JP6737813B2 - 懸濁細胞の小スケール培養 - Google Patents
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Description
本発明は、懸濁細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションする小スケール細胞培養システムに関する。本発明は、特に、細胞を培養するための方法であって、培養培地の一部を置き換えるために、細胞沈降を使用して培養培地から細胞を分離する方法を提供する。この方法は、大スケール細胞培養をシミュレーションするため、ならびに大スケール細胞培養に使用するための培養条件および細胞クローンをスクリーニングするために使用することができる。
組換えタンパク質の産生は、現代のバイオテクノロジー産業の主要な態様である。市場で大量の高品質タンパク質が必要とされる用途の数が増えるにつれ、ますます、その重要性が高まっている。食品生産および特に薬理学は、組換えタンパク質の必要性が着実に増加する2つの主要な分野である。商業的に実行可能なプロセスを得るためには、より高い生産効率および結果的に最終製品のより低いコストが求められる。
したがって、とりわけ真核生物発現細胞株を使用する場合に、スクリーニング目的のために大スケール細胞培養を小スケールで効率的にシミュレーションするための方法を提供する必要性が当該技術分野において存在する。
(a)細胞培養物を提供するステップ;
(b)細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
(a)大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の1つまたは複数の培養条件を使用して、小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
(a)大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養が攪拌されるステップ;
(c)小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含み、個々の小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき培養条件および/または細胞クローンが異なる、方法を提供する。
本発明は、小スケールの懸濁物中で細胞を培養するための方法を対象とする。これらの培養方法を使用して、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションすることができる。さらに、前記培養方法を使用して、適切な培養条件および細胞クローンの決定のためのスクリーニング方法を実施することができる。
(a)細胞培養物を提供するステップ;
(b)細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
(a)大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の1つまたは複数の培養条件を使用して、小スケール細胞培養物中で細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養が攪拌されるステップ;
(c)小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
(g)ステップ(b)で使用される1つまたは複数の培養条件を使用して、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養物を提供するステップ。
(a)大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養が攪拌されるステップ;
(c)小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含み、個々の小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき培養条件および/または細胞クローンが異なる、方法を提供する。
(f)大スケール灌流培養物の所望の特性および/または特徴を提供するための培養条件および/または細胞クローンについてスクリーニングされたものを選択するステップ。
(g)ステップ(f)で選択された培養条件および/または細胞クローンを使用して、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養物を提供するステップ。
(h)1種または複数の小スケール細胞培養物が、大スケール灌流培養に望ましい特性および/または特徴を有するか否かを決定するステップ。
(a)大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の1つまたは複数の培養条件を使用して、小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含んで操作される、使用を対象とする。
(a)大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含んで操作される、使用を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
懸濁物中の細胞を培養するための方法であって、
(a)細胞培養物を提供するステップ;
(b)細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)前記細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)前記細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を前記細胞培養物に添加するステップ
を含む方法。
(項目2)
懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法であって、
(a)前記大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の1つまたは複数の培養条件を使用して前記細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法。
(項目3)
前記小スケール細胞培養物において細胞を培養するために使用される、シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の前記1つまたは複数の培養条件が、培養培地、温度、pH値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、項目2に記載の方法。
(項目4)
懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および/または細胞クローンをスクリーニングするための方法であって、
(a)前記大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)前記小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含み、個々の前記小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき前記培養条件および/または前記細胞クローンが異なる、方法。
(項目5)
スクリーニングするべき前記培養条件が、培養培地、温度、pH値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記培養条件および/または細胞クローンが、高い細胞生存率、高いおよび/または安定な細胞密度、前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の高いおよび/または安定した収率、ならびに前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の所望の特性を提供する前記スクリーニングにおいて選択される、項目4または5に記載の方法。
(項目7)
前記大スケール灌流培養物が少なくとも1lの容量を有し、および/または前記小スケール細胞培養物が50mlもしくはそれ未満の容量を有する、項目2から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
ステップ(c)における撹拌を停止した後、ステップ(d)で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が少なくとも35分間起きる、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
ステップ(c)における撹拌を停止した後、ステップ(d)で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が30分またはそれ未満の間起き、ステップ(d)で、前記細胞培養物中の前記細胞の一部もまた、細胞ブリーディングをもたらすために除去される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
ステップ(d)で前記培養培地の15%〜50%の間および30%が除去され;ならびに/または前記培養培地がステップ(d)で前記細胞培養物の上部から除去される、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
ステップ(e)で添加される新鮮な培養培地の量は、ステップ(d)で除去される培養培地の量と、本質的に同一である、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記培養培地中の前記pH値および/または前記酸素濃度が前記細胞の培養中に制御され、ステップ(c)における前記細胞培養物の撹拌を停止する前に、前記pH値および/または前記酸素濃度の制御が少なくとも5分間停止される、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
ステップ(b)〜(e)が1回または複数回、繰り返され、ステップ(e)の後、次のサイクルのステップ(c)で撹拌が停止する前に、少なくとも1時間、撹拌下で前記細胞が培養される、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
培養するべき前記細胞が、懸濁状態で成長する真核細胞、好ましくは骨髄性白血病起源の不死化ヒト細胞のような不死化ヒト血液細胞、またはCHO細胞である、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記細胞が、目的の生体分子、好ましくは糖タンパク質を組換えにより産生する、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
マイクロバイオリアクター培養は、ambr(商標)(advanced mircobioreactor)システム(TAP Biosystems/Sartorius)において実施する。ambrシステムは、24ウェイまたは48ウェイとして利用可能である。この作業においては、各々12個の容器を収容する2つの培養ステーションからなる24ウェイのみを使用する。各容器は、直径11mmのピッチブレードインペラーを備えている。pHおよびDOは、90秒ごとに各容器の底の光スポットによって測定する。各容器には、窒素(または空気)、酸素(DOを維持するため)、二酸化炭素(pHを減少させるため)、またはこれらのガスの混合物を個別に供給する。容器は事前に滅菌され、スパージャー(sparge tube)付き、またはスパージャーなしで利用可能である。ヒト骨髄性白血病由来細胞(GEX細胞)の培養においては、散布なし容器を使用する。CHO DG44細胞は、用途に応じて、スパージャー付き、またはスパージャーなしで培養する。各培養ステーション(12個の容器のセット)について、培養温度および撹拌速度を設定する。全ての細胞株は37℃で培養する。DO濃度に応じて、GEX細胞は830rpm〜1000rpmまでで、CHO細胞は830〜1300rpmの間で撹拌する。0.5MのNaOHの添加(pH 6.9より下で誘発される)およびCO2の供給(pH 7.3より上で誘発される)によって、pHを維持する。培地のサンプリングおよび添加ならびにフィードは、最大容量1mLまたは5mLの単回使用チップを使用するプログラム可能な液体ハンドラーによって実施する。各容器の作業容量は12mL(最小10mL、最大15mL)である。細胞濃度および代謝物測定のための試料は、毎日(細胞密度に応じて250と〜450μLの間、)採取する。pHは、3〜4日ごとにオフライン測定によって較正した。無菌操作を確認するために、システム全体を生物学的安全キャビネット下に位置させる。GEX細胞については2×105細胞/mL、またはCHO細胞については3×105細胞/mLで、容器に播種する。生存率が65%を下回るまで落ち込んだ時に、培養を終了した。必要な際は、散布された容器に対して消泡剤を供給する。
(実施例2)マイクロバイオリアクターシステムにおける灌流
(実施例4):細胞成長と生成物品質の比較
寄託された生物学的材料の同定
Claims (14)
- 懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法であって、
(a)前記大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の1つまたは複数の培養条件を使用して前記細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;および
(e)新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法。 - 前記小スケール細胞培養物において細胞を培養するために使用される、シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の前記1つまたは複数の培養条件が、培養培地、温度、pH値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および/または細胞クローンをスクリーニングするための方法であって、
(a)前記大スケール灌流培養物の10%またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ;
(b)前記小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ;
(c)前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ;
(d)前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ;
(e)新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ;および
(f)前記大スケール灌流培養物の所望の特性および/または特徴を提供する培養条件および/または細胞クローンについてスクリーニングされたものを選択するステップ
を含み、個々の前記小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき前記培養条件および/または前記細胞クローンが異なる、方法。 - スクリーニングするべき前記培養条件が、培養培地、温度、pH値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記培養条件および/または細胞クローンが、高い細胞生存率、高いおよび/または安定な細胞密度、前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の高いおよび/または安定した収率、ならびに前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の所望の特性を提供する前記スクリーニングにおいて選択される、請求項3または4に記載の方法。
- 前記大スケール灌流培養物が少なくとも1lの容量を有し、および/または前記小スケール細胞培養物が50mlもしくはそれ未満の容量を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)における撹拌を停止した後、ステップ(d)で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が少なくとも35分間起きる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)における撹拌を停止した後、ステップ(d)で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が30分またはそれ未満の間起き、ステップ(d)で、前記細胞培養物中の前記細胞の一部もまた、細胞ブリーディングをもたらすために除去される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)で前記培養培地の15%〜50%が除去され;ならびに/または前記培養培地がステップ(d)で前記細胞培養物の上部から除去される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)で添加される新鮮な培養培地の量は、ステップ(d)で除去される培養培地の量と、本質的に同一である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養培地中の前記pH値および/または前記酸素濃度が前記細胞の培養中に制御され、ステップ(c)における前記細胞培養物の撹拌を停止する前に、前記pH値および/または前記酸素濃度の制御が少なくとも5分間停止される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)〜(e)が1回または複数回、繰り返され、ステップ(e)の後、次のサイクルのステップ(c)で撹拌が停止する前に、少なくとも1時間、撹拌下で前記細胞が培養される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 培養するべき前記細胞が、懸濁状態で成長する真核細胞、好ましくは骨髄性白血病起源の不死化ヒト細胞のような不死化ヒト血液細胞、またはCHO細胞である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、目的の生体分子、好ましくは糖タンパク質を組換えにより産生する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
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