KR20180049098A - 비알코올성 지방간염을 진단 및 평가하는 방법 - Google Patents

비알코올성 지방간염을 진단 및 평가하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나, NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하거나, 대상체를 NASH 치료의 잠재적인 수용자 또는 비 수용자로 분류하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 시행하기 위한 키트, 및 NASH의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물에 관한 것이며, 여기서 치료될 대상체는 본 발명의 방법에 따라 확인되거나, 평가되거나 분류된다.

Description

비알코올성 지방간염을 진단 및 평가하는 방법
본 발명은 비알코올성 지방간염(NASH)의 진단 방법, NASH의 활성(activity), 단계(stage), 또는 중증도(severity)를 측정하는 방법 또는 대상체를 NASH의 치료의 잠재적인 수용자(receiver) 또는 비 수용자(non receiver)로서 분류하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 시행하기 위한 키트(kit), 및 NASH의 치료 방법에서 사용하기 위한 화합물에 관한 것이며, 여기서 치료될 대상체는 본 발명의 방법에 따라 확인되거나, 평가되거나 분류된다.
비알코올성 지방간염(NASH)은 조직학적으로 알코올성 간염과 비슷한 지방산 축적, 간세포 손상 및 염증에 의해 특징화되는 간의 진행성 질환이다. NASH는 간 지방증으로부터 간경변증 및 간부전으로 확장되는 공정의 주요 단계이다. 유의적인 알코올 흡수의 결여의 조심스러운 병력은 이러한 진단을 확립하는데 필수적이다. NASH는 간 전문가에게서 평가를 위해 언급되는 환자에서 상승된 아미노트랜스퍼라제의 가장 일반적인 원인들 중 하나이다. 비만 및 2형 당뇨병이 NSAH와 연관되어 있다. 이들 질환의 유병률이 증가하고 있기 때문에, NASH의 유병률이 또한 증가되는 것으로 예측되므로, 이러한 질환은 다른 국가뿐만 아니라 미국에서도 최근 공공의 쟁점이 되고 있다.
NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 진단하고 측정하기 위한 비-침습성 방법을 제안하기 위한 수개의 시도가 이루어져 왔지만, 오늘날까지 간 생검의 조직학적 분석이 조기 단계의 지방증으로부터 NASH를 구별하는 최적의 시도로 남아있다. 지방증, 간엽 및 간문맥 염증, 벌루닝(ballooning) 및 세포자멸사(apoptosis) 형태의 간세포 손상, 및 섬유증은 생검으로부터 평가된 NASH의 특징이다. 그러나, 간 생검은 다수의 명백한 단점을 갖는다. 첫째로, 간 생검에서 수집된 물질은 진단된 대상체의 간의 매우 작은 부분만을 나타냄으로써, 수집된 샘플이 대상체의 기관의 전체 상태를 대표하는지의 여부에 대한 의심을 불러일으킨다. 더욱이, 간 생검은 환자에게 복잡하고 느리며, 걱정스럽고 고통스러울 수 있는 매우 침습성인 과정이며, 이환율 및 사망률에 대한 걱정을 불러일으킨다. 결국, 상기의 관점에서, 간 생검은 일반적인 집단 속의 개인, 또는 NASH의 위험이 있는 환자조차 NASH로 고생하는지의 여부를 측정하고/하거나 상기 개인에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하기 위한 정규 과정으로서 충분이 제안될 수 없다.
따라서, 대상체에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 진단하고 측정하기 위한, 정밀하고, 비-침습성인 수단을 제공하기 위한 강력한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 환자의 간 생검으로부터 수득된 조직학적 데이타를 포함하여, 본 출원인에 의해 수행된 임상 시험(연구 GFT505-212-7 - NCT01694849) 동안에 NASH 환자로부터 수득된 300개 이상의 고 품질 샘플로부터 측정된 엄청난 수의 변수들의 매우 정밀하고 완전한 분석을 기반으로 한다. 당해 연구는 NASH 및 이의 중증도 또는 단계 또는 활성의 지표인 주요 순환하는 인자(또는 바이오마커)의 발견을 유도하였다.
따라서, 본 발명의 제1 국면은 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 비알코올성 지방간염(NASH)의 마이크로-RNA 마커 및 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 레벨의 측정을 포함하는, 대상체에서 NASH를 진단하거나, NASH의 활성(activity), 단계(stage), 또는 중증도(Severity)를 측정하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 이러한 제1 국면은 다음에 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계를 포함하여, 대상체에서 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하는 방법에 관한 것이다:
(i) 알파 2 매크로글로불린
(ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
제1 국면의 특정의 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 하기의 측정의 시행을 포함한다:
(i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨을 측정하는 단계;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨을 측정하는 단계;
(iv) hsa-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
(v) hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계;
상기에서, 대조군 샘플의 것과 비교하여 상기 레벨의 증가는 NASH의 지표 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표이다.
본 발명의 제1 국면의 추가의 구현예에서,
- 측정 단계(ii)는 적어도 HbA1c의 레벨을 측정하는 단계를 포함하고/하거나;
- 측정 단계 (iv)는 적어도 hsa-miR-34의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다.
다른 국면에서, 제1 국면의 방법은 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다.
제1 국면의 여전히 다른 국면에서, NASH 점수(NASH score)는 측정 단계(i) 내지 (v)에서 측정된 레벨로부터 계산되고, 여기서 NASH가 진단되고/되거나 NASH 단계 또는 중증도가 상기 NASH 점수를 기준으로 측정된다.
제1 국면의 또 다른 구현예에서, 상기 NASH 점수는 하기 로지스틱 함수(logistic function)에 따라 계산된다:
Figure pct00001
상기에서:
Y= k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F,
상기 식 중,
S는 NASH 점수이며;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이고;
B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)이며;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이고;
D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이며;
F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이고;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이며;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이고;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이며;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이고;
d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이며;
f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
당해 구현예의 구체적인 변형에서:
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수이다.
제1 국면의 추가의 구현예에서, 0.102 내지 0.6465 사이에 포함된 역치 값(threshold value)보다 높은 NASH 점수는 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표이다.
당해 구현예의 변형에서:
k는 25.13과 같고;
a는 0.60과 같으며;
b는 0.48과 같고;
c는 0.1과 같으며;
d는 -0.43과 같고; 및
f는 -0.45와 같으며;
여기서 상기 역치 값은 0.102 내지 0.462 사이에 포함되고, 보다 특히 0.23과 같다.
당해 구현예의 대안의 변형에서:
k는 21.35와 같고;
a는 0.62와 같으며;
b는 0.55와 같고;
c는 0.14와 같으며;
d는 -0.38과 같고;
f는 -0.39와 같으며;
여기서 상기 역치 값은 0.2319 내지 0.6465 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4343과 같다.
본 발명의 제2 국면은 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 비알코올성 지방간염(NASH)의 마이크로-RNA 마커 및 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 간 손상의 마커의 레벨을 측정함을 포함하여, NASH에 대한 치료의 수용자 또는 비수용자로서 대상체를 분류하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 당해 제2 국면은 하기과 같이 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계를 포함하여, 비알코올성 지방간염(NASH)에 대한 치료의 수용자 또는 비-수용자로서 대상체를 분류하는 방법에 관한 것이다:
(i) 알파 2 매크로글로불린,
(ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨,
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드,
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p),
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
본 발명의 제2 국면의 특정의 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 하기의 측정의 시행을 포함한다:
(i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨을 측정하는 단계;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계;
(iii) 콜라제 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨을 측정하는 단계;
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
(v) hsa-miR-200 (특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨을 측정하는 단계;
여기서, NASH 점수는 측정 단계 (i) 내지 (v)에서 측정된 레벨로부터 계산되고, 여기서 상기 대상체는 상기 점수를 기반으로 NASH에 대한 치료의 수용자로 또는 비수용자로 분류된다.
제2 국면의 추가의 구현예에서:
- 측정 단계 (ii)는 적어도 HbA1c의 레벨을 측정하는 단계를 포함하고/하거나;
- 측정 단계 (iv)는 적어도 hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p)의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다.
제2 국면의 다른 구현예에서, 상기 방법은 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p) 및 hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다.
제2 국면의 여전히 다른 국면에서, NASH 점수는 하기의 로지스틱 함수에 따라 계산된다:
Figure pct00002
상기에서:
Y= k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F이고,
상기 식 중,
S는 NASH 점수이고;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이며;
B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)이고;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이며;
D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이고;
F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이며;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
당해 구현예의 변형에서:
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수이다.
제2 국면의 여전히 다른 구현예에서, S가 0.102 내지 0.6465 사이에 포함된 역치 값보다 더 높은 경우 대상체는 치료의 수용자로서 분류된다.
당해 구현예의 변형에서:
k는 25.13과 같고;
a는 0.6과 같으며;
b는 0.48과 같고;
c는 0.1과 같으며;
d는 -0.43과 같고;
f는 -0.45와 같으며;
여기서 상기 역치 값은 0.102 내지 0.462 사이를 포함하고, 보다 특히 0.23과 같다.
상기 구현예의 대안적 변형에서:
k는 21.35와 같고;
a는 0.62와 같으며;
b는 0.55와 같고;
c는 0.14와 같으며;
d는 -0.38과 같고;
f는 -0.39과 같으며;
여기서 상기 역치 값은 0.2319 내지 0.6465 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4343과 같다.
본 발명의 제3 국면은 대상체에서 비알코올성 지방간염(NASH), 또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표인 NASH 점수를 계산하는 방법으로, 여기서 상기 점수는 하기와 같이 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 측정을 기반으로 하는 방법에 관한 것이다:
(i) 알파 2 매크로글로불린,
(ii) 당화된 헤모글로불린(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨,
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드,
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p),
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
제3 국면의 구현예에서, 하기 (i) 내지 (v) 측정은 상기 대상체의 혈액, 혈철 또는 혈장 샘플로부터 측정된다:
(i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨;
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨; 및
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨.
제3 국면의 특정의 구현예에서, 상기 방법은 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p) 및 hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 NASH 점수는 다음의 로지스틱 함수에 따라 계산된다:
Figure pct00003
상기에서:
Y= k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F,
상기 식 중,
S는 NASH 점수이고;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이며;
B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)이고;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이며;
D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이고;
F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이며;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
당해 구현예의 특수한 변형에서:
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수이다.
당해 구현예의 다른 특수한 변형에 있어서:
k는 25.13과 같고;
a는 0.6과 같으며;
b는 0.48과 같고;
c는 0.1과 같으며;
d는 -0.43과 같고;
f는 -0.45와 같다.
당해 구현예의 여전히 다른 구체적인 변형에서:
k는 21.35와 같고;
a는 0.62와 같으며;
b는 0.55와 같고;
c는 0.14와 같으며;
d는 -0.38과 같고;
f는 -0.39와 같다.
제4 국면에서, 본 발명은:
(i) 알파 2 매크로글로불린;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
(iv) has-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커; 및
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 제4 국면의 키트는 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p) 및 hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 제5 국면에서, 본 발명은:
(a) 상기 기술된 방법에 따라 대상체에서 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하는 단계;
(b) 단계 (a)를 기준으로 하여 상기 대상체에게 NASH에 대한 치료제를 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상체에서 NASH를 치료하는 방법에 관한 것이다.
제6 국면에서, 본 발명은:
(a) 상기 기술된 방법에 따라 상기 대상체를 분류하는 단계;
(b) 상기 대상체가 단계 (a)에 따른 치료의 수용자로서 분류되는 경우 상기 대상체에게 비알코올성 지방간염(NASH)에 대한 치료제를 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상체에서 NASH를 치료하는 방법에 관한 것이다.
제5 및 제6 국면의 구현예에서, 치료는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00004
상기 화학식 I에서:
X1은 할로겐, R1, 또는 G1-R1 그룹을 나타내고;
A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 그룹을 나타내며;
X2는 G2-R2 그룹을 나타내고;
G1 및 G2는 동일하거나 상이하며, 산소 또는 황의 원자를 나타내며;
R1은 수소 원자, 비치환된 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 알콕시 또는 알킬티오 그룹, 사이클로알킬 그룹, 사이클로알킬티오 그룹 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 나타내고;
R2는 적어도 -COOR3 그룹(식 중, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타냄)으로 치환된 알킬 그룹을 나타내며;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타낸다.
제5 및 제6 국면의 다른 특정의 구현예에서, 화합물은,
1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온,
1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-이소프로필옥시 카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시페닐] 프로프-2-엔-1-온,
1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐 디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
1-[4-트리플루오로메틸 옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시 페닐] 프로프-2-엔-1-온,
1-[4-트리플루오로메틸옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸 옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸프로판산, 및
2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸-프로판산 이소프로필 에스테르; 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
제5 및 제6 국면의 다른 특정의 구현예에서, 화합물은 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
제5 및 제6 국면의 다른 특정의 구현예에서, 치료는 하기 나타낸 바와 같은 표 1의 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 국면 및 구현예는 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1a 내지 도 1g는 부트스트랩 모델(Bootstrap model)로부터 유도된 본 발명의 방법에 따른 NASH 점수매김(도 1a)과 기존의 점수의 비교를 나타낸다.
발명의 상세한 설명(DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION)
본 발명은 대상체에서 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나 또는 NASH의 활성(activity), 단계(stage), 또는 중증도(severity)를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체를 비알코올성 지방간염(NASH) 치료의 수용자 또는 비 수용자로 분류하는 방법에 관한 것이다. 당해 분류는 또한 대상체가 간 생검을 받는 것에 의해서와 같이 당해 분야에 공지된 방법에 의해 NSAH의 추가의 확인을 겪어야 하는지의 여부를 추가로 측정하는 것에 대한 기준일 수 있다.
본 발명은, 총괄하여 고려하는 경우, NASH 또는 이의 중증도 또는 단계 또는 활성에 대해 시험된 대상체에서 NASH의 지표 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표인 순환하는 마커의 규정된 세트의 확인으로부터 기인한다. 본 발명은 특히 순환하는 마이크로-RNA(들)(miRNA(들))의 레벨의 측정과 간 손상의 다른 순환하는 마커를 조합하여 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나 대상체에서 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명자에 의해 수집된 데이타는 질환 및/또는 이의 중증도 또는 단계 또는 활성의 지표인 점수의 측정으로 이끎으로써, 주치의가 대상체가 NASH를 앓는지를 용이하게 측정하거나, 질환의 단계 또는 활성 또는 중증도를 측정하기 위한 강력하고, 정밀하며 고도로 예측성인 도구를 제공하는 2개의 상이한 생물통계학적 시도에 따라 가공되었다. 다음의 설명에서 "NASH 점수(score)"로 달리 명명된 당해 점수는 비-침습성 과정을 사용하여, 즉, 간 생검에 의존하지 않고 NASH의 중증도 또는 단계 또는 활성의 진단 또는 측정을 가능하도록 하므로, 이를 필요로 하는 참여자 및 대상체 둘 다에 대해 매우 유용한 도구이다.
본 발명의 방법은 마이크로-RNA 마커인 적어도 하나의 마커 및 간 손상의 적어도 하나의 다른 순환하는 마커의 레벨의 측정을 포함한다. 본 발명의 방법은, 보다 특히, 하기 그룹 (i), (ii), 및 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 하기 그룹 (iv) 및 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨의 측정을 포함한다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기의 레벨을 측정하는 것을 포함한다:
- 그룹 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 및 각각의 그룹 (iv) 및 (v)로부터의 적어도 하나의 마커;
- 각각의 그룹 (i) 및 (ii) 또는 (ii) 및 (iii) 또는 (i) 및 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 및 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커;
- 각각의 그룹 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 및 그룹 (iv) 및 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커;
- 하기 마커 (i), (ii), (iii), (iv) 및 (v)의 각각의 그룹에서 적어도 하나의 마커, 즉:
- (i)에 나열된 마커; 및
- (ii)에 나열된 적어도 하나의 마커; 및
- (iii)에 나열된 마커; 및
- (iv)에 나열된 적어도 하나의 마커;
- (v)에 나열된 마커.
마커의 그룹은 하기와 같이 정의된다:
(i) 알파 2 매크로글로불린
(ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
본 발명에 따라서, "비알코올성 지방간염" 또는 "NASH"는 간 지방증(liver steatosis), 간세포 벌루닝(hepatocyte ballooning) 및 간 염증(liver inflammation)의 존재로 정의된다. 질환의 당해 기본적 정의에 대해, NASH는 간 섬유증을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 대상체는 포유동물, 특히 사람 대상체이다. 본 발명은 이의 비-침습성 특성 덕분에 NASH에 대해 공지된 또는 예측된 소인이 없는 대상체와 같은, 어떠한 대상체에서도 시행될 수 있다. 그러나, 특정의 구현예에서, 대상체는 비만, 당뇨병을 지니거나, 대사 증후군으로 고생하거나, 또는 상승된 간 효소를 가지거나, 비 알코올성 지방간 질환(또는 간 지방증)으로 이미 진단된 대상체와 같이, 미래에 NASH를 가지거나 NASH로 진행될 위험이 있는 대상체이다. 대상체는 또한 이미 확인된 NASH를 지닌 대상체일 수 있으며, 따라서 본 발명의 방법은 간암종 또는 간 이식 또는 심혈관 질환의 발전 위험성을 측정하도록 한다.
본 발명에서 측정된 마커의 레벨은 특히 혈액, 보다 특히 혈청 또는 혈장 샘플일 수 있는, 대상체의 체액으로부터 측정된다.
본 발명자들에 의해 확인된 마커의 레벨은 바이오마커 유형(예를 들면, 단백질, 마이크로-RNA, 글루코즈 레벨 등)에 따라서, 면역검정(예를 들면, ELISA), 또는 분자 및 생물화학적 검정(정량적 PCR, 비색 검정), 또는 분석 방법(예를 들면, 질량 분광법)과 같이, 당해 분야에 잘 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 시험한 마커가 마이크로-RNA인 경우, 이의 측정은 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 당해 분야에 잘 공지된 다수의 방법에 따라 수행할 수 있다. 요약하면, 측정은 혈장 샘플, 특히 무(free)-세포의, 무(free)-혈소판의 혈장 샘플로부터 추출된 총 RNA로부터 수행된다. 적절한 내부 대조군(예를 들면, 공지된 서열 및 양의 마이크로-RNA(예를 들면, 씨. 엘레강스(C. elegans) miR-39)를 RNA 추출 전에 샘플에 가할 수 있다. Cq 값은 정량적 PCR을 사용하여 측정한다. 시판되는 키트는 이러한 검정을 수행하는데 이용가능하다. 예를 들면, Taqman miRNA qRT-PCR 검정: Taqman MicroRNA 역 전사 키트, TaqMan MicroRNA 검정 20X, 및 TaqMan 유니버설 마스터 믹스(Universal Master Mix) II(Applied Biosystems)를 제조업자의 지시에 따라 사용할 수 있다. 역 전사는 GeneAmp® PCR 시스템 9700 열 사이클러(Applied Biosystems)와 같은 용이하게 이용가능한 PCR 시스템을 사용하여 16℃에서 30분 동안에 이어 42℃에서 30분 및 4℃에서 유지하기 전에 85℃에서 5분 동안과 같은 적절한 사이클링 매개변수로 수행할 수 있다. 역 전사는 멀티플렉스화된 양식으로 시행될 수 있다. 이후에, 정량적 PCT를 CFX96TM 실시간 시스템(C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad)을 사용하여 수행한다. 사이클링 조건은 다음과 같을 수 있다: 총 50회의 주기 동안 95℃에서 10분에 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초, 및 30℃에서 30초. Cq 측정은 정량적 PCR 시스템에서 회귀의 세트(set of Regression)일 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 측정된 Cq 값은 상기 특이적인 매개변수 및 물질을 사용하여 수득가능한 Cq 값이다. 샘플의 Cq 값은 당해 값이 각각의 miRNA의 표준 곡선의 최대 Cq를 초과하는 경우 상기 분석으로부터 제외될 수 있다. 표준 곡선을 반응 효율을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 일련의 희석을 가장 농축된 cDNA 샘플로부터 출발하여 8개 지점에 걸쳐 수행함으로써 상기 표준 곡선이 당해 연구 동안에 직면할 수 있는 모든 잠재적인 주형 농도를 포괄하도록 보증할 수 있다. 표준 곡선은 수득된 Cq 값에 대해 주형의 출발 양의 log를 플롯팅함으로써 구성될 수 있다.
본 발명에 따라서, 그룹 (i) 내지 (v) 각각에서 선택되어 측정된 마커의 레벨 모두가 대조군(또는 참고) 샘플로부터 수득된 참고 값(reference value)과 비교하여 증가되는 경우, 대상체는 NASH를 가지는 것으로 진단되거나, 잠재적으로 NASH를 가지거나 NASH를 가질 가능성이 있는 것으로 진단된다. 참고 샘플은 NAFLD 또는 NASH를 지니지 않는, 2명 이상과 같은, 1명 이상의 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 체액 샘플에 상응할 수 있다.
본 발명에서, 상기 기술된 바와 같은 측정된 바이오마커의 레벨은 또한 질환 점수, 즉 달리 말하면 NASH 점수를 측정하는데 사용될 수 있다. 질환 점수는 낮은, 중간, 및 높은 NASH 활성, 또는 중간 및 중증 NASH 사이를 구별하는 역치 값과 비교될 수 있다. 본 발명에 따라서, 당해 정보는 대상체가 NASH에 대한 치료학적 치료를 제공받을 것인지 아닌지를 측정하는데 유리하게 사용될 수 있다. 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH를 지닌 대상체 만이 치료될 것이다. 따라서, 본 발명은 비알코올성 지방간염(NASH)에 대한 치료의 수용자 또는 비 수용자로서 대상체를 분류하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 상기 정의한 바와 같은 마커의 레벨의 측정, NASH 점수의 계산, 및 상기 NASH 점수를 기준으로 치료의 수용자 또는 비 수용자로서 대상체의 분류를 포함한다. 또한, 대상체의 분류를 또한 사용하여 대상체에서 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 측정하고, 당해 분류를 기준으로 대상체에게 NASH를 회복시키기 위한 식이 및 생활방식 추천을 제공할 수 있다.
본 발명에 따라서, 중간 내지 높은 NASH 활성으로서, 또는 중증 NASH 환자로서 분류된 대상체는 NASH에 대한 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 고려된다. 본 발명의 내용에서, 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH 환자는 다음의 간 생검-유도된 등급을 나타내는 환자로서, 또는 이와 균등하게 정의된다:
- 지방증 등급(steatosis grade) ≥ 1
- 간세포 벌루닝 등급(hepatocyte ballooning grade) ≥ 1
- 간엽 염증 등급(lobular inflammation grade) ≥ 1
- NAS(NAFLD 활성 점수) ≥ 4(NAS는 지방증 등급, 간세포 벌루닝 등급 및 간엽 염증 등급의 합으로서 정의된다)
- 섬유증 단계(fibrosis stage) ≥ 2(예를 들면, 2, 3 또는 4, 특히 2 또는 3과 동일한 섬유증)
특정의 구현예에서, 본 발명의 NASH 점수는 상기 제공된 바와 같이 측정된 다음의 마커 레벨으로부터 계산된다:
- 알파 2 매크로글로불린의 레벨(LVBP_A2M_GL); 및
- HbA1c의 레벨(LBBC_HBA1C_PERC); 및
- 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(LVB_P3NP); 및
- hsa-miR-34 (특히, miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p)의 레벨 (LVMK_HSA_MIR34A_MULTI1_CQ); 및
- hsa-miR-200 (특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p) 의 레벨(LVMK_HSA_MIR200A_MULTI1_CQ).
추가의 특정의 구현예에서, 상기 점수(score)는 하기의 로지스틱 함수로서 정의된다:
Figure pct00005
상기에서, Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F,
상기 식 중,
S는 NASH 점수이고;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이며;
B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)(예를 들면, 측정된 HbA1c 퍼센트가 10%인 경우 B는 10과 동일함)이고;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이며;
D는 hsa-miR-34 (특히 hsa-miR-34a , 보다 특히 hsa-miR-34a-5p)의 레벨(Cq)이고;
F는 hsa-miR-200 (특히 c hsa-miR-200a , 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨(Cq)이며;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
추가의 특정의 구현예에서, 상기 점수는 상기 로지스틱 함수에 따라 계산되며, 여기서:
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d는 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f는 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수이다.
따라서, NASH 점수는 중간 내지 높은 NASH 활성 또는 중증 NASH를 가질 가능성이다. 대상체에 대해 측정된 것으로서 S가 역치 값 이상인 경우, 그 대상체는 NASH에 대해 치료될 것으로, 또는 NASH에 대해 잠재적으로 치료될 것으로 분류된다. S가 역치 값보다 낮은 경우, 대상체는 치료되지 않는 것으로 분류되고/되거나 대상체는 이의 낮은 NASH 활성 또는 중간 NASH를 관리하기 위해 식이 및 생활방식 충고의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특정의 구현예에 따라서, S가 0.102 내지 0.6465 사이에 포함된 역치 값보다 크거나 이와 동일한 경우, 대상체는 치료의 수용자, 또는 잠재적인 수용자로서 분류된다.
특정의 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기재된 바와 같은 중간값 모델(median model)로부터 하기와 같이 유도된다:
k는 25.13과 동일하고;
a는 0.6과 동일하며;
b는 0.48과 동일하고;
c는 0.1과 동일하며;
d는 -0.43과 동일하고;
f는 -0.45와 동일하며;
여기서 상기 역치 값은 0.102 내지 0.462 사이에 포함되고, 보다 특히 0.23과 동일하다.
특정의 구현예에서, 본 출원의 실험 부분에 기재된 바와 같은 부트스트랩 모델로부터 하기와 같이 기원된다:
k는 21.35와 동일하고;
a는 0.62와 동일하며;
b는 0.55와 동일하고;
c는 0.14와 동일하며;
d는 -0.38과 동일하고;
f는 -0.39와 동일하며;
여기서 상기 역치 값은 0.2319 내지 0.6465 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4343과 동일하다.
본 발명은 또한 하기의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다:
(i) 알파 2 매크로글로불린;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p), hsa-miR-122 (특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커; 및
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
본 발명의 특정의 구현예에서, 상기 키트는 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 miR-34a-5p) 및 hsa-miR-200a(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p)의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명의 키트는 전술된 방법을 시행하는데 유용하며 또한 임의로 상기 방법을 시행하기 위한 지시사항을 포함한다. 상기 키트는 상기 확인된 마커의 레벨의 측정을 수행하는데 적절한 시약 및 완충제를 포함할 수 있다. 특히, 키트는 당해 분야에 잘 공지된 것으로서 정량화될 단백질에 대해 특이적인 항체, 및/또는 마이크로-RNA 레벨을 정량화하는데 유용한 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한
(a) 상기 제공된 방법에 따라 대상체내에서 NASH를 진단하거나, NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하는 단계;
(b) 단계 (a)를 기준으로 하여 상기 대상체에게 NASH에 대한 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 NASH를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한:
(a) 대상체를 위에서 정의한 바와 같은 분류 방법에 따라 분류하는 단계;
(b) 상기 대상체가 단계 (a)에 따른 치료의 수용자로서 분류되는 경우, 상기 대상체에게 NASH에 대한 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 NASH를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한:
(a) 대상체를 위에서 정의한 바와 같은 분류 방법에 따라 분류하는 단계;
(b)상기 대상체가 단계 (a)에 따라 비 수용자로서 분류되는 경우 상기 대상체에게 식이 및 생활방식 추천을 제공하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 낮은 NASH, 활성, 또는 중간 NASH를 관리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 NASH를 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 화학식 I의 화합물과 같은 하나 이상의 화합물(들) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 투여를 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00006
상기 화학식 I에서:
X1은 할로겐, R1, 또는 G1-R1 그룹을 나타내고;
A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 그룹을 나타내며;
X2는 G2-R2 그룹을 나타내고;
G1 및 G2는 동일하거나 상이하고, 산소 또는 황의 원자를 나타내며;
R1은 수소 원자, 비치환된 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 알콕시 또는 알킬티오 그룹, 사이클로알킬 그룹, 사이클로알킬티오 그룹 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 나타내고;
R2는 적어도 -COOR3 그룹(식 중, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타냄)으로 치환된 알킬 그룹을 나타내며;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타낸다.
NASH의 치료를 위한 당해 방법의 특정의 구현예에서, 화학식 I의 화합물은 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-이소프로필옥시 카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐 디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸 옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시 페닐] 프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸 옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸프로판산, 및 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸-프로판산 이소프로필 에스테르; 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명의 NASH의 치료 방법에 사용될 수 있는 다른 화합물은 하기 표 1의 분류 및 구체적인 화합물로부터 선택된 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
분류 화합물
Alanine transaminase stimulator HU-002
11-beta hydroxysteroid dehydrogenase (HSD) inhibitor RO5093151
Aldosterone antagonist, anti-oxydant Spirono-lactone /Vit E
Amino-acid SAMe (S-adenosyl-L-methionine)
Analog of human leptin Metreleptin
Anti-apoptotic caspase inhibitor Emricasan (IDN-6556)
Antibiotic Rifaximin
Anti-oxidant MitoQVitamin E
Anti-Oxidant PPARγ Vitamin E Pioglitazone
Anti-oxydant Cysteamine (Cystagon-EC)
Siliphos
Anti-oxydant Biguanide Vitamin E Metformin
Bovine Colostrum Inflammation IMM 124-E
Caspase Inib GS-9450
SCD1 inhibitors Aramchol
DGAT1 inhibitors LCQ908
Fish oil supplement Omega 3
PUFA Opti-EPA
Flavonoid MEDOX (Anthocyanin)
Silymarin
FXR agonist OCA (obeticholic acid)
galectin inhibitor GR-MD-02
GLP-1 Agonist Exenatide
GLP1 mimetic Liraglutide
Immuno-modulator Oral anti a-CD3
EGS21
Bile acids UDCA
Iron Chelator Deferasirox ICL 670 Exjade*j*
Lipid Lowering agent Ezetimibe
musculotropic vasodilator Pentoxifylline
Omega 3 Lovaza
EPA-E (MND-21)
실시예 (EXAMPLES)
샘플 수집 및 분석
임상 연구
임상 시험(NASH에 있어서 제2상 GOLDEN-505 시험(GFT505-212-7 - NCT01694849)는 비알코올성 지방간염(NASH)을 지닌 환자에서 지방간염에 있어서 1일 1회 엘라피브라노르 (1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온)의 효능 및 안전성을 평가하기 위한, 다중심의(multicentre), 무작위처리된(randomized), 이중 맹검(double blind), 위약-조절(placebo-controlled)된 연구이다.
간 생검을 수행하여 다른 변인의 간 질환의 적절한 배제 후 NASH의 진단을 확인하였다. NASH는 무작위 전 6개월 내에 간 생검에 의해 평가된 지방간염으로서 진단되었다. 지방간염 확인은 간 생검의 중심 판독을 기준으로 하였다. NASH 환자는 지방증 등급 ≥ 1 및 간세포 벌루닝 ≥ 1 및 간염 염증 ≥ 1을 포함하는 NAS ≥ 3으로 규정하였다.
본 연구는 각각의 참여하는 센터에서 적절한 규제 기관에 의해 승인되었으며 모든 환자는 의학 연구에 있어서 참여를 위한 동의서를 제출하였다.
혈액 샘플 채취 및 실험실 시험
혈액 샘플을 Central Laboratory Protocol and Manual- Genfit - GFT505-212-7에 따라 수집하였다.
연구 프로토콜에 따라서, 다음의 분석을 수행하였다.
혈액학(HEMATOLOGY)은 헤모글로빈, 헤마크리트, RBC 계수, 백혈구, 백혈구 감별 계수(호중구, 림프구, 호산구, 단핵구, 호염기성 세포-절대값 및 % 값), 혈소판 및 망상적혈구를 포함한다.
생화학(BIOCHEMISTRY) 패널 I은 혈장 글루코즈, 트리글리세라이드(TG), 크레아티닌, 크레아티닌 청소율, 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 크레아틴 포스포키나제(CPK), 알칼린 포스파타제, 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 HbA1c를 포함한다.
생화학 패널 II는 혈장 글루코즈, 크레아티닌, 크레아티닌 청소율, 전체 단백질, 알부민, 나트륨, 칼륨, 클로라이드, 칼슘, 뇨산, 혈액요소성질소(BUN)로서 발현된 우레아, 아스파르테이트 아미노트랜트퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT), 알칼린 포스파타제, 크레아틴 포스포키나제(CPK), 총 빌리루빈, 빌리루빈 접합된, C-반응성 단백질(hsCRP), AST/ALT 비 및 HbA1c를 포함한다.
소변검사는 다음을 포함한다:
-딥스틱 분석(Dipstick analysis)(비중, pH, RBC, 백혈구, 글루코즈, 단백질, 케톤, 빌리루빈, 우로빌리노겐 및 니트라이트)
- 현미경 분석은 RBC, WBC, 관상구조(cast), 결정, 세균, 상피 세포 및 효모를 포함한다.
- 화학 분석(알부민 및 크레아티닌)
혈청학은 HIV ab I/II, HCV ab, HCV RNA(HCVRNA 방문 샘플의 수령시 및 HCV Ab에 대해 '반응성(reactive)' 또는 '불확정성(indeterminate)' 결과의 경우에 단지 시험함) 및 HbsAg를 포함한다.
지질 패널(LIPID PANEL)은 트리글리세라이드(TG), 총 콜레스테롤, 비 HDL-C(계산), 고-밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C), 저 밀도 지질단백질(LDL-C)(계산), 계산된 초 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(VLDL-C)(계산), 아포지질단백질 AI(ApoAI) 및 아포지질단백질 B(ApoB).
소변 화학(URINE CHEMISTRY)은 알파-1-마이크로글로불린, 베타-N-아세틸글루코스아미다제(베타-NAG) 및 호중구-젤라티나제 연관된 리포칼린(N-Gal)을 포함한다.
안전성 마커(SAFETY MARKER)는 호모시스테인, NT-ProBNP, 트로포닌 T, 시스타틴 C, 및 베타2-마이크로글로불린을 포함한다.
혈당 및 기타 지질 매개변수(GLYCEMIC AND OTHER LIPIDIC PARAMETERS)는 렙틴, 인슐린, 항상성 모델 평가(HOMA-IR), 혈청 글루코즈(HOMA-IR의 계산용), 프럭토사민, C-펩타이드 및 유리 지방산(FFA)을 포함한다.
염증성 마커(INFLAMMATORY MARKERS)는 합토글로빈, 피브리노겐, 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6) 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1(PAI-1) Ag(시트레이트)를 포함한다.
간 마커(LIVER MARKERS)는 사이토케라틴-18(CK18)(M65 & M30), 아디노펙틴, 페리틴, 알파2 매크로글로불린, FGF19 & FGF21, 하이알루론산(Advia centaur, 벨기에 Siemens에 의해 조달되고 통관시 Genfit에 부과되는 시약), 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드(PIIINP)(Advia centaur, 벨기에 Siemens에 의해 조달된 시약) 및 매트릭스 메탈로프로테아제-1(TIMP-1)의 조직 억제제(Adviacentaur, Siemens에 의해 조달된 시약)을 포함한다.
샘플 수집 및 저장
당해 바이오마커 연구에 사용된 혈액 샘플을 치료 기간 전에 505.212.7 연구의 환자로부터 채혈하였다. 모든 환자로부터 추가 샘플의 수집, 보관 및 사용에 대한 서면 동의서를 받았다.
시트레이트를 함유하는 2.7mL들이 튜브에 수집한 혈액을 1,500xg에서 15분 동안 원심분리에 의해 15분내 수집으로 혈액 세포로부터 세포-유리된 혈장을 분리하여 가공하였다. 상층액 혈장을 새로운 튜브로 이전시켰다. 튜브를 -70℃에서 유지시켰다.
RNA 추출을 진행하기 위해, 혈장 튜브를 이후 13,000xg에서 2분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 혈소판을 제거하였다. 상층액의 혈소판-유리된 혈장을 새로운 튜브로 이전시키고, 액체 질소 속에서 동결시키고 -80℃에서 저장하였다.
전체 RNA 추출 및 miRNA의 정량화
보존된 miRNA가 들어있는 전체 RNA를 400μl의 혈소판-유리된 혈장으로부터 miRNeasy 추출 키트(miRNeasy 혈청/혈장 키트 (제품 번호 217184))로부터 제조업자의 지시에 따라 1:5의 혈장/QIAzol 비를 사용하여 추출하였다. 합성 스파이크된(synthetic spiked-in) 씨. 엘레간스(C. elegans) miR-39를 RNA 추출 전에 RNA 추출 공정의 내부 대조군으로서 샘플[3,125 fmoles]에 가하였다. 용출을 18μl의 용출 완충액 속에서 수행하였다.
성숙한 miRNA의 발현을 제조업자의 지시에 따라 Taqman miRNA qRT-PCR 검정: TaqMan MicroRNA 역전사 키트(Ref: 4366596, Applied Biosystems, 캘리포니아주 칼스바드 소재), TaqMan MicroRNA 검정 20X(Ref: 4440887, Applied Biosystems) 및 TaqMan 유니버설 마스터 믹스(Universal Master Mix) II(Ref: 4440040, Applied Biosystems)를 사용하여 검출하였다.
역 전사를 GeneAmp® PCR 시스템 9700 열 사이클러(Ref: 200005, Applied Biosystems)를 사용하여 16℃에서 30분에 이어 42℃에서 30분 및 85℃에서 5분 후 4℃에서 유지의 사이클링 조건을 사용하여 수행하였다. 역 전사를 4개의 miRNA 특이적인-역 프라이머를 사용하여 멀티플렉싱하여 RNA 샘플을 보존하였다.
정량적 PCR을 CFX96TM 실시간 시스템(C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad)을 사용하여 95℃에서 10분에 이어 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초의 사이클링 조건으로 총 50회의 사이클 동안 및 30℃에서 30초 동안 수행하였다.
잠재적인 이익이 있는 miRNA에 대한 특이적인 프라이머의 서열을 다음 표 2에 따라 선택하였다.
표 2: 시험한 miRNA의 서열
Figure pct00007
알고리즘의 제작에 사용된 데이타는 Cq 양식이었다. Cq 측정 방식은 회귀범(regression)였다.
통계적 분석
목적 및 정의
이들 분석의 목적은 치료될 NASH 환자의 확인과 관련될 수 있는 바이오마커를 발견하는 것이었다. 치료될 환자(TBT)는 다음과 같이 정의되었다:
· 섬유증 단계 ≥ 2 및
· NAS ≥ 4 및
· 간엽 염증 등급 ≥ 1 및
· 지방증 등급 ≥ 1 및
· 벌루닝 등급 ≥ 1.
다른 환자는 치료되지 않을 것(NTBT)으로 기술되었다. 분석을 위해, 반응 변수에 있어서 TBT 환자를 1로 분류하였고 NTBT를 0으로 분류하였다. 상기 나타낸 바와 같이, 설명적인 변수는 혈액에서 측정된 광범위한 바이오마커(혈액학, 생화학, 응집, 간 마커, 순환하는 miRNA) 또는 뇨(딥스틱, 침전) 샘플 및 또한 인구학(연령, 성별, 인종), 영역(연구센터, 국가, 대륙) 또는 진료(당뇨병) 기록을 포함하였다
데이타세트 관리
본 연구에 사용된 데이타세트는 Golden-505 시험으로부터 왔으며 초기에 274명의 환자 및 121개의 변수로 구성되었다. 데이타세트 관리는 다음 단계를 포함하였다:
1. miRNA 측정없이 28명의 환자 제거
2. 10 이상의 결측 값을 지닌 9개 변수의 제거
3. 극한 값(extreme value)을 지닌 7명의 환자와 나머지 결측 값을 지닌 28명의 환자 제거.
이는 설명적 변수들 사이의 공선성(collinearity)을 시험하기 위해 사용된 211명의 환자 및 112개의 변수를 지닌 데이타세트를 생성하였다.
공선성(collinearity)의 시험
피어슨 상관관계(Pearson correlation)를 정량적 변수 사이에서 2x2(two by two)로 계산하였다. 2개의 변수가 0.7을 초과하는 상관관계를 나타낸 경우, 환자 TBT를 정의하는 반응 변수와 관련하여 이들의 평균에 있어서의 차이의 단변량 시험을 수행하였다. 선택된 변수는 보다 유의적이었다. 공선적 및 선택된 변수는 표 2에 나타낸다.
제거되는 경우 35개의 유일한 공선적 변수 및 분석에 사용된 최종 데이타세트는 77개의 변수(환자 확인번호, 반응 변수, 5개의 조직학적 등급 및 70개의 설명적 변수) 및 211명의 환자(95명의 TBT 및 116명의 NTBT)를 포함하였다.
표 3. 공선성 시험에서 선택된 및 떨어진 변수
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
중앙 모델
데이타세트를 2/3 트레이닝 세트 및 1/3 입증 세트로 일백만회 분배하고, TBT 및 NTBT 환자 분포에서 계층화하였다. 이들 상이한 가능한 분배에서, 27,477개는 모든 설명적 변수 및 조직학적 등급에 있어서 트레이닝과 입증 세트 사이에 유의적인 차이가 없음을 나타내었으며 분석을 위해 사용하였다.
로지스틱 회귀분석을 반응 변수와 70개의 설명적 변수 사이에서 수행한 후 27,477개의 트레이닝 세트에서 알카이크 정보 기준(Akaike Information Criterion: AIC)을 사용한 변수 선택을 수행하였다. 이는 70개의 변수에 대해 27,477개의 상이한 계수를 생성하였다. 중앙 모델은 변수를 0과는 상이한 중앙 계수와 합하여 생성하였다(표 4).
표 4. 중앙 모델의 결과 (cor: 공선 변수)
Figure pct00011
LVBP_A2M_GL: 알파 2 매크로글로불린; LBBC_HBA1C_PERC: HbA1c; LVB_P3NP: 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드; lvmk_hsa_mir34a_multi1_cq: miR-34a; lvmk_hsa_mir200a_multi1_cq: miR-200a.
그 후, 모델을 27.477개의 세트 각각에 대해 ROC 곡선 하 영역(AUC)을 계산함으로써 입증하였다. AUC는 0.82(95% CI: 0.72-0.91)이었다. 중앙 AUC를 사용하여, 3개의 역치는 환자를 TBT 또는 NTBT로서 예측하기 위해 정의하였다:
1. 1-특이성 = 0% 및 민감성 = 100%을 지닌 점에 가장 가까운 역치는 0.23과 같았다. 상응하는 분할표는 표 5a에 나타내며 다음 지수를 생성하였다:
· 전체 정확도: 80.28%
· 민감성: 81.25%
· 특이성: 79.49%
· PPV(양성의 예측값): 76.47%
· NPV(음성의 예측값): 83.78%
2. 90%를 초과하는 민감성을 제공하는 역치는 0.102와 동일하였다. 상응하는 분할표는 표 5b에 나타내며 다음 지수를 생성하였다:
· 전체 정확도: 63.38 %
· 민감성: 90.63 %
· 특이성: 41.03 %
· PPV(양성의 예측값): 55.77 %
· NPV(음성의 예측값): 84.21 %
3. 90%를 초과하는 특이성을 제공하는 역치는 0.462와 동일하였다. 상응하는 분할표는 표 5c에 나타내며 다음의 지수를 생성하였다:
· 전체 정확도: 70.42 %
· 민감성: 43.75 %
· 특이성: 92.31 %
· PPV(양성의 예측값): 82.35 %
· NPV(음성의 예측값): 66.67 %
표 5a. 중앙 모델 및 0.23의 역치에 의해 관찰되고 예측된 TBT/NTBT 환자의 분할 표(Contingency table)
Figure pct00012
표 5b. 중앙 모델 및 0.102의 역치에 의해 관찰되고 예측된 TBT/NTBT 환자의 분할 표
Figure pct00013
표 5c. 중앙 모델 및 0.462의 역치에 의해 관찰되고 예측된 TBT/NTBT 환자의 분할 표
Figure pct00014
부트스트랩 모델
모든 211명의 환자를 사용하여 로지스틱 회귀분석을 모든 70개의 설명적 변수를 사용한 완전한 모델로서 계산하였고 최적 모델은 AIC를 사용하여 변수를 선택함으로써 수득한다(표 6). 이후에, 다양한 계수의 유의성을 1000개의 부트스트랩 샘플을 사용하여 시험하였다(표 6).
표 6. 부트스트랩 모델의 결과(cor: 공선 변수)
Figure pct00015
가장 중요한 것은, 부트 트랩 모델로 확인한 변수가 상기 기술한 중앙 모델로 확인한 것과 동일하다는 것을 주목하는 것이 매우 만족스럽다는 것이다. 당해 관찰은 NASH 및 이의 단계 또는 중증도의 예측으로서 이들 변수의 통계적 관련성 및 확신을 강화시킨다.
1000개의 부트스트랩 샘플에서 AUC를 계산함으로써 최적 모델을 입증한다. AUC는 0.82(95% CI: 0.76-0.87)이었다. 최적 모델의 AUC를 사용하여, 환자를 TBT 또는 NTBT로 예측하기 위해 3개의 역치를 정의하였다:
1. 1-특이성(specificity) = 0% 및 민감성(sensitivity) = 100%를 갖는 점에 가장 가까운 역치는 0.4343과 같았다. 상응하는 분할 표는 표 7a에 나타내고 다음 지수를 생성하였다:
· 전체 정확도: 75.36%
· 민감성: 74.74%
· 특이성: 75.86%
· PPV: 71.72%
· NPV(음성 예측치): 78.57%
2. 90%를 초과하는 민감성을 제공하는 역치는 0.2319와 같았다. 상응하는 분할 표는 표 7b에 나타내며 다음의 지수를 생성하였다:
· 전체 정확도: 65.88%
· 민감성: 90.53%
· 특이성: 45.69%
· PPV(양성의 예측치): 57.72%
· NPV(음성의 예측치): 85.48%
3. 90%를 초과하는 특이성을 제공하는 역치는 0.6465와 동일하였다. 상응하는 분할 표는 표 7c에 나타내며 다음 지수를 생성하였다:
· 전체 정확도: 73.46%
· 민감성: 52.63%
· 특이성: 90.52%
· PPV(양성의 예측치): 81.97%
· NPV(음성의 예측치): 70.00%
표 7a. 부트스트랩 모델 및 0.4343의 역치에 의해 관찰되고 예측된 TBT/NTBT 환자의 분할표
Figure pct00016
표 7b. 부트스트랩 모델 및 0.2319의 역치에 의해 관찰되고 예측된 TBT/NTBT 환자의 분할표
Figure pct00017
표 7c. 부트스트랩 모델 및 0.6465의 역치에 의해 관찰되고 예측된 TBT/NTBT 환자의 분할표
Figure pct00018
다른 NASH 점수매김 방법과의 비교
NASH 점수를 확립하기 위한 방법은 문헌에 이미 기술되었다:
- 안굴로 지수(Angulo Index)(Angulo et al, 2007)
- ELF(Guha et al, 2008)(Ref: 또한 ELF 명세 시이트 http://www.healthcare.siemens.com/clinical-specialities/liver-disease/elf-test-now-avail)
- 피브로시험(Fibrotest)(Ratziu et al, 2006)
- 피브로미터(Fibrometer)(Cales et al, 2009)
- FLI(Bedogni et al, 2006)
- 지방증 등급(steatosis grade) 또는 스테아토시험(SteatoTest)(Poynard et al, 2005)
따라서, 본 발명자들은 다수의 이들 앞서의 방법에 대한 본 발명의 NASH 점수를 평가하였다. 도 1a 내지 도 1g는 기존의 점수를 사용하여 부트스트랩 모델(도 1a)로부터 유도된 본 발명의 방법에 따른 NASH 점수매김의 비교를 나타낸다.
본원에 제공된 데이타는 NASH 환자, 또는 잠재적인 NASH 환자의 확인, NASH 활성, 단계 또는 중증도의 측정의 정확도의 극적인 개선을 나타낸다. 이러한 발견은 가장 중요하며, 환자 관리 효율을 개선시키기 위한 매우 가치있는 도구가 될 것이다.
본원에 개시된 추가의 목적(FURTHER OBJECTS DISCLOSED HEREIN)
본 개시내용은 특히 하기의 목적들과 관련된다:
1. 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 비알코올성 지방간염(NAH)의 마이크로-RNA 마커 및 간 손상의 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 마커의 레벨의 측정을 포함하는, 대상체에서 NASH의 진단 또는 NASH의 활성, 단계, 또는 민감성을 측정하는 방법.
2. 목적 1에 있어서, 하기에서 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 방법:
(i) 알파 2 매크로글로불린
(ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
3. 목적 1 또는 2에 있어서, 상기 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터의 하기 측정을 시행함을 포함하는 방법:
(i) 알파 2 매크로글로불린 레벨의 측정;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커 레벨의 측정;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨의 측정;
(iv) hsa-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨의 측정; 및
(v) hsa-miR-200의 레벨의 측정;
여기서 대조군 샘플의 레벨에 대한 상기 레벨에 있어서의 증가는 NASH의 지표 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표이다.
4. 목적 2 또는 3에 있어서:
- 측정 (ii)가 적어도 HbA1c의 레벨을 측정함을 포함하고/하거나;
- 측정 (iv)가 적어도 hsa-miR-34의 레벨을 측정함을 포함하는 방법.
5. 목적 1 또는 4에 있어서, 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정함을 포함하는 방법.
6. 목적 2 내지 5 중의 어느 하나에 있어서, NASH 점수가 측정 (i) 내지 (v)에서 측정된 레벨로부터 계산되고, 여기서 상기 NASH 점수를 기준으로 NASH가 진단되고/되거나 NASH 단계 또는 활성 또는 중증도가 측정되는 방법.
7. 목적 6에 있어서, NASH 점수가 하기의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:
Figure pct00019
여기서:
Y= k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F이고,
여기서:
S는 NASH 점수이며;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이고;
B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)이며;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이고;
D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이며;
F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이고;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이며;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이고;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이며;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이고;
d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이며;
f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
8. 목적 7에 있어서,
k가 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a가 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b가 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c가 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d가 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f가 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수인 방법.
9. 목적 7 또는 8에 있어서, 0.102 내지 0.6465 사이에 포함된 역치 값보다 높은 NASH 점수가 중증 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성의 지표인 방법.
10. 목적 9에 있어서:
k가 25.13와 같고;
a가 0.60과 같으며;
b가 0.48과 같고;
c가 0.1과 같으며;
d가 -0.43과 같고;
f가 -0.45와 같으며;
여기서 상기 역치 값은 0.102 내지 0.462 사이에 포함되고, 보다 특히 0.23과 같은 방법.
11. 목적 9에 있어서,
k가 21.35와 같고;
a가 0.62와 같으며;
b가 0.55와 같고;
c가 0.14와 같으며;
d가 -0.38과 같고;
f가 -0.39와 같으며;
여기서 상기 역치 값은 0.2319 내지 0.6465 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4343과 같은 방법.
12. 비-알코올성 지방간염(NASH)의 적어도 하나의 혈액, 혈청 또는 혈장을 순환하는 마이크로-RNA 마커 및 간 손상의 적어도 하나의 다른 혈액, 혈청 또는 혈장 순환 마커의 레벨을 측정함을 포함하여, NASH에 대한 치료의 수용자 또는 비수용자로서 대상체를 분류하는 방법.
13. 목적 12에 있어서, 하기와 같이 정의된, 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 방법:
(i) 알파 2 매크로글로불린
(ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드
(iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p)
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
14. 목적 12 또는 13에 있어서, 상기 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 하기의 측정의 시행을 포함하는 방법:
(i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨을 측정하는 단계;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계;
(iii) 콜라제 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨을 측정하는 단계;
(iv) hsa-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
(v) hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계;
여기서, NASH 점수는 측정 단계 (i) 내지 (v)에서 측정된 레벨로부터 계산되고, 여기서 상기 대상체는 상기 점수를 기준으로 NASH에 대한 치료의 수용자 또는 비수용자로 분류된다.
15. 목적 13 또는 14에 있어서:
- 측정 단계 (ii)가 적어도 HbA1c의 레벨을 측정하는 단계를 포함하고/하거나;
- 측정 단계 (iv)가 적어도 hsa-miR-34의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
16. 목적 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
17. 목적 16에 있어서, NASH 점수가 다음의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:
Figure pct00020
상기에서:
Y=k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F,
상기 식에서:
S는 NASH 점수이고;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이며;
B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)이고;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이며;
D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이고;
F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이며;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d가 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
f가 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
18. 목적 17에 있어서:
k가 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a가 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b가 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c가 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d가 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f가 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수인 방법.
19. 목적 17 또는 18에 있어서, S가 0.102 내지 0.6465 사이에 포함되는 역치 값보다 더 높은 경우 상기 대상체를 치료의 수용자로서 분류하는 방법.
20. 목적 19에 있어서:
k가 25.13과 같고;
a가 0.6과 같으며;
b가 0.48과 같고;
c가 0.1과 같으며;
d가 -0.43과 같고;
f가 -0.45와 같으며;
상기 역치 값이 0.102 내지 0.462 사이에 포함되고, 보다 특히 0.23과 같은 방법.
21. 목적 19에 있어서:
k가 21.35와 같고;
a가 0.62와 같으며;
b가 0.55와 같고;
c가 0.14와 같으며;
d가 -0.38과 같고;
f가 -0.39와 같으며;
여기서 상기 역치 값이 0.2319 내지 0.6465 사이에 포함되고, 보다 특히 0.4343과 같은 방법.
22. 하기와 같이 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 측정을 기준으로 하는, 대상체에서 비-알코올성 지방간염(NASH)의 지표, 또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표인, NASH 점수를 계산하는 방법:
(i) 알파 2 매크로글로불린;
(ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
(iv) has-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p);
(v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
23. 목적 22에 있어서, 하기 (i) 내지 (v) 측정이 상기 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 측정되는 방법:
(i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨;
(iv) hsa-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨; 및
(v) hsa-miR-200의 레벨.
24. 목적 23에 있어서, 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
25. 목적 24에 있어서, 상기 NASH 점수가 하기의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:
Figure pct00021
상기에서:
Y= k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F,
상기에서:
S는 NASH 점수이며;
A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이고;
B는 HbA1c이 레벨(퍼센트)이며;
C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이고;
D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이며;
F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이고;
k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이며;
a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이고;
b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이며;
c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이고;
d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이며;
f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수이다.
26. 목적 25에 있어서,
k가 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
a가 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
b가 0.001 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
c가 0.001 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
d가 -0.77 내지 -0.001 사이에 포함되는 수이고;
f가 -0.78 내지 -0.04 사이에 포함되는 수인 방법.
27. 목적 25에 있어서,
k가 25.13와 같고;
a가 0.6과 같으며;
b가 0.48과 같고;
c가 0.1과 같으며;
d가 -0.43과 같고;
f가 -0.45와 같은 방법.
28. 목적 25에 있어서,
k가 21.35와 같고;
a가 0.62와 같으며;
b가 0.55와 같고;
c가 0.14와 같으며;
d가 -0.38과 같고; 및
f가 -0.39와 같은, 방법.
29. (i) 알파 2 매크로글로불린;
(ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커;
(iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
(iv) has-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커; 및
(v) hsa-miR-200,의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트.
30. 목적 29에 있어서, 알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트.
31. (a) 목적 1 내지 11 중 어느 하나의 방법에 따라 대상체에서 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하는 단계;
(b) 단계 (a)를 기준으로 상기 대상체에게 NASH에 대한 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 NASH를 치료하는 방법.
32. (a) 목적 12 내지 21 중 어느 하나의 방법에 따라 대상체를 분류하는 단계;
(b) 상기 대상체가 단계 (a)에 따른 치료의 수용자로서 분류되는 경우 상기 대상체에게 비알코올성 지방간염(NASH)에 대한 치료제를 투여하는 단계를 포함하여는, 상기 대상체에서 NASH를 치료하는 방법.
33. 목적 31 또는 32에 있어서, 상기 치료가 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법:
[화학식 I]
Figure pct00022
상기 화학식 I에서:
X1은 할로겐, R1, 또는 G1-R1 그룹을 나타내고;
A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 그룹을 나타내며;
X2는 G2-R2 그룹을 나타내고;
G1 및 G2는 동일하거나 상이하며, 산소 또는 황의 원자를 나타내며;
R1은 수소 원자, 비치환된 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 알콕시 또는 알킬티오 그룹, 사이클로알킬 그룹, 사이클로알킬티오 그룹 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 나타내고;
R2는 적어도 -COOR3 그룹(식 중, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타냄)으로 치환된 알킬 그룹을 나타내며;
R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타낸다.
34. 목적 33에 있어서, 상기 화합물이 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-이소프로필옥시 카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시페닐] 프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐 디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸 옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시 페닐] 프로프-2-엔-1-온, 1-[4-트리플루오로메틸옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸 옥시페닐]프로프-2-엔-1-온, 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸프로판산, 및 2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸-프로판산 이소프로필 에스테르; 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
35. 목적 33 또는 34에 있어서, 상기 화합물이 1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 방법.
36. 목적 31 또는 32에 있어서, 상기 치료가 표 1의 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
참고문헌(REFERENCES)
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Claims (16)

  1. 하기에서 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 비-알코올성 지방간염(Non-alcoholic steatohepatitis: NASH)을 진단 또는 NASH의 활성(activity), 단계(stage), 또는 중증도(severity)를 측정하는 방법:
    (i) 알파 2 매크로글로불린(macroglobulin),
    (ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨(fasting glucose level), 프럭토사민 레벨(fructosamine level),
    (iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드(pro-peptide),
    (iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p),
    (v) hsa-miR-200 (특히, hsa-miR-200a, 보다 특히, hsa-miR-200a-3p).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 하기의 측정의 시행을 포함하는 방법:
    (i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨을 측정하는 단계;
    (ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계;
    (iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨을 측정하는 단계;
    (iv) hsa-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
    (v) hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계;
    상기에서, 대조군 샘플의 레벨에 대한 상기 레벨에 있어서의 증가는, NASH의 및/또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표임.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항에 있어서,
    NASH 점수(NASH score)가 측정 (i) 내지 (v)에서 측정된 레벨로부터 계산되고, 상기 NASH 점수를 기준으로 하여 NASH가 진단되고/되거나 NASH 단계 또는 활성 또는 중증도가 측정되는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 NASH가 하기의 로지스틱 함수(logistic function)에 따라 계산되는 방법:
    Figure pct00023

    상기에서:
    Y는 k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F이고,
    S는 NASH 점수이며;
    A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이고;
    B는 HbA1c이 레벨(퍼센트)이며;
    C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이고;
    D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이며;
    F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이고;
    k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이며;
    a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이고;
    b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이며;
    c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이고;
    d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이며;
    f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수임.
  6. 청구항 5에 있어서,
    0.102 내지 0.6465 사이에 포함된 역치 값(thresh hold)보다 높은 NASH 점수가 중증의 NASH, 또는 중간 또는 높은 NASH 활성에 대한 지표인 것인, 방법.
  7. 하기와 같이 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 대상체를 비-알코올성 지방간염(NASH)에 대한 치료의 수용자 또는 비 수용자로 분류하는 방법:
    (i) 알파 2 매크로글로불린,
    (ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨,
    (iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드,
    (iv) hsa-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122 (특히, hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192 (특히, hsa-miR-192-5p)
    (v) hsa-miR-200(특히, hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 대상체의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플로부터 하기의 측정의 시행을 포함하는 방법:
    (i) 알파 2 매크로글로불린의 레벨을 측정하는 단계;
    (ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계;
    (iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨을 측정하는 단계;
    (iv) hsa-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커의 레벨을 측정하는 단계; 및
    (v) hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계;
    상기에서, NASH 점수는 (i) 내지 (v) 측정에서 측정된 레벨로부터 계산되고, 상기 대상체는 상기 점수를 기준으로 하여 NASH에 대한 치료의 수용자(receiver) 또는 비수용자(non receiver)로서 분류됨.
  9. 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
    알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 NASH 점수가 하기의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:
    Figure pct00024

    상기에서,
    Y는 k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F이고,
    S는 NASH 점수이고;
    A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이며;
    B는 HbA1c의 레벨(퍼센트)이고;
    C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이며;
    D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이고;
    F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이며;
    k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이고;
    a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이며;
    b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이고;
    c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이며;
    d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이고;
    f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수임.
  10. 청구항 9에 있어서,
    S가 0.102 내지 0.6465 사이에 포함되는 역치 값보다 더 높은 경우 상기 대상체가 상기 치료의 수용자로서 분류되는 방법.
  11. 대상체 내 비-알코올성 지방간염(NASH)의 지표이거나 또는 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도의 지표인, NASH 점수를 계산하는 방법으로, 상기 NASH 점수가 하기와 같이 정의된 그룹 (i), (ii) 또는 (iii)으로부터 선택된 적어도 하나의 마커, 및 그룹 (iv) 또는 (v)로부터 선택된 적어도 하나의 마커의 측정을 기초로 하는, 방법:
    (i) 알파 2 매크로글로불린;
    (ii) 당화된 헤모글로빈(HbA1c), 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨;
    (iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
    (iv) has-miR-34(특히 hsa-miR-34a, 보다 특히 hsa-miR-34a-5p), hsa-miR-122(특히 hsa-miR-122-5p) 및 hsa-miR-192(특히 hsa-miR-192-5p);
    (v) hsa-miR-200(특히 hsa-miR-200a, 보다 특히 hsa-miR-200a-3p).
  12. 청구항 11에 있어서,
    알파 2 매크로글로불린, HbA1c, 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드, hsa-miR-34 및 hsa-miR-200의 레벨을 측정하는 단계를 포함하고, NASH 점수가 하기의 로지스틱 함수에 따라 계산되는 방법:
    Figure pct00025

    상기에서:
    Y는 k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F이고,
    S는 NASH 점수이며;
    A는 알파 2 매크로글로불린의 레벨(g/L)이고;
    B는 HbA1c이 레벨(퍼센트)이며;
    C는 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드의 레벨(ng/mL)이고;
    D는 hsa-miR-34의 레벨(Cq)이며;
    F는 hsa-miR-200의 레벨(Cq)이고;
    k는 5.26 내지 36.76 사이에 포함되는 수이며;
    a는 0.11 내지 1.07 사이에 포함되는 수이고;
    b는 0 내지 1.02 사이에 포함되는 수이며;
    c는 0 내지 0.23 사이에 포함되는 수이고;
    d는 -0.77 내지 0 사이에 포함되는 수이며;
    f는 -0.78 내지 0 사이에 포함되는 수임.
  13. 하기의 레벨을 측정하기 위한 수단을 포함하는 키트:
    (i) 알파 2 매크로글로불린;
    (ii) HbA1c, 공복시 글루코즈 레벨, 프럭토사민 레벨로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커;
    (iii) 콜라겐 제III형의 N-말단 프로-펩타이드;
    (iv) has-miR-34, hsa-miR-122 및 hsa-miR-192로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커; 및
    (v) hsa-miR-200.
  14. 하기의 단계를 포함하는, 대상체에서 비알코올성 지방간염 (NASH)을 치료하는 방법:
    (a) 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 방법에 따라 대상체에서 비알코올성 지방간염(NASH)을 진단하거나 NASH의 활성, 단계, 또는 중증도를 측정하거나, 청구항 7 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 방법에 따라서 상기 대상체를 분류하는 단계;
    (b) 단계 (a)를 기준으로 하여 상기 대상체에게 NASH에 대한 치료제를 투여하는 단계.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 치료가 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    [화학식 I]
    Figure pct00026

    상기 화학식 I에서:
    X1은 할로겐, R1, 또는 G1-R1 그룹을 나타내고;
    A는 CH=CH 또는 CH2-CH2 그룹을 나타내며;
    X2는 G2-R2 그룹을 나타내고;
    G1 및 G2는 동일하거나 상이하며, 산소 또는 황의 원자를 나타내며;
    R1은 수소 원자, 비치환된 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 알콕시 또는 알킬티오 그룹, 사이클로알킬 그룹, 사이클로알킬티오 그룹 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 나타내고;
    R2는 적어도 -COOR3 그룹(식 중, R3은 수소 원자, 또는 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 또는 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타냄)으로 치환된 알킬 그룹을 나타내며;
    R4 및 R5는 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 할로겐 원자, 사이클로알킬 그룹, 헤테로사이클릭 그룹으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹을 나타냄.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 화합물이
    1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시 페닐]프로프-2-엔-1-온,
    1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-이소프로필옥시 카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
    1-[4-메틸티오페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
    1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐 디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
    1-[4-트리플루오로메틸페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
    1-[4-트리플루오로메틸 옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-tert부틸옥시카보닐디메틸메틸옥시 페닐] 프로프-2-엔-1-온,
    1-[4-트리플루오로메틸옥시페닐]-3-[3,5-디메틸-4-카복시디메틸메틸 옥시페닐]프로프-2-엔-1-온,
    2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸프로판산, 및
    2-[2,6-디메틸-4-[3-[4-(메틸티오)페닐]-3-옥소-프로필]페녹시]-2-메틸-프로판산 이소프로필 에스테르;
    또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
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