KR101726513B1 - 실리비닌을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, 실리비닌 처리에 따른 뇌전증 발작의 지연 및 발생 빈도 감소효과를 확인하였으며, 과립세포의 분산화와 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 뇌전증의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

실리비닌을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising silibinin for preventing or treating epilepsy}

본 발명은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

뇌전증은 기질적 병변 또는 기능적 장애로 인하여 뇌신경 세포의 발작적인 방전으로 간헐적인 신경계의 장애를 일으키고, 신경증상, 의식상실, 경련, 감각장애 등의 증상을 나타내는 질환이다. 알츠하이머병(Alzheimer) 및 뇌졸증(Stroke)에 이어 세 번째로 흔한 신경계 질환으로, 전 세계 인구의 약 0.5~2%가 뇌전증을 앓고 있다. 또한, 전 세계적으로는 매년 10만명당 45명 정도로 새로운 환자가 발생하고 있고, 우리나라의 경우 약 30~40만 명의 뇌전증 환자가 있는 것으로 추정되고 있다. 뇌전증 환자의 연령 분포를 살펴보면, 전체 뇌전증의 70%가 소아 청소년 연령에서 시작되고, 특히, 유아기에 발병률이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 발병률과 유병률은 생후 1년 이내에 가장 높았다가 급격히 낮아지고, 60세 이상의 노년층에서 다시 급격히 증가하는 U자 형태를 보이며, 일생동안 발작을 경험하는 유병률은 10~15%에 이른다.

뇌전증은 뇌전증 발작(epileptic　seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환으로서, 그 원인이 매우 다양하며, 이에, 정확한 원인은 밝혀져 있지 않은 실정이다. 다만, 최근 신경영상검사 기술의 발달에 따라 과거에는 관찰할 수 없었던 뇌의 미세한 병리적 변화들을 관찰할 수 있게 되면서 뇌전증의 원인에 대한 규명이 점차 확대되고 있다. 일부 역학 연구에서는 환자의 1/3 이상이 뇌에 생긴 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 것으로 보고된바 있고, 주요한 원인으로는 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성 뇌병증, 유전, 미숙아, 분만 전후의 손상 등으로 알려져 있다.

한편, 뇌전증의 치료는 크게 약물 치료와 약물외 치료, 즉 수술, 케톤식이요법, 미주신경자극술 등으로 분류할 수 있다. 다만, 약물외 치료는 약물에 저항성을 보이는 환자에 대해서만 시행되고 있는바, 뇌전증 치료를 위한 주요한 방법으로 약물 치료가 이용되어왔다. 종래의 약물들로 페니토인(Phenytoin: Dilantin), 발프로에이트(Valproate: Orfil, Depakine, Depakote), 카바마제핀(Carbamazepine: Tegretol), 페노바비탈 (Phenobarbital: Luminal), 에토숙시마이드(Ethosuximide: Zarontin) 등이 있으며, 최근에는 토피라메이트(Topiramate: topamax), 라모트리진 (Lamotrigine: Lamictal), 비가바트린 (Vigabatrin: Sabril), 옥스카바제핀(Oxcarbazepine: Trileptal) 등이 개발되어 상용화되어 있다.

다만, 이러한 약물 치료에도 불구하고, 뇌전증 환자의 30% 이상은 여러가지 작용 기전의 약물을 사용해도 발작이 조절되지 않으며, 일부 약물들은 면역 과민 반응에 의한 피부 발진, 약물에 의한 위장 자극, 및 어지럼증 등과 같은 부작용을 나타내고 있는바, 효과적인 뇌전증 치료에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이에, 새로운 뇌전증 치료 약물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2013-0065646), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 실리비닌(Silibinin) 처리에 따른 뇌전증 발작 지연 및 발생 빈도 감소 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 및/또는 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 과립세포의 분산화를 억제시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있다.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌전증의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 실리비닌(Silibinin)을 포함하는 조성물의 뇌전증 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하며, 상기 실리비닌 처리에 따른 뇌전증 발작의 지연 및 발생 빈도 감소효과를 확인하였다. 또한, 실리비닌은 과립세포의 분산화와 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있음을 확인하였는바, 종래 치료제의 부작용을 해소시킨 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에서, 다양한 농도의 실리비닌(50, 100, 200 mg/kg) 처리에 따른 발작 잠재기 지연 효과를 나타낸 결과이다(KA; 카이닉산 처리군 (대조군), KA+S(50); 카이닉산 및 Silibinin 50 mg/kg 처리군, KA+S(100); 카이닉산 및 Silibinin 100 mg/kg 처리군, KA+S(200); 카이닉산 및 Silibinin 200 mg/kg 처리군).
도 2는 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에서, 실리비닌(200 mg/kg) 처리에 따른 발작 빈도 감소 효과를 나타낸 결과이다(KA; 카이닉산 처리군 (대조군), KA+S(200); 카이닉산 및 Silibinin 200 mg/kg 처리군).
도 3은 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에서, 다양한 농도의 실리비닌(50, 100, 200 mg/kg) 처리에 따른 과립세포의 분산화 정도를 0.5% cresyl violet (Sigma) 염색을 통해 확인한 결과이다(CON; 카이닉산 비처리군, KA; 카이닉산 처리군 , KA+S(50); 카이닉산 및 Silibinin 50 mg/kg 처리군, KA+S(100); 카이닉산 및 Silibinin 100 mg/kg 처리군, KA+S(200); 카이닉산 및 Silibinin 200 mg/kg 처리군).
도 4는 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에서, 다양한 농도의 실리비닌(50, 100, 200 mg/kg) 처리에 따른 과립세포의 분산화 정도를 수치화하여 비교한 결과이다(CON; 카이닉산 비처리군, KA; 카이닉산 처리군 , KA+S(50); 카이닉산 및 Silibinin 50 mg/kg 처리군, KA+S(100); 카이닉산 및 Silibinin 100 mg/kg 처리군, KA+S(200); 카이닉산 및 Silibinin 200 mg/kg 처리군).
도 5는 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에서, 실리비닌(200 mg/kg) 처리에 따른 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성 변화를 표지자인 p-4E-BP1을 이용하여 확인한 결과이다(CON; 카이닉산 비처리군, KA; 카이닉산 처리군, KA+S(200); 카이닉산 및 Silibinin 200 mg/kg 처리군).
도 6은 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에서, 실리비닌(200 mg/kg) 처리에 따른 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성 변화를 수치화하여 비교한 결과이다(CON; 카이닉산 비처리군, KA; 카이닉산 처리군, KA+S(200); 카이닉산 및 Silibinin 200 mg/kg 처리군).

본 발명자들은, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델을 이용하여 실리비닌 처리에 따른 뇌전증 발작의 지연 및 발생 빈도 감소효과를 확인하였으며, 과립세포의 분산화와 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시킬 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 유효성분인 실리비닌(Silibinin; (2R,3R)-3,5,7-trihydroxy- 2-[(2R,3R)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl) -2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl]chroman-4-one)은 밀크시슬(Milk thistle)로 부터 분리한 화합물 중 하나로서, 종래에 간 질환과 중독을 치료하는데 주로 이용되어왔으며, 최근 연구에서는 폐암의 전이를 막는데 실리비닌이 이용될 수 있음을 새롭게 밝혀낸 바가 있다. 그러나 이러한 연구에도 불구하고, 실리비닌과 뇌전증간 관련성에 대해서는 아직 보고된 바가 없는 실정이다.

본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "뇌전증"은 뇌의 비정상적인 과흥분과 과동기화로 인해 신경세포 중 일부가 발작적으로 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 발작(seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환으로서, 신경생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 변화를 수반하는 심각한 신경 질환이다. 또한, 신경세포가 퇴행 또는 사멸하면서 인지 장애, 행동 장애 등을 나타내는 일반적인 뇌신경계 질환과 달리, 뇌전증은 신경세포가 비정상적으로 과도하게 활성화됨에 따라 발생하는 뇌신경계 질환이라는 점에 특징이 있다. 또한, 신경세포의 비정상적 과다흥분성(hyperexcitability)에 의한 흥분독성(excitotoxicity)이 유발되어 뇌전증에 의한 병리학적 손상이 잘 나타나는 대뇌 부위 중 해마(hippocampus) 내에서 해마경화증(hippocampal sclerosis), 교질화(gliosis), 비정상적 신경발생(abnormal neurogenesis)과 치아이랑 과립세포 비정상적 세포구축(cytoarchitectural abnormality of dentate granule cells) 및 이상시냅스회로 형성(aberrant synpatic circuit)등이 나타난다. 위와 같은 해마 내 병리학적 현상들이 진행됨으로써 만성 뇌전증 발작(chronic epileptic seizure)이 발생되고 인지 및 기억 장애뿐만 아니라 약물 치료에 반응하지 않는 약제불응성 난치성 뇌전증이 발생된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방 "이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌전증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌전증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일실시예에서는, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델에 실리비닌을 지속적으로 처리함으로써, 발작 잠재기를 지연시킬 수 있을 뿐만 아니라, 발작 발생 빈도를 감소시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조). 또한, 상기와 부합되는 결과로서, 실리비닌은 과립세포의 분산화 및 관련 인자인 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 효과적으로 억제시킬 수 있는바, 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 3 및 4 참조).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때, 상기 건강 기능 식품 조성물은 뇌전증의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제중 하나이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물에 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 구으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 다른 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토스, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐키롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피로리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌전증의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 방법

1-1. 카이닉산 처리에 의한 뇌전증의 유도

성체 수컷 C57BL/6 쥐(8주령, 대한바이오링크, 음성, 한국)에 chloral hydrate(360mg/kg, sigma, st.Louis. Mo. USA)를 복강 내 주사하여 마취하였고, stereotaxic frame(David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)에서 수술하였다. 구체적으로, 쥐의 해마 부위(정수리점 기준 AP: -2.0mm, ML: -1.2mm, DV: -1.5mm; Franklin and Paxinos, 2004)에 Hamilton syringe needle(30S)과 syringe pump(KD Scientific, NewHope, PA, USA)를 이용하여 카이닉산[(Kainic acid, KA; 0.2μg in 2μL phosphate-buffered saline (PBS); Sigma]을 직접 투여하여 뇌전증을 유도하였다. 모든 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 프로토콜과 지침에 따라 실험하였다.

1-2. 실리비닌의 투여

실리비닌(silibinin; Sigma)은 0.25% carboxymethyl cellulose(Sigma)가 함유된 생리식염수(0.9% saline)에 녹여서 사용하였다. 발작 발생 지연 및 과립세포 분산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실리비닌(50, 100, 200 mg/kg)을 카이닉산 투여 하루 전과 카이닉산 투여 한 시간 전에 복강 내 주사하였고, 카이닉산 처리에 의한 뇌전증 발작(seizure)을 유도 후, 다음날부터 하루에 한 번씩 6일 동안 실리비닌을 투여하였다.

또한, 카이닉산 처리에 의해 유도된 자발적 재발성 뇌전증(spontaneous recurrent seizure(SRS))의 발작 빈도에 미치는 영향을 측정하기 위하여 카이닉산을 처리한 후 다음날부터 5주 동안 하루에 한 번씩 실리비닌(200 mg/kg)을 복강 내 주사하였다.

1-3. 통계 분석

모든 값은 Sigma plot 12.0 프로그램을 이용하여, 평균 ± 평균치 표준오차(mean ± standard error of the mean (SEM))로 표현하였다. 다중 비교분석은 Tukey 사후검정을 이용한 단일 분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 실시하였다.

실시예 2. 실리비닌 처리에 의한 발작 지연 및 발작 빈도 감소 효과

본 실시예에서는, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델을 이용하여 실리비닌 처리에 의한 발작 잠재기 지연 및 발작 발생 빈도 감소 효과를 확인하고자 하였다.

2-1. 발작 지연 효과 확인

행동학적 발작 단계(seizure stages)는 5 가지 단계로 식별되며, 각 단계로는 1 단계; 안면 떨림(facial movement), 2 단계; 머리 끄덕임과 근간대 경련성 뒤틀림(head nodding and myoclonic twitching), 3 단계; 전만증 자세에서 앞다리 경련(forelimb clonus with lordotic posture), 4 단계; 배후 자세에서 앞다리 경련(forelimb clonus with reared posture), 5 단계; 자세 제어 불가 긴장간대발작(tonic-clonic seizure without postural control)의 행동학적 유형이 있다. 발작 발생 시작은 카이닉산 처리에 유도된 발작 행동 유형 중 3 단계(전만증 자세에서 앞다리 경련 (forelimb clonus with lordotic posture))를 보이는 시점으로 설정하였고, 카이닉산 처리 후부터 발작 행동 3 단계가 발생하는 시간을 기록하였다. 카이닉산을 처리한 쥐는 6시간 동안 비디오 촬영하면서 카이닉산 처리에 의한 발작 발생(seizure onset) 시간을 측정하였으며, 이를 통해 실리비닌 처리에 의한 발작 발생 잠재기(latency of seizure onset)의 지연 효과를 관찰하고자 하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 실리비닌을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 실리비닌을 지속적으로 처리한 군(50, 100, 200 mg/kg)에서는, 뇌전증 발작의 발생이 유의적으로 지연됨을 확인하였으며, 이러한 경향은 실리비닌 처리 농도가 증가할수록 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.

2-2. 발작 발생 빈도 감소 효과 확인

자발적 재발성 뇌전증 발작(spontaneous recurrent seizure (SRS)) 여부는 카이닉산을 처리한 후 3주째부터 2주 동안(하루 9시간, 주 6일, 2주 내 총 108 시간) 비디오 촬영을 실시하여 관찰하였다. 촬영기간 동안 3 단계에서 5 단계의 발작 행동을 나타내는 경우, 자발적 재발성 뇌전증이 발생한 것으로 기록하여 그 빈도를 측정하였으며, 이를 통해 실리비닌 처리에 의한 발작 발생 빈도 감소 효과를 확인하고자 하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실리비닌을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 실리비닌을 지속적으로 처리한 군(200 mg/kg)에서는, 자발적 뇌전증 발작의 발생 빈도가 현저하게 감소됨을 확인하였다.

실시예 3. 실리비닌 처리에 의한 과립세포 분산화 억제 효과

본 실시예에서는, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델을 이용하여 실리비닌 처리에 의한 과립세포의 분산화 정도를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 카이닉산을 처리한 후 7일째, 뇌전증이 유도된 동물모델에 chloral hydrate(360mg/kg; Sigma)를 복강 내 주사하여 안락사시켰으며, 0.1M PB(phosphate buffer; Sigma)에 녹인 4% paraformaldehyde를 심장을 통해 관류시켜 고정하였다. 이후, 적출한 뇌는 cryotat (Microm International GmbH, Walldorf, Germany)을 이용하여 30 μm 두께의 관상 대뇌 절편(coronal brain section)을 제작하였으며, 슬라이드에 부착한 절편들은 0.5% cresyl violet (Sigma)로 염색하였다. 과립세포 분산화 (GCD)정도는 해마 치아이랑 (dentate gyrus, DG) 내 상부 과립세포층(granule cell layer, GCL)의 안쪽 1/4 지점과 중간 지점에서, 과립세포층 평균 폭 비교를 통해 측정하였으며, 반대편 치아이랑 과립세포층 평균 폭과 비교하여 카이닉산이 처리된 해마 치아이랑 과립세포층 평균 폭에 대한 수치를 백분율로 표기하여 분석하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 실리비닌을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 실리비닌을 지속적으로 처리한 군(50, 100, 200 mg/kg)에서는, 과립세포층의 폭이 현저하게 감소됨을 확인하였으며, 이러한 경향성은 상기 실시예 2-1과 마찬가지로 농도가 증가할수록 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.

실시예 4. 실리비닌 처리에 의한 과립세포 분산화 관련 인자 억제 효과

본 실시예에서는, 카이닉산에 의해 뇌전증이 유도된 동물모델을 이용하여 실리비닌 처리에 의한 과립세포 분산화와 관련된 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성 변화를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 카이닉산을 처리한 뒤 7일째 안락사를 시킨 후, 실리비닌을 처리 또는 처리하지 않은 동물모델의 해마 조직을 적출하였다. 적출한 해마조직을 균질화시키고, 원심분리하여 상층액을 분리시켰다 (4℃, 15분, 14000 g). Bicinchoninic acid assay kit (BCA kit; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyacrylAmide Gel Electrophoresis)를 통해 단백질을 분리하였다. Electrophoretic transfer system (Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 membrane에 분리된 단백질들을 이송시켰고, 각각 1차 항체들[anti-p-4E-BP1 (1:1000, Cell Signaling), anti-β-actin (1:4000, Cell Signaling)]과 함께 하루 동안 4℃에서 배양하였다. 이후, 다시 2차 항체 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)와 반응시키고 ECL Western blot detection reagents (Amersham Biosciences) 처리하여 발색시켰다. 정량 분석을 위해 컴퓨터 프로그램 Image gauge 4.0 (FUJIFILM Science Lab)을 이용하여 각 단백질의 밀도를 측정하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 실리비닌을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 실리비닌을 지속적으로 처리한 군(200 mg/kg)에서는, 과립세포 분산화 발생과 관련된 mTORC1의 활성이 억제되었음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (4)

1. 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 과립세포의 분산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 실리비닌(Silibinin)을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.

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