CN108026571A

CN108026571A - 生物传感器

Info

Publication number: CN108026571A
Application number: CN201680051377.7A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·P·谢弗; 飞利浦·J·W·翰兹; 大卫·费里尔
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2018-05-11
Also published as: GB201511969D0; US20180201982A1; AU2016288749A1; JP2018526980A; CA2991677A1; WO2017006122A1; KR20180027574A; EP3320114A1; HK1251621A1

Abstract

一种生物传感器，所述生物传感器包括可膨胀生物敏感元件和物理电式换能器(physicoelectrical transducer)，所述可膨胀生物敏感元件包含核酸探针，所述物理电式换能器与所述可膨胀生物敏感元件相关联。物理电式换能器将可膨胀生物敏感元件的膨胀转化为可检测的电学特性。在优选的实施方案中，生物传感器包括安装在合适的基底上的寡核苷酸交联聚合物复合材料，所述基底包括适于测量电阻抗的电极。还提供了相关的方法和包括所述生物传感器的装置。

Description

生物传感器

本发明涉及生物传感器和包括生物传感器的系统。在一些实施方案中，生物传感器适于检测样品中的核酸。

生物传感器是一组越来越重要的分析工具，用于在多种技术领域，尤其是诊断中使用。在许多情况下，它们组合生物识别(biological recognition)(生物识别(bio-recognition))组分和合适的换能器。在与生物识别组分相互作用的分析物的存在下，它们通常可以将生物化学信号转化为合适的信号。

用于核酸检测的生物传感器是特别重要的。鉴于微小RNA(miRNA)作为生物标志物用于诊断和其他生物研究的用途的持续发展，对于快速且方便地鉴定样品中的核酸的传感器的需求已经增加。用于核酸的生物传感器可以利用两条互补的核酸链之间的相互作用来活化生物传感器的生物识别组分。将这种相互作用转换为可测量的电学信号是具有挑战性的。

虽然存在用于检测样品中的核酸(例如，miRNA)的多种已知方法，但对另外的生物传感器仍然存在迫切需求。

更广泛地讲，对用于其他类型靶的新型生物传感器还存在需求。

特别地，期望具有比已知的生物传感器平台更低的成本、改进的方便性、更快的检测速度和/或改进的灵敏度的生物传感器。

根据本发明的第一方面，提供了生物传感器，所述生物传感器包括：

-可膨胀生物敏感元件，所述可膨胀生物敏感元件包含核酸探针；和

-物理电式换能器(physicoelectrical transducer)，所述物理电式换能器与所述可膨胀生物敏感元件相关联。

包含核酸探针的可膨胀生物敏感元件适于识别靶/分析物。

在本发明的某些实施方案中，靶可以是核酸。在这种情况下，靶核酸可以通过核酸探针与靶核酸之间的互补碱基配对(杂交)而被核酸探针合适地识别。

在其他实施方案中，靶可以是非核酸靶，其可以是任何合适的靶实体，例如蛋白/肽、药物、脂质、多糖、其他小分子、细胞表面等。在这些实施方案中，核酸探针优选地是核酸适配体。适配体是一类充分描述的基于核酸的部分，其可以通常以高特异性和亲和力与范围从大分子和更大结构至小化合物的宽范围的靶结合。核酸适配体可以是DNA、RNA或非天然核酸，其可以以多种方式被进一步改性。适配体数据库(http://aptamer.icmb.utexas.edu/)已经被建立，该适配体数据库大体上登记分类使用适配体的所有公布的实验。因此，在一些优选的实施方案中，核酸探针包含适配体。

在靶是核酸的情况下，它基本上可以是任何核酸，但在许多情况下，它是寡核苷酸，诸如miRNA。优选地，当暴露于生物传感器时，靶核酸是单链的，因为这便于与核酸探针杂交。在miRNA的情况下，单链形式是正常状态。可选地，可以生成单链形式以便于与核酸探针的相互作用。这可以在生物传感器中原位完成，或者在将样品应用于生物传感器之前完成。例如，双链(双链体)DNA可以通过加热和/或施用合适的化学剂(例如尿素)容易地分开为单链(解链或变性)；随后去除过量的热量和/或化学剂将允许至少一定比例的靶核酸与核酸探针退火。然而，鉴于核酸杂交的动态性质，在暴露于生物传感器时靶核酸是双链的情况，本发明通常仍然可以起作用。

在使用中，当暴露于包含适当靶的样品时，生物敏感元件允许物理效应，即聚合物的膨胀。这种物理效应是靶与核酸探针之间相互作用的结果。然后，物理电式换能器将物理效应(物理信号)转化为可以被使用者测量和/或监测的可检测/可测量的电指示物(例如，可测量的电学特性诸如阻抗或电阻或者电学信号诸如电压或电流)。优选地，待检测的电学特性是电阻抗(或导纳，被定义为阻抗的倒数)中的变化，并且因此可以包括电阻、电导、电抗、电纳、电容、电感中的变化或其组合。可选地，可以使用电学特性中的其他形式的可检测变化，例如，介电常数、电容率(electrical permittivity)、电渗透率(electricalpermeability)。

优选地，可膨胀生物敏感元件适于使得核酸探针与对应靶的结合导致可膨胀生物敏感元件的可膨胀性增加。例如，核酸探针可以限定可膨胀聚合物材料的脆弱(frangible)(即，可容易地裂解的)交联物(cross-linker)的部分，其中当靶与核酸探针结合时所述交联物被裂解。

在一些实施方案中，可膨胀生物敏感元件合适地包含至少一对至少部分互补的核酸链，每一对中的至少一条链包含核酸探针。部分互补的核酸的多个对(Pairs)能够杂交以形成脆弱交联物，当配对分开时所述脆弱交联物被裂解。

优选地，脆弱交联物包含至少一对部分互补的核酸，所述至少一对部分互补的核酸包含核酸探针链和阻断物链。核酸探针链和阻断物链彼此至少部分互补以允许它们退火，但非常优选的是它们彼此不完全互补和/或仅在它们的总长度的一部分上完全互补。

核酸探针链和阻断物链通常呈单链形式，直至当形成脆弱交联物(它们通常在整合到聚合物之前退火)时它们彼此退火，或者当核酸探针与靶分析物(例如互补多核苷酸，如miRNA)结合时。

在此类实施方案中，核酸探针可以适于与核酸靶通过杂交结合，或者它可以是适于与非核酸靶结合的核酸适配体。将理解，核酸适配体能够以与任何其他核酸相同的方式与互补链诸如阻断物链结合。在适配体靶的存在下，靶将与阻断物竞争与适配体的结合，因此导致交联物的裂解。

在可选的实施方案中，可膨胀生物敏感元件合适地包含两条核酸阻断物链和核酸探针序列，所述两条合适阻断物链与聚合物连接，所述核酸探针序列与所述阻断物序列中的两者至少部分地互补，并且因此与所述阻断物序列中的两者杂交以形成脆弱交联。通常，核酸探针序列将具有与第一阻断物至少部分地互补的第一序列(通常在一个末端或在一个末端附近)和与第二阻断物至少部分地互补的第二序列(通常在另一个末端或在另一个末端附近)。因此，在此类实施方案中，核酸探针在锚定在聚合物中的两个核酸阻断物序列之间形成桥以形成三部分交联。在这种情况下，核酸探针可以同样是意图通过碱基配对与靶核酸结合的适配体或探针。

在可选的实施方案中，可膨胀生物敏感元件合适地包含核酸适配体探针和适配体的对应靶。因此，脆弱交联合适地由核酸适配体和非核酸靶(其可以被称为阻断靶)形成。合适的靶在可膨胀聚合物材料中的整合可以经由许多常规的化学技术实现，适当的技术将明显由聚合物和靶的性质确定。方便地，当靶被整合到聚合物材料中时，由于靶中造成的轻微变化，可能存在适配体对靶的亲和力降低。此类亲和力降低赋予这样的益处：与阻断靶相比，适配体将与生物样品中的‘天然’靶优先结合。

当适配体(或事实上任何其他序列)与单体/聚合物连接时，可以期望在聚合物与结合序列之间包括间隔物，例如，使得适配体采取用于结合靶的正确构象不会被例如空间位阻或聚合物产生的其他效应阻止。间隔物可以是核酸间隔物，或者它可以是任何其他合适的间隔物，诸如烃链，例如(CH₂)_n链，其中n可以是任何合适的数字，优选地从1至10。可以使用任何合适长度的核酸间隔物，优选地从1个至20个核苷酸，更优选地从2个至10个核苷酸，例如约5个核苷酸长度。

脆弱交联物因此可以包含一对或更多对不完全互补的核酸。在这种情况下，‘不完全互补’意指脆弱交联物中两条核酸链之间互补碱基的匹配少于核酸探针与其互补靶(例如，miRNA或其他核酸或非核酸靶)之间互补碱基的匹配。换言之，核酸探针与靶的结合比与阻断物链的结合更强(并且因此在热力学上更有利)。这意味着在靶的存在下，核酸探针与阻断物的结合变成热力学不利的，并且核酸探针与靶的结合变成有利的。这将导致核酸探针与靶而非与阻断物的结合，并且因此导致脆弱交联物裂解。

在靶是核酸的情况下，核酸探针序列与靶核酸分析物序列合适地高度互补。例如，核酸探针和靶核酸的序列可以实质上沿着核酸探针的整个长度合适地完全互补。核酸探针和阻断物可以仅沿着探针长度的一部分(例如，90％或更少、80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、或40％或更少)互补。可选地，或另外地，核酸探针和阻断物可以在沿着其部分互补性的共有区域的一个或更多个位置错配(例如，可以存在1个、2个、3个、4个或5个错配，或者可选地，5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、或40％或更多的碱基可以在部分互补性的区域中错配)。

在一个示例性实施方案中，核酸探针的长度可以是从10个至100个核苷酸(优选地从10个至80个、更优选地从10个至50个、并且又更优选地从10个至30个)，并且可以具有长度为从8个至20个核苷酸的与其对应阻断物部分或完全序列互补的区域。

在优选的实施方案中，探针序列是这样的，即它仅沿着其长度的一部分与阻断物链配对(例如，其长度的从20％至80％，优选地其长度的从40％至60％)，并且沿着其长度的更大比例与靶配对；合适地基本上其全部长度(例如其长度的70％或更多，优选地90％或更多)。

核酸探针和阻断物链通常是寡核苷酸，其可以具有任何合适的长度。合适地，寡核苷酸包含100个或更少的碱基，优选地50个、40个、30个、25个、20个或更少的碱基；通常，寡核苷酸将包含10个或更多个碱基。

应该注意的是，核酸探针不需要是天然核酸(DNA或RNA)，而可以是核酸类似物/模拟物或其他形式的改性或改变的核酸。所需要的只是本发明的核酸探针能够与靶核酸碱基配对。例如，核酸可以是肽核酸(PNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)(还被称为吗啉代(Morpholino))、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、桥接核酸(BNA)或苏糖核酸(TNA)。因此，如本文使用的术语‘核酸探针’不限于天然核酸，并且包括核酸类似物/模拟物和其他形式的改性或改变的核酸。

使用与等同的DNA或RNA序列相比具有降低的电荷和/或亲水性的核酸类似物/模拟物(如PNA和/或吗啉代的情况)可能是有利的。这通常降低了在水性环境中假阳性膨胀反应的机会，并且从而改进了信号强度和对低浓度寡核苷酸标志物的灵敏度。因此，此类核酸类似物/模拟物可以存在于本发明的优选的实施方案中。

在本发明的一些实施方案中，生物传感器可以包括用于检测多于一个靶的核酸探针。

核酸探针和阻断物(和/或用于核酸适配体的阻断靶，如果存在的话)优选地与可聚合部分连接。例如，核酸或阻断靶合适地与能够整合到可膨胀聚合物中的单体部分共价结合。具有连接的核酸/阻断靶的可聚合部分向合适的聚合物的整合导致包含脆弱交联的交联的可膨胀聚合物。

与核酸连接的可聚合部分可以合适地包含烯烃(alkene)(烯烃(olefin))和/或可开环的基团，但它可以包含任何其他合适的可聚合基团。

核酸和可聚合部分的组合可以被称为核酸交联单体，并且阻断靶和可聚合部分的组合可以被称为阻断靶交联单体。除非上下文另外指明，通用术语交联单体指两者。

在本发明的优选的实施方案中，与核酸探针和阻断物连接的可聚合部分是acrydite。下文示出基于acrydite的核酸交联单体的结构。

波浪线表示与acrydite部分连接的寡核苷酸。C＝C双键允许acrydite在聚合期间容易地整合到聚合物主链中，从而将寡核苷酸锚定在聚合物内的位置，并且使连接的核酸自由交联。

除了脆弱核酸交联以外，可膨胀聚合物优选地包含非脆弱交联。例如，聚丙烯酰胺可以与双丙烯酰胺交联，这在本领域中是熟知的。如果聚合物不包含非脆弱交联，则脆弱交联的裂解可以导致聚合物基本上失去其结构完整性，这在许多情况下可能是不期望的。通过提供脆弱和非脆弱交联的混合物，可以保留聚合物的整体结构，但聚合物的可膨胀性可以根据脆弱交联是否被裂解而显著改变。

在使用中，当靶与可膨胀生物敏感元件接触时，它优先与核酸探针杂交(退火)并且置换阻断物链或阻断靶。这裂解脆弱交联，导致聚合物中降低的交联。聚合物中降低的交联允许聚合物显示出增加的膨胀特性。

本领域技术人员可以容易地选择聚合物中适当水平的脆弱和非脆弱交联以调节聚合物的特性。所期望的特性和所需的交联水平将取决于生物传感器的预期用途和所使用的聚合物。增加非脆弱交联的比例将不仅降低/调节系统的膨胀能力，而且还可以减缓膨胀速率(通过产生更加曲折/封闭的水渗透路线)。通常优选一些非脆弱内含物(content)以在膨胀状态时也维持一定程度的结构完整性。通常，在大多数情况下，交联的总量将是最大30％，通常是15％或更低，并且典型地显著更少(例如少于10％或5％)。然而，在一些情况下，更高水平的交联可以是优选的。

可膨胀生物敏感元件可以包含任何合适的可膨胀聚合物，例如亲水聚合物。聚合物的膨胀通常是聚合物与样品中存在的水(或其他合适的溶剂，例如极性溶剂)相互作用的结果。当暴露于包含靶分析物例如核酸的合适样品时(即，在脆弱交联物裂解后)，可膨胀生物敏感元件适于膨胀至合适的(即可检测的)程度，但当靶分析物(例如核酸)不存在时不膨胀或明显较少地膨胀。

在许多情况下，可膨胀生物敏感元件将在存在水(或其他合适的溶剂)但不存在靶分析物的情况下膨胀到一定程度。然而，任何此类膨胀均受到可膨胀生物敏感元件中存在的核酸探针(例如以脆弱交联物形式)的限制。当脆弱交联物被裂解时，对聚合物膨胀的限制降低，并且因此可膨胀生物敏感元件的膨胀能力增加。因此，可膨胀生物敏感元件根据靶分析物的存在或不存在合适地有区别地可膨胀。

在一些情况下，可膨胀生物敏感元件在使用之前可以通过将可膨胀生物敏感元件暴露于与待分析的样品具有相似或相同特性的合适水性液体而‘预膨胀’；在这种情况下，在使用期间聚合物特性中的显著变化仅在靶分析物的存在下发生。可选地，从生物传感器获得的数据可以被处理为忽略在不存在靶分析物时发生的任何背景膨胀。

如以上提及的，由于样品中存在的水(或其他合适的溶剂)被可膨胀生物敏感元件吸收，膨胀发生。因此，待分析的样品将通常是液体，并且将通常是水性的。样品可以合适地是或来源于来自动物的生物样品，例如，血液、尿液、唾液、粘液、粪便、淋巴液、CSF、滑液等。可选地，样品可以是可能包含感兴趣的分析物的任何其他来源，例如，细胞培养基、环境样品等。样品可以包含稀释剂，例如，水、盐水或缓冲液。

亲水性聚合物是用于在可膨胀生物敏感元件中使用的特别合适的材料。如本领域熟知的，亲水性聚合物诸如水凝胶的水吸收(并且因此膨胀)特性主要通过存在的交联的量(有时被称为交联密度)确定。因此，在本发明的优选的实施方案中，可膨胀生物敏感元件合适地包含亲水的、遇水可膨胀(water-swellable)聚合物。

亲水性聚合物优选地是交联的(即，除了脆弱核酸交联以外，还包含常规交联，如以上讨论的)。亲水性聚合物，特别地当交联时，通常被称为水凝胶。因此，本发明的生物传感器优选地包括包含水凝胶的可膨胀生物敏感元件。

本领域已知存在许多亲水性聚合物，并且本领域技术人员可以容易地选择用于在本发明中使用的适当的亲水性聚合物。

为了给出一些特别合适但非限制性的实例，亲水性聚合物可以包括以下中的一种或更多种：聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(乙烯醇)；聚(乙二醇)；聚(N,N'-二烷基丙烯酰胺)；聚(2-羟丙基(甲基)丙烯酸酯)；聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)；和聚(二(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)。脆弱核酸交联物在此类聚合物中的整合可以通过使用与核酸连接的适当的可聚合部分容易地实现。

聚合物优选地包括聚丙烯酰胺水凝胶。聚合物通常包含单体(丙烯酰胺)和交联物(合适地N,N'-亚甲基-双丙烯酰胺)。聚合物可以合适地包含任何合适比例的丙烯酰胺，例如从5％至50％，优选地从7％至30％，通常从10％至20％，并且通常10％-15％(例如约15％)w/w的丙烯酰胺。聚合物中交联物的浓度可以被改变以调节所得水凝胶的物理特性。聚合物中交联物的浓度可以以任何合适的水平存在，例如，交联物可以相对于单体合适地以从0.05mol％至10mol％，优选地从0.1mol％至5mol％，又更优选地从0.2mol％至2.0mol％存在。

聚合物可以合适地包含光引发剂。光引发剂可以合适地是1-羟基环己基苯基甲酮(1-hydroxycyclohexylphenylketone)。然而，许多其他光引发剂是熟知的，并且其他实例包括：AIBN和其他偶氮化合物；过氧化苯甲酰和其他过氧化物；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮；以及樟脑醌，并且另外的光引发剂从Sigma Aldrich可得(参见：https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Aldrich/General_Information/photoinitiators.pdf)。光引发剂的浓度可以以任何合适的浓度存在，例如，相对于单体从0.05mol％至0.5mol％，优选地从0.1mol％至0.2mol％，通常0.125mol％。光引发剂通常用于使聚合能够由UV辐射引发。

其他类型的聚合引发剂是本领域熟知的，并且可以作为光引发剂的替代物(或添加物)存在。例如，用于自由基聚合的引发剂可以包括过氧化物、过硫酸盐、金属烷基(metal-alkyl)、偶氮或其他相关化合物。因此此类引发剂特别地包括热引发剂和氧化还原引发剂。合适的引发剂的实例是本领域熟知的。此类引发剂可以以任何合适的浓度存在，例如，相对于单体从0.05mol％至0.5mol％，优选地从0.1mol％至0.2mol％，通常0.125mol％。例如，过硫酸盐，例如，过硫酸铵(APS)，在二胺的存在下，例如四甲基乙二胺(TEMED)可以用作氧化还原引发剂。例如，成功地使用了相对于单体的0.125mol％。聚合也可以通过其他策略来引发，所述其他策略包括配位-插入、阴离子、阳离子、受控制自由基、开环及其他聚合技术，这取决于所选择的单体和末端官能度。

聚合物可以合适地包含氯化钠或另一种无机金属盐。这对于稳定掺入到聚合物中的DNA或其他带电的核酸探针/交联物是有用的，但当使用吗啉代或PNA脆弱探针/交联物时将通常不需要。氯化钠的浓度可以合适地是0mM至500mM，通常是约150mM。

聚合物可以合适地包含溶剂，或者可在聚合物的聚合期间使用溶剂。特别地，溶剂可以被用作将导电颗粒均匀分布在聚合物中的助剂(aid)。溶剂可以包含二甲基亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲液。溶剂可以包含相等体积的二甲基亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液可以具有任何合适的浓度，并且在一些情况下具有约1mM(毫摩尔/升)的浓度。

聚合物可以合适地是共聚物。共聚合可以是有用的，因为它允许调节最终聚合物的特性。例如，合适的共聚物可以包含丙烯酰胺和一种或更多种另外的单体(除了与核酸连接的单体以外)。一种或更多种另外的单体可以是亲水性的，或者可以是非亲水性的，条件是共聚物总体上是亲水性的。一种或更多种另外的单体可以是丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙酸乙烯酯、苯乙烯、丙烯腈和包含烯烃的单体中的一种或更多种。

优选地，聚合物按比例包含至少60mol％(更优选地至少80％，并且又更优选地至少90mol％)丙烯酰胺单体和40％或更少(更优选地20％或更少，并且又更优选地10％或更少)的另外的单体。

在一个具体实例中，聚合物可以包含丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺单体。例如，已经成功地制备了根据本发明的具有50:50、80:20和20:80比率的丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺的聚合物。

在本发明的优选的实施方案中，可膨胀生物敏感元件包含寡核苷酸交联聚合物复合材料(OCPC)。

本发明的物理电式换能器能够将可膨胀生物敏感元件中的物理变化转化为可以被检测到的电学信号或电学特性。

优选地，膨胀的物理电式换能器包括压阻式材料或电逾渗(percolating)复合材料(参见下文用于“逾渗复合材料”的定义)，压阻式材料或电逾渗复合材料由于其体积中的外部诱导的变化(例如，机械变形或化学膨胀)而能够表现出其电阻抗的变化。在其中电阻变化是待检测的特性的情况下，此类换能器可以被称为“化学阻式的(chemi-resistive)”(或者在这种情况下可能是“生物阻式的(bio-resistive)”)。可选地，可以使用其他形式的物理电式换能器，例如包含压电材料的那些。

本专利所指的物理电式换能器的优选类型通常被称为“逾渗复合材料”。在本文中，我们将该术语定义为具有以下特性的材料：包括具有不同电导率的两种或更多种离散元件的共混物；当更导电元件的有效浓度减少时，表现出电导率降低；并且在体积膨胀后表现出电导率降低。

通常，逾渗复合材料包括分散于绝缘聚合物基质(在这种情况下为可膨胀聚合物基质)内的导电颗粒(例如碳或金属粉末，如下文进一步讨论的)。在导电颗粒的低填料载量下，复合材料是电绝缘的，其中电导率(或电阻率)接近于聚合物的电导率(或电阻率)。随着导电颗粒的浓度增加，更多的颗粒变得彼此物理接触，并且电导率在狭窄的浓度范围(所谓的“逾渗阈值”)内迅速升高。然后它在高填料颗粒浓度逐渐接近金属的电导率。因此，对于此类材料，观察到电导率(电阻率)随导电颗粒载量的大致S形模式。当聚合物被机械压缩或化学膨胀时，也观察到相似的行为模式，从而聚合物的体积变化并且因此改变导电颗粒的有效浓度。

这些类型的材料通常被称为“逾渗复合材料”。这是由于“逾渗理论”首先被提出来描述此类行为模式。然而，这种模型对于许多复合材料来说过于简单，并且在低浓度不起作用，因为它预测在该区域无传导(无限电阻(infinite resistance))。当用于描述导电聚合物和非导电聚合物的共混物，并且事实上，在电导率方面具有有限的差异任何两种材料的行为时，逾渗模型也是无效的。自此“有效介质理论”已经被成功地设计出来，以提供对在导电颗粒载量的全范围内的电学行为的更精确的描述。它们也可以用于对颗粒形状和尺寸如何影响逾渗阈值进行建模。然而，一些材料仍然具有未由逾渗理论或有效介质理论良好预测的特性，并且需要对理论进一步修正。显著地，这些包括“量子隧穿复合材料(QuantumTunnelling Composite)”(或“QTC”)，其不显示填料浓度的逾渗阈值，但显示对通过压缩或膨胀的体积变化的极度敏感度，并且不依赖于相邻颗粒之间的紧密接触使得能够通过复合材料传导(而是依赖于颗粒之间的量子隧穿)。

重要的是要注意，贯穿本文件(并且事实上贯穿许多文献)，术语“逾渗复合材料”用于遵循先前描述的定义描述这些类型的材料的所有以上实例，尽管存在未严格符合逾渗理论模型的大量实例。

物理电式换能器的逾渗复合材料因此适于将可膨胀生物敏感元件的膨胀转换和/或转化为电阻抗的可测量变化。在本发明中，当可膨胀生物敏感元件膨胀时(其在适当靶分析物(例如寡核苷酸)和水(或其他合适的溶剂)的存在下发生)，逾渗复合材料的电阻变化。如早先讨论的，尽管在一些情况下在靶分析物的不存在下可以发生一些膨胀，这些膨胀少于在分析物的存在下发生的膨胀，这允许检测分析物的存在和/或量。

逾渗复合材料合适地包含优选地呈颗粒形式的导电材料(诸如金属或碳)或半导体。

逾渗复合材料优选地包含分布在可膨胀生物敏感元件中的导电颗粒。例如，可膨胀生物敏感元件的亲水性聚合物可以限定导电颗粒分布在其中的基质。导电颗粒可以被称为导电填料或导电填料颗粒。

将理解，分布在可膨胀生物敏感元件中的导电颗粒将随着可膨胀生物敏感元件膨胀和体积增加经历移动。通常，随着可膨胀生物敏感元件膨胀，导电颗粒的堆积密度(packing density)将减小，即每一个颗粒之间的间距将增加。这导致材料的电阻增加。这种电阻中的变化可以容易地检测到，例如，通过使用与可膨胀生物敏感元件连接的合适电极。

高导电颗粒材料是优选的，以使在膨胀后的电导率变化最大化。例如，如由金属或碳颗粒证明的高电导率是优选的，因为它使在可膨胀生物敏感元件膨胀后的电阻变化最大化。通常，可以使用适当尺寸的任何高导电颗粒。

逾渗复合材料优选地包含碳纳米粉末和/或碳纳米管作为导电颗粒。

可以使用多种形式的碳纳米粉末。本发明人已经发现具有少于或等于50nm的平均粒径的碳纳米粉末是非常合适的，但这不限制本发明。同样可以使用多种形式的碳纳米管。本发明人已经发现多壁且具有约10nm的外直径并且约6μm长的碳纳米管是非常合适的，但这不限制本发明。技术人员可以容易地选择可选的碳纳米粉末或纳米管材料。

逾渗复合材料可以可选地或另外地包含炭黑、镍、金、银、锌和铜颗粒中的一种或更多种。当然也可以使用其他导电金属颗粒，也可以使用其他任何合适的导电非金属颗粒，包括导电聚合物颗粒/珠。

对本领域技术人员将明显的是，可以使用以上导电颗粒材料中的两种或更多种的组合。

优选的是，导电颗粒的尺寸是亚微米的，例如，少于1000nm，优选地少于500nm，并且更优选地少于100nm。此类颗粒因其与大规模印刷工艺(诸如喷墨印刷)的更大相容性而是优选的。较小的填料颗粒还允许可膨胀生物敏感元件体积的进一步微型化(其可以允许更快的响应)，同时维持均匀的颗粒分布和良好的相关电重复性。

作为导电填料颗粒的替代，技术人员也可以使用本征导电聚合物(intrinsicallyconductive polymers)，其可以与以上提及的(绝缘)聚合物材料共混。导电聚合物填料的实例包括但不限于：聚(噻吩)(PT)、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)、聚(对亚苯基硫醚)(PPS)、聚(苯胺)(PANI)、聚(吡咯)(PPY)、聚(乙炔)(PAC)、聚(对苯撑乙烯)(PPV)以及其混合物和共混物。

在交流电(AC)电阻抗测量被用于响应的电测量(详见下文)的情况下，填料颗粒可以合适地用于调节复合材料的介电特性(以及因此其电阻和复阻抗两者)以优化对膨胀的可测量的响应。在这种情况下，可以优选的是将复合材料的阻抗降低或提高至具有最大灵敏度的区域。在这些情况下，其他电导率的填料颗粒可以是优选的，并且可以包括半导体粉末，或甚至绝缘颗粒。

本领域技术人员可以容易地从以上列出的那些中选择适当导电材料。此外，技术人员可以提供适当量的导电材料以在生物传感器中实现期望的逾渗特性，即当聚合物在靶分析物的存在下膨胀时阻抗的适当变化。提供关于可膨胀聚合物与导电颗粒的相对比例的约束性一般规则既不可能也不必要，因为其将随情况而改变。然而，对于技术人员来说，优化任何给定的系统将是一件简单的事情。

导电颗粒的比例优选地使得在膨胀之前，复合材料高于逾渗阈值，并且因此处于最大导电状态。然后，在膨胀已经发生之后，复合材料将变成非逾渗的并且处于最低导电状态。通过在接近该‘逾渗阈值’的值处负载导电粉末，传感器的灵敏度被最大化。(逾渗曲线具有S形形状，并且因此在逾渗阈值处电阻非常剧烈地变化)。

然而，在一些情况下，可能优选的是选择具有稍微更远离逾渗阈值的初始状态，使得由单独的溶剂(即不存在靶分析物)的初始(假阳性)膨胀对电阻具有最小影响。然后在靶分析物的存在下的另外触发的膨胀以及所得交联物裂解将推动复合材料超过逾渗阈值以用于检测。

在任一种情况下，传感器应该在临暴露于靶分析物之前处于稍微高于逾渗阈值的填料体积分数。然后暴露使复合材料膨胀，将体积分数改变至低于逾渗阈值的值。

逾渗阈值浓度在文献中被很好地理解，并且由颗粒尺寸、形状和纵横比确定。

因此逾渗阈值提供了一种固有地放大由膨胀(即体积的增加)引起的电阻的变化的方便机制。本发明的生物传感器被合适地适配，使得在核酸交联物裂解后聚合物的膨胀导致导电颗粒材料的体积分数在逾渗阈值内或跨越逾渗阈值(或跨越逾渗阈值的至少一部分)的变化。可以容易地确定导电颗粒材料和聚合物的任何组合的逾渗阈值。

本发明的生物传感器通常包括基底，所述基底合适地包含电极，以允许检测和/或测量由于可膨胀生物敏感元件的膨胀导致的所述生物传感器的电学信号或电学特性中的变化。

可以使用任何合适的电极系统。本发明人已经发现叉指式电极(interdigitatedelectrode)(IDE)是特别合适的。电极可以在硅基底，例如硅晶片上提供。此类电极的制造可以使用标准的光刻程序进行，即将金属电极图案化到硅基底上。

在本发明的一个示例性实施方案中，电极包括在二氧化硅(SiO₂)基底上制造的铂IDE。例如由钛形成的粘附层也可以用于辅助铂与SiO₂的粘附。在另一个示例性实施方案中，金电极可以被图案化到玻璃基底上。将明显的是，可以使用许多其他合适的电极系统，并且通常合适的是具有导电的图案化电极的任何绝缘材料。对于许多应用，可以优选的是电极是一次性的且成本低，可能由塑料或纸基底组成，用印刷的金属、碳或导电墨水电极图案化；此类电极是本领域已知的。

合适地，电极的活性区域被可膨胀生物敏感元件(例如OCPC)完全覆盖。

在一些实施方案中，基底在其中可膨胀生物敏感元件将要用剂沉积的区域中至少部分地被表面改性，以增强可膨胀生物敏感元件与基底和/或电极的粘附。基底可以，例如，用甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯合适地甲硅烷化。当使用玻璃或硅基底时，甲硅烷化(Silanisation)是特别有用的。

合适地，本发明的生物传感器是单次使用的物品。

根据本发明的第二方面，提供了一种在基底上的根据本发明的生物传感器的阵列。这允许在单个阵列上并行执行多个感测操作的执行。

阵列中的生物传感器可以被配置为检测多种靶分析物，和/或可以被配置为针对同一靶进行多于一个并行检测(即，多个重复)。清楚地期望检测几个不同的靶以有效地筛选多个靶，并且可以期望多个重复以增加统计显著性/置信度或消除噪音。

也可以使用多个重复获得有关靶浓度的定量信息。这通过改变几个不同传感器之间的交联密度、但在每一个传感器中使用相同的探针来实现。这组传感器的差别响应量级和差别时间响应(differential temporal response)将然后使得能够获得关于靶物类的相对丰度的定量信息。

也可以采用多种传感器用于改进选择性，每一个传感器对于单个特定靶具有不同程度的靶-探针重叠/匹配。这将有助于鉴定和忽略来自感测事件的假阳性响应的情况，其中由探针与靶结合引起能量上更有利状态，然而探针和靶仍然不是100％匹配的。

合适地，阵列包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10或更多个生物传感器。然而，阵列上可以提供的生物传感器的数目不存在有效限制，并且因此阵列可以合适地包括20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、或者500个或更多个生物传感器。阵列可以潜在地被配置为检测临床或研究意义的一小组或一大组miRNA。例如，阵列可以包含指示特定疾病(即用于诊断)或疾病状态(即用于分类(stratification)或用于治疗监测)的几种miRNA。可选地，阵列可以包含非常宽范围的miRNA，用于多种疾病的多重筛选。

基底合适地包含合适的电极以与生物传感器的每一个相互作用。

在第三方面，本发明提供了一种生物传感器装置，所述生物传感器装置包括根据本发明的第一或第二方面的生物传感器或阵列，所述生物传感器或阵列与适于检测和/或定量来自生物传感器的电指示物的测量设备连接。

测量设备可以适于测量来自生物传感器的阻抗的变化(例如使用欧姆计)或电学信号(通常电压(例如使用电压计))。合适的灵敏的计量设备是本领域熟知的。

生物传感器装置可以合适地包括样品接收容器以接收待分析的样品。生物传感器或阵列适于被暴露于容器中的样品。

根据本发明的第四方面，提供了一种用于检测样品中靶的存在或量的方法，所述方法包括：

a)提供根据本发明的第一方面的生物传感器或根据本发明的第二方面的阵列；

b)将所述生物传感器暴露于所述样品；

c)观察由于暴露于所述样品而导致的所述生物传感器中的电学信号或电学特性的变化；

d)任选地确定所述变化的量级；和/或

e)任选地确定所述变化的速度；以及

f)由此确定所述样品中所述靶的存在和/或量。

当使用适配体探针时，靶可以是核酸或任何其他合适的靶。

优选地，该方法用于检测生物样品中的靶(例如寡核苷酸，诸如miRNA)。然而，该方法可以适于其中靶可能存在的任何合适的样品。优选地，样品是水性的。

该方法可以包括从受试者获得样品的步骤，或者它可以在预先获得的样品上执行。

优选地，在从受试者获得样品的情况下，受试者是哺乳动物；更优选地，受试者是人类。

合适地，该方法用于检测样品中的多于一个靶分析物。例如，可以在单一方法中检测多个核酸(例如，miRNA)，可以检测多个非核酸，或者可以检测核酸和非核酸的组合。这通常需要使用适于检测不同靶的多个生物传感器。

该方法合适地是诊断方法，并且它可以用于辅助诊断医学状况和/或为受试者选择适当的疗法。

可选地，该方法可以用于监测恢复或对治疗剂的响应。

在本发明的第五方面，提供了一种产生生物传感器的方法，所述方法包括：

a)制备可膨胀生物敏感元件，所述可膨胀生物敏感元件包含核酸探针；和

b)使物理电式换能器与所述可膨胀生物敏感元件相关联。

在优选的实施方案中，可膨胀生物敏感元件包含可膨胀聚合物，合适地亲水性聚合物，例如水凝胶。以上列出了特别优选的聚合物和共聚物，以及用于其形成的相关单体。因此，该方法合适地包括提供合适的单体以形成可膨胀聚合物(例如丙烯酰胺单体)并且使所述单体聚合以形成聚合物可膨胀生物敏感元件。

该方法优选地包括提供核酸交联单体并且将所述核酸交联单体整合到聚合物中。合适地，核酸交联单体包含与acrydite连接的核酸。优选地，该方法包括使对应的核酸交联单体退火，然后整合到可膨胀聚合物中。以上讨论了合适的核酸交联单体，并且其他对于技术人员将是明显的。

合适地，该方法包括提供非脆弱交联物并且将所述非脆弱交联物整合到聚合物中。合适的非脆弱交联物是本领域熟知的，并且以上讨论了一些，而其他的对技术人员将是明显的。

因此，该方法合适地包括提供合适的单体以形成可膨胀聚合物基质(例如丙烯酰胺单体)，提供核酸交联单体，任选地提供非脆弱交联物，并且引起单体和任选地非脆弱交联物聚合，从而形成包含脆弱核酸交联的可膨胀聚合物。

单体的聚合可以通过提供聚合引发剂和通过应用合适的条件例如通过光引发、热引发等引发聚合来合适地实现。合适的引发剂是本领域熟知的，并且以上讨论了实例。

优选地，该方法包括提供导电颗粒并且将所述导电颗粒分布在可膨胀生物敏感元件中，优选地形成逾渗复合材料。例如，导电颗粒在单体聚合形成可膨胀聚合物之前适当地与单体混合。以上讨论了合适的导电颗粒，也讨论了逾渗复合材料的优选的特性。

因此，该方法合适地包括：

-提供合适的单体以形成可膨胀聚合物，

-提供核酸交联单体，

-提供导电颗粒，

-任选地提供非脆弱交联物，

-将以上提及的混合在一起，以及

-使单体和任选地非脆弱交联物聚合，

从而形成具有相关联的物理电式换能器的包含脆弱核酸交联的可膨胀聚合物。优选地，该方法产生逾渗复合材料。

合适地，该方法包括以下步骤：提供包含电极的基底，并且用可膨胀生物敏感元件和相关联的物理电式换能器覆盖所述基底上的电极。合适地，可膨胀生物敏感元件是聚合物，并且该方法包括使合适的单体和任选地交联物聚合以在基底上原位形成聚合物。

本发明的第一方面的任选的特征可以被并入到本发明的第二、第三、第四、和第五方面中，反之亦然。

现在将仅通过示例并参考附图来描述本发明的实施方案，在附图中：

-图1是根据本发明的一个方面的生物传感器的示意性图；

-图2是制造的微电极芯片的图像；

-图3是电极的制造步骤的示意性图；

-图4是寡核苷酸官能化水凝胶的膨胀响应的示意性图；

-图5是电路图的示意性图；

-图6是电导(即1/电阻)随着导电填料的体积分数被改变如何改变的图(即，它显示特定复合材料的逾渗阈值)；

-图7是OCPC的电阻的图；

-图8示出了包含丙烯酰胺(AAm)单体以及N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和AAm的50/50共聚物的OCPC中的膨胀的比较；

-图9是包含适配体脆弱交联的OCPC的示意图。DNA适配体与腺苷结合。使用了两种方法，如该图的上图和下图中呈现的；

-图10是显示包含适配体的OCPC的膨胀的图。该图示出了根据方法2，即包含SEQID NO:12和SEQ ID NO:11的适配体OCPC。测试分析物是在1mM PBS和300mM NaCl中的2mM腺苷。缓冲液是1mM PBS和300mM NaCl；

-图11是显示包含与基于DNA的脆弱交联物相比以不同方式(乙基-和戊基-连接的)与聚合物主链连接的基于吗啉代的脆弱交联物的OCPC膨胀结果的图；

-图12是显示包含吗啉代对比DNA传感链和阻断物链的OCPC和包含吗啉代传感链和DNA阻断物链的杂合体的盐敏感度的图；以及

-图13示出了不使用DMSO产生的OCPC的电阻的图。

下文描述示例性生物传感器的结构和制造。

电极

生物传感器包括叉指式电极(IDE)。电极的制造使用标准的光刻程序进行，将金属电极图案化到硅基底上，如下文描述的。图1是电极10的示意性表示。电极10可以被称为电极芯片。区域12是铂(Pt)，区域14是二氧化硅(SiO₂)。加圆圈的区域16示出叉指式电极18。总计存在30个指状物(finger)(为了清楚起见，并未示出所有)。

图2示出了在硅基底214上制造的微电极芯片210。还示出了沉积有寡核苷酸交联聚合物复合材料(OCPC)211的芯片210a。示出了5便士硬币220用于尺寸参考。

电极310的制造步骤示于图3中。相关的制造技术是本领域熟知的。所使用的电极310是在二氧化硅(SiO₂)上制造的铂(Pt)IDE。芯片被设计为使得IDE将被OCPC的液滴完全覆盖，并且因此IDE阵列跨越1.5mm×1.46mm。IDE中总计存在30个指状物，彼此相距40μm，每一个指状物的宽度是10μm(如图1中示出的)。

电极310在100mm硅晶片340上制造。将这些在1100℃经历(put through)湿式氧化炉持续40分钟，以便产生约500nm的SiO₂层342。在此之后，将晶片340置于桶灰(barrel-ash)中持续一小时，以便从表面去除任何痕量的水分(30分钟是已经成功地使用的另一个合适的时间段)。

在使绝缘的SiO₂层342在硅晶片340上生长之后，一层光刻胶344被淀积。然后将晶片通过光刻掩模348暴露于UV光346。然后使光刻胶344显影，并且将钛350蒸发到晶片上。然后将铂352蒸发到晶片上并且执行剥离工艺，仅留下期望的图案360。

在沉积光刻胶之前，用六二甲基硅氧烷(hexadimethylsiloxane)(HMDS)将晶片打底(prime)约10分钟以改进光刻胶与SiO₂表面的粘附。所使用的光刻胶是AZNLof 2070-3.5，并且它使用Polos旋涂器(Spinner)以以下旋转谱以约3.5μm的厚度沉积：700转/分钟(rpm)持续5秒，随后是3000rpm持续45秒，具有1000rpm/s的加速度。在光刻胶沉积之后，将晶片在100℃的热板上软烘烤5分钟以去除任何剩余的溶剂。

然后将光刻胶涂覆的晶片使用Karl Suss掩模对准器和以上提及的掩模在硬接触下暴露于紫外线(UV)辐射持续30秒(图3-C)。在暴露之后，将晶片转移至热板上，在115℃反向烘烤(reverse-bake)持续1分钟。然后将晶片置于AZ726显影剂溶液中1分钟，然后转移至新鲜批次的显影剂中持续另外1分钟(图3-D)。

然后使用电子束蒸发器将金属沉积在晶片上。将钛(Ti)以10nm的厚度沉积(图3-E)以充当粘附层，并且将Pt以100nm的厚度沉积在顶部(图3-F)(50nm是已经成功地使用的沉积层的另一厚度)。在此之后，通过将晶片在50℃在NMR 1150中浸渍持续1小时，然后将其转移至新鲜批次的NMR 1150(同样在50℃)持续另外1小时执行剥离工艺(图3-G)。然后将晶片在异丙醇(IPA)中浸渍持续15-20分钟，然后用去离子(DI)水冲洗。在剥离步骤之后，然后将晶片切割为单独的芯片。

为了改进当电极表面膨胀时OCPC对电极表面的粘附性，将电极用甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯甲硅烷化，以便将聚合物化学结合至基底上。为了实现这个目的，将电极在0.01M盐酸(HCl)中浸渍持续15分钟以初始化SiO₂基底。然后将它们取出，用DI水冲洗并且允许其干燥。在此之后，将电极在0.02M的甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯的溶液中浸渍1小时。在此之后，将它们取出，用DI水冲洗并且允许其干燥。在执行该工艺之后，现在键合至基底表面的甲基丙烯酸酯基团将参与聚合反应，将聚合物共价结合至基底表面。

OCPC沉积和聚合

为了将OCPC沉积在叉指式电极(IDE)上和/或使所得混合物聚合，将在2μL与5μL之间的小体积的OCPC溶液移液到IDE上，使得溶液完全覆盖电极。然后使用Dymax Bluewave75UV源将溶液暴露于UV辐射持续60秒。所得的自由基聚合将导致OCPC覆盖IDE。

使用微量移液管手动进行OCPC沉积。然而，这可以使用能够以更小(例如纳升(nL))沉积的机器人注射器分配技术容易地自动化。也可以使用基于液体或聚合物的沉积技术。这些技术包括但不限于，喷墨印刷、丝网印刷和卷对卷印刷(roll-to-rollprinting)。

参数诸如电极尺寸、间距、图案和定向可以被改变以优化电极特性。这可以改进电学测量，例如通过改进信噪比。设想的IDE修改类型的具体实例包括：

■减小IDE尺寸以允许使用更小的复合材料液滴(允许更快的响应时间和/或改进电信噪比(electrical signal to noise ratios))。

■创建图案化的IDE阵列，用于单个芯片上的多个传感器。

■修改芯片设计以包括钝化层，更复杂的几何形状或芯片上微流体递送。

■用于芯片制造的可选的低成本和一次性材料，例如纸、塑料。

■丝网印刷电极(例如碳)、导电墨水的卷对卷印刷和/或喷墨印刷。

聚合物

所使用的基础聚合物是聚丙烯酰胺水凝胶，其由单体(丙烯酰胺，按重量计15％)和标准交联物(N,N'-亚甲基-双丙烯酰胺)组成，其中浓度可以被改变以根据需要调节所得水凝胶的物理特性(通常范围在关于单体的0.2mol％与2.0mol％之间)。向其中添加光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)和氯化钠(NaCl,150mM)。光引发剂用于使聚合能够通过UV辐射引发，并且NaCl将稳定整合到聚合物中的任何寡核苷酸。用于水凝胶的溶剂可以是二甲基亚砜(DMSO)和1mM磷酸盐缓冲液的等量混合物。用于制备这些水凝胶的确切方法根据所使用的导电组分而变化(这种方法由[1]改编)。在另外的实验工作中，已经发现可以从方法中省略DMSO而没有不利影响，并且事实上DMSO的省略已经成为标准方法(图13示出了实验的图，其中重复本文描述方法但不使用DMSO)。然而，在一些情况下，充当分散的助剂的溶剂可以是有益的。

然而，寡核苷酸交联的水凝胶可以由任何亲水性聚合物构成，所述任何亲水性聚合物包括，但不限于，聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(乙烯醇)；聚(乙二醇)；聚(N,N'-二烷基丙烯酰胺)；聚(2-羟丙基(甲基)丙烯酸酯)；聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)；和聚(二(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)。

在每一种情况下，水凝胶可以通过主要单体与次要单体的共聚合进一步调节。该单体不必是亲水性的，并且可以包括形成以上提及的聚合物的单体，并且也可以包括任何其他丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙酸乙烯酯、苯乙烯、丙烯腈和其他此类包含烯烃的单体。该材料的组成通常将包含较小分数的该次要单体(＜10％)。

导电填料

当逾渗复合材料包含碳纳米粉末时，该预凝胶(pre-gel)混合物然后被添加至所期望质量的碳纳米粉末中，并且以脉冲模式使用设置为60％振幅的500W声探头通过高功率超声处理(10秒开、15秒关)持续12分15秒，将纳米粉末分散于溶液内。这种超声处理间接发生，意指超声波发生器用于超声处理水浴，并且将复合材料混合物置于该浴中紧密接近探头尖端处。在已经成功地进行的另一个实例中，将样品悬浮于低功率超声水浴中。又在另一个成功的实例中，样品通过手动简单地搅动持续5分钟。

当逾渗复合材料包含碳纳米管时，碳纳米管合适地是多壁的10nm×6μm。将期望的重量，通常2mg/ml和潜在更少的纳米管通过低功率超声处理分散于DMSO和1mM磷酸盐缓冲液的等量混合物中。将混合物在超声浴(约12W)中超声处理持续8-24小时。为了辅助分散，以碳重量的十倍添加表面活性剂(十二烷基苯磺酸钠)(由参考文献[2]改编的方法)。在超声处理之后，将纳米管悬浮液添加至所需质量的单体、交联物、光引发剂和NaCl的干燥混合物中，以制备所期望浓度的预凝胶/纳米管悬浮液溶液。

学术文献提供了许多使用其他导电填料粉末与绝缘聚合物组合使用的实例，以制备具有电阻随体积变化而变化的相似特性的逾渗复合材料(即压阻式复合材料)。通常参考的实例(其可以容易地整合(如果期望的话))包括炭黑、镍、金、银、锌、铜等。高导电填料是优选的以使在膨胀后的电阻变化最大化。先前的大部分文献都集中在微米级的粉末上，因为它们的成本低且易于购买。然而，对于未来的低成本传感器，纳米级粉末因其与大规模印刷工艺(诸如喷墨印刷)的更大相容性而是优选的。较小的填料颗粒还允许传感器体积的进一步微型化(用于更快的响应)，同时维持均匀的颗粒分布和良好的相关电重复性。

作为金属填料颗粒的替代，人们也可以使用本征导电聚合物，其可以与以上提及的绝缘(感测)聚合物材料共混。导电聚合物填料的实例包括但不限于：聚(噻吩)(PT)、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT)、聚(对亚苯基硫醚)(PPS)、聚(苯胺)(PANI)、聚(吡咯)(PPY)、聚(乙炔)(PAC)、聚(对苯撑乙烯)(PPV)以及其混合物和共混物。

在其中交流电(AC)电阻抗测量被用于响应的电学测量(详见下文)的情况下，填料颗粒可以用于调节复合材料的介电特性(以及因此其电阻和复阻抗两者)以优化对膨胀的可测量的响应。在这种情况下，可以优选的是将复合材料的阻抗降低或提高至具有最大灵敏度的区域。在这些情况下，其他电导率的填料颗粒可以是优选的，并且可以包括半导体粉末，或甚至绝缘颗粒。

寡核苷酸交联物

通过添加脆弱的、基于寡核苷酸的交联物将水凝胶官能化。这些交联物由两个寡核苷酸序列组成，每一个寡核苷酸序列在其5′末端用可聚合化学改性剂Acrydite(一种参与聚合反应的丙烯酰胺衍生物)封端(图4)，从而将寡核苷酸锚定至水凝胶网络上。寡核苷酸被设计为使得它们彼此部分地互补以使它们将杂交并且形成交联，并且在其末端提供有acrydite分子(图4)。在引入与两条交联链之一完全互补的核苷酸链后，该链将优先与其匹配链杂交，因此破坏交联。该过程导致交联密度的变化，这将影响水凝胶的膨胀特性。这种膨胀变化可以通过分析所得复合材料的电学特性来转换。

用于在交联物中使用的所有官能化的寡核苷酸序列以及作为靶和对照的序列源自整合DNA技术。将寡核苷酸靶设计为miRNA mir-92a的DNA类似物。这因其作为证实的白血病生物标志物的相关性而被选择，但可以选择任何序列或miRNA，。探针链(也被称为“传感器链”)被设计为与靶序列完全互补。使用定制的MatLab算法，阻断物序列被设计为使得前10个碱基(从5′末端)具有随机序列，并且剩余12个碱基与传感器链的最后12个碱基完全互补，如图4中示出的。随机序列被设计为充当对照。以上描述的所有核酸链的序列示于下文表1中。“Acr”表示Acrydite部分。

表1

链	序列(5’-3’)
		传感器	Acr-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA(SEQ ID NO 1)
阻断物	Acr-TAGTGCGTTTTATTGCACTTGT(SEQ ID NO 2)
		靶	TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT(SEQ ID NO 3)
随机对照	ACGTCTAGACGTAACGAAGGTC(SEQ ID NO 4)

为了将寡核苷酸交联物掺入到聚合物复合材料中，将探针和阻断物官能化的寡核苷酸以期望浓度在1mM磷酸盐缓冲液中混合在一起(并且合适地加热至95℃持续2分钟，然后冷却至室温)，然后使用标准乙醇沉淀从溶液中提取，留下干燥的官能化的寡核苷酸。向其添加适当体积的预凝胶溶液/纳米颗粒悬浮液并且放置约3小时以允许寡核苷酸完全溶解并杂交。(在碳纳米粉末的情况下，使用与之前描述相同的方法将所得混合物振荡或超声处理，以重悬纳米粉末，其在三小时期间通常会从悬浮液中析出)。

最终的复合材料水凝胶通过由光诱导原位生成的自由基引发的自由基聚合制备。该自由基聚合也可以由过氧化物、金属-烷基、偶氮或其他相关化合物的通过热或光诱导的自由基形成而引发。可选地，水凝胶可以通过其他策略形成，所述其他策略包括配位-插入、阴离子、阳离子、受控制自由基、开环及其他聚合技术，这取决于所选择的单体和末端官能度。

图4示出了在引入靶核酸后寡核苷酸交联水凝胶的膨胀响应。如可以观察到的，探针(感测)链472和阻断链474形成部分地互补的寡核苷酸交联。在引入靶核酸476后，当靶核酸476与感测链472优先杂交时，交联被裂解。这引起聚合物的交联密度降低，因此允许聚合物478膨胀480。还示出了交联物的核酸序列所连接的化学改性剂acrydite 482。

电测量

DC电阻测量以2个末端电阻模式使用Keithley 2000万用表执行，以测量IDE上OCPC的电阻。该技术用于测量当OCPC在干燥状态(在环境室内条件)与饱和状态(在磷酸盐缓冲溶液中平衡)之间移动时发生的电阻的变化。传感器响应可以以多种方式进行测量。可以在有靶寡核苷酸的存在的饱和状态和没有靶寡核苷酸的存在的饱和状态(即，生物传感器预膨胀的位置)之间或在干燥状态与饱和状态之间进行比较。这些方法之间的选择将取决于传感器性能和实际使用的环境方面。

定制的电流源(图5)也用于供应1.11μA的恒定电流，并且万用表用于测量DC电压。图5示出了电流源的电路图590。R_C是5.1MΩ电阻器，R_L是在测试下的OCPC电极。运算放大器是LM 741CN。所得输出电流经由校准被确定为1.11μA。电阻由这两个信息推断出。选择低电流以使不想要的作用最小化，诸如焦耳加热或空间电荷限制电流，这可以引起传感器响应中的漂移。恒定电流也是优选的，以避免由这些类型的复合材料的非线性电流-电压特性(非欧姆行为)引起的电阻测量不准确性。

可选的/未来的电测量技术：

-AC阻抗测量：当前正在进行研究，以确定复杂电阻抗(即电容和/或电感)的AC测量与DC电阻测量相比是否为测量传感器响应提供了益处。该技术被假设为消除来自竞争性离子传导机制的贡献。

-AC阻抗谱学方法(或自谐振频率(SRF)测量)被充分记载并且也可以被使用。复杂的等同电路通过电极与聚合物(以及还与分布在其内的导电颗粒)的电容性连接形成。该电路的谐振频率在聚合物膨胀后将变化，并且可以被用作灵敏的检测方法。

-模式识别软件和技术诸如主成分分析(PCA)已经广泛用于电子鼻技术，以帮助提供对复杂香味的高度特异性识别。在本发明中也设想了相似的方法，其中多个miRNA使用多个OCPC传感器在单个一次性芯片上被检测，每一个传感器靶向不同的寡核苷酸序列。疾病状态的检测和诊断将是很可能处于不同的浓度的多个生物标志物的复杂组合。装置的使用者将不必具有解释来自单独传感器的单独的miRNA信号的数据的知识或技能，并且因此模式识别将被用于将原始数据转化为有用的诊断。随着未来医学研究取得的进展，用于比较和识别生物标志物模式的算法和文库将被更新至装置，使其能够不断地改进其性能。

-芯片上集成：以上的电子和软件技术均可以与OCPC传感器本身使用先进的(例如CMOS)微电子制造技术可行地集成在芯片上，并且因此可以被集成到宽范围的电学诊断装置中。然而，由于OCPC的一次性和不可逆的响应，可能更有可能的是开发包含电测量电路并且一次性传感器芯片被插入到其中的单独的询问模块。

感测和其他结果

图6示出了具有0.8mol％的双丙烯酰胺交联密度(没有任何寡核苷酸交联物)的聚丙烯酰胺中碳纳米粉末的逾渗曲线。它示出了OCPC的电导率如何随着纳米颗粒浓度而改变和发生逾渗的浓度。恰好高于逾渗阈值，复合材料将对由膨胀发生的体积中的任何变化最为敏感。当在环境条件将复合材料在空气中干燥时进行这些测量，并且这些测量使用万用表以2个末端电阻模式进行。电导在碳粉的临界体积载量的急剧变化为聚合物膨胀提供了增强的电转换。

图7示出了在10μM寡核苷酸溶液中浸渍后，OCPC的电阻如何随时间变化。以圆圈和三角形(情况1和情况2)表示的数据集显示在包含互补分析物链的溶液中浸渍的OCPC的电阻变化的单独重复。用正方形表示的数据集显示在包含随机寡核苷酸链的对照溶液中浸渍的OCPC的电阻。可以观察到，与对照溶液相比，OCPC在分析物溶液中的膨胀行为存在明显差异。特别地，我们注意到阳性与阴性情况(positive and negative instances)之间的膨胀响应速率存在差异，这可以用来提供区别。人们可以简单地测量达到预定膨胀量所需的时间(电阻值)，或比较OCPC响应之间的其他时间特征。可选地，人们可以在指定时间(在这种情况下约200s)之后简单地测量电阻，并且比较该时间点处的电阻值。在传感器的一些实施方案中，人们还可以能够比较多种OCPC之间的最终饱和状态和完全膨胀状态中的差异，尽管这个特定的实例显示在所有3种情况下最终的膨胀状态是相似的。

这些结果清楚地证明根据本发明的生物传感器可以成功地检测样品中的寡核苷酸。当然，生物传感器将可能受益于进一步的优化，但本发明的实用性和前景已经被清楚地证明。

适配体序列在聚合物基质中的整合

核酸适配体可以使用与以上对于miRNA靶向核酸探针描述的类似方法来引入。

适配体序列从多种商业来源可得，并且在文献中广泛描述。例如，Base PairBiotechnologies,Inc.出售针对蛋白、细胞表面、肽和小分子靶的经过验证的适配体(参见http://www.basepairbio.com/project-phases-2/existing-aptamers/)。

对于本实例，我们将参考靶向氨苄青霉素的适配体探针，但可以容易地使用针对其他靶的适配体。

商购可得的氨苄青霉素适配体，被称为氨苄青霉素适配体5E01#284，从Base PairBiotechnologies,Inc.可获得(参见http://www.basepairbio.com/wp-content/uploads/2013/04/Ampicillin-ATW0001-284-datasheet.pdf)。文献中描述了针对氨苄青霉素的几个其他适配体序列，包括5'-CACGGCATGGTGGGCGTCGTG-3'(SEQ ID NO 5),5'-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3'(SEQ ID NO 6)、和5'-TTAGTTGGGGTTCAGTTGG-3'(SEQ ID NO 7)。

为了将适配体序列与可聚合单体组合，使伯胺官能化氨苄青霉素适配体序列，例如NH₂(5’-CACGGCATGGTGGGCGTCGTG-3’)、NH₂(5’-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’)或NH₂(5’-TTAGTTGGGGTTCAGTTGG-3’)与丙烯酰氯或丙烯酰溴反应，得到丙烯酰胺封端的寡核苷酸序列(即CH2＝CHN(＝O)-序列)。这产生了与以上讨论的acrydite改性的序列基本等同的单体。在一些情况下，可以在丙烯酰胺与适配体序列之间提供间隔物序列(例如长度是从1个至20个核苷酸)。

使用以上描述的方法将该序列与不良匹配的阻断链一起掺入到可膨胀聚合物中以形成脆弱交联。靶(即在此情况下是氨苄青霉素)的结合裂解交联，允许增加的水凝胶膨胀。

在可选的方法中，使用早先描述的方法将适于与适配体序列杂交的两个阻断物寡核苷酸链整合到聚合物中。将适配体序列(现在未官能化)添加至聚合物中，并且杂交至并桥接这两个阻断物链，形成部分匹配(例如每一侧～10个碱基对)。靶化合物(即氨苄青霉素)的存在导致适配体序列从三部分交联中解离，允许增加的膨胀和转换响应。

在可选的方法中，以类似于以上讨论的使寡核苷酸官能化的方式通过将氨苄青霉素的胺(NH₂)官能化使氨苄青霉素整合到聚合物中。任选地，使用短间隔物链将氨苄青霉素与聚合物主链隔开(例如长度为10个或更少个碳的间隔物，产生(CH₂)_nNHCOCH＝CH₂-其中n＝0至10)。

Yang等[29]描述了将适配体整合到水凝胶中的进一步详细内容。

可以进行修改和改进而不偏离本发明的范围。例如，可选的转换机制也是可能的。这些包括多种基于微机电系统(MEMS)的方法，其可以与聚合物组合使用。

进一步例证

实施例1—使用丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺单体的另外的聚合物

使用不同量的丙烯酰胺单体，并且使用丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺单体的组合来产生其他聚合物变体。使用的方法一般如以上描述，除非其中另外指明。

除非另外陈述，所有样品均在具有NaCl浓度为150mM的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(1mM)中制备。单体/预胶凝剂(pre-gelator)溶液由丙烯酰胺(AAm)；和用于共聚物凝胶的N-异丙基丙烯酰胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(Bis-AAm)和1-羟基环己基苯基甲酮(在乙二醇中)的储备溶液来制备。混合这些储备液，得到最终浓度分别为10wt％或15wt％总单体、0.6mol％交联物和0.13mol％引发剂。然后将储备液移液到包含DNA的1.5mL Eppendorf离心管中，得到0.4mol％的最终寡核苷酸浓度。

图8示出了与随机对照链(SEQ.ID:4)相比，在分析物链(SEQ.ID:3)的存在下，聚合物和共聚物凝胶(10wt％)的选择性膨胀。观察到由于寡核苷酸交联被分析物链裂解而引起的膨胀的较大增加。观察到由于N-异丙基丙烯酰胺的降低的亲水性而引起的50:50共聚物凝胶稍微降低的总体膨胀。

产生以下变化：

1.在10wt％、15wt％、20wt％或25wt％的AAm凝胶

●关于AAM 0.4mol％、0.6mol％、0.8mol％、1.0mol％和1.2mol％Bis

●以克对克基础(on a gram for gram basis)使用PDA(哌嗪二丙烯酰胺)而不是Bis

2.具有在10wt％或15wt％的DNA的AAm凝胶

●关于AAM 0-1mol％Bis

●关于AAM 0.1-2mol％DNA

●关于AAM通常0.6mol％Bis、0.4mol％DNA

3.在10wt％和15wt％的50:50AAm/NIPAAm凝胶，以及80:20和20:80AAm/NIPAAm凝胶(15wt％)。所有制备的样品具有和不具有DNA交联(0.6mol％Bis具有或不具有0.4mol％DNA)

所有这些变体均在其预期的目的方面显示出令人满意的表现，尽管每一个变体的单独特性当然是不同的，并且将适于不同的用途。

实施例2—基于适配体的脆弱交联物

使用基于Yang等[29]的方法，使用基于适配体的交联物产生聚合物。在该实施例中，使用了两种不同的使用选择性结合腺苷的适配体的方法。这两种方法示意性地示于图9中，并且在下文进行描述。适配体具有序列5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’(SEQ IDNO:8)。

方法1：

在方法1中，将两条核酸链与聚合物连接(被称为阻断链1和2)，并且提供包含适配体序列的‘感测’核酸链作为第三序列，所述第三链适于与两条阻断链结合。因此，两条阻断链与感测链组合形成脆弱交联物。

包含感测链的适配体具有序列5’ACTCATCTGTGAAGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’(SEQ ID NO:9)–实际的适配体序列加下划线。

-阻断链1具有序列5’-TGAGTAGACACT-3’(SEQ ID NO:10)，其与感测链的5'末端互补。

-阻断链2具有序列5’-TCTCTTGGACCC-3’(SEQ ID NO:11)，其与在被阻断链1结合的区域的紧接的(immediately)3'区域中的感测链及适配体序列的5’末端的前7个碱基互补。阻断链2实际上阻断了适配体序列的活性区域。

如在图9中可以观察到，当腺苷被引入到样品中时，感测链结合腺苷并被从阻断链2释放，因此裂解脆弱交联物。感测链保持与阻断链1结合。聚合物因此能够在样品的存在下膨胀，因此产生可检测的信号。

干燥寡核苷酸交联如先前描述来制备，使用异丙醇而不是乙醇。使用300mM NaCl而不是150mM NaCl，由上文针对AAm凝胶描述的储备溶液和方法来制备具有适配体交联(关于AAm 0.6mol％bis和0.4mol％适配体)的AAm(10wt％和15wt％)凝胶。与缓冲液相比，响应于2mM腺苷溶液获得选择性膨胀。

方法2：

在方法2中，将包含感测适配体的链和对应的阻断链两者与聚合物连接。因此，在方法2中不存在第三条链，而是阻断链和感测链一起形成脆弱交联物。

-包含适配体的‘感测链’具有序列5’AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’(SEQ ID NO:12)–实际的适配体序列加下划线。

-阻断链具有序列5’-TCTCTTGGACCG-3’(SEQ ID NO:11)，其与从感测链的5’末端延伸至适配体链的第七个碱基的区域互补。

如在图9中可以观察到，当腺苷被引入到样品中时，感测链与两个腺苷分子结合并且被从阻断链释放，因此裂解脆弱交联物。聚合物能够在样品的存在下膨胀，因此产生可检测的信号。

干燥寡核苷酸交联如先前描述来制备，使用异丙醇而不是乙醇。使用300mM NaCl而不是150mM NaCl，由上文针对AAm凝胶描述的储备溶液和方法来制备具有适配体交联(关于AAM 0.6mol％bis和0.4mol％适配体)的AAm(10wt％和15wt％)凝胶。与缓冲液相比，响应于2mM腺苷溶液获得选择性膨胀(图10)。膨胀体积低于先前的适配体交联凝胶。

实施例3—吗啉代脆弱交联物

如下文反应中示出的，将吗啉代官能化掺入到聚合物框架中。

将分别具有与SEQ ID NO:1和2相同的序列、但Acrydite基团用伯胺代替的‘传感器/阻断物’吗啉代寡核苷酸材料(在伯胺与寡核苷酸序列之间具有乙基接头)溶解于在圆底烧瓶中的蒸馏水(以1mM的浓度)中并且添加2摩尔当量的N-琥珀酰亚胺基丙烯酸酯水性溶液。将其在室温搅拌～20小时。进行MALDI-ToF光谱学以确定产物形成。在冷冻干燥之后，将产物用过量的热(～50℃)乙酸乙酯洗涤以去除琥珀酰亚胺，并且然后冷冻干燥，以得到丙烯酰胺官能化产物。

所有凝胶样品均由上文针对聚合物和共聚物凝胶描述的储备溶液和方法制备，但然后将单体/预凝胶剂溶液添加至包含改性的吗啉代传感器和阻断物链的Eppendorf管中，以得到0.4mol％和0.6mol％bis浓度的最终的吗啉代交联浓度。

可以形成具有吗啉代交联(0.6mol％bis和0.4mol％吗啉代)的AAm和50:50(10wt％和15wt％)凝胶，并且所述凝胶在包含分析物(SEQ ID NO:3)和随机对照(SEQ IDNO:4)的溶液中的浸渍之间显示选择性膨胀。与具有DNA交联的凝胶相比，包含吗啉代交联的凝胶中的总体膨胀更少。当使用具有戊基接头而不是乙基接头(在分子的寡核苷酸序列和丙烯酰胺末端之间)的吗啉代材料时，显示出选择性膨胀并且总体膨胀也低于DNA凝胶。(对于AAm(10wt％)凝胶)膨胀稍微高于包含乙基接头部分的吗啉代交联凝胶；示于图11中。该包含戊基接头的吗啉代材料由GeneTools合成，然后使用HPLC对其进行纯化。

与包含纯DNA的凝胶相比，包含吗啉代交联(乙基接头)或吗啉代(具有在丙烯酰胺部分与寡核苷酸序列之间的戊基接头)传感器链和DNA阻断物链的凝胶(‘杂合体’凝胶)(10wt％AAm)似乎不太受盐浓度(从0-200mM的NaCl浓度)影响(图12)。如之前描述地但使用包含范围从0-200mM的NaCl浓度的溶液制备样品，并且样品仅当存在靶分析物(SEQ.ID NO：3)时膨胀。

实施例4-可选的引发剂

多种引发剂可以用于引发聚合。使用利用过硫酸铵(APS)的引发，另外的实例如下：

不使用光引发剂，制备无寡核苷酸交联的AAm(10wt％和15wt％)凝胶的预凝胶剂溶液(关于AAM 0.6mol％bis)。在惰性气氛下，在这种情况下为氮气，将关于AAM0.125mol％的APS(过硫酸铵)、和0.5％或1.0％终浓度的TEMED(四甲基乙二胺)添加至预凝胶剂溶液中。然后将适当的体积(1μL或2μL)移液到先前描述的甲硅烷化硅表面上，并且允许其在惰性气氛中聚合90-120分钟。对于寡核苷酸交联凝胶，在预胶凝剂溶液中溶解干燥的寡核苷酸之后添加APS和TEMED。

参考文献

1.S.Tierney，D.R.Hjelme，B.T.Stokke，Analytical Chemistry，80，5086(2008)

2.M.F.Islam，E.Rojas，et al.，Nano Letters，3，269(2003)

3.M.Gao，K.Gawel，B.T.Stokke，Soft Matter，7，1741(2011)

4.M.Gao，K.Gawel，B.T.Stokke，Soft Matter，7，1741(2011)

5.K.Gawal，D.Barriet，et al.，Sensors，10，4381(2010)

6.K.Gawal，B.T.Stokke，Soft Matter，7，4615(2011)

7.S.Tierney，B.T.Stokke，Biomacromolecules，10，1619(2009)

8.M.C.Burl，B.J.Doleman，et al.，Sensors and Actuators B，72，149(2001)

9.B.J.Doleman，N.S.Lewis，Sensors and Actuators B，72，41(2001)

10.B.J.Doleman，M.C.Longergan，et al.，Analytical Chemistry，70，4177(1998)

11.B.J.Doleman，R.D.Sanner，et al.，Analytical Chemistry，70，2560(1998)

12.B.J.Doleman，E.J.Severin，N.S.Lewis，Proc Natl Acad Sci USA，95，5442(1998)

13.M.C.Lonergan，E.J.Severin，et al.，Chemical Materials，8，2298(1996)

14.E.J.Severin，B.J.Doleman，N.S.Lewis，Analytical Chemistry，72，658(2000)

15.E.J.Severin，R.D.Sanner，et al.，Analytical Chemistry，70，1440(1998)

16.P.J.W.Hands，P.J.Laughlin，D.Bloor，Sensors and Actuators B：Chemical，162，400(2012)

17.D.C.Ferrier，M.P.Shaver，P.J.W.Hands，Biosensors and Bioelectronics，68，798(2015)

18.M.Lee，C.-Y.Chen，et al.，Advanced Materials，24，1759(2012)

19.L.Cui，Conducting polymer based QCM-interdigitated electrode hybridelectronic nose-system.1999，University of Glasgow：Glasgow.

20.L.Cui，M.J.Swann，et al.，Sensors and Actuators B，66，94(2000)

21.O.B.Ayyub，J.W.Sekowski，et al.，Biosensors and Bioelectronics，28，349(2011)

22.P.Jiang，D.W.Smith Jr.，et al.，Advanced Materials，17，179(2005)

23.Y.Kang，J.J.Walish，et al.，Nature Materials，6，957(2007)

24.W.Lee，J.Yoon，et al.，Macromolecules，(2013)

25.C.J.Musto，K.S.Suslick，Current Opinion in Chemical Biology，14，758(2010)

26.N.A.Rakow，A.Sen，K.S.Suslick.A colorimetric nose：″Smell-seeing″.inISOEN8.2001.Washington DC：ECS.

27.H.Wang，K.-Q.Zhang，Sensors，13，4192(2013)

28.M.C.Chiappelli，R.C.Hayward，Advanced Materials，24，6100(2012)

29.Yang et al.Engineering Target-Responsive Hydrogels Based onAptamer-Target Interactions；JAm Chem Soc.2008 May 21；130(20)：6320-6321.

doi：10.1021/ja801339w

序列表

<110> 爱丁堡大学董事会

<120> 生物传感器

<130> P223189WO

<150> GB 1511969.6

<151> 2015-07-08

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 传感器链

<400> 1

acaggccggg acaagtgcaa ta 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 阻断物链

<400> 2

tagtgcgttt tattgcactt gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶链

<400> 3

tattgcactt gtcccggcct gt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 对照链

<400> 4

acgtctagac gtaacgaagg tc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 与氨苄青霉素结合的适配体

<400> 5

cacggcatgg tgggcgtcgt g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 与氨苄青霉素结合的适配体

<400> 6

gcgggcggtt gtatagcgg 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 与氨苄青霉素结合的适配体

<400> 7

ttagttgggg ttcagttgg 19

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 与腺苷结合的适配体

<400> 8

acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于结合腺苷的感测链

<400> 9

actcatctgt gaagagaacc tgggggagta ttgcggagga aggt 44

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 阻断链1

<400> 10

tgagtagaca ct 12

<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 阻断链2

<400> 11

tctcttggac cc 12

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于结合腺苷的感测链

<400> 12

agagaacctg ggggagtatt gcggaggaag gt 32

Claims

1.一种生物传感器，所述生物传感器包括：

-物理电式换能器，所述物理电式换能器与所述可膨胀生物敏感元件相关联。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其中所述探针的靶是核酸、蛋白/肽、药物、脂质、多糖、其他小分子或细胞表面。

3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其中所述核酸探针是适配体。

4.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述物理电式换能器适于将所述可膨胀生物敏感元件的膨胀的物理效应转化为可检测/可测量的电指示物。

5.根据权利要求4所述的生物传感器，其中待检测的电指示物是电阻抗或导纳，诸如电阻、电导、电抗、电纳、电容、电感中的变化或其组合。

6.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述核酸探针限定可膨胀聚合物材料的脆弱交联物的部分，其中当所述靶与所述核酸探针结合时所述交联物被裂解。

7.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述可膨胀生物敏感元件包含至少一对至少部分互补的核酸链，每一对中的至少一条链包含核酸探针。

8.根据权利要求6或7所述的生物传感器，其中所述脆弱交联物包含至少一对部分互补的核酸，所述至少一对部分互补的核酸包含核酸探针链和阻断物链。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的生物传感器，其中所述核酸探针适于与核酸靶通过杂交结合，或者是适于与非核酸靶结合的适配体。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的生物传感器，其中所述可膨胀生物敏感元件包含脆弱交联物，所述脆弱交联物包含两条核酸阻断物链和核酸探针序列，所述两条核酸阻断物链与聚合物连接，所述核酸探针序列与两条所述阻断物序列至少部分地互补，并且因此与两条所述阻断物序列杂交以形成脆弱交联。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的生物传感器，其中所述可膨胀生物敏感元件包含脆弱交联物，所述脆弱交联物包含适配体探针和所述适配体的对应靶。

12.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中在所述核酸探针与和它连接的单体/聚合物之间设置间隔物。

13.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，所述生物传感器包括脆弱交联物，所述脆弱交联物包含一对或更多对不完全互补的核酸。

14.根据权利要求13所述的生物传感器，其中所述脆弱交联物包含探针序列，所述探针序列仅沿着其长度的一部分与对应的阻断物链配对，并且沿着其长度的更大比例与所述靶配对。

15.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述核酸探针包含核酸类似物/模拟物或其他形式的改性或改变的核酸。

16.根据权利要求15所述的生物传感器，其中所述核酸探针是肽核酸(PNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、桥接核酸(BNA)或苏糖核酸(TNA)。

17.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，所述生物传感器包括用于检测多于一种类型的靶的核酸探针。

18.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述核酸探针与可聚合部分连接，优选地其中所述核酸探针与能够整合到可膨胀聚合物中的单体部分共价结合。

19.根据权利要求18所述的生物传感器，其中与所述核酸探针连接的可聚合部分是acrydite。

20.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，所述生物传感器包括可膨胀聚合物，所述可膨胀聚合物包含非脆弱交联物和脆弱核酸交联物。

21.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述可膨胀生物敏感元件包含可膨胀聚合物，优选地亲水的遇水可膨胀聚合物。

22.根据权利要求21所述的生物传感器，其中所述亲水性聚合物包括以下中的一种或更多种：聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(乙烯醇)；聚(乙二醇)；聚(N,N'-二烷基丙烯酰胺)；聚(2-羟丙基(甲基)丙烯酸酯)；聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)；和聚(二(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)。脆弱核酸交联物向此类聚合物中的整合可以通过使用与所述核酸连接的适当的可聚合部分容易地实现。

23.根据权利要求22所述的生物传感器，其中所述亲水性聚合物包含聚丙烯酰胺水凝胶。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的生物传感器，所述生物传感器包括氯化钠或另一种无机金属盐。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的生物传感器，所述生物传感器包括溶剂。

26.根据权利要求20至25中任一项所述的生物传感器，可膨胀生物敏感元件包含共聚物。

27.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中所述可膨胀生物敏感元件包含寡核苷酸交联聚合物复合材料(OCPC)。

28.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，其中膨胀的物理电式换能器包括压阻式材料或电逾渗复合材料，所述压阻式材料或电逾渗复合材料由于其体积的外部诱导变化能够表现出其电阻抗的变化。

29.根据权利要求28所述的生物传感器，其中所述逾渗复合材料包括颗粒形式的导电材料。

30.根据权利要求28或29所述的生物传感器，其中所述逾渗复合材料包括分布在所述可膨胀生物敏感元件中的导电颗粒。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的生物传感器，其中所述逾渗复合材料包括碳纳米粉末和/或碳纳米管作为所述导电颗粒，或者所述逾渗复合材料包括碳黑、镍、金、银、锌和铜颗粒中的一种或更多种作为所述导电颗粒。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的生物传感器，其中所述导电颗粒的尺寸是亚微米，优选地小于500nm，并且更优选地小于100nm。

33.根据权利要求28至32中任一项所述的生物传感器，其中导电颗粒的比例使得在膨胀之前，所述复合材料高于逾渗阈值，并且因此处于最大导电状态，并且在膨胀已经发生之后，所述复合材料将变成非逾渗的并处于最低导电状态。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的生物传感器，所述生物传感器适于使得在所述核酸交联物裂解后所述聚合物的膨胀引起所述导电颗粒材料的体积分数在所述逾渗阈值的至少一部分内或跨越所述逾渗阈值的至少一部分的变化。

35.根据任一项前述权利要求所述的生物传感器，所述生物传感器包括基底，所述基底包含电极，以允许检测和/或测量由于所述可膨胀生物敏感元件的膨胀导致的所述生物传感器的电学信号或电学特性中的变化。

36.根据权利要求35所述的生物传感器，其中所述电极的活性区域被所述可膨胀生物敏感元件(例如OCPC)完全覆盖。

37.根据权利要求35或36所述的生物传感器，其中所述基底在所述可膨胀生物敏感元件将被剂沉积的区域中被至少部分地被表面改性，以增强所述可膨胀生物敏感元件与所述基底和/或电极的粘附。

38.一种在基底上的根据权利要求1至37中任一项所述的生物传感器的阵列，所述基底包含与所述生物传感器的每一个相互作用的合适的电极。

39.一种生物传感器装置，所述生物传感器装置包括根据权利要求1至37中任一项所述的生物传感器或根据权利要求38所述的阵列，所述生物传感器或所述阵列与适于检测和/或定量来自所述生物传感器的电指示物的测量设备连接。

40.根据权利要求39所述的生物传感器装置，所述生物传感器装置包括样品接收容器以接收待分析的样品。

41.一种用于检测样品中靶的存在或量的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求1至37中任一项所述的生物传感器、根据权利要求38所述的生物传感器阵列或根据权利要求39或40所述的生物传感器装置；

b)将所述生物传感器、阵列或生物传感器装置暴露于所述样品；

d)任选地确定所述变化的量级；和/或

e)任选地确定所述变化的速度；以及

f)由此确定所述样品中所述靶的存在和/或量。

42.根据权利要求41所述的方法，所述方法用于检测生物样品中的靶。

43.根据权利要求41或42所述的方法，所述方法包括从受试者获得样品的步骤。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测所述样品中的多于一种靶分析物。

45.一种产生生物传感器的方法，所述方法包括：

b)使物理电式换能器与所述可膨胀生物敏感元件相关联。

46.根据权利要求45所述的方法，所述方法包括：

-提供合适的单体以形成可膨胀聚合物基质，

-提供核酸交联单体，

-提供导电颗粒，

-任选地提供非脆弱交联物，

-将以上提及的混合在一起，以及

-使单体和任选地非脆弱交联物聚合，从而形成具有相关联的物理电式换能器的包含脆弱核酸交联的可膨胀聚合物。