KR20170142120A - 프로토포르피리노겐 옥시다아제 또는 이의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

프로토포르피리노겐 옥시다아제 또는 이의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase) 또는 이의 아미노산 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류(algae)의 제초제에 대한 보다 강화된 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 보다 증진시키는 기술이 제공된다.

Description

프로토포르피리노겐 옥시다아제 또는 이의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법{Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using Protoporphyrinogen Oxidase or Variant Thereof}
원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (Protoporphyrinogen oxidase) 또는 이의 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류 (Algae)의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 기술이 제공된다.
포르피린 합성 경로는 식물의 대사 과정에서 중요한 엽록소와 헴 (Heme)을 합성하는 과정으로 엽록체에서 이루어진다. 이 경로에서, 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase, 이하 PPO; EC:1.3.3.4)는 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)로부터 프로토포르피린 IX (Protoporphyrin IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chelatase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성 되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴 (Heme)이 합성된다.
따라서, PPO의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되면, 광과 산소 분자의 존재 하에서 활성이 높은 단일항산소 (singlet oxygen, 1O2)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여, PPO 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며, 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 9개 계통의 제초제가 사용되고 있다.
또한, 상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 작물의 생장에는 영향을 미치지 않게 하기 위해서는 재배 대상 작물에 상기 제초제들에 대한 내성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다.
한편, 조류 (Algae)는 광합성 생물로서, 빛에너지를 다양한 유용 화합물을 합성할 수 있는 에너지로 전환할 수 있다. 예를 들어, 조류는 광합성에 의하여 탄소를 고정시키며, 이산화탄소를 당, 전분, 지질, 지방 또는 다른 생체분자들로 전환함으로써, 대기 중의 온실가스를 제거할 수 있다. 또한, 조류의 대규모 배양을 통하여 산업적 효소, 치료 화합물 및 단백질, 영양 물질, 상업적 물질, 연료 물질과 같은 다양한 물질들을 생산할 수 있다.
그러나, 생물반응기 (bioreactor) 또는 공개된 또는 폐쇄된 연못에서 조류를 대규모로 배양하는 경우, 원하지 않는 경쟁 생물들, 예를 들어 원치 않는 조류, 곰팡이, 윤충류 (rotifer) 또는 동물성 플랑크톤들에 의하여 오염이 발생할 수 있다.
따라서, 원하는 식물 및/또는 조류에 제초제 내성을 부여한 후, 제초제 내성이 없는 경쟁 생물들의 성장을 저해할 수 있는 농도로 제초제를 처리하여, 원하는 식물 및/또는 조류를 대규모로 수확할 수 있는 기술이 필요하다.
미국특허출원 등록공보 US 6,308,458 (2001.10.30) 미국특허출원 등록공보 US 6,808,904 (2004.10.26) 미국특허출원 등록공보 US 7,563,950 (2009.07.21) 국제특허출원 공개공보 WO2011/085221 (2011.07.14)
Li X, Volrath SL, Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747, 2003
본 명세서에서, 원핵생물로부터 hemY 타입의 PPO 유전자를 분리하여 이 유전자 및 이의 아미노산 변이체가 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (PPO) 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타냄이 입증되어, 이를 식물 및/또는 조류 (Algae)에 발현시키면 제초제 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 증진시킬 수 있음이 제안된다.
일 예는 서열번호 2의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 2의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 2의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 2의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, 및 I408로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 서열번호 4의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 4의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 4의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 4의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 서열번호 4의 아미노산 서열 중 R101, F171, V175, A177, G194, P316, V318, F337, L340, I353, 및 F373으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다 .
다른 예는 상기 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는
서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 2의 폴리펩타이드의 변이체, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드의 변이체, 및 이들과 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 및 이들과 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다. 일 예에서 상기 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제일 수 있다.
구체 예로, 상기 제초제는 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타 제초제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone), 티아페나실 (tiafenacil), 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로인트로펜 (chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜 (halosafen), 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트 (fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl), 플루티아셋 (fluthiacet), 티디아지민 (thidiazimin), 옥사디아길 (oxadiargyl), 옥사디아존 (oxadiazon), 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone), 아자페니딘 (azafenidin), 펜톡사존 (pentoxazone), 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸 (profluazol), 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 1992, 40(10) 1993-2000" 참조)), 이들의 농약적으로 허용가능한 염들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식물은 광합성을 하는 다세포 진핵 생물을 의미하는 것으로, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이거나, 초본 식물 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 조류 (Algae)는 광합성을 하는 단세포 생물을 의미하는 것으로, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다.
일 예에서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작되며 상기 제2의 제초제에 대한 더 넓은 범위의 제초제 내성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다. 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 식물 또는 조류는 상기한 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물에 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함시킨 것을 사용하여 제조된 것일 수 있다. 따라서, 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것일 수 있다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산 합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제 및 세포막 저해성 제초제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨 (isoxaflutole), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제 또는 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate Synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 Athahasl (acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자 및 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제 내성 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 형질전환체, 이의 클론, 또는 자손을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 형질 전환은 조류, 및/또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)에 대하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
구체 예로, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하여 수행되는 것일 수 있다.
다른 예로, 상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 것이고, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 원하지 않는 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
식물 또는 조류에 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진하는 기술이 제공된다.
본 명세서에서, '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진' 또는 '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 증진' 이란 제초제에 내성이 없는 식물 또는 조류에 대하여 내성을 부여하는 것, 또는 제초제에 내성을 지닌 식물 또는 조류에 대하여 그 내성을 보다 향상시키는 것, 또는 이 모두를 포괄하는 광범위한 의미로 해석된다.
본 명세서에서, '서열로 이루어진' 또는 '서열을 포함하는' 이라 함은 기재된 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하는 경우를 모두 의미하기 위하여 사용되며, 기재된 서열 이외의 서열을 포함하는 것을 배제하고자 하는 의도로 해석되지 않는다.
일 예에서, 서열번호 2의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 2의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 2의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체; 및 서열번호 4의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 4의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 4의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩타이드 변이체가 제공된다.
다른 예에서, 서열번호 2 또는 4의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드 변이체, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입 될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예에서,
서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 2와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 서열번호 2의 폴리펩타이드의 변이체, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 서열번호 4와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 및 서열번호 4의 폴리펩타이드의 변이체;
상기 서열번호 2의 폴리펩타이드 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제에 대한 내성을 가진 형질전환체가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 식물전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법이 제공된다.
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 서열번호 2 및 4의 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 이의 변이체는 원핵생물 (예컨대, 남세균)로부터 유래하는 PPO 단백질로서, PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질이다. 구체적으로, 써모시네코코커스 에롱가투스 (Thermosynechococcus elongatus) BP-1 에서 유래한 PPO 단백질이 제공되며, 이를 CyPPO10으로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 2로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 1로 각각 나타낸다. 또한, 시네코코커스속 (Synechococcus sp.) JA-3-3Ab 균주에서 유래한 PPO가 제공되며, 이를 CyPPO13으로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 4로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 3으로 각각 나타낸다.
본 명세서에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 변이체는 각각 PPO 계열 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체로도 표현될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바로서, "제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체"는 상기한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체, 제초제 내성 PPO 단백질 암호화 유전자 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체 암호화 유전자, 또는 이들 모두를 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
남세균 유래 PPO 단백질은 그 자체로 식물 PPO 보다 효소 활성이 우수한 특성을 가지며 PPO 활성 저해 제초제에 대하여 내성을 부여할 수 있을 뿐 아니라, 이들 PPO 단백질은 고유의 효소 활성을 전체적으로 유지시키는 범위 내에서 아미노산 변이를 포함함으로써 야생형 PPO 단백질보다 제초제 내성을 강화시킬 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 PPO 단백질과 제초제 간 상호작용 부위의 아미노산 잔기 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함하는 것일 수 있다.
상기 PPO 단백질의 변이체를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
일 예는 서열번호 2의 폴리펩타이드 (CyPPO10)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 2의 아미노산들 (서열번호 2의 폴리펩타이드 (CyPPO10)의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 2의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 2의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)는 서열번호 2의 아미노산 서열 중의 N59 ("59번째 위치의 N(Asn)"을 의미; 이하의 아미노산 잔기의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, 및 I408로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중의 N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, 및 I408로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이, 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), R(Arg), W(Trp), 및 G(Gly) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, F360M (360번째 위치의 아미노산 잔기가 F(Phe)에서 M(Met)으로 치환됨을 의미함; 이하의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), F360V, F360I, F360T, F360L, F360C, A167C, A167L, A167I, P303L, V305L, V305M, V305T, N59T, S60T, R89A, R89L, R89V, F161A, V165S, V165C, Q184G, F324V, L327T, I340T, I408R, 및 I408W로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, F360M, F360V, F360I, F360T, F360L, F360C, A167C, A167L, A167I, P303L, N59T, S60T, R89A, R89L, R89V, F161A, V165S, V165C, Q184G, V305L, V305M, V305T, F324V, L327T, I340T, I408R, I408W, P303L+V305L (303번째 잔기의 P에서 L로의 치환 및 305번째 잔기의 V에서 L으로의 치환을 모두 포함; 이하의 2가지 이상의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), N59T+F360V, S60T+V165S+F360M, S60T+V165S+F360I, S60T+I340T+F360I, R89A+F360M, R89A+F360I, R89A+F360L, R89L+F360I, R89V+F360I, R89A+A167L+F360M, R89A+V305T+F360M, V165S+F360M, V165S+F360I, V165S+F360L, V165S+F360V, V165C+F360M, V165C+A167C+F360M, V165C+A167I+F360M, V165C+A167L+F360M, A167L+F360M, A167L+F360I, A167C+F360M, A167C+F360I, A167I+F360M, V305M+F360M, V305T+F360I, V305L+F360M, I408R+F360M, 또는 I408W+F360M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 서열번호 4의 폴리펩타이드 (CyPPO13)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 4의 아미노산들 (서열번호 4의 폴리펩타이드 (CyPPO13)의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 4의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 4의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)은 서열번호 4의 아미노산 서열 중의 R101, F171, V175, A177, G194, P316, V318, F337, L340, I353, 및 F373으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열 중의 R101, F171, V175, A177, G194, P316, V318, F337, L340, I353, 및 F373로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), E(Glu), Q(Gln), K(Lys), R(Arg), H(His), N(Asn) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서, F373M, F373V, F373I, F373T, F373L, F373C, F373N, F373H, A177C, A177L, A177I, P316A, P316L, V318L, V318M, R101A, F171A, V175C, V175L, G194E, G194Q, G194M, G194K, G194R, F337V, L340T, 및 I353T로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서, F373M, F373V, F373I, F373T, F373L, F373C, F373N, F373H, A177C, A177L, A177I, P316A, P316L, V318L, V318M, R101A, F171A, V175C, V175L, G194E, G194Q, G194M, G194K, G194R, F337V, L340T, I353T, P316L+V318L, P316A+V318L, R101A+F373M, A177C+F373M, A177I+F373M, A177L+F373M, A177L+F373I, A177L+F373L, A177L+F373T, A177L+F373V, A177C+F373T, A177C+F373V, V175L+F373M, G194E+F373M, G194Q+F373M, G194M+F373M, G194K+F373M, G194R+F373M, 또는 V318M+F373M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 서열 상동성 (예컨대, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 변이체는 서열 상동성 판단의 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (예컨대, 앞서 설명한 아미노산 서열 또는 아미노산 변이를 갖는 PPO 단백질)과 동등 정도의 효소 활성, 예컨대, 식물 내 (식물체 내, 식물 세포 또는 세포 배양체 내, 식물 조직 내 등), 조류 내, 및/또는 시험관내에서 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유하는 것일 수 있으며, 상기와 같은 서열 상동성 기재는 본 명세서에 기재된 제초제 내성 PPO 단백질 또는 변이체가 상기 조건 (효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유)을 만족하는 범위의 모든 서열 변이를 포함할 수 있음을 명확하게 하기 위하여 사용된다.
본 명세서에서 사용된 아미노산의 명명을 아래의 표에 정리하였다:
Figure pat00001
상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 효소 활성은 유지하면서, 야생형과 비교하여 증진된 제초제 내성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 폴리펩타이드 (제초제 내성 PPO 단백질) 및 폴리펩타이드 변이체 (제초제 내성 PPO 단백질 변이체)는 앞서 설명한 바와 같은 서열번호 2 또는 서열번호 4, 또는 앞서 설명한 바와 같은 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추가적 변이는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환일 수 있고, 이러한 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 일 예에서, 상기 추가적 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 또는 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산이 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아실화 (acylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수식 (modification) 될 수도 있다. 또한, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 아미노산 변이 및/또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "서열 상동성"이란 야생형 (wild type) 또는 기준이 되는 아미노산 서열 또는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 제초제 내성 PPO 단백질 변이체의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이의 변이체와 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 온라인 분석 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, GAP, BESTFIT, BLAST, 및 Clustal Omega 등을 포함한다.
상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체는 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는, 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들 중 2가지 이상을 조합하여 이용할 수 있다.
상기 제초제 내성 PPO 핵산 분자 (PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드)는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
구체적인 실시예에서, 상기 제공된 PPO 단백질/핵산분자 또는 이들의 변이체들은 PPO가 결핍된 대장균 BT3(ΔPPO)를 이용한 제초제 내성 검증 시스템을 통하여, 화학 구조에 따라 9개 계통에 속하는 대표적인 PPO 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타낸다는 것이 검증되었으며, 트랜지트 펩타이드 (transit peptide, TP)를 사용하면 식물의 엽록체에서 발현될 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 PPO 단백질/핵산분자는 식물 발현용 벡터에 의하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0)와 같은 쌍자엽 식물 또는 벼와 같은 단자엽 식물에서 발현이 가능하며, 이와 같이 형질전환된 식물체에 PPO 활성 저해 제초제를 처리하더라도 식물이 발아 및/또는 생장 가능한 것이 확인되었다. 아울러, 후대 유전성 시험을 통하여 위와 같은 제초제 내성 형질이 다음 세대로 성공적으로 전달되는 것이 확인되었다.
따라서, 본 명세서에서 제공하는 PPO 단백질 또는 이들의 변이체들을 식물 또는 조류에 도입함으로써 식물 또는 조류의 제초제 내성을 부여 및/또는 증진시키는 데 사용될 수 있다.
일 예는
(1) 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 이들과 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
(2) 앞서 설명한 폴리펩타이드 변이체,
(3) 상기 폴리펩타이드 (1) 또는 폴리펩타이드 변이체 (2)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
(4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
(5) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 제초제란, 식물 또는 조류를 사멸시키거나 방제하거나, 또는 식물 또는 조류의 생장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 말한다. 또한, 본원에서 제초제 내성이란, 정상 또는 야생형 식물 또는 조류를 정상적으로 사멸시키거나 그의 생장을 정상적으로 억제시키는 제초제를 처리하더라도, 정상 또는 야생형의 식물 또는 조류에 비하여 식물 또는 조류 생장의 저해 정도가 약화되거나 제거되어, 식물 또는 조류의 생장이 지속적으로 이루어지는 것을 말한다. 상기 제초제는 식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (PPO) 를 억제하는 제초제를 포함한다. 이러한 PPO 저해 제초제는 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 제초제를 예시할 수 있다.
구체예로, 피리미딘디온계 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone) 및 티아페나실 (tiafenacil)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
디페닐에테르계 제초제는 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로인트로펜 (chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl) 및 할로사펜 (halosafen) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐피라졸계 제초제는 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트 (fluazolate)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐프탈이미드계 제초제는 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐에스테르계 (phenylesters) 제초제는 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate) 및 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 1992, 40(10) 1993-2000 " 참조)) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 페노필레이트의 카바메이트 유사체는 피롤리딘-1카르복실산 페닐 에스테르 (pyrrolidine-1-carboxylic acid phenyl ester; CAS No. 55379-71-0), 1-피롤리딘카르복실산, 2-클로로페닐 에스테르 (1-Pyrrolidinecarboxylicacid, 2-chlorophenyl ester; CAS No. 143121-06-6), 4-클로로페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chlorophenyl pyrrolidine-1-carboxylate: CAS No. 1759-02-0), 카르밤산, 디에틸-, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (carbamic acid, diethyl-, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester (9CI); CAS No. 143121-07-7), 1-피롤리딘카르복시산, 2,4-디클로로-5-하이드로페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 2,4-dichloro-5-hydroxyphenyl ester; CAS No. 143121-08-8), 2,4-디클로로-5-(메톡시카르보닐)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(methoxycarbonyl)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-94-9), 2,4-디클로로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-96-1), 1-피페리딘카르복실산, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (1-Piperidinecarboxylic acid, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester; CAS No. 87374-78-5), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 87365-63-7), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 4,4-디플루오로피페리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl 4,4-difluoropiperidine-1-carboxylate; CAS No. 138926-22-4), 1-피롤리딘카르복실산, 3,3-디클루오로-, 2,4-디클로로-5-(2-프로핀-1-일옥시)페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 3,3-difluoro-, 2,4-dichloro-5-(2-propyn-1-yloxy)phenyl ester; CAS No. 143121-10-2), 4-클로로-2-플루오로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chloro-2-fluoro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-98-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
티아디아졸계 제초제는 플루티아셋 (fluthiacet) 및 티디아지민(Thidiazimin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사디아졸계 제초제는 옥사디아길 (oxadiargyl) 및 옥사디아존(Oxadiazon)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아졸리논계 제초제는 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone) 및 아자페니딘 (azafenidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사졸리딘디온계 제초제는 펜톡사존 (pentoxazone)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타의 제초제는 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸 (profluazol)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공하는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 식물체 또는 조류 내에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 식물 또는 조류 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다.
식물체 형질전환의 경우, 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체 내 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유니트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB (blue copper binding protein) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end), 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터 (octopine synthase terminator), 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 및 파세올린 (phaseoline) 터미네이터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 조류 형질전환의 경우, 프로모터로서 엽록체 특이적 프로모터, 핵 프로모터, 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 5'UTR 또는 3'UTR 에 작동적으로 연결되어 조류의 핵 안에서 기능을 발휘하도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 조류 형질전환에 적합한 전사 조절 서열을 더욱 포함할 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 재조합 유전자는 숙주 조류에서 핵의 게놈 또는 엽록체의 게놈에 통합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체를 엽록체에 발현시키기 위하여, 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드를 PPO 유전자 또는 이의 변이체의 5'-위치에 연결시킬 수 있다.
또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자로서 선택 표지를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지의 예로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 앰피실린, 클로람페니콜 등) 또는 제초제 (글리포세이트, 글루포시네이트, 포스피노트리신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti (tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB (left border)와 RB (right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.
상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며 (Agrobacterium - mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법 (electroporation), 입자 총법 (particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본 명세서에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물세포 (현탁배양 세포 포함), 원형질체 (protoplast), 캘러스 (callus), 배축 (hypocotyl), 종자 (seed), 자엽 (cotyledon), 신초 (shoot) 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
또한, 본 명세서의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손 (T1 세대, T2 세대, T3 세대, T4 세대, T5 세대, 또는 그 이상)을 포함하며, 예를 들어, PPO 유전자 또는 이의 변이체가 형질전환된 식물의 무성 또는 유성 자손으로서 제초제 내성 형질이 유전된 식물들도 본 발명의 형질전환 식물의 범주에 포함된다. 또한, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께, 초기 형질전환된 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 식물, 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 괴경, 및/또는 괴근과 같은 식물의 일부도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 모두 포함하여 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 초본 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae), 난초과 (Orchidaceae)의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과 (돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과 (Clethraceae), 노루발과 (Pyrolaceae), 진달래과 (Ericaceae), 자금우과 (Myrsinaceae), 앵초과 (Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과 (Ebenaceae), 때죽나무과 (Styracaceae), 노린재나무과 (Symplocaceae), 회목과 (Symplocaceae), 물푸레나무과 (목서과, Oleaceae), 마전과 (Loganiaceae), 용담과 (Gentianaceae), 조름나물과 (Menyanthaceae), 협죽도과 (마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과 (Asclepiadaceae), 꼭두서니과 (Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과 (Convolvulaceae), 지치과 (Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 가지과 (Solanaceae), 현삼과 (Scrophulariaceae), 능소화과 (Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과 (Acanthaceae), 참깨과 (Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과 (Gesneriaceae), 통발과 (Lentibulariaceae), 파리풀과 (Phrymaceae), 질경이과 (Plantaginaceae), 인동과 (Caprifoliaceae), 연복초과 (Adoxaceae), 마타리과 (Valerianaceae), 산토끼꽃과 (Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과 (Compositae), 소귀나무과 (Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과 (Salicaceae), 자작나무과 (Betulaceae), 너도밤나무과 (참나무과, Fagaceae), 느릅나무과 (Ulmaceae), 뽕나무과 (Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과 (Santalaceae), 겨우살이과 (Loranthaceae), 마디풀과 (여뀌과, Polygonaceae), 자리공과 (상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과 (Nyctaginaceae), 석류풀과 (Aizoaceae), 쇠비름과 (Portulacaceae), 석죽과 (Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과 (Amaranthaceae), 선인장과 (Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과 (Illiciaceae), 녹나무과 (Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과 (Ranunculaceae), 매자나무과 (Berberidaceae), 으름덩굴과 (Lardizabalaceae), 새모래덩굴과 (방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과 (Ceratophyllaceae), 어항마름과 (Cabombaceae), 삼백초과 (Saururaceae), 후추과 (Piperaceae), 홀아비꽃대과 (Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae), 다래나무과 (Actinidiaceae), 차나무과 (동백나무과, Theaceae), 물레나물과 (Guttiferae), 끈끈이주걱과 (Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과 (Capparidaceae), 십자화과 (겨자과, Cruciferae), 플라타너스과 (버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과 (금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과 (돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과 (Saxifragaceae), 두충과 (Eucommiaceae), 돈나무과 (Pittosporaceae), 장미과 (Rosaceae), 콩과 (Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과 (Geraniaceae), 한련과 (Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마과 (Linaceae), 대극과 (Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향과 (Rutaceae), 소태나무과 (Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과 (Polygalaceae), 옻나무과 (Anacardiaceae), 단풍나무과 (단풍과, Aceraceae), 무환자나무과 (Sapindaceae), 칠엽수과 (Hippocastanaceae), 나도 밤나무과 (Sabiaceae), 봉선화과 (물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과 (Aquifoliaceae), 노박덩굴과 (화살나무과, Celastraceae), 고추나무과 (Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과 (Empetraceae), 갈매나무과 (Rhamnaceae), 포도과 (Vitaceae), 담팔수과 (Elaeocarpaceae), 피나무과 (Tiliaceae), 아욱과 (Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과 (서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과 (Flacourtiaceae), 제비꽃과 (Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과 (Tamaricaceae), 물별과 (Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과 (Cucurbitaceae), 부처꽃과 (배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과 (Punicaceae), 바늘꽃과 (Onagraceae), 개미탑과 (Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과 (산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과 (오갈피나무과, Araliaceae), 산형과 (미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체예로, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 마초, 목초, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 잔디 및 피마자를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 소나무, 팜오일 및 유칼립투스를 포함하는 목본류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체 예로, 상기 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물; 및 벼, 밀, 보리, 옥수수, 수수 등의 단자엽 식물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명이 적용될 수 있는 조류는 특별히 제한되지 않으며, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다. 예를 들어, 조류는 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 갈조류, 대형조류 (macroalgae) 또는 미세조류 (microalgae)일 수 있다.
시아노박테리아류로는, Chroococcales 문 (예, Aphanocapsa, Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria 문, Nostocales 문 (예, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales 문 (예, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales 문 (예, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales 문, 또는 Stigonematales 문 (예, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis) 등을 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella, 또는 Hematococcm 를 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp., Nannochloris spp. 등을 예시할 수 있다. 그러나, 상기 열거한 종류들에 제한 되는 것은 아니며, 그 외 다양한 속 및 종에 속하는 조류들이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 2 종 이상의 PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 기술은 2 종 이상의 PPO 저해 제초제를 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자는, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자와 조합하여 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 작용기전이 상이한 2 종 이상의 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 작용기전이 PPO 저해 제초제를 포함한 상이한 2 종 이상의 제초제를 순서에 상관없이 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 및/또는 원치 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이하, PPO 저해 제초제와 작용기전이 상이한 제초제를 "제2의 제초제"라고 지칭한다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법을 제공한다.
예컨대, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제, 세포막 저해성 제초제 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제 (예를 들어, 이미다졸리디논, 설포닐우레아, 트리아졸피리미딘, 설포아닐라이드, 피리미딘 티오벤조에이트 등), 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제, 색소체 저해성 제초제, 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate Dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate Synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 Athahasl (acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자; 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질의 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 식물 또는 조류에 적용함으로써 보다 우수한 제초제 내성 형질을 부여 및/또는 증진시키고, 제초제를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거할 수 있다.
도 1은 pACBB 벡터의 개열지도이다.
도 2는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 pACBB-eGFP 벡터만 도입된 대장균) (V), PPO 감수성 애기장대 PPO1 유전자가 도입된 BT3 대장균 (AtPPO1 WT), PPO 저항성 애기장대 PPO1 변이 유전자가 도입된 BT3 대장균 (AtPPO1 SLYM), CyPPO10 유전자가 도입된 BT3 대장균 (Cy10 WT), 및 CyPPO13 유전자가 도입된 BT3 대장균 (Cy13 WT)에 tiafenacil을 0 μM (micromole), 100 μM 및 400 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 3은 pET303-CT-His벡터의 개열지도이다.
도 4는 MBP (maltose binding protein)과 PPO 단백질이 융합된 단백질 제조를 위한 재조합 벡터를 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 5는 pMAL-c2X 벡터의 개열지도이다.
도 6은 CyPPO 유전자의 식물 형질전환을 위한 이원 벡터의 구조를 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 7은 CyPPO10 변이체 (F360I 변이체 또는 F360M 변이체) 또는 CyPPO13 변이체 (F373M 변이체) 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체(T2)에서의 CyPPO 변이 단백질의 발현 정도를 보여주는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8은 CyPPO10 및 CyPPO13 야생형 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)에 tiafenacil을 1 μM 농도로 처리한 경우의 애기장대의 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 9는 CyPPO10 변이체 (F360C, F360I, F360L, F360M, F360V, F360T, A167C, A167L, A167L+F360M, 또는 A167C+F360I)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 tiafenacil을 1 μM, 5 μM 또는 25 μM 농도로 처리한 경우의 애기장대의 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 10은 CyPPO13 변이체 (A177C, F373C, F373I, F373M, A177L+F373L, A177L+F373I)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 tiafenacil을 1 μM 또는 10 μM 농도로 처리한 경우의 애기장대의 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 11은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO10 wild type 유전자 (Cy10 WT로 나타냄) 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, tiafenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 12는 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, saflufenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 13은 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, fomesafen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 14는 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, acifluorfen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 15는 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, flumioxazin을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 16은 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, sulfentrazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 17은 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pentoxazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 18은 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraflufen-ethyl을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 19는 BT3(ΔPPO)에 Cy10 WT 또는 다양한 CyPPO10 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraclonil 을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 20은 BT3(ΔPPO)에 CyPPO13 wild type 유전자 (Cy13 WT로 나타냄) 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, tiafenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 및 50 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 21은 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, saflufenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 및 50 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 22는 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, fomesafen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 23은 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, acifluorfen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 및 100 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 24는 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, flumioxazin을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 및 50 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 25는 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, sulfentrazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 26은 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pentoxazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 27은 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraflufen-ethyl을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 28은 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraclonil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 29는 BT3(ΔPPO)에 Cy13 WT 또는 다양한 CyPPO13 변이 유전자를 형질전환시킨 후, oxadiazon을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 30은 pET-29b 벡터의 개열지도이다.
도 31a 내지 31c은 CyPPO10 또는 CyPPO13의 야생형 또는 변이 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대를 제초제가 포함된 배지에 파종 7일 후 종자 발아 결과를 보여주는 사진이다.
도 32는 CyPPO10 변이체 (F360I, F360L, F360M, A167C+F360I, A167C+F360M, 또는 V305M+F360M)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)에 tiafenacil을 25 μM 농도 또는 saflufenacil을 100 μM 농도로 처리 후, 애기장대의 약해 정도를 보여주는 사진이다.
도 33a는 CyPPO10 변이체 (F360I, 또는 A167L+F360M)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)에 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone을 각각 50 μM 농도로 처리 후, 애기장대의 약해 정도를 보여주는 사진이다.
도 33b는 CyPPO13 변이체 (A177L+F373L, A177L+F373I)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)에 saflufenacil, tiafenacil, flumioxazin, sulfentrazone, oxyfluorfen 또는 pyraclonil 을 각각 50 μM 농도로 처리 후, 애기장대의 약해 정도를 보여주는 사진이다.
도 34는 CyPPO10의 F360I 삽입된 애기장대 형질전환체 (T4)의 tiafenacil 15 μM 또는 saflufenacil 150 μM 처리시의 약해 정도를 보여주는 사진이다.
도 35는 CyPPO10의 F360I 삽입된 애기장대 형질전환체 (T5)의 tiafenacil 15 μM 또는 saflufenacil 150 μM 처리시의 약해 정도를 보여주는 사진이다.
도 36은 CyPPO10의 F360I 삽입된 애기장대 형질전환체 (T4 및 T5)에서의 CyPPO10 F360I 변이 단백질 발현 여부를 보여주는 웨스턴 블랏 사진이다.
도 37은 pB2GW7.0 binary vector의 개열지도이다.
도 38은 CyPPO10 A167L+F360M 삽입된 콩 (Kwangan soybean) 형질전환체에 5 μM 또는 15 μM tiafenacil 처리시의 잎에서의 약해 정도를 보여주는 사진이다.
도 39는 CyPPO10 A167L+F360M 형질전환 콩에서 변이 유전자 존재 여부를 확인한 southern blotting 결과를 보여준다.
도 40은 CyPPO10 A167L+F360M 형질전환 콩 (Kwangan soybean)의 T1 식물체를 대상으로 25 μM tiafenacil 또는 150 μM saflufenacil 을 처리하고 5일 후 모습의 사진이다.
도 41은 CyPPO10의 돌연변이 유전자를 형질전환한 BT3(ΔPPO)를 제초제 함유 배지에서 배양 후, 생장을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 원핵생물로부터 PPO 유전자의 분리
써모시네코코커스 에롱가투스 BP-1 (Thermosynechococcus elongatus BP-1) 및 시네코코커스속 (Synechococcus sp.) JA-3-3Ab 의 Genbank database를 이용하여 PPO 유전자정보를 획득하였다. BT3 E. coli 에서 보다 효율적인 제초제 저항성 스크리닝을 위해 각 PPO 유전자를 코돈 최적화 (codon optimization)하여 합성하였다 (GenScript). 이를, pACBB 벡터에 클로닝하기 위해 표 1의 프라이머를 이용, 아래의 조건으로 PPO 유전자를 증폭하였다.
PCR 반응액은 Template (각 유전자의 합성 DNA) 1 ㎕, 10X buffer 5 ㎕, dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕, forward primer (표 1 참조; 10 μM) 1 ㎕, reverse primer (표 1 참조; 10 μM) 1 ㎕, DDW 40 ㎕, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5unit/㎕) 1 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕ 으로 구성하였고, 94 에서 4분간 반응한 후, 25 cycles (94 에서 30초, 56 에서 30초, 및 72 에서 1.5분) 반복하고, 72 에서 5분 반응하여 증폭하였다.
써모시네코코커스 에롱가투스 BP-1 에서 분리한 PPO를 CyPPO10으로, 시네코코커스속 JA-3-3Ab 균주에서 분리한 PPO를 CyPPO13으로 각각 명명하였다.
균주 프라이머 서열 서열번호
Thermosynechococcus elongatus CyPPO10_BamHI F CCCCGGATCCATGATTGAAGTGGATGTGGC 8
CyPPO10_XhoI R CCCCCTCGAG TGATTGTCCA CCAGCGAGGT 9
Synechococcus sp . JA-3-3Ab CyPPO13_BamHI F CCCCGGATCCATG AAC CCT GCT ACC CCT GA 10
CyPPO13_XhoI R CCCCCTCGAG CACCTGTGAT AACAACTGCT 11
실시예 2. CyPPO10및 CyPPO13의 제초제 저항성 확인
상기 준비된 CyPPO10 및 CyPPO13의 제초제 내성을 PPO 유전자가 결핍된 대장균을 이용하여 시험하였다.
상기 PPO 유전자를 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 형질전환한 후, PPO 저해 제초제가 포함된 배지에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. BT3(ΔPPO) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며, hemG type PPO가 결여된 대장균이며 카나마이신(kanamycin)에 내성을 가지는 균주이다 ("Watanabe et al., Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame inhibition codons, JBC 2001 276(23):20474-20481; Che et al., Molecular Characterization and Subcellular Localization of Protoporphyrinogen Oxidase in Spinach Chloroplasts, Plant Physiol.　2000 Sep;124(1):59-70"). 참조).
구체적인 시험 과정은 다음과 같다:
상기 준비된 CyPPO10 및 CyPPO13 유전자를 pACBB 벡터 (Plasmid #32551; Addgene; 도 1참조)에 클로닝하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 증폭한 PCR product를 BamHI, XhoI 제한효소로 처리하고, 동일 제한효소로 처리한 pACBB-eGFP 벡터와 ligation하였다.
상기 제한효소 처리는 다음의 조건 하에서 수행하였다:
PCR product 30 ㎕ (microliter), BamHI 및 XhoI (New England Biolabs) 각 0.5 ㎕, 10X buffer 4 ㎕, water 5.5 ㎕; Restriction enzyme reaction 37 , 1시간
Ligation reaction은 다음의 조건 하에서 수행하였다:
T4 DNA ligase (RBC) 0.5 ㎕, A buffer 1 ㎕, B buffer 1 ㎕, 상기의 제한효소로 처리한 PCR products와 vector, total 10 ㎕; 22 , 30분
상기 클로닝한 플라스미드를 각각 BT3 competent cell에 열충격 방법으로 형질전환하였다. 각 변이 유전자 종류별로 클로람페니콜 (Duchefa)이 포함된 LB (Luria-Bertani) agar 배지에서 배양하였다.
각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니 (single colony)를 클로람페니콜을 포함한 3 ml LB broth에서 12시간 이상 배양 (220 rpm, 37 )한 후, 50 내지 100 ㎕를 새로운 3 ml LB broth에 계대하여 4 내지 5시간동안 배양한 후, 흡광도 (OD600)가 0.5 내지 1 이 될 때까지 배양하고, 흡광도 (OD600)를 0.5에 맞추기 위해 LB broth로 희석하였다. 이 희석액을 LB broth 로 10배씩 5번 희석하였다. 다음으로, tiafenacil이 농도별 (0, 100 μM, 400 μM)로 혼합된 LB Agar 배지 (패트리디쉬)에 위에서 상기 준비한 형질전환 대장균 배양 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨렸다. LB agar 배지를 37 ℃, light 조건에서 배양하였고, 16 내지 20시간 후 생장 저해 정도를 확인하였다.
비교를 위하여, pACBB-eGFP 벡터 (Plasmid #32551; Addgene; 도 1참조)로 형질전환된 BT3 대장균 형질전환체 (V; PPO 결핍 대장균); 상기 원핵세포 유래의 PPO 유전자 대신 애기장대 유래의 야생형 PPO 유전자 (Wild type AtPPO1; PPO 감수성) (서열번호 6)가 도입된 BT3 대장균 형질전환체 (WT); 및 Wild type AtPPO1 의 아미노산 서열 (서열번호 5)에서 Y426M (426번째 아미노산인 타이로신이 메티오닌으로 치환) 및 S305L (305번째 아미노산인 세린이 류신으로 치환)의 아미노산 치환이 발생한 mutant (아미노산 서열: 서열번호 7) (Li et al. Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize. Plant physiol. 2003 133:736-747)를 암호화하는 유전자가 도입된 BT3 대장균 형질전환체 (AtPPO1 SLYM)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 제초제 미포함 배지 (tiafenacil 0 μM)에서, PPO 유전자가 삽입되지 않은 pACBB-eGFP로 형질전환된 BT3 형질전환체 (V)는 정상 생장을 회복하지 못하였으며, 애기장대 PPO 야생형 유전자 (AtPPO1 WT), 애기장대 PPO 변이 유전자 (AtPPO1 SLYM), CyPPO10 유전자 (Cy10 WT), 또는 CyPPO13 유전자(Cy13 WT)가 각각 삽입된 BT3 형질전환체는 각 삽입 유전자가 BT3 내 PPO 기능을 회복시켜줌으로써 정상 생장을 보였다. 이러한 결과는 상기 CyPPO10 및 CyPPO13가 모두 정상 기능을 발휘함을 의미한다.
한편, tiafenacil 감수성인 애기장대 PPO1 wild type이 삽입된 BT3 형질전환체 (AtPPO1 WT)는 제초제가 포함되지 않은 배지 (0 μM)에서는 정상적으로 자라지만 100 μM tiafenacil 이 포함된 배지에서는 자라지 않았으며, tiafenacil 저항성인 애기장대 PPO1 mutant type이 삽입된 BT3 형질전환체 (AtPPO1 SLYM)는 tiafenacil 처리 농도가 100 μM부터 생장저해가 발생하고, 400 μM까지 자라는 것이 관찰되었다. CyPPO10 또는 CyPPO13 유전자가 삽입된 BT3 형질전환체는 100 μM tiafenacil 이 포함된 배지에서 tiafenacil이 포함되지 않은 배지와 동등 수준의 생장을 보였으며, 400 μM tiafenacil 이 포함된 배지에서도 우수한 생장이 관찰되었다. 이러한 결과로부터 CyPPO10 및 CyPPO13 유전자가 tiafenacil 감수성인 애기장대 PPO1 wild type에 비해 현저하게 높은 tiafenacil 내성을 가지며, tiafenacil 내성을 갖는 애기장대 PPO1 mutant type과 비교하여 유사하거나 높은 수준의 tiafenacil 저항성을 가지고 있음을 확인할 수 있다.
실시예 3. PPO -제초제 복합체 구조 분석을 통한 제초제와 상호작용하는 PPO의 아미노산 정보 획득
PPO 단백질과 제초제의 결합 구조 정보 확인을 위하여, PPO 단백질의 대표 예로서CyPPO10을, PPO 저해 제초제의 대표 예로서 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, sulfentrazone을 사용하여 시험하였다. CyPPO10의 단백질을 암호화하는 유전자를 pET29b vector (Catalog Number: 69872-3; EMD Biosciences; 도 30 참조)에 클로닝하고, 대장균 시스템을 사용하여 CyPPO10 단백질을 발현시켰다. 발현된 CyPPO10 단백질을 니켈 친화 크로마토그래피를 통해 순수 분리하였고, 정제된 CyPPO10 단백질에 각 1 mM 농도의tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone을 첨가하여 CyPPO10 와 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 이 결합한 결정을 획득하였다. 이후 방사광가속기를 이용하여 2.4Å 해상도의 CyPPO10과 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, sulfentrazone 결합체의 X-ray 회절데이터를 확보하고, 분자수준의 삼차원 구조를 규명하였다. 이러한 과정을 통해 제초제 저항성을 부여하는 CyPPO10 단백질 내 아미노산 변이 위치에 대한 정보를 수집하였다.
CyPPO10 과 tiafenacil 복합체 구조 분석결과, CyPPO10 단백질 (서열번호 2)의 N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, 및 I408 위치의 아미노산이 tiafenacil과 상호작용하고 있음을 확인하였다.
이와 같이 CyPPO10-tiafenacil 복합체 구조로부터 도출된 결합 아미노산 정보를 이용하여, CyPPO10 (서열번호 2)와, CyPPO13의 아미노산 간의 서열 homology 분석 (NCBI BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)을 통해 CyPPO13 (서열번호 4) 단백질에서 tiafenacil과 상호작용하는 아미노산 잔기들을 도출하였다.
그 결과, CyPPO13 단백질 (서열번호 4)의 R101, F171, V175, A177, G194, P316, V318, F337, L340, I353, 및 F373 위치의 아미노산이 tiafenacil과 상호작용하는 것으로 판단하였다.
실시예 4. PPO 변이체의 제조
CyPPO10 및 CyPPO13의 PPO 저해 제초제 내성을 보다 높이기 위하여 각각 PPO 아미노산 서열 중 상기 실시예 3에서 얻어진 제초제와 상호작용하는 위치의 아미노산에 변이를 유발하여 CyPPO10 및 CyPPO13의 변이 유전자를 제작하였다.
구체적인 시험 과정은 다음과 같다:
표 3의 프라이머를 이용, 다음의 조건 하에서 PCR 을 수행하여 PPO 유전자를 분리 및 증폭시켰다:
PCR 반응액 조건
Template (CyPPO10 또는 CyPPO13의 합성 DNA) 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
forward primer (10 μM) 1 ㎕
reverse primer (10 μM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5unit/㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 4분
94 30초 25cycles
56 30초
72 1.5분
72 5분
4 5분
균주 프라이머 서열 서열번호
Thermosynechococcus elongatus BP-1 CyPPO10_XbaI F CCCCTCTAGAATGATTGAAGTGGATGTGGC 12
CyPPO10_XhoI R CCCCCTCGAG TGATTGTCCA CCAGCGAGGT 13
Synechococcus sp . JA-3-3Ab CyPPO13_XbaI F CCC TCTAGAATG AAC CCT GCT ACC CCT GA 14
CyPPO13_XhoI R CCCCCTCGAG CACCTGTGAT AACAACTGCT 15
상기 증폭한 유전자 products와 pET303-CT His vector (VT0163; Novagen; 도 3참조)를 XbaI, XhoI 으로 절단한 후, T4 DNA ligase(RBC, 3unit/㎕)를 이용하여 pET303-CyPPO10과 pET303-CyPPO13 plasmid를 각각 제작하였다.
상기 pET303-CT His vector에 클로닝한 CyPPO10과 CyPPO13을 template으로 하여, 아래 표5 및 표 6의 프라이머를 사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 CyPPO10과 CyPPO13의 변이 유전자를 제작하였다.
PCR 반응액 조건
Template 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
forward primer (10 μM) 1 ㎕
reverse primer (10 μM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5unit/㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 4분
94 30초 17~25cycles
56~60 30초
72 3분
72 5분
4 5분
CyPPO10 변이 유전자 제작용 프라이머 list
CyPPO10의 아미노산 변이 프라이머 서열 (5'-> 3')
F360M F: GTT TTT ACC TCT ATG ATA GGA GGT GCT ACT (서열번호 16)
R: AGC ACC TCC TAT CAT AGA GGT AAA AAC CTG (서열번호 17)
F360V F: GTT TTT ACC TCT GTT ATA GGA GGT GCT ACT (서열번호 18)
R: AGC ACC TCC TAT AAC AGA GGT AAA AAC CTG (서열번호 19)
F360I F: GTT TTT ACC TCT ATT ATA GGA GGT GCT ACT (서열번호 20)
R: AGC ACC TCC TAT AAT AGA GGT AAA AAC CTG (서열번호 21)
F360T F: GTT TTT ACC TCT ACT ATA GGA GGT GCT ACT (서열번호 22)
R: AGC TCC ACC AAT AGT AGA GGT AAA AAC CTG (서열번호 23)
F360L F: GTT TTT ACC TCT CTT ATA GGA GGT GCT ACT (서열번호 24)
R: AGC TCC ACC AAT AAG AGA GGT AAA AAC CTG (서열번호 25)
F360C F: GTT TTT ACC TCT TGT ATA GGA GGT GCT ACT (서열번호 26)
R: AGC TCC ACC AAT ACA AGA GGT AAA AAC CTG (서열번호 27)
A167C F: TCAGGAGTGTAC TGT GGAGATCCTCAACAG (서열번호 28)
R: TTGAGGATCTCC ACA GTACACTCCTGAAAC (서열번호 29)
A167L F: TCAGGAGTGTAC CTT GGAGATCCTCAACAG (서열번호 30)
R: TTGAGGATCTCC AAG GTACACTCCTGAAAC (서열번호 31)
P303L+V305L F: ATACCTTAT CTT ACT CTT GCT TGT GTT GTG (서열번호 32)
R: AACACAAGC AAG AGT AAG ATA AGG TAT (서열번호 33)
V305M F: CCTTATCCAACT ATG GCTTGTGTTGTGCTT (서열번호 34)
R: CACAACACAAGC CAT AGTTGGATAAGGTAT (서열번호 35)
N59T F: GAG CTT GGT CCA ACT AGT TTC GCT C (서열번호 36)
R: AGCGAAACT AGT TGGACCAAGCTCCCA (서열번호 37)
R89A F: CAC CTT CCA GCT TAT ATA TAC TGG AGG GGA (서열번호 38)
R: GTA TAT ATA AGC TGG AAG GTG CCT ATC TCC (서열번호 39)
V165S F: GTT TCA GGA TCA TAC GCT GGA GAT CCT CAA CAG (서열번호 40)
R: TCC AGC GTA TGA TCC TGA AAC AAA TGG TGC CAC (서열번호 41)
V305T F: CCTTATCCAACT ACT GCTTGTGTTGTGCTT (서열번호 42)
R: CACAACACAAGC AGT AGTTGGATAAGGTAT (서열번호 43)
S60T F: GGT CCA AAC ACT TTC GCT CCT ACT CCA GCA CTC (서열번호44)
R: AGG AGC GAA AGT GTT TGG ACC AAG CTC CCA CAC (서열번호 45)
I340T F: CTC GGA ACC ACC TGG TCT TCA TGC TTA TTC CCA (서열번호 46)
R: TGA AGA CCA GGT GGT TCC GAG TGT CCT TAT ACC (서열번호 47)
R89L F: CAC CTT CCA CTT TAT ATA TAC TGG AGG GGA (서열번호 48)
R: GTA TAT ATA AAG TGG AAG GTG CCT ATC TCC (서열번호 49)
R89V F: CAC CTT CCA GTT TAT ATA TAC TGG AGG GGA (서열번호 50)
R: GTA TAT ATA AAC TGG AAG GTG CCT ATC TCC (서열번호 51)
F161A F: AGATTGGTGGCACCAGCAGTTTCAGGAGTGTAC (서열번호 52)
R: GTACACTCCTGAAACTGCTGGTGCCACCAATCT (서열번호 53)
V165C F: CCATTTGTTTCAGGA TGCTACGCTGGAGATCCT (서열번호 54)
R: AGGATCTCCAGCGTAGCATCCTGAAACAAATGG (서열번호 55)
Q184G F: TTTAGAAGGATTGCTGGACTTGAGAAGTTGGGA (서열번호 56)
R: TCCCAACTTCTCAAGTCCAGCAATCCTTCTAAA (서열번호 57)
F324V F: TCAGTTAGACCTGGAGTTGGTGTTTTGGTGCCT (서열번호 58)
R: AGGCACCAAAACACCAACTCCAGGTCTAACTGA (서열번호 59)
L327T F: CCTGGATTTGGTGTTACCGTGCCTAGAGGACAA (서열번호 60)
R: TTGTCCTCTAGGCACGGTAACACCAAATCCAGG (서열번호 61)
A167I F: TCAGGAGTGTACATTGGAGATCCTCAACAG (서열번호 62)
R: TTGAGGATCTCCAATGTACACTCCTGAAAC (서열번호 63)
I408R F: AGAAGGGCTCGTCCACAATATATCGTTGGTTAC (서열번호 64)
R: TATTGTGGACGAGCCCTTCTCCAAACCTTC (서열번호 65)
I408W F: GGTTTGGAGAAGGGCTTGGCCACAATATATCGTTGG (서열번호 66)
R: CCAACGATATATTGTGGCCAAGCCCTTCTCCAAACC (서열번호 67)
CyPPO13 변이 유전자 제작용 프라이머 list
CyPPO13의 아미노산 변이 프라이머 서열 (5'-> 3')
F373M F: TCATTTCTCAGT ATG TTAGGAGGTGCTACA (서열번호 68)
R: AGCACCTCCTAA CAT ACTGAGAAATGAGTG (서열번호 69)
F373V F: TCATTTCTCAGT GTT TTAGGAGGTGCTACA (서열번호 70)
R: AGCACCTCCTAA AAC ACTGAGAAATGAGTG (서열번호 71)
F373I F: TCATTTCTCAGT ATT TTAGGAGGTGCTACA (서열번호 72)
R: AGCACCTCCTAA AAT ACTGAGAAATGAGTG (서열번호 73)
F373T F: TCATTTCTCAGT ACT TTAGGAGGTGCTACA (서열번호 74)
R: AGCACCTCCTAA AGT ACTGAGAAATGAGTG (서열번호 75)
F373L F: TCATTTCTCAGT CTT TTAGGAGGTGCTACA (서열번호 76)
R: AGCACCTCCTAA AAG ACTGAGAAATGAGTG (서열번호 77)
F373C F: TCATTTCTCAGT TGT TTAGGAGGTGCTACA (서열번호 78)
R: AGCACCTCCTAA ACA ACTGAGAAATGAGTG (서열번호 79)
R101A F: AAGTTGCCAGCATATATCTACTGGGAGGGTGC (서열번호 80)
R: AGTAGATATATGCTGGCAACTTTGCATCAGCC (서열번호 81)
A177C F: TCA GGA GTT TAT TGT GGA GAT CCT GAT CAA (서열번호82)
R: ATC AGG ATC TCC ACA ATA AAC TCC TGA TGT (서열번호 83)
A177L F: TCAGGAGTTTAT CTT GGAGATCCTGATCAA (서열번호 84)
R: ATCAGGATCTCC AAG ATAAACTCCTGATGT (서열번호 85)
A177I F: GGAGTTTATATTGGAGATCCTGATCAACTTAG (서열번호 86)
R: AGGATCTCCAATATAAACTCCTGATGTGAAAG (서열번호 87)
P316L+V318L F: ATA CTC TAT CTT CCT CTT GCT GTT GTG GCT (서열번호 88)
R: CAC AAC AGC AAG AGG AAG ATA GAG TAT TTC (서열번호 89)
V318L F: TATCCACCTCTTGCTGTTGTGGCTCTTGCATAC (서열번호 90)
R: CAACAGCAAGAGGTGGATAGAGTATTTCTGCC (서열번호 91)
V318M F: CTC TAT CCA CCT ATG GCT GTT GTG GCT CTT (서열번호 92)
R: AGC CAC AAC AGC CAT AGG TGG ATA GAG TAT (서열번호 93)
P316A+V318L F: ATA CTC TAT GCT CCT CTT GCT GTT GTG GCT (서열번호 94)
R: CAC AAC AGC AGC AGG AAG ATA GAG TAT TTC (서열번호 95)
F373N F: TTTCTCAGTAACTTAGGAGGTGCTACAGATGC (서열번호 96)
R: CCTCCTAAGTTACTGAGAAATGAGTGATAAC (서열번호 97)
F373H F: TTTCTCAGTCACTTAGGAGGTGCTACAGATGC　(서열번호 98)
R: CCTCCTAAGTGACTGAGAAATGAGTGATAAC (서열번호 99)
G194Q F: GCTTTTCCTAGGGTGGCTCAGCTCGAAGAGAGATACGG (서열번호 100)
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G194K F: GCTTTTCCTAGGGTGGCTAAACTCGAAGAGAGATACGG (서열번호 102)
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실시예 5. PPO 및 이의 변이체의 PPO 저해 제초제 내성 검증 (대장균에서 시험)
CyPPO10 및 CyPPO13의 PPO 저해 제초제 내성을 보다 높이기 위하여 각각 PPO 아미노산 서열 중 상기 실시예 3에서 얻어진 제초제와 상호작용하는 위치의 아미노산에 변이를 유발하였다. 이와 같은 변이를 유발시킬 수 있는 PPO 유전자를 설계하여 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(ΔPPO))에 형질전환한 후, PPO 저해 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다.
구체적인 시험 과정은 다음과 같다:
상기 실시예 4에서 제작한 pET303-CyPPO10과 pET303-CyPPO13 plasmid와 각각의 변이 유전자들이 포함된 plasmid를 BT3 competent cell에 열충격 방법으로 형질전환하여 앰피실린이 포함된 LB agar 배지에서 배양하였다.
각 유전자가 삽입된 BT3 형질전환체의 종배양을 위하여, 앰피실린이 포함된 LB broth (LPSS, 3 ml)에 단일 콜로니를 접종하여 12시간 이상 배양하고, 이 배양액 50~100 ㎕를 새로운 LB broth에 계대하여 흡광도 (OD600)가 0.5~1이 될 때까지 배양하고 이 배양액을 LB broth로 희석하여 흡광도를 0.5로 일정하게 맞춰준 후, LB broth로 10배씩 5번 희석하여 형질전환 대장균 배양 희석액을 준비하였다.
LB 25g/L, Bacto agar 12g/L, 앰피실린 (100 ㎍/ml), 및 다양한 제초제 stock을 농도별 (0~200 μM)로 혼합하여 제초제를 포함하는 배지를 준비하였다. 상기 제초제 stock은 모두 DMSO를 이용하여 제초제를 용해한 것이다.
상기 준비된 형질전환 대장균 배양 희석액을 제초제 배지에 10 ㎕씩 떨어뜨리고, 37 및 광조건 하에서 16~20시간 동안 배양하고, 각 유전자를 포함한 형질전환 대장균들의 생장 정도를 육안으로 확인하여, 형질전환 대장균의 PPO 저해 제초제 내성을 시험하였다.
시험에 사용된 제초제를 아래의 표 7에 정리하였다:
Family 제초제
Pyrimidinedione계 제초제 Tiafenacil
Saflufenacil
Diphenyl ether계 제초제 Fomesafen
Acifluorfen
N-phenylphthalimides계 제초제 Flumioxazin
Triazolinones계 제초제 Sulfentrazone
Oxazolidinediones계 제초제 Pentoxazone
Phenylpyrazoles계 제초제 Pyraflufen-ethyl
기타 Pyraclonil
상기 얻어진 제초제 내성을 CyPPO 야생형과 비교한 상대적 수준으로 평가하여 아래의 표 8 내지 표 11 및 도 11 내지 도 29에 나타내었다:
CyPPO10
변이		 Tiafenacil
(up to 200 μM)		 Saflufenacil
(up to 200 μM)		 Acifluorfen
(up to 200 μM)		 Fomesafen
(up to 200 μM)
CyPPO10
(야생형)		 - - - -
F360C ++++ ++++ ++++ ++++
F360I ++++ ++++ ++++ ++++
F360L ++++ ++++ ++++ ++++
F360M ++++ ++++ ++++ ++++
F360V ++++ ++++ ++++ ++++
A167C +++ + ++++ ++++
A167L ++++ +++ ++++ ++++
P303L+V305L NT NT ++ +
V305M ++ + +++ ++++
NT(Not tested)
CyPPO10
변이		 Pentoxazone
(up to 200 μM)		 Pyraflufen
-ethyl
(up to 200 μM)		 Pyraclonil
(up to 200 μM)		 Flumioxazin
(up to 200 μM)		 Sulfentrazone
(up to 200 μM)
CyPPO10
(야생형)		 - - - - -
F360C ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
F360I ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
F360L ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
F360M ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
F360V ++++ ++++ ++++ NT ++++
A167C ++++ ++++ ++++ + ++
A167L ++++ ++++ ++++ ++++ +++
P303L+V305L ++++ + +++ NT NT
V305M ++++ + +++ NT NT
NT(Not tested)
CyPPO13
변이		 Tiafenacil
(up to 50 μM)		 Saflufenacil
(up to 50 μM)		 Acifluorfen
(up to 200 μM)		 Fomesafen
(up to 200 μM)		 Pentoxazone
(up to 200 μM)
CyPPO13
(야생형)		 - - - - -
F373C +++++ +++ +++ +++ ++++
F373I +++++ +++++ +++ +++ +++++
F373L +++++ +++++ +++ ++++ +++++
F373M +++++ +++ +++ ++++ +++++
F373T +++++ ++++ ++++ ++++ ++++
A177C NT + ++++ ++++ ++++
A177L ++ + ++++ ++++ ++++
V318M NT NT +++ ++ +
P316A+V318L NT NT +++ - NT
P316L+V318L NT NT +++ ++ NT
NT(Not tested)
CyPPO13
변이		 Pyraflufen
-ethyl
(up to 200 μM)		 Pyraclonil
(up to 200 μM)		 Sulfentrazone
(up to 200 μM)		 Flumioxazin
(up to 50 μM)
CyPPO13 - - - -
F373C ++ +++++ - -
F373I ++ +++++ ++++ ++++
F373L ++ +++++ ++++ ++++
F373M ++ ++++++ ++++ +++
F373T ++++ ++++ + ++++
A177C +++++ ++++ ++++ -
A177L +++++ +++ ++++ ++++
V318M ++ - + NT
P316A+V318L + - - NT
P316L+V318L + - + NT
NT(Not tested)
상기 표 8 내지 11에서, 야생형의 제초제 내성 수준을 "-"으로 표시하고, 이와 동등 수준의 내성을 "-"로, 높을수록 "+"를 덧붙여 최대 "+++++"까지 등급을 정하여 평가하였다.
도 11 내지 도 19 (CyPPO10의 야생형 또는 변이형) 및 도 20 내지 도 29 (CyPPO13의 야생형 또는 변이형)은 CyPPO 유전자 (야생형 또는 변이형)가 형질도입된 대장균의 배양 결과를 보여주는 사진으로, 상단에 기재된 농도는 제초제 처리 농도이며, 각 농도별 6개의 컬럼은 대장균 배양액을 10배씩 희석한 결과를 나타낸 것으로, 가장 왼쪽 컬럼이 OD600=0.5인 대장균 배양액의 실험 결과이고, 오른쪽으로 갈수록 10배씩 희석된 배양액의 실험 결과이다.
상기 표 8 내지 11 및 도 11 내지 도 29에서 보여지는 바와 같이, CyPPO10 및 CyPPO13의 변이 유전자가 도입된 형질전환체는 모두 다양한 종류의 제초제에 대하여 야생형 유전자가 도입된 형질전환체와 동등 수준 또는 상승된 수준의 제초제 내성을 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 6: PPO의 효소 활성 및 제초제별 IC 50 값 측정
PPO 단백질 및 특정 위치의 아미노산을 변이시킨 PPO 단백질 변이체의 효소 활성을 측정하고 PPO저해 제초제에 의한 inhibition assay를 수행하였다. PPO 단백질은 수용성이 낮지만, MBP (maltose binding protein)와 함께 fusion protein (MBP-PPO)으로 발현시킬 경우 안정적으로 수용성 단백질이 발현되는 것을 확인하여, 하기의 야생형 및 변이형 단백질을 MBP와의 융합 단백질 형태로 발현시켜서 본 시험에 사용하였다 (도 4 참조).
CyPPO10 및 CyPPO13의 야생형 유전자 및 변이 유전자 (실시예 1 및 실시예 4 참조)를 발현시키기 위하여, 상기 유전자를 각각 pMAL-c2X 벡터 (도 5 참조)에 삽입한 후, BL21 (DE3) 대장균 (CodonPlus)에 형질전환하였다.
상기 얻어진 형질전환 대장균을 다음의 조건으로 배양하여 삽입된 PPO 유전자를 발현시켰다:
Induction: OD600=0.2, 최종농도 0.3 mM IPTG 첨가;
발현온도: 23 ℃, 200 rpm의 진탕 배양;
발현시간: 16 hrs
배양규모: 200 ml/1,000 ml flask.
상기 배양된 형질전환 대장균에 대하여 다음의 과정으로 세포 파쇄 및 단백질 추출을 수행하였다:
추출 버퍼: Column buffer (50 mM Tris-Cl, pH8.0, 200 mM NaCl) 5 ml buffer/g cell;
Sonication: SONICS&MATERIALS社 VCX130 (130 watts);
15 sec ON, 10 sec OFF for 5 min on ice;
4 ℃ 및 20분 조건 하에서 원심분리 (20,000 xg); 및
상기 원심분리로 얻어진 상층액을 column buffer를 사용하여 1:6 비율로 희석하였다.
상기 얻어진 단백질 추출물에 대하여 다음의 과정을 4 ℃ 저온실에서 수행하여 PPO 단백질의 정제를 수행하였다. 1.5x15 cm column (Bio-Rad Econo Columns 1.5 x 10 cm, glass chromatography column, max. vol)에 amylose resin (New England Biolabs)을 부어 컬럼을 packing하고, 상기 얻어진 단백질 추출물을 컬럼에 0.2 ml/min의 속도로 로딩하였다. 상기 컬럼을 컬럼 부피 기준으로 3부피배의 column buffer로 washing 후 washing액 내의 단백질 양을 확인하여 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 washing을 종료하였다. 상기 컬럼 부피 기준으로 약 2부피배의 20 mM maltose 를 포함하는 column buffer로 MBP-PPO 단백질을 elution (1.5 ml E-tube에 각 fraction을 분취)하면서 각 eluent의 단백질 농도를 확인하였다. 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 elution을 종료시켰다. 각 fraction을 10 ㎕의 양으로 취하여 단백질 정량 후 단백질이 검출된 fraction을 SDS-PAGE로 분석하고, 순도가 높은 fraction을 취하여 효소 활성 분석 시험에 사용하였다.
상기 정제된 CyPPO10 및 CyPPO13의 야생형 단백질 및 변이형 단백질의 효소 활성을 아래의 과정으로 측정하였다.
우선, PPO 단백질의 기질인 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)를 합성하였다. 이 과정은 질소기체가 streaming 되는 공간에서 수행되었다. 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX) 6 mg을 20% (v/v) EtOH 20 ml에 용해시키고, dark condition에서 30분간 교반하였다. 상기 얻어진 프로토포르피린 IX 용액을 15 ml screw tube에 800 ㎕의 양으로 넣고 5분간 질소 기체를 flushing하였다. 여기에 아말감나트륨 (sodium amalgam) 1g을 넣고 2분간 vigorous shaking하였다. Tube 안의 수소 기체를 배출하기 위해 뚜껑을 열어두었다. 그 후, 뚜껑을 닫고 3분간 인큐베이션한 후, Syringe와 cellulose membrane filter를 이용해 프로토포르피리노겐 IX 용액을 filtering하였다. 상기 얻어진 프로토포르피리노겐 IX 용액 600 ㎕에 2M MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 약 300 ㎕의 양으로 첨가하여 pH를 8.0으로 조절하였다. PPO 단백질의 효소 활성을 측정하기 위하여 다음의 조성으로 Reaction mixture를 준비하였다 (10 ml 기준): 50 mM Tris-Cl (pH 8.0); 50 mM NaCl; 0.04% (v/v) Tween 20; 40 mM glucose (0.072g); 5 units glucose oxidase (16.6 mg); 및 10 units catalase (1 ㎕).
상기 Reaction mixture 180 ㎕를 96 well plates에 넣고 앞서 정제된 PPO 단백질 (상기 MBP-fusion 단백질을 정제한 산물) 20 ㎕를 첨가하였으며, 약 50 ㎕의 mineral oil로 표면을 커버하였다. 기질인 프로토포르피리노겐 IX 용액을 최종농도 50 μM이 되도록 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. Microplate reader (Hidex社 sense)를 이용하여 프로토포르피린 IX (Protoporphyrin IX)의 형광을 측정하였다 (excitation: 405 nm; emission: 633 nm). PPO 효소 활성값을 계산하기 위해, 상기 프로토포르피리노겐 IX 용액이 들어있는 튜브를 공기 중에 개방하여 용액을 12 시간 이상 산화시켰다. 여기에 2.7N HCl를 첨가하고 408nm에서의 흡광도(absorbance)를 측정하였다. Standard 프로토포르피린 IX을 이용해 standard curve를 작성하고 이를 이용해 프로토포르피리노겐 IX의 농도를 calibration 하여 PPO 활성을 측정하였다.
상기 얻어진 PPO 야생형 및 변이체의 효소 활성을 아래의 표 12에 나타내었다.
한편, PPO 단백질 (CyPPO10 및 CyPPO13)의 효소활성능력을 평가하기 위해 각 효소의 최대반응속도 (Vmax, The maximal velocity) 값을 구하였다. 초기반응속도는 기질 농도를 달리하여 농도에 따라 반응속도가 비례하는 구간을 선정하였으며, 상온에서 20분간 time course로 효소 반응 산물인 프로토포르피린 IX의 생성량을 측정하였다. Vmax값은 미카엘리스-멘텐식에 의해 enzyme kinetics 분석프로그램으로 계산하였으며, 대조군으로 식물 PPO를 사용하였다. 상기 얻어진 결과를 아래의 표 12에 나타내었다.
구분 CyPPO10 CyPPO13 AtPPO1 아마란투스 PPO1
Vmax
(μM mg protein-1 min-1)		 949.1±64 341.4±14 134.4±19 57±7
상기 결과로부터 CyPPO10와 CyPPO13은 애기장대 PPO1 (AtPPO1), 아마란투스 PPO1 보다 Vmax 값이 최소 2.5배에서 최대 16배 이상 높은 것을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 CyPPO10와 CyPPO13의 PPO 단백질이 식물 유래의 애기장대 PPO1 또는 아마란투스 PPO1 보다 PPO 효소로써의 능력이 더 뛰어남을 보여준다.
또한, PPO 효소 활성을 50% 저해하는 농도 (IC50)를 각 제초제별로 측정하였다. 이 때, 각 제초제의 최종 농도는 아래와 같이 하였다:
- Tiafenacil, saflufenacil, fomesafen, butafenacil, flumioxazin, 및 sulfentrazone 각 제초제의 최종농도: 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000 nM
IC50값은 상기한 효소 활성 측정 과정에 제초제를 상기 농도로 첨가하여 PPO 효소 활성을 제초제 첨가 전의 50%로 저해하는 제초제의 농도로 구하였다.
이와 같이 얻어진 제초제 별 IC50을 아래의 표 13에 나타내었다.
CyPPO10 Mutation Activity (%) IC50(nM)
No. Tiafenacil Saflufenacil Fomesafen Butafenacil Flumioxazin Sulfentrazone
1 WT 100 21 9 15 8 NT NT
2 F360M 93 115 1,500 114 24 NT NT
3 F360I 67 799 3,916 191 268 3,323 NT
4 F360L 59 172 NT NT NT NT NT
5 F360V 56 307 NT NT NT NT NT
6 N59T + F360V 62 543 NT NT NT NT NT
7 R89A + F360M 67 931 5,000 5,000 674 1,216 5,000
8 R89A + F360I 38 2,153 5,000 5,000 1,323 5,000 5,000
9 R89A + F360L 30 1,000 NT NT NT 1,025 NT
10 V165S + F360M 78 435 NT NT NT 119 NT
11 V165S + F360I 63 818 NT NT NT NT NT
12 V165S + F360L 59 470 NT NT NT NT NT
13 V165S + F360V 52 929 NT NT NT NT NT
14 A167L + F360M 80 5,000 5,000 3,000 4,000 5,000 5,000
15 A167L + F360I 32 5,000 NT NT NT NT NT
16 A167C + F360M 90 4,500 5,000 1,900 2,500 4,000 5,000
17 A167C + F360I 48 4,500 NT NT NT NT NT
18 V305M + F360M 87 356 5,000 675 121 544 2,057
19 V305T + F360I 10 276 NT NT NT NT NT
20 R89A + V305T + F360M 5 741 NT NT NT NT NT
21 S60T + V165S + F360M 17 2,720 NT NT NT NT NT
22 S60T + V165S + F360I 12 3,580 NT NT NT NT NT
23 S60T + I340T + F360I 5 2,000 NT NT NT NT NT
24 R89V + F360I 57 242 NT NT NT NT NT
25 R89L + F360I 51 184 NT NT NT NT NT
26 A167I + F360M 85 5,000 5,000 5,000 5,000 5,000 5,000
27 V165C + F360M 93 2,169 NT NT NT NT NT
28 V305L + F360M 82 262 NT NT NT NT NT
29 V165C + A167C + F360M 91 5,000 5,000 3,034 2,810 5,000 5,000
30 V165C + A167I + F360M 75 5,000 5,000 3,741 5,000 5,000 5,000
31 V165C + A167L + F360M 83 5,000 5,000 4,277 4,820 5,000 5,000
32 R89A + A167L + F360M 7 5,000 NT NT NT NT NT
33 I408R + F360M 5 5,000 NT NT NT NT NT
34 I408W + F360M 5 5,000 NT NT NT NT NT
35 R89A 83 104 NT NT NT NT NT
36 F161A 92 203 NT NT NT NT NT
37 V165C 99 97 NT NT NT NT NT
38 A167C 98 86 NT NT NT NT NT
39 A167L 95 792 NT NT NT NT NT
40 Q184G 97 79 NT NT NT NT NT
41 V305M 100 186 NT NT NT NT NT
42 F324V 59 140 NT NT NT NT NT
43 L327T 84 214 NT NT NT NT NT
44 I340T 19 216 NT NT NT NT NT
45 F360T 85 5,000 NT NT NT NT NT
CyPPO13 　 　 　 　 　 　 　 　
1 WT 100 28 36 30 37 NT NT
2 F373M 98 56 481 77 18 NT NT
3 F373I 83 135 1,480 NT NT NT NT
4 F373L 82 141 1,470 NT NT NT NT
5 F373C 86 212 NT NT NT NT NT
6 F373V 83 339 NT NT NT NT NT
7 F373T 81 818 NT NT NT NT NT
8 F373H 26 114 NT NT NT NT NT
9 F373N 40 40 NT NT NT NT NT
10 R101A + F373M 55 615 5,000 NT NT 573 NT
11 A177C + F373M 77 336 4,500 NT NT NT NT
12 A177I + F373M 75 261 4,700 NT NT NT NT
13 A177L + F373M 75 1,122 5,000 690 2,500 5,000 5,000
14 A177L + F373I 66 1,630 5,000 315 5,000 5,000 5,000
15 A177L + F373L 68 5,000 5,000 464 5,000 5,000 5,000
16 V175L + F373M 93 203 1,375 NT NT NT NT
17 V318M + F373M 72 386 1,924 NT NT NT NT
18 A177L + F373T 62 4,700 5,000 3,000 4,000 5,000 5,000
19 A177L + F373V 49 5,000 5,000 1,229 5,000 5,000 5,000
20 A177C + F373T 80 3,900 NT NT NT NT NT
21 A177C + F373V 56 3,200 NT NT NT NT NT
22 G194E + F373M 32 64 261 NT NT 66 NT
23 G194Q + F373M 37 24 265 NT NT 5.2 NT
24 G194M + F373M 43 20 475 NT NT 53 NT
25 G194K + F373M 41 95 224 NT NT 128 NT
26 G194R + F373M 35 67 218 NT NT 81 NT
27 R101A 87 139 NT NT NT NT NT
28 F171A 70 70 NT NT NT NT NT
29 V175C 94 57 NT NT NT NT NT
30 A177C 98 113 NT NT NT NT NT
31 A177L 97 211 NT NT NT NT NT
32 V318M 81 211 NT NT NT NT NT
33 F337V 88 158 NT NT NT NT NT
34 L340T 83 443 NT NT NT NT NT
35 I353T 62 280 NT NT NT NT NT
NT (Not Tested)
상기 표 13에서 확인되는 바와 같이, CyPPO 단백질 변이체의 경우 야생형과 비교하여 각 제초제의 IC50값이 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 PPO 단백질의 특정 위치의 아미노산 변이에 의하여 제초제에 대한 내성이 증가됨을 입증하는 것이다. 본 시험 결과에서 CyPPO 단백질 변이체가 대체적으로 야생형에 비하여 감소된 효소활성을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 재조합 단백질과 식물에서 정제된 단백질간의 단백질 접힘 또는 소수성이 다른 데서 기인하는 것으로 생각된다. 식물에 있는 PPO 단백질은 식물체의 엽록체 막에 존재하며, 소수성이지만, 대장균이 생산하는 재조합 PPO 단백질은 MBP 단백질과 융합단백질로 친수성이다. 따라서, 변이 PPO 단백질이 식물의 엽록체에서 정상적인 조건으로 발현되면, 변이 단백질과 야생형 단백질간의 효소 활성 차이가 크지 않을 것으로 생각된다.
실시예 7. CyPPO 및 이의 변이체를 이용한 애기장대 형질전환체 제작 및 PPO 저해 제초제 내성 시험
7-1. 애기장대 형질전환 벡터 제작 및 애기장대 형질전환체 제작
애기장대 형질전환은 선별 마커인 bar 유전자 (glufosinate 내성 유전자)의 ORF와 각각의 CyPPO10 또는 CyPPO13의 아미노산 변이체의 암호화 유전자의 ORF를 가진 이원벡터 (binary vector)를 제작하여 수행하였다. PPO 저해 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 bar 유전자를 사용하였으며, 상기 유전자는 후대 유전이 안정적으로 진행되고 있는지 여부를 검증하는 데에도 사용하였다. Bar 유전자의 발현을 위하여 NOS 프로모터와 전사 종결을 위한 E9 터미네이터를 사용하였다.
CyPPO10, CyPPO10 변이체, CyPPO13, 및 CyPPO13 변이체 각각을 식물체에서 발현시키기 위하여 CaMV35S 프로모터와 NOS 터미네이터를 사용하였다. CyPPO10, CyPPO10 변이체, CyPPO13, 및 CyPPO13 변이체의 암호화 유전자는 XhoI, BamHI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 또한, 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) tag을 BamHI, SacI 제한효소를 이용하여 PPO 유전자의3' 말단 부위에 삽입하였다. HA tag 뒤에 NOS terminator 가 삽입되어 PPO 유전자의 전사 종결을 유도하였다. 또한, 엽록체로 단백질의 이동과 발현을 유도하기 위해 AtPPO1 유전자 (서열번호 6)의 transit peptide (TP)를 XbaI, XhoI 제한효소를 이용하여 PPO 유전자의 5' 앞에 삽입하였다. 벡터 내 삽입된 transit peptide 부위를 서열번호 27로, 삽입된 HA tag 서열을 서열번호 28 로 나타내었다. 본 실시예에 사용한 식물 형질전환 이원벡터의 구조 모식도를 도 6에 예시적으로 나타내었다.
상기에서 제작한 각각의 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 competent cell에 freeze-thaw 방법으로 도입하여 형질전환 시켰다. GV3101 competent cell 을 제조하기 위하여, GV3101 균주를 5 ml LB media 에 30 및 200 rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200 ml LB media 에 접종하여 30 및 200 rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000 xg, 4 에서 20분간 원심분리 하였다. 멸균 증류수로 pellet을 씻어 준 뒤 20 ml LB media 로 재현탁 (resuspension)하였다. 200 ㎕씩 aliquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한 뒤, 초저온 냉동고에 보관하였다.
각각의 형질전환 Agrobacterium을 항생제 배지 (spectinomycin을 포함한 LB agar)에서 배양 및 선별하였다. 상기 선별된 콜로니를 LB broth에서 액체 배양하였다. 이 배양액으로부터 Agrobacterium cell을 harvest 한 후, 5% (w/v) sucrose 용액에 흡광도 (OD600) 0.8의 농도로 현탁한 후, 0.05% (v/v) Silwet L-77 (Momentive performance materials company)를 첨가하였다. Floral dipping 방법으로 Col-0 ecotype 애기장대 wild type에 형질전환하여 형질전환 애기장대를 제작하고, 1~2달 후 종자 (T1)를 수확하였다.
벡터 제작 시 형질전환 개체 선발을 위해 삽입된 bar 유전자를 이용하여 형질전환 개체를 선발하였다. 상기 얻어진 T1 종자를 25 μM glufosinate가 첨가된 1/2 MS 배지 (2.25g/L MS salt, 10g/L sucrose, 7g/L Agar)에 파종하고, 파종 7일 후 생존한 개체를 선발하여 흙으로 이식하고 성장시켜 T1 식물체를 수득하였다.
이식한 T1 식물체들의 PPO 저해 제초제 내성을 판단하기 위해 3~4주 키운 후 추대 전 tiafenacil을 처리하였다. 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 에 tiafenacil 용액 100 ml (1 μM tiafenacil + 0.05%(v/v) Silwet L-77)을 골고루 분사하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)의 경우 상기와 동일한 농도 및 양으로 tiafenacil을 처리하는 경우 사멸한다. 상기와 같은 tiafenacil 처리 후 4~7일 경과 후 각 형질전환체들의 PPO 저해 제초제 내성 여부를 판별하였다.
내성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고 (T2 종자), 상기 T2 종자를 25 μM glufosinate를 첨가한 1/2 MS 배지 (2.25g/L MS salt, 10g/L sucrose, 7g/L Agar)에 파종하여 6~7일간 키운 뒤, 생존 개체를 선발하였다.
Bar 유전자 삽입에 따른 glufosinate 저항성과 감수성 개체의 분리비 (segregation ratio)를 각 삽입 유전자 별 및 라인 별로 판단하였다. Glufosinate 내성 개체: 감수성 개체의 비가 약 3:1을 보이면 멘델의 법칙에 따라 삽입 유전자가 단일 카피로 삽입되고, 세대가 진전됨에 따라 분리되어 잘 발현하는 것으로 판단하였다.
1/2 MS 배지에서 생존한 개체를 흙으로 이식하여 3~4주 간 키워 T1과 동일 조건으로 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 에 tiafenacil 용액 100 ml (1 μM, 5 μM, 10 μM 또는 25 μM tiafenacil + 0.05% Silwet L-77)을 골고루 처리하여 형질전환체들의 tiafenacil 내성을 판단하였다. T3 종자는 tiafenacil 저항성 T2 식물체를 지속적으로 키워 확보하였다.
T1 및 T2 종자 선별과 동일하게, 25 μM glufosinate을 포함한 1/2 MS 배지에서 T3 종자를 선별하였고, glufosinate 저항성 개체가 100%인 라인을 homoline으로 판단하였다.
7-2. 종자 발아
상기 제작된 CyPPO10 및 CyPPO13의 야생형 및 변이 유전자가 삽입된 형질전환 애기장대의 제초제 저항성을 확인하였다.
각 형질전환 애기장대의 T3 세대 종자를 25개씩 제초제가 포함된 1/2 MS 배지에 파종하였다. 대조군으로 Col-0 ecotype (wild type) 종자를 사용하였다. 사용된 제초제 종류 및 사용 농도는 다음과 같다:
도 31a: 25 μM glufosinate (PPT), 70 nM tiafenacil, 100 nM saflufenacil, 25 μM glufosinate + 70 nM tiafenacil, 또는 25 μM glufosinate + 30 nM tiafenacil + 40 nM saflufenacil;
도 31b 및 31c: 0.1 μM 또는 1 μM tiafenacil, 0.3 μM 또는 3 μM saflufenacil, 0.1 μM 또는 1 μM flumioxazin, 0.5 μM 또는 5 μM pyraclonil, 또는 1 μM 또는 10 μM sulfentrazone.
상기 얻어진 파종 7일 후 종자 발아 결과를 도 31a 내지 31c에 나타내었다. 도 31a 내지 31c에서 Col-O는 대조군, 10-3은 CyPPO10 야생형, 10FM-4-7은 CyPPO10 F360M 변이 유전자 삽입 개체, 10FL-1-9는 CyPPO10 F360L 변이 유전자 삽입 개체, 10FC-3-5는 CyPPO10 F360C 변이 유전자 삽입 개체, 10AC-5-4는 CyPPO10 A167C 변이 유전자 삽입 개체, 13-1은 CyPPO13 야생형, 13FM-3-1은 CyPPO13 F373M 변이 유전자 삽입 개체, 13FC-1-1은 CyPPO13 F373C 변이 유전자 삽입 개체, 13FI-2-1은 CyPPO13 F373I 변이 유전자 삽입 개체, 13AC-1-3은 CyPPO13 A177C 변이 유전자 삽입 개체, CyPPO13_ALFL은 CyPPO13 A177L+F373L 변이 유전자 삽입 개체, 및 CyPPO13_ALFI는 CyPPO13 A177L+F373I 변이 유전자 삽입 개체를 각각 의미한다.
도 31a 내지 31c에 나타난 바와 같이, 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)는 제초제를 포함하지 않는 1/2 MS 배지에서는 정상적으로 발아하는 반면, 상기한 바와 같은 제초제를 포함한 1/2 MS 배지에서 정상 발아하지 못하고 사멸하는 것으로 확인되었다. 따라서, 각 제초제가 포함된 배지에서 형질전환 애기장대가 정상 발아한다면, CyPPO 야생형 또는 변이체의 형질도입에 의하여 각 제초제에 대한 저항성이 부여되거나 증진된 것으로 판단할 수 있다.
또한, CyPPO10 야생형 또는 CyPPO10의 변이 유전자 (F360M, F360I, F360L, F360C, A167C), CyPPO13 야생형 또는 CyPPO13의 변이 유전자 (F373M, F373C, F373I, A177C, A177L+F373L, A177L+F373I)가 각각 삽입된 형질전환 애기장대 T3 라인 종자를 대상으로 실험한 결과, 제초제가 포함된 배지 (25 μM glufosinate, 25 μM glufosinate + 70 nM tiafenacil, 또는 25 μM glufosinate + 30 nM tiafenacil + 40 nM saflufenacil 포함)에서 모든 형질전환 애기장대가 정상 발아 및 생존하거나, 대조군보다 우수한 발아율 및 생존 비율을 나타내는 것으로 확인되었다. 선발용으로 삽입한 bar 유전자의 발현으로 glufosinate 저항성이 부여되므로, 상기 결과는 PPO 저해 제초제 저항성 인자와 다른 제초제 저항성 인자 (ex. glufosinate 저항성, bar 유전자)가 동시에 식물체에 삽입되어 독립적으로 저항성을 나타낼 수 있음을 보여주는 것이라고 할 수 있다.
도 31a 내지 31c에 나타난 바와 같이, 다양한 종류 및 농도의 PPO 저해 제초제가 포함된 배지에서, 대조군은 정상 발아를 하지 못하는 반면, 형질전환 애기장대는 정상 발아하고 생존하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 형질전환체의 삽입된 유전자들로 인해 형질전환 애기장대가 다양한 PPO 저해 제초제에 대해 저항성을 부여받거나 증진된 저항성을 보유하게 됨을 보여주는 것이다.
7-3. CyPPO 유전자가 도입된 애기장대(T 2 )에서의 CyPPO 단백질 발현 조사
CyPPO10, CyPPO10 변이체 (F360I 변이체 또는 F360M 변이체), CyPPO13, 또는 CyPPO13 변이체 (F373M 변이체)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에서 각 단백질이 발현되는지 조사하였다.
각 형질전환체의 T2 세대 라인 별로 파종 4주 후 애기장대 형질전환체 잎을 액체질소와 함께 마쇄한 후 단백질 추출버퍼 (0.05 M Tris-Cl pH7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM DTT)를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 애기장대 형질전환 벡터에 포함된 HA tag을 이용하여 PPO 단백질을 검출하였다. RuBisCO large subunit (loading control, 실험 단백질 양 비교)을 Coomassie blue staining으로 확인하였다. 각 변이체 별로 2개 라인을 시험하였으며, 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)을 대조군으로 사용하였다.
상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, CyPPO10 변이체 (F360I 변이체 또는 F360M 변이체) 또는 CyPPO13 변이체 (F373M 변이체) 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체들은 모두 PPO 단백질을 발현함을 확인할 수 있다.
7-4. 형질전환 애기장대(T 2 또는 T 3 )의 제초제 저항성 검증
CyPPO10, CyPPO10 변이체 (F360C, F360I, F360L, F360M, F360V, F360T, A167C, A167L, A167L+F360M, A167C+F360M, A167C+F360I, 또는 V305M+F360M), CyPPO13, 또는 CyPPO13 변이체 (A177C, F373C, F373I, F373M, A177L+F373I, 또는 A177L+F373L)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2 또는 T3)에 대하여 제초제 저항성을 테스트하였다.
CyPPO10 야생형 유전자 또는 CyPPO13 야생형 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)에 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 당, tiafenacil 용액 100 ml (1 μM tiafenacil + 0.05% (v/v) Silwet L-77)을 처리하고, 7일 후에 식물의 약해 정도를 판단하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)을 대조군으로 사용하였다.
상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다.
또한, CyPPO10 변이체 (F360C, F360I, F360L, F360M, F360V, F360T, A167C, A167L, A167L+F360M, 또는 A167C+F360I) 또는 CyPPO13 변이체 (A177C, F373C, F373I, F373M, A177L+F373I, 또는 A177L+F373L)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 당, tiafenacil 용액 100 ml (1 μM, 5 μM, 10 μM, 또는 25 μM tiafenacil + 0.05% (v/v) Silwet L-77)을 처리하고, 7일 후에 식물의 약해 정도를 판단하였다.
상기 얻어진 결과를 도 9 (CyPPO10 변이체 암호화 유전자 삽입 형질전환체 T2 개체) 및 도 10 (CyPPO13 변이체 암호화 유전자 삽입 형질전환체 T2 개체)에 나타내었다.
또한, 상기 도 8 내지 10에 나타난 CyPPO 유전자 또는 CyPPO 변이 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체의 tiafenacil (1 μM, 5 μM, 10 μM 및 25 μM)에 의한 약해 수준 (Injury index)를 수치화하여 아래의 표 14에 나타내었다.
T2 Injury Index (약해 수준)
　 Line No. Tiafenacil Average injury index
Col -0 　 1 μM 5
CyPPO10
Wild type 　 1 μM 0.5
F360C 3 1 μM 0.3
　 　 5 μM 0.9
F360I 7 1 μM 0
　 　 5 μM 0.1
F360L 3 1 μM 0
　 　 5 μM 0.3
F360M 4 1 μM 0.1
　 　 5 μM 0.3
F360V 4 1 μM 0
　 　 5 μM 0.3
F360T 3 1 μM 2.6
A167C 3 1 μM 0
A167L 3 1 μM 0.2
A167L+F360M 12 25 μM 2
A167C+F360I 19 25 μM 2
CyPPO13
Wild type 　 1 μM 0.5
A177C 1 1 μM 0
F373C 2 1 μM 0.1
F373I 2 1 μM 0.1
F373M 2 1 μM 0
A177L+F373I 9 10 μM 1.5
A177L+F373L 7 10 μM 0
CyPPO10 변이체 (F360I, F360L, F360M, A167C+F360I, A167C+F360M, 또는 V305M+F360M)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)에 tiafenacil 용액 (25 μM tiafenacil + 0.05% (v/v) Silwet L-77) 및 saflufenacil (100 μM saflufenacil + 0.05% (v/v) Silwet L-77)을 40 X 60 cm 면적(0.24 m2)에 각 100 ml씩 처리하고, 7일 후에 식물의 약해 정도를 판단하였다.
상기 얻어진 CyPPO10 변이체 암호화 유전자 삽입 형질전환체 T3 개체에서의 결과를 도 32에 나타내었다.
또한, 도 32의 CyPPO10 변이 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체의 tiafenacil 또는 saflufenacil에 의한 약해 수준 (Injury index)를 수치화하여 아래의 표 15에 나타내었다.
T3 Injury Index (약해 수준)
　 Line No. Tiafenacil Average
injury index		 Saflufenacil Average
injury index
Col-0 　 25 μM 5 100 μM 5
CyPPO10 F360I
　		 7-2 25 μM 1 100 μM 1.1
10-2 100 μM 0
F360M 4-7 25 μM 2
F360L 3-2 25 μM 1
A167C+F360I 1-4 25 μM 2 　 　
A167C+F360M 4-5 25 μM 2 　 　
V305M+F360M 6-5 25 μM 2 　 　
상기 표 14 및 표 15의 Average injury index는 각 라인별 시험 개체들 (10 내지 20개)의 약해 수준을 아래의 표 16의 기준으로 평가한 점수의 평균을 나타낸다.
상기 Injury index의 평가 기준을 아래의 표 16에 정리하였다:
약해 수준의 정의
Injury index 증상
0 약해가 없음
1 잎 끝이 마른 상태 또는 20% 미만이 누렇게 마름
2 식물체의 20% 이상 30% 미만이 누렇게 마름
2.5 식물체의 30% 이상 50% 미만이 누렇게 마름
3 식물체의 50% 이상 70% 미만이 누렇게 마름
4 식물체의 70% 이상이 누렇게 마름
5 식물 전체가 말라서 죽음
Tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, sulfentrazone, oxyfluorfen 또는 pyraclonil (각 50 μM) 처리 후 7일차에 CyPPO10 변이 유전자 (F360I, 또는 A167L+F360M) 또는 CyPPO13 변이 유전자 (A177L+F373L, 또는 A177L+F373I)가 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3)의 저항성 수준을 확인하였다. 제초제 저항성으로 알려진 애기장대 PPO1의 변이체 (AtPPO1 SLYM, S305L+Y426M)가 삽입된 애기장대 형질전환체 (T3) 또는 애기장대 야생형 (Col-0)을 대조군으로 사용하였다.
제초제 종류별 내성 실험은 각 제초제 50 μM 농도를 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 에 100 ml씩 골고루 살포하였다. Tiafenacil의 분자량 (MW)은 511.87, saflufenacil 의 분자량은 500.85, flumioxazin 의 분자량 354.34, sulfentrazone 의 분자량은 387.18 이다. 환산된 제초제 처리 약량은 tiafenacil 은 106.7 g ai/ha, saflufenacil 은 104.4 g ai/ha, flumioxazin 73.8 g ai/ha, sulfentrazone 은 80.7 g ai/ha 에 해당된다.
상기 얻어진 결과를 도 33a 및 33b에 나타내었다.
또한, 도 33a에 나타난 형질전환체들의 제초제에 의한 약해 수준 (Injury index)를 수치화하여 아래의 표 17에 나타내었다.
T3 Injury Index (약해 수준)
10_FI AtPPO1_SLYM 10_ALFM
Tiafenacil 1 4 1
Saflufenacil 0 0-1 0-1
Flumioxazin 0-1 4-5 1
Sulfentrazone 0-1 0-1 1
도 33a 및 표 17에서, 'Cy10_FI'는 CyPPO10 F360I 변이 유전자 삽입 개체, 'AtPPO1_SLYM'은 AtPPO1의 S305L+Y426M 변이 유전자 삽입 개체 (대조군), 'Cy10_ALFM'은 CyPPO10 A167L+F360M 변이 유전자 삽입 개체에서의 결과를 각각 나타낸다.
도 33b에서, 'Col-0'은 야생형 애기장대 (negative control), 'ALFL'은 CyPPO13 A177L+F373L 삽입 개체, 및 'ALFI'은 CyPPO13 A177L+F373I 삽입 개체에서의 결과를 각각 나타낸다.
도 33a에 나타난 바와 같이, 변이 유전자 형질전환체들의 저항성이 대조군 (AtPPO1_SLYM)과 비교하여 동등 이상임을 확인할 수 있다. CyPPO10_FI 및 CyPPO10_ALFM은 모두 대조군 (AtPPO1_SLYM)에 비해 다양한 제초제에 높은 수준의 저항성을 부여함을 확인하였다.
상기 표 14 및 도 8 에 나타난 바와 같이, 1 μM tiafenacil 처리시, 야생형 애기장대 (Col-0)는 모든 개체가 사멸한 반면, CyPPO10 야생형 또는 변이형 유전자 또는 CyPPO13 야생형 또는 변이형 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체는 거의 약해 없이 정상적으로 생장함을 확인할 수 있다.
또한, 상기 표 15, 표 17, 도 9, 도10, 도 32, 및 도 33a 및 33b에 나타난 바와 같이, 변이형 유전자 삽입 애기장대 형질전환체는 tiafenacil 5 μM 이상 처리시에도 시험된 거의 모든 형질전환 개체에서 약해가 나타나지 않거나 약한 수준으로 나타남을 확인할 수 있다. 상기 결과는 CyPPO10, CyPPO13, 또는 이들 변이 유전자의 도입에 의하여 애기장대에 제초제 저항성이 부여 및/또는 증진됨을 보여준다.
T2에서 저항성을 보였던 변이체들이 T3에서 저항성이 유지됨을 확인할 수 있다. 이로써 세대가 진전되어도 변이체들에 의한 제초제 저항성이 안정적으로 전달됨을 확인할 수 있다.
또한 tiafenacil 포함 다른 PPO 저해 제초제에 대하여 CyPPO의 변이 유전자가 도입된 형질전환 애기장대가 Col-0에 비해 높은 저항성을 보이므로 해당 변이 유전자를 이용하여 다양한 PPO 저해 제초제에 저항성을 보유한 식물을 개발하는 데에 활용될 수 있다.
7-5. 형질전환 애기장대에서의 삽입 유전자의 후대(T 4 또는 T 5 ) 안정성 확인
본 실시예에서는 애기장대 내 삽입한 유전자가 세대를 진전해도 안정적으로 유전되고 발현되는지 확인하였다.
CyPPO10의 F360I 삽입 형질전환체의 T3 라인 7-2, 10-2, 10-5를 T4, T5 세대로 전개시켜, 각 라인의 후대 세대 (T4, T5 세대)에서의 tiafenacil 또는 saflufenacil 저항성 및 삽입된 유전자의 발현으로 인한 단백질을 다음의 방법으로 확인하였다.
단백질 추출
형질전환체의 세대별, 라인별로 단백질을 추출하였다. 구체적으로, seedling 상태의 식물체를 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 단백질 추출버퍼 (0.05 M Tris-Cl pH7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM DTT)를 첨가하여 total protein을 추출하였으며, 이를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
추출한 단백질을 전기영동하여 PVDF membrane으로 전이한 후 항-HA 항체 (Santa cruz)를 이용하여 삽입한 PPO 단백질을 검출하였다.
제초제 저항성 확인
약 4주 자란 추대 전 애기장대 (T4 및 T5 CyPPO10 F360I 형질전환체)를 대상으로 15 μM tiafenacil 또는 150 μM saflufenacil 을 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 에 100 ml씩 골고루 살포하였다. 제초제 처리 후 7일차에 제초제 약해 정도를 관찰하였다.
상기 제초제 저항성은 도 34 (T4) 및 도 35 (T5)로 확인하였고, 그 약해 수준 (Injury index)를 표 18에 수치화하여 나타내었다.
T4 및 T5 Injury Index (약해 수준)
CyPPO10 F360I
T4 T5
Tiafenacil 0.5 0.5
Saflufenacil 0 1
도 34, 도 35, 및 표 18에 나타난 바와 같이, 대조군 (Col-0; 애기장대 야생형)은 상기 제초제 처리에 의하여 사멸하는 반면, T3에서 제초제 저항성을 보였던 변이체 (CyPPO10 F360I)의 T4 및 T5 세대에서 제초제 저항성이 유지됨을 확인할 수 있다. 이로써 세대가 진전되어도 변이체들에 의한 제초제 저항성이 안정적으로 전달됨을 확인할 수 있다.
또한, 상기 각 라인의 seedling 상태의 식물체를 이용하여 삽입 유전자의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다 (도 36). 대조군 (Col-0; 애기장대 야생형)을 제외한 CyPPO10 F360I 변이 유전자가 삽입된 형질전환체의 T4 및 T5 세대에서 모두 CyPPO10 F360I 변이 단백질이 발현됨을 확인할 수 있다. 이는 세대가 진전되어도 도입된 변이 유전자에 의한 변이 단백질이 안정적으로 발현하고, 상기 실시예 7-5에서 확인된 T4 및 T5에서의 저항성 유지가 상기 변이 유전자의 발현에 의한 것임을 보여준다.
실시예 8. CyPPO 및 이의 변이체를 이용한 콩 형질전환체 제작 및 PPO 저해 제초제 내성 시험
8-1. 콩 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 콩 형질전환체의 제작
CyPPO10 A167L+F360M 유전자를 콩 식물체에 발현시켜 tiafenacil 저항성을 부여하기 위해 형질전환용 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 애기장대 형질전환시 이용한 벡터 (도 6)를 template으로 하여 애기장대 PPO1 유전자의 transit peptide가 결합된 CyPPO10 A167L+F360M 유전자를 PCR로 증폭하였다. pENTR Directional TOPO cloning kits (Invitrogen) 을 이용하여 PCR product를 클로닝하고, DH5 alpha competent cell (Invitrogen)에 형질전환 하였다. 상기 제작된 Entry vector 를 이용하여 콩형질전환용 벡터인 pB2GW7.0 binary vector (도 37)에 클로닝하였다. 상기 클로닝은 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix kit (Invitrogen) 를 이용하여 수행하였다. 상기 CyPPO10 A167L+F360M 유전자가 삽입된 pENTR/D-TOPO vector 와 pB2GW7.0 plasmid, TE buffer, 및 LR Clonase II enzyme mix를 섞어준 뒤, 25 에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 얻어진 반응물에 Proteinase K solution (Invitrogen)을 첨가한 뒤, 37 에서 10분간 반응시키고 DH5 alpha competent cell 에 형질전환 하였다.
상기 제작한 벡터를 전기천공법으로 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 (Hood et al., New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants (EHA105). Trans Res. 1993 2:208-218) 에 형질전환 하였다.
광안콩을 이용하여 콩 형질전환체 제작을 수행하였다. 멸균한 3차수에 침지해 놓은 종자의 양 떡잎 사이로 외과용 메스 (Scapel)를 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 종피를 제거하였다. 배축을 떡잎 밑 약 1 ㎝되는 곳에서 자른 후 embryonic axis가 붙어있는 한 쪽을 외과용 메스 (＃11 blade)로 7 내지 8회 정도 상처를 내었다. 대략 50개 정도의 절편체를 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105와 혼합 후, 초음파 처리 (sonication)를 20초 간 한 뒤 30분 동안 접종시켰다. 각각의 절편체를 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 CCM (Co-cultivation medium; 0.32g/L Gamborg B5, 4.26g/L MES, 30g/L sucrose, 0.7% agar)에도 여과지를 한 장 깔고 10개체를 올려두었다. 이때 절편체의 향축 (adaxial) 부분이 아래로 향하도록 두었다. Micropore surgical tape으로 봉한 뒤 25 ℃, 18시간 광주기에 5일 동안 공배양하였다.
5일간 공배양을 한 후, 제균을 위해서 액체 1/2 SIM (shoot induction medium; 3.2 g/L Gamborg B5, 1.67 ㎎/L BA, 3 mM MES, 0.8% (w/v) aar, 3% (w/v) sucrose, 250 ㎎/L cefotaxime, 50 ㎎/L vancomycin, 100 ㎎/L ticarcillin, pH 5.6)에 10분 동안 세척하였다. 각각의 절편체를 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤 선발 항생제가 없는 SIM에 plate당 6개체씩 배축 부분이 배지에 고착되고 재분화 될 부분이 30도 정도의 각도로 위로 향하도록 치상하였다. 각각의 plate 를 Micropore surgical tape으로 봉한 뒤 25 ℃, 18시간 광주기에서 배양하였다.
2주 후 신초가 나온 절편체를 선발 항생제 PPT 10 ㎎/L가 들어있는 SIM-1 (SIM에 DL-phosphinothricin 10 ㎎/L 첨가, pH 5.6)에 신초를 제외한 나머지 부분은 잘라버리고 향축 (adaxial) 부분이 밑으로 향하도록 치상하였다.
2주 후 갈변한 신초/신초 pad는 외과용 메스 (＃15 blade)로 깎아 선발항생제 PPT 5 ㎎/L가 들어있는 SEM (shoot elongation medium, 신초 신장 배지; MS salt 4.4 g/L, MES 3 mM, GA3 0.5 ㎎/L, asparagine 50 ㎎/L, pyroglutamic acid 100 ㎎/L, IAA 0.1 ㎎/L, zeatin 1 ㎎/L, sucrose 3%, agar 0.8%, cefotaxime 250 ㎎/L, vancomycin 50 ㎎/L, ticarcillin 100 ㎎/L, DL-phosphinothricin 5 ㎎/L, pH 5.6)에 치상하였다. 2주마다 새로운 SEM으로 옮겨주면서 신초의 갈변부위는 외과용 메스 (＃15 blade)로 제거하고 신초 pad는 조금씩 계속 깎아내어 배지가 잘 흡수되도록 하였다.
SEM에서 선발을 거치면서 신장된 신초가 4 cm 이상 일 때, 외과용 메스 (#11 blade)로 잘라 RIM (rooting induction medium, 뿌리 유도 배지; MS salt 4.4 g/L, MES 3 mM, sucrose 3%, agar 0.8%, cefotaxime 50 ㎎/L, vancomycin 50 ㎎/L, ticarcillin 50 ㎎/L, asparagine 25 ㎎/L, pyroglutamic acid 25 ㎎/L, pH 5.6)으로 옮겼다. 이 때 분리해낸 신장된 신초의 밑 부분을 1 ㎎/mL 농도의 IBA (Indole-3-butyric acid)에 3분 동안 담가뒀다가 빼내어 RIM이 들어있는 테스트 튜브에 넣었다.
뿌리가 충분히 자라게 되면 3차 증류수로 RM을 씻어내고 상토 (바이오 프러그 2호, 팜한농)와 버미큘라이트를 2 : 1 부피비로 섞어 넣은 작은 포트 (6 ㎝ x 6 ㎝ x 5.6 ㎝)에 심었다. 10일 정도 경과 후 잎 표면에 100 ㎎/L DL-phosphinothricin로 leaf painting을 하여 저항성 개체를 1차 선발하였다.
식물체가 충분히 자란 후 더 큰 포트 (pot)로 옮겨 심고 투명한 플라스틱 덮개에 10개 정도의 구멍을 만들어 씌웠다. 10일 후, 식물체에 Basta (BAYER, 53 ㎎/L)를 처리하여 저항성 개체를 2차 선발하였다.
8-2. 형질전환 콩의 제초제 저항성 확인
CyPPO10 A167L+F360M 형질전환 콩 T0 세대 2번 라인 및 형질전환되지 않은 콩 (광안; wild type)의 잎에 5 μM 또는 15 μM tiafenacil 용액을 붓을 이용해 2~3회 발라주었다. Tiafenacil 용액은 전착제로 Silwet L-77을 0.05% (v/v)의 농도로 포함한다.
상기 제초제 처리 7일 후의 형질전환 콩의 모습을 도 38에 나타내었다. 도 38에 나타난 바와 같이, 광안 (형질전환하지 않은 콩)에서는 5 μM tiafenacil 처리 시 심한 약해가 나타나는 반면, CyPPO10 A167L+F360M 형질전환 콩은 15 μM의 고농도 처리 시에도 약해가 나타나지 않음을 확인할 수 있다.
한편, CyPPO10 A167L+F360M 형질전환체 콩 2번 라인을 전개하여 얻어진 T1 세대 (파종 후 4주 정도 자란 V2~3 Stage의 식물체)에 제초제 (tiafenacil 또는 saflufenacil)를 스프레이 처리하였다. 40 X 60 cm 면적에 25 μM tiafenacil 또는 150 μM saflufenacil이 포함된 용액 100 ml을 골고루 스프레이하여 처리한 후, 5일 후의 식물체의 상태를 평가하였다.
상기 얻어진 결과를 도 40에 나타내었다. 도 40에서, "대조군"은 야생형 광안콩을 의미하고 "10ALFM"은 CyPPO10 A167L+F360M 형질전환체 콩을 의미한다. 도 40에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여, CyPPO10 변이 유전자 형질전환 콩은 비교적 고농도의 제초제 처리시에도 약해가 거의 나타나지 않음을 알 수 있다.
8-3. 형질전환 콩 내 삽입 유전자 수 확인
CyPPO10 A167L+F360M 형질전환 콩 2, 23번 라인의 잎 250 mg에서 genomic DNA 추출하여 형질전환 콩 내의 삽입 유전자 수를 확인하였다.
상기 Genomic DNA 추출은 CTAB buffer 방법을 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 액체질소로 얼려진 상태에서 막자와 막자사발을 이용하여 상기 형질전환 콩 잎 조직을 미세하게 갈아준 뒤, 조직 1 g 당 5 ml의 DNA isolation buffer (2% (w/v) CTAB, 1.5 M NaCl, 25 mM EDTA, 0.2% (v/v) beta-mercaptoethanol, 100 mM Tris-Cl (pH 8.0))를 넣고 vortexing하였다. 60 에서 1시간 이상 가열한 뒤, chloroform:isoamyl alcohol (24:1) 을 1 volume 첨가하고 inverting 하여 섞어주었다. 7000 xg 및 4 조건에서 10분간 centrifuge 한 뒤, 상층액을 새 튜브로 옮기고 2.5 volume 에탄올을 섞어주었다. 5000 xg 및 4 ℃ 조건에서 5분간 centrifuge 한 뒤, 상층액을 버리고 pellet 을 TE buffer (LPSS)로 녹여주었다. RNase A (Bioneer)를 최종 농도 20 ㎍/ml로 첨가한 뒤 37 ℃에서 30분간 incubation 하였다. 1 volume 의 phenol:chloroform (1:1) 를 넣고 섞어준 뒤, 10000 xg 및 4 ℃ 조건에서 10분간 centrifuge 하고, 상층액을 새 튜브에 옮긴 뒤 1 volume chloroform:isoamyl alcohol(24:1) 을 넣고 섞어주었다. 10000 xg 및 4 ℃ 조건에서 10분간 centrifuge 하고 상층액을 새 튜브로 옮긴 뒤, 0.1 volume NaOAc(pH 5.2)와 2 volume 에탄올을 첨가하고 섞어주었다. 5000 xg 및 4 ℃ 조건에서 5분간 centrifuge 하고 수득한 DNA pellet을 70% 에탄올로 washing 하였다. Air dry 한 뒤 적정량의 TE buffer 로 genomic DNA 를 녹였다.
상기 추출된 DNA 10~40 ㎍를 EcoRI (Enzynomics)를 이용하여 12시간 이상 digestion 하였다.
그 후, 다음의 조건으로 agarose gel 0.8% (w/v) 전기영동 (50 V) 후, gel treatment를 수행하였다:
1)depurination: 0.25 N HCl, 15분 shaking
2)denaturation: 0. 5 M NaOH, 1.5 M NaCl, 30분 shaking
3)neutralization: 0.5 M Tris-Cl(pH 7.5), 1.5 M NaCl, 20분 shaking
그 후, capillary transfer 방법을 이용하여 gel 내 DNA 조각을 nitrocellulose membrane (Amersham)에 옮긴 후, UV crosslinker (UVC-508; ULTRA LUM Inc.)를 이용하여 cross linking 수행하였다.
다음의 방법으로 혼성화 (hybridization)를 수행하였다: 상기 nitrocellulose membrane을 DIG Easyhybridization solution (Roche, 11603558001)에서 42 ℃에서 3시간 동안 incubation하였다. 그 후, 새로운 DIG Easyhybridization solution으로 교체한 후 probe를 넣어주고, 42 ℃에서 12시간 이상 반응시켰다.
상기 probe는 다음의 방법으로 합성하였다:
Probe PCR
DIG dUTP (Jena bioscience)를 이용하여 dig이 표지된 bar 유전자를 증폭시켰으며, 이 때 사용된 primer는 다음과 같다:
Forward primer for bar probe: 5'- TTC CGT ACC GAG CCG CAG GA-3' (서열번호 124)
Reverse primer for bar probe: 5'- CGT TGG GCA GCC CGA TGA CA-3' (서열번호 125)
PCR: Solgent e-Taq kit 이용
조건: 95도 5분 후, 94도 30초, 60도 30초, 72도 30초를 35 cycle 반복, 72도 2분
상기 반응된 membrane에 대하여 low stringency washing (2X SSC, 0.1% SDS)과 high stringency washing (0.5X SSC, 0.1% SDS)을 수행하였다. 다음의 조건으로 DIG detection을 수행하여 밴드를 확인하였다:
1) Membrane을 blocking buffer (Roche, 11585762001)에 넣고 30분간 shaking
2) DIG antibody (anti-digoxigenin-AP Fab fragments, Roche)를 넣고 30분간 shaking
3) washing buffer (Roche)에서 15분간 shaking
4) detection buffer (Roche)를 넣고 3분간 shaking
5) CDP-Star, ready-to-use (Roche)를 membrane에 도포한 후 x-ray film에서 band를 현상함.
비교를 위하여, 형질전환하지 않은 광안콩의 genomic DNA를 이용하여 동일한 시험을 수행하였다 (Negative control; WT).
상기 얻어진 결과를 도 39에 나타내었다. 도 39에서, 필름상에 나타나는 밴드의 수가 삽입된 유전자의 수를 의미한다. 도 39에 나타난 바와 같이, CyPPO10 A167L+F360M 유전자의 삽입 개체인 2, 23번 라인 각각의 형질전환체에서 하나의 밴드가 관찰되었으므로, 삽입 유전자가 single copy로 존재함을 확인할 수 있다.
실시예 9: PPO 변이체와 서열 상동성을 갖는 단백질의 활성 시험
CyPPO plasmid (pACBB 벡터)를 template 으로 다음의 조건으로 error-prone PCR 수행하여, CyPPO 내 random 돌연변이를 유도하였다:
Template 0.5 ㎕
10X buffer 5 ㎕
10 mM MnCl2 1.5 ㎕
dNTP 5 ㎕
e-Taq (Solgent 社) 1 ㎕
forward primer (100 μM) 0.5 ㎕
reverse primer (100 μM) 0.5 ㎕
DDW 36 ㎕
총 50 ㎕
10X buffer: 100 mM Tris-Cl, pH8.3; 500 mM KCl, 70 mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin
dNTP: 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 100 mM dCTP, 100 mM dTTP
94 ℃ 3 min; (94 ℃ 30 sec, 57 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 5 min) 35 cycles
프라이머 서열:
CyPPO10_BamHI F
ccccggatccATGATTGAAGTGGATGTGGCTA (서열번호 126)
CyPPO10_XhoI R
ccccctcgagTGATTGTCCACCAGCGAGGTAAG (서열번호 127)
CyPPO13_BamHI F
ccccggatccATGAACCCTGCTACCCCTGAAC (서열번호 128)
CyPPO13_XhoI R
ccccctcgagCACCTGTGATAACAACTGCTGAG (서열번호 129)
상기 얻어진 error-prone PCR product 를 agarose gel 에 전기영동한 뒤 gel elution 하고, pACBB 벡터와 PCR product를 BamHI, XhoI 제한효소로 digestion 하였다. 제한효소 처리된 벡터와 PCR product를 agarose gel 에 전기영동한 뒤, gel elution 하고, ligation하였다. Ligation product를 BT3 competent cell 에 형질전환하고 colony PCR 한 뒤 돌연변이 CyPPO 의 sequence 를 확인하였다. 돌연변이가 확인된 clone 들을 tiafenacil 또는 saflufenacil이 농도 별 (0, 50, 100, 200 μM)로 함유된 LB plate 에 spotting 하여 대장균의 생장을 조사하였다. 돌연변이 clone 들 중에서, 최종 아래 clone이 제초제 저항성 돌연변이로 선발되었다:
CyPPO10m-6: 9개 아미노산 변이 (E225G, G258S, Q266L, T336I, V356F, F360M, A364D, R406G, W419R) 포함; 유전자 서열 - 서열번호 130, 아미노산 서열 - 서열번호 131 (야생형 CyPPO10 아미노산 서열과 98% 서열상동성)
상기 CyPPO10m-6 의 돌연변이 유전자를 삽입한 BT3 형질전환체의 제초제 저항성을 확인하여, 그 결과를 도 41에 나타내었다. 도 41에서, 'AtPPO1 WT'는 야생형 애기장대 PPO1, 'AtPPO1 SLYM'는 Y426M 및 S305L 변이를 포함하는 변이형 애기장대 PPO1, 'CyPPO10 WT'는 야생형 CyPPO10, 'CyPPO10m-6' 는 앞서 설명한 CyPPO10 변이체를 각각 나타낸다.
도 41에서와 같이, 야생형 CyPPO10 아미노산 서열 기준 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 변이체는 200 μM의 고농도 tiafenacil 또는 saflufenacil을 함유하는 배지에서도 야생형과 동등 정도의 생존을 보이는 것을 확인할 수 있다.
<110> FarmHannong Co., Ltd. <120> Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using Protoporphyrinogen Oxidase or Variant Thereof <130> DPP20171872KR <150> KR 10-2016-0075358 <151> 2016-06-16 <160> 131 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding CyPPO10 <400> 1 atgattgaag tggatgtggc tattgttggt ggtggtctta gtggattgtc agtggcttgg 60 agattacaga ggagtgctcc tcattattct ggagttcttc ttgaggcttc tgatagactt 120 ggaggtaata tcactacaca agctgctgaa ggatttgtgt gggagcttgg tccaaacagt 180 ttcgctccta ctccagcact cttacagttg attgctgaag ttggactcca ttctgagtta 240 atcagaggag ataggcacct tccaagatat atatactgga ggggagaact ttatcctttg 300 gagccaacta ggcctcttgc tttggcaaca tcaaatcttt tgagtccttg gggaaaggtt 360 agagctgcac tcggagcttt aggttttgtg cctccatatc ttggatctgg agatgaaagt 420 gttgattctt tctttagaag gcatcttgga caagaagttg ctgagagatt ggtggcacca 480 tttgtttcag gagtgtacgc tggagatcct caacagcttt ctgctgctgc tgcttttaga 540 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gtggacaatc ataa 1404 <210> 2 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO10 <400> 2 Met Ile Glu Val Asp Val Ala Ile Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Val Ala Trp Arg Leu Gln Arg Ser Ala Pro His Tyr Ser Gly Val 20 25 30 Leu Leu Glu Ala Ser Asp Arg Leu Gly Gly Asn Ile Thr Thr Gln Ala 35 40 45 Ala Glu Gly Phe Val Trp Glu Leu Gly Pro Asn Ser Phe Ala Pro Thr 50 55 60 Pro Ala Leu Leu Gln Leu Ile Ala Glu Val Gly Leu His Ser Glu Leu 65 70 75 80 Ile Arg Gly Asp Arg His Leu Pro Arg Tyr Ile Tyr Trp Arg Gly Glu 85 90 95 Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Thr Arg Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ser Asn 100 105 110 Leu Leu Ser Pro Trp Gly Lys Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly 115 120 125 Phe Val Pro Pro Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Glu Ser Val Asp Ser Phe 130 135 140 Phe Arg Arg His Leu Gly Gln Glu Val Ala Glu Arg Leu Val Ala Pro 145 150 155 160 Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Phe Arg Arg Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu 180 185 190 Ile Ala Gly Ala Leu Arg Leu Arg Arg Gln Gln Pro Pro Gln Pro Lys 195 200 205 Pro Pro Ala Gln Val Gln Met Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg 210 215 220 Glu Gly Leu Ala Ala Leu Pro Arg Ala Ile Ala Gln Gln Leu Lys Ala 225 230 235 240 Pro Leu His Leu Gln Thr Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Glu Pro Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gln Thr Trp His Ala Arg Ser 260 265 270 Val Val Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Gln Thr Ala Glu Leu Val Ala Pro 275 280 285 Phe Gln Pro Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ala Thr Ile Pro Tyr Pro Thr 290 295 300 Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Leu Gly Arg Ser Val 305 310 315 320 Arg Pro Gly Phe Gly Val Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr 325 330 335 Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Cys Leu Phe Pro Gln Arg Thr Pro Ala 340 345 350 Gly Trp Gln Val Phe Thr Ser Phe Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Asp 355 360 365 Leu Ala Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ile Val Glu Gln Val Gln Gln Asp 370 375 380 Leu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ala Lys Ala Arg Leu Leu Gly 385 390 395 400 Met Lys Val Trp Arg Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Ile Val Gly Tyr Pro 405 410 415 Gln Gln Trp Gln Gln Val Thr His Ala Leu Thr Gln Thr Pro Gly Leu 420 425 430 Phe Leu Cys Ser Asn Tyr Ala Glu Gly Val Ala Leu Gly Asp Arg Val 435 440 445 Glu His Gly Asn Arg Thr Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Leu Ala Gly 450 455 460 Gly Gln Ser 465 <210> 3 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding CyPPO13 <400> 3 atgaaccctg ctacccctga acctttgaat gctgaagttg ttgtgattgg tgctggaatt 60 tctggattga ccttggcttg gagactccaa cagggtctta gtgctagagg aggttctcca 120 caagcagttc ttttggctga agcatcttca agggtgggag gttgtattag tacccagtct 180 aaggatggat atagatggga agagggtcct aatagtttta ctccaacacc tgctctctta 240 aacctcattg cagaagttgg attaactgat caacttgtgt tggctgatgc aaagttgcca 300 agatatatct actgggaggg tgctcttttg ccagttcctc tttcacctgc tgctgctttg 360 ggatctaggc tcttatcagt tggaggtaaa cttagagctt tgcagggact tttgggtttt 420 gttcctccac ctccaggtca tgaagagact gtgagacaat ttttcagaag gcagcttgga 480 tctgaagttg ctgagagatt ggtggagcct ttcacatcag gagtttatgc tggagatcct 540 gatcaactta gtgcagttgc agcttttcct agggtggctg gtctcgaaga gagatacgga 600 tcattattcg ctggtgctct tcaagctctt aggcaaagac cacagcctag tccagcagct 660 atccagcctc cacctaaaag gggacaactt ggtaatttga gacagggact ccaacagtta 720 cctgaagctc ttgcacaaaa gttgggagat tctctcagat taggttggag agctttgcaa 780 ttgaaaagag caggagagct ttattgggtt ggtttcgaaa ctccagaggg atcaaggtgg 840 gttgctgcta gacaagttgt gctcgcttta cctgcatacg aagcagctgc actcttacaa 900 gagttgaacc cacctgcttc tcagcttttg gcagaaatac tctatccacc tgttgctgtt 960 gtggctcttg catacccaca agaggctctc cctcagccat taagaggatt tggtcatctc 1020 atccctaggt ctcaaggact tagaaccttg ggtactatat gggcttcatg tttgttccct 1080 gaaagagcac ctcaaggtta tcactcattt ctcagtttct taggaggtgc tacagatgct 1140 gcattggcaa gaaggagagg tattcctcct atccctgctc tcagtccaga agagagagca 1200 caaatagctc acgcagagct ttctcaggtt ctcttaacca ggagagctga accagtgtat 1260 cttggagaga ggttgtggcc tagagctata ccacaataca cacttggaca taggcagaga 1320 attgctcaag ttcaggctca 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33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO10_S60T <400> 45 aggagcgaaa gtgtttggac caagctccca cac 33 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO10_I340T <400> 46 ctcggaacca cctggtcttc atgcttattc cca 33 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO10_I340T <400> 47 tgaagaccag gtggttccga gtgtccttat acc 33 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO10_R89L <400> 48 caccttccac tttatatata ctggagggga 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO10_R89L <400> 49 gtatatataa agtggaaggt gcctatctcc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO10_R89V <400> 50 caccttccag tttatatata ctggagggga 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO10_R89V <400> 51 gtatatataa actggaaggt gcctatctcc 30 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> 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Sequence <220> <223> F primer for CyPPO10_I408W <400> 66 ggtttggaga agggcttggc cacaatatat cgttgg 36 <210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO10_I408W <400> 67 ccaacgatat attgtggcca agcccttctc caaacc 36 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F373M <400> 68 tcatttctca gtatgttagg aggtgctaca 30 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F373M <400> 69 agcacctcct aacatactga gaaatgagtg 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F373V <400> 70 tcatttctca gtgttttagg aggtgctaca 30 <210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F373V <400> 71 agcacctcct aaaacactga gaaatgagtg 30 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F373I <400> 72 tcatttctca gtattttagg aggtgctaca 30 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F373I <400> 73 agcacctcct aaaatactga gaaatgagtg 30 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F373T <400> 74 tcatttctca gtactttagg aggtgctaca 30 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F373T <400> 75 agcacctcct aaagtactga gaaatgagtg 30 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F373L <400> 76 tcatttctca gtcttttagg aggtgctaca 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F373L <400> 77 agcacctcct aaaagactga gaaatgagtg 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F373C <400> 78 tcatttctca gttgtttagg aggtgctaca 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F373C <400> 79 agcacctcct aaacaactga gaaatgagtg 30 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_R101A <400> 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agccacccta ggaaaagc 38 <210> 102 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_G194K <400> 102 gcttttccta gggtggctaa actcgaagag agatacgg 38 <210> 103 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_G194K <400> 103 ccgtatctct cttcgagttt agccacccta ggaaaagc 38 <210> 104 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_G194R <400> 104 gcttttccta gggtggctcg tctcgaagag agatacgg 38 <210> 105 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_G194R <400> 105 ccgtatctct cttcgagacg agccacccta ggaaaagc 38 <210> 106 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_G194E <400> 106 gcttttccta gggtggctga actcgaagag agatacgg 38 <210> 107 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_G194E <400> 107 ccgtatctct cttcgagttc agccacccta ggaaaagc 38 <210> 108 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_G194M <400> 108 gcttttccta gggtggctat gctcgaagag agatacgg 38 <210> 109 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_G194M <400> 109 ccgtatctct cttcgagcat agccacccta ggaaaagc 38 <210> 110 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F337V <400> 110 cagccattaa gaggagtggg tcatctcatc cc 32 <210> 111 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F337V <400> 111 gggatgagat gacccactcc tcttaatggc tg 32 <210> 112 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_L340T <400> 112 gaggatttgg tcataccatc cctaggtctc aag 33 <210> 113 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_L340T <400> 113 cttgagacct agggatggta tgaccaaatc ctc 33 <210> 114 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_I353T <400> 114 gaaccttggg tactacctgg gcttcatgtt tg 32 <210> 115 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_I353T <400> 115 caaacatgaa gcccaggtag tacccaaggt tc 32 <210> 116 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_F171A <400> 116 agattggtgg agcctgctac atcaggagtt tat 33 <210> 117 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_F171A <400> 117 ataaactcct gatgtagcag gctccaccaa tct 33 <210> 118 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_R101A <400> 118 gatgcaaagt tgccagctta tatctactgg gag 33 <210> 119 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_R101A <400> 119 ctcccagtag atataagctg gcaactttgc atc 33 <210> 120 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_V175C <400> 120 cctttcacat caggatgtta tgctggagat cct 33 <210> 121 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_V175C <400> 121 aggatctcca gcataacatc ctgatgtgaa agg 33 <210> 122 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO13_V175L <400> 122 acatcaggat tgtatgctgg agatcctgat c 31 <210> 123 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO13_V175L <400> 123 tccagcatac aatcctgatg tgaaaggctc cac 33 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for bar probe <400> 124 ttccgtaccg agccgcagga 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for bar probe <400> 125 cgttgggcag cccgatgaca 20 <210> 126 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site of CyPPO10_BamHIF <400> 126 ccccggatcc atgattgaag tggatgtggc ta 32 <210> 127 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site of CyPPO10_XhoIR <400> 127 ccccctcgag tgattgtcca ccagcgaggt aag 33 <210> 128 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site of CyPPO13_BamHIF <400> 128 ccccggatcc atgaaccctg ctacccctga ac 32 <210> 129 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site of CyPPO13_XhoIR <400> 129 ccccctcgag cacctgtgat aacaactgct gag 33 <210> 130 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence of CyPPO10m-6 <400> 130 atgattgaag tggatgtggc tattgttggt ggtggtctta gtggattgtc agtggcttgg 60 agattacaga ggagtgctcc tcattattct ggagttcttc ttgaggcttc tgatagactt 120 ggaggtaata tcactacaca agctgctgaa ggatttgtgt gggagcttgg tccaaacagt 180 ttcgctccta ctccagcact cttacagttg attgctgaag ttggactcca ttctgagtta 240 atcagaggag ataggcacct tccaagatat atatactgga ggggagaact ttatcctttg 300 gagccaacta ggcctcttgc tttggcaaca tcaaatcttt tgagtccttg gggaaaggtt 360 agagctgcac tcggagcttt aggttttgtg cctccatatc ttggatctgg agatgaaagt 420 gttgattctt tctttagaag gcatcttgga caagaagttg ctgagagatt ggtggcacca 480 tttgtttcag gagtgtacgc tggagatcct caacagcttt ctgctgctgc tgcttttaga 540 aggattgctc aacttgagaa gttgggaggt tcattgatcg ctggagcact cagattaaga 600 aggcaacagc ctccacagcc aaaacctcca gctcaagtgc agatgagacc tggagaactc 660 ggtagtttta gggggggtct cgctgcatta cctagagcca tcgcacaaca gttgaaggca 720 ccacttcatt tgcaaacacc tgttgaagct attacccctg agccaaaagg aagttatctc 780 ttaaggagtg gtgaactgac ttggcacgct agatcagttg tgttggctac tccagcatac 840 caaactgctg aacttgttgc accattccag cctgctatcg ctagagcttt ggctaccata 900 ccttatccaa ctgttgcttg tgttgtgctt gcttaccctg ctggattggg tagatcagtt 960 agacctggat ttggtgtttt ggtgcctaga ggacaaggta taaggatact cggaaccatt 1020 tggtcttcat gcttattccc acaaaggact cctgctggtt ggcaggcttt tacctctatg 1080 ataggaggtg atactgatcc tgatcttgca tcattgagag aagaggccat tgttgaacaa 1140 gtgcaacagg atctcacaag gcttcttgat cttcctgctg caaaggcaag actcttgggt 1200 atgaaggttt ggagaggggc tattccacaa tatatcgttg gttaccctca acagaggcaa 1260 caggtgacac acgctcttac ccagactcct ggtctcttct tatgttcaaa ctacgcagag 1320 ggagttgcat tgggggatag agtggaacac ggaaatagga ctgctgctgc tgtggctgct 1380 tacctcgctg gtggacaatc atga 1404 <210> 131 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO10m-6 <400> 131 Met Ile Glu Val Asp Val Ala Ile Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Val Ala Trp Arg Leu Gln Arg Ser Ala Pro His Tyr Ser Gly Val 20 25 30 Leu Leu Glu Ala Ser Asp Arg Leu Gly Gly Asn Ile Thr Thr Gln Ala 35 40 45 Ala Glu Gly Phe Val Trp Glu Leu Gly Pro Asn Ser Phe Ala Pro Thr 50 55 60 Pro Ala Leu Leu Gln Leu Ile Ala Glu Val Gly Leu His Ser Glu Leu 65 70 75 80 Ile Arg Gly Asp Arg His Leu Pro Arg Tyr Ile Tyr Trp Arg Gly Glu 85 90 95 Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Thr Arg Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ser Asn 100 105 110 Leu Leu Ser Pro Trp Gly Lys Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly 115 120 125 Phe Val Pro Pro Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Glu Ser Val Asp Ser Phe 130 135 140 Phe Arg Arg His Leu Gly Gln Glu Val Ala Glu Arg Leu Val Ala Pro 145 150 155 160 Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Phe Arg Arg Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu 180 185 190 Ile Ala Gly Ala Leu Arg Leu Arg Arg Gln Gln Pro Pro Gln Pro Lys 195 200 205 Pro Pro Ala Gln Val Gln Met Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg 210 215 220 Gly Gly Leu Ala Ala Leu Pro Arg Ala Ile Ala Gln Gln Leu Lys Ala 225 230 235 240 Pro Leu His Leu Gln Thr Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Glu Pro Lys 245 250 255 Gly Ser Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Glu Leu Thr Trp His Ala Arg Ser 260 265 270 Val Val Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Gln Thr Ala Glu Leu Val Ala Pro 275 280 285 Phe Gln Pro Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ala Thr Ile Pro Tyr Pro Thr 290 295 300 Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Leu Gly Arg Ser Val 305 310 315 320 Arg Pro Gly Phe Gly Val Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Ile 325 330 335 Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Cys Leu Phe Pro Gln Arg Thr Pro Ala 340 345 350 Gly Trp Gln Ala Phe Thr Ser Met Ile Gly Gly Asp Thr Asp Pro Asp 355 360 365 Leu Ala Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ile Val Glu Gln Val Gln Gln Asp 370 375 380 Leu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ala Lys Ala Arg Leu Leu Gly 385 390 395 400 Met Lys Val Trp Arg Gly Ala Ile Pro Gln Tyr Ile Val Gly Tyr Pro 405 410 415 Gln Gln Arg Gln Gln Val Thr His Ala Leu Thr Gln Thr Pro Gly Leu 420 425 430 Phe Leu Cys Ser Asn Tyr Ala Glu Gly Val Ala Leu Gly Asp Arg Val 435 440 445 Glu His Gly Asn Arg Thr Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Leu Ala Gly 450 455 460 Gly Gln Ser 465

Claims (23)

  1. 다음에서 선택된 폴리펩타이드:
    서열번호 2의 아미노산 서열 중 N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, 및 I408로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), 및 K(Lys)로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 4의 아미노산 서열 중 R101, F171, V175, A177, G194, P316, V318, F337, L340, I353, 및 F373로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), 및 K(Lys)로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    서열번호 2의 아미노산 서열 중 N59, S60, R89, F161, V165, A167, Q184, P303, V305, F324, L327, I340, F360, 및 I408으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), R(Arg), W(Trp), 및 G(Gly)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 4의 아미노산 서열 중 R101, F171, V175, A177, G194, P316, V318, F337, L340, I353, 및 F373으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), E(Glu), Q(Gln), K(Lys), R(Arg), H(His), 및 N(Asn)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 F360M, F360V, F360I, F360T, F360L, F360C, A167C, A167L, A167I, P303L, V305L, V305M, V305T, N59T, S60T, R89A, R89L, R89V, F161A, V165S, V165C, Q184G, F324V, L327T, I340T, I408R, 및 I408W로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서 F373M, F373V, F373I, F373T, F373L, F373C, F373N, F373H, A177C, A177L, A177I, P316A, P316L, V318L, V318M, R101A, F171A, V175C, V175L, G194E, G194Q, G194M, G194K, G194R, F337V, L340T, 및 I353T로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 F360M, F360V, F360I, F360T, F360L, F360C, A167C, A167L, P303L, N59T, S60T, R89A, R89L, R89V, F161A, V165S, V165C, A167I, Q184G, V305L, V305M, V305T, F324V, L327T, I340T, I408R, I408W, P303L+V305L, N59T+F360V, S60T+V165S+F360M, S60T+V165S+F360I, S60T+I340T+F360I, R89A+F360M, R89A+F360I, R89A+F360L, R89L+F360I, R89V+F360I, R89A+A167L+F360M, R89A+V305T+F360M, V165S+F360M, V165S+F360I, V165S+F360L, V165S+F360V, V165C+F360M, V165C+A167C+F360M, V165C+A167I+F360M, V165C+A167L+F360M, A167L+F360M, A167L+F360I, A167C+F360M, A167C+F360I, A167I+F360M, V305M+F360M, V305T+F360I, V305L+F360M, I408R+F360M, 또는 I408W+F360M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    서열번호 4의 아미노산 서열에 있어서 F373M, F373V, F373I, F373T, F373L, F373C, F373N, F373H, A177C, A177L, A177I, P316A, P316L, V318L, V318M, R101A, F171A, V175C, V175L, G194E, G194Q, G194M, G194K, G194R, F337V, L340T, I353T, P316L+V318L, P316A+V318L, R101A+F373M, A177C+F373M, A177I+F373M, A177L+F373M, A177L+F373I, A177L+F373L, A177L+F373T, A177L+F373V, A177C+F373T, A177C+F373V, V175L+F373M, G194E+F373M, G194Q+F373M, G194M+F373M, G194K+F373M, G194R+F373M, 또는 V318M+F373M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
    상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  8. 서열번호 2의 폴리펩타이드; 서열번호 4의 폴리펩타이드; 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 또는 조류(algae)의 제초제에 대한 저항성 부여 또는 증진용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(pyrimidinediones), 페닐에테르계(diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계(thiadiazoles), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 트리아졸리논계(triazolinones), 옥사졸리딘디온계(oxazolidinediones), 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸(profluazol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제초제는 부타페나실(butafenacil), 사플루페나실(saflufenacil), 벤즈펜디존(benzfendizone), 티아페나실(tiafenacil), 포메사펜(fomesafen), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 아클로니펜(aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스(bifenox), 에톡시펜(ethoxyfen), 락토펜(lactofen), 클로메톡시펜(chlomethoxyfen), 클로인트로펜(chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜(halosafen), 피라플루펜-에틸(pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트(fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸(cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl), 플루티아셋(fluthiacet), 티디아지민(thidiazimin), 옥사디아길(oxadiargyl), 옥사디아존(oxadiazon), 카펜트라존(carfentrazone), 설펜트라존(sulfentrazone), 아자페니딘(azafenidin), 펜톡사존(pentoxazone), 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸(profluazol), 페노필레이트(phenopylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체, 이들의 농약적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 저항성이 부여 또는 증진된 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylurea)계 제초제, 브로목시닐(bromoxynil)계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase);
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase);
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 DMO(dicamba monooxygenase);
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(aryloxyalkanoate Dioxygenase);
    ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 AHAS(acetohydroxyacid synthase), AHAS(acetohydroxyacid synthase) 또는 Atahasl(acetohydroxyacid synthase large subnit);
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 시토크롬 P450(cytochrome P450);
    색소체 저해성 제초제 내성 HPPD(hydorxylphenylpyruvate dioxygenase);
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 cp4 epsps, epsps(AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자;
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 bar 또는 pat 유전자;
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 dmo 유전자;
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 AAD-1 또는 AAD-12유전자;
    이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자;
    설포닐 유레아 제초제 내성 ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA 또는 SurB;
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 CYP76B1 유전자;
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 bxn 유전자; 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  16. 서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손.
  17. 제16항에 있어서, 상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체인, 형질전환체, 이의 클론 또는 자손.
  18. 서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법.
  19. 서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 또는 증진시키는 방법.
  20. 서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    재배지에서 잡초를 방제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것이고,
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  23. 서열번호 2의 폴리펩타이드, 서열번호 4의 폴리펩타이드, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및
    상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법.
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