KR20180040374A - Age-1을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, AGE-1 처리에 따른 뇌전증 발작의 지연 및 발생 빈도 감소효과를 확인하였으며, 과립세포의 분산화와 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 뇌전증의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

AGE-1을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising astrocyte elevated gene-1 for preventing or treating epilepsy}
본 발명은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌전증은 기질적 병변 또는 기능적 장애로 인하여 뇌신경 세포의 발작적인 방전으로 간헐적인 신경계의 장애를 일으키고, 신경증상, 의식상실, 경련, 감각장애 등의 증상을 나타내는 질환이다. 알츠하이머병(Alzheimer) 및 뇌졸증(Stroke)에 이어 세 번째로 흔한 신경계 질환으로, 전 세계 인구의 약 0.5~2%가 뇌전증을 앓고 있다. 또한, 전 세계적으로는 매년 10만 명당 45명 정도로 새로운 환자가 발생하고 있고, 우리나라의 경우 약 30~40만 명의 뇌전증 환자가 있는 것으로 추정되고 있다. 뇌전증 환자의 연령 분포를 살펴보면, 전체 뇌전증의 70%가 소아 청소년 연령에서 시작되고, 특히, 유아기에 발병률이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 발병률과 유병률은 생후 1년 이내에 가장 높았다가 급격히 낮아지고, 60세 이상의 노년층에서 다시 급격히 증가하는 U자 형태를 보이며, 일생동안 발작을 경험하는 유병률은 10~15%에 이른다.
뇌전증은 뇌전증 발작(epileptic　seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환으로서, 그 원인이 매우 다양하며, 이에, 정확한 원인은 밝혀져 있지 않은 실정이다. 다만, 최근 신경영상검사 기술의 발달에 따라 과거에는 관찰할 수 없었던 뇌의 미세한 병리적 변화들을 관찰할 수 있게 되면서 뇌전증의 원인에 대한 규명이 점차 확대되고 있다. 2012년 대한뇌전증학회 발간 뇌전증 역학 조사서에 의하면, 뇌전증 환자의 2/3 이상이 특별한 원인이 없는 특발성이나 잠재성이고, 나머지 경우가 원인을 찾을 수 있는 중후성 원인에 해당된다. 즉, 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성 뇌병증, 분만손상, 중추신경계 발달장애 및 유전적 성향과 같은 신경 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 경우, 뇌전증이 유발될 수 있다고 알려져 있다.
타 뇌질환과 다르게, 과립세포분산화는 측두엽 뇌전증 환자 해마에서 흔히 관찰될 수 있는 신경병리적 특징이며, 해마 치아이랑 과립세포의 비정상적 세포구축이 진행됨으로서 만성 뇌전증 발작이 발생된다. 아직까지 과립세포분산화의 발생 원인은 정확하게 밝혀져 있지 않은 상황이나, 최근 연구 동향에 따르면, 세포성장 및 내재적/외재적 세포신호전달과 관련되어 있는 mammalian target of rapamycin complex 1(mTORC1)의 과활성이 뇌전증발작과 관련된 과립세포분산화 발생 및 진행과 관련되어 있다. 이는, mTORC1 활성 억제와 함께 과립세포분산화 발생 제어가 뇌전증 예방 및 치료와 관련될 수 있음을 보여준다.
한편 뇌전증의 치료는 크게 약물치료와 약물외 치료, 즉 수술이나 케톤식이요법, 미주신경자극술 등으로 분류할 수 있다. 다만, 약물외 치료는 약물에 저항성을 보이는 환자에 대해서만 시행되고 있는 바, 뇌전증 치료를 위한 주요한 방법으로 약물치료가 이용되어왔다. 종래의 약물들로 페니토인(Phenytoin: Dilantin®), 발프로에이트(Valproate: Orfil®, Depakine®, Depakote®), 카바마제핀(Carbamazepine: Tegretol®), 페노바비탈 (Phenobarbital: Luminal®), 에토숙시마이드(Ethosuximide: Zarontin®) 등이 있으며, 최근에는 토피라메이트(Topiramate: topamax®), 라모트리진 (Lamotrigine: Lamictal®), 비가바트린 (Vigabatrin: Sabril®), 옥스카바제핀(Oxcarbazepine: Trileptal®) 등이 개발되어 상용화되어 있다.
다만, 이러한 약물 치료에도 불구하고, 뇌전증 환자의 30% 이상은 여러 가지 작용 기전의 약물을 사용해도 발작이 조절되지 않는 약제 불응성 뇌전증 (drug refractory epilepsy)에 해당되며, 일부 약물들은 면역 과민 반응에 의한 난치성 피부 발진, 약물에 의한 위장 자극, 및 어지럼증 등과 같은 부작용을 나타내고 있으며, 종래 약물 사용에 의한 정신장애 유발 및 자살 등의 사례 등이 보고되어 있는바, 효과적인 뇌전증 치료에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이에, 새로운 뇌전증 치료 약물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2013-0065646), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 유전자 구조물의 도입에 따른 뇌전증 발작 지연 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);
S1 단계의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및
S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 뇌전증 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 뇌전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 AEG-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 과립세포의 분산화를 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);
S1 단계의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및
S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 뇌전증 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌전증의 치료방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 뇌전증 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 AGE-1 처리에 따른 뇌전증 발작의 지연 효과를 확인하였다. 또한, AGE-1은 과립세포의 분산화와 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있음을 확인하였는바, 뇌전증의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적인 타겟 치료 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 카이닉산에 의해 경련 지속증이 유도된 동물모델의 해마 치아이랑에서 AEG-1의 발현이 증가되는 것을 확인한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 도면이다(Scale bar, 200 μm and 100 μm. CON, 무처리 대조군; KA 7d, 카이낙산 처리 7일째인 실험군).
도 2는 카이닉산에 의해 경련 지속증이 유도된 동물모델의 해마 치아이랑에서 AEG-1의 발현이 증가되는 것을 확인한 Western blot analysis 분석 결과를 나타낸 도면이다(p = 0.015).
도 3은 카이닉산에 의해 경련 지속증이 유도된 동물모델의 치아이랑 과립세포층 (dentate granule cell layer)에서 AEG-1 양성 세포 표현형 (phenotype) 확인을 위한 이중형광 염색 결과를 나타낸 도면이다(NeuN, neuronal nuclei, 성체 신경세포 표지자; GFAP, glial fibrillary acidic protein, 성상교세포 표지자. Scale bar, 50 μm).
도 4는 AAV-AEG-1 주입에 의해 AEG-1의 발현이 유도되는지 확인한 염색 결과를 나타낸 도면이다(Scale bar, 200 μm. HA, Human influenza hemagglutinin, AEG-1 발현 유도 표지자, GFP, green fluorescent protein, 대조유전자 구조물; AEG-1, AEG-1 기반 유전자 구조물, Mol, molecular layer of dentate gyrus; GCL, granule cell layer.).
도 5는 AAV-AEG-1 주입에 의해 AEG-1의 발현이 유도되는지 확인한 Western blot analysis 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 AAV-AEG-1 주입에 의해 타깃 인자들이 과립세포 내에서 특이적으로 발현되는지 확인한 면역형광 라벨링 실험 결과를 나타낸 도면이다(Scale bar, 50 μm).
도 7은 해마 치아이랑 과립세포 내 AAV-AEG-1 도입 후 치아이랑 세포구조 변화를 확인하기 위해서 정상 쥐의 대뇌 절편의 Nissl 염색한 결과를 나타낸 도면이다(Scale bar, 200 μm).
도 8은 해마 치아이랑 과립세포 내 AAV-AEG-1 도입 후 치아이랑 세포구조 변화를 확인하기 위해서 과립세포층 폭 (Width of GCL)을 수치화하여 대조군 및 대조유전자군과 실험군을 비교한 결과를 나타낸 도면이다(CON, contralateral side; EXP, ipsilateral side; NS, No significance).
도 9는 해마 치아이랑 과립세포 내 AAV-AEG-1 도입 후 mTORC1 활성 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 뇌전증 동물모델에서 해마 치아이랑 과립세포 내 AAV-AEG-1 도입에 의한 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면으로, A는 도입에 의해 뇌전증발작 발생이 지연되는지를 확인한 결과를 나타낸 것이고(KA, KA 단독; GFP+KA, AAV-GFP 처리 후 KA-유도 뇌전증발작; AEG-1+KA, AAV-AEG-1처리 후 KA-유도 뇌전증발작; ***p < 0.001), B는 AAV-AEG-1이 도입된 쥐와 대조군 및 대조유전자군의 과립 세포층 폭(Width of GCL)의 차이를 비교한 결과를 나타낸 것이며(**p < 0.01 및 ***p < 0.001, PBS, phosphate-buffered saline, PBS-treated ipsilateral side. Scale bar, 500 μm), C는 뇌전증 동물모델에서 해마 치아이랑 과립세포 내 AAV-AEG-1 도입에 의하여 과립세포 분산 현상이 일어나는지 확인한 결과를 나타낸 것이고, D는 뇌전증 동물모델에서 해마 치아이랑 과립세포 내 AAV-AEG-1 도입에 의한 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다(Scale bar, 200 μm. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001; ###p < 0.001).
본 발명자들은, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델을 이용하여 AGE-1 처리에 따른 뇌전증 발작의 지연 효과를 확인하였으며, 과립세포의 분산화와 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩 되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명의 AEG-1 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AEG-1 단백질의 변이체란 AEG-1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 AEG-1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem.Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 백터에 포함된 형태일 수 있다. 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터, 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 “뇌전증”은 뇌의 비정상적인 과흥분과 과동기화로 인해 신경세포 중 일부가 발작적으로 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 발작(seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환으로서, 신경생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 변화를 수반하는 심각한 신경 질환이다. 또한, 신경세포가 퇴행 또는 사멸하면서 인지 장애, 행동 장애 등을 나타내는 일반적인 뇌신경계 질환과 달리, 뇌전증은 신경세포가 비정상적으로 과도하게 활성화됨에 따라 발생하는 뇌신경계 질환이라는 점에 특징이 있다. 또한, 신경세포의 비정상적 과다흥분성(hyperexcitability)에 의한 흥분독성(excitotoxicity)이 유발되어 뇌전증에 의한 병리학적 손상이 잘 나타나는 대뇌 부위 중 해마(hippocampus) 내에서 해마경화증(hippocampal sclerosis), 교질화(gliosis), 비정상적 신경발생(abnormal neurogenesis)과 치아이랑 과립세포 비정상적 세포구축(cytoarchitectural abnormality of dentate granule cells) 및 이상시냅스회로 형성(aberrant synpatic circuit)등이 나타난다. 위와 같은 해마 내 병리학적 현상들이 진행됨으로서 만성 뇌전증 발작(chronic epileptic seizure)이 발생되고 인지 및 기억 장애뿐만 아니라 약물 치료에 반응하지 않는 약제불응성 난치성 뇌전증이 발생된다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방 ”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌전증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌전증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에 AGE-1 발현 증가 유전자 구조물을 처리함으로써, 발작 발생을 지연시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 4, 도 10A 참조). 또한, 상기와 부합되는 결과로서, AGE-1은 과립세포의 분산화 및 관련 인자인 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 효과적으로 억제시킬 수 있는바, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 4, 도 10D 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 AGE-1(astrocyte elevated gene-1)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 건강 기능 식품 조성물은 뇌전증의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “식품 조성물”은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제중 하나이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물에 첨가 할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌 , 차 , 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 구으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 다른 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유 할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토스, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐키롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피로리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);
S1 단계의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및
S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 뇌전증 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 "후보물질"이란 뇌전증 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보 물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.
상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌전증의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 뇌전증발작 동물모델의 해마 치아이랑에서 AEG -1의 발현 증가
1-1. 뇌전증발작 동물모델 제작
8 주령의 성체 수컷 C57BL/6 마우스를 Daehan Biolink (Eumseong, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 대조군으로는 상기 마우스에 뇌전증을 유도하지 않고 그대로 사용하였고, 실험군으로는 각 마우스에 클로랄 수화물(chloral hydrate, 360 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO.)을 i.p(intraperitoneal) 투여하여 마취시킨 후, 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame, David Kopf Instrument, Tujunga, CA.)에 위치시켰다. 종래 알려진 방법(Jeong et al., 2015; Jang et al., 2016)에 따라 각 마우스의 해마 부위에 카이닉산[(Kainic acid, KA; 0.2μg in 2μL phosphate-buffered saline (PBS); Sigma]을 실린지 펌프(KD Scientific, NewHope, PA.)에 붙어있는 10 ㎕ Hamilton syringe(30S needle)를 이용하여 오른쪽 해마(AP: -0.20 cm; ML: -0.16 cm; DV: -0.15 cm, relative to bregma; Franklin and Paxinos, 2004)에 주사하였다. 주입 후, 바늘을 천천히 회수하기 전에 추가적으로 5분간 유지시켜 뇌전증 발작 동물모델을 제작하였다. 모든 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 프로토콜과 지침에 따라 실험하였다.
1-2. 면역조직화학 염색( Immunohistochemical staining)
공지된 실험 방법(Kim et al., 2005; Kim et al., 2011; Kim et al., 2012)을 변형하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 상기 실시예 1-1의 각 마우스에서 카이닉산을 처리한 후 7일째 안락사를 시키고, 경심관류를 수행을 통해 조직을 고정시켰으며, 30 ㎛ 두께로 뇌 조직을 섹션하였다. 조직 섹션을 PBS로 세척한 후, 1차 항체와 함께 48시간 동안 상온에서 배양하였으며, 1차 항체로는 anti-astrocyte elevated gene-1(AEG-1, 1:500; Invitrogen, Camarillo, CA.)를 이용하였다. 이를 다시 PBS로 세척한 후, 2차 항체와 함께 배양하고, avidin-biotin complex kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA.)로 처리하였다. 상기 조직 섹션을 0.003% H2O2를 포함하는 0.1M PB에 녹인 0.5 mg/ml 3,3'-다이아미노벤지딘(diaminobenzidine; Sigma)과 함께 배양하는 것을 통해 신호를 검출하였다. 염색된 샘플은 명시야 현미경(bright-field microscope, Carl Zeiss, Gotingen, Germany)을 이용하여 분석하였다.
또한, 면역형광 라벨링(immunofluorescence labeling)을 위하여, 뇌조직 섹션을 세척한 후, anti-AEG-1(1:500; Invitrogen) 및 anti-neuronal nuclei(NeuN, 1:1000; Millipore, Bedford, MA.), anti-glial fibrillary acidic protein(GFAP, 1:1000; Millipore) 항체들과 함께 밤새 배양하였다. 다음 날, 조직 섹션을 세척한 후, Cy3 conjugated anti-rabbit IgG(1:200; Millipore) 및 FITC-conjugated anti-mouse IgG(1:200; Millipore)와 함께 1시간 동안 배양하고, 다시 세척하였다. 이를 Vectashield mounting medium(Vector)으로 마운트하였다. 염색된 샘플은 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
1-3. Western blot analysis
공지된 실험 방법(Kim et al., 2005; Kim et al., 2011; Kim et al., 2012)을 변형하여 상기 실시예 1-1의 각 마우스에 카이닉산을 처리한 후 7일째 안락사를 시키고, 해마조직을 적출하였다. 적출한 해마조직을 균질화하였고, 원심분리하여 상층액을 분리시켰다 (4 °C, 15분, 14000 g). Bicinchoninic acid assay kit (BCA kit; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyacrylAmide Gel Electrophoresis)를 통해 단백질을 분리하였다. Electrophoretic transfer system (Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 membrane에 분리된 단백질들을 이송시켰고, 각각 일차항체들[anti-AEG-1(1:500; Invitrogen), anti-β-actin (1:4000, Cell Signaling, Beverly, MA.)]과 함께 하루 동안 4 °C에서 배양하였다. 이후, 다시 2차 항체 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)와 반응시키고 ECL Western blot detection reagents (Amersham Biosciences) 처리하여 발색시켰다. 정량 분석을 위해 컴퓨터 프로그램 Image gauge 4.0 (FUJIFILM Science Lab)을 이용하여 각 단백질의 밀도를 측정하였다.
1-4. 통계분석
모든 값은 Sigma plot 12.0 프로그램을 이용하여, 평균 ± 평균치 표준오차(mean ± standard error of the mean (SEM))로 표현하였다. 다중 비교분석은 Tukey 사후검정을 이용한 단일 분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 실시하였다.
1-5. 결과 확인
면역조직화학 실험 결과를 나타낸 도 1에서와 같이, 카이닉산이 처리된 해마 치아이랑의 결과 대조군과 비교하여 보다 강한 AEG-1의 발현을 보인다는 것을 확인할 수 있고, 그 결과는 도 2에 나타낸 Western blot analysis 결과와 유사한 것으로, 도 2에서도 카이닉산을 처리한 동물의 해마 조직은 아무것도 처리되지 않은 대조군과 비교하여 더 높은 AEG-1 발현 수준을 보였다.
이에 치아이랑 과립세포층 (dentate granule cell layer)에서 AEG-1 양성 세포 표현형 (phenotype) 확인을 위하여 수행한 이중형광 염색 결과를 도 3에 나타내었다(NeuN, neuronal nuclei, 성체 신경세포 표지자; GFAP, glial fibrillary acidic protein, 성상교세포 표지자). 도 3에서 확인할 수 있는 것과 같이, 카이닉산이 처리된 해마의 과립세포분산화가 진행된 치아이랑 과립세포층에서는 AEG-1의 발현이 두드러지게 나타났고(도 3 좌측), 과립세포층 주변의 활성 성상교세포 (reactive astrocyte)에서도 AEG-1 발현이 관찰되었다(도 3 우측).
실시예 2. AAV - AEG -1의 제조
2-1. pBL - AEG -1 재조합 벡터 제조 및 AAV - AEG -1의 제조
pBL 플라스미드(HA-tag)에 AEG-1 유전자를 도입하여, AEG-1 유전자가 도입된 pBL-AEG-1 재조합 벡터를 제조하였다. AAV(Adeno-associated virus)-AEG-1은 University of North Carolina Vector Core에 의뢰하여 제작하였으며, 유전적 역가는 9.4×1012 viral genomes/ml이었다. 동일한 바이러스 백본에 활성화된 GFP(green fluorescent protein)를 서브클로닝하여 대조군으로 이용하였다.
2-2. 뇌수술을 통한 성체 마우스 해마 내 AAV - AEG -1 주입 및 발현 확인
8 주령의 성체 수컷 C57BL/6 마우스(Daehan Biolink)를 클로랄 수화물(chloral hydrate, 360 mg/kg; Sigma)을 투여하여 마취한 후, 스테레오텍식 프레임에 위치시켰다. 종래 알려진 방법(Jeon et al., 2015)을 응용 및 활용하여 각 마우스의 해마 치아이랑 부위에 AAV-AEG-1을 실린지 펌프(KD Scientific)에 붙어있는 10 ㎕ Hamilton syringe(30S needle)를 이용하여 오른쪽 해마 치아이랑(AP: -0.20 cm; ML: -0.14 cm; DV: -0.17 cm, relative to bregma)에 주사하였다(Franklin and Paxinos, 2004). 주입 후, 바늘을 천천히 회수하기 전에 추가적으로 5분간 유지시켰다. 이 때 2.0 ㎕의 바이러스 벡터 현탁액을 0.1 ㎕/min의 속도로 20분 간 주입하였다. 정상 성체 마우스 해마 치아이랑 부위에 AAV-GFP 및 AAV-AEG-1 주입 3주 후, 각 마우스를 안락사시키고, AEG-1의 발현 양상을 면역조직화학 염색 및 western blot analysis를 통해 확인하였다. AEG-1의 발현 양상을 확인하기 위해 면역조직화학 염색 실험에서 일차항체[anti-HA(1:100; Cell-signaling)]를 이용하여 검출하였다. 면역형광 라벨링 실험에서 일차항체들[anti-HA(1:100; Cell-signaling), anti-NeuN(1:1000; Millipore), anti-GFAP(1:1000; Millipore), anti-ionized calcium-binding adapter molecule 1(Iba1, 1:1000; Waco Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)]을 이용하여 분석하였으며, Western blot analysis 실험도 일차항체들[anti-AEG-1(1:500; Invitrogen), anti-HA(1:100; Cell-signaling), anti-GFP(1:100; Millipore), anti-β-actin (1:4000, Cell Signaling)]을 이용하여 분석하였다.
2-3. 결과 확인
본 실시예 2에서는 AEG-1 기반 유전자 구조물인 AAV-AEG-1의 도입에 의해 정상 쥐의 해마 치마이랑 과립세포 내에서 AEG-1 발현이 유도되는지 확인하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 것과 같이, AAV-AEG-1 주입 3주 후 치아이랑 과립세포에서 HA(Human influenza hemagglutinin)이 발현되어, AEG-1의 발현이 유도된다는 것을 확인하였다.
상기 결과는 도 5에 나타낸 Western blot analysis 결과와 유사한 것으로, 도 5에서 AEG-1은 AAV-AEG-1이 주입된 Lane에서 가장 강한 발현을 보였고, 이에 따라 AEG-1의 발현 유도 표지자인 HA의 발현도 관찰되었다.
또한, 도 6의 면역형광 라벨링 실험 결과에서 확인할 수 있는 것과 같이, 타깃 인자들이 과립세포 내에서 특이적으로 발현하는 것이 확인되었다.
즉, AAV-AEG-1의 도입에 의해, 도입되지 않은 대조군의 쥐(CON)나, 대조유전자군의 쥐(GFP)와 비교하여 AEG-1의 발현 수준이 증가한다는 점을 확인할 수 있다.
실시예 3. 정상 해마 치아이랑 내 AEG -1 유전자 도입에 의한 과립세포분산화 발생 여부 확인
3-1. Cresyl violet staining을 통한 과립세포분산화 발생 여부 및 관련 인자 활성 변화 확인
공지된 실험 방법(Jeong et al., 2015; Jang et al., 2016; Park et al., 2016)을 참조하여, 적출한 뇌를 30 μm 두께의 관상 대뇌 절편(coronal brain section)을 제작하였다. 대뇌 절편들은 슬라이드에 부착 후, 0.5% cresyl violet (Sigma)로 염색하였다. 과립세포 분산화 (GCD)정도는 해마 치아이랑 (dentate gyrus, DG) 내 상부 과립세포층(granule cell layer, GCL)의 안쪽 1/4 지점과 중간 지점에서, 과립세포층 평균 폭 비교를 통해 측정하였으며, 반대편 치아이랑 과립세포층 평균 폭과 비교하여 카이닉산이 처리된 해마 치아이랑 과립세포층 평균 폭에 대한 수치를 백분율로 표기하여 분석하였다. 과립세포분산화와 관련된 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성 변화를 확인하기 위해 western blot analysis를 실행하였으며, mTORC1의 활성 변화를 확인하기 위해 일차항체들[anti-phospho-4E-BP1(T37/46)(1:1000; Cell-signaling), anti-4E-BP1(1:1000; Cell-signaling), anti-β-actin (1:4000, Cell Signaling)]을 이용하여 분석하였다.
3-2. 결과 확인
도 7에 나타낸 대뇌 절편의 Nissl 염색 결과를 통해 치마이랑 세포 구조 변화를 확인한 결과, AAV-AEG-1이 도입된 쥐의 세포구조와, 대조군의 쥐의 세포구조에서는 변화가 보이지 않았다. 이에, 과립 세포층 폭(Width of GCL)을 수치화하여 대조군과 비교하였고, 도 8에 나타낸 결과와 같이 AAV-AEG-1가 도입된 쥐와 대조군의 과립 세포층 폭에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
도 9는 AAV-AEG-1 도입 후 과립세포분산화와 관련있는 인자인 mTORC1 활성이 변화하는지 확인한 결과를 나타낸 것으로, 도 9에 나타낸 것과 같이 mTORC1의 하위 인자인 4E-BP1의 T37/46 인산화 정도를 확인한 결과, 정상 대조군 (CON) 및 대조유전자 처리군 (GFP)과 비교했을 때, AAV-AEG-1 주입된 실험군에서 mTORC1의 활성 변화는 관찰되지 않았다.
즉 정상 쥐에 AAV-AEG-1가 도입되더라도, 세포과립분산화와 같은 비정상적 세포 구조 변화를 야기하지 않는다는 점을 확인하였다.
실시예 4. 뇌전증발작 동물모델에서 해마 치아이랑 내 AEG -1 도입에 의한 항뇌전증 효과 확인
4-1. 카이닉산 처리에 의한 뇌전증 발작 지연 효과 확인
상기 실시예 2-2의 실험방법과 같이, 정상 마우스의 오른쪽 해마 치아이랑 부위에 AAV-GFP 및 AAV-AEG-1을 주입 3주 후, 카이닉산을 해마 내 처리하여 뇌전증 발작을 유도하였다. 카이닉산을 처리한 마우스는 6시간 동안 비디오 촬영하여 카이닉산 처리에 의한 발작 발생 (seizure onset)의 시간을 측정하여 AAV-AEG-1 투여에 의한 발작 발생 잠재기 (latency of seizure onset) 지연효과를 확인하였다. 행동학적 발작 단계 (seizure stages)는 5 가지 단계로 식별되며, 각 단계로는 1 단계, 안면 떨림 (facial movement); 2 단계, 머리 끄덕임과 근간대경련성 뒤틀림 (head nodding and myoclonic twitching); 3 단계, 전만증자세에서 앞다리 경련 (forelimb clonus with lordotic posture); 4 단계, 배후 자세에서 앞다리 경련 (forelimb clonus with reared posture); 5 단계, 자세 제어 불가 긴장간대발작 (tonic-clonic seizure without postural control)의 행동학적 유형이 있다 (Macias et al., 2013; Racine, 1972). 본 실시예에서 발작 발생 시작은 카이닉산 처리에 유도된 발작 행동 유형 중 3 단계 [전만증자세에서 앞다리 경련 (forelimb clonus with lordotic posture)]를 보이는 시점으로 설정하였고, 카이닉산 처리 후부터 발작 행동 3 단계가 발생하는 시간을 기록하였다.
4-2. 해마 치아이랑 과립세포 내 AEG -1 도입에 의한 과립세포분산화 발생 및 관련 인자 억제 효과
상기 실시예 1-2과 3-1에 기재된 실험방법을 이용하여 과립세포분산화 발생 및 관련 인자 억제 효과를 확인하였다. 우선, 카이닉산이 처리되어 뇌전증발작이 유도된 마우스의 해마 치아이랑 과립세포 내로 AEG-1 유전자를 도입한 후, 뇌전증발작에 의한 과립세포분산화 및 관련 인자 발현 변화를 확인하였다. 과립세포분산화 관련 핵심인자인 mTORC1 활성 표지자인 p-4E-BP1을 면역조직화학 염색을 통해 검출하였고, 각 마우스의 해마 치아이랑에서 p-4E-BP1의 양성반응을 보이는 세포 수에 대한 수치를 백분율로 표기하여 분석하였다.
4-3. 결과 확인
본 실시예 4에서는 뇌전증 동물모델에서 해마 치아이랑 과립세포 내 AEG-1 도입에 의해서 뇌전증 발작 발생이 지연되고, 과립세포분산화가 억제되는지 확인하였다.
AAV-AEG-1 도입 3주 후 카이낙산을 해마 내 처리한 경우 뇌전증 발작이 지연되는지를 확인한 결과를 도 10A에 나타내었다. 도 10A에 나타낸 것과 같이 카이낙산으로 유도되는 뇌전증 발생 시간은 AAV-AEG-1을 도입한 쥐에서 현저히 지연된다는 것을 확인하였다.
또한 AAV-AEG-1이 도입된 쥐와 대조군 및 대조유전자군의 과립 세포층 폭(Width of GCL)의 차이를 비교한 결과, 도 10B에 나타낸 바와 같이 AAV-AEG-1이 도입된 쥐에서 과립세포분산화 발생이 현저히 감소한다는 점을 확인하였다. 상기 결과와 유사하게 도 10C에 나타낸 대뇌 절편의 염색 결과로부터, AAV-AEG-1이 도입된 쥐에서는 과립세포 분산 현상이 거의 발생하지 않는다는 점을 확인할 수 있다.
또한, 치아이랑 과립세포층에서의 p-4E-BP1 염색 결과를 도 10D에 나타내었다. 그 결과, AEG-1이 도입된 과립세포층에서 p-4E-BP1 양성 세포의 수 및 발현 정도가 현저히 감소된다는 것을 확인하였다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명의 조성물의 유효성분인 AEG-1의 도입에 의해 뇌전증발작과 관련된 과립세포분산화 발생이 현저히 저해된다는 것을 알 수 있으며, 이로부터 상기 AEG-1 발현 증가 유전자 구조물의 뇌전증 치료 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition comprising astrocyte elevated gene-1 for preventing or treating epilepsy <130> MP16-436 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 582 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Arg Ser Trp Gln Asp Glu Leu Ala Gln Gln Ala Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ser Ala Arg Leu Arg Glu Met Leu Ser Val Gly Leu Gly Phe Leu 20 25 30 Arg Thr Glu Leu Gly Leu Asp Leu Gly Leu Glu Pro Lys Arg Tyr Pro 35 40 45 Gly Trp Val Ile Leu Val Gly Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu 50 55 60 Phe Leu Leu Gly Tyr Gly Trp Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Arg Lys 65 70 75 80 Lys Arg Arg Ser Pro Pro Arg Lys Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro 85 90 95 Ala Ala Ala Pro Asp Asp Leu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu 100 105 110 Glu Gln Lys Lys Lys Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Pro 115 120 125 Asn Gly Arg Thr Val Glu Val Ala Glu Gly Glu Ala Val Arg Thr Pro 130 135 140 Gln Ser Val Thr Ala Lys Gln Pro Pro Glu Ile Asp Lys Lys Asn Glu 145 150 155 160 Lys Ser Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ser Lys Ser Asp Ala Lys Ala Val 165 170 175 Gln Asn Ser Ser Arg His Asp Gly Lys Glu Val Asp Glu Gly Ala Trp 180 185 190 Glu Thr Lys Ile Ser His Arg Glu Lys Arg Gln Gln Arg Lys Arg Asp 195 200 205 Lys Val Leu Thr Asp Ser Gly Ser Leu Asp Ser Thr Ile Pro Gly Ile 210 215 220 Glu Asn Thr Ile Thr Val Thr Thr Glu Gln Leu Thr Thr Ala Ser Phe 225 230 235 240 Pro Val Gly Ser Lys Lys Asn Lys Gly Asp Ser His Leu Asn Val Gln 245 250 255 Val Ser Asn Phe Lys Ser Gly Lys Gly Asp Ser Thr Leu Gln Val Ser 260 265 270 Ser Gly Leu Asn Glu Asn Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Trp Asn Glu 275 280 285 Lys Ser Val Lys Leu Ser Ser Gln Ile Ser Ala Gly Glu Glu Lys Trp 290 295 300 Asn Ser Val Ser Pro Ala Ser Ala Gly Lys Arg Lys Thr Glu Pro Ser 305 310 315 320 Ala Trp Ser Gln Asp Thr Gly Asp Ala Asn Thr Asn Gly Lys Asp Trp 325 330 335 Gly Arg Ser Trp Ser Asp Arg Ser Ile Phe Ser Gly Ile Gly Ser Thr 340 345 350 Ala Glu Pro Val Ser Gln Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Gln Trp Asp Val 355 360 365 Ser Arg Asn Gln Pro Tyr Ile Asp Asp Glu Trp Ser Gly Leu Asn Gly 370 375 380 Leu Ser Ser Ala Asp Pro Asn Ser Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu 385 390 395 400 Trp Gly Asn Trp Val Asp Glu Glu Arg Ala Ser Leu Leu Lys Ser Gln 405 410 415 Glu Pro Ile Pro Asp Asp Gln Lys Val Ser Asp Asp Asp Lys Glu Lys 420 425 430 Gly Glu Gly Ala Leu Pro Thr Gly Lys Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 435 440 445 Lys Lys Lys Gln Gly Glu Asp Asn Ser Thr Ala Gln Asp Thr Glu Glu 450 455 460 Leu Glu Lys Glu Ile Arg Glu Asp Leu Pro Val Asn Thr Ser Lys Thr 465 470 475 480 Arg Pro Lys Gln Glu Lys Ala Phe Ser Leu Lys Thr Ile Ser Thr Ser 485 490 495 Asp Pro Ala Glu Val Leu Val Lys Asn Ser Gln Pro Ile Lys Thr Leu 500 505 510 Pro Pro Ala Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Ile Leu Ser Lys Ser Asp 515 520 525 Ser Asp Lys Ser Ser Ser Gln Val Pro Pro Ile Leu Gln Glu Thr Asp 530 535 540 Lys Ser Lys Ser Asn Thr Lys Gln Asn Ser Val Pro Pro Ser Gln Thr 545 550 555 560 Lys Ser Glu Thr Ser Trp Glu Ser Pro Lys Gln Ile Lys Lys Lys Lys 565 570 575 Lys Ala Arg Arg Glu Thr 580 <210> 2 <211> 1746 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggctgcac ggagctggca ggacgagctg gcccagcagg ccgaggaggg ctcggcccgg 60 ctgcgggaaa tgctctcggt cggcctaggc tttctgcgca ccgagctggg cctcgacctg 120 gggctggagc cgaaacggta ccccggctgg gtgatcctgg tgggcactgg cgcgctcggg 180 ctgctgctgc tgtttctgct gggctacggc tgggccgcgg cttgcgccgg cgcccgcaaa 240 aagcggagga gcccgccccg caagcgggag gaggcggcgg ccgtgccggc cgcggccccc 300 gacgacctgg ccttgctgaa gaatctccgg agcgaggaac agaagaagaa gaaccggaag 360 aaactgtccg agaagcccaa accaaatggg cggactgttg aagtggctga gggtgaagct 420 gttcgaacac ctcaaagtgt aacagcaaag cagccaccag agattgacaa gaaaaatgaa 480 aagtcaaaga aaaataagaa gaaatcaaag tcagatgcta aagcagtgca aaacagttca 540 cgccatgatg gaaaggaagt tgatgaagga gcctgggaaa ctaaaattag tcacagagag 600 aaacgacagc agcgtaaacg tgataaggtg ctgactgatt ctggttcatt ggattcaact 660 atccctggga tagaaaatac catcacagtt accaccgagc aacttacaac cgcatcattt 720 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Claims (12)

  1. AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 AEG-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 바이러스성 벡터는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 과립세포의 분산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 개선용 건강 기능 식품 조성물.
  10. AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);
    S1 단계의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및
    S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 뇌전증 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 뇌전증 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 뇌전증 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
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