KR20180053755A - 발열원의 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법과 세포 모델 및 발열원 검출 키트 - Google Patents

발열원의 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법과 세포 모델 및 발열원 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법과 세포 모델 및 발열원 검출 키트를 제공한다. 상기 세포 모델은 CRISPR/CAS9를 이용하여 유전체 특정 위치에 이중결합 파괴가 형성되도록 유도하며, 또한 동종 재조합 수선의 원리를 이용하여, 세포계의 두 개 염색체의 지정 위치에 각각 TLR4 및 CD14-MD2를 삽입하여, 녹색 형광 GFP 와 적색 형광 RFP에 의해 각각 우리가 최종적으로 성공적으로 구축한 TLR4/CD14/MD2가 지정 위치에 삽입된 형광 추적 세포 모델을 추적하며, LPS에 의해 자극된 세포 모델은 ELISA, 웨스턴 블롯(Western Blot), 질량분광법, 자성비드법을 통해 IL-6, TNF-a 세포인자의 방출을 검출할 수 있으며 상기 세포 모델은 안정성이 양호하고 민감성이 높으며, 최저 검출 한도가 0.005EU/mL에 달할 수 있어, 투구게 시약법의 0.025EU/mL보다 매우 낮다.

Description

발열원의 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법과 세포 모델 및 발열원 검출 키트
본 발명은 바이오 기술 분야에 속하고, 약품과 바이오 제품 (유전자공학 제품을 포함) 중의 발열원 검출과 관련되는 것으로, 구체적으로는 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법과 세포 모델 및 발열원의 검출 방법 및 키트에 관한 것이다.
1.1 발열원 요약
모두가 아시다시피, 임상치료 중에서 주사류 의약품이나 의료기기를 이용할 시, 종종 오한, 몸서리, 구역질, 발열, 구토, 두통, 백혈구 감소, 혈관 투과성 증가, 혼미, 쇼크 등 환자의 부작용을 일으킴으로써, 병세를 가중시켜 환자의 고통을 가중시킬 뿐만아니라, 구급과 치료의 효과에도 영향을 주게 되며, 심지어 환자의 생명에도 위협을 주게 된다. 1875년, Burdon-Sanderson(리쩡홍 (李增宏), 왕루이동 (王瑞東), 불산과학기술학원학보 (佛山科學技術學院學報), 2007, 25(3):43-45）의 연구에 따르면, 부패한 고기 중에서 활균 (活菌)이 없는 물질을 분리해낼 시, 일련의 부작용이 일어났는데 이를 발열원（Pyrogen）이라 칭하고, 상기 일련의 증세를 발열원 반응이라고 정의하였다. 그 후, 과학연구의 심입된 발전에 따라 발열원에 대한 더욱 확실한 정의가 있게 되었는데, 미생물에 의해 생성되는 항온 동물의 비정상적인 체온 상승을 일으키는 열발생 물질을 가리킨다. 1923년, 세이버트(Seibert)는, 발열원은 미생물에 의해 생성되는 것으로, 내열성, 불휘발성, 수용성, 여과성과 흡착성 특성이 있으며, 쉽게 차단되지 않고, 열안정성이 강하여, 설령 엄격한 멸균을 거치더라도 여전히 발열원반응의 발생을 제거할 수 없다고 주장하였다. 발열원은 외인성 발열원과 내인성 발열원 두가지로 나뉘는데 외인성 발열원은 주로 그람 음성(Gram-negative) 세균의 내독소와 그람 양성(Gram-positive) 세균의 리포테이코산이고 내인성 발열원에는 주로 체내의 세포인자 (예컨대, TNF-α, INF-β, IL-1, 성장인자), 및 호르몬 (예컨대, 스테로이드, 프로스타글란딘) 등이 포함된다. 우리가 통상적으로 가리키는 "발열원"은 주로 박테리아 발열원을 가리키는데, 이는 일부 세균의 대사 산물, 세균 시체 및 내독소이다. 그 중, 열발생 능력이 가장 강한 것이 그람 음성 G-간균이고 그 다음으로 그람 양성 G+간균류이며, 그람 양성 G+구균이 비교적 약하며 곰팡이, 효모균 심지어 바이러스도 발열원을 일으킬 수 있다（Charles A, Dinarello. Endotoxin Research, 2004, 10:201）.
세균 내독소（Endotoxin）는 외인성 발열원에 속하고, 그람 음성 G-균 세포벽 외벽층의 특유의 구조로서, 인지질, 지다당（Lipopolysaceharide, LPS）과 단백질이 결합되어 형성된 복합물이다. LPS는 복합물의 주요 성분 및 활성 중심으로서, 열발생 작용이 가장 강하나 그 화학적구성이 균종이 다름에 따라 차이가 있는데 분자량이 5Х104 - 5Х105이며, 분자량이 클수록 열발생 작용이 더욱 강하다. 세균 내독소는 세균 자체의 세균의 대사산물이 아니라 세균이 죽은 후 또는 해체 이후에 방출되는 일종의 생물 활성을 지닌 독성 물질으로서, 일반적인 멸균 방법에 의해 제거할 수 없으며, 현재까지 발견된 생물 활성이 가장 광범위한 물질 중 하나이다(유쉬앤야 (劉宣亞), 젤라틴 과학과 기술 (明
Figure pct00001
科學與技術), 2013, 33(1):45-48）. 세균 내독소가 소화계통을 통해 인체내에 침입할 시 위험을 초래하지 않으나, 세균 내독소가 주사 등 방식에 의해 혈액내에 침입할 시 서로 다른 질병이 초래되는데, 가장 전형적인 것으로 발열반응이 있다. 인체내에 침입된 세균 내독소는 직접적으로 세포 생물막에 대한 독성을 생성할뿐만 아니라, 단핵식균세포를 매체로 하는 면역염증반응을 통해 여러 종류의 세포인자 및 염증인자의 합성과 방출을 유도함으로써, 과도로 발현되는 염증 매개체로 하여금 자기분비, 주변분비나 내분비 방식으로 단핵 - 식균세포막 위의 수용체에 작용하도록 함으로써 염증매개체의 발현을 더욱 활성화시킨다 （Guha M, Mackman N. Cell Signal, 2001, 13(2):85-94.）. 이러한 염증인자의 통제력 잃은 방출이 세포기능의 완정성에 영향을 주기에, 인체의 대사를 교란시키고, 혈액 응고성을 상승시키며, 조직내 혈액의 주입을 부족하게 하며, 엄중할 경우 여러 기관의 기능이 쇠약해지면서 소실되게 한다 （Hotchkiss RS, Karl IE. N Engl J Med, 2003, 348(2):138-150.）. 약품과 의료관리부문의 임상 발열반응이 날로 중요해짐에 따라, 그람 음성균의 분포가 아주 광범위하기에, 약품 및 의료기기에서의 발열원에 대한 검출도 최근에 들어서서 연구의 초점으로 되고 있다.
1.2 종래의 주요 발열원의 검출 방법 및 그 한계
발열원의 검출에 있어서, 현재 중국의 약전 (藥典)에 수록된 방법에는 집토끼 발열원 실험 방법과 투구게 시약 (Tachypiens Amebocyte Lysate) 내독소 검출 방법이 있고, 제7판 유럽 약전 (2011판)에는 또한 발열원 검출의 세번째 새로운 방법 - 단핵세포 활성화 검출 방법이 수록되여 있다.
집토끼 발열원 검출 방법: 발열원에 대한 집토끼의 반응이 사람과 거의 비슷하기에 집토끼법은 각국 약전에 규정된 발열원 검출의 법정 방법이다. 일정한 조제량의 테스트 샘플을 집토끼의 체내에 정맥주입한 후, 규정된 시간내에 집토끼의 체온상승 상황을 관찰함으로써 테스트 샘플 중에 포함된 발열원의 한도가 규정에 부합되는지 여부를 판단한다.
집토끼법에는 여전히 많은 한계가 있다. 우선, 집토끼법은 정량화, 표준화를 진행할 수가 없고, 감응성과 반복성이 약하며, 또한 발열원에 대한 집토끼의 민감성에도 개체적 차별이 있으며, 발열원에 대한 서로 다른 개체의 민감성의 차이가 10배 이상에 달한다. 다음으로, 일부 유형의 약품이 검출 결과에 영향을 미치는데, 예를 들어, 일부 해열진통제, 세포독성 의약품 또는 일부 체온중추에 쉽게 영향을 주는 의약품 등은 집토끼법에 이용될 수가 없다. 또한, 많은 집토끼 발열원 검출에 합격된 제품은 임상상 여전히 발열반응을 발생할 수 있다. 세포공정기술, 신 바이오 재료 및 중약 제품의 발전이 급속하고, 날로 새로워지는 오늘날, 집토끼법은 이미 인체의 발열반응을 완전히 대표할 수가 없고, 그 조작도 번거롭고 시간소모가 많다. 따라서, 주사제 생산과정에서 품질 모니터링에 이용될 수가 없고, 또한 일부 의약품에 적용될 수 없다.
투구게 시약 내독소 검출 방법: 아메리카 투구게의 혈액이 그람 음성균을 만날 시 응혈현상이 발생하는데, 미국, 영국, 유럽, 일본과 중국 약전에는 현재 모두 해당 검사법이 수록되어 있다. 투구게 시약 내독소 검출 방법 계열은 투구게 시약을 이용하여 그람 음성균으로 인한 세균 내독소를 검출하거나 또는 계량화하여, 테스트샘플 중의 세균 내독소의 제한량이 규정에 부합되는지 여부를 판단하는 일종의 방법이다. 세균 내독소의 양은 내독소 단위（EU）로 표시된다. 투구게 시약법에 의한 내독소 검출이 있어서, 정밀도는 0.015EU/mL 로서, 집토끼법보다 민감하고, 조작이 간편하며, 시험비용이 낮고, 결과가 신속하고 신뢰할 수 있어, 주사제 생산과정에서의 발열원 조절 및 집토끼법으로 검출해낼 수 없는 일부 세포 독성 의약품 제제에 이용된다.
하지만 투구게 시약법이 환경요소의 영향을 비교적 크게 받기에 쉽게 가양성（pseudopositive） 결과가 나오기도 한다. 또한, 자체가 색을 지닌 제제에 대해서는 검출을 진행할 수 없다. 투구게 시약법에 의해 실질적으로 검출해낼 수 있는 것은 단지 투구게 혈액 세포에 대한 내독소의 응집활성일 뿐, 인체에 대한 내독소의 발열활성 또는 화학적개념의 함량이 아니며, 내독소 이외의 기타 열발생원을 검출할 수도 없다. 당해 방법은 일부 효소 억제제, 칼슘 마그네슘 이온 킬레이트제를 검출할 수도 없기에, 투구게 테스트로 집토끼 발열원 테스트를 완전히 대체할 수가 없다. 중국에서 투구게 시약을 만드는데 이용되는 중화 투구게(
Figure pct00002
)는 공룡보다도 일찍 나타난 물종으로서, 최근 들어 바다를 메꾸어 육지를 만들고 어업활동이 활발히 전개하면서 투구게가 멸종의 위기에 처해 있다. 실험동물학의 "3Rs 원칙", 다시 말해서 감소 （Reduction）, 최적화 （Refinement）와 대체 （Replacement）의 원칙에 따라 투구게 시약의 대체 방법에 대한 연구가 시급하다.
단핵세포 활성화 검사법: 집토끼법과 투구게 시약법 외에도 제7판 유럽 약전 (2011판)에는 이미 세번째 새로운 방법인 단핵세포 활성화 검사법 （monocyte activation test，MAT）이 수록되어 있다. 그 원리는 사람의 전혈 (全血)과 테스트 샘플을 함께 배양시켜 혈액 중의 단핵세포가 방출한 IL-6、IL-1β、TNF-α 등 세포인자의 양으로 테스트 샘플 중의 발열원 활성을 평가하는 것이다. MAT에 의해 발열원과 염증유발인자 오염물을 검출해낼 수 있는데 그람 음성 세균의 내독소 및 비(非) 내독소로 인한 오염물이 포함되며, 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 바이러스, 진균의 병원성 관련 분자패턴（PAMPs）, 그리고 제품 및 가공공정과 관련있는 생물 또는 화학적 실물이 포함된다. 그러나, 단핵세포 활성화 검사법에도 어느 정도의 한계가 존재하는 바, 서로 다른 소스의 인체 혈액에서 분리해낸 단핵세포의 반응성이 서로 다를 가능성이 있고, 그 외에도 신선한 인체의 혈액을 대량으로 얻을 수 없는 것이다. 따라서, 이러한 방법은 보급되기 어렵고, 안정성이 부족한 결함이 있다.
이로부터 알다시피, 새로운 유전자공학을 이용한 체외 발열원 검출방법으로 전통방법을 대체하는 것은, 해당 분야 발전의 국제적인 대추세이다. 발열원의 검출에 대한 연구는, 현재 세포와 분자 수준으로 발전하고 있다. 중국은 이 방면에서 연구가 초급단계에 처해 있는 바, 발열원 검출에 이용되는 세포 모델이 아직 약전에 수록되어 있지 않다. 하지만, 세포 모델을 이용한 발열원의 검출이 연구자들의 주요 관심 포인트로 되어 있고, 방법의 간편성과 효율성이 연구에 있어서의 필연적 추세인 것은 예측할 수 있다.
1.3 발열원 관련 수용체 및 신호 경로
최근 들어 그람 음성균 G-균으로 인한 내독소 반응의 체계에 대해 심층있는 이해가 있게 되었고, 그와 동시에 LPS가 체내 면역 반응의 응답을 활성화시키고 발열반응을 일으키는데 있어서 주도적 역할을 하고 있음을 알게 되었다. LPS는 여러 종류의 병원체에서 모 종의 고도의 보수적인 병원체 구조로 존재하고 있는데, 이러한 보수적인 병원체 구조 형식은 병원체 관련 분자 패턴（Pathogen associated molecular patterns, PAMP)이라 불리운다. Toll 유사 수용체 패밀리는 선천성 면역 시스템 중에서의 중요한 구성 부분으로, 그 역할은 패턴 식별 수용체 (Pattern-recognition receptors, PRRs) 와 유사하다고 여겨지고 있으며, 주로 병원성 미생물 표면의 PAMP에 대한 식별을 통해 면역 반응을 가동시킴으로써 외래 항원을 제거한다.
LPS에 의한 염증 신호 전달 경로에는, 지질 다당류 결합 단백질（Lipopolysaccharide binding protein, LBP）, Toll 유사 수용체4（Toll like receptor-4, TLR4）, 골수성 분화 단백질2 （Myeloid differentiation protein-2, MD2） 및 단핵구 분화 항원14 （Monocyte differentiation antigen 14, CD14）와 같은 4종류의 관건적 역할을 하는 수용체가 있다.
LBP는 사람과 동물의 혈청속에 광범위하게 존재하는 당단백질로서, 엄격하게 말하면 LPS 결합 단백질은 LPS 결합 수용체가 아니지만, LPS가 세포를 매개체로 활성화될 경우, 혈장이나 세포표면이 LPS와 결합할 수 있는 단백질의 참여가 필요하며, LPS가 생물학적 작용을 발휘하는 중요한 벡터이다. 또한 세균 내독소 및 LPS 중의 유지질A에 대해 아주 높은 친화력을 갖고 있다. LBP와 LPS가 결합하여 복합물을 형성하고, LPS를 세포막 위의 CD14 수용체에 전달하여 TLR4-MD2 복합물과 결합하며, 일련의 막관통 및 세포내의 신호 전달 과정을 통해 표적 세포를 활성화시키고, 염증 전의 세포인자와 면역조절인자를 방출한다.
TLR4는 TLRs 패밀리 （Toll like receptors）의 하나로서, 현재 인류는 10여 종의 TLRs 패밀리 단백질을 발견하였는 바, 각각 TLR1-10 （Lemaitre B, Nicolas E, Miehaut L et al. Cell, 1996,86(6):973-983; HuangB．Zhao J. Unkeless J C et al. Oneogene，2008,27(2): 218-224; 류우씽 (劉興), 훵원리 (馮文莉)，캉거훠이 (康格非), 국외의학임상생물화학과 검험학 분책 (國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊), 2001, 22(3):134-136; T Kawai, S Akira. Cell Death and Differentiation, 2006, 13:816-825）로 명명하였다. 서로 다른 TLRs 전달 신호는 서로 다른 소스의 미생물에 의해 자극된 것이다. 때문에 서로 다른 TLRs는 일정한 정도에서 체내에 침입한 병원체의 유형을 식별하고 구분한다. TLRs 패밀리 성원 중에서 현재 가장 많이 연구되고 있는 것은, TLR4, TLR2의 체내 선천적 면역 중의 작용이며, 그 중 LPS 신호 전달 중의 TLR4 체계에 대한 연구가 가장 심층적으로 폭넓게 진행되고 있다（친위신 (秦玉新), 장칭주 (張慶柱), 중국약리학통보 (中國藥理學通報), 2003, 19(12):1336-1339; Li-Yun Huang, James L.DuMontelle,et al. Clinlcal Microbiology, 2009, 47:3427-3434）. TLR4는 염증 반응 중에서 가장 중요한 일종의 수용체 식별방식으로 미생물 진화과정에서의 일부 특이한 보수적 서열 (예컨대, LPS)을 식별할 수 있다. TLR4는 LPS가 세포 신호 전달을 유도하는 가장 주요한 수용체로서, 주로 숙주 방어 기능에 참여하는 세포에서 발현되는데, 예를 들어, 말초 백혈구, T 임파 세포, B 임파 세포, 단핵 대식 세포, 비만 세포, 랑게르한스 세포, 수지상 세포 등이 있으며, 그 중 골수성 단핵 세포 중에서 가장 많이 발현된다 （Medzhitov R, Preston Hurlburt P, Janeway Jr. CA. Nature, 1997, 388:394-79）.
MD2는 일종의 분비 단백질로서, TLR4와 MD2를 발현하는 감염체를 이용하여 면역 침적 실험 검증을 진행하며, MD2는 TLR4를 동반하여 발현되어 세포 표면에 분비되는데, 물리적 작용으로 TLR4 가 세포막 위에 정착한다. MD2는 TLR4가 LPS를 식별하는데 유용하고, 또한 LPS를 TLR4의 결합 위치에 고정시킴으로써, TLR4의 세포막으로의 이전과 발현에 아주 중요한 역할을 한다. 연구에 따르면, MD2분자가 부족하면, LPS에 대한 TLR4의 반응성이 극히 낮다는 것을 발견하였다 （Miyake K, R. Shimazu, J.Kondo,et al. Immunol.1998, 161:1348-1353; Pugin J, Stem Voeffray S, Daubeuf B. Blood. 2004, 104(13):4071-4079; 리우야웨이 (劉亞偉), 리우찡화 (劉靖華), 탕징 (唐靖) 등, 남방의과대학학보 (南方醫科大學學報), 2006, 26(8): 1101-1105; 종티엔위 (鐘田雨), 리우찡화 (劉靖華), 지앙용 (姜勇), 생물화학과 생물물리 발전 (生物化學與生物物理進展), 2007, 34(5): 460-464）.
CD14는 세포질과 백혈구 표면에서 글루코스 포스파티딜이노시톨로 연결 단백질로 발현되는 단백질로서, LPS와 아주 높은 친화력을 갖고 있으나, CD14분자 중 세포질 구역이 결핍하기에, 직접적으로 세포내에 LPS신호를 전달할 수 없다. LPS와 CD14가 결합한 후, 우선 LPS-LBP-CD14 리간드와 보조인자 복합물을 형성하고, 그 다음 TLR4와 결합되어 신호를 전달하여 세포에 침입한다 （Saitoh S, Akashi S, Yamada T, et al. Endotoxin Res, 2004, 10 (4): 257-260; Nagai Y, Akashi S, Nagafuku M, et al. Nat Immunol, 2002, 3(7): 667-672; Zielger, Heitbrock HWL and Ulevitch RJ. Immunol Today, 1993, 14(3): 121-125）.
세균이 체내에 침입하면 LPS는 세균 파괴에 의해 혈액속에 유입되어, 혈장 중의 유리된 지다당 결합 단백질LBP와 결합하여 복합물을 형성할 수 있는데, CD14분자와 결합하거나 또는 직접적으로 TLR4의 부속 단백질인 골수성 분화 단백질 MD2와 결합하여 LPS-MD2/TLR4 복합물을 형성하는데, 이러한 분자의 보조하에 TLR4를 활성화시킨다.
1.4 CRISPR / CAS9 시스템 기본 원리
CRISPR/Cas9 （The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats （CRISPR） and CRISPR Associated（Cas）system）는 일종의 빠르고 간편하며 효율적으로 인간 유전체의 어떠한 유전자도 표적할 수 있는 새로운 방법이다. CRISPRs는 일종의 세균과 고세균 유전체 중에 광범위하게 분포되어 있는 반복 구조로서, 군생이고 간헐적으로 반복되는 회문 구조 염기 서열 집합체 （clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats）를 가리키는데, 이는 세균의 적응성 면역 메카니즘으로서, 박테리오파지 （bacteriophages） 바이러스에 대응하기 위해 진화된 일종의 DNA 단편이다. 세균은 Cas9 단백질을 발현함과 동시에 CRISPR RNA를 전사하는데, 이러한 RNA는 바이러스의 유전체에 매칭된다. 이러한 Cas9 복합물은 바이러스의 유전체를 절단하여 바이러스로 하여금 활성을 잃게 한다. 연구에 따르면, CRISPR은 일련의 관련 단백질, 선도 서열과 함께, 원핵생물에게 대항성 박테리오파지 등 새로운 외부 유전자를 제공하여 면역력을 갖게 한다. CRISPR-Cas9 기술은 하나의 단편의 표적 서열이 서로 같은 단일방향의 RNA （sgRNA）로 Cas9뉴클레아제를 유도하여 특정된 표적 DNA에 대해 식별과 절개를 진행하여, DNA의 이중가닥이나 단일가닥을 단열시킨 후, 세포는 자체가 갖고 있는 두 종류의 수선（
Figure pct00003
） 메카니즘을 이용하여, 단열된 DNA에 대한 수선, 다시 말해서 비-상동말단부착 （NHEJ）이나 상동직접수선 （HDR）을 진행한다.
CRISPR/Cas 시스템의 출현은 유전공학에 하나의 강력한 새로운 응용도구를 제공하였으며, 유전체에 대한 소정 방향 편집의 연구와 응용분야에 획기적인 기술혁명을 가져다 주었으며, 특히 유전자의 기능 분석, 인류의 질병 표적 치료 등 응용에서 거대한 잠재력과 폭넓은 전망을 갖고 있다. 더욱 용기를 북돋아주는 것은 조작이 간편하고 실험 주기가 짧으며 원가가 절감되어 일반적인 실험실에도 해당 기술이 보급될 수 있다는 것이다. 따라서, CRISPR/Cas 시스템의 광범위한 응용은 생물학연구에 있어서 아주 큰 영향을 주게 될 것이다. CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 유전체에 대한 소정 방향 편집을 진행할 수 있어, 사람들이 유전자의 기능을 장악하는데 큰 도움이 될 것이다.
내독소는 그람 음성균으로 인한 발열반응의 주요 성분으로서, 약품 안전에 엄중한 위협을 주는 관건적 요인이기에, 보다 합리적이고 적절한 발열원 검출 방법을 구축해 내는것이 아주 절박하다.
본 발명의 목적은 발열원 검출에 이용되는 세포 모델을 제공하는 것이며, 당해 세포 모델은 유전공학 약품을 포함하는 약품 바이오 제품의 발열원 검출에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 발열원의 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 발열원 검출에 이용되는 키트를 제공하는 것이며, 당해 키트에는 상술한 세포 모델이 포함되어 있다.
본 발명의 네번째 목적은 발열원 검출에 이용되는 방법을 제공하는 것이며, 당해 방법은 상술한 키트를 이용하여 검출한다.
상기 목적을 실현하기 위해, 본 발명이 이하와 같은 기술적 방안을 도입한다.
본 발명은 일종의 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법을 제공하는데 이하 단계를 포함한다.
본 발명은 발열원의 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법을 제공하며, 이하의 단계를 포함한다.
1) TLR4 유전체를 녹색 형광으로 발현할 수 있는 발현 벡터에 넣어 TLR4 유전자가 함유된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계;
2) CRISPR/CAS9 법을 이용하여 TLR4 유전자를 세포계의 하나의 염색체 상의 하나의 유전자의 인트론 내의 지정 위치에 삽입함으로써 하나의 TLR4 유전자를 안정적으로 발현하는 세포계를 수득하는 단계;
3) 서로 다른 두 개의 2A 펩티드를 이용하여, CD14, MD2와 적색 형광 RFP 유전자 구조를 분리시켜, CD14 유전자와 MD2 유전자가 함유되고 적색 형광을 발현할 수 있는 재조합 플라스미드를 구축하는 단계; 및
4) CRISPR/CAS9 법을 이용하여, 단계 2)에서 수득한 세포계의 해당 TLR4 유전자가 삽입된 염색체 이외의 다른 염색체 상의 하나의 유전자의 인트론의 지정 위치에, CD14 유전자와 MD2 유전자를 삽입하여, TLR4 유전자, CD14 유전자와 MD2 유전자를 안정적으로 발현함과 동시에 녹색 형광과 적색 형광을 발현할 수 있는 하나의 세포주, 즉 상기 세포 모델을 수득하는 단계.
상기 세포계는 HEK293T, HEK293 또는 NIH3T3인 것이 바람직하다.
더 나아가, 상기 단계 2)에 있어서, TLR4 유전자가 삽입된 위치는 제19호 염색체 PPR1R12C 유전자 첫번째 인트론이다.
더 나아가, 상기 단계 4)에 있어서, CD14 유전자와 MD2 유전자가 삽입된 위치는 제3호 염색체 CCR5 유전자 첫번째 인트론이다.
본 발명은 또한 상술한 구축 방법을 이용한 세포 모델을 제공하며, 상기 세포 모델은 세포계 HEK293T의 제19호 염색체 PPR1R12C 유전자 첫번째 인트론의 지정 위치에 TLR4 유전자가 삽입되고, 제3호 염색체 CCR5 유전자 첫번째 인트론의 지정 위치에 CD14 유전자와 MD2 유전자가 삽입된 것이다.
그 중, 상기 세포 모델의 분류 명칭은 인간배아신장세포 （HEK） 변종 293T/TLR4/CD14/MD2이고, 보관기관은 중국 미생물 균종 보관 관리 위원회 일반 미생물 센터 (中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)이며 주소는 북경시 조양구 북진서로 1호원 3호 (北京市朝陽區北辰西路1號院3號), 중국과학원 미생물 연구소 (
Figure pct00004
)이며 보관일자는 2016년05월19일이며 보관번호는 CGMCC No. 12296이다.
본 발명은 또한 발열원 검출에 이용되는 키트를 제공하며, 상기 키트는 1) 상술한 구축 방법에 의해 구축된 세포 모델 또는 상술한 세포 모델; 2) 발열원 표준품; 및 3) IL6 및/또는 TNFα 대조품을 포함한다.
상기 발열원 표준품은 LPS 냉동 건조 분말이고, IL6 대조품은 IL6 냉동 건조 분말이며, TNFα 대조품은 TNFα 냉동 건조 분말인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 발열원 검출에 이용되는 방법을 제공하는데 이하 단계를 포함한다.
1) 테스트하고자 하는 샘플 용액과 발열원 표준품 용액을 만드는 단계;
2) 상기 테스트하고자 하는 샘플 용액을 상술한 구축 방법에 의해 구축된 세포 모델 또는 상술한 세포 모델을 함유하는 배양액 중에 추가하여 37℃에서 5h 배양시키는 단계; 및
3) 배양 후의 상청액을 수집하여 그 중의 IL-6 및/또는 TNF-α의 함량을 측정하는 단계.
단계 3)에 있어서, IL-6 및/또는 TNF-α 함량을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯(Western Blot), ELISA, 금 표준법 또는 질량분광법을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 CRISPR/CAS9 법으로 세포 내에 3개의 유전자를 삽입시키는데 그 중 두 개의 유전자는 한 갈래의 염색체의 지정 위치에 삽입되고 다른 하나의 유전자는 다른 한 갈래의 염색체에 삽입된다. 삽입된 TLR4 유전자는 녹색 형광 GFP에 의해 추적되고, 지정 위치에 삽입된 CD14-MD2는 적색 형광 RFP에 의해 추적된다. 자가절단 2A 펩타이드 다중 유전자 벡터의 구축 전략을 응용하여, 서로 다른 2A 펩타이드를 이용하여 CD14, MD2와 적색 형광 RFP 유전자 구조를 분리시켜, 단백질 발현에 영향을 주는 것을 피하였다.
본 발명의 실시예에 있어서, F2A와 T2A 두 종류의 2A 펩타이드 구조를 이용하였는데, 그 중, F2A는 구제역 바이러스 （foot-and-mouth disease viruses, FMDV）에서 온 2A 펩타이드이고 T2A는 쥐 뇌척수염 바이러스 (Theiler's murine encephalitis virus, TMEV)에서 온 2A 펩타이드이다. 이리하여, 동일한 2A 펩타이드 유전자 서열을 이용하여 발현 벡터를 구축할 시에 교차 반응이 나타나면서 목표 위치에 클론하기 어려운 점을 피하였다.
발열원이 해당 세포 모델을 자극한 후, ELISA, 웨스턴 블롯, 질량분광법, 자성비드(magnetic bead)법 등을 통해 IL-6 및/또는 TNF-α 세포인자 방출을 검출해낼 수 있다.
본 발명의 특징은 이하와 같다.
1. CRISPR/CAS9 기술을 이용하여 지정 위치에 특정 유전자를 삽입한다.
본 발명은 지정 위치에 삽입하는 방식에 의해 외원성 유전자를 세포에 전이시키는 것이지, 바이러스, 슬로바이러스 등 벡터 형식으로 순식간에 형질주입시켜 유전을 안정시키는 것이 아니다. 종래의 CRISPR/CAS9 기술은 일반적으로 유전자 제거 또는 유전자 돌연변이에 많이 응용되는 것으로, 유전자 삽입에 있어서는 종래 방법 중에서의 표적이탈효과, 낮은 동종 재조합 효율, 벡터 삽입 구축과정이 번거로운 등 많은 난관을 극복하여야 하며, 특히 여러 개의 유전자의 삽입을 진행할 시 더욱 큰 어려움이 있다. 하지만 본 발명은 유전자 삽입으로 여러 개의 유전자를 성공적으로 세포계에 삽입하여(예컨대, HEK293T 세포) CRISPR/CAS9 기술에 의한 유전자 삽입이 어려운 문제점을 해결하였다.
2. 유전자를 서로 다른 염색체에 삽입한다.
본 발명은 TLR4 유전자, CD14 유전자와 MD2 유전자 등 3개의 유전자를 두 갈래의 서로 다른 염색체의 지정 위치에 삽입하며, 삽입된 위치는 유전자가 삽입된 후 세포 자체의 생리기능에 영향을 주지 않도록 확보하고 세포의 정상적인 생존과 안정적인 번식을 보장하는 위치이다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 있어서, TLR4 유전자를 HEK 293T의 제19호 염색체 PPR1R12C 유전자 첫번째 인트론 내에 삽입하고, CD14 유전자와 MD2 유전자를 HEK 293T의 제3호 염색체 CCR5 유전자의 첫번째 인트론 내에 삽입하는데, 이 두 위치는 모두 유전자가 삽입된 후에도 세포 자체의 생리기능에 영향을 주지 않음을 확보할 수 있으며, 세포의 정상적인 생존과 안정적인 번식을 보장할 수 있다. 동시에, 세 개의 유전자를 동일한 염색체에 삽입하지 않는 이유는, 동일한 염색체에 삽입하면 입체 장애 효과로 발현에 영향을 줌과 동시에 세 개의 유전자가 융합된 단백질이 너무 커서 염색체의 유전자 발현에 영향을 주기 때문이다. 염색체에 유전자를 삽입한 후에 녹색형광 단백질이나 적색형광 단백질을 추가하면, 단백질의 발현 여부를 추적할 수 있다. 세포 번식 중에도 단백질의 발현을 추적할 수가 있다.
3. 검출 정밀도가 높다.
본 발명이 구축한 세포 모델은 공구 세포에 속하며, LPS의 자극이 없는 상황에서 IL-6, TNF-α 등 세포인자의 발현이 없다. 기타 소스의 세포, 예를 들어 인간 단핵세포는 LPS의 자극이 없더라도 일정 양의 IL-6, TNF-α 등 세포인자의 백그라운드 발현이 있으며, 또한 이러한 백그라운드 발현은 후속적인 검출에 영향을 주게 되나, 본 세포 모형은 LPS의 자극이 없을 시 세포인자의 발현이 없고 백그라운드가 존재하지 않는다. 동시에 일부 유전공학 제품에는 세포 증식을 자극하는 물질이 포함될 수 있으며, 서로 다른 정도의 세포 증식은 검출의 불확실성에 영향을 주게 되나, 본 발명의 세포 모형에는 이러한 위험이 따르지 않는다. 본 발명 세포의 최저 검출 한도는 0.005EU/mL에 달할 수 있으나, 투구게 시약법의 최저 검출 한도는 0.025EU/mL로서 본 발명의 정밀도가 투구게 시약법보다 매우 높은 것을 보여준다.
4. 종래 발열원 검출의 결함을 해결한다.
투구게는 국가 2급 보호동물로서 그 혈액의 공급이 한정되어 있으며, 투구게 시약을 이용할 시 투구게의 보호에 영향을 주어, 생물자원의 지속가능한 발전에 불리하며, 또한 서로 다른 생산업체의 투구게 시약 생산방법도 서로 다르기에 동일 제품의 발열원 검출에서 서로 다른 결과가 나오기 쉽다. 단핵세포 자극 검출 방법은 사람의 혈액을 필요로 하고, 또한 서로 다른 사람에서 온 혈액의 단핵세포 반응성이 안정적이지 않아 해당 방법은 안정하지 못하다. 본 발명이 제공한 세포 모델은 검출 유전자를 염색체에 삽입하여 안정적으로 번식하게 함으로써 발열원의 검출에 대한 반복성이 좋고 반응성이 좋으며 모델이 안정적이여서 전통적 방법과 신형 인체 단핵세포 자극 검출 방법의 결함을 극복하였다.
본 발명의 이로운 효과는 이하와 같다.
본 발명은 유전공학 약품을 포함하는 약품 바이오 제품의 발열원 검출에 이용될 수 있는 세포 모델, 그 구축 방법 및 발열원 검출 방법과 키트를 제공한다. 상기 세포 모델은 CRISPR/CAS9를 이용하여 유전체 특정 위치에 이중결합 파괴가 형성되도록 유도하며, 또한 동종 재조합 수선의 원리를 이용하여, 세포계의 두 개 염색체의 지정 위치에 각각 TLR4 및 CD14-MD2를 삽입하여, 녹색 형광 GFP 와 적색 형광 RFP에 의해 각각 우리가 최종적으로 성공적으로 구축한 TLR4/CD14/MD2가 지정 위치에 삽입된 형광 추적 세포 모델을 추적하며, LPS에 의해 자극된 세포 모델은 ELISA, 웨스턴 블롯, 질량분광법, 자성비드법을 통해 IL-6, TNF-a 세포인자의 방출을 검출할 수 있으며 상기 세포 모델은 안정성이 양호하고 민감성이 높으며, 최저 검출 한도가 0.005EU/mL에 달할 수 있어, 투구게 시약법의 0.025EU/mL보다 매우 낮다.
도1A는 본 발명의 바람직한 실시예 중 TLR4와 pMD19-T가 연결된 플라스미드 모식도이다.
도1B는 본 발명의 바람직한 실시예 중 CD14와 pMD19-T가 연결된 플라스미드 모식도이다.
도1C는 본 발명의 바람직한 실시예 중 MD2와pMD19-T가 연결된 플라스미드 모식도이다.
도2A는 본 발명의 바람직한 실시예 중 TLR4와 pCAG-GFP에 의해 구축된 즉석 발현 벡터 pCAG-TLR4-GFP의 플라스미드 모식도이다.
도2B는 본 발명의 바람직한 실시예 중 CD14와 pCAG-GFP에 의해 구축된 즉석 발현 벡터 pCAG-CD14-GFP의 플라스미드 모식도이다.
도2C는 본 발명의 바람직한 실시예 중 MD2와 pCAG-GFP에 의해 구축된 즉석 발현 벡터 pCAG-MD2-GFP의 플라스미드 모식도이다.
도3은 본 발명의 바람직한 실시예 중 TLR4를 지정삽입하는 벡터 구축 전략이다.
도4는 본 발명의 바람직한 실시예 중 TLR4를 세포에 지정삽입하는 원리 모식도이다.
도5A는 본 발명의 바람직한 실시예 중 TLR4를 세포에 지정삽입한 후 백색광을 비춘 사진이다.
도5B는 본 발명의 바람직한 실시예 중 TLR4를 세포에 지정삽입한 후 자극되어 녹색 형광을 나타내는 사진이다.
도6은 본 발명의 바람직한 실시예 중 MD2-CD14를 지정삽입하는 벡터 구축 전략을 나타내는 모식도이다.
도7은 본 발명의 바람직한 실시예 중 MD2-CD14를 세포에 지정삽입하는 원리 모식도이다.
도8은 본 발명의 바람직한 실시예 중 MD2-CD14를 세포에 지정삽입한 후의 형광 검출도이다.
도9는 본 발명의 바람직한 실시예 중 네 종류의 세포의 형광 발현 상황을 나타내는 모식도이다.
도10은 본 발명의 바람직한 실시예 중 네 종류의 세포를 공초점 현미경에서 관찰한 발현 상황을 나타내는 모식도이다.
도11A는 본 발명의 바람직한 실시예 중 네 종류의 세포를 PCR 검증에 의해 TLR4에 삽입하는 전략설명도이다.
도11B는 도11A의 PCR 결과 전기영동도이다.
도11C는 본 발명의 바람직한 실시예 중 네 종류의 세포를 PCR 검증에 의해 CD14/MD2에 삽입하는 전략 모식도이다.
도11D는 도11C의 PCR 결과 전기영동도이다.
도12는 본 발명의 바람직한 실시예 중 웨스턴 블롯에 의해 네 종류의 세포의 단백질 발현 상황을 검출한 결과도이다.
도13A는 본 발명의 바람직한 실시예 중 ELISA를 이용하여 검출한 네 종류의 세포계의 LPS에 의한 세포 자극 이후의 IL-6 방출 상황을 나타내는 모식도이다.
도13B는 본 발명의 바람직한 실시예 중 ELISA를 이용하여 검출한 네 종류의 세포계의 LPS에 의한 세포 자극 이후의 TNF-α 방출 상황을 나타내는 모식도이다.
도14는 본 발명의 바람직한 실시예 중 ELISA를 이용하여 검출한 293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 LPS 자극 이후의 IL-6 방출 상황과 시간의 관계도이다.
도15는 본 발명의 바람직한 실시예 중 ELISA를 이용하여 검출한 상이한 세포수의 293T/TLR4/CD14/MD2의 LPS에 의한 자극 이후의 IL-6 방출량을 나타내는 모식도이다.
도16은 본 발명의 바람직한 실시예 중 ELISA를 이용하여 검출한 293T/TLR4/CD14/MD2 세포계의 서로 다른 양의 LPS에 의한 자극 이후의 IL-6 방출 민감성을 나타내는 모식도이다.
도17A는 본 발명의 바람직한 실시예 중 웨스턴 블롯 법을 이용하여 검증한 293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 LPS 자극에 대한 TNF-α 반응성을 나타내는 모식도이다.
도17B는 본 발명의 바람직한 실시예 중 웨스턴 블롯 법을 이용하여 검증한 293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 LPS 자극에 대한 IL-6 반응성을 나타내는 모식도이다.
이하, 구체적인 실시예에 의해 본 발명의 기술적 방안을 설명한다. 다만 본 발명은 이하 실시예의 범위에 한정되는 것이 아니다.
장치 및 재료:
1. 제한효소들은 전부 캐나다 Fermentas 사에서 구입된 것이다.
2. pMD19-T는 바오(Bao) 바이오엔지니어링(중국 대련) 유한회사(Takara)에서 구입된 것이다.
3. pCAG-GFP, pCAG-RFP, pX330, pMCS.DT-A 와pAAV-CAG-RFP 는 전부 Addgene 사에서 구입된 것이다.
4. 인체 단핵세포 분리액 키트는 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 사에서 구입된 것이다.
5. RPMI1640 배지 (무혈청)와 DMEM 배지 (무혈청)은 GIBCO 사에서 구입된 것이고 소태아 혈청은 Hyclone 사에서 구입된 것이다.
6. HEK293T 세포는 중국과학원 (상해) 세포은행에서 구입된 것이다.
7. 서열 측정: 일반 프라이머 또는 특정 프라이머를 이용하여, 북경 AuGCT 사 (北京奧科鼎盛生物科技有限公司)에서 서열을 측정하였다.
본 발명에서 상세한 단계를 제공하지 않은 부분은 모두 관례적인 분자생물학의 방법으로 실시하였거나 관련 시약의 설명서에 따라 실시된 것임은 설명해야 할 부분이다.
실시예1 세포 모델의 구축
1. 인간 말초 혈액 단핵세포cDNA 의 제조
1.1 인간 말초 혈액 단핵세포의 분리와 배양
5mL의 정상인의 신선한 항응고 전혈을 취하여 인간 단핵세포 분리액 키트의 설명서에 따라 조작하여 인간 말초 혈액 단핵세포를 추출한 후, 다시 RPMI1640 배지에 넣어서 원심 분리 세척을 1회 진행하되, 1500r/min로 10min 원심분리를 진행한 후 상청액은 버린다. 매 밀리미터 혈액표본에 3～4mL 의 10% 소태아 혈청이 함유된 RPMI1640 배양액을 넣은 후 재현탁 (Resuspend)하여 세포 수량을 측정한다. 10cm2 배양접시에서 배양된 세포 밀도가 2Х107/mL에 달하도록 조절한 후, 37℃, 5% CO2의 세포 배양박스에서 2～3h 시간 방치한 후 상청액을 제거하여, 벽에 부착된 인간 단핵세포를 얻는다. 이어서, 10μL를 취하여 필요한 희석비율로 희석한 후의 세포 현탁액과 10μL 의 트리판블루 염료액（0.4%）을 혼합한 후, 활세포의 수량을 측정하여, 세포 농도를 2Х107/mL 정도가 되도록 제어한다.
1.2 인간 말초 혈액 단핵세포 cDNA 의 제조
단계 1.1에서 제조한 인간 말초 혈액 단핵세포의 세포 배양액을 버리고, PBS 용액으로 세번 씻어낸 후, 6홀 플레이트의 매 홀에 200μL TRIzol Reagent (Gibco BRL)를 넣어서 세포를 파괴시킨다. 수득한 파괴된 세포를 1.5mL 원심관에 넣고 실온에서 5min 방치한다. 0.1mL의 클로로포름을 넣고 격렬하게 15sec 흔들고 실온에서 2～3min 방치한다. 12,000g, 4℃ 하에서 원심분리를 15min 진행한 후, 물층을 추출하여 다른 1.5mL 의 원심관에 옮긴다. 250μL의 이소프로필 알코올을 추가한 후 잘 섞어서 실온에서 10min 방치한다. 4℃, 12,000g 하에서 10min 원심분리시켜 RNA를 침전시킨 후, 1mL 75% 에탄올을 넣어 세척 침전시키고, 공기 중에서 5~10min 건조시킨다. RNase가 미함유된 DEPC 적정량을 투입하여 RNA를 용해시키고, 55～60℃ 하에서 10min 수욕시켜 RNA 가 충분히 용해되도록 한다. 자외선 분광 광도계로 RNA 샘플의 농도 (OD260) 와 순도 (OD260/OD280)를 측정한 후, RNA 농도를 1μg/μL 로 조절하여 준비해둔다.
RNA 샘플을 70℃ 하에서 5min 수욕변성시킨 후 얼음 위에 5min 방치한다. 하기 반응 시스템에 따라 역전사 반응을 진행시키며 총 반응 체적은 20μL 이다.
RT 반응 시스템
M-MLV 5Х반응 버퍼(reaction buffer) 4μL
dNTP(5mM) 2μL
DTT(0.1M) 2μL
랜덤 프라이머(random primer)(20μM) 5μL
RNasin RNase 억제제 (40U/μL) 0.5μL
M-MLV 역전사효소 (200U/μL) 1μL
RNA(1μg/μL) 5.5μL
잘 섞은 후, 37℃에서 60min, 70℃에서 10min 멸균 시킨 후, 100μL가 될 때까지 물을 추가하고, -20℃에서 보관하여 준비해둔다.
2. TLR4, CD14, MD2 유전자의 벡터 구축과 검증
2.1 TLR4, CD14, MD2 원핵 발현 벡터의 구축과 검증
2.1.1 TLR4, CD14, MD2 유전자 DNA 단편의 수득
NCBI를 이용하여 인간 게놈 TLR4, MD2 와CD14 의 mRNA서열을 검색한다. Primer premier5.0 소프트웨어를 이용하고, 관련 문헌을 참조하여 RT-PCR 프라이머를 설계한다. 각각 MD2와 CD14 포워드 프라이머의 5'단에 제한효소 식별 서열 EcoRI를 인입하고, 리버스 프라이머의 5'단에 제한효소 식별 서열 KpnI 와 보호 염기를 인입하며, TLR4의 포워드 프라이머의 5'단에 제한효소 식별 서열KpnI를 인입하며, 리버스 프라이머의 5'단에 제한효소 식별 서열 SmaI과 보호 염기를 인입하되, 이는 북경 AuGCT사 (北京奧科鼎盛生物科技有限公司)에 의해 합성되었다. 순환 횟수는 순환 그래프를 통해 확정됨으로써 PCR 과정이 지수증식기에 처해 있도록 한다. 그 중, 이용되는 효소 절단 위치는 상응한 유전자에 함유되지 않은 효소 절단 위치이다.
PCR 프라이머 서열과 PCR 생성물의 길이
유전자 프라이머 서열 (5'-3') 생성물 (bp)
MD2-F(SEQ ID No.1) GCGAATTCCATGTTACCATTTCTGTT 482
MD2-R(SEQ ID No.2) CCGGTACCTTGCAATTTGAATTAGGTT
CD14-F(SEQ ID No.3) TAGAATTCATGGAGCGCGCGTCCTGCTTG 1127
CD14-R(SEQ ID No.4) TTGGTACCTCGAAGGCAAAGCCCCGGG
TLR4-F(SEQ ID No.5) TCGGTACCGAGCTCGGATCCATGATGT 2519
TLR4-R(SEQ ID No.6) ATCCCGGGTGCTCACCATCTCGAGGATA
PCR 반응 시스템
cDNA 또는 플라스미드 템플레이트 2μL
센스 프라이머(Sense primer) (10μM) 1μL
안티센스 프라이머(Anti-sense primer) (10μM) 1μL
2ХGoldStar BestMaster Mix 10μL
RNase 미함유 물을 20μL가 될 때까지 추가
PCR 반응조건
유전자 조기변성 변성 어닐링 연장 순환 횟수
MD2 95℃,10min 95℃,45sec 41℃, 30sec 72℃, 1min 35
CD14 95℃,10min 95℃,90s 62℃, 1min 72℃, 2min 35
TLR4 95℃,10min 95℃,90s 62℃, 2min 72℃, 3min 35
반응 후에 아가로오스 겔 전기영동을 진행하여 생성물의 크기를 검증하였는데, 검증 결과 TLR4 유전자가 약 2500bp이고, CD14 유전자가 약 1100bp이며, MD2 유전자가 약 500bp로서, 전부 예상과 부합되었다. TLR4 유전자, CD14 유전자와 MD2 유전자를 각각 아가로오스 겔 DNA 회수 키트를 이용하여 회수하여, -20℃에서 보관한다.
2.1.2 TLR4, CD14, MD2 유전자 원핵 발현 벡터의 구축과 검증
회수한 DNA 단편을 각각 pMD19-T 클론 벡터에 연결시킨 후, 그 중의 TLR4를 Kpn I와Sma I 사이에 삽입하고, CD14를 EcoR I와 Kpn I 사이에 삽입하며, MD2를 EcoR I와 Kpn I 사이에 삽입하여 세 종류의 클론 벡터를 수득한 후, 대장균DH5α 중에 형질전환시키고, 증폭시켜 플라스미드를 추출하여 효소 절단을 진행하며, 전기영동으로 양성 클론을 검증한다.
선별된 양성 클론을 pMD19-T-TLR4 라 명명하고 (도1A 참조), pMD19-T-CD14 （도1B 참조）, pMD19-T-MD2 (도1C 참조)에 대한 서열 측정을 진행하여, Pubmed 유전자 데이터베이스로부터 매칭되는 유전자 클론을 검색해낸다.
2.2 TLR4，CD14，MD2 진핵 발현 벡터의 구축과 검증
2.2.1 TLR4，CD14，MD2 진핵 발현 벡터의 구축과 검증
서열 측정이 정확한 pMD19-T-TLR4 양성 클론 플라스미드와 pCAG-GFP 진핵 발현 벡터 플라스미드에 대해 SmaI와 KpnI 이중 효소 절단 반응을 진행하고 효소 절단 단편을 전기영동으로 분리하여, 목표 단편과 벡터 암즈 (vector arms)를 회수한다.
TLR4 단편과 pCAG-GFP 단편을 연결시켜 대장균DH5α에 형질전환시킨 후, 증폭시켜 플라스미드를 추출하여 효소 절단을 진행하며, 전기영동으로 양성 클론을 검증한다.
수득한 재조합 양성 플라스미드를 pCAG-TLR4-GFP 라 명명하고(도2A 참조), 서열을 측정하며, Pubmed 유전자 데이터베이스로부터 매칭되는 유전자 클론을 검색해낸다.
MD2, CD14진핵 발현 벡터의 구축 방법은 TLR4 유전자 발현 벡터와 거의 같으며, 서열 측정이 정확한 pMD19-T-MD2, pMD19-T-CD14 양성 클론 플라스미드와 pCAG-GFP진핵 발현 벡터 플라스미드에 대해, 제한효소 EcoRI 와KpnI를 이용하여 이중 효소 절단을 진행하여 연결하며, 형질전환한 후 단일 클론을 선출하여 배양하며, 플라스미드를 소량 취한 후 다시 이중 효소 절단 검증을 진행하며, 아가로오스 겔 전기영동을 거친후 관찰하여, 목표 단편이 삽입된 크기가 정확한 양성 클론을 선출하여, 각기 pCAG-MD2-GFP (도2B 참조), pCAG-CD14-GFP (도2C 참조)로 명명하며, 서열 측정을 진행하여, Pubmed 유전자 데이터베이스에서 Blast를 검색하여, 유전자 클론의 매칭 여부를 검사한다.
3. CRISPR/Cas9 기술에 의한 TLR4 지정 위치 삽입 세포 모델 구축
3.1 삽입 표적의 확정
NCBI 중의 Nucleotide 데이터베이스를 이용하여 인간 유전체 제19호 염색체 PPPR1R12C 의 유전체DNA 서열을 검색한다. 인간PPP1R12C 유전자는 19q13.42에 위치하고, GeneID：54776이다. 유전체 DNA 총 길이는 26688bp이고, 첫번째 엑손 서열은 1-378bp이고, 첫번째 인트론 서열은 378-4806 bp이며, PPPR1R12C 첫번째 인트론서열을 http://crispr.mit.edu/에 입력하여 적절한 CRISPR 삽입 표적을 평가하며, 상기 사이트에서 제시한 결과에 따라 guideRNA에 적절한 표적을 얻는다. sgRNA 위치는 1849bp에 위치하고, Primer premier5.0 바이오소프트웨어를 이용하여, 프라이머가 1849bp 증폭되고, 포워드가 1000bp 좌우이고 리버스가 1000bp 좌우인 암즈를 설정한다.
본 실시예에서는 제19호 염색체PPPR1R12C 의 유전체 DNA 서열의 첫번째 인트론 위치를 TLR4 유전자 지정 위치 삽입 부위로 선택하는데, 보도된 바에 따르면, 위치에 삽입한 외원성 유전자는 세포 자체의 생리기능에 영향을 주지 않는다. TLR4 유전자도 기타 세포의 생리기능에 영향을 주지 않는 염색체의 위치에 삽입될 수 있고, 서로 다른 유전자 중에 삽입될 수 있으며, 그 표적 프라이머의 설계는 상응한 조절과 변화가 가능하다.
3.2 CRISPR/Cas 9 플라스미드의 설계와 구축
3.2.1 CRISPR/Cas 9 플라스미드의 구축
pX330 플라스미드를 골격으로 하여, 상호보완하는 표적 sgRNA 서열을 합성하고, 그 양단에 BbsI 효소 절단 위치를 인입한다. sgRNA 합성 서열은 표5와 같다.
PPPR1R12C 표적sgRNA 합성서열
프라이머 서열 (5'-3')
센스(SEQ ID No.7) GATCGGGGGCCACUAGGGACAGGAUGTTTTAGAG
안티센스(SEQ ID No.8) CTAGCTCTAAAACAUCCUGUCCCUAGUGGCCCCC
BbsI는 pX330를 효소 절단하고, 효소 절단된 단편을 전기영동 분리시켜, pX330 단일 효소 절단 단편을 회수한다. 상호보완하는 양단sgRNA 단편을 어닐링시켜 인산화시키며, sgRNA를 효소 절단된 선형화 pX330 중에 연결시킨다. 연결 반응 생성물을 대장균 DH5α에 형질전환시키고, 증폭시켜 플라스미드를 추출한 후 BbsI 단일 효소 절단에 의해 반응시키며, 효소 절단 검증 후 전기영동으로 삽입된 단편이 존재하는지 여부를 검사하며, 수득한 재조합 양성 플라스미드를 pPsg-Cas9 라 명명하고, 서열을 측정한다.
3.2.2 표적 벡터의 구축
HEK 293T （293T라 약칭）유전체 DNA를 추출하고, PPPR1R12C 유전자 sgRNA 위치의 포워드, 리버스에서 각각 1000bp 정도의 서열을 선택하여, 표적 벡터의 긴 암즈와 짧은 암즈로 한다. 표6과 같이, Primer premier5.0로 프라이머를 설정한다. PCR 긴 암즈, 짧은 암즈, 겔 회수, pMD19-T 벡터와의 연결, 형질전환, 검증, 서열 측정을 통해, pMD19-T-long arm 플라스미드와 pMD19-T-short arm 플라스미드를 얻는다.
PPPR1R12C 유전자 긴 암즈와 짧은 암즈 프라이머 및 생성물의 길이
명칭 프라이머 서열 (5'-3') 생성물 (bp)
long arm-s(SEQ ID No.9) ACTTTTATCTGTCCCCTCCACCC 1315
long arm-a(SEQ ID No.10) CATCCCTGTGAAAGATGCCTGAG
short arm-s(SEQ ID No.11) TCTTCCGCATTGGAGTCGCTTTA 1172
short arm-a(SEQ ID No.12) GTAAGCTTGAGGGGACAGATAAAAGTA
긴 암즈와 짧은 암즈를 각각 효소 절단한 후 pMCS.DT-A 표적 벡터에 연결하는데 구체적 방법으로서, pMCS.DT-A 플라스미드와 서열 측정이 정확한 pMD19-T-long arm 플라스미드에 대해 Sal I 와 Hind III 이중 효소 절단 반응을 진행시키고, 전기영동과 회수를 진행한 후, T4 연결효소에 의해 긴 암즈 단편과 벡터 단편을 연결시켜 연결반응의 생성물을 대장균 DH5α에 형질전환시키는 것이다. 재조합 플라스미드의 효소 절단 전기영동 검증과 서열 측정 검증을 진행하여, DTA-long arm를 수득한다. 서열 측정이 정확한 DTA-long arm 플라스미드와 pMD19-T-short arm 플라스미드에 대해 Sal I 와 Hind III 이중 효소 절단 반응을 진행시키고, 전기영동하여 회수한 후, T4 연결효소에 의해 짧은 암즈 단편과 DTA-long arm 효소 절단 단편을 연결시키며 연결반응의 생성물을 대장균 DH5α에 형질전환시킨다. 재조합 플라스미드의 효소 절단 전기영동 검증과 서열 측정 검증을 진행하여 DTA-long arm-short arm를 수득하며, 서열을 측정한다.
서열 측정이 정확한 DTA-long arm-short arm 플라스미드（DONOR）와 pCAG-TLR4-GFP 플라스미드에 대해 Spe I 와 Not I 이중 효소 절단 반응을 진행시키고, 전기영동하여 회수한 후, T4 연결효소에 의해 CAG-GFP-TLR4단편과 DTA-long arm-short arm 효소 절단 단편을 연결시켜 연결반응의 생성물을 대장균 DH5α에 형질전환시킨다. 재조합 플라스미드의 효소 절단 전기영동 검증과 서열 측정 검증을 진행하여 DTA-short arm-CAG-TLR4-GFP-long arm 표적 벡터 （TLR4-DONOR）를 수득하는 바, 구축 전략은 도3에 도시된 바와 같으며, TLR4 지정 위치 삽입 세포의 원리 설명도는 도4에 도시된 바와 같다.
3.2.3 표적 벡터와 CRISPR/Cas9 플라스미드의 전기 형질주입
전기 형질주입 24hr전, 6홀 플레이트에서 293T 세포 0.5-1.0Х105세포를 접종시켜, 형질주입 시 세포융합도가 90-95%에 달하도록 한다. 표적 벡터 DTA-short arm-CAG-TLR4-GFP-long arm는 동종 재조합 암즈의 짧은 암즈 5'단에서 BstBI 단일 효소 절단에 의해 선형화된다. PBS로 세포를 세척하고, 트립신 소화 이후 800rpm 원심분리를 3min 진행하여 세포를 수집한다. 전기 형질주입 완충액 (무혈청DMEM)에 의해 293T 세포를 재현탁시켜 농도를 1Х107/mL로 조절한다. 4mm 전기자극컵을 이용하여 매번 세포 300μL, 25ng 표적 벡터, 25ng pPsg-Cas 플라스미드에 전기자극을 준다. 실온에서 조작하되 전기자극은 260v, 30ms이며, 그 후 세포를 6홀 플레이트에 넣고, 2mL 배양액을 추가 보충하여 37℃에서 배양시킨다. 세포에 전기 형질주입 48hr 후, 형광을 관찰한다.
3.2.4 한계희석법에 의한 녹색 형광 단일 클론 선별
성장이 양호한 세포를 수집하여 현탁액을 만든다. 세포계산법에 따라 세포현탁액의 세포수를 정확하게 기록한다. 계단희석법에 따라 세포를 10/mL 세포현탁액으로 만드는데 매 0.1㎖에 하나의 세포가 있도록 한다. 세포현탁액을 96홀 플레이트에 넣되 매 홀에 0.1 ㎖가 있도록 한다. 96홀 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양박스에 넣고, 4일 후에 꺼내서 관찰하여 기록하고 결과를 집계한다. 단일 클론 성장 홀 중, 성장이 양호하고 녹색 형광 양성이 강한 것을 선별하여 24홀 플레이트에 이전시켜, 재클론을 진행하여 배양이나 확대배양을 거친다. 여러번의 번식을 거친 후, 안정적으로 녹색 형광을 발현할 수 있는 세포 클론을 수득할 수 있는 바, 이를 293T/TLR4 세포 클론이라 명명한다. 도5A와 도5B로부터 알다시피, 293T/TLR4를 백색광 조사시 형광이 표시되지 않고, 여기광(exciting light) 조사시 녹색 형광이 표시된다.
4. CRISPR/Cas9 기술에 의한 CD14-MD2 지정 위치 삽입 세포 모델 구축
4.1 pCAG-MD2-2A-CD14-2A-RFP 플라스미드의 구축
pAAV-CAG-RFP를 템플릿으로 하여, RFP 단편을 PCR 증폭시키며, 5'단에 프라이머 설정할 시 F2A 서열을 인입하며 (표7 참조), ageI 효소 절단 위치는 3'단에 Not I 효소 절단 위치를 인입한다. AgeI과 Not I에 의해 pCAG-CD14-GFP 플라스미드를 효소분해시켜 녹색 형광 GFP 단편을 절단하며, F2A-RFP 단편에 연결하는 바, 프라이머 서열은 표8과 같다. 효소 절단 서열 측정 검증에 의해 pCAG-CD14-F2A-RFP 플라스미드를 수득하며, 순식간에 293T 세포에 형질주입되어 형광 발현을 관찰할 수 있다. MD2 단편을 PCR 증폭시키며, 3'단에 T2A 서열 (표7에 표기된 바와 같음)에 Age I 효소 절단 위치를 인입한다. Kpn I에 의해 pCAG-CD14-F2A-RFP 플라스미드를 효소분해시키고, abm 클로닝키드를 이용하여 동종 재조합의 방법에 의해 MD2-T2A 단편에 연결하는 바, 프라이머 서열은 표8과 같다. 효소 절단 서열 측정 검증에 의해 pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP 플라스미드를 수득한다.
F2A 및 T2A의 서열
서열명 서열（5'-3'） 길이
F2A (SEQ ID No.13) CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTT
GCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCT		 54bp
T2A(SEQ ID No.14) GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGT
GACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT		 54bp
F2A-RFP와 MD2-T2A 프라이머 및 생성물의 길이
명칭 프라이머 서열 (5'-3') 생성물 (bp)
F2A-RFP-sense
(SEQ ID No.15)		 CGGGCCCGGGATCCACAGCTGTTGAATT
TTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGT
CGAGTCCAACCCTATGGCCTCCTCCGAG
GAC		 739
F2A-RFP-antisense
(SEQ ID No.16)		 CTGAGGAGTGCGGCCCTACAGGAACAG
GTGGTGGC
MD2-T2A-sense
(SEQ ID No.17)		 TTTGGCAAAGAATTCATG 576
MD2-T2A-antisense
(SEQ ID No.18)		 ACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTC
TGCCCTCCTGATTTGAATTAGGTTG
4.2 삽입표적의 확정
NCBI 중의 Nucleotide 데이터베이스를 이용하여 인간 유전체 제3호 염색체 CCR5의 유전체DNA 서열을 검색한다. CCR5 유전자의 첫번째 인트론 서열을 http://crispr.mit.edu/에 입력하여 적절한 CRISPR 삽입표적을 평가하며, 상술한 사이트에서 제시한 결과에 따라 guideRNA에 적절한 표적을 얻는다.
본 실시예에 있어서, 제3호 염색체 CCR5의 유전체 DNA 서열의 첫번째 인트론 위치를 CD14 유전자와 MD2 유전자의 지정 위치 삽입 부위로 선택하는데, 보도된 바에 따르면, 위치에 삽입한 외원성 유전자는 세포 자체의 생리기능에 영향을 주지 않는다. CD14 유전자와 MD2 유전자는 기타 세포의 생리기능에 영향을 주지 않는 염색체의 위치에 삽입될 수 있고, 서로 다른 유전자 중에 삽입될 수 있으며, 그 표적 프라이머의 설계는 상응한 조절과 변화가 가능하다.
4.3 CRISPR/Cas 9 플라스미드의 설계와 구축
4.3.1 CRISPR/Cas 9 플라스미드의 구축
pX330플라스미드를 골격으로 하여, 상호보완하는 표적 sgRNA 서열을 합성하고, 그 양단에 BbsI 효소 절단 위치를 인입한다. sgRNA 합성 서열은 표9와 같다.
CCR5 표적sgRNA 합성 서열
프라이머 서열 (5'-3')
센스(SEQ ID No.19) GATCGUGAGGGCUUAACACAGUGCCGTTTTAGAG
안티센스(SEQ ID No.20) CTAGCTCTAAAACGGCACUGUGUUAAGCCCUCAC
BbsI는 pX330를 효소 절단하고, 효소 절단된 단편을 전기영동 분리시켜, pX330 단일 효소 절단 단편을 회수한다. 상호보완하는 양단sgRNA 단편을 어닐링시켜 인산화시키며, sgRNA를 효소 절단된 선형화 pX330 중에 연결시킨다. 연결 반응 생성물을 대장균 DH5α에 형질전환시키고, 증폭시켜 플라스미드를 추출한 후 BbsI 단일 효소 절단에 의해 반응시키며, 효소 절단 검증 후 전기영동으로 삽입된 단편이 존재하는지 여부를 검사하며, 수득한 재조합 양성 플라스미드를 pCsg-Cas라 명명하고, 서열을 결정한다.
4.3.2 CCR5 유전자 표적 벡터의 구축
CCR5 유전자 sgRNA 위치의 포워드, 리버스에서 각각 약 1000bp의 서열을 선택하여, 표적 벡터의 긴 암즈로 한다. 표10 과 같이, Primer premier5.0로 프라이머를 설정한다. PCR 긴 암즈, 짧은 암즈, 겔 회수, pMD19-T 벡터와의 연결, 형질전환, 검증, 서열 측정을 진행한다.
PCR 긴 암즈 서열
명칭 프라이머 서열 (5'-3') 생성물 (bp)
long arm-s(SEQ ID No.21) TGGTAACAGTTAGCCACTT 1373
long arm-a(SEQ ID No.22) GATTCTTCATCTTCCCTTT
short arm-s(SEQ ID No.23) AACACCTCCTACTATTTACTG 1072
short arm-a(SEQ ID No.24) AGCCCTCAACATGCAATTTCTC
긴 암즈와 짧은 암즈를 효소 절단한 후 pMCS.DT-A 표적 벡터에 연결하는데 구체적 방법은 단계 3.2.2를 참조하되, 그 중 pMCS.DT-A 벡터에서 Sal I와 HindIII 사이에 짧은 암즈를 연결시키고, Sac II와 Sac I 사이에 긴 암즈를 연결시킴으로써, 최종적으로 DTA-long arm-short arm을 수득한다.
이어서, pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP 플라스미드를 효소 절단한 후, DTA-long arm-short arm 벡터에 연결시키는데 구체적 방법은 단계 3.2.2를 참조하되, 최종적으로 DTA-short arm-CAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP-long arm 표적 벡터를 수득하며, 구축 전략은 도6에 도시된 바와 같고, MD2와 CD14의 지정 위치 삽입 세포의 원리 설명도는 도7에 도시된 바와 같다.
4.3.3 표적 벡터와 CRISPR/Cas9 플라스미드의 전기 형질주입
단계 3.2.3의 방법을 참조하여 표적 벡터와 pCsg-Cas를 293T 와293T/TLR4 중에 전기 형질주입하며, 또한 단계 3.2.4의 방법으로 단일 클론을 선별함으로써, 두 종류의 적색 형광 클론 세포인 293T/CD14/MD2 세포와 293T/TLR4/CD14/MD2 세포를 수득하는데 도8에 도시된 바와 같으며, 두 종류의 세포 클론이 모두 적색 형광을 방출하는 것을 관찰할 수 있다. 그 중 293T/CD14/MD2세포를 비교대상으로 하고, 293T/TLR4/CD14/MD2 세포는 목표 세포계로 한다.
5. 세포 모델 검증
5.1 형광 검증과 공초점 현미경 검증
5.1.1 형광 검증
293T, 293T/TLR4, 293T/CD14/MD2, 293T/TLR4/CD14/MD2 네 종류의 세포계를 합계 3회 번식배양시킨 후 형광을 비추면 도9에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 293T에는 녹색 형광 및 적색 형광 발현이 없고, 293T/TLR4에는 안정적인 녹색 형광 발현이 있으며, 293T/CD14/MD2에는 안정적인 적색 형광 발현이 있으며, 293T/TLR4/CD14/MD2에는 안정적인 녹색형광 발현이 있을 뿐만아니라 안정적인 적색 형광 발현도 있다.
5.1.2 공초점 현미경 검증
상기 네 종류의 세포계를 진일보 공초점 현미경으로 검증하면 도10에 도시된 바와 같은 바, 293T에는 녹색 형광 및 적색 형광 발현이 없고, 293T/TLR4에는 안정적인 녹색형광 발현이 있으며, 293T/CD14/MD2에는 안정적인 적색 형광 발현이 있으며, 293T/TLR4/CD14/MD2에는 안정적인 녹색 형광 발현이 있을 뿐만아니라 안정적인 적색 형광 발현도 있음을 관찰할 수 있다. 상술한 2개 도면이 겹칠 시, 293T/TLR4/CD14/MD2 （Merge모드）에는 녹색 형광과 적색 형광의 겹침이 나타날 수 있으나 293T/TLR4와 293T/CD14/MD2가 겹칠 시, 각각 녹색 형광과 적색 형광을 나타내는데 그 결과는 형광 검증과 일치하다. 또한, TLR4의 녹색광은 세포막과 세포질에 집중되어 있으나, CD14-MD2 적색광은 세포질에 집중되어 있음을 관찰할 수 있다.
5.2 PCR 검증
293T, 293T/TLR4, 293T/CD14/MD2, 293T/TLR4/CD14/MD2 네 종류의 세포계에서 유전체 DNA를 추출하여 유전체의 서로 다른 위치에서 프라이머를 설계하고, 삽입이 정확한지 여부를 확인하는 바, 프라이머 서열은 표11과 같다. 그 중, 야생형을 primer 1+primer2 및 primer4+primer5로는 증폭시켜 단편을 만들 수 있으나, primer 1+primer 3, primer 4+ primer 6으로는 증폭시켜 단편을 만들 수 없다. TLR4가 삽입된 세포를 primer 1+primer 3으로 증폭시켜 단편으로 만들 수 있고, CD14-MD2가 삽입된 세포를 primer 4+ primer 6으로 증폭시켜 단편으로 만들 수 있다. 도11A 부터 도11D에 도시된 바와 같이, PCR 검증을 통해, 293T/TLR4, 293T/CD14/MD2, 293T/TLR4/CD14/MD2 삽입위치가 정확함을 관찰할 수 있다.
PCR 검증의 프라이머 서열
명칭 프라이머 서열 (5'-3')
Primer 1（SEQ ID No.25） TCTTCTTCCTCCAACCC
Primer 2（SEQ ID No.26） GACCCAATATCAGGAGAC
Primer 3（SEQ ID No.27） GGCTATGAACTAATGACCC
Primer 4（SEQ ID No.28） CGGGAATGCTTTGTATC
Primer 5（SEQ ID No.29） TGCCCGCTATGTCTAA
Primer 6（SEQ ID No.30） ATGGGCTATGAACTAATGAC
5.3 웨스턴 블롯 검증 단백질 발현 상황
293T, 293T/TLR4, 293T/CD14/MD2, 293T/TLR4/CD14/MD2 네 종류의 세포계의 파괴에 의해 총 단백질을 추출한다. Actin을 내부 표준으로, 웨스턴 블롯에 의해 TLR4, CD14, MD2 세 종류의 단백질의 발현상황을 검증한다. 도12에 도시된 바와 같이, 293T 세포에는 TLR4, CD14, MD2 발현이 없고, 293T/TLR4에는 TLR4 발현이 있으나, CD14, MD2 발현이 없으며, 293T/CD14/MD2에는 TLR4, CD14, MD2 발현이 있으며, 293T/TLR4/CD14/MD2에는 TLR4, CD14, MD2 발현이 있다.
분석에 의하면, 293T/CD14/MD2는 CD14/MD2의 존재로 인해 세포 내원성의 TLR4를 활성화시킴으로써 소량의 TLR4 발현이 발생된 것이다.
실시예 2 세포 모델을 이용한 발열원 표시물 LPS 검출
1. ELISA에 의한 LPS 자극에 대한 세포의 반응성을 검증 및 IL-6 와TNFα 발현 검출
293T, 293T/TLR4, 293T/CD14/MD2, 293T/TLR4/CD14/MD2 네 종류의 세포계를 LPS 로 자극한 후, ELISA에 의해 상청액 중 IL-6 와 TNFα 세포인자 방출상황을 검출한다. 293T, 293T/TLR4는 LPS 자극에 반응이 없고, 293T/CD14/MD2, 293T/TLR4/CD14/MD2는 LPS 자극 후 IL-6 나 TNFα를 방출하지만 293T/CD14/MD2 이 방출하는 양이 293T/TLR4/CD14/MD2이 방출하는 양보다 많지 않은 바, 도13A와 도13B에 도시된 바와 같다.
계속하여 293T/TLR4/CD14/MD2 세포계를 선택하여 후속적 실험을 진행한다. LPS 자극 이후 서로 다른 시간대의 IL-6 방출상황을 검출한다. 약 5~6h에 IL-6 방출이 최대에 도달하는 바, 도14에 도시된 바와 같다. 상이한 세포수의 293T/TLR4/CD14/MD2가 5EU/mL LPS에 의해 자극된 6h 후 IL-6 방출량은 도15에 도시된 바와 같은바, 104 의 세포량이면 5EU/mL LPS과 반응하여 IL-6을 방출하는 것을 관찰할 수 있다. 293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 LPS 자극에 대한 최저 검출치를 검출하며, 도16에 나타낸 것처럼, 0.005EU/mL LPS이면 293T/TLR4/CD14/MD2 세포를 자극하여 IL-6을 방출하며, 투구게 시약의 최저 검출치보다 양호한 것을 관찰할 수 있다.
2. 웨스턴 블롯 법에 의한 LPS 자극에 대한293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 반응성 검증 및 IL-6 와TNFα 발현 검출
고농도 （4EU/mL）, 중농도（1EU/mL）, 저농도 （0.5EU/mL）의 LPS에 의해 1Х106개 293T/TLR4/CD14/MD2 세포를 자극하고, 6h 후 1mL 배양 상청액을 취하여 200μL까지 농축시킨다. 웨스턴 블롯 법에 의해 검출한 결과에 따르면, 배양 상청액 중 IL-6, TNF-α에 방출이 있는 바, 도17A와 도17B에 도시된 바와 같다.
3. 질량분광법에 의한 LPS 자극에 대한 293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 반응성 검증 및 IL-6과 TNFα 발현 검출
293T/TLR4/CD14/MD2 세포계를 LPS로 5시간 자극한 후 1000μL의 배양 상청액을 취하여 정화시킨 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착 질량분석기(MALDI. TOF-MS)을 이용하여 분석 및 교정을 진행하고, 각 단백질의 펩티드 질량지문을 수득하며, Mascot Distiller 소프트웨어에 의해 단일 동위원소 신호 피크를 식별하며, 수득한 펩티드 단편의 질량-전하 비 (m/z) 수치를 Mas―cot 검색 시스템에 도입하여, IPI.HUMAN.v3.53 단백질 데이터베이스를 검색하는 바, Mascot 점수 > 61점 (P < 0.05)으로서 양성으로 판정된다.
4. 콜로이드 금 검사지법 (금 표준법)에 의한 LPS 자극에 대한 293T/TLR4/CD14/MD2 세포의 반응성 검증 및 IL-6 와TNFα 발현 검출
콜로이드 금 검사지법은 나노 레벨의 콜로이드 금을 추적물과 검출제로 하고, 항원 항체 반응을 응용하는 검출방법으로서, 검출 시에 293T/TLR4/CD14/MD2 세포계를 LPS에 의해 5시간 자극한 후, 측정하고자 하는 샘플과 모델 세포를 총 5시간 배양시킨 후 (웨스턴 블롯과 ELISA 법에서 이용한 샘플 및 배양방법과 같음), 배양액의 상청액 50μL을 각각 IL-6 와 TNFα의 콜로이드 금 검사지 (해당 검사지는 시중에서 판매되고 있거나 또는 주문 제작된 것임)에 넣고 검출 영역의 반응에 의해 IL-6 와 TNFα의 발현이 양성인지 여부를 판정한다.
상술한 실시예로부터 알다시피, 본 발명에서 제공하는 세포 모델은 발열원 자극에 대해 반응하며, 그람 음성 세균의 내독소 및 비 내독소를 근원으로 하는 오염물 뿐만 아니라, 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 바이러스, 진균의 병원체와 관련 분자모드（PAMPs）, 제품 및 가공 공정 관련 바이오나 또는 화학적 실체로부터 근원된 것들도 검출해낼 수 있다. 또한, 그 최저 검출 한도가 투구게 시약보다 낮으며, 그 민감성이 더욱 강하며, 그 안정성도 인간 전혈을 이용한 검출보다 더욱 높다.
[수탁번호]
수탁기관 수탁번호 수탁일자
중국과학원 미생물 연구소 CGMCC No. 12296 20160519
SEQUENCE LISTING <110> Niu Gang <120> Construction method of cell models for detecting pyrogens, cell models and pyrogen detection kits <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 1 gcgaattcca tgttaccatt tctgtt 26 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 ccggtacctt gcaatttgaa ttaggtt 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 tagaattcat ggagcgcgcg tcctgcttg 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 ttggtacctc gaaggcaaag ccccggg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 tcggtaccga gctcggatcc atgatgt 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 atcccgggtg ctcaccatct cgaggata 28 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 gatcgggggc cacuagggac aggaugtttt agag 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 8 ctagctctaa aacauccugu cccuaguggc cccc 34 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 9 acttttatct gtcccctcca ccc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 10 catccctgtg aaagatgcct gag 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 11 tcttccgcat tggagtcgct tta 23 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 12 gtaagcttga ggggacagat aaaagta 27 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 13 cagctgttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa ccct 54 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 14 gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54 <210> 15 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 15 cgggcccggg atccacagct gttgaatttt gaccttctta agcttgcggg agacgtcgag 60 tccaacccta tggcctcctc cgaggac 87 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 16 ctgaggagtg cggccctaca ggaacaggtg gtggc 35 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 17 tttggcaaag aattcatg 18 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 18 acgtcaccgc atgttagaag acttcctctg ccctcctgat ttgaattagg ttg 53 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 19 gatcgugagg gcuuaacaca gugccgtttt agag 34 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 20 ctagctctaa aacggcacug uguuaagccc ucac 34 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 21 tggtaacagt tagccactt 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 22 gattcttcat cttcccttt 19 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 23 aacacctcct actatttact g 21 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 24 agccctcaac atgcaatttc tc 22 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 25 tcttcttcct ccaaccc 17 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 26 gacccaatat caggagac 18 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 27 ggctatgaac taatgaccc 19 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 28 cgggaatgct ttgtatc 17 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 29 tgcccgctat gtctaa 16 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 30 atgggctatg aactaatgac 20

Claims (10)

  1. 발열원의 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법에 있어서,
    1) TLR4 유전체를 녹색 형광으로 발현할 수 있는 발현 벡터에 넣어 TLR4 유전자가 함유된 재조합 플라스미드를 구축하는 단계;
    2) CRISPR/CAS9 법을 이용하여 TLR4 유전자를 세포계의 하나의 염색체 상의 하나의 유전자의 인트론 내의 지정 위치에 삽입함으로써 하나의 TLR4 유전자를 안정적으로 발현하는 세포계를 수득하는 단계;
    3) 서로 다른 두 개의 2A 펩티드를 이용하여, CD14, MD2 와 적색 형광 RFP 유전자 구조를 분리시켜, CD14 유전자와 MD2 유전자가 함유되고 적색 형광을 발현할 수 있는 재조합 플라스미드를 구축하는 단계; 및
    4) CRISPR/CAS9 법을 이용하여, 단계 2)에서 수득한 세포계의 상기 TLR4 유전자가 삽입된 염색체 이외의 다른 염색체 상의 하나의 유전자의 인트론의 지정 위치에, CD14 유전자와 MD2 유전자를 삽입하여, TLR4 유전자, CD14 유전자 및 MD2 유전자를 안정적으로 발현함과 동시에 녹색 형광과 적색 형광을 발현할 수 있는 하나의 세포주, 즉 상기 세포 모델을 수득하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포계는 HEK293T, HEK293 또는 NIH3T3인 것을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 2)에 있어서, TLR4 유전자가 삽입된 위치가 제19호 염색체 PPR1R12C 유전자 첫번째 인트론인 것을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 4)에 있어서, CD14 유전자 및 MD2 유전자가 삽입된 위치가 제3호 염색체 CCR5 유전자 첫번째 인트론인 것을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법에 의해 구축된 세포 모델에 있어서,
    상기 세포 모델은, 세포계 HEK293T 의 제19호 염색체 PPR1R12C 유전자 첫번째 인트론의 지정 위치에 TLR4 유전자가 삽입되고, 제3호 염색체 CCR5 유전자 첫번째 인트론의 지정 위치에 CD14 유전자 및 MD2 유전자가 삽입된 것
    을 특징으로 하는, 세포 모델.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포 모델의 분류 명칭은 인간배아신장세포 （HEK） 변종 293T/TLR4/CD14/MD2이고, 보관기관은 중국 미생물 균종 보관 관리 위원회 일반 미생물 센터 (中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)이며 그 주소는 북경시 조양구 북진서로 1호원 3호 (北京市朝陽區北辰西路1號院3號), 중국과학원 미생물 연구소 (
    Figure pct00005
    )이고, 보관일자는 2016년05월19일이며 보관번호는 CGMCC No. 12296인 것
    을 특징으로 하는, 세포 모델.
  7. 발열원 검출에 이용되는 키트에 있어서,
    1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법에 의해 구축된 세포 모델, 또는 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포 모델;
    2) 발열원 표준품; 및
    3) IL6 및/또는 TNFα 대조품
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 발열원 표준품은 LPS 냉동 건조 분말이고, IL6 대조품은 IL6 냉동 건조 분말이며, TNFα 대조품은 TNFα 냉동 건조 분말인 것
    을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 키트.
  9. 발열원 검출에 이용되는 방법에 있어서,
    1) 테스트하고자 하는 샘플 용액과 발열원 표준품 용액을 만드는 단계;
    2) 상기 테스트하고자 하는 샘플 용액을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 발열원 검출에 이용되는 세포 모델의 구축 방법에 의해 구축된 세포 모델 또는 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포 모델을 함유하는 배양액 중에 첨가하여 37℃에서 5시간 배양시키는 단계; 및
    3) 배양 후의 상청액을 수집하여 그 중의 IL-6 및/또는 TNF-α의 함량을 측정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    단계 3)에 있어서, IL-6 및/또는 TNF-α 함량을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯(Western Blot), ELISA, 금 표준법 또는 질량분광법을 이용하는 것
    을 특징으로 하는, 발열원 검출에 이용되는 방법.
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