KR20180025219A - 고본 발효 추출물을 포함하는 미백활성 화장료 조성물 - Google Patents
고본 발효 추출물을 포함하는 미백활성 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 고본의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 고본의 황국균 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 안전한 천연 제제를 이용한 것으로 피부 적용시 부작용이 없으며 고본의 황국균 발효에 따라 고본에서 확인되지 않았던 주름 개선, 미백 및 피부 탄력 증진 효과를 통해 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 우수한 피부 개선 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부노화는 자연히 발생하는 내인성 노화와 외부 요인에 의해 일어나는 외인성 노화로 구분된다. 내인성 노화의 요인은 주로 유전적인 요인을 말하며 피부 세포 및 조직의 구조와 변화를 결정한다. 외인성 노화의 요인은 외부에서 유래된 요인으로 영양부족, 햇빛, 환경오염 등이 속하며 얼마든지 예방 가능하고 피할 수 있는 요인이다.
이러한 요인으로 인해 피부 노화가 진행됨으로서 피부가 건조해지고 거칠어지며 주름 생성, 색소 침착 및 수분 부족 현상 등이 일어나게 된다. 따라서 피부 미용에 대한 관심이 높아지며 특히 피부 노화에 대한 관심과 노화를 늦추기 위한 시도들이 행하여지고 있다.
예를 들어 주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있다. 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형, 진피의 기질인 히아루론산의 감소에 의한 피부 탄력 감소이다. 특히 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 피부 주름의 시작은 진피의 노화에서부터 진행되고 탄력섬유인 엘라스틴의 구조가 변화되어 피부는 늘어지면서 주름이 생기게 되며, 진피의 콜라겐과 다른 결합조직 성분을 분해시키는 MMPs(matrix metalloproteinase) 활성 증가로 인해 콜라겐 합성이 저해되어 주름이 증가한다는 연구가 많이 진행되고 있다.
또한, 피부 미백이 멜라닌 색소와 직접적으로 관련되어 있다는 것은 널리 알려진 사실이다. 멜라닌은 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부 기관을 보호해주는 동시에, 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등에 의한 피부 내 단백질과 유전자들의 손상을 보호해주는 유용한 역할을 하지만, 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 피부 노화를 가져오며 기미나 주근깨 등과 같은 과색소침착증을 유발한다. 미백 작용은 멜라닌의 생성을 억제하거나, 멜라노좀의 이동을 저해함으로써 가능해진다. 이러한 메커니즘으로 식약처에 의해 미백 성분으로 등록된 물질은 닥나무추출물, 알부틴, 에칠아스코빌에텔, 유용성감초추출물, 아스코빌글루코사이드, 나이아신아마이드, 알파-비사볼올, 아스코빌테트라이소팔미테이트 등인데, 일반적으로 멜라닌의 생성을 억제함으로써 그 효과를 나타낸다.
대한민국 등록 특허공보 제1480696호는 사삼, 고본 및 생약 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 복합제제를 사용한 각질세포 형성 증진, 항산화, 피부 보습, 피부장벽 회복 효과를 개시하고 있으나, 주름개선, 미백, 콜라겐 합성 등과 관련된 효과에 대하여는 전혀 언급하고 있지 않으며, 상기 개시된 효과도 복합제제와 비교하여 고본 단독으로는 효과가 떨어지는 것으로 나타났다.
그러나, 대부분의 알려진 주름 개선 또는 미백 효과를 가진 피부 개선을 위한 물질들은 피부 적용시 자극, 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부기능 개선 또는 상처 치유의 효과를 기대할 수 없었다. 따라서, 기존의 피부 개선용 화장료 조성물보다 생체에 안전하고 효과가 높은 새로운 피부 개선용 화장료 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
한 양태에서 본원은 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본원에 따른 화장료 조성물은 특히 노화로 인한 피부 상태 개선, 예를 들면 주름 개선, 피부 탄력 증가 또는 개선, 또는 피부 미백용으로 사용된다.
이런 측면에서 본원은 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본원에 따른 조성물은 다양한 형태 예를 들면 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 등으로 제조되어 사용될 수 있다.
본원에 따른 조성물에서 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량%의 양으로, 바람직하게는 0.01% ~ 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 포함될 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용, 또는 피부 노화 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 안정화된 화장품 제형을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물 제조 방법을 제공한다.
본원의 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 안전한 천연 제제를 이용한 것으로 피부 적용시 부작용이 없으며 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물에 따라 고본 뿌리에서 확인되지 않았던 주름 개선, 미백 및 피부 탄력 증진과 같은 우수한 효과를 나타낸다.
특히 본원에 따른 특유의 효과는 아래에 기재될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 특유의 효과 중 하나는 발효 전 및 후 비교시 발효 후 미백, 주름개선 활성이 월등히 높아진 것으로 나타났으며(실시예 3 및 7 참조) 이는 실시예 2를 근거로 발효로 인해 생성된 프로토카테츄익산 등 신규 생성물질 발효에 의해 생성된 물질로 인한 것으로 판단된다.
또한 본원에 따른 발효조건에 의한 특유의 효과 중 다른 하나는 다양한 %의 고본추출물 넣어 발효시 가장 좋은 발효조건은 고본추출물 20% 첨가해 발효한 것이 월등히 미백과 주름효과가 좋은 것으로 나타났다(실시예 3, 5 및 7 참조).
나아가 화장료 제형에 있어서도 20% 고본 발효추출물 자체의 수용액상에 열안정성이 매우 낮으나(실시예 9), 본 O/W 화장품제형에서 열가혹조건 안정성이 뛰어남 확인하였다(실시예 11).
더 나아가 고본 발효추출물 화장품제형에 첨가시 유효농도를 확인한 결과 0.1 중량%에서 미백, 주름개선 활성이 가장 높은 것으로 확인하였다(세포실험 - 실시예 5, 7, 8/ 인체적용시험 - 실시예 13, 14).
또한 독성으로부터 안전성 확인이 확인되었다(세포독성안전성 - 실시예 4, 6 / 인체자극시험 무자극 - 실시예 12).
도 1은 고본 뿌리 추출물 첨가량을 0% ~ 50%로 다르게 첨가하여 각각을 황국균으로 발효한 후에 얻은 각 발효 추출물의 HPLC 분석크로마토그램을 나타낸 것으로, 고본 뿌리 추출물을 황국균으로 발효함으로써 나타나는 물질의 변화를 나타낸 것으로, 도 1의 (a)는 고본 뿌리 추출물을 0% 첨가한 황국균 발효추출물의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 1의 (b)는 고본 뿌리 추출물을 10% 첨가한 황국균 발효추출물의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 1의 (c)는 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효추출물의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 1의 (d)는 고본 뿌리 추출물을 50% 첨가한 황국균 발효추출물의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이고, 도 1의 (e)는 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물을 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다. 빨간 화살표는 Decursin과 z-리구스틸리드(z-ligustilide)로 예상되는 물질이 용출되어 나오는 피크위치를 나타난 것이다.
도 2a는 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물(a)과 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물(b) 각각을 에탄올로 추출한 후 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2b는 상기 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물(a)과 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물(b) 각각을 에틸아세테이트로 추출한 후 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2c는 상기 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물(a)과 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물(b) 각각을 DW로 추출한 후 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 1 및 2의 결과는 고본 뿌리 추출물과 황국균 발효물, 그리고 고본 뿌리 추출물을 황국균으로 발효한 고본 뿌리 황국균 발효추출물들은 서로 다른 크로마토그램을 나타냈으며 이것은 고본 뿌리를 황국균으로 발효시 기존의 물질들이 대사되어 새로운 물질로 바뀌거나 새롭게 생성됨을 나타낸다.
도 3은 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 발효 전후의 타이로시네이즈(tyrosonase)억제효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 여러가지 %로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 각 발효추출물의 세포독성을 조사한 것으로, 도 4a는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 10% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 세포독성조사 결과이고, 도 4b는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 세포독성조사 결과이고, 도 4c 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 50% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 세포독성조사결과이다.
도 5a는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 여러가지 %로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 각 발효추출물의 멜라닌합성 저해효과를 조사한 것으로써, 도 5a의 (a)는 고본 뿌리 추출물을 10% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 멜라닌합성저해효과를 나타낸 것이고, 도 5a의 (b)는 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 멜라닌합성저해효과를 나타낸 것이고, 도 5a의 (c)는 고본 뿌리 추출물을 50% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 멜라닌합성저해효과를 나타낸 것이다.
도 5b는 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 발효 전후의 멜라닌합성저해효과를 조사한 것이다.
도 6은 인간섬유아세포에서 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 처리 후 세포독성을 조사한 결과이다.
도 7은 인간섬유아세포에서 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 처리 후 콜라겐분해효소(MMP1)발현 저해효과를 나타낸 것이다.
도 8은 인간섬유아세포에서 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 처리 후 콜라겐발현 증가효과를 나타낸 것이다.
도 9는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물의 수용액상에서 지표성분분석을 통한 안정성조사 결과로, 도 9의 (a)는 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 함유 수용액의 지표성분변화 HPLC 분석 크로마토그램이고, 도 9의 (b)는 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 함유 수용액을 70℃에서 24시간 보관 후 지표성분변화 HPLC 분석크로마토그램이다.
도 10은 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물의 화장품제형에서 지표성분분석을 통한 안정성 조사결과로, 도 10의 (a)는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형의 지표성분 HPLC 분석 크로마토그램이고, 도 10의 (b)는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형을 -20℃에서 24시간 보관 후 지표성분 HPLC 분석 크로마토그램이고, 도 10의 (c)는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형을 70℃에서 24시간 보관 후 지표성분 HPLC 분석 크로마토그램이다.
도 11은 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형의 비중, 점도, pH, 지표성분함량 변화분석을 통한 안정성조사결과이다.
도 12는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형의 첩포자극 안전성 인체적용 임상시험결과이다.
도 13은 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형과 첨가하지 않은 화장품제형의 피부미백개선 인체적용 비교임상시험 결과로, 도 13a는 피부미백 개선효능평가를 위한 인체적용시험결과 임상기관보고서 요약문이고, 도 13b는 피부미백 개선효능평가를 위한 인체적용시험 측정결과이다.
도 14는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형과 첨가하지 않은 화장품제형의 피부주름개선 인체적용 비교임상시험 결과로, 도 14a는 피부주름개선효능평가를 위한 인체적용시험결과 임상기관보고서 요약문이고, 도 14b는 피부주름개선효능평가를 위한 인체적용시험 측정결과이다.
도 2a는 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물(a)과 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물(b) 각각을 에탄올로 추출한 후 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2b는 상기 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물(a)과 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물(b) 각각을 에틸아세테이트로 추출한 후 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2c는 상기 발효하지 않은 고본 뿌리 추출물(a)과 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물(b) 각각을 DW로 추출한 후 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 1 및 2의 결과는 고본 뿌리 추출물과 황국균 발효물, 그리고 고본 뿌리 추출물을 황국균으로 발효한 고본 뿌리 황국균 발효추출물들은 서로 다른 크로마토그램을 나타냈으며 이것은 고본 뿌리를 황국균으로 발효시 기존의 물질들이 대사되어 새로운 물질로 바뀌거나 새롭게 생성됨을 나타낸다.
도 3은 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 발효 전후의 타이로시네이즈(tyrosonase)억제효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 여러가지 %로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 각 발효추출물의 세포독성을 조사한 것으로, 도 4a는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 10% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 세포독성조사 결과이고, 도 4b는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 세포독성조사 결과이고, 도 4c 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 50% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 세포독성조사결과이다.
도 5a는 멜라닌생성세포에서 고본 뿌리 추출물을 여러가지 %로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 각 발효추출물의 멜라닌합성 저해효과를 조사한 것으로써, 도 5a의 (a)는 고본 뿌리 추출물을 10% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 멜라닌합성저해효과를 나타낸 것이고, 도 5a의 (b)는 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 멜라닌합성저해효과를 나타낸 것이고, 도 5a의 (c)는 고본 뿌리 추출물을 50% 첨가한 황국균 발효추출물 처리 후 멜라닌합성저해효과를 나타낸 것이다.
도 5b는 고본 뿌리 추출물을 20% 첨가하여 발효 전후의 멜라닌합성저해효과를 조사한 것이다.
도 6은 인간섬유아세포에서 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 처리 후 세포독성을 조사한 결과이다.
도 7은 인간섬유아세포에서 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 처리 후 콜라겐분해효소(MMP1)발현 저해효과를 나타낸 것이다.
도 8은 인간섬유아세포에서 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 처리 후 콜라겐발현 증가효과를 나타낸 것이다.
도 9는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물의 수용액상에서 지표성분분석을 통한 안정성조사 결과로, 도 9의 (a)는 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 함유 수용액의 지표성분변화 HPLC 분석 크로마토그램이고, 도 9의 (b)는 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물 함유 수용액을 70℃에서 24시간 보관 후 지표성분변화 HPLC 분석크로마토그램이다.
도 10은 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물의 화장품제형에서 지표성분분석을 통한 안정성 조사결과로, 도 10의 (a)는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형의 지표성분 HPLC 분석 크로마토그램이고, 도 10의 (b)는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형을 -20℃에서 24시간 보관 후 지표성분 HPLC 분석 크로마토그램이고, 도 10의 (c)는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형을 70℃에서 24시간 보관 후 지표성분 HPLC 분석 크로마토그램이다.
도 11은 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형의 비중, 점도, pH, 지표성분함량 변화분석을 통한 안정성조사결과이다.
도 12는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형의 첩포자극 안전성 인체적용 임상시험결과이다.
도 13은 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형과 첨가하지 않은 화장품제형의 피부미백개선 인체적용 비교임상시험 결과로, 도 13a는 피부미백 개선효능평가를 위한 인체적용시험결과 임상기관보고서 요약문이고, 도 13b는 피부미백 개선효능평가를 위한 인체적용시험 측정결과이다.
도 14는 고본 뿌리 추출물을 20%로 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 함유하는 화장품제형과 첨가하지 않은 화장품제형의 피부주름개선 인체적용 비교임상시험 결과로, 도 14a는 피부주름개선효능평가를 위한 인체적용시험결과 임상기관보고서 요약문이고, 도 14b는 피부주름개선효능평가를 위한 인체적용시험 측정결과이다.
본원은 내인성 및 외부 요인으로부터 피부를 보호할 수 있는 다양한 소재들에 대하여 연구하던 중, 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물이 주름 개선 및 미백 효과 등을 통해 피부 상태 개선, 피부노화 지연에 대한 효능 발견을 근거로 한다.
본 발명은 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 상태 개선 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 안전한 천연 제제를 이용한 것으로 피부 적용시 부작용이 없으며 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물에 함량에 따라 주름 개선, 미백 및 피부 탄력 증진에 우수한 효과를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 고본(Angelica tenuissima)은 8 - 9월에 개화하는 키 약 30 - 80cm의 다년초의 산형과 식물이다. 본원에서는 뿌리줄기, 특히 뿌리가 사용된다.
고본은 풍으로 인한 두통을 낫게 하며 살을 살아나게 하고 얼굴빛을 좋게 해주며 주근깨, 비사증 및 여드름을 없애준다. 목욕하는 약과 얼굴에 바르는 기름을 만들 수 있다고 동의보감에 기록되어 있다. 또한, 고본에 함유된 유용한 약용성분으로 인해 동양의 전통의학 및 민간에서 중요한 약용식물 치료제로 활용되었으며, 특히 보혈, 빈혈, 해열, 진통, 건위, 진정 및 부인병 등의 효능으로 이용되어왔다.
본 발명에 있어서, 황국균(Aspergillus oryzae)이란 누룩곰팡이의 대표균으로 청주, 일본식 된장, 간장류 제조에 사용되는 균주이다. 집락은 처음에는 백색인데 분생자가 생기면 황색에서 황록색으로 되고 오래되면 갈색으로 된다. 전분 당화력, 단백 분해력이 강한 특성을 가진다. 바람직하게 본 발명에 따른 황국균은 Aspergillus oryzae NK 이나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서는 인체에 무독성인 황국균(Aspergillus oryzae)을 고본 발효에 사용하는 경우 고본에서 나타나지 않은 주름 개선, 미백 및 탄력 증진 효과를 발생시키는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명의 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물은 황국균 발효 처리를 하지 않은 일반 고본 추출물과 대비하여 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 미백에 현저히 우수한 효과를 나타내며, 특히 MMP-1 발현 저해, 콜라겐 발현 촉진, 멜라닌 합성 효소 억제에 현저한 효과를 가져, 이로 인한 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 미백에 우수한 활성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "추출물(extract)"이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 또는 적절한 유기용매 예를 들어, 메탄올, 에탄올 등, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출물, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.
상기 용매는 물을 포함하는 극성 또는 비극성, 또는 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 이로 제한하는 것은 아니나, 구체적으로는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 등을 포함하는, 탄소수 1 내지 5의 저가 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 특히 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 특히는 물, 50 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있다. 본원에 따른 일 구현 예에서는 유기용매, 특히 에탄올이 용매로 사용되어 우수한 효과를 나타낸다.
본원의 추출물은 통상의 식물 추출물의 공지된 일반적 제조방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법 또는 상기 용매를 추출용매로 하여 공지의 방법에 의해 제조하는 방법일 수 있다(예를 들어 Nomura T. Phenolic compounds of the mulberry tree and related plants. In: Herz, W.; Grisebach, H.; Kirby, G.W.; Tamm, Ch. (eds.) Fortschritte der chemie organischer naturstoffe. Springer-Veriag, Wien, 53:87-201 (1988)).
또한 추출과정을 거친 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획 시 용매는 2종 이상 개별적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하여 각 용매의 추출물을 제조할 수 있다. 추출물 제조온도는 4 내지 120℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일 일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 예를 들면, 고본 뿌리 황국균 발효물에 용매를 1:1 내지 1:20 중량비로 가열 순환식 추출탱크에 넣고, 정제수 또는 식용 20 ~ 80% 알콜을 가하여 50 내지 122℃에서 2 - 96시간 정도 추출한 후 여과하여 여액을 얻고, 잔여물에 다시 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 동일한 과정을 수회 반복할 수 있다. 여액을 합하여, 그 자체로 사용하거나, 이를 진공 농축기로 감압하에서 농축한 후, 열풍 또는 동결 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물의 제조는 고본 뿌리의 용매 추출 단계; 및 고본 뿌리의 황국균 발효단계 및 추출 단계를 포함한다.
상기 고본 뿌리의 용매 추출 단계는 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법 등을 사용하여 제조할 수 있으며, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하다. 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 물, 에탄올, 에탄올 수용액을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 고본의 총중량의 0.5 내지 15배로 한다. 또한, 필요에 따라 차광 및/또는 가온(예를 들어, 온침) 조건 하에서 수행될 수도 있다. 바람직하게는 25℃ ~ 122℃에서 2 ~ 48시간 동안, 더욱 바람직하게는 2 ~ 36시간 동안 추출하는 것을 1 내지 4회 반복할 수 있다.
상기 고본의 황국균 발효 단계는 고본의 용매 추출 단계에 의해 추출된 고본을 농축하여 약 20 중량%로 포함하는 용매 총중량에 대하여 0.5 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게 2 중량% 내지 10 중량%로 황국균을 접종하여 발효를 수행한다. 일 구현 예에서 고본 뿌리 추출물은 53brix, 20 중량%로 포함되며, 10% 또는 50 중량%를 포함하는 경우와 비교하여 20 중량%에서 월등히 높은 효과를 나타낸다.
상기 발효는 28℃ 내지 40℃, 바람직하게 37℃에서 24시간 내지 72시간, 바람직하게 48시간 배양하여 발효를 수행할 수 있다.
배양물은 고온에서 1분 내지 1시간 동안 멸균하여 효소를 불활성화시킬 수 있으며, 원심분리 등을 통해 상층액 만을 취할 수 있다. 분리된 상층액은 감압농축을 통해서 액상 또는 분말 형태의 고본의 황국균 발효 추출물로 제조될 수 있으며, 이를 동결건조하여 분말형태로 제조될 수 있다.
또는 고본 발효물 추출단계는 고본 발효물에 약 20 ~ 80% 에탄올을 추가하여 약 50 ~ 122℃, 약 2 ~ 96시간 동안 배양하여 발효성분을 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 고본의 황국균 발효 추출물은 추가로 분리하여 얻어진 고본의 황국균 발효 추출물의 분획물을 포함한다. 분획 분리는 당해 분야에 알려진 분리법에 의해 수행된다. 바람직하게는 고본의 황국균 발효를 물에 현탁한 후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 용매를 이용하여 추출하여 고본의 황국균 발효 추출물의 분획물을 수득할 수 있으며, 수득된 고본의 황국균 발효 추출물의 분획물은 피부 개선, 특히 피부의 주름 개선, 탄력 증진 및 미백에 보다 더 현저한 효과를 보일 수 있다.
한편, 다른 일 구현예에서 본원에 따른 추출물은 콜라겐 합성을 촉진시킨다. 상기 콜라겐은 피부, 혈관, 뼈, 치아, 근육 등 모든 결합조직의 주된 단백질이다. 종래에는 콜라겐의 피부 보습 효과 및 상처 치유 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부 외용제 조성물에 콜라겐을 배합하였으나, 콜라겐 자체의 경피 흡수가 어려워 상기 효과를 기대하기 어렵다. 하지만 본원에 따른 추출물은 같이 진피 등과 같은 조직에서 콜라겐 합성을 촉진시키면 인체에 안정하면서도 콜라겐의 효과를 기대할 수 있다. 콜라겐 합성의 증진을 통해 근본적으로 피부의 볼륨감을 증가시켜 줄 수 있고, 결과적으로 피부의 탄력을 지속적으로 유지하고 주름을 개선시킬 수 있다.
이런 측면에서 본원은 본원에 따른 추출물을 포함하는 콜라겐 합성 촉진용 화장품 조성물로 제공될 수 있다.
다른 측면에서 본원에 따른 조성물은 피부탄력 개선 또는 증가; 또는 피부 주름 개선 또는 주름 억제용 화장품 조성물로 제공될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원에 따른 조성물은 피부케어 화장품 조성물로 제공될 수 있다. 이러한 피부케어 화장품 조성물은 특히, 습관 또는 노화에 의한 주름 억제, 개선, 피부 탄력 증가 또는 개선, 또는 피부 미백을 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 고본의 황국균 발효 추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상 형태로 0.001 ~ 10 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01 ~ 2 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 고본의 황국균 발효 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 글리세롤, 글리세린, 지방족 에스테르, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄세스퀴오레이드, 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 카르복시폴리머, 시토스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 콜레스테롤, 스테아레스-4, 디세틸포스페이트, 마카다미아 오일, 카르복시비닐폴리머, 산탄검 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 소디움히아루로네이트, 페녹시에탄올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본원은 또한 상기 기술한 본원의 추출물을 포함하는 조성물은 상술한 바와 같은 효능을 목적으로 한 식품, 예를 들면, 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제 등으로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "기능성식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 가공한 식품을 의미한다.
상기 기능성식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본원의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효 음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
일 구현예에서는 기능성 음료로 제조되며, 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미하며, 특히 피부 탄력 향상, 콜라겐 합성 촉진을 위한 음료를 의미한다.
본원의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예 1. 고본 뿌리 추출물 및 이의 황국균 발효 추출물 제조
충북 제천시에서 재배된 고본(Angelica tenuissima) 뿌리를 입수하여 건조시켰다. 건조된 10kg 고본 뿌리를 실온에서 재차 건조한 후, 분쇄하여 70% 에탄올 60L를 추가한 후 80℃에서 4시간 동안 추출하였다. 추출액은 원심분리 후 감압 농축하여 53brix의 추출액을 제조하였다.
이어 상기 고본 뿌리 추출물의 발효 조건을 다음과 같이 확립하였다.
배양은 Seed 배양 및 본 배양의 2단계로 수행되었다. 먼저 Seed 배양은 1L 삼각플라스크에 200ml LB (Luria-Bertani)배지를 가하여 황국균(Aspergillus oryzae) 균주를 접종 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 이어 본 배양은 2L의 LB 배지에 상기 제조한 53brix 고본 뿌리 추출물을 각각 10 중량%, 20 중량%, 50 중량% (100g/L)을 첨가하여, 50rpm으로 최소화하여, Air 0.1vvm, 37℃에서 48시간 동안 발효가 일어나도록 진탕 배양하였다. 고본 뿌리 추출물을 첨가하지 않고 LB배지에서만 발효시킨 것을 대조군으로 사용하였다.
이어 고본 뿌리의 황국균 발효 추출물은 다음과 같이 제조하였다.
상기 고본 뿌리 추출물을 첨가하여 발효한 각 발효액에 동량의 에탄올을 첨가하고, 80℃에서 4시간 동안 추출하였다. 발효 추출액을 4℃에서 20분 동안 8000rpm으로 원심분리하고 여과하여 농축 후 동결건조함으로써 고본 뿌리 황국균 발효추출물을 제조하였다.
발효 단계를 수행하지 않은 고본은 에탄올 추출물을 대조군으로 사용하였다.
실시예
2. 고본과
황국균
발효추출물의
HPLC분석
고본 뿌리 황국균 발효추출물의 발효 후 물질변화를 조사하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 0%, 10%, 20%, 50%의 고본 추출물을 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 각 발효추출물과 발효하지 않은 고본 추출물들을 아래 조건으로 HPLC 분석하였다.
상기 각 시료를 20 uL를 주입하여 PDA detector 200 ~ 400nm 파장에서 칼럼은 Zorbax C18(150 x 4.5 mm, 5um) 컬럼으로 칼럼온도는 30℃ 조건에서 이동상은 물과 아세토나이트릴을 사용하여 물에 대하여 아세토나이트릴을 0 ~ 100%로 25분간 구배용매조성법으로 유속 1mL/min으로 분석하였다.
도 1의 각 크로마토그램은 PDA detector 분석 시 x축은 머무는 시간을 y축은 검출된 파장을 나타내며 등고선은 물질의 농도를 나타낸다. 등고선이 많이 겹칠수록 높은 농도임을 보여준다. 고본 추출물 없이 황국균만 발효한 도 1(a)과 발효하지 않은 고본 추출물 결과인 도 1(e) 비교 시 도 1(a)는 2.5분에서 240 ~ 270nm, 3.5분의 200 ~ 230nm, 4.2분의 240 ~ 260nm의 흡광을 가지는 물질 피크가 검출되었고 도 1(e)는 9.2분 260 ~ 290nm, 11.2분에서 260 ~ 300nm, 16.8분의 260 ~ 360nm의 흡광을 가지는 물질 피크가 특이적으로 검출되었으며 특히 16.8분대 검출되는 물질은 용출시간(retention time)으로 판단할 때 디크루신(decursin)과 z-리구스틸리드(z-ligustilide)와 동일한 물질로 예상되며 황국균만 발효한 도 1(a)에서는 전혀 나타나지 않았다.
고본 추출물을 10% 첨가하여 발효한 도 1(b), 20% 첨가하여 발효한 도 1(c), 50% 첨가하여 발효한 도 1(d)에서는 2 ~ 7분 사이와 9.2분, 11.2분 16.8분에서 주요 물질 피크가 관찰되었고 2 ~ 7분 사이는 피크들은 고본 추출물(e)에서는 검출되지 않았던 피크였다. 9.2분, 11.2분, 16.8분의 물질은 고본 추출물에서도 나타난 피크로써 고본의 첨가 함량이 증가할수록 함께 증가하는 것으로 나타났으며 16.8분의 디크루신(decursin)과 z-리구스틸리드(z-ligustilide)으로 예상되는 피크 함량이 높게 나타났다.
고본 추출물 발효시 상세한 물질 변화를 조사하기 위해 고본 추출물과 고본 추출물 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 각각 에탄올로 추출한 시료들을 PDA detector 200 ~ 400nm 파장에서 칼럼은 Zorbax C18(150 x 4.5 mm, 5um) 컬럼으로 칼럼온도는 30℃ 조건에서 이동상은 물과 아세토나이트릴을 사용하여 물에 대하여 아세토나이트릴을 0 ~ 100%로 18분간 구배용매조성법으로 유속 1 mL/min으로 분석하였다(도 2a). 210nm 파장 분석시 도 2a의 (b)와 같이 발효추출물에서 6.5분대에 새로운 피크가 관찰되었다. 이것은 프로토카테츄익산(protocatechuic acid)과 동일한 용출시간을 갖는 피크로써 미백, 항산화 활성이 높은 물질로 보고되고 있다(I. Nat. Prod., vol 73, 1767-1774, 2010년).
고본 추출물과 고본 추출물 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물을 각각 에틸아세테이트로 추출한 것을 HPLC 분석하여 비교하였다(도 2b). 210nm 파장 분석시 도 2b의 (b)와 같이 발효추출물에서 8 ~ 8.5분대에 새로운 피크들이 관찰되었다.
고본 추출물과 고본 추출물 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효 추출물을 각각 물 추출 후 다시 에틸아세테이트로 추출한 것을 HPLC 분석하여 비교하였다(도 2c). 310nm 파장 분석시 도 2c의 (b)와 같이 발효추출물에서 6 ~ 10분대에 다수의 새로운 피크들이 관찰되었다.
결과를 종합해볼 때 고본 추출물과 황국균 발효물, 그리고 고본 추출물을 황국균으로 발효한 고본 황국균 발효 추출물들은 서로 다른 크로마토그램을 나타냈으며 이것은 고본을 황국균으로 발효시 기존의 물질들이 대사되어 새로운 물질로 바뀌거나 새롭게 생성됨을 알 수 있다.
실시예
3. 고본 뿌리 추출물 및 고본
황국균
발효 추출물의 멜라닌합성효소(tyrosinase) 활성 억제효능확인
상기 실시예 1에서 제조된 고본 및 고본의 황국균 발효 추출물의 피부 미백 효과 증진을 측정하기 위하여 멜라닌 합성효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 활성 억제 효과를 한국보건공정서연구회(2004)의 미용관련 기능성 시험의 가이드라인(821-858면 참조)을 참고하여 측정하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰 상에서 PBS(pH 6.8)에 녹인 상기 실시예 1에서 제조된 고본 추출물과 고본 추출물 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효 추출물을 각각 최종농도 200μg/mL로 mushroom tyrosinase (2,000 unit/mg) 20μL와 10 mM L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) 10μL를 첨가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, microplate reader (Infinite 200, Tecan Group Ltd., Switzerland)를 이용해 475nm에서 흡광도를 측정하였다.
이 때, 시료를 함유되지 않은 버퍼만을 넣었을 때의 흡광도 변화를 기준(100%)로 하여 흡광도 감소를 억제율로 표시하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 고본의 황국균 발효 추출물(발효 후)은 32.7%의 우수한 티로시나아제 억제율을 나타났으며, 발효 전의 고본 추출물은 12.7%의 티로시나아제 억제율을 확인되었다. 즉, 양성대조군에 비해 고본 및 특히 고본의 황국균 발효 추출물 티로시나아제 억제율이 향상된 것을 확인 할 수 있었으며, 발효전보다 발효 후 그 효과가 월등히 향상된 것 확인으로 나타났다.
실시예
4. 멜라닌생성세포에서 세포독성 조사
상기 실시예 1에서 제조된 고본의 황국균 발효 추출물의 멜라닌생성세포에서의 독성을 조사하였다. 멜라닌생성세포인 murine melanoma (B-16 F1)세포를 배양접시의 바닥에 접종하고 페니실린(100IU/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL), 10% FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 넣고 5% 이산화탄소를 일정농도의 시료를 넣어 세포를 배양한 다음 MTT용액(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-2H- tetrazolium bromide)을 넣어, 4시간 동안 배양한다. 배양액을 제거한 다음 DMSO (dimethylsulfoxide) 또는 isopropanol 300μL씩을 첨가하고 10분간 흔들어 준 다음 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성이 나타나는 농도를 조사하였다. 도 4에서 확인된 바와 같이 멜라닌생성세포에서 추출물을 넣지 않은 대조군(control)과 비교시 고본추출물 10 ~ 50%를 첨가한 황국균 발효추출물을 최대 2,000ug/ml까지 첨가하여도 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예
5. 고본 뿌리
황국균
발효 추출물의 멜라닌 생성 저해실험
상기 실시예 1에서 제조된 고본의 황국균 발효 추출물의 피부 미백 효과 증진을 측정하기 위하여 멜라닌 합성효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 생성 억제 효과를 식품의약품안전처의 기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인 중 피부의 미백에 도움을 주는 제품의 유효성 또는 기능을 입증하는 자료를 참고하여 실험을 실시하였다. 이 방법은 미백성분에 대한 세포의 멜라닌 생성 저해 효과를 평가하는 방법으로써 멜라닌 생성세포를 배양하여 세포 내 멜라닌의 양 또는 세포 내외의 총 멜라닌 양을 정량화하여 대조군의 결과와 비교하는 방법이다.
murine melanoma (B-16 F1)세포를 6-well plate에 well당 1×105 개로 접종하고 세포배양조건에서 24시간 배양한다. 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 다음 검액 및 새로운 배지를 넣고 배양한다. 배지에 a-MSH를 처리하여 멜라닌 생성 과정을 촉진하게 하는 알파 엠에스에이치(a-MSH)를 처리하였다. 이때 멜라닌 생성 억제효과를 보기 위해 상기 실시예 1에서 준비한 고본 추출물을 각각 10%, 20%, 50% 농도로 첨가하여 황국균으로 발효하여 준비한 발효 추출물을 실시예 3에서 세포독성이 나타나지않는 범위까지 알파 엠에스에이치(a-MSH)와 함게 처리하였고 발효 추출물 대신 미백 기능성 물질로 잘 알려진 알부틴을 처리한 결과와 저해효과를 비교하였다. 양성대조군으로 알파 엠에스에이치(a-MSH)만을 처리한 것과 아무것도 처리하지 않은 음성대조군을 함께 비교하였다.
도 5a에서와 같이 고본 추출물 첨가 황국균 발효 추출물을 125ug/ml부터 1000ug/ml까지 증가시킴에 따라 멜라닌합성 양은 비례적으로 감소하였다. 특히 도 5의 (b)에서처럼 고본 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효 추출물에서 높은 멜라닌 생성 억제효과를 나타냈으며 125ug/ml 이상 처리시 알부틴 처리한 결과보다도 월등히 높은 멜라닌 생성저해효과를 나타냈다.
도 5b는 20% 고본 추출물을 발효전과 황국균으로 발효한 후 효과를 비교한 결과로써 고본 추출물에 비교하여 고본 추출물을 황국균으로 발효하여 준비한 발효 후 추출물의 멜라닌 합성 억제효율이 월등히 증가된 것으로 나타났다.
실시예
6.
인감섬유아세포에서
세포독성 조사
상기 실시예 1에서 제조된 고본의 황국균 발효 추출물을 시료로 하여 사람섬유아세포(HS68,)를 24-well plate에 well당 5×104 개로 분주한 후 24시간 배양한다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 10% FBS를 포함하지 않는 새로운 배지로 갈아주고 일정농도의 시료를 처리하여 세포를 24시간 배양하고 MTT용액(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-2H- tetrazolium bromide)을 넣어, 4시간 동안 배양한다. 배양액을 제거한 다음 DMSO (dimethylsulfoxide) 또는 isopropanol 300μL씩을 첨가하고 10분간 흔들어 준 다음 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성이 나타나는 농도를 조사하였다. 도 6에서 확인된 바와 같이, 인간섬유아세포에서 추출물을 넣지 않은 대조군(control)과 비교시 고본 추출물 10 ~ 50%를 첨가한 황국균 발효 추출물을 최대 2,000ug/ml까지 첨가하여도 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예
7. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물의
인간섬유아세포에서
콜라겐분해효소(
MMP1
)의 발현 저해효과 실험
피부의 광노화에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP-1의 발현은 UVA에 의해 세포에서 JNK/p38 활성도가 증가하고 전사인자인 AP-1의 활성도가 증가되는 신호 전달경로를 통해 MMP-1 발현을 증가시켜 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다. MMP-1(Matrix methaloprotease-1, collagenase) 저해 활성을 가진 물질은 콜라겐을 보호하여 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지한다. 따라서 원료의 MMP 저해 활성을 측정함으로써 주름을 개선하고 탄력 있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 1에서 제조된 고본 및 고본의 황국균 발효 추출물에 의한 MMP-1 발현 억제 효과를 분석하기 위해 NIH3T3 세포를 2 x 105 cells/well 농도로 6-well plate에 접종하여 24시간 배양 후, 각 well에 시료와 TNF-를 10ng/mL의 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양된 NIH3T3를 PBS로 세척한 후 Homogenization buffer를 첨가하여 99℃에서 5분간 용해시켰다. 용해된 세포를 10분 동안 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 정량을 통해 동량의 단백질을 취하여 SDS sample buffer와 혼합한 후 99℃에서 5분간 끓여 단백질을 분리시킨 후 SDS-PAGE로 단백질을 분자별로 분리하였다. 분리된 단백질은 cold transfer buffer를 300A의 조건에서 100분 동안 transfer하여 nitro-cellulose membrane으로 이동시켰다. Membrane으로 옮긴 후 5% skim milk 용액에 넣고 한 시간 동안 교반시킨 후 blocking 하였다. 이 membrane을 primary antibody (MMP1)가 첨가된 antibody solution으로 옮겨 4℃에서 18시간 교반하였다. Primary antibody 처리 후 membrane을 TBS/T로 교반기에서 5분간 5회 세척하였다. Secondary antibody 용액에 1시간 상온에서 처리 후 TBS/T로 5분간 5회 세척하였다. 세척된 membrane은 EZ-Western Lumi Pico reagents를 처리하여 Gel doc을 이용하여 밴드를 확인하였다.
도 7에 나타난 바와 같이 본원에 따른 발효 전인 고본 추출물과 발효 후의 고본의 황국균 발효 추출물은 MMP-1 발현을 농도 의존적으로 억제하였으며, 특히 발효 전의 고본 추출물과 비교하여 20% 고본 추출물을 황국균으로 발효하여 준비한 발효 후 추출물의 억제효과가 월등히 향상된 것으로 나타났다.
실시예
8. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물의
인간섬유아세포에서
콜라겐 발현 증가효과 실험
콜라겐발현 효과를 조사하기 위해 식품의약품안전처의 기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인 중 피부의 주름개선에 도움을 주는 제품의 유효성 또는 기능을 입증하는 자료를 참고하여 실험을 실시하였다. 실시예 6의 실험으로 얻은 cDNA를 주형으로 하여 Collagen 1 특이적인 프라이머(primer) F 5’ CTCCAACGAGATCGAGATC 3’와 R 5’ GTTTACAGGAAGCAGACAGG 3’한 쌍을 첨가하여 PCR을 수행하고 이를 전기영동과 Real-time PCR을 통하여 분석결과를 그래프로 나타냈다. 그 결과 도 8에서와 같이 20% 고본 추출물을 황국균으로 발효한 발효 추출물 처리시 콜라겐 발현 양이 증가하였고 0.2mg/ml 이상에서 TGF-β 처리시와 거의 동일한 콜라겐 발현 증가효과가 있음을 확인하였다.
실시예
9. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물의
수용액상
안정성 조사
고본 추출물 20% 첨가한 황국균 발효 추출물을 물에 녹여서 24시간 동안 70℃ 상태에서 보관한 후 HPLC로 지표성분 함량변화를 측정함으로써 수용액상 가혹조건에서의 안정성(stability)을 조사하였다. 도 1에서 주요 피크로 검출되었던 디크루신(decursin)과 z-리구스틸리드(z-ligustilide)로 예상되는 물질을 지표성분으로 하여 실시예 1의 HPLC 분석방법을 변형하여 아세토나이트릴 60% 아이소크레틱 분석조건으로 분석한 결과 도 9과 같이 24시간 동안 70℃ 상태에서 보관한 후 지표물질양이 현저히 줄어들었음으로 수용액에서 높은 온도 가혹조건 안정성이 낮음을 확인하였다. 이 결과를 통해 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물의 수용액상의 안정성이 낮음을 확인하였다.
실시예
10. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물 함유 화장품
제형제조
상기 실시예들을 통해 높은 주름개선과 미백효과를 확인한 20% 고본 추출물을 첨가하여 황국균으로 발효하여 제조한 발효 추출물을 함유하는 안정화된 제형을 개발하고자 상기 실시예 1에서 제조된 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효시켜 제조한 발효 추출물을 함유한 화장품제형을 아래와 같은 조성으로 제조하였다. 실시예 9에서 수용액상의 안정성이 낮음을 확인하였음으로 이를 개선하기 위해 물로부터의 안정성을 높인 내상을 오일상으로 하고 외상을 물로 하는 O/W 화장품 제형으로 제조하였다.
실시예
11. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물 함유 화장품 제형의
안정성조사
상기 실시예들을 통해 높은 주름개선과 미백효과를 확인한 20% 고본 추출물을 첨가하여 황국균으로 발효하여 제조한 발효 추출물을 함유하는 안정화된 제형을 개발하고자 상기 실시예 10에서와 같이 제조한 O/W 화장품제형의 24시간 동안 가혹조건에서 안정성을 조사하였다. -20℃와 70℃에서 각각 24시간 동안 보관한 경우와 즉시 제조한 양성대조군 시료와 실시예 9의 지표성분 함량을 HPLC로 분석하였다.
도 10에 나타난 바와 같이 두 가지 가혹조건에서도 지표성분 함량이 일정하게 유지됨을 확인하였다.
상기 실시예 10에서와 같이 제조한 O/W 화장품제형의 14일동안 가혹조건 보관시에 안정성을 조사하였다. 상기의 -20℃, 상온, 50℃를 24시간 교대로 반복 보관한 가혹조건시료를 2일 ~ 3일 간격으로 비중, 점도, pH 함량 변화를 조사한 결과 도 11에서와 같이 모두 안정하게 유지되는 것으로 나타났다.
이 결과를 통해 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물과 이를 함유하는 화장품제형의 안정성을 확인하였다.
실시예
12. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물 함유
화장품제형의
첩포자극 안전성 인체적용 임상시험
고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효 추출물과 이를 함유하는 화장품제형의 인체 안전성(safety)을 조사하기 위해 첩포자극 인체적용임상시험을 실시하였다. 상기 실시예 10의 크림제형 화장품 시료를 임상전문기관인 세명대학교 한방바이오산업 임상지원센터에 첩포자극 안전성 인체적용임상시험을 의뢰하여 30명에게 48시간 동안 안전성을 조사한 결과 도 12에 나타난 바와 같이 자극이 전혀 없는 무자극으로 확인됨으로써 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효하여 얻은 발효추출물과 이를 함유하는 화장품제형의 첩포자극 안전성을 확인하였다.
실시예
13. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물 함유
화장품제형과
이를 포함하지 않는
화장품제형의
피부미백
개선 인체적용 비교 임상시험
고본 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효 추출물 및 이를 함유한 제형의 인체 적용시 미백효과를 확인하기 위해 실시예 10에서 제조한 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효한 발효 추출물을 함유하는 크림제형 화장품(KRIBS-AT-W-01)과 발효 추출물 대신 해당함량만큼의 정제수를 첨가하여 제조한 크림제형 화장품(KRIBS-AT-W-00)의 피부미백 개선 비교임상시험을 임상전문기관인 세명대학교 한방바이오산업 임상지원센터에 의뢰하여 8주간 시료 도포 사용 후 미백효과를 분석하였다. 도 13a와 13b에서와 같이 KRIBS-AT-W-01와 KRIBS-AT-W-00 비교시 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효한 발효 추출물을 함유 크림제형 화장품인 KRIBS-AT-W-01에서 통계적으로 유의한 수준의 피부미백 개선 효과가 있음을 확인하였다.
실시예
14. 고본 뿌리 추출물에 대한
황국균
발효 추출물 함유
화장품제형과
이를 포함하지 않는
화장품제형의
피부주름개선 인체적용
비교임상시험
고본 추출물을 20% 첨가한 황국균 발효 추출물 및 이를 함유한 제형의 인체 적용시 주름개선효과를 확인하기 위해 실시예 9에서 제조한 고본 추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효한 발효 추출물을 함유하는 크림제형 화장품(KRIBS-AT-A-01)과 발효 추출물 대신 해당함량만큼의 정제수를 첨가하여 제조한 크림제형 화장품(KRIBS-AT-A-00)의 피부주름개선 비교임상시험을 임상전문기관인 세명대학교 한방바이오산업 임상지원센터에 의뢰하여 12주간 시료 도포 사용 후 주름개선효과를 분석하였다. 도 14a와 14b에서와 같이 KRIBS-AT-A-01와 KRIBS-AT-A-00 비교시 고본추출물을 20% 첨가하여 황국균으로 발효한 발효추출물을 함유 크림제형 화장품인 KRIBS-AT-W-01에서 통계적으로 유의한 수준의 피부주름개선 효과가 있음을 확인하였다.
본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원이 지원하는 경제협력권산업 육성사업으로 수행된 연구결과이다.
Claims (10)
- 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물을 함유하는, 피부의 주름 개선, 피부 탄력 증가 또는 피부 미백을 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.01% ~ 2 중량% 포함되는 피부상태 개선용 화장료 조성물. - 제 2 항에 있어서,
상기 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 포함되는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 화장료는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 화장료 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 클로로포름, 아세톤, 프로필렌글리콜, 초산에틸, 부틸렌글리콜, 및 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합 용매로 추출한 것인, 화장료 조성물.
- 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 콜라겐 생성 촉진 또는 콜라겐 생성 촉진을 통한 주름 개선용 화장료 조성물.
- 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 미백 화장료 조성물.
- 고본(Angelica tenuissima) 뿌리의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부의 주름 개선, 피부 탄력 증가 또는 피부 미백을 포함하는 피부상태 개선용 식품 조성물.
- 하기와 같은 조성을 포함하는 고본 뿌리 황국균 발효 추출물을 포함하는 안정화된 화장품 제형:
- 발효 고본 추출물의 제조방법으로
고본 뿌리의 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
상기 20 중량% 고본 뿌리 추출물에 0.01 중량% 내지 20 중량%의 황국균을 접종하는 단계;
상기 접종물을 28℃ 내지 40℃에서 24시간 내지 72시간 배양하여 발효하는 단계; 및
상기 발효물에 20 ~ 80 중량% 에탄올을 추가하여 50 ~ 122℃에서 2 ~ 96시간 동안 침지 또는 섞은 후 발효성분을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
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