KR20180046962A - 고분자 코팅 기반의 산화질소 전달용 복합체 제작 방법 및 이의 응용 - Google Patents

고분자 코팅 기반의 산화질소 전달용 복합체 제작 방법 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이차 아민(secondary amine) 그룹을 가지는 고분자로 나노 입자 등의 기재의 표면을 개질한 산화질소 전달용 복합체에 관한 것이다.
이차 아민은 일산화질소와의 고압 반응을 통해서 다이아제니움다이올레이트(Diazeniumdiolate) 작용기를 형성하며, 상기 작용기는 산화질소 제공자로 작용할 수 있다.
본 발명에서는 층과층(LbL) 코팅법을 통해서 고분자로 기재 표면을 단층 혹은 다층으로 개질 가능하며, 상기 제조 기술은 공정이 간단하고 경제적이며 응용 분야가 넓다. 또한 일산화질소의 방출 속도 및 방출량의 조절이 용이하며 나노 입자 등의 기재의 분포도를 증대시킬 수 있는 장점이 있다. 본 발명에 따라 제조된 산화질소 전달용 복합체는 세포 독성이 없으므로, 일산화질소의 방출량 및 방출 속도의 조절을 통해 체내에서 혈관확장, 상처치유, 항균 등의 의료용 목적으로 활용할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

고분자 코팅 기반의 산화질소 전달용 복합체 제작 방법 및 이의 응용{Manufacturing method of complex for the delivery of nitric oxide}
본 발명은 산화질소 전달용 복합체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
일산화질소(NO, nitric monoxide)는 세포 내에서 일산화질소 생성 효소에 의해 생성되는 반응성이 높은 라디칼 분자로서, 체내에서 다양한 생리적 또는 병리적인 과정을 담당하는 중요한 세포 신호 분자(cellular signaling molecule)이다. 일산화질소는 1992년 미국 학술지 사이언스에서 "올해의 분자"로 선정되면서 신경과학, 생리학과 및 면역학 분야에서 주목받기 시작했다. 일산화질소의 심혈관계 신호전달 기능을 밝혀낸 연구는 1998년에 노벨 생리의학상을 수상하였다. 일산화질소는 혈관 내에서 강력한 혈관확장제로써 작용하며 그 외에도 면역 반응, 신경 전달, 발기 조절, 항균 작용 및 상처 치유 등 다양한 기능을 한다.
나노 입자를 통한 일산화질소 전달의 필요성
일산화질소는 신체 내에서 다양한 역할을 수행하고 조절하기 때문에, 사람들은 외부에서 일산화질소를 인위적으로 전달하는 방법을 찾기 위한 연구들을 진행하였다. 특히 일산화질소는 가스 상태에서 다양한 효능을 나타내는데 반감기가 6초 이내로 매우 짧으므로, 화합물 형태로의 일산화질소 방출에 관한 연구가 진행되고 있다.
가장 많이 연구된 화합물에는 다이아제니움다이올레이트(diazeniumdiolate, NONOate)와 S-니트로소티올(S-nitrosothiol, RSNO) 등이 있다. S-니트로소티올의 경우에는 온도, 빛 및 구리 이온(Cu2 +)에 의해서 방출이 촉진되며 일산화질소 방출 효율이 높다는 장점을 가진다. 반면 일산화질소가 생체 내로 방출되지 않거나 물질이 안정하지 못하여 순수한 상태로 얻어내기 어려운 단점이 있다. 다이아제니움다이올레이트는 고체 상태로 안정하게 보관할 수 있고, 물에 대한 용해도가 높으며, 생체 온도와 pH 조건에서 쉽게 일산화질소를 생성할 수 있다. 그러나 분해산물이 독성을 나타낼 수 있으며, 물과 접촉하는 동시에 일산화질소가 방출되는 단점을 가진다.
나노 입자를 통한 일산화질소 전달 선행 연구들
일산화질소 전달체에 관한 연구를 진행하는 대표적인 국외 그룹으로는 미국 University of Michigan의 Mark E. Meyerhoff 그룹과 North Carolina State University Chapel Hill의 Mark H. Schoenfisch 그룹 등이 있다. Meyerhoff 그룹에서는 aminoalkylsilane을 이용하여 졸-젤 방식으로 다이아제니움다이올레이트 기반의 수백 나노미터의 산화질소를 방출하는 실리카 나노입자를 개발하였다(비특허문헌 1). 이후 Schoenfisch 그룹에서는 실리카 나노입자를 먼저 제작한 후, 표면의 이차 아민 그룹을 다이아제니움다이올레이트기로 변환하여 표면에서 일산화질소의 방출이 나타나는 입자와 aminoalkoxysilane 분자를 다이아제니움다이올레이트기로 변환한 다음 실리카 나노입자를 제작하여 입자의 내부에서부터 일산화질소의 방출이 일어나는 두 가지 형태를 개발하였다. 다양한 aminoalkoxysilane를 이용하여 입자들을 제작한 후에 크기 및 일산화질소 방출 효율을 정리하여 보고하였는데, 입자의 내부에 aminoalkoxysilane 그룹이 있을 경우에 일산화질소의 방출 효율이 최대가 되어 고효율의 산화질소 나노입자를 제조할 수 있으며, aminoalkoxysilane 분자 구조에 따라서 효율에 차이가 있다. 그러나 aminoalkoxysilane 기반의 산화질소 나노입자는 졸-젤 원리에 따라 제작되므로 실험과정에서 온도 및 수분을 철저히 통제해야하므로 과정이 까다롭고 비용이 많이 들며 실패할 확률이 높다(비특허문헌 2).
국내에서는 최근 포스텍의 김원종 교수팀에서 다이아제니움다이올레이트 기반의 산화질소 나노입자의 일산화질소 방출을 조절하기 위한 연구를 진행히고 있다. Aminoalkoxysilane으로 제작된 다공성 실리카 나노입자에 2-nitro-benzaldehyde라는 UV에 의해서 구조적인 형태가 변해서 수소이온을 방출하는 분자를 넣은 후, calcium phosphate로 나노입자를 capping한 형태를 제작하여 고압의 일산화질소 기체 하에서 3일간 반응을 시켜서 산화질소 나노입자를 제작하였다. 이렇게 제작된 나노입자는 capping에 의해 외부의 수소이온의 침투가 저해되므로 일산화질소의 방출이 자발적으로 일어나지 않으며, UV를 조사하였을 경우, 나노입자 내부의 2-nitro-benzaldehyde가 수소이온을 방출하여 pH가 낮아짐에 따라 capping layer가 분해되면서 일산화질소의 방출이 일어나는 결과를 가진다(비특허문헌 3). 그러나 이 연구에서도 여전히 aminoalkoxysilane을 사용하여 실험과정이 복잡하고 까다롭다는 단점이 존재한다.
즉, 기존에 많이 연구되고 있는 졸-젤 반응을 기반으로 하는 산화질소 나노입자의 합성은 온도 및 수분에 민감한 물질을 사용하기 때문에, 실험과정에서 통제할 조건이 많아 과정이 까다롭고 비용이 많이 들며 실패 확률이 매우 높다.
1. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5015-5024 2. Chem. Mater. 2008, 20, 239-249 3. ACS Nano 2016, 10, 4199-4208
본 발명에서는 전술한 문제를 해결하기 위하여, 외부 환경에 민감하게 반응하는 물질 대신 생체적합한 고분자를 이용하고, 층과층(layer-by-layer, LbL) 적층 방식을 적용하여 단순한 원리로 손쉽고 저렴하게 산화질소 전달용 복합체를 제작하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 기재; 및
상기 기재 상에 형성되고, 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막을 포함하며,
상기 고분자 박막은 한 층 이상 형성된 산화질소 전달용 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 (A) 기재 상에 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 박막을 한 층 이상 형성하는 단계; 및
(B) 25 내지 300℃의 온도 및 1 내지 30 atm의 압력에서, 일산화질소와 반응시키는 단계를 포함하는 산화질소 전달용 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의해 제조되는 산화질소 전달용 복합체는 기존의 졸-젤 기반의 산화질소 입자와 같거나 높은 일산화질소 방출 효율을 가지며, 제조 공정이 간단하고 제한적이지 않아서 제조 성공확률이 높으며 대량생산이 가능하다.
층과층(LbL) 적층 방식의 고분자 코팅은 나노입자뿐만 아니라 마이크로 입자 및 평면 기판 등 크기나 형태에 제한없이 적용 가능하며, 이에 따라 다양한 산화질소 전달용 복합체의 제작이 가능하다.
또한, LbL 방식은 다양한 분자 간 인력을 기반으로 원하는 생체적합성 고분자뿐만 아니라, 그래핀, 단백질, 약물 및 성장인자 등을 코팅할 수 있으므로, 이를 적용하여 산화질소 기체의 방출과 동시에 약물이나 성장인자의 방출이 일어나는 다기능성을 부여할 수 있다.
더 나아가 표면 코팅을 통해서 입자나 특정 표면의 표면전하 및 작용기를 자유자재로 조절하여 입자의 분포도(distribution ability) 및 생체적합성을 증대시킬 수 있으며, 그래핀과 같은 기체 차단 효과가 있는 물질을 이용하여 일산화질소의 방출 속도 및 양 또한 조절이 가능하다.
도 1은 입자, 박막 및 하이드로젤 등의 다양한 형태의 산화질소 전달용 복합체의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 BPEI 등의 고분자를 상온에서 고압의 일산화질소 하에 3일 간 반응하였을 때, 생성되는 다이아제니움다이올레이트 작용기를 화학적 구조로 나타낸 모식도이다.
도 3은 실시예에서 제조된 BPEI 코팅 나노입자의 SEM 이미지이다.
도 4는 실시예에서 제조된 산화질소 나노입자의 SEM 이미지이다.
도 5는 실리카 나노입자, BPEI 코팅 나노입자 및 산화질소 나노입자의 표면전하를 분석한 그래프이다.
도 6는 산화질소 나노입자로부터 실시간으로 방출되는 일산화질소의 양을 일산화질소 분석기기로 분석한 그래프이다.
도 7은 산화질소 나노입자로부터 방출된 일산화질소의 양을 누적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 산화질소 나노입자로부터 일산화질소의 총 방출량, 반감기, 일산화질소의 최대 방출 및 총 방출 시간을 정리한 표이다.
도 9은 산화질소 나노입자(B-NO)와 BPEI 코팅 나노입자(B-Si)의 농도에 따른 근아세포(myoblast)에 대한 독성을 24 시간과 48 시간 동안 평가한 그래프이다.
도 10는 실리카 나노입자(Si), 산화질소 나노입자(B-NO) 및 BPEI 코팅 나노입자(B-Si)의 더 높은 농도에 따른 근아세포에 대한 독성을 24 시간 동안 평가한 그래프이다 .
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 기재; 및 상기 기재 상에 형성되고, 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막을 포함하며,
상기 고분자 박막은 한 층 이상 형성된 산화질소 전달용 복합체에 관한 것이다.
본 발명에서 '산화질소 전달용 복합체'는 일산화질소를 전달할 수 있는 물질을 의미하여, '산화질소 복합체' 또는 '산화질소 전달체'라 할 수도 있다.
본 발명에서 기재는 일산화질소를 조절 방출할 수 있도록 표면을 코팅하고자 하는 소재라면 특별히 제한되지 않으며, 생체 내에서 안정한 무기 성분, 생체 내에서 분해가능한 생분해성 고분자, 마이셀(micelle) 및 생체 유래 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
이때, 무기 성분은 실리카, 하이드록시 아파타이트(hydroxyapatite) 또는 금 등일 수 있고, 생분해성 고분자는 폴리-β-하이드록시 부티레이트(poly-β-hydroxy butyrate, PHB), 폴리유산(polylactic acid, PLA), 폴리-D-L-락티드-co- 글라이콜리드(poly-D-L-lactide-co-glycolide, PLGA), 알리파틱 폴리에스테르(aliphatic polyesters), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리-에틸렌글리콜(poly-ethyleneglycol, PEG), 폴리-비닐알코올(poly-vinylalcohol, PVA), 폴리-알킬-시아노-카릴레이트(poly-alkyl-cyano-carylates, PAC), 키토산(chitosan) 또는 젤라틴(gelatin) 등일 수 있다. 또한, 마이셀은 Phopholipid 기반의 리포좀, 계면활성제(surfactant)를 포함한 유중수(water/oil) 상에서 생성되는 에멀젼 형태의 입자, PS-b-PAA, PS-b-P4VP, PEO-b-PCL 등의 블록 코폴리머(block copolymer) 등일 수 있으고, 생체 유래 물질은 DNA/RNA, 인지질(phospholipid) 또는 리포좀(liposome) 등일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 기재로는 실리카를 사용할 수 있다.
상기 기재의 형상은 특별히 제한되지 않으며, 나노입자, 마이크로 입자 또는 필름 형상을 가질 수 있다. 상기 나노입자의 형상을 가질 경우 산화질소 전달용 복합체는 산화질소 나노입자로 명명할 수 있으며, 마이크로 입자의 형상을 가질 경우 산화질소 마이크로 입자로, 필름 형상을 가질 경우 산화질소 필름으로 명명할 수 있다.
일 구체예에서 상기 기재는 체내 삽입이 가능한 소재(이하, 체내 삽입물이라 한다.)로 구성될 수 있다. 상기 체내 삽입물은 사람 또는 포유동물을 포함한 동물의 체내에서 일산화질소 방출로 생리 효과를 볼 수 있는 위치에 자리 잡으며, 그 표면에 일산화질소 조절 방출용 전달체를 갖출 수 있는 모든 물건을 의미한다. 이러한 삽입물은 체내에 그 일부분이 삽입되어 있는 이상 반드시 그 물건의 전부가 체내에 존재할 필요는 없는데, 예를 들어 관이나 전선 등의 연결부가 체외로 빠져 나와 있을 수 있다. 이러한 체내 삽입물은 스텐트(stent), 카테터(catheter), 피하 이식편(subcutaneous implant), 화학 센서, 도관(lead), 심장 박동기(pacemaker), 이식 혈관편(vascular graft), 상처용 드레싱(dressing), 남성기 삽입물(penile implant), 삽입용 심박 발생 장치(implantable pulse generator), 삽입용 심장 제세동기(cardiac defibrillator), 또는 신경 흥분기(nerve stimulator) 등일 수 있다.
본 발명에서 상기 기재 상에는 일산화질소를 저장 및 방출할 수 있는 다이아제니움다이올레이트기(RR’N-N(O)=NOR)를 포함하는 고분자 박막이 형성된다. 상기 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자는 고체 형태로서 안정하게 보관할 수 있으며, 물에 대한 용해도가 높고, 다이아제니움다이올레이트기가 연결된 나머지 부분의 구조에 따라 방출 속도와 방식 등의 방출 형태를 조절할 수 있다. 또한, 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자는 생체 온도와 pH 조건에서 분해될 뿐만 아니라, pH에 따라 다양한 방출 형태를 가지며 한 단위의 다이아제니움다이올레이트기당 2분자의 일산화질소를 방출하므로 복합체에 포함시켰을 때 상대적으로 높은 농도의 일산화질소 발생이 가능하다.
이러한 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막은 한 층 이상으로 형성될 수 있으며, 구체적으로 1 내지 500 층, 또는 2 내지 200 층의 다층으로 형성될 수 있다.
상기 박막이 2 층 이상의 다층으로 형성될 경우, 하나의 박막은 이웃하는 박막과 층과층(layer-by-layer, LbL) 적층 방식에 의해 형성될 수 있다.
층과층 적층 방식은 분자 수준에서 자유롭게 조절이 가능하고 여러 가지 재료들의 특성에 제한을 주지 않으며, 열이나 강한 자극을 가할 필요 없이 간단하게 분자적 상호 인력에 의해 다층 나노 박막을 제작할 수 있는 기술이다. 상호 간의 인력은 화학적 결합이 아닌 물리적 결합이기 때문에 물질들의 고유의 특성을 변성시키지 않는다는 큰 장점이 있다. 상기 층과층 적층 방식은 용액을 서로 혼합하는 것이 아니라 기질을 사용하는 방법이기 때문에 상분리가 일어나지 않는 박막(고분자층)을 제작할 수 있다.
또한, 상기 층과층 적층 방식은 나노입자 뿐만 아니라 모든 크기의 입자나 평면 기판과 같이 크기나 형태에 제한되지 않으며, 산소 플라즈마, RCA 및 piranha와 같은 표면처리를 통해서 코팅하고자 하는 표면을 개질하여 재료의 제한도 거의 없다.
상기 층과층 적층 방식으로는 정전기적 인력, 반 데르발스 힘, 수소결합, 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 전하-전송(charge-transfer) 결합, π-상호작용(π-interaction), 배위화학결합, 스트레오복합화(stereocomplexation), 호스트-게스트(host-guest) 또는 생물학적 결합을 이용할 수 있다.
상기 호스트-게스트(host-guest)에서 호스트는 사이클로덱스트린 (cyclodextrins), 쿠커비투릴(cucurbiturils), 칼릭스아렌(calixarenes), 필러아렌(pillararenes), 크라운 에테르(crown ethers) 또는 포르피린(porphyrins)일 수 있으며, 게스트는 페로센(ferrocene), 아다만탄(adamantine) 또는 아조벤젠(azobenzene)일 수 있다. 또한, 생물학적 결합은 아비딘-비오틴(Avidin-Biotin) 결합, 항원-항체 결합, 렉틴-카보하이드레이트(lectin-carbohydrate) 결합 또는 DNA 상보결합일 수 있다.
일 구체예에서 상기 층과층 적층 방식은 정전기적 인력 또는 수소결합을 이용할 수 있다.
본 발명에서 상기 박막의 총 두께는 1 nm 내지 1000 μm, 또는 1 nm 내지 10 μm일 수 있다. 상기 두께에서 안정하고 세포독성을 나타내지 않으며, 우수한 일산화질소 방출 효과를 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막은 박막 내에 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들을 통해 일산화질소 전달 외에 새로운 기능을 부여할 수 있다.
또한, 본 발명에서 산화질소 복합체는 제 2 고분자, 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분으로 구성된 박막을 추가로 포함할 수 있다.
상기 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물은 당업계에서 사용되는 물질을 제한없이 사용할 수 있다.
일 구체예에서 그래핀은 기체 차단 효과를 가지므로, 일산화질소의 방출 속도 및 양을 조절할 수 있다.
일 구체예에서 다층의 고분자 박막이 정전기적 인력에 의해 형성될 경우, 상기 산화질소 복합체는 제 2 고분자를 포함하는 박막을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 상기 제 2 고분자는 음전하를 가지는 고분자일 수 있다.
상기 제 2 고분자로는 폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol)), 히알루론 산(hyaluronic acid), 폴리-L-락틱 산(poly-L-lactic acid), 알긴산(alginic acid), 덱스트란황산(dextran sulfate), 리그닌(lignin), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 셀룰로오스(cellulose)류 고분자, 후코이단(fucoidan), 폴리(아크릴 산)(poly(acrylic acid)), 폴리 (소디움-4-스티렌술포네이트(Poly(sodium4-styrenesulfonate)), 폴리(비닐이딘 플루오라이드)(poly(vinylidene fluoride)), 폴리(메타크릴산)(Poly(methacrylic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)), 폴리(락틱산)(poly(lactic acid)), poly(caprolactone), 폴리(오쏘 에스터) Ⅱ(poly(ortho ester) Ⅱ), 폴리[(카르복시페녹시)프로판 세바스산](poly[(carboxyphenoxy)propane sebacic acid]), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트)(poly(alkyl cyanoacrylate)), 폴리포스포에스터(polyphosphoesters), 폴리에스테르 아미드(polyester amides) 및 폴리우레탄(polyurethane)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 산화질소 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 산화질소 복합체는 (A) 기재 상에 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 박막을 한 층 이상 형성하는 단계; 및
(B) 25 내지 300℃의 온도 및 1 내지 30 atm의 압력에서, 일산화질소와 반응시키는 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 기재는 전술한 바와 같이, 생체 내에서 안정한 무기 성분, 생체 내에서 분해가능한 생분해성 고분자, 마이셀(micelle) 및 생체 유래 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있고, 구체적으로 실리카를 사용할 수 있으며, 형상은 나노입자, 마이크로 입자 또는 필름 형상일 수 있다. 상기 나노입자의 형상을 가질 경우 산화질소 전달용 복합체는 산화질소 나노입자로 명명할 수 있으며, 마이크로 입자의 형상을 가질 경우 산화질소 마이크로 입자로, 필름 형상을 가질 경우 산화질소 필름으로 명명할 수 있다.
본 발명에서 단계 (A)는 기재를 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액에 침지하여 수행할 수 있다. 상기 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액에서 용매로는 물, 에탄올, 아세트산 나트륨 버퍼(sodium acetate buffer), PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지(culture media) 등을 사용할 수 있으며, 상기 용액은 아민 그룹에 의해 양전하를 띠게 된다.
일 구체예에서 기재로 실리카를 사용할 경우, 상기 실리카는 OH-기에 의해 음전하를 띠므로, 이차 아민 그룹과 정전기적 인력을 통해 결합할 수 있다.
일 구체예에서 기재가 음전하를 띠지 않을 경우, 상기 기재에 음전하 표면을 형성하기 위한 표면처리 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 표면처리는 코로나 처리 또는 플라즈마 처리와 같은 고주파수의 스파크 방전 처리; 열 처리; 화염 처리; 커플링제 처리; 프라이머 처리 또는 기상 루이스산(ex. BF3), 황산 또는 고온 수산화나트륨 등을 사용한 화학적 활성화 처리 등일 수 있다.
본 발명에서 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자는 가지친 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, BPEI), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 피브리노겐(fibrinogen), 실크 피브로인(silk fibroin), 카세인(casein), 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 폴리 도파민(poly dopamine), 폴리 에틸렌이민(poly ethyleneimine), 폴리-L-리신(poly-L-lysine), 폴리(비닐아민) 하이드로클로라이드(poly(vinylamine) hydrochloride), 폴라(아미노 산)(poly(amino acids)) 및 des아미노타이로실옥틸 에스터(desaminotyrosyl octyl ester)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로 BPEI일 수 있다.
또한, 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액은 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 외에 필요에 따라 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 박막이 다층으로 형성될 경우, 하나의 박막은 이웃하는 박막과 층과층(layer-by-layer, LbL) 적층 방식에 의해 형성될 수 있다. 상기 층과층 적층 방식으로는 정전기적 인력, 반 데르발스 힘, 수소결합, 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 전하-전송(charge-transfer) 결합, π-상호작용(π-interaction), 배위화학결합, 스트레오복합화(stereocomplexation), 호스트-게스트(host-guest) 또는 생물학적 결합을 이용할 수 있으며, 구체적으로 정전기적 인력 또는 수소결합을 이용할 수 있다.
일 구체예에서 박막이 수소 결합을 통해 둘 이상의 다층으로 형성될 경우, 상기 박막은 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액을 2회 이상 적층하여 형성할 수 있다.
또한, 일 구체예에서 박막이 정전기적 인력을 통해 둘 이상의 다층으로 형성될 경우, 상기 박막은 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 형성할 수 있다.
상기 음전하 고분자 용액에서 음전하 고분자는 용매에 용해되어 음전하를 띨 수 있는 고분자를 의미한다. 상기 음전하 고분자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당 업계에서 사용되는 고분자를 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 음전하 고분자는 히알루론 산(hyaluronic acid), 폴리-L-락틱 산(poly-L-lactic acid), 알긴산(alginic acid), 덱스트란황산(dextran sulfate), 리그닌(lignin), 탄닌산(tannic acid), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 셀룰로오스(cellulose)류 고분자, 후코이단(fucoidan), 헤파린(Heparin, HEP) 등을 포함하는 천연고분자 및 폴리(아크릴산)(Poly(acrylic acid), PAA), 폴리 (소디움-4-스티렌술포네이트(Poly(sodium4-styrenesulfonate)), 폴리(비닐이딘 플루오라이드)(poly(vinylidene fluoride)), 폴리(메타크릴산)(Poly(methacrylic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)), 폴리(락틱산)(poly(lactic acid)), poly(caprolactone), 폴리(오쏘 에스터) Ⅱ(poly(ortho ester) Ⅱ), 폴리[(카르복시페녹시)프로판 세바스산](poly[(carboxyphenoxy)propane sebacic acid]), 폴리(알킬 시아노아크릴레이트)(poly(alkyl cyanoacrylate)), 폴리포스포에스터(polyphosphoesters), 폴리에스테르 아미드(polyester amides) 및 폴리우레탄(polyurethane)등의 합성고분자 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에서는 하나의 박막을 형성한 후, 워싱하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 제 2 고분자, 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 박막을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제 2 고분자는 전술한 고분자를 사용할 수 있다.
본 발명에서 단계 (B)는 단계 (A)에서 제조된 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 박막이 코팅된 기재를 일산화질소와 반응시키는 단계이다. 본 발명에서는 고분자 박막이 형성된 나노입자 또는 마이크로 입자를 하이드로겔에 봉입시킨 후 일산화질소와 반응시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 일산화질소와의 반응은 25 내지 300℃의 온도 및 1 내지 30 atm의 압력에서 수행될 수 있다. 반응 시간은 1 내지 5 일, 2 내지 4일 또는 3일일 수 있다. 또한, (A)에서 제조된 생성물의 사용량은 반응용기의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 예를들어 반응용기의 크기가 1 ml 내지 10 L일 경우 생성물의 사용량은 1 mg 내지 100 g일 수 있다. 상기 반응에 의해 이차 아민 그룹은 다이아제니움다이올레이트기로 변환될 수 있다(도 2).
일 구체예에서 상기 단계 (b)는 박막이 코팅된 기재 및 촉매를 용매에 넣고 반응기에 투입하는 단계;
반응기를 불활성 기체로 배기하는 단계; 및
반응기 내에 일산화질소를 투입하여 반응시키는 단계를 통해 수행될 수 있다.
상기 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, THF 또는 DMF 등을 사용할 수 있으며, 촉매로는 소디움 메톡사이드(Sodium methoxide)와 같은 염기 촉매(base catalyst)를 사용할 수 있다.
상기 불활성 기체로의 배기는 반응기와 용액에 포함된 기체를 제거하기 위해 수행할 수 있으며, 불활성 기체로는 아르곤(Ar)을 사용할 수 있다. 상기 배기는 불활성 기체를 주입하고 방출하는 과정을 복수회 반복하여 수행할 수 있다.
상기 일산화질소와의 반응은 전술한 온도, 압력 및 시간동안 수행할 수 있다.
상기 반응이 완료된 생성물은 건조한 후 포장하여 보관할 수 있다.
본 발명에서 도 1은 입자, 필름 및 하이드로젤 등의 다양한 형태의 산화질소 복합체의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 층과층 적층 방식을 통해서 고분자 박막이 형성된 입자 또는 필름을 일산화질소 복합체로 제조할 수 있다. 또한, 박막이 형성된 입자를 함유하는 하이드로젤과 같이 응용된 형태로도 일산화질소 복합체를 제작할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예
실시예 1. 산화질소 나노입자 제조
(1) 실리카 나노입자 합성
지름 100 nm의 실리카 나노입자는 Stober 원리를 기반으로 K. Nozawa et al.에 의하여 보고된 연구를 참고하여 제작하였다(Langmuir 2005, 21, 1516).
TEOS(Tetraethyl orthosilicate), 암모니아, 에탄올을 1:1:10의 부피 비로 사용하였다. 먼저 에탄올에 암모니아를 첨가하여 400 rpm 속도로 용액을 교반하면서 TEOS를 빠르게 첨가하였다. 같은 속도로 12시간 동안 교반한 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고 가라앉은 실리카 나노입자를 확인하였다. 에탄올을 첨가하여 나노입자를 세척하고 원심분리하는 과정을 두 번 더 진행하고 세척하여 실리카 나노입자를 최종 제조하였다.
(2) Amine 기반의 고분자를 이용한 실리카 나노입자의 표면 개질 ( BPEI 코팅 나노입자 제조)
이차 아민(Secondary amine) 작용기를 가지고 있는 고분자인 BPEI를 이용하여 실리카 나노입자의 표면을 개질하였다.
물을 용매로 하여 10 mg/mL 농도의 BPEI 수용액을 제조하였다. 실리카 나노입자 500 mg에 BPEI 수용액 1 L을 첨가한 후, vortexer와 sonicator를 이용하여 5분 동안 분산시켰다. 그 다음, 소형 원심분리기를 이용하여 5분 간 실리카 나노입자를 침전시켰다. 상층의 BPEI 수용액을 제거한 후, 동일한 pH의 증류수를 1 L 첨가한 후, 30분 동안 분산시켜서 세척 과정을 진행하였다. 같은 방법으로 실리카 나노입자를 침전시켜서 상층액을 제거하였다. 이 과정을 5회 반복하여 실리카 나노입자를 세척하여, 나노입자의 표면 위에 BPEI 한 층을 형성시켰다.
이와 같은 방법으로 BPEI와 인력을 가지는 재료를 이용하여 과정을 반복함으로써 나노입자의 표면에 다층을 형성할 수 있었다.
(3) 산화질소 나노입자 합성
BPEI 코팅 나노입자를 고압의 일산화기체 하에서 반응시켜 산화질소 나노입자를 합성하였다.
BPEI 코팅 나노입자를 메탄올 30 mL가 담긴 바이알(vial)에 넣고 sonication을 30 분간 처리하여 잘 분산시킨 후, 소디움 메톡사이드(sodium methoxide)를 BPEI의 양과 동일한 비율로 첨가하였다. 바이알을 고압반응기에 넣고, 밀폐한 다음 아르곤 기체를 3 기압으로 빠르게 주입하고 방출하는 과정과 30분 동안 주입하는 과정을 각각 세 번씩 반복하여 반응기와 용액에 포함되어있는 기체들을 제거하였다.
그 후, 일산화질소 기체를 3 기압으로 반응기에 주입하여 상온에서 5일간 반응을 진행하였다. 5일 후, 일산화질소 기체를 배출시킨 후, 아르곤 가스를 3 기압으로 빠르게 주입하고 배출하는 과정을 다섯 번 반복하여 용액 속에 미반응된 일산화질소 기체를 제거하였다. 6,000 rpm으로 30분 간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 용해를 시키지 못하는 용매를 100 ml 채워서 나노입자를 분산시킨 다음 같은 방법으로 원심분리하는 과정을 두 번 더 반복하여 산화질소 나노입자를 세척하였다. 전술한 과정을 통해서 도 2와 같이 BPEI 고분자의 이차 아민 그룹이 다이아제늄디올레이트(diazeniumdiolate)기로 변환되었으며 산화질소를 방출할 수 있다.
실험예 1. 입자 크기 및 표면전하 측정
실시예에서 제조된 실리카 나노입자, BPEI 코팅 나노입자 및 산화질소 나노입자의 표면전하를 측정하였다.
나노입자들은 실리콘 웨이퍼 위에 건조되어 SEM으로 형태 및 크기를 분석하였으며, 제타포텐셜(zeta potential)로 표면전하를 측정하였다.
도 3은 BPEI 코팅 나노입자의 SEM 이미지로, 약 100 nm의 지름을 가지는 실리카 나노입자가 관찰되었다.
도 4는 산화질소 나노입자의 SEM 이미지로, 일산화질소의 고압반응에 따른 실리카 입자의 형태나 크기의 차이는 없는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 5는 나노입자들의 표전전하를 측정한 그래프이다. 제조된 실리카 나노입자에서 표면의 SiO-는 음전하를 띠므로 정전기적 인력을 이용하여 상기 나노입자 상에 양전하를 띠는 BPEI를 코팅할 수 있다. 이는 BPEI 코팅 나노입자의 표면전하가 양전하를 띠는 것으로 확인할 수 있다. 이어서, 산화질소 나노입자의 표면전하를 측정해보면 이차 아민이 상당 부분 다이아제니움다이올레이트(diazeniumdiolate)로 변환되어 음전하를 띠는 것을 확인할 수 있다. pH 7의 생체환경에서 다이아제니움다이올레이트 그룹은 zwitter 형태이지만, 제타포텐셜이 측정된 pH 8 환경에서는 음전하가 더 활성화된다.
실험예 2. 산화질소 나노입자의 산화질소 방출량 측정
실시예에서 제조된 산화질소 나노입자 1 mg을 정량하여 pH 8의 증류수 0.1 ml에 분산시켰다. 둥근플라스크에 pH 7.4의 0.01 M PBS (0.05 M NaCl)를 넣고 항온수조에 담가서 37℃의 생체환경을 조성하였다. 일산화질소를 전달하는 역할을 하는 아르곤 가스가 PBS 상에 방출되도록 버블러를 둥근플라스크 내부에 설치하였다. 둥근플라스크의 다른 연결부는 일산화질소 분석기기와 연결시켰다. 분석기기에서 준비가 되면 소프트웨어로 분석을 시작한 후, 증류수에 분산되어있던 산화질소 나노입자를 파이펫을 이용하여 플라스크 내부의 PBS 상에 첨가하였다.
도 6에서는 방출되는 일산화질소의 농도(ppb)를 1초 간격으로 실시간 측정하여 그래프로 나타내었고, 도 7에서는 일산화질소의 실시간 방출을 누적 방출량 그래프로 나타내었다. 또한, 도 8에서는 상기 도 6 및 7의 그래프를 기반으로 일산화질소의 총 방출량, 반감기, 일산화질소의 최대 방출 및 총 방출 시간을 분석하여 표로 나타내었다.
산화질소 전달용 나노입자의 일산화질소 총 방출량은 3.5 umol/mg으로 기존에 보고된 연구결과와 비교했을 때 높은 수치였다. 또한 입자의 표면에서만 일산화질소의 방출이 일어남을 고려했을 때는 매우 높은 효율성을 가진다고 볼 수 있다. 또한 반감기가 151분으로 기존의 다이아제니움다이올레이트 입자들보다 3배에서 4배 이상 반감기가 느리게 나타났다. 이는 BPEI가 많은 아민 그룹을 포함하고 있으므로 일차 아민이나 미반응된 이차 아민이 다이아제니움다이올레이트 그룹과 수소결합을 형성하여 안정화를 통해 일산화질소의 방출 속도를 저해하는 것으로 예상된다.
실험예 3. 산화질소 나노입자의 생체적합성 평가
쥐의 근아세포(myoblast) 세포를 이용하여 실시예에서 제조된 BPEI 코팅 나노입자 및 산화질소 나노입자의 생체적합성을 평가하였다.
먼저, 근아세포를 4개의 24 well plate에 하나의 well 당 20000개씩 씨딩(seeding)하여 12시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 각 well의 세포배양액을 제거한 후, 새로운 배양액을 640 ㎕씩 넣은 다음, pH 7.4의 PBS에 다양한 농도(0.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml)로 분산되어있는 BPEI 코팅 나노입자를 160 ㎕씩 well에 처리하였다. 각 농도는 여섯 개의 well씩 처리하였다. 산화질소 나노입자도 pH 8의 PBS에 다양한 농도로 분산되어있으며 같은 방식으로 well에 처리하였다. Well plate는 24시간 동안 incubation한 후, 배양액을 제거한 다음 2.5 mg/ml의 MTT solution과 배양액을 1:9 비율로 제조하여 각 well에 800 ㎕씩 첨가하였다. 2시간 동안 incubation 후, 배양액을 제거하고 DMSO를 넣어서 dye를 녹인 다음 96 well plate로 100 ㎕씩 용액을 옮겼다. Plate reader로 540 nm에서의 용액들의 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 높을수록 세포생존률이 높음을 의미하며, 음성대조군(Media)과 나노입자들을 처리한 결과를 백분율로 계산하여 비교하였다. 48시간 후에도 위와 동일한 과정을 통해서 세포생존률을 분석하였다.
상기 분석결과를 도 9에 그래프로 나타내었다.
도 9에 나타나듯이, 24시간과 48시간에서 모두 산화질소 나노입자를 음성대조군과 BPEI 코팅 나노입자와 비교했을 때, 가장 높은 농도에서도 독성을 나타내지 않았으므로 생체적합성을 확인할 수 있다. 한 가지 특이한 점은 두 그래프에서 모두 5 ㎍/ml 산화질소 입자를 처리하였을 때, 다른 농도들에 비해서 세포생존률이 약간 낮게 나타난 점이다. 산화질소 기체가 낮은 농도에서 세포의 신호전달 및 여러가지로 관여하는 바가 많기 때문에, 이는 세포사멸을 일으켰다기보다는 분화가능성을 포함하는 근아세포에게 증식 외에 다른 변화를 유발하는 특정 산화질소 농도일 가능성이 있다.
동일한 근아세포를 이용하여 더 높은 농도 범위의 산화질소 나노입자의 생체적합성을 평가하였다. 비교실험군으로는 실리카 나노입자 및 BPEI 코팅 나노입자가 사용되었으며 입자의 농도는 25, 50, 100 ㎍/ml로 하였다. 동일한 방법으로 MTT assay를 24시간 후에 진행했으며 그 결과를 도 10에 그래프로 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 산화질소 나노입자의 농도가 증가함에 따라 세포생존률은 68%, 55%, 38%로 급격히 감소함을 확인할 수 있다. 그 이유는 고농도의 산화질소가 급격하게 방출되어 세포에게 독성을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서 이 농도 범위는 세포에게 긍정적인 결과를 가져오기에는 고농도이며, 항암이나 항균작용에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.

Claims (14)

  1. 기재; 및
    상기 기재 상에 형성되고, 다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막을 포함하며,
    상기 고분자 박막은 한 층 이상 형성된 산화질소 전달용 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    기재는 실리카, 하이드록시 아파타이트(hydroxyapatite), 금, 폴리-β-하이드록시 부티레이트(poly-β-hydroxy butyrate, PHB), 폴리유산(polylactic acid, PLA), 폴리-D-L-락티드-co- 글리코리드(poly-D-L-lactide-co-glycolide, PLGA), 알리파틱 폴리에스테르(aliphatic polyesters), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리-에틸렌글리콜(poly-ethyleneglycol, PEG), 폴리-비닐알코올(poly-vinylalcohol, PVA), 폴리-알킬-시아노-카릴레이트(poly-alkyl-cyano-carylates, PAC), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 마이셀(micelle), DNA/RNA, 인지질(phospholipid) 및 리포좀(liposome)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 기반으로 형성되는 산화질소 전달용 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    기재는 나노입자, 마이크로 입자 또는 필름 형상을 가지는 산화질소 전달용 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막은 1 내지 500 층으로 구성되는 산화질소 전달용 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막은 층과층(layer-by-layer, LbL) 적층 방식에 의해 다층으로 형성되는 산화질소 전달용 복합체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    층과층(layer-by-layer, LbL) 적층 방식은 정전기적 인력, 반 데르발스 힘, 수소결합, 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 전하-전송(charge-transfer) 결합, π-상호작용(π-interaction), 배위화학결합, 스트레오복합화(stereocomplexation), 호스트-게스트(host-guest) 또는 생물학적 결합을 이용하는 산화질소 전달용 복합체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    다이아제니움다이올레이트기를 포함하는 고분자 박막은 상기 박막 내에 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 산화질소 전달용 복합체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    제 2 고분자, 단백질, 성장인자, 그래핀 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 박막을 추가로 포함하는 산화질소 전달용 복합체.
  9. (A) 기재 상에 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 박막을 한 층 이상 형성하는 단계; 및
    (B) 25 내지 300℃의 온도 및 1 내지 30 atm의 압력에서, 일산화질소와 반응시키는 단계를 포함하는 산화질소 전달용 복합체의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    기재는 나노입자, 마이크로 입자 또는 필름 형상을 가지는 산화질소 전달용 복합체의 제조방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    이차 아민 그룹을 포함하는 고분자는 가지친 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, BPEI), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 피브리노겐(fibrinogen), 실크 피브로인(silk fibroin), 카세인(casein), 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 폴리 도파민(poly dopamine), 폴리 에틸렌이민(poly ethyleneimine), 폴리-L-리신(poly-L-lysine), 폴리(비닐아민) 하이드로클로라이드(poly(vinylamine) hydrochloride), 폴라(아미노 산)(poly(amino acids)) 및 des아미노타이로실 옥틸 에스터(desaminotyrosyl octyl ester)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 산화질소 전달용 복합체의 제조방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    단계 (A)에서 박막이 수소 결합을 통해 둘 이상의 다층으로 형성될 경우,
    상기 박막은 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액을 2회 이상 적층하여 형성하는 산화질소 전달용 복합체의 제조방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    단계 (A)에서 박막이 정전기적 인력을 통해 둘 이상의 다층으로 형성될 경우,
    상기 박막은 이차 아민 그룹을 포함하는 고분자 용액 및 음전하 고분자 용액을 반복적으로 적층하여 형성하는 산화질소 전달용 복합체의 제조방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    단계 (A)를 수행한 후, 고분자 박막이 형성된 나노입자 또는 마이크로 입자를 하이드로겔에 봉입하는 단계를 추가로 포함하는 산화질소 전달용 복합체의 제조방법.
KR1020160142007A 2016-10-28 2016-10-28 고분자 코팅 기반의 산화질소 전달용 복합체 제작 방법 및 이의 응용 KR20180046962A (ko)

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