KR20170140995A - 감국 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감국 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 감국(Chrysanthemum indicum Linne) 꽃의 분쇄물에 물을 첨가하고 가열 추출하여 수득한 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 및 비만의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 유효성분인 감국 꽃 추출물의 항산화 효과 및 전지방세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화하는 과정에서의 지방축적 억제 효과를 통해 비만을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분인 감국 꽃 추출물의 항산화 효과 및 전지방세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화하는 과정에서의 지방축적 억제 효과를 통해 비만을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 감국 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 감국(Chrysanthemum indicum Linne) 꽃의 분쇄물에 물을 첨가하고 가열 추출하여 수득한 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 및 비만의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
산소는 에너지를 생산하는 생명체의 생물학적인 과정에서 필수적으로 요구되지만 인체에서 2 ~ 3%의 산소는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 유리 라디칼(free radicals)로 전환된다고 알려져 있다(Zhang et al., 2016). ROS는 인체의 다양한 대사과정 중에 발생하며, 세포의 신호 및 신경 전달에 중요한 역할을 하고 일반적인 조직의 항상성을 유지한다. 건강한 사람에게서 유리 라디칼의 생성은 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GPx), 그리고 glutathione(GSH) 등과 같은 항산화 방어 메커니즘에 의해 보호되지만, 체내 유리 라디칼의 생성과 항산화 방어 시스템이 불균형해지면 산화적 스트레스를 유발하고, 그 결과 암, 당뇨병, 그리고 비만과 같은 만성질환에 원인이 될 수 있다(Salla et al, 2016). 따라서 체내 유리 라디칼의 생성을 적정 수준으로 유지시키는 것은 만성질환을 예방하는데 중요하다.
만성질환 중 하나인 비만은 체지방이 과도하게 축적된 상태를 일컫는다. 일반적으로 남성은 체지방이 체중의 25% 이상, 여성은 30% 이상일 경우 비만이라고 한다. 비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형 상태이며, 이상지질혈증, 제2형 당뇨병, 그리고 고혈압을 포함하는 만성질환의 유발과 긴밀한 연관성이 있어 건강상 심각 한 위험인자가 될 수 있다(Kim et al., 2014; Park et al., 2008). 일반적으로 지방조직에 존재하는 전지방세포(preadipocytes) 및 전구세포는 지방세포 분화과정(adipocytes differentiation, adipogenesis)을 통해 성숙한 지방세포로 되는 과정을 겪으므로 adipogenesis를 효과적으로 조절하는 것은 비만을 예방 또는 치료하기 위해 중요한 부분이다(Cho et al., 2015).
최근에는 지방축적 억제활성을 가지면서 상대적으로 안전한 천연물 기능성 소재들의 탐색에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이를 활용한 약제 및 식품 개발에 대한 관심이 크다.
이에 본 발명자들은 천연 소재를 바탕으로 비만을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 약제 및 기능성 식품을 개발하고자 하였다.
Zhang DY, Wan Y, Xu JY, Wu GH, Li L, Yao XH. Ultrasound extraction of polysaccharides from mulberry leaves and their effect on enhancing antioxidant activity. Carbohydrate Polymers, 137: 473-479, 2016.
Salla S, Sunkara R, Ogutu S, Walker LT, Verghese M. Antioxidant activity of papaya seed extracts against H2O2 induced oxidative stress in HepG2 cells. LWT-Food Science and Technology, 66: 293-297, 2016.
Kim MO, Song YW, Kim CH, Hwang JK. Kirenol inhibits adipogenesis through activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 445: 433-438, 2014.
Park HG, Kim JM, Kim JM, Chung WY, Yoo YJ, Cha JH, Kim JM. Inhibitory effect of ethyl acetate extract of white peach pericarp on adipogenesis of 3T3-L1 preadipocyte cells. Food Science and Biotechnology, 17: 1327-1331, 2008.
Cho YL, Min JK, Roh KM, Kim, WK, Han BS, Bae KH, Lee SC, Chung SJ, Kang HJ. Phosphoprotein phosphatase 1CB (PPP1CB), a novel adipogenic activator, promotes 3T3-L1 adipogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 467: 211-217, 2015.
따라서 본 발명의 주된 목적은 천연 소재를 바탕으로 하여 안전하며, 비만을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약제 및 기능성 식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 감국(Chrysanthemum indicum Linne) 꽃의 분쇄물 100중량부에 물 500 내지 2000중량부를 첨가하고 110 내지 130℃에서 15 내지 30분간 추출하여 수득한 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 비만의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 비만의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물은 항산화 효과를 나타내며, 전지방세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화하는 과정에서 지방의 축적을 억제하여 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분인 감국 꽃 추출물의 항산화 효과 및 전지방세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화하는 과정에서의 지방축적 억제 효과를 통해 비만을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 감국 꽃 추출물을 제조를 위해 사용된 감국 꽃 분쇄물을 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 감국 꽃 추출물의 금속 킬레이팅 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. 각 그래프 상단의 알파벳(a ~ c)이 다른 것은 Duncan's multiple range test(p<0.05)로 검증한 ANOVA를 기초로 감국 꽃 추출물(CIW)의 서로 다른 농도 사이에 유의적인 차이가 있다는 것 또는 Student's t-test(***p<0.001)를 기초로 대조군(control)과 CuSO4 처리군(CuSO4) 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 감국 꽃 추출물의 환원력 분석 결과를 나타낸 것이다. 각 그래프 상단의 알파벳(a ~ c)이 다른 것은 Duncan's multiple range test(p<0.05)로 검증한 ANOVA를 기초로 감국 꽃 추출물(CIW)의 서로 다른 농도 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실험예에서 전지방세포인 3T3-L1 세포의 분화와 감국 꽃 추출물 처리 방법을 나타낸 것이다. DM: FBS-DMEM, 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 5.2μM dexamethasome(DEX), 및 167nM insulin으로 이루어지는 분화유도배지(differentiation medium), Post-DM: FBS-DMEM 및 167nM insulin으로 이루어지는 분화유도후배지(post differentiation medium).
도 5는 본 발명의 감국 꽃 추출물의 지방세포 지방축적 억제활성 분석 결과를 나타낸 것이다. A는 Day 6에 3T3-L1 지방세포의 ORO 염색을 통해 측정한 지방축적률을 나타낸 것이고, B는 3T3-L1 지방세포의 지방축적을 현미경으로 촬영한 것이다. 각 그래프의 ***는 Student's t-test(***p<0.001)를 기초로 감국 꽃 추출물(CIW) 처리군과 대조군 지방세포 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다. Pre: 3T3-L1 전지방세포(preadipocytes), Adi: Day 6에 성숙한 3T3-L1 지방세포(adipocytes).
도 2는 본 발명의 감국 꽃 추출물의 금속 킬레이팅 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. 각 그래프 상단의 알파벳(a ~ c)이 다른 것은 Duncan's multiple range test(p<0.05)로 검증한 ANOVA를 기초로 감국 꽃 추출물(CIW)의 서로 다른 농도 사이에 유의적인 차이가 있다는 것 또는 Student's t-test(***p<0.001)를 기초로 대조군(control)과 CuSO4 처리군(CuSO4) 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 감국 꽃 추출물의 환원력 분석 결과를 나타낸 것이다. 각 그래프 상단의 알파벳(a ~ c)이 다른 것은 Duncan's multiple range test(p<0.05)로 검증한 ANOVA를 기초로 감국 꽃 추출물(CIW)의 서로 다른 농도 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실험예에서 전지방세포인 3T3-L1 세포의 분화와 감국 꽃 추출물 처리 방법을 나타낸 것이다. DM: FBS-DMEM, 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 5.2μM dexamethasome(DEX), 및 167nM insulin으로 이루어지는 분화유도배지(differentiation medium), Post-DM: FBS-DMEM 및 167nM insulin으로 이루어지는 분화유도후배지(post differentiation medium).
도 5는 본 발명의 감국 꽃 추출물의 지방세포 지방축적 억제활성 분석 결과를 나타낸 것이다. A는 Day 6에 3T3-L1 지방세포의 ORO 염색을 통해 측정한 지방축적률을 나타낸 것이고, B는 3T3-L1 지방세포의 지방축적을 현미경으로 촬영한 것이다. 각 그래프의 ***는 Student's t-test(***p<0.001)를 기초로 감국 꽃 추출물(CIW) 처리군과 대조군 지방세포 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다. Pre: 3T3-L1 전지방세포(preadipocytes), Adi: Day 6에 성숙한 3T3-L1 지방세포(adipocytes).
본 발명의 추출물 제조 사용되는 감국의 학명은 Chrysanthemum indicum Linne이며, 국화과(Compositae) 국화속(Chrysanthemum)에 속하는 여러해살이풀이다.
다른 국화과 또는 국화속에 속하는 식물은 함유 성분에서 감국과 차이가 나타나기 때문에 추출물 제조 시 구별하여 사용할 필요가 있다. 또한 식물체는 그 부위에 따라서도 함유 성분에 차이가 있어 본 발명에서 기대하는 효과를 위해서는 감국의 여러 부위 중에서도 꽃을 사용하여 추출물을 제조할 필요가 있다. 또한 감국은 10월에서 11월까지 수확한 것으로 감국 꽃이 80% 정도 개화 되었을 때의 것을 선택적으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기와 같은 감국의 꽃을 이용하여 꽃의 분쇄물 100중량부에 물 500 내지 2000중량부를 첨가하고 110 내지 130℃에서 15 내지 30분간 추출하는 방법을 사용한다. 이때의 추출조건은 본 발명에서 기대하는 효과를 충분히 나타낼 수 있도록 하는 추출조건으로 이 조건을 벗어날 경우 본 발명에서 목적으로 하는 비만의 예방, 개선 또는 치료 효과가 현저히 낮아질 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 전체 조성물의 중량을 기준으로 상기 추출물을 0.1 내지 90중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능할 것이며, 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명 약제학적 조성물의 일일 투여량은 조성물에 함유된 추출물의 건조중량을 기준으로 체중 1㎏ 당 약 1㎎ 내지 20㎎, 바람직하게는 5㎎ 내지 15㎎일 수 있으며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
이 밖에도 본 발명의 감국 꽃 추출물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물을 이용한 예방 또는 치료 방법은 인간 또는 인간을 제외한 동물에 사용할 수 있다. 이때 투여방법 및 투여량은 상기 약제학적 조성물의 투여방법 및 투여량에 따라 적용될 수 있다.
상기 유효량을 기준으로, 본 발명은 추출물 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 포함하는 기능성 식품을 제공하는데, 상기 식품은 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수의 식품에 포함하여 사용할 수 있다. 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 이의 구체적인 조리 방법이나 생산 방법의 기재는 생략하기로 한다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 약제학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 감국 꽃 추출물 제조
건조된 감국 꽃[광우한약품(Changewon, Korea)]을 분쇄하고, 분쇄물에 10배 중량의 물을 가한 다음 121℃에서 20분간 가열하여 추출하였다. 이후 추출액을 Whatman NO. 2 여과지로 여과한 뒤 여과액을 진공동결건조기(PVTFD-10R; Ilshinbiobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 동결건조하여 -20℃에 보관하면서 이후 분석에 사용하였다.
추출물의 수율은 41.9%(w/w-dry base)로 나타났다.
실험예 1. 금속 킬레이팅 활성 분석
감국 꽃 물 추출물(이하, CIW라 한다)의 금속 킬레이팅 활성은 Mariana의 방법을 일부 변형하여 사용하였다(Mariana et al ., 2003). 이 방법은 calcein을 이용하는 것으로, calcein은 유리 상태일 때 강한 형광값을 나타내지만, Cu2+, Ca2+, Mg2+ 그리고 Zn2+ 등의 2가 이온과 결합하여 복합체를 형성하면 형광값이 감소되는 원리를 이용한 방법이다.
CIW를 10, 50, 100 그리고 500㎍/㎖의 농도로 증류수에 녹인 용액 200㎕와 0.4μM CuSO4 용액 200㎕를 잘 섞어 주었다. 그 후 0.05μM calcein 용액 100㎕를 넣어 다시 섞어주었으며, 형광분석기(GENios; Tecan Trading AG, Salzburg, Austria)를 이용하여 excitation 파장 485㎚와 emission 파장 535㎚에서 형광의 강도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 calcein 용액의 형광값을 대조군으로 하여 CIW의 금속 킬레이팅 활성(% of control)을 계산하였다.
Calcein 자체의 형광값을 대조군 100%로 하여 CuSO4만을 첨가하였을 때 대조군에 비해 53.41% 형광값이 감소한 46.59%의 calcein 형광값을 얻었다. 반면 CIW를 10, 50, 100, 그리고 500㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 calcein 형광값은 53.55%, 69.88% 70.14%, 그리고 75.10%로 CuSO4만을 첨가하였을 때 보다 각각 6.96%, 23.29%, 23.55%, 그리고 28.51% 증가하였다(도 2 참조). 이는 CIW가 Cu2 + 킬레이팅 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
항산화 활성에서 금속 킬레이팅 활성의 중요성은 이전 연구에서 다양하게 보고되었다. 체내 자유 라디칼로 잘 알려진 hydroxyl radical(HO·)은 대표적인 전이금속인 철, 구리 등과 H2O2가 반응하는 Fenton reaction(2가 전이금속 + H2O2 → HO·)에 의해 생성되는데 체내에서 높은 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Wei & Guo, 2007). 그러므로 상기와 같은 결과는 CIW가 금속 킬레이팅 활성으로 인해 2가 전이금속이 H2O2와 반응하는 것을 차단 또는 지연시킴으로써 HO· 생성을 억제시킬 수 있음을 시사한다.
실험예 2. 환원력 분석
CIW의 전자공여능을 환원력으로 평가하였으며, 환원력은 Aruoma의 방법을 일부 변형하여 측정하였다(Aruoma et al ., 1998). 즉, Cu2+ 이온을 CIW가 Cu1+로 환원시키는 능력을 측정하는 방법을 사용하였다.
10, 50, 100 그리고 500㎍/㎖ 농도의 CIW 용액 40㎕에 10mM phosphate buffer(pH 7.4)에 녹인 100μM CuCl2 용액 20㎕와 250μM neocuproin 용액 80㎕를 함께 섞어준 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액의 흡광도를 microplate reader를 이용하여 454㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 Cu+1/neocuproin의 extinction coefficient(7.95×103M-1cm-1)를 사용하여 흡광도로부터 계산된 Cu+1의 농도로서 환원력을 표시하였다.
CIW의 환원력을 측정한 결과, 10, 50, 100 그리고 500㎍/㎖의 CIW는 Cu2+를 각각 4.36, 13.04, 22.3, 그리고 23.19μM 수준으로 Cu1+로 환원시켰으며, CIW 농도가 증가할수록 Cu2+에 대한 환원력은 유의적으로 증가하였다(도 3 참조). 이 결과는 CIW가 전자공여능을 통해 불안정한 상태의 산화물질을 안정화시키는 항산화 효과가 있음을 시사한다.
실험예
3. 세포독성 및 지방축적 억제활성 분석
3-1. 세포배양(3T3-L1 및 HSF) 및 지방세포분화
감국 꽃 추출물의 세포독성 및 지방축적 억제활성을 분석하기 위하여 3T3-L1 및 HSF(human skin fibroblasts) 세포를 이용하였다. 이중 3T3-L1 세포는 분화 유도호르몬(adipocytes differentiation hormonal cocktail)의 처리로 지방세포로 분화하는 일종의 섬유아세포이다.
3T3-L1 전지방세포는 DMEM 배지에 10% BCS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 100% 가득 찬 상태(confluent)로 될 때까지 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 3T3-L1 세포의 지방세포 분화와 CIW 처리는 도 4에 나타내었다. 3T3-L1 전지방세포가 세포배양접시에 100% 자랐을 때를 Day -2라고 표기하였다. 분화유도 배지(Differentiation medium; DM)를 이용하여 지방세포 분화를 유도한 날을 Day 0라고 표기하였으며, 분화유도 배지는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에 500μM의 IBMX, 5.2μM의 DEX, 그리고 167nM의 insulin을 포함하여 Day 0부터 Day 2까지 48시간 동안 처리하였고, 분화유도 후 배지(Post-differentiation medium; Post-DM)는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에 167nM의 insulin만을 추가하여 Day 2에서 Day 4까지 사용하였다. 이후 DMEM 배지에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 후 Day 4에서 Day 6까지 사용하였으며 Day 6에 지방세포 분화를 종료하였다(도 4 참조).
HSF 세포는 DMEM배지에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였으며, 2일마다 배지를 교체하였다.
3-2. 세포독성 평가
3T3-L1 세포 및 HSF 세포에서 CIW의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 3T3-L1 세포와 HSF에 CIW를 10, 50, 100, 200, 400 그리고 800㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리한 후, PBS에 용해된 MTT 시약을 최종농도 200㎍/㎖가 되도록 DMEM 배지에 희석하여 추가로 37℃ incubator에서 1시간 배양하였다. 반응이 끝난 후 배지를 완전히 제거하고 DMSO 300㎕를 첨가하여 보라색의 formazan을 용해시킨 후 96-well plate에 100㎕씩 넣어 microplate reader(VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아무것도 처리되지 않은 3T3-L1 세포와 HSF의 흡광도를 대조군으로 하여 세포 독성(% of control)을 평가하였다.
이의 결과, 3T3-L1 세포에서는 각각 96.40%, 100.90%, 112.97%, 107.03%, 101.62%, 그리고 97.77%로 대조군과 비교하여 세포생존율에 유의적인 영향을 미치지 않았다(표 1 참조). 그러나 HSF 세포의 경우 10, 50, 그리고 100㎍/㎖ 농도에서는 각각 세포생존율이 93.37%, 102.24%, 그리고 86.70%로 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 없었으나, 200, 400, 그리고 800㎍/㎖ CIW 처리군에서 각각 75.34%, 77.14%, 그리고 84.93%로 유의적인 세포독성이 발견되었다. 따라서 이후 실험에서는 세포독성이 발견되지 않은 100㎍/㎖ 이하의 CIW를 사용하였다.
농도(㎍/㎖) | 3T3-L1 세포(% of control) | HSF 세포(% of control) |
10 | 96.40±2.56 | 93.37±7.02 |
50 | 100.90±3.20 | 102.24±4.38 |
100 | 112.97±5.94 | 86.70±5.28 |
200 | 107.03±1.07 | 75.34±7.73* |
400 | 101.62±0.12 | 77.14±7.51* |
800 | 97.77±4.72NS | 84.93±2.71* |
NS : not significant
* : Student's t-test 상에서 대조군과 CIW 처리 세포의 사이에 유의적인 차이가 있다는 것을 나타냄(*p<0.05)
3-3. 지방축적 억제활성
CIW가 3T3-L1 세포의 adipogenesis 과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 ORO 염색법을 통해 평가하였다.
CIW는 3T3-L1 전지방세포에 10, 50, 그리고 100㎍/㎖의 농도로 Day -2에서 Day 6까지 총 8일 동안 처리하였으며, ORO 염색은 Day 6에 실시하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포는 실온에서 30분 동안 3.7%(v/v) formaldehyde를 사용하여 고정시켰다. 고정된 3T3-L1 지방세포는 3㎎/㎖의 ORO를 이용하여 실온에서 15분 동안 염색시켰다. 지방 세포내 지방구와 결합된 ORO는 DMSO를 사용하여 용해시키 고 96-well plate에 100㎕/well씩 옮겨 microplate reader를 이용하여 510㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 Day 6의 3T3-L1 지방세포를 대조군으로 하여 지방 축적률(% of control)을 계산하였다. 또한 CIW의 처리가 3T3-L1 지방세포의 지방구 수 및 크기에 미치는 영향을 분석하였다. CIW는 위의 방법과 동일하게 처리하였으며, 3T3-L1 세포의 지방구 수 및 크기는 Day 6에 현미경을 통해 관찰하였다.
10, 50, 그리고 100㎍/㎖ 농도로 CIW를 처리한 결과, 아무것도 처리하지 않은 Day 6의 지방세포를 100%로 하였을 때 CIW 처리군은 각각의 농도에서 94.83%, 27.20%, 그리고 -4.09%로 농도 의존적이며 유의적인 adipogenesis 억제활성을 나 타냈다(도 5의 A 참조). 또한 분화시키지 않은 3T3-L1 전지방세포에서는 지방구가 발견되지 않았으며 지방세포 분화를 유도시킨 대조군 지방세포에서는 다량의 지방구가 형성된 것을 확인하였다(도 5의 B 참조). CIW를 10, 50, 그리고 100㎍/㎖ 농도로 처리했을 때 도 5의 A 결과와 유사하게 세포내 지방구의 수 및 크기가 유의적으로 감소된 것이 관찰되었다. 이와 같은 결과는 CIW가 비만의 예방, 개선 및 치료에 효과적이라는 것을 나타낸다.
통계분석
상기 실험결과 데이터는 평균±표준편차로 표현하였으며, 데이터의 통계 처리는 SPSS software(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. 그룹간의 유의성을 평가하기 위하여 일원 배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 실시하였으며, 사후검증은 Duncan's multiple range test(p<.05) 또는 Student's t-test 방법을 통해 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다(*p<0.05, 그리고 ***p<0.001).
Claims (4)
- 감국(Chrysanthemum indicum Linne) 꽃의 분쇄물 100중량부에 물 500 내지 2000중량부를 첨가하고 110 내지 130℃에서 15 내지 30분간 추출하여 수득한 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 항산화 효과를 나타내며, 전지방세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화하는 과정에서 지방의 축적을 억제하여 비만을 예방 및 치료하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물. - 감국(Chrysanthemum indicum Linne) 꽃의 분쇄물 100중량부에 물 500 내지 2000중량부를 첨가하고 110 내지 130℃에서 15 내지 30분간 추출하여 수득한 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 조성물은 항산화 효과를 나타내며, 전지방세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화하는 과정에서 지방의 축적을 억제하여 비만을 예방 및 치료하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
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KR1020160073861A KR20170140995A (ko) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | 감국 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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KR102139443B1 (ko) | 2020-03-27 | 2020-07-29 | 연성대학교 산학협력단 | 감국 발효물을 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 억제용 조성물 |
KR20200094435A (ko) * | 2019-01-30 | 2020-08-07 | 주식회사 비티씨 | 비배당체 함량이 증가된 감국 효소처리 추출물의 제조방법 및 이로 제조된 비만 예방 또는 치료용 조성물 |
-
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- 2016-06-14 KR KR1020160073861A patent/KR20170140995A/ko active Search and Examination
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