -R4-CH3 구조를 가지며, 여기서 R4는 구조식 (II) 및 구조식 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기이다. 바람직하게는, R4는 구조식 (II) 및 (III) 이외에 다른 중합 단위를 갖지 않는다.
바람직하게는, n은 0 또는 1이다.
구조식 (II)의 단위 대 구조식 (III)의 단위의 몰비(본원에서 "PO/EO 비")를 특성화하는 것이 유용하다. 바람직하게는, PO/EO 비는 0.01:1 이상; 보다 바람직하게는 0.02:1 이상; 보다 바람직하게는 0.05:1 이상; 보다 바람직하게는 0.1:1 이상이다. 바람직하게는, PO/EO 비는 2:1 이하; 보다 바람직하게는 1.5:1 이하; 보다 바람직하게는 1:1 이하; 보다 바람직하게는 0.5:1 이하이다.
바람직하게는, 구조식 (I)의 화합물은 이온성 기를 갖지 않는다.
구조식 (I)의 화합물은 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 바람직한 방법은 NH2-R3 구조를 갖는 화합물을 하기 구조식 V의 화합물 및 하기 구조식 VI의 화합물로부터 선택되는 화합물과 반응시키는 것이다:
Figure pct00009
V
Figure pct00010
VI
상기 식에서, X3은 O, S 또는 NH이다. 바람직하게는 R1, X2, R2, R3 및 n은 상술한 바와 같다. 바람직하게는, X3은 O이다.
구조식 (I)의 화합물의 일부 구현예를 제조하는 더욱 바람직한 방법은 하기와 같다. 제1 단계에서, 아실 클로라이드를 아미노산과 반응시켜 다음과 같이 카복실-작용성 지방족 아미드를 형성시킨다:
Figure pct00011
.
이어서, 제2 단계에서, 카복실-작용성 지방족 아미드를 하기와 같이 아민-말단 폴리알콕시 화합물과 반응시킨다:
Figure pct00012
상기 식에서, PO는 구조식 (II)이고 EO는 구조식 (III)이다.
구조식 (I)의 화합물의 바람직한 용도는 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물을 함유하는 조성물에서이다.
바람직한 단백질은 아미노산의 40개 이상의 중합 단위를 가지며; 보다 바람직하게는 100개 이상이다.
바람직한 단백질은 모노클로날 항체, 성장 인자, 인슐린, 면역글로불린, 폴리클로날 항체, 호르몬, 효소, 폴리펩타이드, 펩타이드의 융합, 글리코실화된 단백질, 항원, 항원 서브유닛 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직한 단백질은 질환 또는 의학적 상태를 치료하거나 백신으로서 기능하는 치료 효능을 갖는다. 또한, 식품 조성물 또는 세정 조성물 또는 코팅 제형에 유익한 효과를 갖는 단백질이 고려된다.
바람직하게는, 단백질 대 구조식 (I)의 화합물의 중량비는 0.1:1 이상; 보다 바람직하게는 0.2:1 이상; 보다 바람직하게는 0.5:1 이상; 보다 바람직하게는 0.9:1 이상이다. 바람직하게는, 단백질 대 구조식 (I)의 화합물의 중량비는 150:1 이하; 보다 바람직하게는 100:1 이하이다.
단백질 및 구조식 (I)의 화합물 모두를 함유하는 제형을 제조하는 바람직한 방법은 물, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물 및 임의적인 추가 성분을 함께 혼합하여 단백질이 물에 용해되어 있는 제형(본원에서 제형 "F1"이라 칭함)을 제조하는 것이다.
바람직하게는, 제형 F1 중의 물의 양은 제형 F1의 중량을 기준으로 50% 이상이며; 보다 바람직하게는 60% 이상; 보다 바람직하게는 70% 이상이다.
제형 F1에서, 응집된 입자가 액체 매질 중에 분산되어 있어도, 단백질의 분자는 큰 입자들로 응집되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 분자를 함유하는 임의의 응집된 입자가 존재하는 경우, 그러한 입자의 체적 평균 직경은 10 nm 이하이고; 보다 바람직하게는 6 nm 이하이다.
제형 F1에서, 바람직하게는 단백질의 양은 0.01 mg/mL 이상; 보다 바람직하게는 0.1 mg/mL 이상; 보다 바람직하게는 0.9 mg/mL 이상이고; 제형 F1에서, 바람직하게는 단백질의 양은 400 mg/mL 이하; 보다 바람직하게는 300 mg/mL 이하; 보다 바람직하게는 250 mg/mL 이하이다.
제형 F1에서, 바람직하게는 구조식 (I)의 화합물의 양은 0.01 mg/mL 이상이고; 보다 바람직하게는 0.1 mg/mL 이상; 보다 바람직하게는 0.5 mg/mL 이상이다. 제형 F1에서, 바람직하게는 구조식 (I)의 화합물의 양은 50 mg/mL 이하이고; 보다 바람직하게는 10 mg/mL 이하; 보다 바람직하게는 5 mg/mL 이하이다.
제형 F1은 임의적으로 하나 이상의 추가 성분을 함유한다. 추가 성분은 물, 단백질 및 구조식 (I)을 갖는 화합물 이외의 화합물이다. 바람직한 추가 성분은 구조식 (I), 당, 염, 완충제, 아미노산, 아미노산의 염 및 이들의 혼합물을 갖지 않는 계면활성제이다. 이러한 추가 성분이 존재하는 경우, 바람직하게는 모든 추가 성분의 총량은 300 mg/mL 이하이다.
제형 F1에 포함시키기 위해, 구조식 (I)을 갖지 않는 계면활성제 중에서, 비이온성 계면활성제가 바람직하며; 소르비탄 모노라우레이트의 폴리옥시에틸렌 유도체(예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80) 및 프로필렌 옥사이드의 중합 단위의 중심 블록 및 에틸렌 옥사이드의 중합 단위의 말단 블록을 갖는 트리블록 코폴리머(예를 들어 폴리옥사머 F127 및 폴리옥사머 188)가 보다 바람직하다.
제형 F1에 포함시키기 위해, 바람직한 당은 수크로스, 글루코오스, 만노스, 트레할로스, 말토스 및 이들의 혼합물이다.
제형 F1에 포함시키기 위해, 바람직한 염은 수소, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄 및 이들의 혼합물로부터 선택된 양이온을 갖는다. 바람직한 염은 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 설페이트 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 음이온을 갖는다. 바람직한 완충제는 수소, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄 및 이들의 혼합물로부터 선택된 양이온을 갖는다. 바람직한 완충제는 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 설페이트 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 음이온을 갖는다.
제형 F1에 포함시키기 위해, 바람직한 아미노산 및 이의 염은 리신, 글리신, 아르기닌, 히스티딘 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
제형 F1에서, 단백질을 함유하는 입자는 연속 수성 매질에 용해되는 것이 고려된다. 제형 F1에 존재하는 단백질 이외의 화합물 중, 각각의 화합물은, 다른 화합물과는 독립적으로, 수성 매질 중에 용해되는 것으로 확인되거나; 단백질을 함유하지 않은 분산된 입자에서 확인되거나; 단백질의 용해된 분자의 일부 또는 전부에 부착된 것으로 확인되거나; 또는 두 개 또는 그 이상의 위치 사이에 분산된 것으로 확인될 수 있다.
제형 F1은 양호한 안정성을 가질 것으로 고려된다. 즉, 제형 F1은 단백질의 변성에 저항하고 용해된 분자가 응집된 입자로 응집하는 것에 저항할 것으로 예상된다.
단백질과 구조식 (I)의 화합물의 혼합물을 저장 및/또는 운반하는 한 가지 방법은 제형 F1을 제조한 다음 건조 공정을 통해 제형 F1으로부터 물을 제거하는 것이다. 건조 제형 F1(본원에서 고체 "S1"이라 칭함)에 의해 생성된 고체 물질은 단백질을 변성시키거나 또는 다른 분해를 일으키지 않고 쉽게 저장되고 운반될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 운반 및/또는 저장 후에, 고체 S1은 물과 혼합되어 제형 F1의 특성과 유사한 특성을 갖는 용액을 생성할 수 있는 것으로 예상된다.
하기는 본 발명의 실시예이다.
절차는 달리 명시된 경우를 제외하고 약 23℃의 실온에서 수행되었다.
다음 용어 및 약어가 사용된다.
BSA = 소 혈청 알부민
IgG = 면역글로불린 G; 전형적으로 토끼 또는 인간 혈청으로부터 입수가능; 아래의 실시예에서는 IgG의 공급원이 명시되어 있다.
THF = 테트라하이드로푸란
PO = 구조식 (II)
EO = 구조식 (III)
PEA1 = 제파민(Jeffamine™) M1000 폴리에테르아민(훈츠만(Hunstman)), 약 1,000의 분자량 및 3/19의 PO/EO 비율
PEA2 = 제파민 M2070 폴리에테르아민(훈츠만), 약 2070의 분자량 및 10/31의 PO/EO 비율
동적 광산란(DLS) 측정은 다음과 같이 수행되었다. 광산란 측정은 와이어트 다이나프로(Wyatt DyanaPro™) 고 처리량 DLS 장비에서 수행되었다. 시트레이트-염수 완충제, pH7, 15 밀리몰의 나트륨 시트레이트, 150 밀리몰의 나트륨 클로라이드 내의 다양한 단백질 농도 및 1 mg/mL의 계면활성제를 함유하는 샘플을 제조하였다. 오렌시아(Orencia™) 및 레미케이드(Remicade™) 분말은 완충제가 아닌 물과 재구성되었다. 30 μL의 각 샘플을 깨끗한 바닥이 있는 오로라(Aurora) 384 웰(well) 블랙 사이클로올레핀 폴리머 플레이트(브룩스 라이프 사이언스 시스템즈(Brooks Life Science Systems)의 웰에 넣었다. 각 웰 위에 15 μL의 실리콘 오일을 첨가했다. 온도 램프 실험을 위해, 샘플을 25℃에서 평형을 유지시킨 다음, 0.05℃/분으로 80℃로 램핑시켰다. DLS 측정치는 사이클 당 웰 당 5 x 3초 수집으로 웰에서 웰로 주기적으로 연속해서 수득되었다. 등온 실험의 경우, 샘플을 1℃/분으로 40℃, 50℃까지 램핑시키고 최종 온도(레미케이드의 경우 50℃, BSA의 경우 65℃, 오렌시아의 경우 73℃)와 데이터를 약 36시간 동안 지속적으로 수집했다.
원편광 이색성 실험(CD)은 자스코(JASCO) J-1500 CD 분광편광계(spectropolarimeter)에서 수행되었다. 단백질 용액[5% BSA(50 mg/mL) 및 0.2% IgG(2 mg/mL)]를 10 mM 인산 완충 식염수(PBS) 완충제 pH 7.3에서 제조하였다. BSA 샘플을 측정하기 전에 PBS 완충제로 1:10 희석시켰다.
나노-시차 주사 열량계(나노-DSC)는 미국 칼로리메트리 사이언스 코포레이션(Calorimetry Science Corporation)의 모델 6100 나노 II DSC를 사용하여 수행되었다. 샘플(전형적으로 2.5 mg/ml 단백질 용액)과 참조(포스페이트 완충제)를 0.3 MPa(3 bar)의 압력 및 1ºC/분 스캔 속도로 스캔했다. 스캐닝은 15ºC 내지 105ºC였다.
구조식 (I)의 화합물("계면활성제")의 합성은 다음과 같이 수행하였다:
N-미리스토일 아미노산 유도체는 실온(약 23℃)에서 4시간 동안 수산화 나트륨 및 트리에틸아민의 존재하에 미리스토일 클로라이드와 글리신을 반응시켜 제조하였다. 교반 막대가 들어있고 응축기 및 가스 주입 어댑터가 장착된 50 mL의 1-구 환저 플라스크에 N-미리스토일 아미노산 유도체(5 mmol)와 폴리에테르아민(PEA1 또는 PEA2)(5 mmol 아민기)을 첨가했다. 플라스크를 오일 욕에 넣고 다음과 같이 가열하였다: 100℃에서 1시간, 125℃에서 1시간, 150℃에서 1시간, 175℃에서 1.5시간, 및 200℃에서 1.5시간. 이 시간 동안, 반응 온도가 175 내지 200℃에 도달하면 물의 발생이 관찰되었다. 반응 혼합물을 실온(약 23℃)으로 냉각시키고, 플라스크에 진공을 가한 다음, 플라스크를 100℃에서 30분간, 125℃에서 30분간, 150℃에서 30분간, 175℃에서 30분간, 및 200℃에서 2시간 동안 재가열하였다. 가열을 중단하고 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 플라스크를 질소로 역-충전시켰다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 계면활성제의 구조와 일치했다.
n = 0인 구조식 (I)의 화합물에 대해, 상기한 바와 같이 미리스토일 클로라이드를 제파민(Jeffamine) 수지와 직접 반응시켰다.
각각의 본 발명의 계면활성제에서, R1-은 CH3(CH2)11CH2-이었다. X1과 X2는 모두 N이었다. R3은 산화 프로필렌 단위와 에틸렌 옥사이드 단위의 코폴리머이며, 메틸기로 말단 캡핑되었다.
제조된 본 발명의 계면활성제는 하기와 같다.
Figure pct00013
실시예 1: BSA를 함유하는 단백질 용액의 시험
지시된 대로 다양한 계면활성제로 5 mg/mL BSA의 DLS 스캐닝. 스캔 속도는 25 내지 80℃에서 0.05℃/분이었다. 계면활성제는 모두 1 mg/mL이었다. DLS 스캐닝에서, 샘플은 온도의 함수로서 체적-평균 입경에 대해 시험되었다. 각 샘플은 최종적으로 직경이 증가했다. 개시 온도(Tonset)를 기록했다. 높은 Tonset은 보다 안정한 단백질 용액을 의미한다.
BSA(5 mg/mL)의 나노-DSC는 다양한 계면활성제(5 mg/mL)로 수행되었다. 열 흐름 대 온도의 나노-DSC 그래프는 "펼침" 피크라고 표시된 60℃와 85℃ 사이의 피크를 보여주며, 이는 단백질이 최대 속도로 변성하는 온도를 나타낸다. 펼쳐지는 피크 온도(Tm)가 보고된다. Tm이 높을수록 단백질 용액이 더 안정하다는 의미이다.
서로 다른 계면활성제를 함유한 원형 이색성(CDA) BSA 샘플(5 mg/mL)을 70℃에서 30분간 열 에이징시킨 후 측정했다. CD 대 파장의 그래프는 222 nm에서의 피크를 나타내며, 알파-나선의 흡광도를 나타낸다. 알파-나선 피크의 감소는 변성을 나타낸다. 각 샘플에 대해, 222 nm에서의 CD를 조사하고, 초기 샘플의 값과 70℃에서 30분 동안 열 에이징시킨 후 동일한 샘플의 값 사이의 차이를 조사하였다; 이 차이는 ΔCD로보고된다. ΔCD의 절대값이 높을수록 단백질 용액의 안정성이 떨어지는 것을 의미한다.
또한 62℃에서 1 mg/mL 계면활성제를 포함한 BSA(5 mg/mL)의 등온 DLS가 수행되었다. 체적-평균 입자 직경은 시간의 함수로서 측정되었다. 2000초(D2k)의 직경을 기록하였다. D2k 값이 낮으면 단백질 용액이 안정적으로 유지되는 것을 의미한다.
결과는 다음과 같다. "nt"는 테스트하지 않은 것을 의미한다.
Figure pct00014
Tonset 결과에서, 모든 본 발명의 실시예는 비교예와 비슷하거나 또는 우수한 안정성을 보였으며, 실시예 2, 3 및 4는 비교예보다 특히 월등하였다. Tm 결과에서, 모든 본 발명의 실시예는 비교예와 비슷하거나 또는 우수한 안정성을 나타내었고, 실시예 4는 비교예보다 특히 월등하였다. ΔCD 결과에서, 모든 본 발명의 실시예는 비교예 샘플보다 훨씬 월등한 결과를 나타냈다. D2k 결과에서, 시험된 유일한 본 발명의 실시예인 실시예 4는 비교예의 것보다 월등하였다.
실시예 2: IgG를 함유하는 단백질 용액의 시험
스캐닝 DLS는 토끼의 1 mg/mL IgG를 포함하는 단백질 용액에서 25℃ 내지 80℃에서 0.05℃/min으로 계면활성제를 모두 1 mg/mL로 하여 수행했다. Tonset은 모든 샘플에서 66℃ 였지만, 온도가 Tonset보다 높아짐에 따라, 실시예 1을 사용하는 샘플은 다른 모든 샘플보다 훨씬 더 느린 입자 직경 성장을 보였다.
65℃에서 1 mg/mL 토끼 IgG에서 등온 DLS를 수행하였고, 4000초(D4k)에서의 크기를 기록하였다. 인간 IgG를 사용한 CD 기술은 18시간 동안 65℃에서 열 에이징으로 인한 218 nm에서의 흡광도의 변화를 비교했다. 결과는 다음과 같다.
Figure pct00015
ΔCD 결과에서, 본 발명의 실시예는 비교예보다 훨씬 월등했다. D4k 결과에서, 실시예 3은 비교예보다 월등하였다.
실시예 3: 오렌시아(Orencia™) 분말을 사용한 결과
오렌시아(아바타셉트) 분말(브리스톨-마이어스 수퀴브(Bristol-Myers Squibb) 제조)을 처방에 의해 얻었다. 오렌시아를 물로 4 mg/mL로 희석하고 Tonset에 대해 DLS를 스캐닝하여 시험했다. 또한, 오렌시아는 물로 10 mg/mL로 희석하고 73℃에서 등온 DLS로 시험하였으며, 직경은 20시간(D20h)에 기록되었다. 단백질 용액에서, D20h는 시간이 지남에 따라 커지는 경향이 있고, 덜 안정된 용액은 D20h의 더 높은 값에 도달한다. D20h 값이 작으면 단백질 용액이 더 안정적임을 의미한다. 1 mg/mL의 오렌시아 용액을 등온 단계 실험에서 시험하였다; 입자 직경은 50℃에서 45 시간을 유지하고 이어서 60℃에서 15시간 동안 유지하는 시간의 함수로서 DLS에 의해 측정하였다. 이 과정의 마지막 직경인 Dstep을 기록하였다. Dstep 값이 작으면 단백질 용액이 더 안정적임을 의미한다.
결과는 다음과 같다.
Figure pct00016
Tonset 및 D20h 결과에서, 본 발명의 샘플은 비교예 샘플보다 더 안정한 단백질 용액을 가졌다.
실시예 4: 레미케이드(Remicade™)에 대한 테스트 결과
레미케이드(REMICADE™)(인플릭시맙) 분말(존슨 앤 존슨(Johnson and Johnson) 제조)을 처방하여 얻었다. 레미케이드 분말을 물에서 1 mg/mL로 희석시켰다. 스캐닝 DLS를 사용하여, Tonset은 위에서 설명한 대로 측정되었다. 또한, 등온 DLS는 50℃에서 수행되었으며 입자 직경이 빠르게 증가하기 시작하는 시간(t-grow)을 기록했다. 결과는 다음과 같다.
Figure pct00017
본 발명의 샘플은 비교 샘플에 비해 비교할만한 성능을 보였다.

Claims (8)

  1. 하기 구조식 (I)을 갖는 폴리알콕시 지방족 화합물:
    Figure pct00018
    (I)
    상기 식에서, R1은 지방족 기이고; R2는 H 또는 치환된 또는 비치환된 하이드로카빌기이고; n은 0 내지 5이고; X1은 S 또는 NH이고; X2는 O, S 또는 NH이고; R3은 하기 구조식 (II) 및 구조식 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기이다:
    Figure pct00019
    .
  2. 청구항 1에 있어서, -R3은 구조식 -R4-CH3를 갖되, R4는 하기 구조식 (II) 및 (III)의 중합 단위를 포함하는 폴리머성 기인, 폴리알콕시 지방족 화합물:
    Figure pct00020
    .
  3. 청구항 1에 있어서, -R3은 이온성 기를 갖지 않는, 폴리알콕시 지방족 화합물.
  4. 청구항 1에 있어서, -R3은 600 내지 10,000의 수-평균 분자량을 갖는, 폴리알콕시 지방족 화합물.
  5. 청구항 1에 있어서, -R2는 20개 이하의 원자를 갖는, 폴리알콕시 지방족 화합물.
  6. 청구항 1에 있어서, -R1은 선형 비치환된 알킬기인, 폴리알콕시 지방족 화합물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    -R1은 10 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환된 알킬기이고,
    -R2는 수소, 메틸 및 -CH2-(C6H5)로 이루어진 군으로부터 선택되되, -(C6H5)는 벤젠 고리이고,
    -R3은 800 내지 3000의 수-평균 분자량을 갖는, 폴리알콕시 지방족 화합물.
  8. 청구항 1의 폴리알콕시 지방족 화합물의 제조 방법으로서,
    구조식 NH2-R3을 갖는 화합물을 하기 구조식 V의 화합물 및 하기 구조식 VI의 화합물로부터 선택되는 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00021
    V
    Figure pct00022
    VI
    상기 식에서, X3은 S 또는 NH이다.
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