KR20180010200A - 현탁 세포용 소규모 배양 방법 - Google Patents

현탁 세포용 소규모 배양 방법 Download PDF

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슈테펜 고레트
라이너 슈타흔
슈테펜 크레예
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글리코토페 게엠베하
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Abstract

본 발명은 세포 배양 분야에 관한 것이다. 현탁 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 소규모 세포 배양 시스템이 제공된다. 본 발명은 특히 배양 배지의 일부를 대신하기 위해 세포 침강을 이용하여 배양 배지로부터 세포를 분리하는 세포 배양 방법을 제공한다.

Description

현탁 세포용 소규모 배양 방법
발명의 분야
본 발명은 현탁 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 소규모 세포 배양 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 특히 배양 배지의 일부를 대신하기 위해 세포 침강을 이용하여 배양 배지로부터 세포를 분리하는 세포 배양 방법을 제공한다. 이 방법은 대규모 세포 배양을 시뮬레이션하고 대규모 세포 배양에 사용되는 배양 조건 및 세포 클론을 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.
발명의 배경
재조합 단백질 생산은 오늘날의 생명공학 산업의 주요 측면이다. 이는 시장에서 대량의 고품질의 단백질을 필요로 하는 적용분야의 수가 증가함에 따라 점점 더 중요성이 커지고 있다. 식품 생산 및 특히 약리학은 재조합 단백질의 필요성이 꾸준히 증가하는 2개의 주요 분야이다. 상업적으로 실행 가능한 과정을 얻기 위해서는 높은 생산 효율 및 결과적으로 최종 제품의 낮은 비용이 요구된다.
그러나, 동시에 높은 제품 품질 및 인간 적용과의 양립성이 필수적이다. 점점 더 많은 적용분야가 진핵 세포, 특히 고등 진핵 세포에서 단백질의 재조합 생산을 필요로 한다. 특히, 번역후 변형, 예를 들어, 당화(당단백질)를 갖는 단백질은 E. 콜라이와 같은 원핵 세포 시스템 또는 특히 인간 세포주와 같은 진핵 세포 시스템에서 이들을 발현시키는 경우 상당히 상이하다. 이러한 차이는 많은 경우에 생산된 단백질의 생물학적 활성뿐만 아니라 면역원성에 현저히 영향을 미친다. 그러나, 고등 진핵 세포주를 이용하는 많은 발현 시스템은 요망되는 단백질의 다소 낮은 발현율로 고통받으며, 이는 재조합 단백질의 낮은 수율 및 높은 비용을 발생시킨다.
진핵 세포에서 생산된 재조합 단백질의 번역후 변형의 특징을 포함하여, 이들의 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다수의 배양 조건이 최적화되고 많은 수의 세포 클론이 시험된다. 재조합 단백질의 후기 생산에 사용되는 대규모 세포 배양으로 이러한 스크리닝 과정을 수행하는 것은 매우 비싸고 번거롭다. 따라서, 그러한 스크리닝 과정은 종종 소규모 배양으로 수행된다. 그러나, 그러한 소규모 배양은 종종 시뮬레이션되는 대규모 배양과 그 거동에 있어서 현저하게 상이하다. 대규모로 전환될 때, 소규모 배양에서 확립된 배양 조건 및 세포 클론은 덜 최적임이 입증될 수 있다.
신뢰할 수 있는 다운스케일 모델은 효율적이고 빠른 생물공정 개발을 위해 매우 중요하다. 배지 또는 공정 최적화 및 클론 스크리닝과 같은 주요 작업은 일반적으로 높은 운영비 또는 낮은 처리량과 같은 여러 가지 이유로 인해 공정 조건 하에서 수행되지 않는다. 생물공정학을 위한 주요 임무는 가능한 한 최상으로 더 큰 규모를 나타내는 적절한 다운스케일 모델을 찾는 것이다. 적용할 수 있는 다운스케일 시스템은 주로 대규모 및 중간 내지 높은 처리량에 대한 핵심 파라미터의 만족할 만한 비교성을 특징으로 해야 한다.
진보된 미세생물반응기(ambr) 시스템은 보다 큰 규모의 생물반응기로의 우수한 재현성을 갖는 그러한 다운스케일 도구를 나타낸다(Hsu et al. (2012) Cytotechnology 64:667-678). ambr 시스템은 10 내지 15 ml의 작업 부피를 갖는 단일 사용 용기, 액체 취급 로봇 및 산소 포화도(DO)와 pH를 온라인으로 측정하는 모니터로 구성된다. 처리량은 장치 장비에 따라 24 내지 48개 용기로 제한된다. ambr 시스템은 배치 및 페드-배치(fed-batch) 배양을 위한 규모 축소 모델로서 널리 이용된다. 그러나, 관류 배양은 이용될 수 없었다. 1 ℓ 벤치 탑(bench top) 생물반응기는 관류 배양을 위한 가장 작은 규모 축소 유닛인 것으로 고려된다(Shimoni et al. (2014) BioProcess Int 12:54-61). 더 작은 규모의 관류 시스템을 개발하는데 있어서의 장애물은 세포 보유 장치의 규모 축소이다. 전형적인 세포 보유 장치는 문헌[Voisard et al. (2003) Biotechol Bioeng 82:751-765]에 논의되어 있고, 여과 또는 원심분리에 기반한 메커니즘은 작은 부피의 생물반응기로 효율적으로 작업하기에 너무 많은 사장 용적을 필요로 한다. 관류 시작시 세포 배양물 침강은 세포 분리 방법으로 탐구되었고 추가 개발로 경사판 침전조와 같은 외부 장치가 개발되었다. 튼튼하고 전단 응력이 거의 발생하지 않는 반면, 세포는 생물반응기의 외부에 위치하여 낮은 온도 또는 불충분한 산소 공급과 같은 차선의 조건에 직면한다(Voisard et al. (2003) Biotechol Bioeng 82:751-765).
따라서, 특히 진핵 발현 세포주를 사용할 때, 스크리닝 목적을 위해 대규모 세포 배양을 소규모로 효율적으로 시뮬레이션하는 방법을 제공할 필요가 당 분야에 존재한다.
발명의 개요
본 발명에 의해 입증된 바와 같이, 현탁액에서 진핵 세포의 관류 배양은 교반된 세포 배양을 이용하여 소규모로 효율적으로 시뮬레이션될 수 있고, 여기서 일정한 시간 간격 후에 배지의 일부는 신선한 배지로 교환된다. 배양액 중의 세포의 유지는 배양 배지의 제거 전에 세포의 침강에 의해 달성된다. 배양액 중의 세포 농도, 세포 생존력 및 특히 생산된 당단백질의 당화 패턴은 소규모 세포 배양과 이것이 시뮬레이션하는 대규모 관류 배양 사이에 매우 유사하다.
따라서, 본 발명은, 제1 양태에서,
(a) 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은,
(a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건을 이용하여 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 방법을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은,
(a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법으로서,
개개의 소규모 세포 배양액이 스크리닝되는 배양 조건 및/또는 세포 클론에 있어서 상이한, 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태는 하기 설명 및 첨부된 청구항으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 출원의 바람직한 구현예를 나타내는 하기 설명, 첨부된 청구항, 및 특정 예는 단지 예시로서 제공되는 것이 이해되어야 한다. 개시된 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 하기를 읽음으로써 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 소규모로 현탁액에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 이러한 배양 방법은 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 배양 방법을 이용하여 적합한 배양 조건 및 세포 클론의 결정을 위한 스크리닝 방법이 수행될 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은,
(a) 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
단계 (a)에 제공된 세포 배양액은 바람직하게는 세포 배양액을 교반하는 수단이 구비된 생물반응기에 제공되는 현탁 세포 배양액이다. 세포 배양액을 교반하는 수단은 특히 피치 블레이드 임펠러(pitched blade impeller)와 같은 임펠러일 수 있다. 생물반응기는 세포 배양액에 기체 및/또는 액체를 공급하는 수단, 및 세포 배양액의 하나 이상의 배양 조건을 측정하는 수단을 추가로 구비할 수 있다. 상기 배양 조건은 세포 배양액의 온도, pH 값, 산소 농도, 영양소 농도 및 이산화탄소 농도를 포함할 수 있다.
세포 배양의 자동화 작업을 위해, 생물반응기는 산소 및/또는 영양소 공급, 세포 배양액의 온도 및/또는 pH 값을 제어할 수 있는 제어 유닛을 추가로 구비한다. 제어 유닛은 세포 배양액에서 측정된 하나 이상의 배양 조건의 값에 기반하여 이러한 파라미터 중 하나 이상을 자동으로 제어할 수 있다. 각 배양 조건에 요망되는 값 또는 범위는 작업자에 의해 미리 설정될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 생물반응기는 진보된 미세생물반응기(AMBR) 시리즈(TAB Biosystems/Sartorius)의 미세생물반응기, 특히 AMBR24 또는 AMBR15이다.
특정 구체예에서, 소규모 세포 배양이 사용된다. 본 발명에 따르면, 소규모 세포 배양은 특히 250 ml 이하, 특히 100 ml 이하, 50 ml 이하, 25 ml 이하 또는 12.5 ml 이하의 배양 부피를 갖는다. 소규모 세포 배양의 부피는 특히 1 ml 내지 200 ml, 특히 2 ml 내지 150 ml, 3 ml 내지 100 ml, 5 ml 내지 75 ml, 7 ml 내지 50 ml, 8 ml 내지 30 ml, 또는 9 ml 내지 20 ml의 범위이다. 특정 구체예에서, 소규모 세포 배양은 10 ml 내지 15 ml, 특히 약 12 ml의 부피를 갖는다.
세포 배양액 중의 세포는 특히 현탁 세포, 즉, 현탁액에서 생존 및/또는 증식할 수 있는 세포이다. 특히, 세포는 생존 및/또는 증식하기 위해 어떤 고체 표면에 부착될 필요가 없다. 특정 구체예에서, 세포는 진핵 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 골수성 백혈병 기원의 무한증식 인간 세포와 같은 무한증식 인간 혈액 세포이다. 골수성 백혈병 기원의 특수한 인간 세포는 K562 세포 및 그로부터 유래된 세포, 예컨대, NM-F9, NM-D4, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X, GT-5s 및 그로부터 유래된 세포이다. K562는 American Type Culture Collection에 존재하는 인간 골수성 백혈병 세포주이다(ATCC CCL-243). 나머지 세포주는 K562 세포에서 유래되며 특수한 당화 특징에 대해 선택되었다. K562로부터 유래된 세포주는 K562에 적합한 널리 공지된 조건 하에서 배양되고 유지될 수 있다. K562 세포를 제외한 이러한 모든 세포주는 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 기탁에 대한 정보는 본 명세서의 끝 부분에서 찾을 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다.
특정 구체예에서, 세포 배양액 중의 세포는 관심 생체분자를 생산한다. 세포는 관심 생체분자를 재조합적으로 생산할 수 있다. 특정 구체예에서, 관심 생체분자는 단백질, 특히 항체와 같은 당단백질이다.
단계 (b)에서, 세포는 세포 배양액에서 배양된다. 세포 배양액의 배양 조건은 일반적으로 배양되는 세포를 수용하도록 선택된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 37℃, 특히 33℃ 내지 40℃의 범위, 특히 35℃ 내지 38℃의 온도에서 배양된다. 또한, 특정 구체예에서, 세포는 약 7.1의 pH 값, 특히 6.5 내지 7.7, 특히 6.7 내지 7.5, 특히 6.9 내지 7.3 범위의 pH 값에서 배양된다. 세포 배양액에서의 세포 밀도는 적어도 1x104개 세포/ml, 특히 적어도 5x104개 세포/ml 또는 적어도 1x105개 세포/ml일 수 있다. 세포 밀도는 특히 약 1x105개 세포/ml 내지 약 5x105개 세포/ml, 특히 약 2x105개 세포/ml 내지 약 3x105개 세포/ml의 범위이다. 특정 구체예에서, 배양 배지의 산소 농도는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 특히 10% 내지 80%, 특히 20% 내지 60%의 범위이다.
특정 구체예에서, 배양 배지의 pH 값 및/또는 산소 농도는 세포 배양 동안 제어된다. pH 값의 제어는 pH 값이 요망되는 범위를 벗어나는 경우 이산화탄소 또는 NaOH를 첨가함에 의해 수행될 수 있다. 이산화탄소는 pH 값을 감소시키기 위해, 즉, pH 값이 지나치게 높은 경우에 첨가되고, NaOH는 pH 값을 증가시키기 위해, 즉, pH 값이 지나치게 낮은 경우에 첨가된다. 산소 농도의 제어는 배양 배지로 통과하는 산소의 양을 제어함으로써 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 배양액에 산소가 공급된다.
세포 배양 동안, 세포 배양액은 교반된다. 특정 구체예에서, 세포 배양액은 임펠러로 교반된다. 세포 배양액을 교반하기에 적합한 임의의 임펠러, 특히 피치 블레이드 임펠러가 이용될 수 있다. 교반 속도는 사용된 생물반응기 및 배양되는 세포에 대해 조정되어야 한다. 예를 들어, 예컨대, 약 5 ml 내지 50 ml의 부피를 갖는 소규모 세포 배양에서, 임펠러의 교반 속도는 약 500 rpm 내지 약 2000 rpm의 범위, 예컨대, 750 rpm 내지 1500 rpm이다.
단계 (c)에서, 세포 배양액의 교반이 정지된다. 특정 구체예에서, 세포는 교반이 단계 (c)에서 정지되기 전에 적어도 1 h 동안 단계 (b)에서 교반 하에서 배양된다. 특히, 세포는 적어도 1.5 h, 적어도 2 h, 적어도 2.5 h 또는 적어도 3 h 동안 교반 하에서 배양된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 8 h, 적어도 10 h, 적어도 11 h 또는 적어도 12 h 동안 교반 하에서 배양된다. 교반이 정지된 후에, 세포는 침강될 수 있다. 세포의 침강은 단계 (d)에서 배양 배지의 일부를 제거하기 전에 적어도 30분 동안 일어날 수 있다. 특정 구체예에서, 침강은 적어도 35분 동안, 특히 적어도 40분 또는 적어도 45분 동안 일어난다. 특히, 세포는 30분 내지 45분, 특히 약 40분의 시간 동안 침강될 수 있다. 특정 구체예에서, 침강 시간은 배양되는 세포의 거동에 따라 조정된다. 특히, 침강 시간은 세포 배양액 중의 세포의 적어도 75%, 특히 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%가 배양 컨테이너의 하부 75%, 특히 배양 컨테이너의 반 아래, 특히 배양 컨테이너의 바닥에 침전될 정도로 충분히 길다. 특정 구체예에서, 세포의 침강은 세포의 침강을 유도하거나 향상시키는 어떠한 수단 또는 물질의 첨가 또는 존재없이 발생한다.
특정 구체예에서, pH 값의 제어 및/또는 산소 농도의 제어는 단계 (c)에서 세포 배양액의 교반을 정지시키기 전에 중단된다. 특히, pH 값 및 산소 농도 둘 모두의 제어는 중단된다. pH 값의 제어 및/또는 산소 농도의 제어는 단계 (c)에서 세포 배양액의 교반을 정지하기 적어도 5분 전, 특히 적어도 10분 전 또는 적어도 15분 전에 중단될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 단계 (c)에서 교반을 정지시킨 후 세포의 침강은 35분 이하 동안 일어난다. 더 짧은 침강 시간을 이용하면, 세포 배양액의 모든 세포가 침강의 끝에 바닥에 침전되지는 않을 것이다. 단계 (d)에서 배양 배지의 일부를 제거할 때, 이 구체예에서, 제거된 배양 배지는 상당한 양의 세포를 함유할 것이다. 따라서, 배양 배지의 일부를 제거함으로써, 세포 블리딩(bleeding)이 달성된다. 이에 의해, 세포 밀도는 제어되고 이러한 세포는 증식 단계로 유지된다. 이러한 구체예에서, 단계 (d)에서 또한 세포 배양액 중 세포의 일부가 제거되어 세포 블리딩이 수행될 수 있다. 특히, 침강 시간은 세포 배양액 중 세포의 약 1% 내지 약 25%, 특히 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15% 또는 약 7.5% 내지 약 12.5%가 단계 (d)에서 제거되는 배양 배지에 의해 제거되도록 조정된다. 특정 구체예에서, 단계 (c)에서 교반을 정지시킨 후 세포의 침강은 단계 (d)에서 배양 배지의 일부를 제거하기 전에 30분 이하, 25분 이하 또는 20분 이하 동안 일어난다. 특히, 단계 (c)에서 교반을 정지시킨 후 세포의 침강은 단계 (d)에서 배양 배지의 일부를 제거하기 전에 약 15분 내지 약 35분, 특히 약 20분 내지 약 30분 동안 일어난다.
단계 (d)에서, 세포 배양액의 배양 배지의 일부가 제거된다. 특정 구체예에서, 약 10% 내지 약 75%의 배양 배지가 제거된다. 특히, 약 50% 내지 약 50%, 특히 약 20% 내지 약 30% 및 특히 약 25%의 배양 배지가 단계 (d)에서 제거된다. 배양 배지는 바람직하게는 단계 (d)에서 세포 배양액의 상부로부터 제거된다. 세포 블리딩이 의도되지 않는 구체예에서, 단계 (d)에서 제거되는 배양 배지는 특히 세포 배양액 중 세포의 10% 미만, 특히 5% 미만, 2.5% 미만 또는 특히 1% 미만을 포함한다.
단계 (e)에서, 신선한 배양 배지가 세포 배양액에 첨가된다. 특정 구체예에서, 단계 (e)에서 첨가되는 신선한 배양 배지의 양은 단계 (d)에서 제거되는 배양 배지의 양과 본질적으로 동일하다. 특히, 단계 (e)에서 첨가되는 배양 배지의 양은 단계 (d)에서 제거되는 배양 배지의 양의 75% 내지 125%의 범위, 특히 90% 내지 110% 또는 95% 내지 105%, 특히 약 100%이다.
특정 구체예에서, 단계 (b) 내지 (e)는 1회 이상 반복된다. 특히, 세포를 일정 시간 동안 배양하고, 특정 시간 간격 후에, 교반을 정지시키고, 세포가 침강되게 하고, 배양 배지의 일부를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가하고, 교반을 다시 시작한다. 그 후, 단계 (b) 내지 (e)를 포함하는 이 사이클을 다시 시작한다. 특정 구체예에서, 단계 (e) 이후, 세포를 다음 사이클의 단계 (c)에서 교반을 정지시키기 전에 적어도 1 h 동안 교반 하에서 배양한다. 특히, 세포는 적어도 1.5 h, 적어도 2 h, 적어도 2.5 h 또는 적어도 3 h 동안 교반 하에서 배양된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 8 h, 적어도 10 h, 적어도 11 h 또는 적어도 12 h 동안 교반 하에서 배양된다. 본원에 기재된 방법은 하루에 적어도 1회 사이클, 특히 하루에 적어도 2회, 적어도 3회 또는 적어도 4회 사이클, 예를 들어, 하루에 8회 이하의 사이클을 포함할 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은,
(a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건을 이용하여 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 방법을 제공한다.
소규모 세포 배양액에서 세포를 배양하는데 사용되는, 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건은 특히 배양 배지 또는 특정 배양 배지 성분, 온도, pH 값, 산소 농도, 세포 밀도, 배양 배지에서 영양소의 첨가 시간 및 표적 농도를 포함하는 세포 영양소의 첨가, 배양 시간, 특정 파워 입력(specific power input), 기체 공급 속도, 관류 속도, 및 배양 배지의 삼투압농도로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
소규모 세포 배양은 대규모 관류 배양의 배양 부피를 시뮬레이션하지 않는다. 특정 구체예에서, 작은 세포 배양은 대규모 관류 배양에서 사용되는 제거되는 배양 배지로부터 세포를 분리하는 방법을 시뮬레이션하지 않는다.
소규모 세포 배양에 의한 대규모 관류 배양의 시뮬레이션은 특히 소규모 세포 배양에서 관찰되는 특정 성질 및 특징이 대규모 관류 배양에서 유사하게 나타날 것임을 의미한다. 이에 의해, 특정 배양 조건 및/또는 세포 클론이 소규모 세포 배양에서 시험될 수 있다. 이러한 배양 조건 및/또는 세포 클론이 유리하다고 입증되면, 이들은 대규모 배양에 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 대규모 관류 배양은 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 밀도로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성 및/또는 특징에 관해 소규모 세포 배양에 의해 시뮬레이션된다. 세포가 관심 생체분자, 특히 당단백질을 생산하는 구체예에서, 소규모 세포 배양에 의해 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 특성 및/또는 특징은 관심 생체분자의 수율, 세포의 생산성, 관심 생체분자의 생산 안정성 및 관심 생체분자의 품질, 예를 들어, 특히 이것이 당단백질인 경우, 생체분자의 하나 이상의 당화 특징을 추가로 포함할 수 있다. 당화 특징은 특히 당화의 상대적인 양, 즉, 글리칸 구조가 당단백질의 당화 부위 중 몇 퍼센트를 차지하는가; 글리칸 구조 유형의 상대적인 양, 즉, 당단백질에 부착된 모든 글리칸 구조 중 몇 퍼센트가 복합체-유형 N-글리칸과 같은 특정 유형의 글리칸 구조인가; 상이한 단당류의 상대적인 양, 즉, 당단백질에 부착된 글리칸 구조 내의 모든 단당류 중 몇 퍼센트가 특정 종류의 단당류, 예컨대 및 갈락토스, 푸코스, 시알산, N-아세틸글루코스아민 및 만노스인가; 및 특정 당화 모티프의 상대적인 양, 즉, 모든 글리칸 구조 중 몇 퍼센트가 특정 당화 모티프, 예컨대, 코어 푸코스, 양분 N-아세틸글루코사민, 적어도 하나의 갈락토스 잔기, 적어도 2개의 갈락토스 잔기, 적어도 하나의 시알산 잔기, 적어도 2개의 시알산 잔기 및 모노안테나, 디안테나, 트리안테나 및 테트라안테나 글리칸을 나타내는가를 포함한다.
특정 구체예에서, 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 방법은 단계 (e) 뒤에 추가 단계 (g)를 포함한다:
(g) 단계 (b)에서 사용된 하나 이상의 배양 조건을 이용하여 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 제공하는 단계.
단계 (g)에서 제공되는 대규모 관류 배양은 상기 방법에 의해 시뮬레이션된 대규모 관류 배양이고 단계 (b)에서 사용된, 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건을 이용한다.
제3 양태에서, 본 발명은,
(a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법으로서,
개개의 소규모 세포 배양액이 스크리닝되는 배양 조건 및/또는 세포 클론에 있어서 상이한, 방법을 제공한다.
단계 (a)에서, 2개 이상의 소규모 세포 배양액이 제공된다. 특히, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 8개 또는 적어도 10개의 소규모 세포 배양액이 제공된다.
특정 구체예에서, 스크리닝되지 않은 배양 조건 중 하나 이상, 특히 전부는 소규모 세포 배양들 간에 유사하거나 동일하다. 스크리닝될 수 있는 적합한 배양 조건은 특히 배양 배지 또는 특정 배양 배지 성분, 온도, pH 값, 산소 농도, 세포 밀도, 배양 배지에서 영양소의 첨가 시간 및 표적 농도를 포함하는 세포 영양소의 첨가, 배양 시간, 특정 파워 입력, 기체 공급 속도, 관류 속도, 및 배양 배지의 삼투압농도로 구성된 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
상기 방법이 대규모 관류 배양을 위한 세포 클론을 스크리닝하기 위한 것인 구체예에서, 상이한 소규모 세포 배양에 사용되는 상이한 세포 클론은 특히 동일한 부모 세포로부터 유래된다. 세포가 재조합적으로 관심 생체분자를 생산하는 경우, 상이한 클론은 특히 동일한 생체분자를 생산하고, 특히 동일한 트랜스펙션 실험에 의해 수득될 수 있다.
특정 구체예에서, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법은 단계 (e) 뒤에 단계 (f)를 추가로 포함한다:
(f) 대규모 관류 배양의 요망되는 특성 및/또는 특징을 제공하는 스크리닝된 배양 조건 및/또는 세포 클론를 선택하는 단계.
대규모 관류 배양의 요망되는 특성 및/또는 특징은 특히 세포 성장, 세포 생존력 및 세포 밀도로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 세포가 관심 생체분자, 특히 당단백질을 생산하는 구체예에서, 대규모 관류 배양의 특성 및/또는 특징은 관심 생체분자의 수율, 세포의 생산성, 관심 생체분자의 생산 안정성 및 관심 생체분자의 품질, 예를 들어, 특히 이것이 당단백질인 경우, 생체분자의 하나 이상의 당화 특징을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 당화 특징은 상기 기재되어 있다.
특정 구체예에서, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법은 단계 (f) 뒤에 단계 (g)를 추가로 포함한다:
(g) 단계 (f)에서 선택된 배양 조건 및/또는 세포 클론을 이용하여 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 제공하는 단계.
특정 구체예에서, 단계 (g)에서 제공된 대규모 관류 배양의 추가 배양 조건은, 가능하다면, 스크리닝되지 않은 소규모 세포 배양의 배양 조건과 유사하거나 동일하다. 대규모 관류 배양과 소규모 세포 배양 사이에 유사하거나 동일할 수 있는 적합한 배양 조건은 특히 배양 배지 또는 특정 배양 배지 성분, 온도, pH 값, 산소 농도, 세포 밀도, 배양 배지에서 영양소의 첨가 시간 및 표적 농도를 포함하는 세포 영양소의 첨가, 배양 시간, 특정 파워 입력, 기체 공급 속도, 관류 속도, 및 배양 배지의 삼투압농도로 구성된 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
특정 구체예에서, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법은 추가 단계 (h)를 포함한다:
(h) 소규모 세포 배양 중 하나 이상이 대규모 관류 배양에 요망되는 특성 및/또는 특징을 갖는지를 결정하는 단계.
단계 (h)는 특히 단계 (e)와 (f) 사이에 수행될 수 있다. 단계 (h)에서 결정된 특성 및/또는 특징은 단계 (f)에 관해 상기 기술된 임의의 하나 이상의 특성 및/또는 특징일 수 있다. 특성 및/또는 특징을 결정하기 위한 수단 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
단계 (b) 내지 (e)가 1회 이상 반복되는 구체예에서, 단계 (h)는 또한 각 사이클 동안 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계 (h)는 특정 수의 사이클이 수행된 후에 1회 또는 수 회 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 대규모 관류 배양은 적어도 1 ℓ, 바람직하게는 적어도 2 ℓ, 적어도 5 ℓ 또는 적어도 10 ℓ의 부피를 갖는다. 특정 구체예에서, 대규모 관류 배양은 적어도 10 ℓ 또는 적어도 100 ℓ의 부피를 갖는다. 이와 관련하여 관류는 특히 세포 배양액의 배양 배지의 일부가 배양 과정 동안 신선한 배양 배지로 교환되는 것을 의미한다. 따라서 관류 배양은 배치 배양과 상이하다. 대규모 관류 배양에서의 관류는 임의의 공지된 수단에 의해 수행될 수 있고, 특히 여과 또는 원심분리 시스템을 이용함에 의해 수행된다. 적합한 여과 시스템은 중공 섬유 필터이며, 특히 교대적인 접선 유동(ATF) 시스템으로 이용된다. 원심분리 시스템의 경우, 특히 연속 원심분리기가 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 소규모 세포 배양은 대규모 관류 배양의 7.5% 이하의 배양 부피, 특히 대규모 관류 배양의 5% 이하, 2.5% 이하, 1.5% 이하, 또는 심지어 1% 이하의 배양 부피를 갖는다. 특정 구체예에서, 소규모 세포 배양은 심지어 대규모 관류 배양의 0.5% 이하, 특히 0.25%의 배양 부피를 갖는다.
본원에 기술된 현탁액에서 세포를 배양하는 방법의 특징 및 구체예는 또한 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 방법 및 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법에 유사하게 적용된다.
추가 양태에서, 본 발명은 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하기 위한 소규모 세포 배양의 이용에 관한 것이고, 여기서 소규모 세포 배양은,
(a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건을 이용하여 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하여 작업된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하기 위한 소규모 세포 배양의 이용을 제공하고, 여기서 소규모 세포 배양은,
(a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
(b) 세포를 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
(c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
(d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
(e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하여 작업된다.
특정 구체예에서, 하나 초과의 소규모 세포 배양이 이용되며 개개의 소규모 세포 배양은 스크리닝되는 배양 조건 및/또는 세포 클론에 있어서 상이하다.
본원에 기재된 방법의 특징 및 구체예는 소규모 세포 배양의 이용에도 유사하게 적용된다.
본원에서 사용되는 표현 "포함하다"는 이의 문자상의 의미 외에도 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하며, 특별히 이를 나타낸다. 따라서, 표현 "포함하다"는 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함하지 않는 구체예뿐만 아니라 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함할 수 있고/있거나 확실히 포함하는 구체예를 지칭한다. 마찬가지로, 표현 "갖는다"는 표현 "포함하다"로 이해되어야 하며, 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하고, 이들을 구체적으로 언급한다.
본원에 기술된 수치 범위는 그 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 본원에 제공된 제목은 본 발명의 다양한 양태 또는 구체예의 제한이 아니며, 전체로서의 명세서에 대한 언급으로 해석될 수 있다. 한 구체예에 따르면, 방법의 경우 특정 단계를 포함하고 조성물의 경우 특정 성분을 포함하는 것으로 본원에 기재된 주제는 개별 단계 또는 성분으로 구성된 주제를 지칭한다. 본원에 기술된 특정 양태 및 구체예를 선택하고 조합시키는 것이 바람직하며, 특정 구체예들의 각각의 조합으로부터 발생하는 특정 주제가 또한 본 개시내용에 속한다.
도면
도 1은 침강 동안(최대 40분) 및 배양 배지 교환 및 교반 재시작 후(41분에서의 값)의 골수성 백혈병 기원(A+B) 및 CHO 세포 기원(C+D)의 무한증식 인간 혈액 세포의 생존 가능한 세포 농도(A+C) 및 생존력(B+D)을 제시한다.
도 2는 연속 교반 및 불연속 교반된 항체 생성 클론에 대한 생산성(A) 및 글루코스(B-C) / 글루타민(D-E) 대사에 대한 침강의 효과를 제시한다. 세포는 11시간 동안 배양되었다. 교반은 침강된 세포(사각형)에 대해 중단되었으나, 대조군 세포(원)에 대해서는 중단되지 않았다(오차 막대는 s.d.임, n=3).
도 3은 IgG 항체를 재조합적으로 생성하는 클론 3(GEX 세포주)의 12 mL 침강 기반 ambr 배양(5회 작업), 1L 관류 배양(7회 작업) 및 10L 단일 사용 생물반응기 배양의 생존 가능한 세포 농도(A), 생존력(B) 및 생성물 당화(C)를 제시한다. 평균±SEM(A-B) 및 평균±SD(C)가 제시된다. 배양 조건(DO, pH, 온도, 배지)은 모든 규모에 대해 동등하다. 10 mL 침강 기반 ambr 배양 및 1 L 내지 1000 L의 표준 배양에서 다양한 IgG 항체를 생성하는 다양한 클론의 생성물 당화가 (D)에 제시된다. 또한, IgG 항체를 재조합적으로 생성하는 클론 4(GEX 세포주)의 12 mL 침강 기반 ambr 배양(2회 작업), 스테인리스강 생물반응기에서의 200 L 센트리테크(centritech) 관류 배양 및 1000L 단일 사용 관류 생물반응기 배양의 생존 가능한 세포 농도(E), 및 생존력(F)이 제시된다. 배양 조건(DO, pH, 온도, 배지)은 모든 규모에 대해 동등하다.
도 4는 배치 방식의 12 mL 규모 ambr 배양(백색), 관류 방식의 소규모 ambr 배양(적색) 및 1L 규모 배양(회색, 흑색)에 대한 클론 1(A) 및 클론 2(B)에 의해 생성된 IgG 항체에 대한 푸코실화의 정도를 제시한다.
도 5는 ambr 시스템에서 침강 기반 관류에 적용되는 CHO 세포 배양물의 세포 농도(A) 및 생존력(B)을 제시한다.
실시예
실시예 1: 미세생물반응기 시스템에서의 배양
미세생물반응기 배양은 ambr™(진보된 미세생물반응기) 시스템(TAP Biosystems/Sartorius)에서 수행된다. ambr 시스템은 24-방식 또는 48-방식으로 이용 가능하다. 본 작업에서, 각각 12개의 용기를 수용하는 2개의 배양 스테이션으로 구성되는 24-방식만 사용된다. 각각의 용기에는 11 mm 직경을 갖는 피치 블레이드 임펠러가 장착되어 있다. pH 및 DO는 90초마다 각각의 용기의 바닥에 있는 광점에 의해 측정된다. 각각의 용기에는 질소(또는 공기), 산소(DO를 유지하기 위함), 이산화탄소(pH를 감소시키기 위함) 또는 이들 기체의 혼합물이 개별적으로 공급된다. 용기는 살균되며, 살포관과 함께 또는 살포관 없이 이용 가능하다. 인간 골수성 백혈병 유래 세포(GEX 세포)의 배양을 위해, 비살포(spargeless) 용기가 사용된다. CHO DG44 세포는 적용에 따라 살포관으로 또는 살포관 없이 배양된다. 배양 온도 및 교반 속도는 각각의 배양 스테이션(12개 용기의 세트)에 대해 설정된다. 모든 세포주는 37℃에서 배양된다. DO 농도에 따라 GEX 세포는 830 rpm에서 1000 rpm까지 교반되고, CHO 세포는 830 내지 1300 rpm으로 교반된다. pH는 0.5 M NaOH의 첨가(pH 6.9 미만에서 촉발됨) 및 CO2 공급(pH 7.3 초과에서 촉발됨)에 의해 유지된다. 샘플링 및 배지 및 공급물의 첨가는 1 mL 또는 5 mL의 최대 부피로 단일 사용 팁을 이용하여 프로그램화 가능한 액체 핸들러로 수행된다. 각각의 용기의 작업 부피는 12 mL(최소 10 mL, 최대 15 mL)이다. 세포 농도 및 대사물 측정을 위한 샘플(세포 밀도에 따라 250 내지 450 μL)이 매일 채취된다. pH를 오프라인 측정에 의해 3-4일마다 교정하였다. 살균 작업을 보장하기 위해, 전체 시스템은 생물학적 안전 캐비넷 하여 놓여진다. 용기는 GEX 세포에 대해 2x105 세포/mL 또는 CHO 세포에 대해 3x105 세포/mL로 접종된다. 생존력이 65% 미만으로 떨어진 경우에 배양을 종료시켰다. 살포된 용기에 대한 소포제는 필요한 경우 공급된다.
실시예 2: 미세생물반응기 시스템에서의 관류
관류 방식에 대해, 세포는 상기 기재된 바와 같이 접종된다. 관류는 글루코스 농도가 2.5 g/L 미만으로 떨어진 경우(보통 72 내지 120시간 후) 12 mL로 시작된다. 세포 유지는 침강에 의해 보장된다. 세포가 침강되도록 하기 위해, 교반이 전체 배양 스테이션에 대해 중지된다. 교반 중단 10분 전, NaOH를 이용한 pH 조절이 중단되어 교반 정지 직전에 염기의 첨가가 방지된다. DO 조절은 교반과 동시적으로 중단된다. 세포는 30 내지 45분, 바람직하게는 45분 동안 침강된다. 이 시간 후, 3 mL의 수거물이 액체 상단으로부터 액체 핸들러에 의해 분리되고, 24-딥 웰 플레이트에 놓여진다. ambr 시스템의 샘플 깊이는 수거물이 배양 액체의 상단으로부터 채취되는 것을 보장하도록 변경된다(표준 샘플 깊이는 용기의 바닥 근처의 샘플을 채취하도록 설정된다). 수거물의 분리는 각각의 용기에 대해 다수의 피페팅 작업에 의해 수행된다. 수거물의 분리 후, 교반은 지속되고, 배양의 부피는 액체 핸들러에 의해 딥 웰 플레이트 내에 공급되는 새로운 배지의 첨가에 의해 12 mL로 회복된다. DO 및 pH 조절은 배지의 첨가 후에 지속된다. 모든 단계는 시스템에 의해 자율적으로(사용자 상호작용 없음) 수행된다. 모든 단계를 함께 취하면 약 1시간이 걸린다. 단계마다, 3 mL(작업 부피의 25%)가 교환된다. 한 반응기 부피의 관류 속도(Vr/d)에 대해, 하루에 4 단계가 필요하다. 사용자 상호작용은 매일의 샘플링, 단일 사용 팁의 재로딩, 수거물의 분리 및 공급 배지의 보충으로 제한된다.
표 1: 관류 작업을 가능하게 하는 ambr 시스템에서 수행되는 단계
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실시예 3: 침전 시간의 결정
하기 실시예는 골수성 백혈병 기원의 무한증식 인간 혈액 세포 또는 CHO 세포로 수행된다. 세포의 생성 및 생성물 품질의 분석을 위해, 세포를 당화된 항체를 재조합적으로 생성시키도록 트랜스펙션시켰다.
최적 침전 시간을 결정하기 위해, 교반이 중단되고, 침전 전, 교반 중지 10, 15, 20, 25, 30, 35 및 40분 후 및 교반의 지속 및 새로운 배지의 첨가 직후에 세포가 계수된다.
분리 효율(SE)은 관류 배양에서 세포 유지 성능을 표현하기 위해 일반적으로 사용되며, 다음과 같이 계산된다(c반응기는 생물반응기 내의 배양 배지 내의 세포의 농도이고, c수거는 침전 시간 후의 생물반응기로부터 분리된 배양 배지 내의 세포의 농도이다):
Figure pct00002
둘 모두의 세포주에 대해, 거의 세포가 없는 수거를 의미하는 95% 초과의 분리 효율을 달성하기 위해 약 1x107 세포/mL의 최초 세포 밀도에서 40분의 침강 시간이 충분하다. 90% 미만의 분리 효율도 만족스러우며, 때로는 자동 세포 블리딩을 포함하는 것이 바람직하다. 블리딩의 정도는 침전 시간에 의해 조정될 수 있다(짧은 침전 시간 = 높은 블리딩 속도). 교반의 지속 후, 세포 밀도는 시작 세포 밀도로 회복되며, 이는 관류 단계가 세포 손실 없이 수행되는 것을 나타낸다(도 1A 참조). 더욱이, 세포 생존력은 또한 침강 단계에 의해 영향을 받지 않는다(도 1B 참조).
생산성 및 주요 대사물에 대한 침강의 효과를 추가로 연구하기 위해, 1x107 세포/ml의 통상적인 공정 세포 밀도로 ambr 작업을 시작하였다. 대조군 배양물은 연속적으로 교반되는 반면, 침강된 용기는 110분 이내에 교반 40분 동안 4번 중단으로 불연속적으로 혼합되었다. 배지는 둘 모두의 배양 설정에서 교환되지 않았다.
도 2 B, C 및 E에서 관찰되는 바와 같이, 글루코스, 글루타민 및 글루타메이트 수준은 배양 조건 사이뿐만 아니라 생존 가능한 세포 농도 및 생존력 사이에서 상이하지 않다(데이터는 제시되지 않음). 역가 및 락테이트 수준에 대해, 차이가 관찰될 수 있다. 정기적으로 침강된 세포는 지속적으로 교반된 세포보다 높은 락테이트 수준을 나타낸다. 침강을 개시하기 위해 교반 및 기체 발생이 중단되는 경우, 산소 전달은 신속히 감소하여 저산소 상태가 된다. 이러한 효과는 국소 세포 농도가 잘 혼합된 조건하에서보다 훨씬 높은 용기의 바닥에 축적된 세포에 대해 더더욱 극적이다. 저산소 조건하에서, 세포는 암 기원의 포유동물 세포에 대해 글루코스의 락테이트로의 전환을 의미하는 혐기성 에너지 생성에 더 의존한다. CHO 세포에서의 저산소 조건은 또한 단백질 생산성을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 특정 mAb 생성 속도가 14.7±0.2 μg/mL h로부터 12.1 7±0.1 μg/mL h로 감소한 도 2A에 제시된 감소된 IgG 축적과 일치한다.
실시예 4: 세포 성장 및 생성물 품질의 비교
세포 성장 및 생성물 품질을 상기 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 미세생물반응기 ambr 시스템과 관류 생물반응기에서의 1 L 배양 사이에서 비교하였다.
1 L 배양물에 2.0x105 세포/mL를 접종하였다. 글루코스가 2.5 g/L 미만으로 떨어지는 경우(일반적으로, 4-5일), 0.5 V/d의 관류 속도로 배지를 공급함으로써 연속 작업을 가능하게 하였다. 글루코스 농도가 2.5 g/L 미만으로 유지되는 경우에 관류가 증가되었으나, 적어도 격일로 증가되었다. 최대 관류 속도는 하루에 2 반응기 부피였다. pH를 0.5 M NaOH의 첨가 또는 CO2 살포에 의해 조절하였다. 생존력이 65% 미만으로 떨어진 경우 또는 의도된 작업 시간에 도달한 경우 배양을 종료시켰다. 실험실 1 L 규모 배양을 Sartorius Biostat B-DCU 2l에서 수행하였다. 용존 산소 및 pH는 표준 전극(각각 Mettler Torledo InPro 6800 및 Mettler-Torledo 405-DPAS-SC-K8S, Mettler Torledo, Switzerland)에 의해 측정된다. 3-블레이드 세그먼트 임펠러에 의해 진탕이 수행된다. 관류는 ATF2 모듈 또는 센트리테크 원심분리기를 이용하여 수행된다. ATF2 모듈은 60 cm PES 막(0.2 μm 포어 크기 및 0.15m2 막 영역, Spectrum, USA)을 갖는다. ATF2 모듈 내부의 사장 용적으로 인해, 막 교환은 100-150 mL의 세포 현탁액의 블리딩과 함께 진행된다. 독립형 연속 원심분리기 센트리테크 Lab II 또는 Lab III(Lab II의 후속모델)(Berry Wehrmiller, Pneumatic scale)가 불연속의 간헐적 방식 작업에 사용된다. 이는 소규모 부피에 대해 권장된다. 주기 사이의 대기 시간은 관류 속도를 조절하도록 조정된다. 각각의 작업 주기 종료시, 모든 튜브는 남아 있는 세포를 생물반응기로 역 플러싱시키기 위해 상층액으로 플러싱된다.
관류 생물반응기에서의 1 L 또는 10 L 배양 및 ambr 시스템에서의 소규모 배양의 성장 프로파일은 매우 유사하다. 배양물은 동일한 최대 세포 밀도에 도달한다. 1 L 관류 배양물의 생존력은 소규모 ambr 시스템 또는 10 L 대규모 배양에서의 침강 기반 관류에 대해서보다 조금 더 낮지만, 유사하다. 생성물 당화 패턴은 1000 L의 부피까지도 소규모 ambr 배양과 대규모 배양 사이에 매우 유사하다(공정 관리에서 관련되지 않은 변화를 갖는 상이한 작업으로부터 획득된 평균 값)(도 3 참조). 추가의 품질 속성은 표 2에 나열된다:
표 2: 추가 생성물 품질 분석.
Figure pct00003
도 4는 관류 방식의 소규모 ambr 시스템이 배치 방식의 ambr 시스템보다 큰 규모의 배양의 과정 동안 당화 패턴에서의 변화를 예측하는데 훨씬 더 적합한 것을 제시한다. 특히, 클론 P741-E5는 초기 수거물(관류 4일)과 후기 수거물(관류 25일)을 비교하는 경우 시간이 지남에 따라 푸코실화의 증가를 나타낸다(B에서 회색 막대). 푸코실화의 증가는 또한 배치 방식에서가 아니라 ambr 관류에서 관찰된다. 클론 P915-D3은 배치 방식에서 높은 푸코실화를 나타내지만, ambr 및 1L 규모 관류에서는 낮은 푸코실화를 나타낸다.
CHO DG44 세포는 기체 공급(살포되거나 살포되지 않음)과 독립적으로 소규모 ambr 시스템에서의 침강 기반 관류에서 3.5 x 107 세포/mL까지 우수하고 일관된 성장을 나타낸다. 생존력은 21일의 전체 배양 동안 높게(90% 초과) 유지된다(도 5 참조).
CHO DG44 유래 세포를 사용하여 1L 및 12mL 규모로 생성된 모노클로날 항체의 당화는 매우 유사하다. ambr 기반 관류의 갈락토실화는 수거 10일 동안 약간 감소된다.
표 3: 1L 및 12mL 규모로 CHO DG44에서 생성된 모노클로날 항체의 글리칸 구조.
Figure pct00004
실시예 5: 실험(DoE) 연구의 설계
본원에서 개발된 시스템의 이점을 추가로 입증하기 위해, DoE 연구가 수행된다. DoE 인자로서, 0.5% 내지 1.5%(CC5)의 농도 범위 내의 화학 샤페론의 첨가, 0.5 내지 1.5배의 GlycoMix의 보충, 표준 농도 및 공정 pH(6.8-7.2)가 사용된다. 4개의 중심점 및 14개의 설계 작업을 갖는 CCF(중심 합성면) 설계가 선택된다. 평균 생존력, 적분 생존 가능 세포 밀도(IVCD), 및 작업 당 전체 생성물이 반응으로 사용된다. 모델 적합성의 요약은 표 4에서 설명된다.
표 4: DoE 적합성의 요약
Figure pct00005
모든 반응에 대한 R2 값은 높고, 1에 가까우며, 이는 우수한 모델 적합성을 나타낸다. 미래 예측 정확도 Q2는 또한 3개 응답 모두에 대해 약 0.8로 높다. 우수한 모델은 0.5를 초과하는 Q2 값을 나타낸다. 유효성(0.25 초과여야 함) 및 재현성(0.5 초과여야 함)이 또한 허용 가능하였다.
기탁된 생물학적 물질의 확인
세포주 DSM ACC 2606 및 DSM ACC 2605는 Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (DE)에 의해 2003년 8월 14일에 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (DE)에 기탁되었다. 한편 이들은 Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG에서 Glycotope GmbH로 양도되었으므로 Glycotope는 이러한 생물학적 물질을 언급할 권리가 있다.
세포주 DSM ACC 2806, DSM ACC 2807, DSM ACC 2856, DSM ACC 2858 및 DSM ACC 3078은 하기 표에 지시된 날짜에 Glycotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (DE)에 의해 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE)에 기탁되었다.
Figure pct00006

Claims (15)

  1. (a) 세포 배양액을 제공하는 단계;
    (b) 세포를 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 세포 배양액이 교반되는 단계;
    (c) 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
    (d) 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
    (e) 신선한 배양 배지를 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포를 배양하는 방법.
  2. (a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
    (b) 세포를 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건을 이용하여 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
    (c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
    (d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
    (e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 시뮬레이션하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 소규모 세포 배양액에서 세포를 배양하는데 사용되는, 시뮬레이션되는 대규모 관류 배양의 하나 이상의 배양 조건이 배양 배지, 온도, pH 값, 산소 농도, 세포 밀도, 배양 배지에서 영양소의 첨가 시간 및 표적 농도를 포함하는 세포 영양소의 첨가, 배양 시간, 특정 파워 입력(specific power input), 기체 공급 속도, 관류 속도, 및 배양 배지의 삼투압농도로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  4. (a) 대규모 관류 배양액의 10% 이하의 배양 부피를 갖는 소규모 세포 배양액을 제공하는 단계;
    (b) 세포를 소규모 세포 배양액에서 배양하는 단계로서, 소규모 세포 배양액이 교반되는 단계;
    (c) 소규모 세포 배양액의 교반을 정지시키는 단계;
    (d) 소규모 세포 배양액 중 세포의 적어도 부분적 침강 후에 소규모 세포 배양액의 배양 배지의 일부를 제거하는 단계; 및
    (e) 신선한 배양 배지를 소규모 세포 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는, 현탁액에서 세포의 대규모 관류 배양을 위한 배양 조건 및/또는 세포 클론을 스크리닝하는 방법으로서,
    개개의 소규모 세포 배양액이 스크리닝되는 배양 조건 및/또는 세포 클론에 있어서 상이한, 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 스크리닝되는 배양 조건이 배양 배지, 온도, pH 값, 산소 농도, 세포 밀도, 배양 배지에서 영양소의 첨가 시간 및 표적 농도를 포함하는 세포 영양소의 첨가, 배양 시간, 특정 파워 입력, 기체 공급 속도, 관류 속도, 및 배양 배지의 삼투압농도로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 높은 세포 생존력, 높은 및/또는 안정한 세포 밀도, 세포 배양액에서 세포에 의해 생산되는 관심 생체분자의 높은 및/또는 안정한 수율, 및 세포 배양액에서 세포에 의해 생산되는 관심 생체분자의 요망되는 특성을 제공하는 그러한 배양 조건 및/또는 세포 클론이 스크리닝에서 선택되는 방법.
  7. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 대규모 관류 배양액이 적어도 1 ℓ의 부피를 갖고/거나, 소규모 세포 배양액이 50 ml 이하의 부피를 갖는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 교반을 정지시킨 후, 세포의 침강이 단계 (d)에서 배양 배지의 일부를 제거하기 전에 적어도 35분 동안 일어나는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 교반을 정지시킨 후, 세포의 침강이 단계 (d)에서 배양 배지의 일부를 제거하기 전에 30분 이하 동안 일어나고, 단계 (d)에서 또한 세포 배양액 중 세포의 일부가 제거되어 세포 블리딩이 수행되는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지의 15% 내지 50% 및 30%가 단계 (d)에서 제거되고/거나; 배양 배지가 단계 (d)에서 세포 배양액의 상부로부터 제거되는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)에서 첨가되는 신선한 배양 배지의 양이 단계 (d)에서 제거되는 배양 배지의 양과 본질적으로 동일한 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지의 pH 값 및/또는 산소 농도가 세포 배양 동안 제어되고; pH 값 및/또는 산소 농도의 제어가 단계 (c)에서 세포 배양액의 교반을 정지시키기 적어도 5분 전에 중단되는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 내지 (e)가 1회 이상 반복되고, 단계 (e) 이후, 세포가 다음 사이클의 단계 (c)에서 교반을 정지시키기 전에 적어도 1 h 동안 교반 하에서 배양되는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 배양되는 세포가 현탁액에서 성장하는 진핵 세포, 바람직하게는 무한증식 인간 혈액 세포, 예컨대, 골수성 백혈병 기원의 무한증식 인간 세포, 또는 CHO 세포인 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 재조합적으로 관심 생체분자, 바람직하게는 당단백질을 생산하는 방법.
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