KR20180026566A - 고용량 이온 교환 생체분리를 위한 그라프팅된 해도형 부직포 - Google Patents

고용량 이온 교환 생체분리를 위한 그라프팅된 해도형 부직포 Download PDF

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KR20180026566A
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마이클 레오나드 헬러
루벤 지. 카보넬
베남 폴데히미
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노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티
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Abstract

본 발명은 약 1.5 마이크론 미만의 평균 섬유 직경을 갖는 폴리에스테르 섬유의 부직 웹을 포함하고, 다수의 폴리에스테르 섬유 각각에는 메타크릴레이트 중합체로 구성된 다수의 중합체 세그먼트가 그라프팅되며, 각각의 중합체 세그먼트가 표적 분자에 결합하는데 적합한 관능 그룹을 지니는, 생체분리 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막을 제공한다. 본 발명은 또한 단백질과 같은 표적 분자를 포함하는 용액을, 용액 중의 표적 분자의 적어도 일부가 부직포 막에 결합하도록, 본 발명의 부직포 막을 통해 통과시킴을 포함하는 생체분리 방법을 제공한다. 생체분리 공정에서 사용하기에 적합한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막의 제조방법이 또한 제공된다.

Description

고용량 이온 교환 생체분리를 위한 그라프팅된 해도형 부직포
본 발명은 생체분리(bioseparation) 공정용의 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막, 및 이를 형성 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
막 크로마토그래피는 생체분리를 위한 플랫폼으로서 종래의 충전층 크로마토그래피를 능가하는 몇 가지 잠재적인 이점을 제공한다. 막의 상호연결된 기공은 충전층과 비교하여 상당한 압력 강하 없이 높은 체적 처리율을 가능케 한다. 크로마토그래피 수지는 충전해야 할 필요가 있고, 통상적으로 일회용이 아니며, 그 결과 이들은 이들의 사용을 위해 검증된 세정 및 재생 공정을 필요로 한다. 다른 한편으로, 다수의 막은 확장 가능한 생산 기술을 사용하여 중합체로부터 만들어질 수 있어, 적층 가능하고, 바로 사용할 수 있으며, 일회용인 생체분리 필터로서의 이들의 사용을 가능케 한다. 부직포 막은 고속 제조 기술을 사용하여 저 비용 재료로 조절 가능한 다공도, 섬유 직경, 및 기공 크기를 나타내도록 고도로 조작되기 때문에 이러한 용도에 특히 매력적이다. 막에 결합하는 단백질은 유동 및 흡착 둘 다에 이용 가능한 기공에 의해 생성된 표면적에 크게 제한된다. 이것은 흡착에 대한 모든 확산 제한을 없애지만, 또한 크로마토그래피 수지에 비해 막의 결합 용량을 저하시킨다. 상업용 부직포는 크로마토그래피 수지의 표면적의 몇 분의 일을 가지므로, 대부분의 표적 단백질 포획 용도를 위한 낮은 결합 용량을 야기한다. 부직포 막에서 섬유의 표면에 중합체 브러시를 테더링함으로써, 전반적인 단백질 결합 용량을 상당히 증가시킬 수 있는 3차원 결합 도메인이 생성될 수 있다. 중합체 브러시 그라프팅(polymer brush grafting)이 종래의 크로마토그래피 수지, 중공 섬유 막, 캐스트 막, 및 부직포 막에서 단일층 적용범위(monolayer coverage)의 수 배까지 단백질 흡착 용량을 증가시키는 것으로 알려졌다.
중합체 그라프팅은 지지체의 표면 특성을 극적으로 변화시킬 수 있다. 이것은 표면의 극성을 조율하는 것을 도와 생체분자(biomolecule) 흡착을 감소시키거나 증가시킬 수 있으며 이것은 지지 계면에 도입된 3차원 미세-환경에서 리간드 또는 스페이서 아암 부착을 위해 관능 그룹을 도입하는데 사용될 수 있다. Liu 등에 의해 수행된 선행 연구에서, 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 단량체가 상업적으로 이용 가능한 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT) 부직포에 성공적으로 그라프팅되었다[문헌 참조; H. Liu, Y. Zheng, P. Gurgel,R.Carbonell, Affinity membrane development from PBT nonwoven by photo-induced graft polymerization, hydrophilization and ligand attachment, J. Membr. Sci. 428 (2013) 562-575]. 균일한 등각성 polyGMA 그라프트가 UV-유도된 유리 라디칼 중합을 사용하여 개별 PBT 섬유 주위에서 달성되었다. polyGMA는 수소 제거를 통해 PBT 표면에 직접 부착되어, 벤조페논(BP)을 개시제로 사용하여 GMA 중합을 개시한다.
PBT는 부직포의 생산에 통상적으로 사용되는 다수의 폴리올레핀을 그라프팅하는데 필요한 별도의 표면 UV 전처리를 필요로 하지 않기 때문에 polyGMA 그라프팅을 위한 출발 물질로서 사용하기에 유리하다. PBT 부직 재료는 성질이 본질적으로 소수성이어서, 높은 정도의 비특이 단백질 흡착을 유도하여, 기본 재료 자체를 생체분리를 위한 불량한 플랫폼으로 만든다. 산성 조건을 사용한 PBT에 대한 polyGMA 그라프트의 직접 가수분해는 섬유 표면을 완전 친수성으로 만들고 비특이 소수성 단백질 흡착을 실질적으로 감소시킨다. GMA의 각각의 단량체 단위는 이용 가능한 아민, 티올, 및 하이드록실 그룹으로의 친핵성 치환을 통해 리간드를 공유적으로 부착시키는데 사용될 수 있는 에폭시 말단 그룹을 함유한다. Liu 등의 연구에서, polyGMA 브러시에 공유적으로 부착된 디에틸렌 글리콜이 비특이 소수성 상호작용에 의해 단백질 흡착을 실질적으로 없애는 것으로 또한 밝혀졌다.
PolyGMA 그라프팅된 부직포는 효과적인 이온 교환 막의 개발을 위한 간편한 플랫폼을 제공한다. Saito 등은 polyGMA 브러시를 폴리프로필렌 섬유 및 폴리에틸렌 중공 섬유에 성공적으로 그라프팅시켰다[문헌 참조; K. Saito, T. Kaga, H. Yamagishi, S. Furasaki,T.Sugo,J.Okamoto, Phosphorylated hollow fibers synthesized by radiation grafting and crosslinking, J. Membr. Sci. 43 (1989) 131-141]. 이러한 그라프팅된 물질을 인산 그룹으로 관능화시켜 2가 금속 양이온을 포획하는 강한 양이온 교환 막을 개발하였다.
Zheng 등의 연구에서, polyGMA를 폴리프로필렌 부직포에 그라프팅시키고 디에틸 아민(DEA)으로 관능화시켜 약한 음이온 교환체를 개발하였다[문헌 참조; Y. Zheng, H. Liu, P. Gurgel,R.Carbonell, Polypropylene nonwoven fabrics with conformal grafting of poly(glycidyl methacrylate) for bioseparations, J. Membr. Sci. 364 (2010) 362-371]. 이 물질은 소 혈청 알부민(BSA)에 대해 120mg/g 막의 평형 결합 용량을 달성하였다.
Liu 등은 음이온 교환에 의한 BSA의 포획을 위한 부직 PBT에 대한 다양한 정도의 polyGMA 그라프팅의 효과를 조사하였다[문헌 참조; H. Liu, Surfacemodified nonwoven membranes for bioseparations, Raleigh NC USA, North Carolina State Univ., PhD thesis, 2012]. 이 연구에서, polyGMA 그라프트는 DEA로 약한 음이온 교환체로 전환되었으며 BSA와 겨루었다. 전반적인 단백질 결합 용량이 그라프팅의 정도(% 중량 증가)에 따라 증가한다는 것을 알아내었다. 800mg/g의 가장 큰 평형 결합 용량이 12% polyGMA 중량 증가시 관찰되었다. 이러한 조사는 또한, 최대 결합에 도달하는 데에는 수 시간 내지 종일의 체류 시간이 소요되었으며 이러한 결합 시간은 증가된 그라프팅 중량 % 증가에 따라 증가하였음을 보여주었다. 이러한 긴 체류 시간은 다운스트림 가공용의 고 처리량, 고 성능 단백질 포획 장치의 개발을 위한 이러한 polyGMA 그라프팅된 부직포 PBT 막의 사용을 불가능하게 한다.
따라서, 고 처리량, 고 성능 단백질 포획이 가능한 그라프팅된 부직포 막이 계속해서 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 약 1.5 마이크론 미만의 평균 섬유 직경을 갖는 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT) 부직포는, 예를 들면, UV-유도된 라디칼 중합을 통해 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 또는 유사한 메타크릴레이트 중합체로 용이하게 그라프팅되어, 음이온 또는 양이온 교환체로서 작용하도록 화학적으로 개질될 수 있는 균일한 등각성 중합체 브러시 망상구조를 각각의 섬유 주위에 생성할 수 있다. 이온 교환에 의한 단백질의 흡착 속도를 본 발명에 따르면 대략 1㎛의 평균 섬유 직경을 갖는 해도형 (islands-in-the-sea; I/S) PBT 부직포에서 및 대략 3㎛의 평균 섬유 직경을 갖는 상업적으로 이용 가능한 PBT 부직포에서 측정하였다. 두 가지 부직포 모두는 polyGMA로 성공적으로 그라프팅되었으며 유사한 중량 % 그라프팅에서 유사한 이온 교환 평형 단백질 결합 용량을 보였다. 그러나, 본 발명의 그라프팅된 I/S 부직포 막은 초기에 상당히 더 높은 양의 단백질 결합을 나타내었으며 보다 큰 섬유 직경을 갖는 그라프팅된 상업용 부직포에 의해 소요되는 시간의 몇 분의 일 내에 평형에 도달할 수 있었다. 작동 이론에 의해 결부되는 것은 아니지만, 본 발명의 I/S PBT 부직포에서 관찰된 보다 빠른 단백질 흡착 속도는 동일한 중량 % 그라프팅을 갖는 상업용 PBT에 비해 섬유 주위의 보다 얇은 polyGMA 그라프트 층 두께의 결과인 것으로 믿어진다.
하나의 측면에 따르면, 본 발명은 약 1.5 마이크론 미만(보다 전형적으로 약 1 마이크론 이하)의 평균 섬유 직경을 갖는 다수의 폴리에스테르 섬유(예를 들면, 폴리부틸렌 테레프탈레이트 섬유)를 포함하는 부직 웹(nonwoven web)을 포함하는, 생체분리 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막을 제공하며, 여기서 다수의 폴리에스테르 섬유의 각각에는 메타크릴레이트 중합체(예를 들면, polyGMA)로 구성된 다수의 중합체 세그먼트가 그라프팅되며, 각각의 중합체 세그먼트는 표적 분자에 결합하기 위한 관능 그룹을 갖는다. 특정 양태에서, 메타크릴레이트 중합체는 글리시딜 메타크릴레이트, 메타크릴산, 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, [2-(메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸-암모늄 클로라이드, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 설폰산, 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 3-클로로-2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단량체로부터 구성된다. 관능 그룹은 표적 분자에 따라 변할 수 있지만, 전형적으로 표적 분자와의 양이온 또는 음이온 교환에 적합한 그룹일 것이다.
특정 양태에서, 부직 웹은 해도형 이성분 섬유의 해 성분(sea component)의 제거 후 남은 도 섬유(island fiber)를 포함한다. 부직 웹은 적어도 약 1.5 m2/g의 예시적인 BET 비표면적을 가질 수 있다. 전형적으로, 그라프팅된 중합체 세그먼트의 중량은 부직 웹의 중량의 약 2 내지 약 50%, 가장 바람직하게는 5 내지 25% 중량 증가이다.
또 다른 측면에서, 단백질과 같은 표적 분자를 포함하는 용액을, 용액 중의 표적 분자의 적어도 일부가 부직포 막에 결합하도록, 본 발명의 부직포 막을 통해 통과시킴을 포함하는 생체분리의 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다수의 해도형 섬유 또는 이성분 해도형 섬유의 해 성분의 제거 후 남은 다수의 도 섬유를 포함하는 부직 웹을 제공받는 단계; 임의로, 이성분 해도형 섬유의 해 성분을 제거하여 이의 도 섬유를 노출시키는 단계; 메타크릴레이트 중합체를 도 섬유의 표면에 그라프팅시켜 이에 공유적으로 부착된 다수의 중합체 세그먼트를 형성함으로써, 그라프팅된 도 섬유를 형성하는 단계로서, 상기 그라프팅 단계는 부직 웹을 개시제 및 적어도 하나의 메타크릴레이트 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계 및 부직 웹을 자외선에 노출시켜 메타크릴레이트 단량체의 중합을 개시하는 단계를 포함하는, 상기 그라프팅된 도 섬유를 형성하는 단계; 및 임의로, 표적 분자를 그라프팅된 도 섬유의 다수의 중합체 세그먼트의 각각에 결합시키기 위한 적어도 하나의 관능 그룹을 부착시키기 위해 그라프팅된 도 섬유를 관능화시키는 단계를 포함하여, 생체분리 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막을 제조하는 방법을 제공한다. 그라프팅 용액 중의 단량체의 농도는 변할 수 있지만, 전형적으로 약 5 내지 약 50% v/v(가장 바람직하게는 15 내지 25% v/v)이고, 벤조페논과 같은 개시제는 전형적으로 약 1:100 내지 약 1:5(예를 들면, 1:20)의 개시제 대 단량체의 몰 비로 존재한다. 자외선 광원은 중합을 개시하기 위해 200nm 내지 500nm(가장 바람직하게는 365nm) 범위의 파장을 가질 수 있다. 중합을 개시하기 위한 특정 파장은 사용되는 광개시제 뿐만 아니라 PBT의 표면에 그라프팅되는 단량체에 따라 좌우된다. 추가로, 자외선 광원은 그라프팅에 필요한 에너지 및 목적하는 중합도를 달성하기 위해 그라프팅을 수행하고자 하는 목적하는 속도에 따라 1 내지 30mW/cm2(가장 바람직하게는 5mW/cm2)의 강도를 가질 수 있다.
본 발명은 제한함이 없이 다음의 양태를 포함한다:
양태 1: 약 1.5 마이크론 미만의 평균 섬유 직경을 갖는 다수의 폴리에스테르 섬유를 포함하는 부직 웹을 포함하는, 생체분리 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막으로서, 상기 다수의 폴리에스테르 섬유의 각각에는 메타크릴레이트 중합체로 이루어진 다수의 중합체 세그먼트가 그라프팅되며, 각각의 중합체 세그먼트는 표적 분자에 결합하는데 적합한 관능 그룹을 갖는, 상기 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막.
양태 2: 상기 메타크릴레이트 중합체가 글리시딜 메타크릴레이트, 메타크릴산, 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, [2-(메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸-암모늄 클로라이드, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 설폰산, 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 3-클로로-2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단량체로부터 구성되는, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 3: 상기 폴리에스테르 섬유가 폴리부틸렌 테레프탈레이트로 구성되는, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 4: 상기 평균 섬유 직경이 약 1 마이크론 이하인, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 5: 상기 관능 그룹이 표적 분자와의 양이온 또는 음이온 교환에 적합한, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 6: 상기 부직 웹이 해도형 이성분 섬유의 해 성분의 제거 후 남은 도 섬유를 포함하는, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 7: 상기 부직 웹이 적어도 약 1.5m2/g의 BET 비표면적을 갖는, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 8: 상기 그라프팅된 중합체 세그먼트의 중량이 부직 웹의 중량의 약 2 내지 약 50%인, 임의의 상기 또는 하기 양태의 막.
양태 9: 표적 분자를 포함하는 용액을, 용액 중의 표적 분자의 적어도 일부가 부직포 막에 결합하도록, 임의의 상기 또는 하기 양태의 부직포 막을 통해 통과시킴을 포함하는 생체분리 방법.
양태 10: 상기 표적 분자가 단백질인, 임의의 상기 또는 하기 양태의 방법.
양태 11: i) 다수의 해도형 섬유 또는 이성분 해도형 섬유의 해 성분의 제거 후 남은 다수의 도 섬유를 포함하는 부직 웹을 제공받는 단계; ii) 임의로, 이성분 해도형 섬유의 해 성분을 제거하여 이의 도 섬유를 노출시키는 단계; iii) 메타크릴레이트 중합체를 상기 도 섬유의 표면에 그라프팅시켜 이에 공유적으로 부착된 다수의 중합체 세그먼트를 형성함으로써, 그라프팅된 도 섬유를 형성하는 단계로서, 상기 그라프팅 단계는 부직 웹을 개시제 및 적어도 하나의 메타크릴레이트 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계 및 부직 웹을 자외선 또는 열에 노출시켜 메타크릴레이트 단량체의 중합을 개시하는 단계를 포함하는, 상기 그라프팅된 도 섬유를 형성하는 단계; 및 iv) 임의로, 표적 분자를 그라프팅된 도 섬유의 다수의 중합체 세그먼트의 각각에 결합시키기 위한 적어도 하나의 관능 그룹을 부착시키기 위해 그라프팅된 도 섬유를 관능화시키는 단계를 포함하여, 생체분리 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막을 제조하는 방법.
양태 12: 상기 도 섬유가 폴리부틸렌 테레프탈레이트로 구성되고 상기 메타크릴레이트 중합체가 polyGMA인, 임의의 상기 또는 하기 양태의 방법.
양태 13: 상기 용액 중의 단량체의 농도가 약 5 내지 약 50% v/v이고 상기 개시제가 약 1:100 내지 약 1:5의 개시제 대 단량체의 몰 비로 존재하는, 임의의 상기 또는 하기 양태의 방법.
양태 14: 상기 개시제가 벤조페논인, 임의의 상기 또는 하기 양태의 방법.
본 발명의 이러한 및 다른 특징, 양태, 및 이점은 아래에 간략하게 기재된 첨부된 도면과 함께 하기 상세한 설명의 판독으로 자명해질 것이다. 본 발명은 상기한 양태들 중의 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 임의의 조합 뿐만 아니라 본 발명에 제시된 임의의 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 특징 또는 요소들의 조합을, 이러한 특징 또는 요소들이 명백히 본원의 특정 양태 설명에 구비되어 있는지에 관계없이, 포함한다.　 본 발명은 개시된 발명의 임의의 분리 가능한 특징들 또는 요소들이, 이의 다양한 측면 및 양태에서, 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 한 조합 가능한 것으로 의도되는 것으로 간주된다고 전체론적으로 판독되어야 한다. 본 발명의 다른 측면 및 이점들은 하기로부터 자명해질 것이다.
본 발명의 양태들의 이해를 제공하기 위해, 첨부된 도면을 참조하며, 이것은 반드시 일정한 비율로 작성된 것은 아니다. 도면은 단지 예시적인 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1A 및 1B는 (A) 36개 도를 갖는 I/S 섬유 및 (B) 108개 도를 갖는 I/S 섬유의 단면도이고;
도 2A 및 2B는 (A) PLA 제거 전 및 (B) PLA 제거 후 108 도 I/S PBT 부직포의 SEM 이미지이고;
도 3은 PLA 제거 후 상업용 PBT 부직포 및 108 I/S 부직포에 대한 다양한 UV 노출 시간에서의 polyGMA 그라프팅의 정도를 예시하고;
도 4A-4D는 (A) 그라프팅 전의 상업용 PBT 부직포, (B) 그라프팅 전의 108 I/S PBT 부직포, (C) 20% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 부직포, 및 (D) 20% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포의 SEM 이미지이고;
도 5A-5C는 (A) 20% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT, (B) 5.9% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 부직포, 및 (C) 20% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포의 섬유 직경 및 건조 그라프트 층 두께의 단면 개략도이고;
도 6은 각각 IgG 및 BSA에 결합하는 양이온 또는 음이온 교환체로 되도록 다양한 정도로 그라프팅되고 관능화된 108 I/S PBT 부직포 및 상업용 PBT 부직포에 대한 평형 결합 용량을 예시하고;
도 7은 음이온 교환 관능화되고 그라프팅된 부직포: 20% 및 5.9% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT, 및 20% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT에 대한 다양한 접촉 시간에서의 BSA 포획을 예시하고;
도 8은 양이온 교환 관능화되고 그라프팅된 부직포: 18% 및 5.3% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT, 및 18% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT에 대한 다양한 접촉 시간에서의 hIgG 흡착을 예시하고;
도 9는 BSA 및 hIgG 결합 속도에 대해 시험된 이온 교환 관능화되고 그라프팅된 부직포 모두에 대한, 15 분 이하의 접촉 시간 동안의 단백질 결합을 예시하고;
도 10은 시간(t)이 경과함에 따라 이용 가능한 polyGMA "코어"를 포화 단백질/polyGMA 쉘로 전환시키는, 시간 경과에 따른 단백질로의 그라프팅된 PBT 섬유 충전의 단면 개략도이고, r1= PBT 섬유 반경, rc= 코어 반경, r2= 그라프팅된 섬유 반경;
도 11A 및 11B는 (A) 최적선(line of best fit)으로 시간에 대해 플롯팅된 음이온 교환 관능화된 polyGMA 부직포의 전환에 대한 실험 데이터로부터 계산된 Ψ 값 및 (B) 최적선으로 시간에 대해 플롯팅된 양이온 교환 관능화된 polyGMA 부직포의 전환에 대한 실험 데이터로부터 계산된 Ψ 값을 예시하고;
도 12는 시간의 함수로서의 음이온 교환 polyGMA로의 BSA의 흡착에 대한 실험적 및 수축 코어 모델 결과이고(20% 중량 증가시의 상업용 PBT:
Figure pct00001
= 0.75 및 τ = 6716 분, 5.9% 중량 증가시의 상업용 PBT:
Figure pct00002
= 0.84 및 τ = 3109 분, 및 20% 중량 증가시의 108 I/S PBT:
Figure pct00003
= 0.75 및 τ = 1839 분);
도 13은 시간의 함수로서의 양이온 교환 polyGMA "코어"로의 hIgG의 흡착에 대한 실험적 및 수축 코어 모델 결과이다(18% 중량 증가시의 상업용 PBT:
Figure pct00004
= 0.71 및 τ = 3789 분, 5.3% 중량 증가시의 상업용 PBT:
Figure pct00005
= 0.88 및 τ = 4955 분, 및 18% 중량 증가시의 108 I/S PBT:
Figure pct00006
= 0.74 및 τ = 3189 분).
본 발명은 이하에서 첨부된 도면을 참고로 하여 보다 상세하게 기재될 것이다. 본 발명은 여러 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본원에 개시된 양태들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며; 오히려, 이러한 양태들은 본 기재내용이 해당되는 법률상의 요구를 충족시키도록 제공된다. 비슷한 숫자는 전반에 걸쳐 비슷한 요소들을 가리킨다. 본 명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는, 문맥이 명백히 달리 나타내지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.
본 발명은 이온 교환 또는 친화 크로마토그래피를 사용한 특정 용액으로부터의 단백질의 분리와 같은 생체분리를 위해 사용할 수 있는 관능화된 막을 만들기 위한 기질로서 부직 웹을 사용한다. 본 발명에서 사용되는 부직 웹은 나노섬유 범위이거나 이에 가까운 평균 섬유 직경을 갖는다. 나노섬유 부직포의 가능성있는 상업적 생산의 해법은 부직포 매트의 생산을 위한 스펀본딩 공정에 이성분 섬유를 사용하는 것이다[문헌 참조; N. Fedorova, B. Pourdeyhimi, High strength nylon micro- and nanofiber based nonwovens via spunbonding, J. Appl. Polym. Sci. 104 (2007) 3434-3442]. 이러한 생산 체계에서는, 두 개의 중합체를 동일한 방적돌기(spinneret)로부터 공압출시킬 수 있으며, 여기서 이들이 합쳐져서 응집 섬유(cohesive fiber)로 된다. 섬유를 또한 외피 배열(sheath configuration)로 세그먼트화 파이(pie) 또는 코어로 압출시킬 수 있다. 그후, 이들 섬유를 균열시켜 훨씬 작은 직경의 다수의 섬유를 방출시킬 수 있거나, 중합체 중의 하나를 선택적으로 용해시켜 부직포 매트릭스에 훨씬 더 작은 섬유 세트를 야기할 수 있다[문헌 참조; A. Durany, N. Anantharamaiah, B. Pourdeyhimi, High surfaceareanonwovens via fibrillating spunbonded nonwovens comprising Islands-in-the-Sea bicomponent filaments: structure-process-property relationships, J. Mater. Sci. 44 (2009) 4926-5934].
본원에서 사용되는 용어 "섬유"는, 예를 들면, 적어도 약 100배의 높은 종횡비(aspect ratio)를 갖는 직물의 기본 요소로서 정의된다. 또한, "필라멘트/연속 필라멘트"는 매우 높은 종횡비를 갖는 대단히 긴 길이의 연속 섬유이다. 용어 "다성분 섬유"는 이성분 섬유를 포함하여 물리적 또는 화학적 성질이 상이한 둘 이상의 중합체를 포함하는 섬유를 가리킨다. 섬유상 재료, 웹, 매트, 배트, 또는 시트와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "부직포"는 섬유가 부정 또는 랜덤 배향으로 정렬되어 있는 섬유상 구조를 가리킨다. 본 발명에 따르는 섬유는 다양할 수 있으며, 원형, 직사각형, 정사각형, 타원형, 삼각형, 및 다엽형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의 유형의 단면을 갖는 섬유를 포함한다. 특정 양태에서, 섬유는 하나 이상의 보이드 공간(void space)을 가질 수 있으며, 여기서 보이드 공간은, 예를 들면, 원형, 직사각형, 정사각형, 타원형, 삼각형, 또는 다엽형 단면을 가질 수 있다.
부직 웹을 제조하는 수단은 다양할 수 있다. 일반적으로, 부직 웹은 전형적으로 세 단계로 생산된다: 웹 형성, 본딩, 및 피니싱 처리. 웹 형성은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 웹은 드라이레이드(drylaid) 공정, 스펀레이드(spunlaid) 공정, 또는 웨트레이드(wetlaid) 공정에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 다양한 양태에서, 부직 웹은 스펀본딩(spunbonding) 공정에 의해 제조된다. 스펀본딩은 다양한 타입의 섬유 방적 공정(예를 들면, 습윤, 건조, 용융, 또는 유화)을 사용할 수 있다. 용융 방사(melt spinning)가 가장 흔하게 사용되며, 여기서는 중합체를 액체 상태로 용융시키고, 중합체 가닥이 오리피스의 형상에 따라 고화되도록 작은 오리피스를 통해 냉풍으로 밀어 넣는다. 그후, 이렇게 하여 생산된 섬유 다발을 연신시키며, 즉, (예를 들면, 3-5배까지) 기계적으로 스트레칭시켜 섬유를 배향시킨다. 그후, 연신된 섬유를 무빙 벨트 상에 두어 부직 웹을 형성한다. 일반적인 스펀본딩 공정은, 예를 들면, Appel 등의 U.S. 특허 제4,340,563호, Dorschner 등의 제3,692,618호, Matsuki 등의 제3,802,817호, Kinney의 제3,338,992호 및 제3,341,394호, Hartmann의 제3,502,763호, 및 Dobo 등의 제3,542,615호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다. 스펀본딩은 전형적으로 예를 들면 멜트블로잉(meltblowing)보다 더 큰 직경 필라멘트를 생산한다. 예를 들면, 몇몇 양태에서, 스펀본딩은 약 20 마이크론 이상의 평균 직경을 갖는 섬유를 생산한다.
다양한 방법들이 보다 작은 직경(예를 들면, 약 1.5 마이크론 미만, 약 1.0 마이크론 미만 또는 약 0.5 마이크론 미만)을 갖는 섬유를 수득하기 위해 다성분 섬유를 가공하는데 이용 가능하다. 이러한 방법들은 전형적으로 보다 큰 직경을 갖는 스펀본딩된 물질에 흔히 적용되지만, 이들은 또한 멜트블로잉된 물질 뿐만 아니라 다른 수단에 의해 제조된 섬유성 물질에도 적용될 수 있음을 주지한다. 예를 들면, 몇몇 양태에서, 분할 가능한 다성분 섬유를 제조하고(예를 들면, 세그먼트화 파이형, 리본형, 해도형, 또는 다엽형을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 후속적으로 분할 또는 피브릴화하여 보다 작은 직경을 갖는 둘 이상의 섬유를 제공한다. 이러한 섬유를 분할시킬 수 있는 수단은 다양할 수 있으며 고수압직조(hydroentangling)와 같은 섬유에 기계 에너지를 부여하는 다양한 공정들을 포함할 수 있다. 이러한 공정을 위한 예시적인 방법은, 예를 들면, Pourdeyhimi 등의 U.S. 특허 제7,981,226호에 기재되어 있으며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.
상기 주지된 바와 같이, 특정 양태에서, 다성분 섬유를 제조한 다음 (예를 들면, 섬유를 용매와 접촉시킴으로써) 처리하여 성분 중의 하나 이상을 제거한다. 예를 들면, 특정 양태에서, 해도형 섬유를 제조하고 해 성분을 용해시키도록 처리하여, 도(island)를 보다 작은 직경을 갖는 섬유로 잔류시킬 수 있다. 이러한 타입의 공정을 위한 예시적인 방법은, 예를 들면, Kato 둥의 U.S. 특허 제4,612,228호에 기재되어 있으며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.
해도형 (I/S) 부직포 기술은 심초형(core in sheath) 이성분 필라멘트 공정의 연장이다. 이러한 타입의 부직포는 "해(sea)"로 알려진 희생 중합체 외피에 매봉된 "도"로 알려진 섬유 내에 다수의 영구 중합체 코어를 갖는다. 도의 수 및 도 성분 대 해 성분의 비는 본 발명에서 특별히 제한되지 않으며, 도의 수의 예시적인 범위는 약 20 내지 약 400개 도(예를 들면, 약 50 내지 약 200개 도)를 포함한다. 도 1A 및 1B는 두 개의 예시적인 I/S 구조의 단면도이며, 여기서 하나는 36개 도를 갖고 다른 하나는 108개 도를 갖는다. "도" 대 "해"의 비는, 예를 들면, 약 25:75 (w:w) 내지 약 75:25 (w:w)에 이를 수 있다. 폴리락트산(PLA)은 여러 중합체(예를 들면, 나일론-6 및 PBT)에 비해 낮은 용융 온도를 가지며 가열 가성 욕(hot caustic bath)에서 용이하게 분해될 수 있어, 용해 가능한 "해"의 훌륭한 후보물질로 될 수 있다. I/S 부직포는 섬유 생산의 높은 생산성 및 치수 안정성을 여전히 보존하면서 멜트블로운 또는 스펀본드 기술에 의해 만들어진 상업적으로 이용 가능한 부직포에 비해 보다 작은 섬유 직경 및 이에 따라 더 높은 비표면적을 달성할 수 있다.
이렇게 하여 생산된 섬유 웹은 다양한 기초 중량을 가질 수 있다. 몇몇 양태에서, 부직 웹의 기초 중량은 약 200g/m2 이하, 약 150g/m2 이하, 약 100g/m2 이하, 또는 약 50g/m2 이하이다. 특정 양태에서, 부직포는 약 75g/m2 내지 약 125g/m2의 기초 중량을 갖는다. 직물의 기초 중량은, 예를 들면, "직물의 단위 면적(중량)당 질량에 대한 표준 시험 방법(Standard Test Method for Mass Per Unit Area (Weight) of Fabric)"이라는 명칭의 ASTM D 3776/D 3776M-09ae2에 요약된 시험 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 시험은 단위 면적당 질량의 척도를 기록하며 제곱 미터당 그램(g/m2)으로 측정되고 표현된다.
부직 웹은 적어도 약 1.5m2/g, 예를 들면, 적어도 약 2.0m2/g 또는 적어도 약 2.2m2/g의 예시적인 BET 비표면적을 가질 수 있다. 예시적인 BET 표면적 범위는 약 1.5m2/g 내지 약 3.0m2/g이다.
부직 웹의 중합체는 다양할 수 있지만, 전형적으로 그라프팅에 적합한 열가소성 중합체를 포함할 것이다. 예시적인 중합체는 폴리올레핀(예를 들면, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌), 폴리에스테르, 및 폴리아미드를 포함한다. 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 코-폴리에스테르, 및 이들의 조합을 포함한 폴리에스테르가 특히 유용하다. PBT가 특히 유용한데, 그 이유는 PBT의 중합체 표면이 벤조페논과 같은 그라프팅 반응에 사용되는 특정 개시제에 대해 자연 친화성을 갖기 때문이다. 이러한 이유로, 중합체와 개시제 간의 친화도를 증진시키기 위해 중합체에 관능 그룹을 도입하는 전처리가 PBT를 사용하는 경우에는 필요하지 않다.
상기 주지된 바와 같이, 부직 웹의 중합체 섬유는 그라프팅 공정에 적용되며 이를 통해 중합체 브러시 또는 세그먼트가 섬유에 공유적으로 부착된다. 이 공정은 전형적으로 부직 웹을 광개시제(예를 들면, 벤조페논)와 같은 유리 라디칼 중합 개시제와 함께 적합한 용매에 용해된 단량체를 포함하는 용액과 접촉시킴을 수반한다. 공정은 또한 전형적으로 부직 웹을 200 내지 500nm(가장 바람직하게는 365nm)의 파장과 1 내지 30mW/cm2(가장 바람직하게는 5mW/cm2)의 강도를 갖는 자외선에 적용하여 중합 반응을 개시함을 수반한다. 그라프팅 용액 중의 단량체의 농도는 다양할 수 있지만, 전형적으로 약 5 내지 약 50% v/v (가장 바람직하게는 15-25 % (v/v))이고, 벤조페논과 같은 개시제는 전형적으로 약 1:100 내지 약 1:5 (예를 들면, 1:20)의 개시제 대 단량체의 몰 비로 존재한다. 특정 양태에서, 중합 반응은 그라프팅된 중합체 세그먼트의 중량이 부직 웹의 중량의 약 2 내지 약 50%(가장 바람직하게는 5-25% 중량 증가)일 때까지 계속될 수 있다.
그라프팅에 사용되는 중합체는 다양할 수 있지만, 전형적으로 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 중합체일 것이다. 그라프팅 중합체는 특정 표적 분자에 대한 친화성을 증진시키기 위해 관능화될 수 있는 부직 웹의 섬유에 브러시형 연장부(brush-like extension)를 제공한다. 그라프트 중합체를 위한 단량체의 선택은 다양할 수 있으며, 부분적으로, 최종 막 구조에 필요한 목적하는 결합 특성에 따라 좌우될 것이다. 특정 단량체는 친화성 또는 이온 교환 결합을 위해 사용될 수 있는 관능 그룹을 본질적으로 갖는 반면 다른 단량체는 필요한 결합 그룹을 부가하기 위해 추가의 관능화를 필요로 할 것이다. 예시적인 단량체 및 이의 가능한 사용은 글리시딜 메타크릴레이트(추가의 관능화에 적합), 메타크릴산(약한 양이온 교환 막), 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트(약한 음이온 교환 막), [2-(메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸-암모늄 클로라이드(강한 음이온 교환 막), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA, 단백질 내성 막), 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 설폰산(강한 양이온 교환 막), 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(약한 음이온 교환 막), 부틸메타크릴레이트(소수성 상호작용 막), 3-클로로-2-하이드록시프로필 메타크릴레이트(추가의 관능화에 적합), 2-에틸헥실 메타크릴레이트(소수성 상호작용 막), 및 이들의 조합을 포함한다.
필요에 따라, 중합체 세그먼트 또는 브러시는 각각의 중합체 세그먼트가 표적 분자에 결합하는데 적합한 관능 그룹을 지니도록 관능화될 수 있다. 이러한 관능 그룹과 단백질과 같은 표적 분자 사이에 일어날 수 있는 예시적인 결합은 이온 결합, 수소 결합, 및 반 데르 발스 힘을 포함할 수 있다. 예시적인 관능 그룹은 아민 그룹(1급, 2급, 3급 또는 4급 아민 포함), 설폰산 그룹, 카복실산 그룹, 포스페이트 그룹 등을 포함한다. 이러한 관능 그룹을 부착시키기 위한 유도체화 반응은 전형적으로 중합체 브러시 상의 에폭시 그룹 또는 기타 반응성 그룹을 목적하는 관능 그룹을 함유하는 분자와 반응시킴을 포함한다.
실험 부분에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명자들은 108 도 I/S PBT 부직 웹에 완전 등각성 polyGMA 브러시를 성공적으로 그라프팅시켰다. 그라프팅된 부직포를 각각 BSA 및 hIgG의 포획을 위한 약한 음이온 및 강한 양이온 교환체로 되도록 성공적으로 유도체화하였다. 18-20% polyGMA 중량 증가에 대해 1000mg/g 정도로 높은 평형 정적 단백질 결합 용량이 달성되었으며, 이는 polyGMA 브러시가 단일층 적용범위의 수배로 단백질 포획을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 보다 얇은 polyGMA 그라프트를 갖는 보다 높은 표면적의 108 I/S PBT 부직포가 polyGMA/단백질 층에서 확산 제한의 유의성을 감소시킬 수 있어, 상업용 PBT 부직포에 비해 평형에 도달하는데 더 짧은 시간이 소요되는 것으로 관찰되었다. 게다가, 108 I/S 부직포 PBT는 상업용 PBT 부직포에 비해 더 높은 양의 초기 단백질 결합을 입증하였으며, 이는 짧은 체류 시간을 필요로 하는 용도에서 유리하다.
특정 양태에서, 본 발명의 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막은 적어도 약 18%의 그라프트 중합체 중량 증가(예를 들면, 부직 웹의 중량을 기준으로 하여, 18-20중량%의 그라프트 중합체를 포함하는 부직포)에서 적어도 약 800mg/g, 적어도 약 850mg/g, 또는 적어도 약 900mg/g 단백질의 용량과 같은 매우 높은 단백질 결합 용량을 특징으로 할 수 있다. 게다가, 본 발명의 부직 웹은 최대 약 1분의 접촉 시간에서, 적어도 약 18%의 그라프트 중합체 중량 증가(예를 들면, 부직 웹의 중량을 기준으로 하여, 18-20중량%의 그라프트 중합체를 포함하는 부직포)에서 적어도 약 200mg/g, 적어도 약 250mg/g, 또는 적어도 약 300mg/g의 단백질 결합과 같은 짧은 접촉 시간에 상당량의 단백질에 결합함을 특징으로 할 수 있다.
실험
108 도 계수를 갖는 해도형 부직포 PBT 섬유는 Nonwovens Institute(NWI, North Carolina State University, Raleigh, NC)에서 파일럿 시설에서 제조되었다. 도 계수(island count)는 일단 PLA "해"가 제거되면 유리되는 별개의 PBT 섬유의 수를 가리킨다. "해" 중합체로서의 50% PLA 및 "도" 중합체로서의 50% PBT로 이루어진 100g/m2의 기초 중량을 갖는 I/S 부직포가 제조되었으며, "해" 제거 후 기초 중량은 50g/m2이다. Macopharma(Tourcoing, France)이 52g/m2의 기초 중량을 갖는 상업적으로 이용 가능한 멜트블로운 PBT 부직포를 제공하였다. 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)는 Pflatz & Bauer(Waterbury, CT)로부터 구입하였다. GMA 중의 억제제를 예비-충전된 억제제 제거 컬럼을 통해 제거하여 하이드로퀴논 및 모노메틸 에테르 하이드로퀴논을 제거하였다(Sigma Aldrich, St. Louis, MO). 벤조페논(BP)은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 수산화나트륨, 1-부탄올, 트리스 염기, 염산, 염화나트륨 및 아세트산나트륨 삼수화물은 Fisher Scientific(Fairlawn, NJ)로부터 구입하였다. 테트라하이드로푸란(THF), 메탄올, 황산, 및 아세트산은 BDH(West Chester, PA)로부터 구입하였다. 디에틸아민(DEA)은 Alfa Aesar(Ward Hill, MA)로부터 구입하였다. 인산(85%)은 Acros Organics(Fairlawn, NJ)로부터 구입하였다. 고체상 추출 튜브는 Supelco(Bellefonte,PA)로부터 구입하였다. 소 혈청으로부터의 알부민(BSA)은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 인간 면역글로불린 G(hIgG)는 Equitek-Bio Inc.(Kerrville, TX)로부터 구입하였다.
I/S 부직포로부터의 PLA 제거
108 I/S 부직포의 50% PLA "해"를 제거하여 그라프팅 전에 PBT "도"를 유리시켰다. PLA는 80-90℃에서 DI 물 중의 10% w/w 수산화나트륨을 사용하여 분해하였다. I/S 부직포를 PLA 모두가 부직포로부터 용해될 때까지 연속 교반하면서 5 분 동안 가성 욕에 침지시켰다. 그후, PBT 부직포를 중성 pH가 달성될 때까지 DI 물로 두루 세척하였다. 그후, 샘플을 밤새 공기 건조되도록 하였다. 도 2A 및 2B는 각각 PLA의 제거 전 및 후의 108 I/S PBT 부직포를 나타낸다.
도 2A에서 PLA는 PBT "도"를 캡슐화하면서 여전히 존재하며, PLA 제거 전 직경이 약 15㎛인 초기의 더 큰 섬유를 보여준다. 도 2B는 직경이 대략 1㎛인 108개 별개의 PBT 섬유를 유리하기 위한 PLA 제거 후의 부직포를 보여준다. PLA 제거 후 방출된 PBT 섬유는 원래의 PLA 섬유의 일반적인 방향을 유지한다.
PBT 부직포로의 UV-유도된 polyGMA 그라프팅
GMA 그라프팅 용액은 용매로서의 1-부탄올 중의 20% v/v GMA 단량체로 구성되었다. 광개시제 벤조페논(BP)을 1:20(mol:mol)의 BP:GMA 비로 그라프팅 용액에 가하였다. PLA 제거 후 상업적으로 이용 가능한 PBT 부직포 및 108 I/S PBT 부직포를 75 x 50 mm 크기의 샘플로 되도록 절단하고 그라프팅 전에 칭량하였으며, 샘플은 각각 상업용 PBT 및 108 I/S PBT에 대해 대략 200mg 및 180mg이었다. 1.5-2.0ml의 그라프팅 용액을 시린지를 통해 분무함으로써 부직포를 그라프팅 용액으로 포화시키고, 두 개의 보로실리케이트 유리 슬라이드(75 x 50 mm) 사이에 두었다. 365nm 파장 및 5mW/cm2의 강도를 갖는 UV 램프(model EN-180L, Spectronics Corporation, Westbury, NY)를 사용하여 PBT 표면에서 GMA의 유리 라디칼 중합을 유도하였다. 램프와 샘플 사이의 간격은 3mm이었다. 샘플을 다양한 노출 시간에서 조사하여 상이한 % 중량 증가를 갖는 상이한 정도의 polyGMA 그라프팅을 달성하였다. polyGMA 그라프팅 후, 샘플을 100ml의 THF를 함유하는 플라스크에 배치하고, THF와 샘플을 갖는 플라스크를 초음파 욕으로 30 분 동안 초음파처리하여(Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) 임의의 미반응 그라프팅 용액 또는 비테더링된 polyGMA를 제거하였다. THF 세척 후 샘플을 플라스크로부터 제거하고 100ml의 메탄올을 함유하는 플라스크에 배치하고, 샘플과 메탄올을 함유하는 플라스크를 초음파 욕으로 10 분 동안 초음파 처리하여 부직포로부터 THF를 제거하였다. 메탄올 세척 후 샘플을 플라스크로부터 제거하고 밤새 공기중에서 건조되도록 하였다. 부직포의 최종 중량을 측정하고 polyGMA 그라프팅의 정도를 그라프팅으로 인한 % 중량 증가의 측면에서 방정식 1을 사용하여 구하였다.
Figure pct00007
(1)
방정식 1에서, W i 는 그라프팅 전의 초기 부직포 중량이고 Wf는 polyGMA 그라프팅 후의 최종 부직포 중량이다. 방정식 1에 정의된 % 중량 증가는 당해 보고서에 제시된 도면에서 % 중량 증가(% Wt. Gain)로 약칭된다.
polyGMA 그라프팅된 PBT 부직포의 관능화
PolyGMA 그라프팅된 PBT 부직포를 50% v/v 수성 디에틸 아민(DEA) 용액 중에 침지시켜 polyGMA 브러시 상에 3급 아민을 생성함으로써 관능화시켜 약한 음이온 교환체를 생산하였다. 180 내지 200mg(75 x 50mm)의 그라프팅된 PBT 부직포 샘플을 100ml의 DEA 용액에 침지시켰다. 반응물을 인큐베이션 후드(Certomat® HK, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany) 내에 담긴 인큐베이션 진탕기(Certomat® RM, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany)를 사용하여 100rpm에서 교반하면서 일정한 30℃에서 유지시켰다. 아민화 후, 샘플을 100ml의 DI 물을 함유하는 플라스크에 배치하고, 플라스크를 초음파 욕(Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT)에 5 분 동안 두어, 과량의 DEA를 제거하였다. 초음파 처리 후, DI 수 세척물을 신선한 DI 물로 교체하고, pH 시험지로 7.0의 중성 pH가 검증될 때까지 공정을 반복하였으며, 10회 세척으로 모든 DEA가 부직포로부터 확실히 제거되었다. 샘플을 100ml의 100mM 황산에 밤새 침지시킴으로써 임의의 미반응 에폭시 그룹을 가수분해하였다. 에폭시 그룹의 가수분해 후, 샘플을 100ml의 DI 물을 함유하는 플라스크에 배치하고, 플라스크를 초음파 욕(Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT)에 5 분 동안 두어, 과량의 황산을 제거하였다. 초음파 처리 후, DI 수 세척물을 신선한 DI 물로 교체하고, pH 시험지로 7.0의 중성 pH가 검증될 때까지 공정을 반복하였으며, 10회 세척으로 모든 황산이 부직포로부터 확실히 제거되었다. 그후, 샘플을 밤새 공기 건조시켰다.
PolyGMA 그라프팅된 PBT 부직포를 인산 그룹을 polyGMA 브러시에 부착함으로써 관능화하여 강한 음이온 교환체를 생성하였다. 대략 20mg(25 x 15 mm)의 그라프팅된 PBT 부직포 샘플을 10ml의 85% w/w 인산에 침지시키고 80℃에서 밤새 항온처리하였다(Isotemp 115, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ). 관능화 후 샘플을 100ml의 DI 물을 함유하는 플라스크에 배치하고, 플라스크를 초음파 욕(Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT)에 5 분 동안 두어, 과량의 인산을 제거하였다. 초음파 처리 후, DI 수 세척물을 신선한 DI 물로 교체하고, pH 시험지로 7.0의 중성 pH가 검증될 때까지 공정을 반복하였으며, 5회 세척으로 모든 인산이 부직포로부터 확실히 제거되었다. 샘플을 10ml의 100mM 황산에 밤새 침지시킴으로써 임의의 미반응 에폭시 그룹을 가수분해하였다. 에폭시 그룹의 가수분해 후, 샘플을 100ml의 DI 물을 함유하는 플라스크에 배치하고, 플라스크를 초음파 욕(Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT)에 5 분 동안 두어, 과량의 황산을 제거하였다. 초음파 처리 후, DI 수 세척물을 신선한 DI 물로 교체하고, pH 시험지로 7.0의 중성 pH가 검증될 때까지 공정을 반복하였으며, 10회 세척으로 모든 황산이 부직포로부터 확실히 제거되었다. 그후, 샘플을 밤새 공기 건조시켰다.
재료 특성화
평균 섬유 직경을 구하고 UV 그라프팅의 유효성을 평가하기 위해, Hitachi S-3200N 변압 주사 전자 현미경(VPSEM)(Hitachi High Technologies America, Inc., Schaumberg, IL)을 사용하여 주사 전자 현미경 이미지를 수득하였다. 부직포 샘플을 아르곤 가스 중에서 Pd/Au로 스퍼터 피복시켰다. 33mm의 작동 거리에서 20kV의 가속 전압으로 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다. 섬유 직경을 가로지르는 거리를 4pi Analysis, Inc.(Hillsborough, NC)로부터의 Revolution 소프트웨어를 사용하여 SEM 현미경사진 상에서 측정하였다. 108 I/S PBT 및 상업적으로 이용 가능한 PBT 부직포의 평균 섬유 직경을 SEM 현미경사진의 150개 무작위 섬유를 가로지르는 거리를 측정함으로써 구하였다.
PLA 해의 제거 후의 108 I/S PBT 부직포 및 상업적으로 이용 가능한 멜트블로운 부직포의 비표면적을 BET(Brunauer, Emmet and Teller) 다점 분석에 의해 질소 흡착을 사용하여 구하였다. 1 그램의 부직포 재료를 12mm 샘플 홀더에 부하하고 39개 질소 분압 포인트를 측정하는 AutosorbTM-1C 화학흡착-물리흡착 분석기(Quantachrome Industries, Boynton Beach, FLA) 상에서 분석하였다.
상업적으로 이용 가능한 PBT 멜트블로운 부직포 및 PLA 제거 후의 108 I/S PBT 부직포의 평균 기공 크기를 모세관류 기공 측정기(capillary flow porometry)를 사용하여 구하였다. 부직포 샘플을 CFP-1100-AX 모세관류 기공 측정기(Porous Materials Inc., Ithaca, NY) 상에서 시험하였다. 습윤화 액체는 GalwickTM (Porous Materials Inc., Ithaca, NY)이었으며, 표면 장력은 15.9 dynes/cm이었다.
상업용 PBT 부직포는 3000nm ± 900nm의 평균 섬유 직경을 갖고 108 I/S PBT 부직포는 916nm ± 174nm의 평균 섬유 직경을 가졌다. 부직포의 비표면적은 질소 흡착을 위한 BET 방법을 사용하여 구하였다. BET 분석에 따라 상업용 PBT 부직포는 0.86m2/g의 비표면적을 갖고 PLA 제거 후의 108 I/S PBT는 2.45m2/g의 비표면적을 갖는 것으로 밝혀졌다. 평균 유동 기공 크기는 모세관류 기공 측정기를 사용하여 구하였다. 상업용 PBT는 8.73㎛ ± 3.10㎛의 평균 유동 기공 크기를 나타내고 PLA 제거 후의 108 I/S PBT는 8.09㎛ ± 11.9㎛의 평균 유동 기공 크기를 가졌다. 도 2는 PLA "해"의 제거 전(A) 및 후(B)의 108 I/S PBT를 보여준다. PLA의 제거 후 섬유는 대체로 원래의 방향 배열을 유지한다는 것을 알 수 있다. 이로 인해 재료는 넓은 기공 크기 분포를 갖게 되고 원래 재료의 기공 구조를 유지하며 일단 PLA가 제거되면 보다 미세한 기공이 생성된다.
다양한 정도의 polyGMA 그라프팅에서의 정적 평형 단백질 흡착
상업적으로 이용 가능한 PBT 부직포 및 108 I/S PBT 부직포를 약한 음이온 교환 포맷 뿐만 아니라 강한 양이온 교환 포맷으로 다양한 정도의 polyGMA 적용범위에서 이들의 평형 정적 단백질 결합 용량에 대해 시험하였다. 2.5, 5.9, 7.2, 12 및 20% 중량 증가에서 그라프팅된 상업적으로 이용 가능한 PBT 부직포 및 5.6, 12, 및 20% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포는 DEA로 약한 음이온 교환체로서 관능되었다. 이러한 막을 순수한 BSA를 모델 단백질로 하여 시험하여 이러한 음이온 교환 막에 대한 정적 평형 결합 용량을 확립하였다. BSA는 66.5 kDa의 분자량과 4.7의 등전점을 갖는다[Sigma Aldrich, St. Louis MO]. 대략 20mg(25 x 15mm)의 부직포 샘플을 3ml 고체상 추출(SPE) 튜브에 배치하고 3ml의 저 이온 강도 결합 완충액, 20 mM Tris HCl pH 7.0로 5회 세척하였다. 샘플을 BSA 결합 전에 회전자(Tissue culturerotator, Glas-col, TerreHaute,IN) 상에서 결합 완충액 중에 적어도 30 분 동안 평형화시켰다. 일단 평형화되면 20mM Tris HCl pH 7.0 중의 3ml의 10mg/ml BSA를 각 샘플에 가하고 15시간 동안 밤새 결합되도록 하였다. pH 7.0의 저 이온 강도 완충액은, DEA 관능화되고 그라프팅된 PBT는 양으로 하전되고 BSA는 음으로 하전되어 단백질 결합을 방해하는 이온의 양을 최소로 하면서 결합을 촉진시키도록 보장한다. 결합 후, 샘플을 3ml의 20mM Tris HCl pH 7.0로 세척하였다. 모든 비결합 단백질을 제거하는 데에는 20mM Tris HCl pH 7.0로의 5회 세척이 요구되었으며, 이것은 280nm에서 UV-Vis 분광계를 사용하여 다섯 번째 및 최종 세척물 중의 무시해도 될 정도의 단백질 양에 의해 입증되었다. 결합된 BSA는 고 이온 강도 용출 완충액, 3ml의 20mM Tris HCl pH 7.0 + 1 M NaCl을 용출 완충액으로서 사용하여 용출시켰다. 용출 완충액 중의 높은 이온 농도는 이온 상호작용을 효과적으로 방해하여, 부직포로부터 단백질을 제거한다. 용출 분획을 수집하고 단백질 농도를 280nm에서 UV-Vis 분광계를 사용하여 구하였다. 정적 평형 결합 용량(M eq , 막의 질량당 단백질의 질량으로) 값은 방정식 2를 사용하여 구하였다.
Figure pct00008
(2)
유사한 방식으로, 그라프팅된 PBT 부직포를 포스페이트 그룹으로 관능화시킴으로써 강한 양이온 교환 막을 합성하였다. 5.3, 10 및 18% 중량 증가에서 그라프팅된 상업적으로 이용 가능한 PBT 멜트블로운 부직포 및 7, 12, 및 18% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포를 관능화시켜 강한 양이온 교환체를 제조하였다. 이러한 막을 순수 다클론성 hIgG를 모델 단백질로 하여 시험하여 이러한 양이온 교환 막에 대한 평형 결합 용량을 확립하였다. 다클론성 hIgG는 150 kDa의 분자량 및 7-9의 등전점을 갖는다[Equitek-Bio, Kerrville TX]. 대략 20mg(25 x 15mm)의 부직포 샘플을 3ml의 SPE 튜브에 배치하고 3ml 저 이온 강도 결합 완충액, 20mM 아세테이트 pH 5.5로 5회 세척하였다. 샘플을 hIgG 결합 전에 회전자(Tissue culturerotator, Glas-col, Terre Haute, IN) 상에서 결합 완충액 중에서 적어도 30 분 동안 평형화시켰다. 일단 평형화되면 20mM 아세테이트 pH 5.5 중의 3ml의 10mg/ml hIgG를 각 샘플에 가하고 15시간 동안 밤새 결합되도록 하였다. pH 5.5의 저 이온 강도 완충액은, 인산 관능화되고 그라프팅된 PBT는 음으로 하전되고 hIgG는 양으로 하전되어 단백질 결합을 방해하는 이온의 양을 최소로 하면서 결합을 촉진시키도록 보장한다. 결합 후, 샘플을 3ml의 20mM 아세테이트 pH 5.5로 세척하였다. 모든 비결합 단백질을 제거하는 데에는 20mM 아세테이트 pH 5.5로의 5회 세척이 요구되었으며, 이것은 280nm에서 UV-Vis 분광게를 사용하여 다섯 번째 및 최종 세척물 중의 무시해도 될 정도의 단백질 양에 의해 입증되었다. 결합된 hIgG는 3ml의 고 이온 강도 용출 완충액, 20mM 아세테이트 pH 5.5 + 1 M NaCl을 사용하여 용출시켰다. 용출 완충액 중의 높은 이온 농도는 이온 상호작용을 효과적으로 방해하여, 부직포로부터 단백질을 제거한다. 용출 분획을 수집하고 단백질 농도를 280nm에서 UV-Vis 분광계를 사용하여 구하였다. 방정식 2를 사용하여 정적 평형 결합 용량을 계산하였다.
단백질 흡착의 동역학
당해 실험은 그라프팅된 이온 교환 관능화된 부직포 PBT 막에서의 단백질 흡착의 속도를 측정하는 것을 목표로 하였다. 당해 실험에서, 상업적으로 이용 가능한 PBT 부직포 및 108 I/S PBT 부직포를 동일한 정도의 polyGMA 적용범위(% 중량 증가) 및 동일한 건조 polyGMA 그라프트 두께에서 그라프팅시켰다. polyGMA 그라프트의 건조 두께는, 그라프팅이 균일하면서도 등각이라고 가정하여, 샘플의 polyGMA의 % 중량 증가 및 polyGMA 및 PBT의 밀도로부터 추정할 수 있다. 이러한 가정은 원래의 PBT 섬유 및 polyGMA 그라프트 층의 용적을 원통형 PBT 내부 코어를 둘러싸는 원통형 외부 그라프팅 층을 갖는 동축 원통으로서 처리할 수 있도록 한다. 원통형 polyGMA 그라프팅 층의 외부 용적 및 PBT 원통형 코어의 내부 용적에 대한 표현과 방정식 1에 정의된 바와 같은 % 중량 증가를 사용하여, 방정식 3에 나타낸 바와 같은 건조 그라프팅 층 두께 근사치(δ)에 대한 표현을 도출할 수 있다. 방정식 3의 완전한 도출은 문헌[참조; the Supplemental Information: Derivation of dry polyGMA graft thickness]에서 찾아볼 수 있다.
Figure pct00009
(3)
방정식 3에서, δ는 건조 polyGMA 그라프트 두께이고, r 1 은 그라프팅된 특정 PBT 부직포의 평균 섬유 직경이고, ρPBT는 PBT 중합체의 밀도(1.30g/cm3)이고 ρpolyGMA는 건조 polyGMA 중합체의 밀도이다(0.80g/cm3). 표 1은 이들 각각의 % 중량 증가, 건조 polyGMA 브러시 두께 및 관능화 타입과 단백질 결합에 대한 접촉 시간의 영향을 분석한 실험에 대해 생성된 샘플의 목록을 담고 있다.
표 1: 단백질 흡착 속도 연구에서 사용된 PolyGMA 그라프팅된 부직포와 특정 그라프팅 정도, 건조 그라프트 두께( δ ), 및 이온 교환 기능.
Figure pct00010
대략 20mg(25 x 15mm)의 부직포 샘플을 3ml SPE 튜브에 배치하고, BSA로의 음이온 교환 실험의 경우에는 결합 완충액, 20mM Tris HCl pH 7.0 또는 hIgG로의 양이온 교환 실험의 경우에는 20mM 아세테이트 pH 5.5로 대대적으로 세척하였다. 샘플을 단백질 결합 전에 회전자(Tissue culturerotator, Glas-col, Terre Haute, IN) 상에서 결합 완충액 중에서 적어도 30 분 동안 평형화시켰다. 일단 샘플이 평형화되면, 이들을 각각 음이온 교환 또는 양이온 교환 부직포에 대해 3ml의 10mg/ml BSA 또는 3ml의 10mg/ml hIgG로 시험하였다. 단백질을 30초 내지 15시간의 다양한 노출 시간에서 결합되도록 하였다. 결합 후, 결합된 BSA를 갖는 음이온 교환 샘플은 3ml의 20mM Tris HCl pH 7.0로 5회 세척하고 결합된 hIgG를 갖는 양이온 교환 샘플은 3ml의 20mM 아세테이트 pH 5.5로 5회 세척하여 비결합된 단백질을 제거하였다. BSA는 3ml의 고 이온 강도 용출 완충액, 20mM Tris HCl pH 7.0 + 1 M NaCl을 사용하여 용출시켰다. hIgG는 3ml의 고 이온 강도 용출 완충액, 20mM 아세테이트 pH 5.5 + 1 M NaCl을 사용하여 용출시켰다. 용출 분획을 280nm에서 UV-Vis 분광계를 사용하여 분석하고 각 재료에 대한 결합된 단백질의 양을 방정식 2를 사용하여 계산하였다.
PBT 부직포의 그라프팅
상업용 PBT 및 108 I/S PBT 부직포를 다양한 정도의 polyGMA 적용범위로 성공적으로 그라프팅시켰다. 증가하는 UV 노출 시간에서 그라프팅 정도에 대한 결과가 도 3에 나타내어져 있다.
도 3으로부터, 108 I/S PBT 부직포가 상업용 PBT 부직포보다 더 빠른 속도로 그라프팅됨이 자명하다. 상업용 PBT 부직포에 비해, 108 I/S PBT 부직포는 GMA 중합의 개시를 위해 2.85배 더 많은 이용 가능한 면적을 가지므로, 대략 2.4배 더 높은 그라프팅 속도를 갖는다. 부직포 둘 다는 상이한 최소 그라프팅도에서 완전히 등각이면서 균일한 polyGMA 그라프트 적용범위를 나타낸다: 상업용 PBT 멜트블로운 부직포의 경우 3% 이상의 중량 증가 및 108 I/S PBT 부직포의 경우 6% 이상의 중량 증가. 20% 중량 증가에서 그라프팅 전 및 후의 108 I/S PBT 부직포 및 상업용 PBT 부직포의 SEM 이미지가 도 4에 나타내어져 있다.
도 4C 및 4D는 비그라프팅된 PBT 부직포에 대해 도 4A 및 4B에 나타내지 않은 polyGMA 그라프팅에 기인하는 PBT 섬유의 표면 상의 가시적으로 증가된 조도를 나타낸다. polyGMA 그라프팅의 속도를 증가시키는 외에, 108 I/S 섬유의 보다 작은 직경은 그라프팅된 층의 두께에 상당한 영향을 미친다. 도 4C 및 D에서 상업용 PBT 및 108 I/S PBT 둘 다는 polyGMA 그라프팅의 동일한 20% 중량 증가를 갖는다. 그러나, 108 I/S 부직포의 소정의 샘플에서 그라프팅하는데 더 많은 표면적이 이용 가능하므로, 상업용 PBT 부직포에서보다 더 얇은 그라프팅된 층 두께가 초래된다. 상업용 PBT 및 108 I/S PBT에서 다양한 정도의 그라프팅에 대한 실제 건조 그라프트 두께를 방정식 3을 사용하여 계산하였으며 표 1에 나타내어져 있다. 20% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT 및 108 I/S PBT 및 5.9% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT에 대한 건조 polyGMA 그라프트 두께를 비교한 시각적 개략도가 도 5에 나타내어져 있다.
도 5의 시각적 도식은 동일한 % 중량 증가의 그라프팅에 대해 108 I/S PBT 부직포(도 5C)에 비해 상업용 PBT 부직포(도 5A)에서 20% 증량 증가를 달성하는데 얼마나 두꺼운 polyGMA 그라프트 층이 필요한지를 예시한다. 그라프팅된 상업용 PBT 부직포가 I/S PBT 부직포와 동일한 그라프팅된 층 두께를 갖기 위해, 상업용 PBT의 % 중량 증가가 I/S 그라프팅된 부직포의 경우보다 3배 이상 더 작아야 한다는 것을 또한 알 수 있다(도 5B를 도 5C와 비교). 후속적으로 알 수 있는 바와 같이, 그라프팅된 층 두께는 막에 대한 단백질의 흡착 속도를 조절한다. 그러나, 평형 결합 용량은 단지 % 중량 증가의 함수이다.
유도체화된 PBT 부직포의 평형 단백질 결합 이온 교환 성능
상업용 PBT 부직포 및 108 I/S 부직포를 다양한 % 중량 증가에서 그라프팅시키고 BSA의 음이온 교환 포획 및 hIgG의 양이온 교환 포획 둘 다에 대한 이들의 평형 단백질 결합 용량을 측정하였다. 이러한 실험의 결과가 도 6에 나타내어져 있다.
도 6의 결과는 평형 단백질 결합 용량이 음이온 및 양이온 교환 막 둘 다에 대해 및 두 개의 매우 상이한 분자량 및 크기의 단백질에 대해 증가하는 polyGMA 그라프팅 정도(% 중량 증가)에 따라 선형으로 증가함을 보여준다. 108 I/S PBT 부직포는 상업용 PBT 부직포보다 2.85배 더 큰 비표면적을 갖지만 이들 둘 다는 매우 유사한 평형 결합 용량을 달성하였다. 이러한 결과는, 충분한 시간이 주어진다면, BSA(66.5 kDa)와 같은 중간 크기 단백질 및 hIgG(150 kDa)와 같은 큰 단백질 둘 다가, 전체 그라프팅된 층이 단백질로 포화될 때까지, 샘플의 그라프팅된 층으로 침투할 수 있음을 나타낸다. 이러한 단백질이 매우 상이한 분자량을 갖더라도, BSA 및 hIgG는 유사한 비체적(specific volume)을 갖는다(각각 0.733cm3/g 및 0.739cm3/g). 상업용 PBT 부직포 및 I/S PBT 부직포 샘플 둘 다가 동일한 원래 질량 및 동일한 % 중량 증가를 갖는 경우, 이들은 동일한 질량의 그라프팅된 층을 가지며, 따라서, 질량에 기초하여 평형 단백질 결합 용량이 어떻게 동일한지를 이해하기가 어렵지 않다. 이러한 결과는 또한, 당해 실험에서 사용되는 결합 용액 조건하에서 그라프팅된 층이 100nm의 회전 반경을 갖는 hIgG와 같은 훨씬 큰 분자의 침투를 가능하게 할 정도로 충분히 가요성 또는 다공성이어야 함을 나타낸다. 이러한 그라프팅된 층은 고도로 하전되기 때문에, 결합 상태 동안 저 이온 강도에서 그라프팅된 층은 연신된 배열로 있을 가능성이 있어, 단백질 침투가 가능해진다.
고 % 중량 증가 샘플의 경우 평형 단백질 결합 용량이 극히 커서, 20% 중량 증가에서 부직포 그램당 결합 단백질 800mg 이상의 값에 이른다는 것을 주지하는 것이 또한 중요하다. BSA 및 hIgG가 섬유의 외부 표면에 흡착되었을 뿐 그라프팅된 층에 침투되지 않는다면, 결합 용량은 훨씬 더 낮을 것이다. BSA 및 hIgG의 단일층 흡착은 어딘가에서 각각 2.5-6mg/m2 및 2-5.5mg/m2의 범위인 것으로 보고되었다. 이러한 단일층 적용범위 수 및 상업용 PBT 부직포의 측정된 비표면적을 고려할 때, BSA 및 hIgG에 대한 단일층 결합 용량은 각각 5.2 및 4.7mg/g일 것이다. 유사하게, 108 I/S PBT 부직포 상의 BSA 및 hIgG의 최대 단일층 적용범위는 각각 14.7 및 13.5mg/g일 것이다. 도 6에 보고된 평형 결합 용량 모두는 단일층 단백질 흡착보다 50 내지 200배 더 컸다. 이것은 polyGMA 브러시가 3차원 결합 환경을 생성한다는 매우 강력한 증거이며, 여기서 평형 단백질 흡착은 막의 질량당 결합을 위해 이용 가능한 중합체 브러시의 양에 따라 증가한다. 도 6은 동일한 정도의 polyGMA 그라프팅을 갖는 부직포 둘 다가 동일한 평형 단백질 결합 용량을 나타냄을 보여준다. 예를 들면 음이온 교환에 의해 20% 중량 증가에서 상업용 PBT 부직포는 평형시 823 ± 66mg/g의 BSA를 포획하였고 20% 중량 증가를 갖는 108 I/S PBT 부직포는 817 ± 164mg/g의 BSA를 포획하였다. 도 5는 20% 중량 증가 polyGMA 건조 그라프트 두께가 108 I/S PBT 부직포(δ= 69nm)보다 상업용 PBT 부직포(δ= 227nm)의 경우 더 크다는 것을 보여준다. % 중량 증가가 평형 결합 용량을 결정하지만 평형에서 단백질의 분포는 상업용 PBT 부직포와 108 I/S PBT 부직포 간에 매우 상이하다. 평형에서, 단백질은 재료의 보다 낮은 비표면적으로 인해 동일한 양의 단백질에 결합하는데 더 두꺼운 polyGMA 그라프팅된 층을 필요로 하는 상업용 PBT 부직포에 비해 108 I/S PBT 부직포에 대해 더 넓은 표면적에 걸쳐 더 얇은 층으로 분포된다.
polyGMA 그라프팅된 음이온 및 양이온 교환 부직포에의 흡착 속도
섹션 3.3에서 이온 교환 관능화된 polyGMA 그라프팅된 부직포가 매우 높은 평형 결합 용량을 보이는 것으로 나타났다. 그러나, 몇몇 용도의 경우 polyGMA 브러시 층에의 단백질 흡착의 동역학에 대한 % 중량 증가 및 그라프팅된 층 두께의 영향을 이해하는 것이 필요하다. 도 7은 20% 및 5.9% 중량 증가에서의 상업적으로 그라프팅된 PBT 뿐만 아니라 20% 중량 증가에서의 108 I/S 그라프팅된 PBT에 대한 다양한 단백질 노출 시간에서의 음이온 교환에 의한 BSA 포획에 대한 결과를 보여준다. 이러한 정도의 그라프팅은, 20% 중량 증가에서 상업용 PBT 및 108 I/S PBT 둘 다가 도 6에 나타낸 동일한 양의 polyGMA 그라프팅 및 평형 결합 용량을 갖고 5.9% 그라프팅에서 그라프팅된 상업용 PBT는 도 5에서 알 수 있는 바와 같이 108 I/S PBT와 동일한 polyGMA 그라프트 두께를 가지며, 유사한 단백질 흡착 속도를 갖기 때문에 선택되었다. 5.9% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S는 조사하지 않았는데, 그 이유는 이것은 완전 등각 그라프팅을 제공하는데 필요한 그라프팅의 하한이며 단백질 결합에 대해 시험된 재료에서 높은 변동성을 초래하기 때문이다.
이러한 실험은 정적 또는 비-유동 조건하에서 배치식으로 수행되었다. 도 7에서 20% 중량 증가에서 동일한 polyGMA 그라프팅 정도로 그라프팅된 상업적으로 이용 가능한 PBT 및 108 I/S PBT 부직포에 대한 BSA의 흡착 속도를 다양한 접촉 시간에서 단백질 포획에 대해 비교하였다. 20% 중량 증가에서 상업용 PBT 부직포 및 108 I/S PBT 부직포 둘 다는 충분한 접촉 시간이 주어지는 한 동일한 결합 용량(~800mg/g)으로 수렴되었으며, 이는 이전에 나타낸 결과와 일치하였다. 그러나, BSA가 108 I/S PBT 부직포보다도 훨씬 더 느린 속도로 20% 중량 증가 그라프팅된 상업용 PBT 부직포에 흡착함을 알 수 있다. 4시간 후 20% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT 부직포는 단지 평형 결합 용량의 60%에 도달한데 비해 20% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포는 이미 이의 평형 결합 용량에 도달하였다. 도 7은 또한 5.9% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT 부직포 또한 4시간의 단백질 접촉 시간 후 이의 평형 결합 용량에 도달하였음을 보여준다. 20% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포 및 5.9% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 부직포는 도 5에 나타낸 바와 같이 방정식 3에 따라 70nm의 동일한 건조 polyGMA 그라프트 두께를 갖는다. 이것은 이러한 그라프팅된 부직포에의 이온 교환에 의한 단백질의 흡착 속도가 대개 그라프팅된 층을 통한 확산 제한에 의해 결정되고, 따라서 그라프팅된 층 두께에 의해 지배되며, 상기 두께는 부직포의 초기 섬유 직경 및 그라프팅된 재료의 % 중량 증가에 의해 결정된다는 우수한 증거이다.
그라프팅된 상업용 PBT 부직포 및 108 I/S PBT 부직포에의 양이온 교환에 의한 hIgG 흡착의 동역학을 또한 조사하였다. 도 8은 18% 및 5.3% 중량 증가에서 상업적으로 그라프팅된 PBT 뿐만 아니라 18% 중량 증가 양이온 교환체에서 108 I/S 그라프팅된 PBT에 대한 다양한 접촉 시간에서의 hIgG 포획에 대한 결과를 나타낸다.
도 8은 동일한 정도의 polyGMA 그라프팅, 18% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 부직포 및 108 I/S PBT 부직포가 양이온 교환체로서 관능화되는 경우 어떻게 유사한 평형 hIgG 결합 용량으로 수렴되는지를 보여준다. 이것은 음이온 교환 막에 대해 도 7에 나타낸 것과 동일한 거동이다. 18% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포 샘플은 종일 단백질 접촉을 필요로 하는 18% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT 부직포에 비해 4시간 후 평형 결합에 도달하였다. 18% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포와 동일한 그라프트 두께(δ = 63nm)로 그라프팅된 5.3% 중량 증가를 갖는 상업용 PBT 부직포도 또한 대략 4시간 내에 평형에 도달하였다. 다시, 이러한 결과는 도 7에서 음이온 교환 부직포에 대해 밝혀진 결과와 전적으로 유사하며, 관찰되는 동력학적 현상이 그라프팅된 층 전하 타입, 또는 흡착되는 단백질의 크기에 좌우되지 않는다는 추가의 증거를 제공한다.
실제 적용을 위해 어떻게 단백질이 짧은 체류 시간에 결합하는지를 평가하는 것이 중요하다. 예를 들면, 이러한 막을 생물제제의 다운스트림 정제에서 단백질 포획에 사용하고자 하는 경우, 흡착 장치에서의 체류 시간이 5분 이하인 것이 바람직할 수 있다. 도 9는 15 분 하에 BSA 및 hIgG 접촉 시간에 대해 상기 논의된 음이온 및 양이온 교환 그라프팅된 부직포에 대한 도 7 및 8의 단백질 결합 데이터를 보여준다.
도 9에서 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포가 임의의 관능화되고 그라프팅된 상업용 PBT 부직포보다 양이온 및 음이온 교환 모드 둘 다에서 매우 짧은 접촉 시간에 더 많은 단백질에 결합할 수 있음이 자명하다. 108 I/S PBT 부직포가 초기에 더 많은 단백질에 결합할 수 있는 능력은 직물의 보다 높은 비표면적으로 인한 것이다. PLA 제거 후의 I/S PBT 부직포의 비표면적이 상업용 멜트블로운 PBT 부직포의 비표면적보다 2.85배 더 크다는 것을 상기한다. 도 9에 나타낸 데이터는 시간 t = 0에 외삽하여, polyGMA 층으로의 임의의 확산이 일어나기 전에 부직포 표면적 상의 단백질의 흡착으로 인해 즉각적으로 발생하는 결합된 단백질의 초기 양(M i )을 추정하였다. 단백질 흡착의 초기 양은 표 2에 제공되어 있다.
표 2: 표면적 흡착으로 인한 흡착된 단백질의 초기 양(M i ).
Figure pct00011
표 2에 나타낸 결과를 관능화된 상업용 PBT 부직포(120mg/g 평균 초기 단백질 결합) 및 108 I/S PBT 부직포(325mg/g 평균 초기 단백질 결합)에 대해 평균을 내면, 108 I/S PBT 부직포가 상업용 PBT 부직포보다 초기에 2.7배 더 많은 단백질에 결합하는 것으로 관찰된다. 이것은 상업용 PBT 부직포보다 108 I/S PBT 부직포에 대해 2.85배 더 높은 실험적 표면적과 매우 일치한다. 이러한 이유로 엄격히 보다 높은 비표면적으로 인해 상당히 높은 결합 용량을 달성할 수 있기 때문에 매우 짧은 체류 시간이 요구되는 경우 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포를 사용하는 것이 유리하다.
양이온 및 음이온 교환 그라프팅된 부직포에 대한 흡착 속도 측정의 결과는 흡착 공정이 이러한 관능화된 polyGMA 브러시 매트릭스에서 확산 제한되어 평형에 도달하는데 수 시간을 필요로 함을 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이러한 확산 문제를 최소화하기 위해 더 높은 표면적(더 작은 섬유 직경) 부직포가 더 낮은 표면적(더 큰 섬유 직경) 매트릭스에 비해 동일한 % 중량 증가에 대해 더 얇은 그라프팅된 층 두께를 초래한다. 도 7 및 8에서 알 수 있는 바와 같이 더 얇은 polyGMA 층은 확산 거리를 감소시키고 높은 평형 결합 용량을 유지하면서 평형에 도달하는 시간을 단축시킨다. 특정 polyGMA 그라프팅 정도에 대해 평형에 도달하는 시간을 감소시키는 이외에, 더 높은 비표면적 108 I/S PBT 부직포는 또한 도 9에서 관찰되는 바와 같이 단백질 흡착의 더 높은 초기 양에 기여한다. 전반적인 평형 단백질 결합 용량은 polyGMA 그라프팅의 정도에 의해 결정되지만 단백질 포획의 유효 속도는 부직포의 초기 비표면적 및 polyGMA 브러시 층의 두께에 의해 결정된다.
그라프팅된 polyGMA 부직포 샘플에의 단백질 흡착의 동역학에 대한 모델
상기한 음이온 및 양이온 그라프팅된 층 부직포에의 단백질 흡착에 대한 평형 및 속도 측정 둘 다의 결과에 의해 제공된 식견은, 흡착 공정을 설명하는 수학적 모델을 개발하는 것이 가능할 수 있으며, 이러한 수학적 모델은 실험 결과와 정성적으로 및 정량적으로 일치해야 함을 시사한다. 하전된 결합 부위에의 하전된 단백질의 흡착 속도는 이온 교환 배지에서의 물질 전달 제한의 속도에 비해 거의 순간적이다. 관능화된 중합체 층으로의 확산의 경우에 단백질 흡착에 대한 속도-결정 단계는 중합체 층으로의 침투인 것으로 이미 제안되었다. 단백질이 PBT 섬유 주위에 그라프팅된 관능화된 polyGMA 브러시 층에 시간 경과에 따라 어떻게 흡착하는지의 단면 도해가 도 10에 나타내어져 있다. 그라프팅된 층에의 흡착 속도는 층을 통한 단백질의 확산 속도보다 훨씬 빠를 수 있기 때문에, 일단 단백질 분자가 그라프팅된 층의 외부 표면 상의 하전된 그룹에 결합되면, 그라프팅된 층에 진입하는 추가의 분자는 결합된 단백질을 함유하는 층을 통해 확산되어야 한다고 이론을 세우는 것이 부당한 것은 아니다. 일단 비결합 단백질이 결합 단백질 층을 통해 확산되어 중합체 상의 자유 하전 그룹과 맞닥뜨리면 이것이 즉시 결합하여 결합 단백질 층은 PBT 섬유의 표면에 도달할 때까지 시간 경과에 따라 성장할 것이다. 방금 묘사한 현상은 크로마토그래피 수지에서 단백질의 확산에 적용되었던 종래의 수축 코어 모델과 일치한다. polyGMA 그라프팅된 층 상의 결합 단백질은 비결합 polyGMA의 잔류 층으로의 단백질 물질 이동에 대해 상당한 확산 저항을 생성하는 "쉘"을 형성하는 것으로 간주될 수 있다. 도 10은 전체 polyGMA 브러시 층이 결합 단백질을 가질 때까지 쉘의 두께가 시간 경과에 따라 어떻게 증가하는지를 보여준다. 비결합 polyGMA 브러시는 이 모델에서 "코어"이며 단백질이 "쉘"에 침투하여 브러시에 결합됨에 따라 수축한다. 초기에 흡착된 단백질을 갖는 "쉘"의 두께는 0일 것이며 외부 표면에의 단백질의 흡착 속도는 매우 빠를 것이다. 시간의 진행에 따라, "쉘" 두께 및 물질 이동에 대한 확산 저항은 흡착된 단백질 쉘이 PBT의 표면에 도달하고 "코어"가 0으로 수축할 때까지 증가한다. 본 출원인은 또한, 확산 공정이 흡착 속도에 비해 느리기 때문에, 확산 공정은 polyGMA 브러시 층으로의 확산에 의한 단백질 수송의 속도가 위치에 따라 일정하도록 준안정 상태에 있어, 쉘의 어떠한 지점에서도 하전된 중합체에의 단백질의 흡착 속도는 쉘을 통한 확산 속도와 같다고 가정하였다. 이러한 가정으로, 그라프팅된 층 내의 어떠한 반경 위치에서도, 단백질의 흡착 속도는 polyGMA 브러시 층으로의 단백질의 방사 확산 속도와 같으며 이는 방정식 4로 표현된다.
Figure pct00012
(4)
방정식 4에서, R a 는 주어진 반경 위치에서 쉘에의 단백질의 총 흡착 속도이고, D e 는 흡착된 단백질을 갖는 polyGMA 브러시 매트릭스에서의 단백질의 유효 확산도이고, C 단백질 은 polyGMA 층을 통해 확산하는 단백질 농도이고, L은 주어진 섬유의 길이이고, r은 반경 위치이다. polyGMA 브러시에 의한 단백질 결합의 속도가 거의 순간적이기 ‹š문에 "코어" 및 "쉘" 사이의 계면에서의 단백질 농도(r = r c )를 0이라고 할 수 있다. 게다가, 쉘을 통한 확산이 속도-제한 단계이기 때문에 쉘의 외부에서의 단백질 농도(r = r 2 )는 C 벌크 로 표시되는 용액 중의 벌크 단백질 농도에 등가이다. 그라프팅된 층의 내부 반경에서 외부 반경까지 방정식 4를 적분하면 단백질의 흡착 속도에 있어서의 반경 변화를 표현할 수 있다.
Figure pct00013
r 1 < r c < r 2 (5)
코어로 확산되고 polyGMA에 결합하는 단백질의 속도는 결합을 위해 이용 가능한 polyGMA "코어" 물질의 질량 소비 속도와 같다.
Figure pct00014
(6)
비점유 polyGMA "코어"의 질량의 소멸 속도는 polyGMA에 의해 점유된 용적 변화의 시간 속도 및 밀도 측면에서 표현될 수 있다(방정식 7),
Figure pct00015
(7)
방정식 6과 7을 방정식 5에 대입하면 polyGMA의 "코어"와 결합 단백질을 갖는 "쉘" 사이 계면의 변화 시간 속도에 대한 방정식이 산출된다.
Figure pct00016
(8)
시간 t = 0에서, 코어 반경은 r 2 이다. 방정식 8을 시간에 대해 적분하면, 시간의 함수로서 그라프팅된 층에 흡착된 질량에 대한 표현이 유도된다,
Figure pct00017
(9)
방정식 9에서 M은 임의의 주어진 시간에 결합된 단백질의 질량이고, M eq 는 평형에서 결합된 단백질의 질량이고, M i 는 부직포의 외부 표면적에서의 흡착으로 인한 시간 t = 0에서 결합된 단백질의 초기 질량이다. 수축 코어 모델은 이러한 초기 단백질 흡착(M i )을 예측하지 못하지만 이것은 우리의 실험 결과로부터 추정할 수 있다(도 9 참조). 이 모델을 사용하는 경우, 용액 중에 초기 침지 단계 후 시간의 함수로서 polyGMA 브러시 층에 흡착된 단백질의 평형 양의 분율은
Figure pct00018
= [(M-M i )/(M eq -M i )]에 의해 제공된다. 시간의 함수로서 polyGMA 브러시 층에 결합된 단백질의 총량은 두 개의 파라미터에 따라 좌우된다: 상이한 섬유 직경 및 그라프팅된 층 두께를 갖는 각각의 상이한 부직포마다 다른 τ 및
Figure pct00019
,
Figure pct00020
(10)
Figure pct00021
(11)
방정식 10 및 11에서, r 1 및 r 2 는 도 10에서 알 수 있는 바와 같이 각각 PBT 섬유 및 polyGMA 브러시 층으로 덮힌 섬유의 반경이다. 추가로 방정식 10에서, D e 는 쉘 층을 통한 단백질의 유효 확산도이고, C 벌크 는 액체 상에서 단백질 용액의 농도이며, 이것은 수행된 각 실험에 대해 10mg/ml이었다.
polyGMA 브러시는 하전된 그룹으로 관능화되는 경우 전하들 간의 정전기 반발의 결과로서 수성 용매 중에서 팽윤하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 방정식 3에 의해 계산된 건조 polyGMA 브러시 두께를 r 2 를 결정하는데 사용할 수 없으며 팽윤된 polyGMA 브러시 두께를 계산해야 한다. 브러시 층이 단백질로 완전히 충전된 경우 polyGMA 브러시가 가능한 최대로 연장된다고 가정한다면, 우리는 polyGMA 브러시 두께 r 2 를 추정할 수 있다. 단백질은 충분한 시간이 주어지는 경우 다가 전해질 브러시 매트릭스에서 높은 충전 효율을 달성하는 것으로 알려져 있기 때문에 이것은 합당한 가정이다. 평형에서 막의 질량당 흡착된 단백질의 질량은 M eq (단백질 질량/막 질량)이며 물질의 결합 용량에 해당한다. 결합된 단백질의 질량을 단백질의 부분 비체적을 사용하여 결합된 단백질의 용적으로 변환시킬 수 있다. 단백질에 의해 점유된 용적은 PBT 섬유 주위의 고리형 원통의 용적이다. 이러한 기하학적 구조를 사용하여, 방정식 12를 사용하여 팽윤된 polyGMA 브러시 두께를 제공하도록 r2를 계산할 수 있다. 방정식 12의 유도는 문헌[참조; the SupplementaryInformation: Derivation of swollen polyGMA brush radius]에서 찾아볼 수 있다.
Figure pct00022
(12)
방정식 12에서, M eq 는 평형 결합 용량이고,
Figure pct00023
는 단백질의 부분 비체적(
Figure pct00024
BSA = 0.733cm3/g 및
Figure pct00025
IgG = 0.739cm3/g)이고, ρ PBT 는 PBT 섬유의 밀도(ρ PBT =1.33g/cm3)이고, r 1 은 PBT 섬유의 반경이다.
관찰된 브러시 두께를 증가시키는 이외에, polyGMA 브러시의 팽윤은 브러시가 차지하는 용적을 효과적으로 증가시켜 "코어"에 대한 관찰된 밀도를 감소시킨다. 비결합 팽윤된 polyGMA 브러시가 "코어"를 구성하고 이러한 브러시의 밀도가 코어의 밀도이다. 우리는 PBT 부직포에서의 중량 증가로부터의 polyGMA 브러시의 질량을 알고 있고 r 2 에 대한 계산치를 사용하여 팽윤된 polyGMA 브러시의 용적을 계산할 수 있다. polyGMA 브러시에 대한 질량 및 용적을 사용하여, 방정식 13으로 표현되는 "코어"의 유효 밀도를 계산할 수 있으며, 이의 유도는 문헌[참조; the Supplementary Information: Derivation of polyGMA core density]에서 찾아볼 수 있다.
Figure pct00026
(13)
방정식 13에서, ρ 코어 는 단백질이 흡착된 "코어"의 유효 밀도이고, % 중량 증가는 그라프팅으로부터 부직포에 부가된 polyGMA의 질량이며, ρPBT는 PBT 섬유의 밀도이고, r 1 는 PBT 섬유의 반경이며, r 2 는 팽윤된 polyGMA 반경이다. r 2 에 대한 계산치 뿐만 아니라 후속적인 팽윤된 polyGMA 브러시 두께, 유효 코어 밀도, 및
Figure pct00027
에 대한 값이 표 3에 나타내어져 있다.
표 3: PBT에 그라프팅된 팽윤 polyGMA 층의 반경, 팽윤 polyGMA 두께, 유효 "코어" 밀도, 및 다양한 그라프팅된 부직포 샘플에 대한 값들.
Figure pct00028
표 3에 제시된
Figure pct00029
값들을 사용하면, 시간의 함수로서 막에 흡착된 총 질량에 대한 실험 데이터를 사용하여 방정식 9에 남은 단 하나의 파라미터 τ를 피팅할 수 있다. 그후, 이러한 τ의 값으로부터 polyGMA 그라프팅된 층에 흡착된 단백질의 "쉘"을 통해 확산되는 단백질의 유효 확산도의 값을 추정할 수 있다. 도 11A 및 B는 역학적 실험에서 시험된 모든 부직포에 대한 Ψ 대 단백질 접촉 시간(t)의 결과에 대한 최적선을 보여준다. 도 13에서 관찰되는 수평 점선 및 파선은 표 3에서 수득된 다양한
Figure pct00030
값에 대한 단백질로의 관능화된 polyGMA "코어"의 평형 흡착에 대한 Ψ의 최대값(Ψ max )이다. 도 13에서 관찰되는 최적선이 Ψ max 에 도달하는 시간은 평형 단백질 결합에 도달하는데 필요한 시간(t eq )이다. 또한, 도 13에서 관찰되는 최적선의 기울기는 방정식 5.1에 의해 정의된 바와 같은 τ의 역수와 같다. 일단 τ을 알면, "쉘"을 통한 단백질 수송의 유효 확산도(D e )에 대한 값을 방정식 5.2를 사용하여 계산할 수 있다. t eq , τ 및 D e 의 값은 표 4에 나타내어져 있다.
표 4: 특징적인 흡착 시간(τ), polyGMA "코어"의 완전 전환을 달성하는데 필요한 시간(t eq ), 및 수축 코어 모델에서 "쉘"을 통한 단백질 확산에 대해 계산된 유효 확산도(D e ).
Figure pct00031
음이온 교환 및 양이온 교환 시스템에 대한 τ의 최적 값으로부터 수득된 실험적 유효 확산도가 표 4에 나타내어져 있다. 단백질 충전된 음이온 교환 관능화된 polyGMA 층을 통한 BSA 확산의 경우, 유효 확산도는 2.47x10-13 내지 7.25x10-13 cm2/s 사이였으며, 평균 유효 확산도는 4.77x10-13 cm2/s이었다. 단백질 충전된 양이온 교환 관능화된 polyGMA 층을 통한 hIgG 확산의 경우, 유효 확산도는 1.28x10-13 내지 11.6x10-13 cm2/s 사이였으며, 평균 유효 확산도는 5.16x10-13 cm2/s이었다. 스토크-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)에 따르면 BSA 및 IgG는 실온에서 물 중에 각각 6.23 x 10-7 cm2/s 및 3.41 x 10-7 cm2/s의 확산 계수를 갖는다. 크로마토그래피 수지에서 단백질에 대한 전형적인 기공 확산 계수는 대략 10-9 내지 10-12 cm2/s이다. 이온 교환 관능화된 polyGMA 그라프팅된 부직포 상의 단백질 포획에 대한 유효 확산도는 크로마토그래피 수지에서 대부분의 기공 확산 계수보다 상당히 더 낮다. 이온 교환 관능화된 polyGMA 브러시에 의한 단백질 포획이 도 10에 도시된 polyGMA/단백질 "쉘"에서 심각한 확산 제한을 겪으므로, 표 4에 나타낸 바와 같이 평형에 도달하는데 수 분, 그렇지 않다면, 수 시간이 필요하다는 것이 자명하다.
수축 코어 모델은 단백질이 시간 경과에 따라 어떻게 polyGMA "코어"에 흡착되는지를 예측하기 위해
Figure pct00032
및 τ에 의지한다. 각각 표 3 및 4에서 찾아볼 수 있는
Figure pct00033
및 τ에 대한 값을 사용하여 수축 코어 모델 결과를 시간의 함수로서 관능화된 polyGMA "코어"에의 단백질 흡착에 대한 실험 데이터와 비교할 수 있다. 음이온 교환 polyGMA "코어"에의 BSA의 흡착 질량 대
Figure pct00034
의 값을 사용한 t/τ에 대한 결과가 도 12에 나타내어져 있다. 도 12에서 보여지는 바와 같이, 수축 코어 모델은 실험 데이터의 양호한 근사치를 제공한다. 수축 코어 모델에서 polyGMA 그라프트의 두께가 주어진 PBT 섬유 직경 주위에서 증가함에 따라,
Figure pct00035
의 값은 감소하고, Ψ max 에 대한 값은 도 11에서 알 수 있는 바와 같이 증가하며, 흡착의 특징적인 시간 규모(τ)는 증가한다. 이러한 이유로 인해, 표 4에서 알 수 있는 바와 같이 보다 두꺼운 그라프트 층을 갖는 샘플의 경우 평형에 도달하는데 더 긴 시간이 요구된다. 이러한 현상은 특히 각각 504nm 및 281nm의 팽윤된 polyGMA 브러시 두께를 갖는 20% 중량 증가 및 5.9%에서 그라프팅된 상업용 PBT를 비교하는 경우 알 수 있다. 샘플 둘 다는 상이한 정도의 polyGMA 적용범위를 갖는 동일한 출발 물질을 이용하므로, 실질적으로 상이한 값의
Figure pct00036
, Ψ max , 및 τ를 초래한다. 따라서, 수축 코어 모델에 따르면 보다 얇은 그라프팅된 층을 갖는 상업용 PBT는 보다 빠른 전환 속도를 나타내고 평형에 보다 빨리 도달할 것이다. 이것은 876 분에 평형에 도달하는 20% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT에 비해 241 분에 평형에 도달하는 5.9% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT에서 관찰된다.
108 I/S PBT 부직포는 도 5에 나타나 있는 바와 같이 상업용 PBT 부직포보다 더 작은 PBT 섬유 직경을 가지며 더 얇은 그라프팅된 polyGMA 브러시 층을 야기한다. 그러나, 20% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 및 108 I/S PBT 부직포에 대한 r 1 및 r 2 의 값들 사이에는 비례원칙이 있어,
Figure pct00037
에 대한 유사한 값 및 수축 코어 모델에서 유사한 동향을 초래한다.
Figure pct00038
의 값이 20% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포 및 상업용 PBT 부직포 둘 다에 대해 동일하더라도, 이들의 흡착의 특징적인 시간 규모는 실질적으로 다르며, τ는 20% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S 부직포의 경우 1839 분이고 20% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT 부직포의 경우 6716 분이다. 20% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포에서 관찰된 흡착의 보다 작은 특징적인 시간 규모로 인해, 평형에 도달하는데 876 분을 필요로 하는 20% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 부직포에 비해, 223 분 후 평형에 도달한다. 5.9% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT 및 20% 중량 증가로 그라프팅된 108 I/S PBT 둘 다는 더 짧은 polyGMA 브러시 두께를 갖고, 거의 900 분을 필요로 하는 20% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT 부직포에 비해, 수축 코어 모델에 따르면 220 내지 250 분의 평형 결합에 도달하는데 필요한 실질적으로 더 짧은 시간을 갖는다. 이것은 polyGMA 그라프팅된 층의 두께를 감소시키면 이러한 확산 제한된 흡착 공정에서 polyGMA 코어의 전환 속도가 더 빨라지고 평형에 도달하는 시간이 더 단축된다는 강력한 증거이다.
다양한
Figure pct00039
값에 피팅된 수축 코어 모델의 t/τ에 대해 플롯팅된 hIgG 결합에 의한 양이온 교환 polyGMA "코어"의 전환에 대한 결과가 도 13에 제시되어 있다. 도 13이 보여주는 바와 같이, 수축 코어 모델은 상이한
Figure pct00040
값에 대한 실험 데이터의 공정한 근사치이다. 음이온 교환 부직포와 유사하게, 소정의 PBT 섬유 직경에 대해 더 얇은 polyGMA 층의 경우 평형에 도달하는데 더 짧은 시간이 관찰된다. 5.3% 중량 증가로 그라프팅된 상업용 PBT는 평형에 도달하는데 556 분을 필요로 하는 18% 중량 증가의 polyGMA 그라프팅에 비해 283 분 내에 평형을 달성할 수 있었다. 18% 중량 증가에서 그라프팅된 108 I/S PBT 부직포는 또한 18% 중량 증가에서 그라프팅된 상업용 PBT에 비해 더 짧은 양의 시간 내에 평형 결합을 달성하였다. 그러나, 표 4가 입증하는 바와 같이 평형 결합 시간의 차는 음이온 교환 샘플 만큼 크지 않았다.
도 12 및 13에 도시된 수축 코어 모델은 단백질 결합의 매우 짧은 시간 규모에서 알 수 있는 단백질 결합의 매우 빠른 초기 속도를 입증한다. 충분한 양의 단백질이 결합함에 따라, 단백질 흡착을 위해 확산 제한을 도입한 "쉘"이 도 10에 도시된 바와 같이 생성된다. 단백질 결합된 polyGMA "쉘"은 시간 경과에 따라 더 두꺼워지며 이러한 조밀한 층에서 확산의 거리는 더 커져서, 단백질 확산이 결합을 위해 이용 가능한 코어에 도달하는데 더 오랜 시간을 필요로 한다. 이것은 재료가 평형에 근접함에 따라 실험적으로 및 수축 코어 모델에서 모두 감소하는 단백질 흡착 속도로서 도 12 및 13에서 관찰된다.
이온 교환 관능화된 polyGMA 브러시에 의한 단백질 포획이 심각한 확산 제한을 겪으므로, 평형에 도달하는데 수 분, 그렇지 않다면, 수 시간이 필요하다는 것이 자명하다. 따라서, 보다 얇은 polyGMA 브러시 층을 사용하여 확산의 거리를 감소시키고 완전한 전환을 위해 필요한 시간을 줄이는 것이 유리하다. 추가로 108 I/S PBT와 같은 고 표면적 부직포를 사용함으로써 도 5가 보여주는 바와 같이 polyGMA 결합 용적이 더 얇은 층에 분포될 수 있어, 높은 단백질 결합 용량을 여전히 유지하면서 표획 시간을 줄일 수 있다.
본 발명의 다수의 개질 및 기타의 양태들은 상기한 설명에 나타낸 교시들의 혜택을 갖는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에게 상기될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 양태들에 제한되지 않으며 개질 및 기타 양태들은 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 특정 용어들이 본원에서 사용되지만, 이들은 단지 포괄적이면서 서술적인 의미로 사용되며 제한의 목적은 아니다.

Claims (14)

  1. 약 1.5 마이크론 미만의 평균 섬유 직경을 갖는 다수의 폴리에스테르 섬유를 포함하는 부직 웹(nonwoven web)을 포함하고, 상기 다수의 폴리에스테르 섬유 각각에는 메타크릴레이트 중합체로 구성된 다수의 중합체 세그먼트가 그라프팅(grafting)되며, 각각의 중합체 세그먼트가 표적 분자에 결합하는데 적합한 관능 그룹을 지니는, 생체분리(bioseparation) 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메타크릴레이트 중합체가 글리시딜 메타크릴레이트, 메타크릴산, 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, [2-(메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸-암모늄 클로라이드, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 설폰산, 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 3-클로로-2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단량체로부터 구성되는 부직포 막.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리에스테르 섬유가 폴리부틸렌 테레프탈레이트로 구성되는 부직포 막.
  4. 제1항에 있어서, 상기 평균 섬유 직경이 약 1 마이크론 이하인 부직포 막.
  5. 제1항에 있어서, 상기 관능 그룹이 표적 분자와의 양이온 또는 음이온 교환에 적합한 부직포 막.
  6. 제1항에 있어서, 상기 부직 웹이 해도형(islands-in-the-sea) 이성분 섬유의 해 성분(sea component)의 제거 후 남은 도 섬유(island fiber)를 포함하는 부직포 막.
  7. 제1항에 있어서, 상기 부직 웹이 적어도 약 1.5 m2/g의 BET 비표면적을 갖는 부직포 막.
  8. 제1항에 있어서, 상기 그라프팅된 중합체 세그먼트의 중량이 부직 웹의 중량의 약 2 내지 약 50%인 부직포 막.
  9. 표적 분자를 포함하는 용액을 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항의 부직포 막을 통해 통과시켜, 상기 용액 중의 표적 분자의 적어도 일부가 상기 부직포 막에 결합하도록 함을 포함하는 생체분리 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 방법.
  11. i) 다수의 해도형 섬유, 또는 이성분 해도형 섬유의 해 성분의 제거 후 남은 다수의 도 섬유를 포함하는 부직 웹을 제공받는 단계;
    ii) 임의로, 이성분 해도형 섬유의 해 성분을 제거하여 이의 도 섬유를 노출시키는 단계;
    iii) 메타크릴레이트 중합체를 상기 도 섬유의 표면에 그라프팅시켜 이에 공유적으로 부착된 다수의 중합체 세그먼트를 형성함으로써, 그라프팅된 도 섬유를 형성하는 단계로서, 상기 그라프팅 단계는 상기 부직 웹을 개시제 및 적어도 하나의 메타크릴레이트 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계 및 상기 부직 웹을 자외선 또는 열에 노출시켜 메타크릴레이트 단량체의 중합을 개시하는 단계를 포함하는, 상기 그라프팅된 도 섬유를 형성하는 단계; 및
    iv) 임의로, 표적 분자를 상기 그라프팅된 도 섬유의 다수의 중합체 세그먼트의 각각에 결합시키는데 적합한 적어도 하나의 관능 그룹을 부착시키기 위해 그라프팅된 도 섬유를 관능화시키는 단계를 포함하여, 생체분리 공정에서 사용하기 위한 중합체-그라프팅되고 관능화된 부직포 막을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 도 섬유가 폴리부틸렌 테레프탈레이트로 구성되고 상기 메타크릴레이트 중합체가 polyGMA인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 용액 중의 단량체의 농도가 약 5 내지 약 50% v/v이고 상기 개시제가 약 1:100 내지 약 1:5의 개시제 대 단량체의 몰 비로 존재하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 개시제가 벤조페논인 방법.
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