KR20180027574A - 바이오센서 - Google Patents

Abstract

핵산 프로브를 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소 및 팽윤성 생물학적 감응성 요소와 연합된 물리전기적 변환기를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 물리전기적 변환기는 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤을 검출 가능한 전기적 특성으로 전환시킨다. 바람직한 실시형태에서, 바이오센서는 전기 임피던스를 측정하도록 적합화된 전극을 포함하는 적합한 기재 상에 고정된 올리고뉴클레오타이드 가교된 중합체 복합체를 포함한다. 상기 바이오센서를 포함하는 연관 방법 및 장치가 또한 제공된다.

Description

바이오센서

본 발명은 바이오센서 및 바이오센서를 포함하는 시스템에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 바이오센서는 샘플 중 핵산을 검출하도록 적합화된다.

바이오센서는 다양한 기술 영역, 특히 진단에서 사용을 위해 점점 더 중요해지는 분석 도구의 세트이다. 많은 경우에서 그들은 생물학적 인식(생물-인식) 성분 및 적합한 변환기를 조합시킨다. 그들은 일반적으로 생물-인식 성분과 상호작용하는 피분석물의 존재에서 생화학적 신호를 적합한 신호로 전환시킨다.

핵산의 검출을 위한 바이오센서가 특히 중요하다. 진단 및 다른 생물학적 조사용 생물마커로서 마이크로 RNA(miRNA)의 사용이 계속 개발중임을 고려하여, 샘플 중의 핵산을 신속하고 편리하게 동정하는 센서에 대한 필요성이 증가되고 있다. 핵산용 바이오센서는 바이오센서의 생물-인식 성분을 활성화시키도록 2종의 상보성 핵산 가닥 사이의 상호작용을 이용할 수 있다. 이러한 상호작용의 측정 가능한 전기 신호로의 변환은 도전해볼 만하다.

샘플 중 핵산(예를 들어, miRNA)을 검출하기 위한 다양한 기지의 방법이 존재하지만, 그 이상의 바이오센서에 대한 절실한 요구가 남아있다.

보다 대략적으로 말하면, 다른 유형의 표적을 위한 신규 바이오센서의 요구가 역시 존재한다.

구체적으로, 기지의 바이오센서 플랫폼보다 더 저렴한 비용, 개선된 편의성, 더 신속한 검출 속도 및/또는 개선된 감도의 바이오센서가 바람직하다.

본 발명의 제1 양상에 따르면,

- 핵산 프로브를 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소(swellable biologically sensitive element); 및

- 팽윤성 생물학적 감응성 요소와 연합된(associated) 물리전기적 변환기를 포함하는 바이오센서를 제공한다.

핵산 프로브를 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 표적/피분석물의 인식을 위해 적합화된다.

본 발명의 일정 실시형태에서, 표적은 핵산일 수 있다. 이러한 경우에서 표적 핵산은 핵산 프로브와 표적 핵산 사이의 상보성 염기 쌍형성(혼성화)을 통해 핵산 프로브에 의해 적합하게 인식될 수 있다.

다른 실시형태에서 표적은 임의의 적합한 표적 독립체, 예를 들어, 단백질/펩타이드, 약물, 지질, 다당류, 다른 소형 분자, 세포 표면 등일 수 있는 비핵산 표적일 수 있다. 이들 실시형태에서, 핵산 프로브는 바람직하게는 핵산 앱타머이다. 앱타머는 종종 높은 특이성 및 친화성으로, 거대분자 및 거대 구조에서 소형 화합물 범위의 광범위한 표적에 결합할 수 있는, 핵산 기반 모이어티의 잘 설명된 부류이다. 핵산 앱타머는 다양한 방식으로 더욱 변형될 수 있는, DNA, RNA 또는 비천연 핵산이다. 앱타머를 사용한 실질적으로 모든 공개된 실험을 목록으로 만든 앱타머 데이터베이스(http://aptamer.icmb.utexas.edu/)가 확립되어 있다.

표적이 핵산인 경우, 본질적으로 임의의 핵산일 수 있지만, 많은 경우에서, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, miRNA이다. 바람직하게는 표적 핵산은 이것이 핵산 프로브와의 혼성화를 용이하게 하므로 바이오센서에 노출 시 단일 가닥이다. miRNA의 경우, 단일 가닥 형태는 정상 상태이다. 대안적으로, 단일 가닥 형태는 핵산 프로브와의 상호작용을 용이하게 하도록 생성될 수 있다. 이는 바이오센서 내에서 제자리에서, 또는 샘플이 바이오센서에 적용되기 이전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥(듀플렉스) DNA는 가열 및/또는 적합한 화학제(예를 들어, 우레아)를 투여하여 단일 가닥(용융 또는 변성)으로 쉽게 분리시킬 수 있고, 과량의 열 및/또는 화학제의 후속 제거는 표적 핵산의 적어도 일부분과 핵산 프로브가 어닐링될 수 있게 한다. 그러나, 핵산의 혼성화의 동적 성질 관점에서, 본 발명은 표적 핵산이 바이오센서에 노출시 이중 가닥일때 전형적으로 여전히 기능할 수 있다.

사용 시 생물학적 감응성 성분은 적절한 표적을 포함하는 샘플에 노출 시, 물리적 효과, 즉 중합체의 팽윤을 가능하게 한다. 이러한 물리적 효과는 표적과 핵산 프로브 간 상호작용의 결과이다. 이후 물리전기적 변환기는 물리적 효과(물리적 신호)를 사용자가 측정할 수 있고/있거나 모니터링할 수 있는 검출 가능하고/측정 가능한 전기 지표(예를 들어, 측정 가능한 전기적 특성 예컨대, 임피던스 또는 저항성 또는 전기 신호 예컨대, 전압 또는 전류)로 변환시킨다. 바람직하게는, 검출하려는 전기적 특성은 전기 임피던스(또는 임피던스의 역수로서 정의된 어드미턴스)의 변화이고, 따라서 저항성, 전도성, 리액턴스, 서셉턴스(susceptance), 전기용량, 인덕턴스, 또는 이들의 조합의 변화를 포함할 수 있다. 전기 특성의 검출 가능한 변화의 다른 형태, 예를 들어 유전상수, 전기 유전율, 전기 투자율이 대안적으로 사용될 수 있다.

바람직하게는 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 상응하는 표적에 대한 핵산 프로브의 결합이 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤능을 증가시킬 수 있도록 적합화된다. 예를 들어, 핵산 프로브는 팽윤성 중합체 재료 중 취성(즉, 쉽게 절단가능함) 가교제의 일부를 한정할 수 있고, 가교제는 표적이 핵산 프로브에 결합될 때 절단된다.

일부 실시형태에서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 적합하게, 적어도 부분적으로 상보성인 핵산 가닥의 적어도 한 쌍을 포함하고, 각 쌍의 적어도 한 가닥은 핵산 프로브를 포함한다. 부분적으로 상보성인 핵산의 쌍은 취성 가교제를 형성하도록 혼성화될 수 있고, 취성 가교제는 쌍이 분리될 때 절단된다.

바람직하게는 취성 가교제는 핵산 프로브 가닥 및 차단제 가닥을 포함하는 부분적으로 상보성인 핵산의 적어도 한 쌍을 포함한다. 핵산 프로브 가닥 및 차단제 가닥은 그들이 어닐링할 수 있도록, 서로에 대해 부분적으로 상보성이지만, 그들이 다른 것에 대해 불완전하게 상보성이고/이거나 그들의 전체 길이의 일부분에 대해서만 완전하게 상보성인 것이 매우 바람직하다.

핵산 프로브 가닥 및 차단제 가닥은 전형적으로 취성 가교를 형성할 때(그들은 전형적으로 중합체에 도입되기 전에 어닐링됨), 또는 핵산 프로브가 표적 피분석물에 결합할 때(예를 들어, 상보성 폴리뉴클레오타이드 예컨대, miRNA) 그들이 서로 어닐링될 때까지 단일 가닥으로 존재한다.

이러한 실시형태에서, 핵산 프로브는 혼성화를 통해 핵산 표적에 결합하도록 적합화될 수 있거나, 또는 비핵산 표적에 결합하도록 적합화된 핵산 앱타머일 수 있다. 핵산 앱타머는 임의의 다른 핵산과 동일한 방식으로 상보성 가닥, 예컨대, 차단제 가닥에 결합할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 앱타머 표적의 존재에서, 표적은 앱타머에 결합을 위한 차단제와 경쟁하게 되어서, 가교제의 절단을 유발시키게 된다.

대안적인 실시형태에서 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 적합하게 중합체에 연결된 2종의 핵산 차단제 가닥 및 차단제 서열 둘 모두에 적어도 부분적으로 상보성이어서, 혼성화하여 취성 가교를 형성하는 핵산 프로브 서열을 포함한다. 전형적으로, 핵산 프로브 서열은 제1 차단제에 적어도 부분적으로 상보성인 제1 서열(전형적으로 한쪽 말단 또는 그 말단 근처), 및 제2 차단제에 적어도 부분적으로 상보성인 제2 서열(전형적으로 다른쪽 말단 또는 그 말단 근처)을 가지게 될 것이다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 핵산 프로브는 3부분의 가교를 형성하도록 중합체 내에서 앵커링된 2종 핵산 차단제 서열 사이에 브릿지를 형성한다. 이러한 경우 핵산 프로브는 역시 염기 쌍형성을 통해 표적 핵산에 결합하도록 의도된 프로브 또는 앱타머일 수 있다.

대안적인 실시형태에서 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 적합하게 핵산 앱타머 프로브 및 앱타머에 대한 상응하는 표적을 포함한다. 따라서, 취성 가교는 핵산 앱타머 및 비핵산 표적(차단 표적이라고 할 수 있음)에 의해 적합하게 형성된다. 팽윤성 중합체 재료로 적합한 표적의 통합은 많은 통상의 화학 기술을 통해 획득할 수 있고, 적절한 기술은 중합체 및 표적의 성질에 의해 명백하게 결정될 것이다. 편리하게, 표적이 중합체 재료에 통합될 때 표적에서의 결과적인 약간의 변화로 인해 표적에 대한 앱타머의 친화성의 감소가 존재할 수 있다. 친화성의 그러한 감소는 앱타머가 차단 표적과 비교하여 생물학적 샘플 중 '천연' 표적과 우선적으로 결합하는 이득을 부여한다.

앱타머(또는 확실히 임의의 다른 서열)가 단량체/중합체에 연결될 때 중합체와 결합 서열 사이에 스페이서를 포함하는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들어 표적과의 결합을 위해 앱타머에 의한 올바른 입체형태의 채택이 예를 들어 입체 방해 또는 중합체로부터 발생되는 다른 효과에 의해 방해받지 않게 된다. 스페이서는 핵산 스페이서일 수 있거나 또는 임의의 다른 적합한 스페이서 예컨대, 탄화수소 사슬, 예를 들어(CH₂)_n 사슬일 수 있고, 여기서 n은 임의의 적합한 수, 바람직하게는 1 내지 10일 수 있다. 임의의 적합한 길이의 핵산 스페이서, 바람직하게는 1 내지 20개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2 내지 10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 5개의 뉴클레오타이드의 길이가 사용될 수 있다.

따라서, 취성 가교제는 불완전하게 상보성인 핵산의 하나 또는 그 이상의 쌍을 포함할 수 있다. 이 경우에서 '불완전하게 상보성'은 취성 가교제의 2개 핵산 가닥 사이의 상보성 염기의 일치가 핵산 프로브와 이의 상보성 표적(예를 들어, miRNA 또는 다른 핵산, 또는 비핵산 표적) 사이의 상보성 염기의 일치보다 적다는 것을 의미한다. 달리 말해서, 표적에 핵산 프로브의 결합은 차단제 가닥과의 결합보다 더 강력하다(따라서 열동력학적으로 보다 호의적임). 이는 표적의 존재에서, 차단제에 대한 핵산 프로브의 결합이 열동력학적으로 비호의적이게 되고, 표적에 대한 핵산 프로브의 결합이 호의적으로 된다는 것을 의미한다. 이는 차단제보다는 표적과 핵산 프로브의 결합을 일으키게 되어 취성 가교제의 절단을 일으키게 된다.

표적이 핵산인 경우, 핵산 프로브 서열은 표적 핵산 피분석물 서열과 적합하게 높게 상보성이다. 예를 들어, 핵산 프로브 및 표적 핵산의 서열은 핵산 프로브의 실질적으로 전체 길이를 따라 적합하게 완벽하게 상보성일 수 있다. 핵산 프로브 및 차단제는 프로브의 길이의 오직 일부분(예를 들어, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 또는 40% 이하)을 따라 상보성일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 핵산 프로브 및 차단제는 부분 상보성의 그들의 공유된 영역을 따라서 하나 이상의 위치에서 불일치될 수 있다(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 불일치가 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로, 염기의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 또는 40% 이상이 부분 상보성의 영역에서 불일치될 수 있음).

예시적인 일 실시형태에서, 핵산 프로브는 10 내지 100개 뉴클레오타이드 길이(바람직하게는 10 내지 80, 보다 바람직하게는 10 내지 50, 및 보다 더 바람직하게는 10 내지 30개)일 수 있고, 길이가 8 내지 20개 뉴클레오타이드인 이의 상응하는 차단제에 대해 부분 또는 완전 상보성의 영역을 가질 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 프로브 서열은 차단제 가닥과 이의 길이의 일부를 따라서만(예를 들어, 이의 길이의 20 내지 80%, 바람직하게는 이의 길이의 40 내지 60%), 그리고 표적과 이의 길이의 상당한 비율을 따라서, 적합하게 이의 길이의 실질적으로 전부(예를 들어, 이의 길이의 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상)와 쌍을 형성하도록 한다.

핵산 프로브 및 차단제 가닥은 전형적으로 임의의 적합한 길이일 수 있는 올리고뉴클레오타이드이다. 적합하게 올리고뉴클레오타이드는 100개 또는 그 이하의 염기, 바람직하게는 50, 40, 30, 25, 20 또는 그 이하의 염기를 포함하고, 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 10 또는 그 이상의 염기를 포함하게 된다.

핵산 프로브는 천연 핵산(DNA 또는 RNA)일 필요는 없으며, 핵산 유사체/모방체 또는 변형되거나 또는 변경된 핵산의 다른 형태일 수 있음을 주의해야 한다. 필요한 모든 것은 본 발명의 핵산 프로브가 표적 핵산과 염기 쌍형성을 할 수 있는 것이다. 예를 들어, 핵산은 펩타이드 핵산(PNA), 포스포로다이아미데이트 몰폴리노 올리고(PMO)(몰폴리노라고도 알려짐), 잠김 핵산(LNA), 글리콜 핵산(GNA), 브릿지된 핵산(BNA), 또는 트레오스 핵산(TNA)일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용시 용어 '핵산 프로브'는 천연 핵산에 제한되지 않고 핵산 유사체/모방체 및 변형 또는 변경 핵산의 다른 형태를 포함한다.

균등한 DNA 또는 RNA 서열와 비교하여 감소된 전하 및/또는 소수성을 갖는 핵산 유사체/모방체를 사용하는 것이 유리할 수 있다(PNA 및/또는 몰포리노를 갖는 경우처럼). 이는 전형적으로 수성 환경에서 거짓 양성 팽윤 반응의 기회를 감소시켜서 낮은 농도의 올리고뉴클레오타이드 마커에 대한 신호 강도 및 감도를 개선시킨다. 따라서, 이러한 핵산 유사체/모방체는 본 발명의 바람직한 실시형태에 존재할 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 바이오센서는 하나 이상의 검출을 위한 핵산 프로브를 포함할 수 있다.

핵산 프로브 및 차단제(및/또는 존재한다면, 핵산 앱타머를 위한 차단 표적)은 바람직하게는 중합가능한 모이어티에 연결된다. 예를 들어, 핵산 또는 차단 표적은 팽윤성 중합체에 통합될 수 있는 단량체 모이어티에 적합하게 공유적으로 결합된다. 적합한 중합체에 이에 연결된 핵산/차단 표적을 갖는 중합가능한 모이어티의 통합은 취성 가교를 포함하는 가교된 팽윤성 중합체를 생성시킨다.

핵산에 연결된 중합가능한 모이어티는 적합하게 알켄(올레핀) 및/또는 고리 개방성기를 포함할 수 있지만, 임의의 다른 적합한 중합가능한 기를 포함할 수 있다.

핵산 및 중합가능한 모이어티의 조합은 핵산 가교 단량체라고 할 수 있고, 차단 표적 및 중합가능한 모이어티의 조합은 차단 표적 가교 단량체라고 할 수 있다. 일반 용어 가교 단량체는 내용에서 달리 명시하지 않으면 둘 모두를 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 핵산 프로브 및 차단제에 연결된 중합가능한 모이어티는 아크리다이트이다. 아크리다이트 기반 핵산 가교 단량체의 구조는 하기에 도시한다:

.

물결선은 아크리다이트 모이어티에 연결된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. C=C 이중 결합은 아크리다이트가 중합반응 동안 중합체 골격으로 쉽게 통합될 수 있게 하여서, 중합체 내의 위치에 올리고뉴클레오타이드를 앵커링시키고, 연결된 핵산이 가교되게 자유롭게 남겨둔다.

팽윤성 중합체는 바람직하게는 취성 핵산 가교 이외에도 비취성 가교를 포함한다. 예를 들어, 폴리아크릴아마이드는 당분야에 잘 알려진 바와 같이, 비스아크릴아마이드와 가교될 수 있다. 중합체가 비취성 가교를 포함하지 않으면, 취성 가교의 절단은 많은 경우에 바람직하지 않을 수 있는, 실질적으로 이의 구조적 무결성을 잃은 중합체를 생성시킬 수 있다. 취성 및 비취성 가교의 혼합물을 제공하여, 중합체의 전체적인 구조를 유지시킬 수 있지만, 중합체의 팽윤능은 취성 가교가 절단되는지 또는 그렇지 않은지 여부에 따라서 유의하게 변형될 수 있다.

사용시에, 표적이 팽윤성 생물학적 감응성 요소와 접촉하게 되면, 핵산 프로브와 우선적으로 혼성화(어닐링)되어 차단제 가닥 또는 차단 표적을 대체한다. 이는 중합체에 감소된 가교를 일으키는 취성 가교를 절단시킨다. 중합체에서 감소된 가교는 중합체가 증가된 팽윤 특성을 나타낼 수 있게 한다.

당업자는 중합체의 특성을 조율하도록 중합체에 취성 및 비취성 가교의 적절한 수준을 쉽게 선택할 수 있다. 바람직한 특성 및 필요한 가교 수준은 바이오센서의 의도하는 용도 및 사용된 중합체에 따라 좌우될 것이다. 비취성 가교의 증가된 비율은 시스템의 팽윤 용량을 감소/조율하게 될 뿐만 아니라, 수분 침투를 위한 보다 뒤틀리고/밀폐된 경로를 생성시켜 팽윤 속도를 완화시킬 수 있다. 일부 비취성 함량은 일반적으로 팽윤된 상태에서도 구조적 무결성 정도를 유지시키는 것이 선호된다. 일반적으로, 대부분의 예에서, 가교의 총량은 최대 30%, 종종 15% 이하, 전형적으로 유의하게 그 이하(예를 들어, 10% 또는 5% 미만)일 것이다. 그러나, 더 높은 수준의 가교가 일부 상황에서 바람직할 수 있다.

팽윤성 생물학적 감응성 요소는 임의의 적합한 팽윤성 중합체, 예를 들어 친수성 중합체를 포함할 수 있다. 중합체의 팽윤은 전형적으로 샘플에 존재하는 물(또는 다른 적합한, 예를 들어, 극성 용매)와 중합체의 상호작용의 결과이다. 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 표적 피분석물, 예를 들어 핵산을 포함하는 적합한 샘플에 노출 시(즉, 취성 가교제의 절단 시) 적합한(즉, 검출 가능한) 정도로 팽윤되도록 적합화되지만, 표적 피분석물(예를 들어, 핵산)이 존재하지 않을 때 팽윤되지 않거나 또는 유의하게 덜 팽윤된다.

많은 경우에서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 물(또는 다른 적합한 용매)의 존재에서 어느 정도 팽윤될 것이지만, 표적 피분석물의 부재에서는 그렇지 않을 것이다. 그러나, 임의의 이러한 팽윤은 팽윤성 생물학적 감응성 요소(예를 들어, 취성 가교제의 형태)에 존재하는 핵산 프로브에 의해 제한된다. 취성 가교제가 절단되면, 중합체의 팽윤에 대한 제한성이 감소되어서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤 용량이 증가된다. 따라서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 표적 피분석물의 존재 또는 부재에 의존적으로 적합하게 차등적으로 팽윤된다.

일부 경우에서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 팽윤성 생물학적 감응성 요소를 분석하려는 샘플과 유사하거나 또는 동일한 특성을 갖는 적합한 수성 액체에 노출시켜 사용 전에 '사전-팽윤'될 수 있고, 이러한 경우 사용 동안 중합체의 특성의 유의한 변화는 표적 피분석물의 존재에서만 일어나게 된다. 대안적으로, 바이오센서로부터 획득된 데이터는 표적 피분석물 부재에서 일어나는 임의의 배경 팽윤을 무시하도록 처리될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 팽윤은 팽윤성 생물학적 감응성 요소에 의한 샘플에 존재하는 물(또는 다른 적합한 용매)의 흡수의 결과로서 일어난다. 따라서, 분석하려는 샘플은 전형적으로 액체가 될 것이고, 일반적으로 수성일 것이다. 샘플은 적합하게 동물 유래의 생물학적 샘플이거나, 또는 그로부터 유래된 것으로서, 예를 들어 혈액, 소변, 타액, 점액, 대변, 림프액, CS, 활액 등일 수 있다. 대안적으로, 샘플은 관심 피분석물을 포함할 수 있는 임의의 다른 공급원, 예를 들어 세포 배양 배지, 환경 샘플 등일 수 있다. 샘플은 희석물, 예를 들어, 물, 염수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

친수성 중합체는 팽윤성 생물학적 감응성 요소에서 사용을 위해 특히 적합한 재료이다. 당분야에서 공지된 바와 같이, 친수성 중합체, 예컨대, 하이드로겔의 물 흡수(그에 따라 팽윤) 특성은 존재하는 가교량(때때로 가교 밀도라고 알려짐)에 의해 유의하게 결정된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 적합하게 친수성, 수팽윤성 중합체를 포함한다.

친수성 중합체는 친수성 중합체는 바람직하게는 가교된다(즉, 상기 기술된 바와 같이, 취성 핵산 가교이외에도 통상의 가교를 함유한다). 특히 가교시, 친수성 중합체는 종종 하이드로겔이라고 한다. 따라서, 본 발명의 바이오센서는 바람직하게는 하이드로겔을 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소를 포함한다.

당분야에 공지된 많은 친수성 중합체가 존재하고, 당업자는 본 발명에서 사용을 위해 적절한 친수성 중합체를 쉽게 선택할 수 있다.

일부 특히 적합하지만, 비제한적인 예로 제공을 위해서, 친수성 중합체는 폴리아크릴아마이드, 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드); 폴리(비닐 알코올); 폴리(에틸렌 글리콜); 폴리(N,N'-다이알킬 아크릴아마이드); 폴리(2-하이드록시프로필(메타)크릴레이트); 폴리(2-메톡시에틸 아크릴레이트); 및 폴리(다이(에틸렌 글리콜)메틸 에테르 메타크릴레이트) 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 이러한 중합체로 취성 핵산 가교제의 통합은 핵산에 연결된 적절한 중합가능한 모이어티를 사용하여 쉽게 획득될 수 있다.

중합체는 바람직하게는 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 포함한다. 중합체는 정상적으로 단량체(아크릴아마이드) 및 가교제(적합하게 N,N'-메틸렌-비스아크릴아마이드)를 포함한다. 중합체는 적합하게 임의 비율의 아크릴아마이드, 예를 들어 5 내지 50% w/w, 바람직하게는 7 내지 30% w/w, 전형적으로 10 내지 20% w/w, 및 일반적으로 10-15% w/w(예를 들어, 대략 15%)의 아크릴아마이드를 포함할 수 있다. 중합체 중 가교제의 농도는 최종 하이드로겔의 물리적 특징을 조율하도록 가변적일 수 있다. 중합체 중 가교제의 농도는 임의의 적합한 수준으로 존재할 수 있고, 예를 들어, 단량체에 대해서 0.05 내지 10 몰%, 바람직하게는 0.1 내지 5 몰%, 보다 더 바람직하게는 0.2 내지 2.0 몰%로 적합하게 존재할 수 있다.

중합체는 광개시제를 적합하게 포함할 수 있다. 광개시제는 적합하게 1-하이드록시사이클로헥실페닐케톤일 수 있다. 그러나, 많은 다른 광개시제가 잘 알려져 있고 다른 예는 AIBN 및 다른 아조 화합물; 벤조일 퍼옥사이드 및 다른 퍼옥사이드; 2,2-다이메톡시-2-페닐아세토페논; 및 캠포르퀴논일 수 있고, 추가의 광개시제는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)(https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Aldrich/General_Information/photoinitiators.pdf 참조)에서 입수할 수 있다. 광개시제의 농도는 임의의 적합한 농도, 예를 들어 단량체에 대해 0.05 내지 0.5 몰%, 바람직하게는 0.1 내지 0.2 몰%, 전형적으로 0.125 몰%로 존재할 수 있다. 광개시제는 전형적으로 UV 조사에 의해 중합반응이 개시될 수 있도록 제공된다.

다른 유형의 중합반응 개시제가 당 분야에 잘 알려져 있고, 광개시제의 대체물(또는 추가물)로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 라디칼 중합반응의 개시제는 퍼옥사이드, 퍼설페이트, 금속-알킬, 아조 또는 다른 관련 화합물을 포함할 수 있다. 따라서 이러한 개시제는 구체적으로 열개시제 및 리독스 개시제를 포함한다. 적합한 개시제의 예는 당분야에 잘 알려져 있다. 이러한 개시제는 임의의 적합한 농도, 예를 들어 단량체에 대해 0.05 내지 0.5 몰%, 바람직하게는 0.1 내지 0.2 몰%, 전형적으로 0.125 몰%로 존재할 수 있다. 다이아민, 예를 들어 테트라메틸에틸렌다이아민(TEMED) 존재에서, 예를 들어 퍼설페이트, 예를 들어 암모늄 퍼설페이트(APS)가 리독스 개시제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단량체에 대해 0.125 몰%가 성공적으로 사용되었다. 중합반응은 또한 선택된 단량체 및 최종 작용성에 따라서 배위-삽입, 음이온성, 양이온성, 제어 라디칼, 개환 및 다른 중합반응 기술을 포함한 다른 전략에 의해 개시될 수도 있다.

중합체는 염화나트륨 또는 다른 무기 금속 염을 적합하게 포함할 수 있다. 이는 중합체로 도입되는 DNA 또는 다른 하전된 핵산 프로브/가교제를 안정화시키는데 유용하지만, 전형적으로 몰폴리노 또는 PNA 취성 프로브/가교제가 사용될 때 필요하지 않다. 염화나트륨의 농도는 적합하게 0 내지 500mM일 수 있고, 대략 150mM이 전형적이다.

중합체는 적합하게 용매를 포함할 수 있거나, 또는 용매는 중합체의 중합반응 동안 사용될 수 있다. 구체적으로, 용매는 중합체에 전도성 입자를 균일하게 분포시키기 위한 보조제로서 사용될 수 있다. 용매는 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 인산염 완충액을 포함할 수 있다. 용매는 동일한 부피의 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 인산염 완충액을 포함할 수 있다. 인산염 완충액은 임의의 적합한 농도를 가질 수 있고, 일부 경우에서 약 1mM(밀리몰) 농도를 갖는다.

중합체는 적합하게 공중합체일 수 있다. 공중합반응은 최종 중합체의 특성의 조율을 가능하게 하므로 유용할 수 있다. 예를 들어, 적합한 공중합체는 아크릴아마이드 및 1종 이상의 추가 단량체(핵산이 연결된 단량체 이외에도)를 포함할 수 있다. 1종 이상의 추가 단량체는 친수성이거나 또는 비친수성일 수 있고, 단 공중합체는 전체로 친수성이다. 1종 이상의 추가 단량체는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 비닐 아세테이트, 스티렌, 아크릴로니트릴 및 올레핀-함유 단량체 중 1종 이상일 수 있다.

바람직하게는 중합체는 비례적으로 적어도 60 몰%(보다 바람직하게는 적어도 80% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 90 몰%) 아크릴아마이드 단량체 및 40% 이하(보다 바람직하게는 20% 이하 및 보다 더 바람직하게는 10% 이하)의 추가 단량체(들)를 포함한다.

일 특정예에서, 중합체는 아크릴아마이드 및 N-아이소프로필아크릴아마이드 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 50:50, 80:20 및 20:80 비율의 아크릴아마이드 대 N-아이소프로필아크릴아마이드를 갖는 중합체가 성공적으로 제조되었다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 올리고뉴클레오타이드 가교된 중합체 복합체(OCPC)를 포함한다.

본 발명의 물리전기적 변환기는 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 물리적 변화를 검출할 수 있는 전기 신호 또는 전기 특성으로 전환시킬 수 있다.

바람직하게는, 팽윤의 물리전기적 변환기는 이의 부피의 외부적으로 유도된 변화(예를 들어, 기계적 변형 또는 화학적 팽윤)로 인해 이의 전기 임피던스에서 변화를 나타낼 수 있는, 압전저항성 재료 또는 전기 침투성 복합체 재료("침투성 복합체"의 정의는 하기를 참조함)를 포함한다. 전기 저항성 변화가 검출하려는 특성인 경우, 이러한 변환기는 "화학 저항성"(또는 이 경우 "생물-저항성")이라고 할 수 있다. 대안적으로, 물리전기적 변환기의 다른 형태, 예를 들어 압전 재료를 포함하는 것을 사용할 수 있다.

본 출원에서 언급하는 물리전기적 변환기의 바람직한 형태는 통상 "침투성 복합체"라고 한다. 여기서, 우리는 이 용어를 하기 특성을 갖는 재료로서 정의한다:　전기 전도성이 상이한 2 이상의 별개 성분의 블렌드 포함; 보다 전도성인 성분의 유효 성분이 감소함에 따라 전기 전도성 감소를 나타냄; 및 부피 팽윤 시 전기 전도성의 감소를 나타냄.

전형적으로, 침투성 복합체는 절연성 중합체 매트릭스(이 경우 팽윤성 중합체 매트릭스) 내에 분산된, 전기 전도성 입자(예를 들어, 이하에 더욱 기술하는 바와 같이, 탄소 또는 금속 분말)를 포함한다. 전도성 입자의 낮은 충전제 적재량에서, 복합체는 전기적으로 절연성이고, 전도성(또는 저항성)은 중합체의 것에 가깝다. 전도성 입자의 농도가 증가함에 따라, 더 많은 입자가 서로 물리적으로 접촉하게 되고, 전도성은 협소한 농도 범위에서 신속하게 상승된다(소위 "침투 한계치"). 다음으로, 높은 충전제 입자 농도에서 금속의 전도성에 점근적으로 접근한다. 따라서 그러한 재료에 대한 전도성 입자 적재물에서 대략 S자형 패턴의 전도성(저항성)이 관찰된다. 중합체가 기계적으로 압축되거나 또는 화학적으로 팽윤될 때 유사한 거동 패턴이 관찰되어서, 중합체의 부피가 변화되고 그에 따라 전도성 입자의 유효 농도가 변경된다.

이들 유형의 재료는 통상적으로 "침투성 복합체'라고 한다. 이는 "침투 이론"이 먼저 이러한 거동 패턴을 설명하기 위해 처음 제안되었다는 사실에 기인한다. 그러나, 이 모델은 많은 복합체에 대해 너무 지나치게 단순하여 저농도에서 실패하는데, 이 영역에서 전도(무한 저항성)가 예측되지 않기 때문이다. 침투 모델은 또한 전도성 및 비전도성 중합체의 블렌드, 및 게다가 그들 전도성의 유한 차이를 갖는 임의의 2종 재료의 거동을 설명하는데 사용시에도 비효율적이다. "유효 매질 이론"은 전체 범위의 전도성 입자 적재량에 걸쳐 전기 거동의 보다 정확한 설명을 제공하기 위해 성공적으로 고안되었다. 그들은 또한 입자 형상 및 크기가 어떻가 침투 한계치에 영향을 미치는지 모델화하는데 사용될 수 있다. 그러나, 일부 재료는 여전히 침투 이론 또는 유효 매질 이론으로 충분히 예측되지 않는 특성을 갖고, 이론에 추가 변형을 필요로 한다. 이들은 충전제 농도에서 침투 한계치를 보이지 않지만, 압축 또는 팽윤을 통한 부피 변화에 극도의 감응성을 보이고, 복합체를 통해 전도할 수 있는 인접한 입자 간 친밀한 접촉에 의존적이지 않은(대신 입자 사이의 양자 터널에 의존) "양자 터널화 복합체"(또는 "QTC")를 포함한다.

본 문헌 전반에서(그리고 많은 문헌 전반에서), 용어 "침투성 복합체"는 침투 이론의 모델을 엄격하게 따르지 않는 많은 예들에도 불구하고 이전에 기술된 정의에 따라 이들 유형의 재료의 모든 상기 예들을 설명하는데 사용된다는 것을 주의하는 것이 중요하다.

따라서 물리전기적 변환기의 침투성 복합체는 전기 임피던스의 측정 가능한 변화로 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤의 변환 및/또는 전환을 위해 적합화된다. 본 발명에서, 침투성 복합체의 전기 저항성은 적절한 표적 피분석물(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드) 및 물(또는 다른 적합한 용매)의 존재에서 발생되는, 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤이 일어날때 변화된다. 앞서 설명한 바와 같이, 일부 팽윤이 일부 경우에서 표적 피분석물의 부재에서 발생될 수 있지만, 이는 피분석물의 존재 및/또는 양을 검출할 수 있게 하는 피분석물의 존재에서 발생되는 팽윤보다 적다.

침투성 복합체는 적합하게 전기 전도성 재료(예컨대, 금속 또는 탄소) 또는 반도체를 포함하고, 이는 바람직하게는 미립자 형태이다.

침투성 복합체 바람직하게는 팽윤성 생물학적 감응성 요소에 분포된 전도성 입자를 포함한다. 예를 들어, 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 친수성 중합체는 전도성 입자가 분포되는 매트릭스를 한정할 수 있다. 전도성 입자는 전도성 충전제 또는 전도성 충전제 입자라고 할 수 있다.

팽윤성 생물학적 감응성 요소에 분포된 전도성 입자는 팽윤성 생물학적 감응성 요소가 팽윤되어 부피가 증가됨에 따라 이동하게 될 것이라는 것을 이해하게 될 것이다. 전형적으로, 팽윤성 생물학적 감응성 요소가 팽윤하면서 전도성 입자의 포장 밀도가 감소하게 되고, 다시 말해, 각 입자 사이의 공간이 증가하게 된다. 이는 재료의 전기 저항성의 증가를 초래한다. 저항성의 이러한 변화는 예를 들어, 팽윤성 생물학적 감응성 요소에 접속된 적합한 전극의 사용에 의해 쉽게 검출될 수 있다.

고도의 전도성 미립자 재료는 팽윤 시 전기 전도성 변화를 극대화시키는 것이 바람직하다. 예를 들어 금속 또는 탄소 입자에 의해 입증되는 바와 같이, 고전도성은 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤 시 저항성 변화를 극대화하므로 바람직하다. 일반적으로, 적절한 크기의 임의의 고도의 전도성 입자가 사용될 수 있다.

침투성 복합체는 바람직하게는 전도성 입자로서 탄소 나노분말 및/또는 탄소 나노튜브를 포함한다.

많은 형태의 탄소 나노분말이 사용될 수 있다. 본 발명자는 50㎚ 이하의 평균 입자 크기를 갖는 탄소 나노분말이 대단히 적합하다는 것을 확인하였지만, 이것에 본 발명을 제한하지 않는다. 유사하게 많은 형태의 탄소 나노튜브가 사용될 수 있다. 본 발명자는 다중벽이고 외경이 대략 10㎚이며 대략 6㎛ 길이인 탄소 나노튜브가 특히 적합하다는 것을 확인하였지만, 이에 본 발명을 제한하지 않는다. 당업자는 대안적인 탄소 나노분말 또는 나노튜브 재료를 쉽게 선택할 수 있다.

침투성 복합체는 대안적으로 또는 부가적으로 카본 블랙, 니켈, 금, 은, 아연 및 구리 입자 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 다른 전기적 전도성 금속성 입자가 물론 사용될 수 있고, 전도성 중합체 입자/비드를 포함한 임의의 다른 적합한 전도성 비금속성 입자일 수 있다.

상기 전도성 미립자 재료의 2 이상의 조합을 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.

전도성 입자는 크기가 마이크로미터 이하, 예를 들어 1000㎚ 미만, 바람직하게는 500㎚ 미만, 보다 바람직하게는 100㎚ 미만인 것이 바람직하다. 이러한 입자는 대규모 프린팅 공정, 예컨대, 잉크-젯 프린팅과 그들의 보다 큰 상용성 때문에 바람직하다. 더 작은 충전자 입자는 또한 팽윤성 생물학적 감응성 요소 부피의 추가적인 최소화를 가능하게 하는(보다 신속한 반응을 가능하게 할 수 있음) 한편, 균일한 입자 분포 및 양호한 관련 전기 반복성을 유지한다.

전도성 충전제 입자의 대안으로서, 당업자는 또한 상기 언급한(절연) 중합체 재료와 블렌딩할 수 있는 고유한 전도성 중합체를 사용할 수 있다. 전도성 중합체 충전제의 예는 제한없이, 폴리(티오펜)(PT), 폴리(3,4-에틸렌다이옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(p-페닐렌 설파이드)(PPS), 폴리(아닐린)(PANI), 폴리(피롤)(PPY), 폴리(아세틸렌)(PAC), 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV), 및 이의 혼합물 및 블렌드를 포함한다.

교류(AC) 전기 임피던스 측정이 반응의 전기 측정에 이용되는 경우(보다 상세한 내용은 하기를 참조함), 충전제 입자는 팽윤에 대한 측정 가능한 반응을 최적화하도록 복합체의 유전체 특성(따라서 이의 저항성 및 복합 임피던스 둘 모두)을 조율하는데 적합하게 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 최고 감도를 갖는 영역까지 복합체의 임피던스를 낮추거나 또는 상승시키는 것이 바람직할 수 있다. 이들 예에서, 충전제 입자의 다른 전도성이 바람직할 수 있고, 반도체 분말 또는 심지어 절연 입자를 포함할 수 있다.

당업자는 상기 기재된 것들로부터 적절한 전도성 재료를 쉽게 선택할 수 있다. 또한, 당업자는 바이오센서에서 바람직한 침투 특성, 즉 표적 피분석물의 존재에서 중합체가 팽윤할 때 임피던스의 적절한 변화를 획득하도록 적절한 양으로 전도성 재료를 제공할 수 있다. 경우에 따라 다양할 수 있으므로 전도성 입자에 대한 팽윤성 중합체의 상대적 비율에 대해 결합 일반 규칙을 제공하는 것은 가능하지 않거나 또는 필수적이지 않다. 그러나, 임의의 소정 시스템을 최적화하는 것은 당업자에게 단순한 일이다.

전도성 입자의 비율은 팽윤 이전에, 복합체가 침투 한계치 이상이어서 최대 전도성 상태이도록 하는 것이 바람직하다. 다음으로, 팽윤이 발생된 후, 복합체는 비침투성이 되고 최소 전도성 상태이게 될 것이다. 이러한 '침투 한계치'에 가까운 값에서 전도성 분자의 적재에 의해, 센서의 감도가 극대화된다(침투 곡선은 S자형 형상을 가지므로, 저항성은 침투 한계치에서 매우 가파르게 변화됨).

그러나, 일부 경우에서, 용매 단독(즉, 표적 피분석물 부재)에서 초기(거짓 양성) 팽윤이 저항성에 최소 효과를 갖도록, 침투 한계치에서 약간 더 멀리 있는 초기 상태를 갖도록 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 표적 피분석물 존재에서 추가적으로 촉발된 팽윤, 및 최종적인 가교제 절단은, 검출을 위해 침투 한계치 이상으로 복합체를 밀어낸다.

모든 경우에서, 센서는 표적 피분석물 노출 직전 침투의 어느 정도 위의 충전제 부피 분율이어야 한다. 노출되면 복합체를 팽윤시켜서, 부피 분율이 침투 한계치 이하의 값으로 변화된다.

침투 한계치 농도는 문헌으로 충분히 이해되며, 입자 크기, 형상 및 종횡비에 의해 결정된다.

따라서 침투 한계치는 팽윤(즉, 부피의 증가)으로 일어나는 저항성의 변화를 본질적으로 증폭시키는 편리한 기전을 제공한다. 본 발명의 바이오센서는 핵산 가교제의 절단 시 중합체의 팽윤이 침투 한계치 이내 또는 그에 걸쳐서(또는 적어도 일부분에 걸쳐서) 전도성 미립자 재료의 부피 분율의 변화를 일으키도록 적합하게 적합화된다. 적도성 미립자 재료 및 중합체의 임의 조합에 대한 침투 한계치는 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명의 바이오센서는 전형적으로 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤 결과로서 바이오센서의 전기 특성의 변화 또는 전기적 신호의 검출 및/또는 측정을 가능하도록 적합한 전극을 포함하는 기재(substrate)를 포함한다.

임의의 적합한 전극 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명자는 깍지형 전극(IDE)이 특히 적합한 것을 확인하였다. 전극은 규소 기판, 예를 들어 규소 웨이퍼 상에 제공될 수 있다. 이러한 전극의 제작은 표준 포토리소그라피 절차, 즉 규소 기판 상에 금속성 전극의 패턴화를 사용해 수행할 수 있다.

본 발명의 예시적인 일 실시형태에서, 전극은 이산화규소(SiO₂) 기재 상에 제작된 플래티늄 IDE를 포함한다. 예를 들어, 티타늄으로 형성된 부착층은 또한 SiO₂에 플래티늄의 부착을 보조하는데 사용될 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 금 전극은 유리 기재 상에 패턴화될 수 있다. 많은 다른 적합한 전극 시스템이 사용될 수 있고, 일반적으로 전도성 패턴화 전극을 갖는 임의의 절연 재료가 적합하다는 것이 분명해질 것이다. 많은 용도에서, 전극은 일회용이고 저비용이며, 프린팅된 금속, 탄소 또는 전도성 잉크 전극으로 패턴화된, 아마도 플라스틱 또는 종이 기재로 이루어지는 것이 바람직할 수 있고, 이러한 전극은 이미 당분야에 공지되어 있다.

적합하게 전극의 활성 영역은 팽윤성 생물학적 감응성 요소(예를 들어, OCPC)로 완벽하게 덮인다.

일부 실시형태에서, 기재는 팽윤성 생물학적 감응성 요소가 기재 및/또는 전극에 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 부착을 강화시키는 작용제로 증착되는 영역에 적어도 부분적으로 표면 변형된다. 기재는 적합하게, 예를 들어 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트로 실란화될 수 있다. 실란화는 유리 또는 규소 기판이 사용될 때 특히 유용하다.

적합하게 본 발명의 바이오센서는 단일 용도 아이템이다.

본 발명의 제2 양상에 따르면, 기재 상의 본 발명에 따른 바이오센서의 어레이를 제공한다. 다수의 감지 작동의 수행이 단일 어레이 상에서 동시에 수행될 수 있게 한다.

어레이의 바이오센서는 다수의 표적 피분석물을 검출하도록 구성될 수 있고/있거나 동일한 표적에 대한 1회 이상의 동시 검출(즉, 다수 복제물)을 수행하도록 구성될 수 있다. 몇몇 상이한 표적의 검출은 다수 표적을 효율적으로 검출하는데 특히 바람직하고, 다수 복제물은 통계적 유의성/신뢰성을 증가시키거나 또는 노이즈를 제거하는데 바람직할 수 있다.

다수 복제물은 또한 표적 농도에 대한 정량적 정보를 획득하는데 사용될 수 있다. 이는 몇몇 상이한 센서 간 가교 밀도를 가변화시키지만, 각각 동일 프로브를 사용하여 획득된다. 이러한 센서군의 차등적인 반응 규모 및 차등적인 일시적 반응은 이후에 표적 종의 상대적 풍부함에 대해 정량적 정보를 획득할 수 있게 한다.

각각 단일 특이적 표적에 대해 상이한 정도의 표적-프로브 중첩/일치도를 갖는 다수 센서가 또한 감도를 개선시키는데 적용될 수 있다. 이는 보다 에너지적으로 호의적인 상태가 표적에 대한 프로브 결합에 의해 일어나지만, 프로브 및 표적이 여전히 100% 일치하지 않는 감지 사건으로부터 거짓 양성 반응의 예를 식별하고 무시하는데 도움을 준다.

적합하게 어레이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 바이오센서를 포함한다. 그러나, 어레이 상에 제공될 수 있는 바이오센서의 수에 효과적으로 한계가 존재하지 않으며, 따라서 어레이는 적합하게 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 또는 500개 이상의 바이오센서를 포함할 수 있다. 잠재적으로 어레이는 임상 또는 연구 중요성의 miRNA의 소형 또는 대형 패널을 검출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 어레이는 특정 질환(즉, 진단을 위함) 또는 질환 상태(즉, 계층화 또는 치료 모니터링을 위함)의 지표인, 몇몇 miRNA를 포함할 수 있다. 대안적으로, 어레이는 다수 질환의 복합 스크리닝을 위해, 훨씬 더 광범위한 miRNA를 포함할 수 있다.

기재는 적합하게 바이오센서 각각과 상호작용하도록 적합한 전극을 포함한다.

제3 양상에서, 본 발명은 바이오센서로부터 전기 지표를 검출 및/또는 정량하도록 적합화된 측정 장비에 접속된 본 발명의 제1 또는 제2 양상에 따른 바이오센서 또는 어레이를 포함하는 바이오센서 장치를 제공한다.

측정 장비는 바이오센서로부터 임피던스(예를 들어, 옴미터 사용) 또는 전기 신호, 전형적으로 전압(예를 들어, 전압계를 사용)의 변화를 측정하도록 적합화될 수 있다. 적합한 민감한 계량 장비는 당분야에 충분히 공지되어 있다.

바이오센서 장치는 분석하려는 샘플을 수용하는 샘플 수용 용기를 적합하게 포함할 수 있다. 바이오센서 또는 어레이는 용기 중 샘플에 노출되도록 적합화된다.

본 발명의 제4 양상에 따르면, 샘플 중 표적의 존재 또는 양을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은,

a) 본 발명의 제1 양상에 따른 바이오센서 또는 본 발명의 제2 양상에 따른 어레이를 제공하는 단계;

b) 바이오센서를 샘플에 노출시키는 단계;

c) 샘플에 노출의 결과로서 바이오센서의 전기적 특성의 전기 신호 또는 변화를 관찰하는 단계;

d) 경우에 따라 상기 변화의 규모를 결정하는 단계; 및/또는

e) 경우에 따라 상기 변화의 속도를 결정하는 단계; 및

f) 상기 결정으로부터 상기 샘플 중 상기 표적의 존재 및/또는 양을 결정하는 단계를 포함한다.

표적은 앱타머 프로브가 사용될 때 핵산 또는 임의의 다른 적합한 표적일 수 있다.

바람직하게는 상기 방법은 생물학적 샘플 중 표적(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 예컨대, miRNA)의 검출을 위한 것이다. 그러나, 상기 방법은 표적이 존재할 수 있는 임의의 적합한 샘플에 적용될 수 있다. 바람직하게는 샘플은 수성이다.

상기 방법은 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계를 포함할 수 있거나, 또는 사전 획득된 샘플에 대해 수행될 수 있다.

바람직하게는 샘플이 대상체로부터 획득되는 경우, 대상체는 포유동물이고, 보다 바람직하게는 대상체는 인간이다.

적합하게, 상기 방법은 샘플 중 1종 이상의 표적 피분석물의 검출을 위한 것이다. 예를 들어, 다수의 핵산(예를 들어, miRNA)은 단일 방법으로 검출될 수 있고, 다수의 비핵산이 검출될 수 있거나, 또는 핵산 및 비핵산의 조합이 검출될 수 있다. 이는 전형적으로 상이한 표적을 검출하도록 적합화된 다수의 바이오센서의 사용을 필요로 한다.

상기 방법은 적합하게 진단 방법이고, 의학 상태를 진단하고/하거나 대상체에 적절한 요법을 선택하는 것을 보조하는데 사용될 수 있다.

대안적으로, 상기 방법은 치료제에 대한 반응 또는 회복을 모니터링하기 위해 사용된다.

본 발명의 제5 양상에서, 바이오센서를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은

a) 핵산 프로브를 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소를 제조하는 단계; 및

b) 물리전기적 변환기를 팽윤성 생물학적 감응성 요소와 연합시키는 단계를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 팽윤성 중합체, 적합하게 친수성 중합체, 예를 들어 하이드로겔을 포함한다. 특히 바람직한 중합체 및 공중합체, 및 그들 형성을 위한 연합 단량체는 상기에 기재되어 있다. 따라서, 상기 방법은 적합하게 팽윤성 중합체를 형성하도록 적합한 단량체(예를 들어, 아크릴아마이드 단량체)를 제공하는 단계 및 중합성 팽윤성 생물학적 감응성 요소를 형성하도록 상기 단량체를 중합반응시키는 단계를 포함한다.

상기 방법은 바람직하게는 핵산 가교 단량체를 제공하는 단계 및 상기 핵산 가교 단량체를 중합체에 통합시키는 단계를 포함한다. 적합하게 핵산 가교 단량체는 아크리다이트에 연결된 핵산을 포함한다. 바람직하게는 상기 방법은 팽윤성 중합체에 도입 전에 상응하는 핵산 가교 단량체를 어닐링하는 단계를 포함한다. 적합한 핵산 가교 단량체는 상기에 기술되어 있고, 다른 것은 당업자에게 자명해질 것이다.

적합하게, 상기 방법은 비취성 가교제를 제공하는 단계 및 상기 비취성 가교제를 중합체에 통합시키는 단계를 포함한다. 적합한 비취성 가교제는 당분야에 충분히 공지되어 있고, 일부는 상기에 기술하는 한편 다른 것들은 당업자에게 자명해질 것이다.

따라서, 상기 방법은 팽윤성 중합체 매트릭스를 형성하도록 적합한 단량체(예를 들어, 아크릴아마이드 단량체)를 제공하는 단계, 핵산 가교 단량체를 제공하는 단계, 경우에 따라 비취성 가교제를 제공하는 단계, 단량체 및 경우에 따라 취성 가교제가 중합반응하여, 취성 핵산 가교를 포함하는 팽윤성 중합체를 형성시키는 단계를 포함한다.

단량체의 중합반응은 적합하게 중합반응 개시제를 제공하는 단계 및 적합한 조건, 예를 들어 광개시, 열개시 등을 적용하여 중합반응을 개시하는 단계에 의해 획득될 수 있다. 적합한 개시제는 당분야에 충분히 공지되어 있고, 예는 상기에 기술되어 있다.

바람직하게는 상기 방법은 전기적 전도성 입자를 제공하는 단계 및 상기 전기적 전도성 입자를 팽윤성 생물학적 감응성 요소에 분포시켜, 바람직하게는 침투성 복합체를 형성시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 전기적 전도성 입자는 팽윤성 중합체를 형성하도록 단량체의 중합반응 이전에 단량체와 적합하게 혼합된다. 침투성 복합체 재료의 바람직한 특성처럼, 적합한 전도성 입자는 상기에 기술되어 있다.

따라서, 상기 방법은, 적합하게,

- 팽윤성 중합체를 형성하도록 적합한 단량체를 제공하는 단계,

- 핵산 가교 단량체를 제공하는 단계,

- 전기적 전도성 입자를 제공하는 단계,

- 경우에 따라 비취성 가교제를 제공하는 단계,

- 상기 언급된 것을 함께 혼합하는 단계, 및

- 단량체, 및 경우에 따라 비취성 가교제가 중합반응하도록 하여, 연합된 물리전기적 변환기를 구비한 취성 핵산 가교를 포함하는 팽윤성 중합체를 형성시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 침투성 복합체를 생성시킨다.

적합하게, 상기 방법은 전극을 포함하는 기재를 제공하는 단계, 상기 기재 상의 전극을 팽윤성 생물학적 감응성 요소 및 연합된 물리전기적 변환기로 피복시키는 단계를 포함한다. 적합하게, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 중합체이고, 상기 방법은 적합한 단량체, 및 경우에 따라 가교제를 중합반응시켜 기재 상에서 제자리에서 중합체를 형성시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 제1 양상의 선택적인 특징은 본 발명의 제2, 제3, 제4 및 제5 양상에 도입될 수 있고 그 반대도 가능하다.

본 발명의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 오직 예시를 통해서 설명한다:
- 도 1은 본 발명의 양상에 따른 바이오센서의 개략도;
- 도 2는 제작된 미세전극 칩의 영상;
- 도 3은 전극의 제작 단계의 개략도;
- 도 4는 올리고뉴클레오타이드 작용화된 하이드로겔의 팽윤 반응의 개략도;
- 도 5는 회로도의 개략도;
- 도 6은 충전제의 부피 분율이 변함에 따라서 어떻게 전도도(즉, 1/저항성)가 변하는지의 그래프(즉, 미립자 복합체에 대한 침투 한계치를 보여줌);
- 도 7은 OCPC의 저항성의 그래프;
- 도 8은 아크릴아마이드(AAm) 단량체를 함유하는 OCPC 및 N-아이소프로필아크릴아마이드(NIPAAm)와 AAm의 50/50 공중합체에서 팽윤의 비교를 나타낸 도면;
- 도 9는 앱타머 취성 가교를 함유하는 OCPC의 개략도이다. DNA 앱타머는 아데노신에 결합한다. 도면의 위 및 아래 패널에 표시한 바와 같이, 2가지 접근법을 사용하였다;
- 도 10은 앱타머를 함유하는 OCPC의 팽윤을 보여주는 그래프이다. 그래프는 접근법 2에 따른, 즉 서열번호 12 및 서열번호 11을 함유하는 앱타머 OCPC를 보여준다. 시험 피분석물은 1mM PBS 및 300mM NaCl 중 2mM 아데노신이다. 완충액은 1mM PBS 및 300mM NaCl이다;
- 도 11은 DNA-기반 취성 가교제와 비교한 다양한 방식(에틸-연결 및 펜틸-연결)으로 중합체 골격에 연결된 몰폴리노-기반 취성 가교제를 함유하는 OCPC의 팽윤 결과를 보여주는 그래프;
- 도 12는 DNA 센서 및 차단제 가닥, 및 몰폴리노 센서 가닥 및 DNA 차단제 가닥을 함유하는 하이브리드와 비교한 몰폴리노 함유 OCPC의 염 민감도를 보여주는 그래프; 및
- 도 13은 DMSO의 사용없이 생성된 OCPC의 저항성의 그래프를 보여준다.

예시적인 바이오센서의 구조 및 제조를 하기에 설명한다.

전극

바이오센서는 깍지형 전극(IDE)을 포함한다. 전극의 제작은 이하에 기술하는 바와 같이, 규소 기판 상에 금속성 전극을 패턴화하는, 표준 포토리소그라피 절차를 사용해 수행된다. 도 1은 전극(10)의 개략도이다. 전극(10)은 전극 칩이라고 할 수도 있다. 영역(12)은 플래티늄(Pt)이고, 영역(14)은 이산화규소(SiO₂)이다. 원형 영역(16)은 깍지형 전극(18)을 나타낸다. 총 30개의 핑거부가 존재한다(분명함을 위해 모두 도시하지 않음).

도 2는 규소 기판(214) 상에 제작된 미세전극 칩(210)을 보여준다. 또한 올리고뉴클레오타이드 가교된 중합체 복합체(OCPC)(211)가 침착된 칩(210a)이 도시되어 있다. 크기 비교를 위해 5 펜스 동전(220)을 도시하였다.

전극(310)의 제작 단계는 도 3에 도시한다. 관련 제작 기술은 당분야에 잘 알려져 있다. 사용된 전극(310)은 이산화규소(SiO₂) 상에 제작된 플래티늄(Pt) IDE였다. 칩은 IDE가 OCPC의 액적으로 완전히 덮히고 이와 같이 IDE 어레이는 1.5 ×1.46 mm에 걸치도록 디자인되었다. 각각 너비가 10㎛이고 40㎛씩 이격된 총 30개 핑거부가 IDE에 존재한다(도 1에 도시된 바와 같음).

전극(310)은 100 mm 규소 웨이퍼(340) 상에 제작되었다. 이들은 대략 500㎚의 SiO₂ 층(342)을 생성시키기 위해 40분 동안 1100℃에서 습식 산화로를 통해 넣었다. 이후 웨이퍼(340)는 표면으로부터 임의의 미량의 수분을 제거하기 위해 1시간 동안 배럴-애쉬에 넣었다(30분은 성공적으로 사용되었던 다른 적합한 시간 기간임).

절연성 SiO₂ 층(342)이 규소 웨이퍼(340) 상에서 성장한 후, 포토레지스트의 층(344)이 침착된다. 다음으로 웨이퍼는 포토리소그라피 마스크(348)를 통해 UV 광(346)에 노광된다. 이후 포토레지스트(344)를 현상시키고 티타늄(350)을 웨이퍼 상에서 증발시킨다. 플래티늄(352)을 이후 웨이퍼 상에서 증발시키고 리프트 오프 공정을 수행하여 바람직한 패턴(360)만을 남겨둔다.

포토레지스트의 침착 이전에 웨이퍼는 SiO₂의 표면에 포토레지스트의 부착을 개선시키기 위해 대략 10분 동안 헥사다이메틸실록산(HMDS)으로 프라이밍된다. 사용된 포토레지스트는 AZNLof 2070-3.5였고, 이는 5초 동안 700 분당 회전수(rpm) 이후 45초간 3000 rpm의 스핀 프로파일과 1000 rpm/s의 가속으로 폴로스(Polos) 스피너를 사용해 대략 3.5㎛ 두께로 침착되었다. 포토레지스트의 침착 후 임의의 잔류 용매를 제거하기 위해 5분간 100℃에서 핫플레이트 상에서 소프트 베이킹하였다.

포토레지스트 코팅된 웨이퍼를 이후 칼 서스(Karl Suss) 마스크 얼라이너를 사용해 자외선(UV) 조사에 노출시켰고 30초간 상기 언급된 마스크를 강성 접촉 하에 두었다(도 3 - C). 노출후 웨이퍼를 115℃에서 1분간 리버스 베이킹을 위해 핫플레이트로 옮겼다. 다음으로 웨이퍼는 추가 분 동안 현상제의 신선한 뱃치로 옮기기 전에, 1분간 AZ726 현상제 용액에 위치시켰다(도 3 - D).

다음으로, e-빔 증발기를 사용해 웨이퍼 상에 금속을 침착시켰다. 티타늄(Ti)을 부착층으로 작용하도록 10㎚의 두께(도 3 - E)로 침착시켰고 Pt는 100㎚의 두께로 침착시켰다(도 3 - F)(50㎚는 성공적으로 사용된 침착층의 다른 두께임). 이후 리프트 오프 공정을 추가 시간 동안 NMR 1150의 신선한 뱃치로 옮기기 전에(다시 50℃), 1시간 동안 50℃에서 NMR 1150에 웨이퍼를 침지시켜 수행하였다(도 3 - G). 다음으로 웨이퍼를 탈이온(DI)수로 세정하기 전에 15 내지 20분간 아이소프로필 알코올(IPA)에 침지시켰다. 리프트 오프 단계 후, 웨이퍼를 이후 개별 칩으로 잘랐다.

팽윤됨에 따라 전극 표면에 OCPC의 부착을 개선시키기 위해서, 전극은 기재에 중합체를 화학적으로 결합시키기 위해 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트로 실란화시켰다. 이를 획득하기 위해서, 전극은 15분간 0.01M 염산(HCl)에 침지시켜서 SiO₂ 기재를 개시시켰다. 다음으로, 그들을 제거하고 ID수로 세정하고 건조되도록 하였다. 이후, 전극은 1시간 동안 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트의 0.02M 용액에 침지시켰다. 그들을 제거한 후, DI수로 세정하고 건조되도록 하였다. 이러한 공정을 수행한 후, 기재의 표면에 이제 결합된 메타크릴레이트 기는 중합 반응에 참여하게 되어, 기재 표면에 중합체를 공유 결합시키게 된다.

OCPC 침착 및 중합반응

깍지형 전극(IDE) 상에 OCPC를 침착시키고/시키거나 최종 혼합물을 중합반응시키기 위해서, 2 내지 5 ㎕의 적은 부피의 OCPC 용액을 IDE 상에 파이펫팅하여서 용액이 완전하게 전극을 덮도록 하였다. 다음으로, 용액을 다이맥스 블루웨이브(Dymax Bluewave) 75 UV 공급원을 사용해 60초 동안 UV 조사에 노출시킨다. 최종 자유 라디칼 중합반응은 IDE를 덮은 OCPC를 생성시키게 될 것이다.

OCPC 침착은 마이크로파이펫을 사용해 수동으로 수행하였다. 그러나, 소량(예를 들어, 나노리터(nL))을 침착시킬 수 있는, 로봇식 시린지 분배 기술을 사용해 쉽게 자동화시킬 수 있다. 액체 또는 중합체 기반 침착 기술이 또한 사용될 수 있다. 이들 기술은 제한없이, 잉크-젯 프린팅, 스크린 프린닝, 및 롤투롤 프린팅을 포함한다.

전극 크기, 간격, 패턴 및 배향과 같은 변수는 전극 특성을 최적화시키기 위해 가변적일 수 있다. 이는 예를 들어 신호 대 노이즈 비율의 개선을 통해 전기 측정을 개선시킬 수 있다. 예상되는 IDE 변형의 유형의 특정 예는 다음을 포함한다:

■ 보다 작은 복합체 액적을 사용할 수 있게 IDE의 크기의 감소(보다 신속한 반응 시간 및/또는 전기 신호 대 노이즈 비율의 개선을 가능케 함).

■ 단일 칩 상의 다수 센서를 위한, IDE의 패턴화된 어레이의 생성.

■ 패시베이션층, 보다 복잡한 기하학 또는 온칩 미세유동성 전달을 포함하도록 칩 디자인의 변형.

■ 칩 제작을 위한 대안적인 저비용 및 일회용 재료, 예를 들어 종이, 플라스틱.

■ 전도성 잉크의 스크린-프린팅 전극(예를 들어, 탄소), 롤투롤 및/또는 잉크-젯 프린팅.

중합체

사용되는 기본 중합체는 단량체(아크릴아마이드, 15 중량%) 및 표준 가교제(N,N'-메틸렌-비스아크릴아마이드)로 이루어진, 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이었고, 필요하다면 최종 하이드로겔의 물리적 특징을 조율하도록 농도를 가변화시킬 수 있다(전형적으로 단량체에 대해 0.2 내지 2.0 몰%의 단량체 범위). 여기에 광개시제(1-하이드록시사이클로헥실페닐케톤) 및 염화나트륨(NaCl, 150mM)을 첨가하였다. 광개시제는 중합반응이 UV 조사에 의해 개시될 수 있게 제공되고 NaCl은 중합체에 도입되는 임의의 올리고뉴클레오타이드를 안정화시키게 된다. 하이드로겔에 사용된 용매는 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 1mM 인산염 완충액의 동일한 혼합물일 수 있다. 이들 하이드로겔을 제조하기 위한 정확한 방법은 사용된 전도성 성분에 따라서 다양하다(이 방법은 [1]로부터 적합화시킴). 추가의 실험 작업에서, DMSO는 부정적인 효과없이 방법론에서 생략될 수 있다는 것이 확인되었고, 게다가 DMSO의 생략은 표준 접근법이 되었다(도 13은 본 명세서에 기술된 방법을 반복하였지만, DMSO의 사용은 하지 않은 실험의 그래프를 도시함). 그러나, 일부 경우에서 분산의 보조제로서 작용하는 용매가 유리할 수 있다.

그러나, 올리고뉴클레오타이드 가교된 하이드로겔은 제한없이, 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드); 폴리(비닐 알코올); 폴리(에틸렌 글리콜); 폴리(N,N'-다이알킬 아크릴아마이드), 폴리(2-하이드록시프로필(메타)크릴레이트), 폴리(2-메톡시에틸 아크릴레이트) 및 폴리(다이(에틸렌 글리콜)메틸 에테르 메타크릴레이트)를 포함하는, 임의의 친수성 중합체로 구성될 수 있다.

각 예에서, 하이드로겔은 제2 단량체와 주요 단량체의 공중합반응을 통해 더욱 조율될 수 있다. 이러한 단량체는 반드시 친수성일 필요는 없고 상기 언급된 중합체를 형성하는 단량체뿐만 아니라 임의의 다른 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 비닐 아세테이트, 스티렌, 아크릴로니트릴 및 다른 이러한 올레핀-함유 단량체를 포함할 수 있다. 재료의 조성은 일반적으로 이러한 제2 단량체의 보다 작은 분율을 함유하게 된다(10% 미만).

전도성 충전제

침투성 복합체가 탄소 나노분말을 포함하는 경우, 이러한 프리-겔 혼합물은 희망하는 질량의 탄소 나노분말에 첨가되고, 나노분말은 12분 15초 동안 박동식 방식(10초 켬, 15초 꺼짐)으로 60% 진폭으로 설정된 500 W 초음파 프로브를 사용해 고출력 초음파 처리에 의해 용액 내에 분산시킨다. 이러한 초음파 처리는 간접적으로 일어나며, 초음파기를 사용하여 수조를 초음파 처리하고 복합체 혼합물을 프로브 팁에 가깝게 그 수조 내에 위치시킨다는 것을 의미한다. 성공적으로 수행된 다른 예에서, 샘플은 저출력 초음파처리 수조에 현탁시켰다. 또 다른 성공적인 예에서, 샘플은 5분간 손으로 간단히 교반시켰다.

침투성 복합체가 탄소 나노튜브를 포함하는 경우, 탄소 나노튜브는 적합하게 다중 벽이 있는 10㎚ × 6㎛이다. 희망하는 무게, 전형적으로 2 mg/mL, 및 잠재적으로 더 적은 나노튜브를 저출력 초음파 처리를 통해 DMSO 및 1mM 인산염 완충액의 동일 혼합물에 분산시킨다. 혼합물은 8 내지 24시간 동안 초음파욕에서 초음파 처리된다(약 12W). 분산을 보조하기 위해 계면활성제(나트륨 도데실벤젠설포네이트)를 탄소 중량의 10배로 첨가하였다(참조문헌 [2]로부터 적합화시킨 방법). 초음파 처리 후, 나노튜브 현탁물을 단량체, 가교제, 광개시제 및 NaCl의 필요한 질량의 건조 혼합물에 첨가하여 원하는 농도의 프리-겔/나노튜브 현탁물 용액을 만들었다.

학술 문헌은 부피 변화와 전기 저항성 변화의 유사한 특성을 갖는 침투성 복합체(즉, 압전저항성 복합체)를 제조하기 위해, 절연 중합체와 조합된, 다른 전도성 충전제 분말의 사용에 관한 수많은 예들을 제공한다. 쉽게 도입시킬 수 있는(바람직하다면), 통상의 참조 예는 카본 블랙, 니켈, 금, 은, 아연, 구리 등을 포함한다. 고도의 전도성 충전제는 팽윤 시 저항성 변화를 극대화시키는 것이 바람직하다. 대부분의 문헌은 이전에 그들의 저 비용 및 구매 용이성 때문에 미세 크기 분말에 집중하였다. 그러나, 향후 저비용 센서를 위해 나노크기 분말이 대규모 프린팅 공정, 예컨대, 잉크-젯 프린팅과 그들의 더 큰 상용성 때문에 바람직하다. 소형 충전제 입자는 균일한 입자 분포 및 양호한 연관 전기 반복성을 유지하면서 또한 센서 부피(보다 신속한 반응을 위함)의 추가 소형화를 가능하게 한다.

금속성 충전제 입자의 대안으로서, 상기 언급한 절연(센싱) 중합체 재료와 블렌딩할 수 있는, 본질적으로 전도성인 중합체를 또한 사용할 수 있다. 전도성 중합체 충전제의 예는 제한없이, 폴리(티오펜)(PT), 폴리(3,4-에틸렌다이옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(p-페닐렌 설파이드)(PPS), 폴리(아닐린)(PANI), 폴리(피롤)(PPY), 폴리(아세틸렌)(PAC), 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV), 및 이의 혼합물 및 블렌드를 포함한다.

교류(AC) 전기 임피던스 측정이 반응의 전기 측정에 이용되는 예에서(상세한 사항은 이하를 참조), 충전제 입자는 팽윤에 대한 측정 가능한 반응을 최적화하기 위해 복합체의 유전체 특성(및 따라서 이의 저항성 및 복합 임피던스 둘 모두)을 조율하는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 최고 감도의 영역에 복합체의 임피던스를 낮추거나 또는 상승시키는 것이 바람직할 수 있다. 이들 예에서, 충전제 입자의 다른 전도성이 바람직할 수 있고, 반도체 분말, 또는 심지어 절연성 입자를 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오타이드 가교제

하이드로겔은 취성, 올리고뉴클레오타이드-기반 가교제의 첨가에 의해 작용화시켰다. 이들 가교제는 2종의 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 각각은 중합 반응에 참여하는 아크릴아마이드 유도체인 중합가능한 화학 변형제, 아크리다이트(도 4)로 그들 5' 말단이 종결되어서, 하이드로겔 네트워크에 올리고뉴클레오타이드가 앵커링된다. 올리고뉴클레오타이드는 그들이 혼성화하여 가교를 형성하게 되도록 서로 부분적으로 상보성이도록 디자인되었고, 그들 말단에 아크리다이트 분자가 제공되었다(도 4). 2개의 가교 가닥 중 하나에 완벽하게 상보성인 뉴클레오타이드 가닥의 도입 시, 이 가닥은 우선적으로 이의 일치하는 가닥과 혼성화하게 되어서, 가교를 파괴한다. 이러한 과정은 하이드로겔의 팽윤 특징에 영향을 주게 되는 가교 밀도의 변화를 야기한다. 이러한 팽윤의 변화는 최종 복합체의 전기 특성의 분석에 의해 변환될 수 있다.

가교제 및 표적 및 대조군 서열로서 사용을 위한 모든 작용화된 올리고뉴클레오타이드 서열은 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)로부터 공급받았다. 올리고뉴클레오타이드 표적은 miRNA mir-92a의 DNA 유사체이도록 디자인되었다. 이는 백혈병에 대해 확인된 생물마커로서 이의 연관성때문에 선택되었지만, 임의의 서열 또는 miRNA가 선택될 수 있다. "센서 가닥"이라고도 하는 프로브 가닥은 표적 서열에 정확하게 상보성이도록 디자인되었다. 주문제작한 매트랩(MatLab) 알고리즘을 사용하여, 도 4에 도시된 바와 같이, 차단제 서열은 처음 10개 염기(5' 말단부터)는 무작위 서열을 갖고 나머지 12개 염기는 센서 가닥의 마지막 12개 염기와 완벽하게 상보성이도록 디자인되었다. 무작위 서열은 대조군으로 작용하도록 디자인되었다. 상기 기술된 모든 핵산 가닥의 서열은 하기 표 1에 표시하였다. "Acr"은 아크리다이트 모이어티를 의미한다.

가닥	서열(5' - 3')
센서	Acr-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA(서열번호 1)
차단제	Acr-TAGTGCGTTTTATTGCACTTGT(서열번호 2)
표적	TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT(서열번호 3)
무작위 대조군	ACGTCTAGACGTAACGAAGGTC(서열번호 4)

올리고뉴클레오타이드 가교제를 중합체 복합체에 도입시키기 위해서, 프로브 및 차단제 작용화된 올리고뉴클레오타이드는 건조된 작용화된 올리고뉴클레오타이드가 남게, 표준 에탄올 침전법을 사용해 용액으로 추출하기 전에 희망하는 농도로 1mM 인산염 완충액에서 함께 혼합하였다(그리고 적합하게 95℃로 2분간 가열한 후 실온으로 냉각시킴). 이를 위해서, 적절한 부피의 프리-겔 용액/나노입자 현탁물을 첨가하였고 대략 3시간 동안 올리고뉴클레오타이드가 완전하게 용해되고 혼성화되도록 두었다(탄소 나노분말의 경우, 최종 혼합물은 전형적으로 3시간 동안 현탁물로부터 빠져나오게 되는 나노분말을 재현탁시키기 위해 이전에 기술한 바와 동일한 방법을 사용해 진탕시키거나 또는 초음파 처리하였음).

최종 복합체 하이드로겔은 광 유도 제자리 발생 라디칼에 의해 개시된 라디칼 중합반응으로 제조된다. 이러한 라디칼 중합반응은 또한 퍼옥사이드, 금속-알킬, 아조 또는 다른 관련 화합물로부터 열 또는 광 유도 라디칼 형성으로 개시될 수 있다. 대안적으로, 하이드로겔은 선택된 최종 단량체 및 말단-작용성에 따라서 배위-삽입, 음이온성, 양이온성, 제어 라디칼, 개환 및 다른 중합반응 기술을 포함하는 다른 전략에 의해 형성될 수 있다.

도 4는 표적 핵산의 도입 시 올리고뉴클레오타이드 가교된 하이드로겔의 팽윤 반응을 보여준다. 확인할 수 있는 바와 같이, 프로브(센싱) 가닥(472) 및 차단 가닥(474)은 부분적으로 상보성인 올리고뉴클레오타이드 가교를 형성한다. 표적 핵산(476)의 도입시, 가교는 표적 핵산(476)이 센싱 가닥(472)과 우선적으로 혼성화함에 따라 절단된다. 이는 중합체의 가교 밀도가 감소되도록 유발하여서, 중합체(478)를 팽윤(480)시키게 된다. 또한 가교제의 핵산 서열이 연결되는 화학 변형제 아크리다이트(482)가 도시되어 있다.

전기적 측정

DC 저항성 측정은 IDE 상에서 OCPC의 저항성을 측정하기 위해 2-단자 저항성 방식으로 케이틀리(Keithley) 2000 멀티미터를 사용해 수행하였다. 이러한 기술을 사용하여 건조 상태(대기 실내 상태) 및 포화 상태(인산염 완충액 용액 중 평형상태) 사이에서 OCPC가 이동함에 따라 발생되는 저항성의 변화를 측정하였다. 센서 반응은 많은 방식으로 측정할 수 있다. 표적 올리고뉴클레오타이드의 존재 및 부재의 포화된 상태 사이(즉, 바이오센서가 사전 팽윤된 경우) 또는 건조 상태 및 포화된 상태 사이에서 비교를 할 수 있다. 이들 방법 간 선택은 실제 용법의 환경적 측면 및 센서 성능에 따라 좌우될 것이다.

주문 제작된 전류 공급원(도 5)을 또한 사용하여 1.11㎂의 정전류를 공급하였고 멀티미터를 사용해 DC 전압을 측정하였다. 도 5는 전류 공급원의 회로도(590)를 도시한다. R_C는 5.1㏁ 저항기이고, R_L은 시험 중인 OCPC 전극이다. 연산 증폭기는 LM 741CN이다. 최종 출력 전류는 1.11㎂으로 보정을 통해 결정하였다. 저항성은 이들 2가지 정보로부터 추론하였다. 저전류를 선택하여 센서의 반응의 이동을 야기할 수 있는, 원치않는 효과 예컨대, 줄(Joule) 발열 또는 공간-전하 제한 전류를 최소화시킨다. 이들 유형의 복합체의 비선형 전류-전압 특징(비옴성 거동)에 의해 야기되는 저항성 측정 부정확성을 피하기 위해, 정정류가 또한 바람직하다.

대안적/향후 전기 측정 기술:

- AC 임피던스 측정: 복합 전기 임피던스(즉, 전기용량 및/또는 인덕턴스)의 AC 측정이 DC 저항성 측정과 비교하여 센서 반응을 측정하는데 이득을 제공하는지 여부를 결정하기 위한 조사가 현재 진행되고 있다. 이 기술은 필적하는 이온 전도성 기전에서 기여를 제거하는 것으로 가설을 세운다.

- AC 임피던스 분광 방법(또는 자기 공진 주파수(SRF) 측정)은 잘 보고되어 있어서 역시 사용될 수 있다. 복합 등가 회로가 중합체(및 또한 그 안에 분포된 전도성 입자)와 전극의 전기용량 접합을 통해 형성된다. 이 회로의 공진 주파수는 중합체 팽윤 시 변화될 것이고, 민감한 검출 방법으로서 사용될 수 있다.

- 패턴 인식 소프트웨어 및 기술 예컨대, 주성분 분석(PCA)은 복합 아로마의 고도의 특이적 인식을 제공하는데 도움이 되는, 전자 코 기술에 광범위하게 사용되어왔다. 유사한 접근법이 또한 본 발명에서 예상되고, 그에 의해 다수의 miRNA는 각각 상이한 올리고뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하는, 다수의 OCPC 센서를 사용한 단일 일회용 칩 상에서 검출된다. 질환 상태의 검출 및 진단은 상이한 농도에서 매우 가능하게, 다수 생물마커의 복합 조합이 될 것이다. 장치의 사용자는 개별 센서로부터 개별 miRNA 신호의 데이터를 해석하는 지식 또는 기술을 반드시 갖지 않을 수 있어서, 패턴 인식은 유용한 진단으로 미가공 데이터를 전환시키는데 사용될 것이다. 미래의 의료 연구가 진행됨에 따라서, 생물마커 패턴을 비교하고 인식하기 위한 알고리즘 및 라이브러리는 이의 성능을 계속적으로 개선시킬 수 있는, 장치로 갱신될 것이다.

- 온칩 통합: 상기의 전기 및 소프트웨어 기술은 모두 진보된(예를 들어, CMOS) 미세전자 제작 기술을 사용해, OCPC 센서 그 자체와 칩 상에 실행 가능하게 통합될 수 있어서, 광범위한 전자 진단 장치에 통합될 수 있다. 그러나, OCPC의 일회성 및 비가역적 반응으로 인해, 전기 측정 회로를 함유하고, 일회용 센서 칩이 삽입된, 개별 문의 모듈이 개발되는 것이 아마도 보다 그럴듯 할 것이다.

감지 및 다른 결과

도 6은 0.8 몰%의 비스아크릴아마이드 가교 밀도(임의의 올리고뉴클레오타이드 가교제없음)의 폴리아크릴아마이드 중 탄소 나노분말에 대한 침투 그래프를 도시한다. 이는 OCPC의 전도성이 나노입자 농도에 따라 어떻게 변화하는지 및 침투가 일어나는 농도를 보여준다. 침투 한계치 바로 위에서, 복합체는 팽윤으로 발생되는 부피의 임의 변화에 가장 민감하게 될 것이다. 이들 측정은 복합체를 대기 조건에서 공기 중에 건조시켰을 때 수행되었고 2-단자 저항성 방식으로 멀티미터를 사용해 수행하였다. 탄소 분말의 임계 부피 적재량에서 전도도의 급격한 변화는 중합체 팽윤에 대한 향상된 전기적 변환을 제공한다.

도 7은 10 μM 올리고뉴클레오타이드 용액에 함침 시 시간 경과에 따라 OCPC의 저항성이 어떻게 변화되는지를 보여준다. 원 및 삼각형(예 1 및 예 2)으로 표시된 데이터 세트는 상보성 피분석물 가닥을 함유하는 용액에 함침된 OCPC의 저항성 변화의 개별 반복성을 보여준다. 네모로 표시된 데이터 세트는 무작위 올리고뉴클레오타이드 가닥을 함유하는 대조군 용액에 함침된 OCPC의 저항성을 보여준다. 대조군 용액과 비교하여 피분석물 용액 중 OCPC의 팽윤 거동은 명확한 차이가 존재한다는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 우리는 구별을 제공하는데 사용할 수 있는, 양성예 및 음성예 사이의 팽윤 반응 속도의 차이가 존재한다는 것으로 확인하였다. 사전 결정된 팽윤량(저항성 값)에 도달하는데 걸린 시간을 단순히 측정할 수 있거나, 또는 OCPC 반응 사이의 다른 일시적 특징을 비교할 수 있다. 대안적으로, 명시된 시간(이 경우 대략 200초) 이후 저항성을 단순히 측정하고 이 시점에서 저항성 값을 비교할 수 있다. 센서의 일부 실시형태에서, 또한 다양한 OCPC 간 최종 포화 및 완전 팽윤 상태의 차이를 비교할 수 있지만, 이러한 특정 예는 최종 팽윤 상태가 모든 3가지 예에서 유사하다는 것을 보여준다.

이들 결과는 본 발명에 따른 바이오센서가 샘플 중 올리고뉴클레오타이드를 성공적으로 검출할 수 있다는 것을 명확하게 입증한다. 물론, 바이오센서는 추가적인 최적화를 통해 이득을 얻을 수 있게 될 것이지만, 본 발명의 유용성 및 가능성은 명확하게 입증되었다.

중합체 매트릭스로 앱타머 서열의 통합

핵산 앱타머는 miRNA-표적화 핵산 프로브에 대해 상기 기술된 것과 유사한 방법을 사용해 도입시킬 수 있다.

앱타머 서열은 다양한 상업적 공급처에서 입수할 수 있고 문헌에 광범위하게 기술되어 있다. 예를 들어, 베이스 페어 바이오테크톨로지스, 인코포레이션(Base Pair Biotechnologies, Inc.)은 단백질, 세포 표면, 펩타이드, 및 소형 분자 표적에 대해 검증된 앱타머를 판매한다(http://www.basepairbio.com/project-phases-2/existing-aptamers/ 참조)

이러한 예를 위해 우리는 앱타머 프로브 표적화 앰피실린을 참조할 것이지만, 다른 표적용 엡타머가 쉽게 사용될 수 있다.

앰피실린 앱타머 5E01# 284로 알려진, 상업적으로 입수할 수 있는 앰시필린 앱타머는 베이스 페어 바이오테크놀로지스, 인코포레이션(http://www.basepairbio.com/wp-content/uploads/2013/04/Ampicillin-ATW0001-284-datasheet.pdf)에서 입수할 수 있다. 5'-CACGGCATGGTGGGCGTCGTG-3'(서열번호 5), 5'-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3'(서열번호 6), 및 5'-TTAGTTGGGGTTCAGTTGG-3'(서열번호 7)을 포함한, 앰피실린에 대한 몇몇 다른 앱타머 서열이 문헌에 기술되어 있다.

앱타머 서열을 중합가능한 단량체와 조합하기 위해서, 1차 아민 작용화된 앰피실린 앱타머 서열, 예를 들어 NH₂(5'-CACGGCATGGTGGGCGTCGTG-3'), NH₂(5'-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3') 또는 NH₂(5'-TTAGTTGGGGTTCAGTTGG-3')를 아크릴로일 클로라이드 또는 브로마이드와 반응시켜서 아크릴아마이드 말단화된 올리고뉴클레오타이드 서열(즉, CH2=CHN(=O)-서열)을 제공한다. 이는 상기 기술된 아크리다이트 변형된 서열과 본질적으로 균등한 단량체를 제공한다. 일부 경우에서 스페이서 서열(예를 들어, 1 내지 20개 뉴클레오타이드 길이)은 아크릴아마이드 및 앱타머 서열 사이에 제공될 수 있다.

서열은 상기 기술된 방법론을 사용하여 취성 가교를 형성하도록 불충분하게 일치된 차단 가닥을 따라서 팽윤성 중합체에 도입된다. 표적(즉, 이 경우 앰피실린)의 결합은 가교를 절단하여, 증가된 하이드로겔 팽윤을 가능하게 한다.

대안적인 접근법에서, 앱타머 서열과 혼성화하도록 접합된 2개의 차단제 올리고뉴클레오타이드 가닥은 앞서 기술된 방법론을 사용하여, 중합체에 통합된다. 앱타머 서열(이제 작용화되지 않음)이 중합체에 첨가되어 이들 차단제 가닥에 혼성화하여 브릿징시켜서 부분 일치부(예를 들어, 각 면에서 ∼10 염기쌍)를 형성한다. 표적 화합물(즉, 앰피실린)의 존재는 3부분 가교로부터 앱타머 서열의 해리를 일으켜서 증가된 팽윤 및 변환된 반응을 가능하게 한다.

대안적인 접근법에서, 앰피실린은 상기 기술된 올리고뉴클레오타이드의 작용화와 유사한 방식으로 앰피실린의 아민(NH₂)의 작용화에 의해 중합체에 통합된다. 경우에 따라, 짧은 스페이서 사슬을 사용하여 중합체 골격으로부터 앰피실린을 이격시킨다(예를 들어, 간격을 둔다(예를 들어, (CH₂)_nNHCOCH=CH₂(여기서, n은 0 내지 10임)로 제공되는, 10개 이하 탄소 길이의 스페이서).

하이드로겔로 앱타머의 통합에 관한 추가의 상세 설명은 문헌 [Yang et al.] [29]에 기술되어 있다.

본 발명의 범주를 벗어나지 않고 변형 및 개선이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 대안적인 변환 기전이 또한 가능하다. 이들은 중합체와 조합할 수 있는, 다양한 미세전기화학 시스템(MEMS)-기반 접근법을 포함한다.

추가의 예시

실시예 1 - 아크릴아마이드 및 N-아이소프로필아크릴아마이드 단량체를 사용한 추가 중합체

추가의 중합체 변이체는 다양한 양의 아크릴아마이드 단량체를 사용하고 아크릴아마이드 및 N-아이소프로필아크릴아마이드 단량체를 사용하여 생성시켰다. 사용된 방법론은 달리 표시하는 경우를 제외하고, 일반적으로 상기에 기술된 바와 같았다.

모든 샘플은 달리 명시하지 않으면 150mM의 NaCl 농도의 pH 7.4 인산염 완충액(1mM)에서 제조하였다. 단량체/프리-겔레이터 용액은 아크릴아마이드(AAm); 및 공중합체 겔을 위한 N-아이소프로필아크릴아마이드, N,N'-메틸렌 비스아크릴아마이드(Bis-AAm) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(에틸렌 글리콜 중)의 스톡 용액으로부터 제조하였다. 이들 스톡의 혼합물은 각각 10 또는 15 중량%의 총 단량체, 0.6 몰%의 가교제 및 0.13 몰%의 개시제의 최종 농도를 제공하였다. 다음으로 스톡 용액은 0.4 몰%의 최종 올리고뉴클레오타이드 농도를 제공하도록 DNA를 함유하는 1.5 mL 에펜도르프 원심분리 튜브에 파이펫팅하였다.

도 8은 무작위 대조군 가닥(서열번호 4)와 비교하여 피분석물 가닥(서열번호 3)의 존재에서 중합체 및 공중합체 겔(10 중량%)의 선택적인 팽윤을 보여준다. 피분석물에 의한 올리고뉴클레오타이드 가교의 절단으로 인한 팽윤의 보다 큰 증가가 관찰되었다. N-아이소프로필아크릴아마이드의 감소된 친수성으로 인해 50:50 공중합체에서 약간의 더 낮은 총 팽윤성이 관찰되었다.

다음의 변이를 발생시켰다:

1. 10, 15, 20 또는 25 중량%의 AAm 겔

● AAM에 대해 비스 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 및 1.2 몰%

● PDA(피페라진 다이-아크릴아마이드)는 비스 대신 그램 기반으로 1 그램을 사용함

2. 10 또는 15 중량%의 DNA를 갖는 AAm 겔

● AAM에 대해 비스 0-1 몰%

● AAM에 대해 DNA 0.1-2 몰%

● 전형적으로 AAM에 대해 0.6 몰% 비스, 0.4 몰% DNA

3. 10 및 15 중량%의 50:50 AAm/NIPAAm, 및 80:20 및 20:80 AAm/NIPAAm gels(15 중량%). 모든 샘플은 DNA 가교가 있고 없게 제조하였다(0.4 몰% DNA가 있거나 또는 없는 0.6 몰% 비스).

모든 이들 변이체는 각 변이체의 개별 특성이 물론 상이하고, 다른 용도에 적합할 수 있지만, 그들의 의도하는 목적 관점에서 만족할만하게 수행하는 것으로 확인되었다.

실시예 2 - 앱타머-기반 취성 가교제

중합체는 문헌 [Yang et al.][29]을 기반으로 하는 접근법을 사용하여, 앱타머-기반 가교제를 사용해 생성시켰다. 이 실시예에서, 아데노신에 선택적으로 결합하는 앱타머를 사용한 2개의 상이한 접근법이 사용되었다. 2개 접근법은 도 9에 개략적으로 도시하였고, 이하에 설명한다. 앱타머는 서열 5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'(서열번호 8)을 갖는다.

접근법 1:

접근법 1에서, 2개 핵산 가닥을 중합체에 연결시켰고(차단 가닥 1 및 2라고 함), 앱타머를 포함하는 '감지' 핵산은 양쪽 차단 가닥에 결합하도록 적합화된 제3 서열로서 제공되었다. 따라서, 2개 차단 가닥은 감지 가닥과 조합되어 취성 가교제를 형성한다.

- 앱타머 함유 감지 가닥은 서열 5' ACTCATCTGTGAAGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'(서열번호 9)을 갖는다 - 실제 앱타머 서열은 밑줄로 표시한다.

- 차단 가닥 1은 감지 가닥의 5' 말단에 상보성인, 서열 5'-TGAGTAGACACT-3'(서열번호 10)을 갖는다.

- 차단 가닥 2는 차단 가닥 1이 결합된 영역의 바로 3' 영역 및 앱타머 서열의 5' 말단의 처음 7개 염기에서 감지 가닥에 상보성인 서열 5'-TCTCTTGGACCC-3'(서열번호 11)을 갖는다. 앱타머 서열의 활성 영역을 실제로 차단하는 것은 차단 가닥 2이다.

도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아데노신이 샘플 중에 도입되면, 감지 가닥은 아데노신에 결합하여 차단 가닥 2로부터 방출되어서, 취성 가교제를 절단한다. 감지 가닥은 차단 가닥 1에 결합된 채로 남아있는다. 따라서, 중합체는 샘플 존재에서 팽윤될 수 있어서, 검출 가능한 신호를 생성시킨다.

건조된 올리고뉴클레오타이드 가교는 에탄올보다는 아이소프로판올을 사용해, 이전에 기술된 대로 제조하였다. 앱타머 가교(AAm에 대해 0.6 몰% 비스 및 0.4 몰% 앱타머)를 갖는 AAm(10 및 15 중량%) 겔은 150mM보다는 300mM의 NaCl을 사용해 상기 AAm 겔에 대해 기술된 스톡 용액 및 방법으로 제조하였다. 선택적인 팽윤은 완충액과 비교하여 2mM 아데노신 용액에 대응하여 획득되었다.

접근법 2:

접근법 2에서 감지 앱타머 함유 가닥 및 상응하는 차단 가닥 둘 모두는 중합체에 연결된다. 따라서, 접근법 2에서는 제3 가닥이 없고, 대신 차단 및 감지 가닥이 함께 취성 가교제를 형성한다.

- 앱타머 함유 '감지' 가닥은 서열 5' AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'(서열번호 12)을 갖는다 - 실제 앱타머 서열은 밑줄 표시하였다.

- 차단 가닥은 감지 가닥의 5' 말단에서 앱타머 가닥의 7번째 염기로 확장된 영역에 상보성인 서열 5'-TCTCTTGGACCG-3'(서열번호 11)을 갖는다.

도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 아데노신이 샘플 중에 도입되면, 감지 가닥은 아데노신의 2개 분자에 결합되고, 차단 가닥으로부터 방출되어서, 취성 가교제를 절단한다. 중합체는 샘플의 존재에서 팽윤될 수 있어서, 검출 가능한 신호를 생성시킨다.

건조된 올리고뉴클레오타이드 가교는 에탄올 대신 아이소프로판올을 사용하여, 이전에 기술된 대로 제조하였다. 앱타머 가교(AAm에 대해 0.6 몰% 비스 및 0.4 몰% 앱타머)를 갖는 AAm(10 및 15 중량%) 겔은 150mM 보다는 300mM의 NaCl로 상기 AAm 겔에 대해 기술된 스톡 용액 및 방법으로 제조하였다. 완충액과 비교하여 2mM 아데노신 용액에 대응하여 선택적인 팽윤이 획득되었다(도 10). 팽윤 부피는 이전 앱타머 가교된 겔보다 낮았다.

실시예 3 - 몰폴리노 취성 가교제

몰폴리노는 하기 반응에 도시된 바와 같이 중합체 프레임워크에 도입을 위해 작용화시켰다.

각각 서열번호 1 및 2와 동일한 서열을 갖지만 아크리다이트 기가 1차 아민으로 치환된 '센서/차단제' 몰폴리노 올리고뉴클레오타이드 재료(1차 아민과 올리고뉴클레오타이드 서열 간 에틸 링커를 가짐)를 둥근 바닥 플라스크 중 증류수 (1mM 농도)에 용해시키고 N-숙신이미딜 아크릴레이트의 수용액의 2 몰 등가량을 첨가하였다. 이를 실온에서 ∼20시간 동안 교반되도록 두었다. MALDI-ToF 분광법을 수행하여 생성물 형성을 결정하였다. 동결건조 후, 생성물을 과량의 뜨거운(∼50℃) 에틸 아세테이트로 세척하여 숙신이미드를 제거하고 냉동 건조시켜서 아크릴아마이드-작용화된 생성물을 제공하였다.

모든 겔 샘플은 상기 중합체 및 공중합체 겔에 대해 기술된 스톡 용액 및 방법으로 제조하였지만, 단량체/프리-겔레이터 용액은 변형된 몰폴리노 센서 및 차단제 가닥을 함유하는 에펜도르프 튜브에 첨가하여 0.4 몰%의 최종 몰폴리노 가교 농도 및 0.6 몰% 비스 농도를 제공하였다.

몰폴리노 가교(0.6 몰% 비스 및 0.4 몰% 몰폴리노)가 있는 AAm 및 50:50(10 및 15 중량%) 겔을 형성시킬 수 있고 피분석물(서열번호 3) 및 무작위 대조군(서열번호 4)을 함유하는 용액 중 함침 사이에 선택적인 팽윤을 보일 수 있다. 전체 팽윤은 DNA 가교를 갖는 것과 비교하여 몰폴리노 가교를 함유하는 겔에서 덜하였다. 선택적 팽윤을 나타내었고 전체 팽윤은 또한 에틸 링커와 반대로, 펜틸 링커를 갖는 몰폴리노 재료(분자의 아크랄아마이드 말단 및 올리고뉴클레오타이드 서열 사이)가 사용되었을 때 DNA 겔보다 더 낮았다. 팽윤은 도 11에 도시된 에틸 링커 모이어티(AAm(10 중량%) 겔)를 함유하는 몰폴리노 가교된 겔보다 약간 더 높았다. 이러한 펜틸 링커 함유 몰폴리노 재료는 진툴(GeneTool)로 합성한 후, HPCL를 사용해 정제하였다.

몰폴리노 가교(에틸 링커) 또는 몰폴리노(아크릴아마이드 모이어티와 올리고뉴클레오타이드 서열 상에 펜틸 링커를 가짐) 센서 가닥 및 DNA 차단 가닥('하이브리드' 겔)을 함유하는 겔(10 중량% AAm)은 순수하게 DNA-함유 겔과 비교하여 염 농도(0 - 200mM의 NaCl 농도)에 의해 덜 영향받는 것으로 보인다(도 12). 샘플은 이전처럼 제조하였지만, 0 - 200mM 범위의 NaCl 농도를 함유하는 용액을 사용하였고 표적 피분석물이 존재할 때만 팽윤하였다(서열번호 3).

실시예 4 - 대안적인 개시제

다양한 개시제를 사용하여 중합반응을 개시시킬 수 있다. 암모늄퍼설페이트(APS)를 사용한 개시를 다음과 같이, 추가 예로 사용하였다:

올리고뉴클레오타이드 가교가 없는 AAm(10 및 15 중량%)의 프리-겔레이터 용액(AAm에 대해 0.6 몰% 비스)을 광개시제없이 제조하였다. 불활성 대기 하에서, 이 경우 질소에서, AAM에 대해 0.125 몰%의 APS(암모늄 퍼설페이트), 및 0.5 또는 1.0% 최종 농도의 TEMED(테트라메틸에틸렌다이아민)를 프리-겔레이터 용액에 첨가하였다. 다음으로 적절한 부피(1 또는 2 ㎕)를 이전에 기술된 실란화 규소 표면 상에 파이펫팅하였고 90-120분간 불활성 대기에서 중합반응될 수 있게 하였다. 올리고뉴클레오타이드 가교된 겔의 경우, 프리-겔레이터 용액 중 건조된 올리고뉴클레오타이드를 가용화시킨 후 APS 및 TEMED를 첨가하였다.

참조문헌

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Claims (46)

1. 하기를 포함하는 바이오센서:
   - 핵산 프로브를 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소(swellable biologically sensitive element); 및
   - 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소와 연합된(associated) 물리전기적 변환기.
2. 제1항에 있어서, 상기 프로브를 위한 표적은 핵산, 단백질/펩타이드, 약물, 지질, 다당류, 다른 소형 분자, 또는 세포 표면인, 바이오센서.
3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 앱타머인, 바이오센서.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물리전기적 변환기는 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤의 물리적 효과를 검출 가능한/측정 가능한 전기 지표로 변환시키도록 적합화된, 바이오센서.
5. 제4항에 있어서, 검출하려는 상기 전기 지표는 전기 임피던스 또는 어드미턴스, 예컨대, 저항성, 전도도, 리액턴스, 서셉턴스(susceptance), 전기용량, 인덕턴스, 또는 이들의 조합의 변화인, 바이오센서.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 팽윤성 중합체 재료 중 취성 가교제의 일부분을 한정하고, 상기 가교제는 표적이 상기 핵산 프로브에 결합 시 절단되는, 바이오센서.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 적어도 부분적으로 상보성인 핵산 가닥의 적어도 한 쌍을 포함하고, 각 쌍의 적어도 한 가닥은 핵산 프로브를 포함하는, 바이오센서.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 취성 가교제는 핵산 프로브 가닥 및 차단제 가닥을 포함하는 부분적으로 상보성인 핵산의 적어도 한 쌍을 포함하는, 바이오센서.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 혼성화를 통해 핵산 표적에 결합하도록 적합화되거나, 또는 비핵산 표적에 결합하도록 적합화된 앱타머인, 바이오센서.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 중합체에 연결된 2개 핵산 차단제 가닥을 포함하는 취성 가교제 및 차단제 서열 둘 모두에 적어도 부분적으로 상보성이어서 그에 혼성화하여 취성 가교를 형성하는 핵산 프로브 서열을 포함하는, 바이오센서.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 앱타머 프로브를 포함하는 취성 가교제 및 상기 앱타머를 위한 상응하는 표적을 포함하는, 바이오센서.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서는 상기 핵산 프로브 와 그에 연결되는 단량체/중합체 사이에 제공되는, 바이오센서.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 불완전하게 상보성인 핵산의 하나 이상의 쌍을 포함하는 취성 가교제를 포함하는, 바이오센서.
14. 제13항에 있어서, 상기 취성 가교제는 상응하는 차단제 가닥과 이의 길이의 오직 일부를 따라서 및 상기 표적과 이의 길이의 상당 부분을 따라서 쌍형성하는 프로브 서열을 포함하는, 바이오센서.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서 상기 핵산 프로브는 핵산 유사체/모방체 또는 변형 또는 변경 핵산의 다른 형태를 포함하는, 바이오센서.
16. 제15항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 펩타이드 핵산(PNA), 포스포로다이아미데이트 몰폴리노 올리고(PMO), 잠금 핵산(LNA), 글리콜 핵산(GNA), 브릿지된 핵산(BNA), 또는 트레오스 핵산(TNA)인, 바이오센서.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유형의 표적의 검출을 위한 핵산 프로브를 포함하는, 바이오센서.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 중합가능한 모이어티에 연결되고, 바람직하게는 상기 핵산 프로브는 팽윤성 중합체에 통합될 수 있는 단량체 모이어티에 공유적으로 결합되는, 바이오센서.
19. 제18항에 있어서, 상기 핵산 프로브에 연결되는 상기 중합가능한 모이어티는 아크리다이트인, 바이오센서.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비취성 가교제 및 취성 핵산 가교제를 포함하는 팽윤성 중합체를 포함하는, 바이오센서.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 팽윤성 중합체, 바람직하게는 친수성, 수팽윤성 중합체를 포함하는, 바이오센서.
22. 제21항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 상기 폴리아크릴아마이드, 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드); 폴리(비닐 알코올); 폴리(에틸렌 글리콜); 폴리(N,N'-다이알킬 아크릴아마이드); 폴리(2-하이드록시프로필(메타)크릴레이트); 폴리(2-메톡시에틸 아크릴레이트); 및 폴리(다이(에틸렌 글리콜)메틸 에테르 메타크릴레이트) 중 1종 이상을 포함하고, 이러한 중합체로 취성 핵산 가교제의 통합은 상기 핵산에 연결된 적절한 중합가능한 모이어티를 사용하여 쉽게 획득될 수 있는, 바이오센서.
23. 제22항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 포함하는, 바이오센서.
24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 또는 다른 무기 금속 염을 포함하는, 바이오센서.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 용매를 포함하는, 바이오센서.
26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 공중합체를 포함하는, 바이오센서.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소는 올리고뉴클레오타이드 가교된 중합체 복합체(OCPC)를 포함하는, 바이오센서.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 팽윤의 상기 물리전기적 변환기는 이의 부피의 외부적으로 유도된 변화로 인한 전기 임피던스의 변화를 나타낼 수 있는, 압전저항성 재료 또는 전기적 침투성 복합체 재료를 포함하는, 바이오센서.
29. 제28항에 있어서, 상기 침투성 복합체는 미립자 형태인 전기 전도성 재료를 포함하는, 바이오센서.
30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 침투성 복합체는 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소에 분포된 전도성 입자를 포함하는, 바이오센서.
31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 침투성 복합체는 상기 전도성 입자로서 탄소 나노분말 및/또는 탄소 나노튜브를 포함하거나, 또는 상기 전도성 입자로서 카본 블랙, 니켈, 금, 은, 아연 및 구리 입자 중 1종 이상을 포함하는, 바이오센서.
32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전도성 입자는 크기가 마이크로미터 이하이고, 바람직하게는 500㎚ 미만, 보다 바람직하게는 100㎚ 미만인, 바이오센서.
33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 전도성 입자의 비율은, 팽윤 이전에는 상기 복합체가 침투 한계치 이상이어서 최대 전도성 상태이고, 팽윤이 일어난 이후에는 상기 복합체가 비침투성이 되고 최소 전도성 상태이도록 하는, 바이오센서.
34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 가교제의 절단 시 상기 중합체의 상기 팽윤이 침투 한계치의 적어도 일부 내에서 또는 그에 걸쳐서 전도성 미립자 재료의 부피 분율의 변화를 일으키도록 적합화된, 바이오센서.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 팽윤 결과로서 상기 바이오센서의 전기 특성의 변화 또는 전기 신호 의 검출 및/또는 측정이 가능하도록 전극을 포함하는 기재(substrate)를 포함하는, 바이오센서.
36. 제35항에 있어서, 상기 전극의 활성 영역은 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소(예를 들어, OCPC)로 완전하게 피복되는, 바이오센서.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 기재는 상기 기재 및/또는 전극에 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소의 부착을 향상시키도록 작용제가 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소에 침착되는 영역에서 적어도 부분적으로 표면 변형되는, 바이오센서.
38. 기재 상의 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서의 어레이로서, 상기 기재는 상기 바이오센서 각각과 상호작용하는데 적합한 전극을 포함하는, 어레이.
39. 바이오센서로부터의 전기 지표를 검출 및/또는 정량하도록 적합화된 측정 장비에 연결된 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서 또는 제38항에 따른 어레이를 포함하는 바이오센서 장치.
40. 제39항에 있어서, 분석하려는 샘플을 수용하기 위한 샘플 수용 용기를 포함하는, 바이오센서 장치.
41. 샘플 중 표적의 존재 또는 양을 검출하기 위한 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서, 제38항에 따른 바이오센서의 어레이, 또는 제39항 또는 제40항에 따른 바이오센서 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 바이오센서, 어레이 또는 바이오센서 장치를 상기 샘플에 노출시키는 단계;
    c) 상기 샘플에 노출의 결과로서 상기 바이오센서의 전기 특성의 변화 또는 전기 신호를 관찰하는 단계;
    d) 경우에 따라 상기 변화의 규모를 결정하는 단계; 및/또는
    e) 경우에 따라 상기 변화의 속도를 결정하는 단계; 및
    f) 상기 결정으로부터 상기 샘플 중 상기 표적의 존재 및/또는 양을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 중 표적의 존재 또는 양을 검출하기 위한 방법.
42. 제41항에 있어서, 생물학적 샘플 중 표적의 검출을 위한, 방법.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 샘플을 대상체로부터 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플 중 하나 이상의 표적 피분석물의 검출을 위한, 방법.
45. 바이오센서를 제조하는 방법으로서,
    a) 핵산 프로브를 포함하는 팽윤성 생물학적 감응성 요소를 제조하는 단계; 및
    b) 물리전기적 변환기를 상기 팽윤성 생물학적 감응성 요소와 연합시키는 단계를 포함하는, 바이오센서를 제조하는 방법.
46. 제45항에 있어서,
    - 팽윤성 중합체 매트릭스를 형성하도록 적합한 단량체를 제공하는 단계,
    - 핵산 가교 단량체를 제공하는 단계,
    - 전기적 전도성 입자를 제공하는 단계,
    - 경우에 따라 비취성 가교제를 제공하는 단계,
    - 상기 전술한 것을 함께 혼합하는 단계, 및
    - 상기 단량체, 및 경우에 따라 비취성 가교제가 중합반응하도록 하여, 연합된 물리전기적 변환기를 구비한 취성 핵산 가교를 포함하는 팽윤성 중합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 바이오센서를 제조하는 방법.

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