KR20170138481A - 외음질 칸디다증, 질편모충증 및 세균성 질염의 복합 검출 방법 - Google Patents
외음질 칸디다증, 질편모충증 및 세균성 질염의 복합 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
외음질 칸디다증(VVC), 질편모충증 및 세균성 질염(BV)의 검출을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플 중의 VVC-연관 칸디다(Candida), 트리코모나스 발지날리스(Trichomonas valginalis), 및 다수의 BV-관련 박테리아의 존재 또는 부재는 복합 핵산-기반 시험법을 사용하여 결정된다.
Description
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 2015년 4월 24일자로 출원된 U.S. 임시특허 출원 제62/152754호; 및 2016년 1월 15일자로 출원된 U.S. 임시특허 출원 제62/279220호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 관련 출원들의 내용은 명백히 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 포맷으로 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2016년 4월 20일자로 작성된 SEQLISTING_GENOM.143WO.TXT라는 이름의 파일로 제공되며, 크기는 36Kb이다. 서열 목록의 전자 포맷의 정보는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 질 질환, 예를 들면, 외음질 칸디다증(VVC), 질편모충증, 및 세균성 질염(BV)의 검출을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산-기반 시험법에 의한 질염 및/또는 질증의 임상 증상을 가진 여성으로부터의 질 면봉 샘플과 같은 생물학적 샘플에서의 VVC-연관 칸디다(Candida) 종, 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis )(T. vaginalis) 및 다수의 BV-관련 박테리아의 검출에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
칸디다(Candida)는 효모 속이며 전세계적인 진균 감염의 가장 흔한 원인이다. 여러 칸디다 종은 무해한 공생체로서 숙주의 정상 세균총의 일부로 밝혀졌으며 인간을 포함한 숙주의 내공생자(endosymbiont)일 수 있다. 그러나, 숙주의 불균형 또는 면역약화의 경우, 칸디다가 침입하여 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 칸디다 알비칸스(C. albicans), 칸디다 두블리니엔시스(C. dubliniensis), 칸디다 트로피칼리스(C. tropicalis), 칸디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 칸디다 크루세이(C. krusei), 및 칸디다 글라브라타(C. glabrata)와 같은 몇몇 칸디다 종은 외음질 칸디다증(VVC)과 연관되는 것으로 알려져 있다. 트리코모나스 바지날리스는 혐기성의 편모 원생 기생충이며, 이것은 질편모충증의 원인 인자이다. 세균성 질염(BV)은 질에서 박테리아의 정상적 균형의 변화에 의해 유발되는 질 감염이다.
지금까지, VVC, 질편모충증, 및 BV를 진단하기 위한 표준 검사들은 해석 방법인 다수의 주관적 방법에 의존한다. 이들 검사는 전형적으로 VVC의 경우 곰팡이 균사 또는 출아 효모의 관찰 및 질편모충증의 경우 운동성 트리코모나스의 관찰을 포함하여, 환자 샘플(e.g., 질 분비물)의 젖은 표본 제제의 현미경 검사를 포함한다. 뉴젠트 스코어(Nugent Score) 및 암셀 기준(Amsel's criteria)이 BV를 진단하기 위해 가장 흔히 사용되는 검사이다. 뉴젠트 스코어는 큰 그람-양성 막대균(Lactobacillus morphotypes), 작은 그람-부정 막대균(Gardnerella vaginalis morphotypes), 및 굽은 그람-부정 막대균(Mobiluncus spp. morphotypes)의 존재에 대해 평가함으로써 계산될 수 있는 그람 염색 스코어링 시스템이다. 암셀 기준은 진단 확인을 나타내기 위해 다음의 네 가지 기준 중의 적어도 세 가지를 필요로 한다: (1) 묽은 백색, 황색의 균질한 분비물, (2) 현미경 상에서 실타래상 세포(clue cell), (3) 질액의 pH > 4.5, 및 (4) 알칼리-10% 수산화칼륨(KOH) 용액 첨가시 비린내 방출. 이러한 표준 검사들은 고가이며, 노동 집약적이고, 시간 소모적일 수 있으며, 예를 들면, 칸디다는 진단이 이루어질 수 있기 전에 발색 배지에서 48시간 동안 또는 덜 선택적인 배지에서 7일 이하 동안 배양할 필요가 있다.
따라서, 외음질 칸디다증, 질편모충증 및 세균성 질염을 검출하기 위한 보다 효율적이고 신속한 방법, 예를 들면, 환자에게 적절한 치료를 효과적으로 전달하기 위해 단일 검정으로 세 가지 질 질환을 검출할 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구된다.
본원에는 외음질 칸디다증(VVC), 질편모충증, 및/또는 세균성 질염(BV)을 검출하기 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다.
하나의 측면에서, 생물학적 샘플에서 다수의 BV-관련 박테리아를 검출하는 방법이 개시되어 있으며, 여기서 다수의 BV-관련 박테리아는 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 아토포비움 바지나에(Atopobium vaginae), 메가스파에라(Megasphaera) 타입 1, 및 BVAB2를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
상기 생물학적 샘플을 다수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계[여기서, 다수의 프라이머 쌍은 다음을 포함한다:
락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열, 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다), 및
아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)];
생물학적 샘플이 BV-관련 박테리아 중의 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 생물학적 샘플로부터 아토포비움 바지나에, BVAB2, 메가스파에라 타입 1, 및/또는 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 서열의 앰플리콘, 및/또는 가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
상기 생물학적 샘플에서 BV-관련 박테리아의 존재의 표시로서 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계.
몇몇 실시형태에서, "접촉시키는" 단계는 상기 생물학적 샘플 및 상기 프라이머를 DNA 폴리머라제, 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌을 포함한 다수의 유리 뉴클레오타이드, 및/또는 완충제와 접촉시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산은 이중 가닥 DNA를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 반응 혼합물은 임의로 2가 양이온, 1가 양이온 칼륨 이온, 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 프로브, 및/또는 이들의 임의의 조합을 추가로 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, "앰플리콘을 생성하는" 단계는 (a) 생물학적 샘플 중에 또는 핵산 중에 존재하는 이중 가닥 DNA의 가닥을 분리하기 위해 반응 혼합물을 제1의 소정 기간 동안 제1의 소정 온도로 가열하는 단계, (b) 반응 혼합물을 프라이머가 이들의 상보적 서열과 혼성화되도록 하고 DNA 폴리머라제가 프라이머를 연장시키도록 하는 조건하에서 제2의 소정 시간 동안 제2의 소정 온도로 냉각시키는 단계, 및 (c) 단계 (a) 및 (b)를 적어도 10 내지 12회 반복하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단계 (a) 및 (b)는 적어도 15, 20, 22 또는 25회 반복된다.
몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 샘플이다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 요도, 음경, 항문, 인후, 자궁경부, 또는 질로부터 수집된다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 시료로부터 추출된 DNA, RNA 또는 전체 핵산이다.
몇몇 실시형태에서, 다수의 프라이머 쌍은 서열 번호 1의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열 번호 2의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열 번호 8의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열 번호 10의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 서열 번호 11의 서열을 포함하는 제8 프라이머, 서열 번호 12의 서열을 포함하는 제9 프라이머, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 제10 프라이머, 및 서열 번호 15의 서열을 포함하는 제11 프라이머를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 1 및 2이고; BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 4 및 5이며; 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 7 및 8이고; 가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은: a) 서열 번호 10 및 12, 또는 b) 서열 번호 11 및 12이며; 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 1 및 2이다.
몇몇 실시형태에서, 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 고리-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 변위 증폭 (SDA), 레플리카아제-매개 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-유지 서열 복제 (3SR), 회전 환 증폭, 및 전사-매개 증폭 (TMA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들면, PCR은 실시간 PCR일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, PCR은 정량적 실시간 PCR(QRT-PCR)이다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머는 증폭 자체에는 상당한 영향 없이 증폭 산물의 증폭후 조작을 가능케 하는 외생 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머에는 5' 말단에 형광단 및 3' 말단에 형광 켄처(fluorescence quencher)를 포함하는 상보적 서열이 측면에 있다(flanked).
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계는 증폭된 산물을 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브 중의 적어도 하나는 형광 이미터 모이어티(fluorescence emitter moiety) 및 형광 켄처 모이어티(fluorescence quencher moiety)를 포함한다.
본 발명은 또한 다수의 BV-관련 박테리아의 검출을 위한 조성물을 제공하며, 여기서, 다수의 BV-관련 박테리아는 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 젠세니이, 가드네렐라 바지날리스, 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1, 및 BVAB2를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 다음을 포함한다:
락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다), 및
아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다).
몇몇 실시형태에서, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 1의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 2의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; BVAB2a의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 4의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 5의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하며; 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 7의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 10의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하며; 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 12의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 15의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
조성물은, 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 프로브 중의 적어도 하나는 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 외음질 칸디다증(VVC)-연관 칸디다 종 및 트리코모나스 발지날리스를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 VVC-연관 칸디다 종은 칸디다 글라브라타(Candida glabrata ), 칸디다 알비 칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 두블 리니엔시스(C. dubliniensis), 칸디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 칸디다 크 루세이(C. krusei)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
상기 생물학적 샘플을 다수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계[여기서, 다수의 프라이머 쌍은 다음을 포함한다:
칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 다수의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25의 서열, 또는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및
트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 서열, 또는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)]; 및
상기 생물학적 샘플이 VVC-연관 칸디다 종 및/또는 트리코모나스 바지날리스 중의 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 생물학적 샘플로부터 칸디다 종의 tef1 서열의 앰플리콘 및/또는 트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
상기 생물학적 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종 및 트리코모나스 바지날리스의 존재의 표시로서 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계.
몇몇 실시형태에서, "접촉시키는" 단계는 상기 생물학적 샘플 및 상기 프라이머를 DNA 폴리머라제, 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌을 포함한 다수의 유리 뉴클레오타이드, 및/또는 완충제와 접촉시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 생물학적 샘플로부터 추출된 핵산은 이중 가닥 DNA를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 반응 혼합물은 임의로 2가 양이온, 1가 양이온 칼륨 이온, 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 프로브, 및/또는 이들의 임의의 조합을 추가로 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, "앰플리콘을 생성하는" 단계는 (a) 생물학적 샘플 중에 또는 핵산 중에 존재하는 이중 가닥 DNA의 가닥을 분리하기 위해 반응 혼합물을 제1의 소정 기간 동안 제1의 소정 온도로 가열하는 단계, (b) 반응 혼합물을 프라이머가 이들의 상보적 서열과 혼성화되도록 하고 DNA 폴리머라제가 프라이머를 연장시키도록 하는 조건하에서 제2의 소정 시간 동안 제2의 소정 온도로 냉각시키는 단계, 및 (c) 단계 (a) 및 (b)를 적어도 10 내지 12회 반복하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단계 (a) 및 (b)는 적어도 15, 20, 22 또는 25회 반복된다.
몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 샘플이다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 요도, 음경, 항문, 인후, 자궁경부, 또는 질로부터 수집된다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임상 시료로부터 추출된 DNA, RNA 또는 전체 핵산이다.
몇몇 실시형태에서, 다수의 프라이머 쌍은 서열 번호 20의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열 번호 21의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열 번호 23의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열 번호 24의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열 번호 25의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열 번호 27의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열 번호 28의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 서열 번호 17의 서열을 포함하는 제8 프라이머, 및 서열 번호 18의 서열을 포함하는 제9 프라이머를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 20 및 21이고; 칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 a) 서열 번호 23 및 24, b) 서열 번호 23 및 35, 또는 c) 이들의 조합이고; 칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 27 및 28로 이루어지고; 트리코모나스 바지날리스의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 17 및 18이다.
몇몇 실시형태에서, 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 고리-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 변위 증폭 (SDA), 레플리카아제-매개 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-유지 서열 복제 (3SR), 회전 환 증폭, 및 전사-매개 증폭 (TMA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들면, PCR은 실시간 PCR일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, PCR은 정량적 실시간 PCR(QRT-PCR)이다.
몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머는 증폭 자체에는 상당한 영향 없이 증폭 산물의 증폭후 조작을 가능케 하는 외생 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머에는 5' 말단에 형광단 및 3' 말단에 형광 켄처를 포함하는 상보적 서열이 측면에 있다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계는 증폭된 산물을 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브 중의 적어도 하나는 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함한다.
또한 본원에는 생물학적 샘플에서 외음질 칸디다증(VVC)-연관 칸디다 종 및 트리코모나스 바지날리스의 검출을 위한 조성물이 개시되며, 여기서 VVC-연관 칸디 다 종은 칸디다 글라브라타 , 칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 칸디다 파랍실로시스 , 칸디다 크루세이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 다음을 포함한다:
칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스, 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 다수의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25의 서열, 또는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및
트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 서열, 또는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다).
몇몇 실시형태에서, 칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 21의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 다수의 프라이머는 서열 번호 23의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 24의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 25의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 27의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 28의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 17의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 18의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 프로브 중의 적어도 하나는 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 가드네렐라 바지날리스의 바지놀리신 유전자(vly)에 혼성화할 수 있는 약 100개 이하 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 제공하며, 여기서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어진다.
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본원에는 외음질 칸디다증(VVC), 질편모충증, 및 세균성 질염(BV)의 검출을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 예를 들면, VVC와 연관된 칸디다 종, 트리코모나스 바지날리스(T. vaginalis) 및 BV-관련 박테리아의 특정 유전자에 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플과 같은 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종, 트리코모나스 바지날리스 및 BV-관련 박테리아의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 복합 핵산 증폭은 단일 검정으로 VVC-연관 칸디다 종, 트리코모나스 바지날리스 및 BV-관련 박테리아의 검출을 가능케 하기 위해 수행될 수 있다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 핵산 골격 결합(e.g., 포스포디에스테르 결합)에 의해 함께 연결되어 폴리뉴클레오타이드를 형성하는, 질소계 헤테로사이클릭 염기, 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 중합체성 화합물을 말한다. 핵산의 비제한적인 예는 RNA, DNA, 및 이의 유사체를 포함한다. 핵산 골격은 단일 올리고뉴클레오타이드 내에 다양한 결합들, 예를 들면, 당-포스포디에스테르 결합, 펩타이드-핵산 결합, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 결합 또는 이러한 결합의 혼합물 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 핵산 중의 당 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스, 또는 알려진 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 통상의 질소계 염기(e.g., A, G, C, T, U), 알려진 염기 유사체(e.g., 이노신), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 유도체 및 "비염기성(abasic)" 잔기(즉, 하나 이상의 골격 위치에 대한 질소계 염기가 없음)가 용어 핵산에 포함된다. 즉, 핵산은 RNA 및 DNA에서 발견되는 통상의 당, 염기 및 결합 만을 포함할 수 있거나, 통상의 성분 및 치환 둘 다(e.g., 메톡시 골격을 통해 연결된 통상의 염기 및 유사체, 또는 RNA 또는 DNA 골격을 통해 연결된 통상의 염기 및 하나 이상의 염기 유사체)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산을 단리하다(isolate nucleic acid)"는 하나 이상의 세포 성분으로부터의 핵산의 정제를 말한다. 당업계의 숙련가는 그것으로부터 "핵산을 단리"하도록 가공된 샘플이 핵산 이외의 성분 및 불순물을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 단리된 핵산을 포함하는 샘플은 당업계에 공지된 임의의 허용 가능한 방법을 사용하여 시료로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 세포는 공지된 용해제를 사용하여 용해될 수 있으며, 핵산은 다른 세포 성분으로부터 정제되거나 부분 정제될 수 있다. DNA 및 RNA 추출에 적합한 시약 및 프로토콜은, 예를 들면, 각각 U.S. 특허 출원 공개 US 제2010-0009351호, 및 US 제2009-0131650호(이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다)에서 찾아볼 수 있다. 핵산 시험(e.g., 아래에서 더욱 상세하게 논의되는 증폭 및 혼성화 방법)에서, 추출된 핵산 용액을 본원에 개시된 실시형태들에 따라 시험을 수행하는데 필요한 시약에(e.g., 아래에 더욱 상세하게 논의된 바와 같이 액체로, 기질에 결합되어, 동결건조된 형태 등으로) 직접 첨가할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "주형(template)"은 적어도 하나의 표적 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프라이머"는 핵산 연쇄 연장 반응을 개시하는 역할을 할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 프라이머의 길이는, 예를 들면, 약 5 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 약 10 내지 약 50개 뉴클레오타이드, 약 15 내지 약 40개 뉴클레오타이드, 또는 약 20 내지 약 30개 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. 프라이머의 길이는 약 10개 뉴클레오타이드, 약 20개 뉴클레오타이드, 약 25개 뉴클레오타이드, 약 30개 뉴클레오타이드, 약 35개 뉴클레오타이드, 약 40개 뉴클레오타이드, 약 50개 뉴클레오타이드, 약 75개 뉴클레오타이드, 약 100개 뉴클레오타이드, 또는 이러한 값들 중의 어느 두 개 사이의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 10 내지 약 50개 뉴클레오타이드, 즉, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 18 내지 32개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로브"는 혼성화를 가능케 하는 조건하에 핵산에서 표적 서열에 (e.g., 특이적으로) 혼성화되어 표적 서열 또는 증폭된 핵산을 검출할 수 있게 하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 프로브의 "표적"은 일반적으로 표준 수소 결합(즉, 염기 쌍형성)에 의해 프로브 올리고머의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화되는 증폭된 핵산 서열 내의 서열 또는 이의 서브세트를 말한다. 프로브는 표적-특이 서열 및 프로브의 삼차원 배위에 기여하는 기타의 서열을 포함할 수 있다. 서열은 이들이 프로브의 표적-특이 서열에 완전히 상보적이지 않은 표적 서열에 대해 프로브 올리고머의 적합한 혼성화 조건에서 안정한 혼성화를 가능케 한다면 "충분히 상보적"이다. 프로브의 길이는, 예를 들면, 약 5 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 약 10 내지 약 50개 뉴클레오타이드, 약 15 내지 약 40개 뉴클레오타이드, 또는 약 20 내지 약 30개 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. 프로보의 길이는 약 10개 뉴클레오타이드, 약 20개 뉴클레오타이드, 약 25개 뉴클레오타이드, 약 30개 뉴클레오타이드, 약 35개 뉴클레오타이드, 약 40개 뉴클레오타이드, 약 50개 뉴클레오타이드, 약 100개 뉴클레오타이드, 또는 이러한 값들 중의 어느 두 개 사이의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 10 내지 약 50개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 예를 들면, 프라이머 및 또는 프로브는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 비-서열 특이적일 수 있다.
바람직하게는, 프라이머 및/또는 프로브는 길이가 8 내지 45개 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들면, 프라이머 및 또는 프로브는 길이가 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 프라이머 및 프로브는 5' 또는 3' 말단에, 또는 둘 다에 추가의 뉴클레오타이드를 함유하도록 변형될 수 있다. 당업계의 숙련가는 증폭 프라이머(반드시 프로브는 아님)의 3' 말단의 추가의 염기가 일반적으로 주형 서열에 상보적임을 인지할 것이다. 프라이머 및 프로브 서열은 또한 5' 또는 3' 말단에 뉴클레오타이드를 제거하도록 변형될 수 있다. 당업계의 숙련가는 증폭을 위해 작용하기 위해서는 프라이머 또는 프로브가 본원에 개시된 바와 같은 최소의 길이와 어닐링 온도를 가짐을 인지할 것이다.
프라이머 및 프로브는 어닐링 온도에서 이들의 표적에 결합할 수 있으며, 이것은 용융 온도(Tm) 미만의 온도이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "Tm" 및 "용융 온도"는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 분자의 집단의 50%가 단일 가닥으로 해리되는 온도를 말하는 상호교환 가능한 용어이다. 폴리뉴클레오타이드의 Tm을 계산하기 위한 공식은 당업게에 널리 알려져 있다. 예를 들면, Tm은 하기 방정식에 의해 계산될 수 있다: Tm = 69.3+0.41×(G+C)%-6-50/L, 여기서, L은 뉴클레오타이드에서의 프로브의 길이이다. 하이브리드 폴리뉴클레오타이드의 Tm은 또한 1M 염에서의 혼성화 검정으로부터 채택된 공식을 사용하여 추정될 수 있으며, PCR 프라이머에 대한 Tm을 계산하는데 흔히 사용된다: [(A+T의 수) × 2℃ + (G+C의 수) × 4℃]. 문헌[C. R. Newton et al. PCR, 2nd ed., Springer-Verlag (New York: 1997), p.24 (전문이 본원에 참고로 포함됨)]을 참조한다. 또 다른 더욱 정교한 계산법이 당업계에 존재하며, 이것은 Tm의 계산을 위해 구조적 특징 뿐만 아니라 서열 특징도 고려한다. 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브와 결합 서열 간의 상보성, 및 염 조건에 따라 좌우될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브는 50mM KCl, 10mM Tris-HCl 완충액에서 약 90℃ 미만, 예를 들면 열거된 값들 중의 어느 두 개 사이의 범위를 포함하여 약 89℃, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39℃, 또는 그 미만의 Tm을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 프라이머, e.g., 증폭 프라이머는, 예를 들어, 전방향 프라이머 및 후방향 프라이머(제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머)를 포함하는 증폭 프라이머 쌍으로서 제공될 수 있다. 바람직하게는, 전방향 및 후방향 프라이머는 10℃ 이상 차이나지 않는, 예를 들면, 10℃ 미만, 9℃ 미만, 8℃ 미만, 7℃ 미만, 6℃ 미만, 5℃ 미만, 4℃ 미만, 3℃ 미만, 2℃ 미만, 또는 1℃ 미만으로 차이나는 Tm을 갖는다.
프라이머 및 프로브 서열은, 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되기에 충분한 상보성을 함유하는 한, 올리고뉴클레오타이드 서열 내에 (표적 서열에 대한) 뉴클레오타이드 치환을 가짐으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 적어도 1, 2, 3, 4개, 또는 최대 약 5개 뉴클레오타이드가 치환될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보적"은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 영역 간의 또는 동일한 폴리뉴클레오타이드 가닥의 두 개의 영역 간의 서열 상보성을 말한다. 두 개의 영역이 역평행 방식으로 정렬되는 경우, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 제2 영역의 염기와 염기 쌍을 형성할 수 있다면, 폴리뉴클레오타이드의 제1 영역은 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오타이드의 제2 영역에 상보적이다. 따라서, 두 개의 상보적 폴리뉴클레오타이드가 모든 뉴클레오타이드 위치에서 염기 쌍을 형성할 필요는 없다. "완전 상보적(fully complementary)"은 제2 폴리뉴클레오타이드에 100% 또는 "완전" 상보적이어서 모든 뉴클레오타이드 위치에서 염기 쌍을 형성하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 말한다. "부분 상보적"은 또한 100% 상보적인 것은 아니며(e.g., 90%, 또는 80% 또는 70% 상보적) 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치에 미스매치된 뉴클레오타이드를 함유하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 범용 염기(universal base)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "외생(exogenous) 뉴클레오타이드 서열"은 표적 뉴클레오타이드 서열이 복제되는 원래의 주형에서는 발견되지 않는 배열로 외생 뉴클레오타이드 서열 및 표적 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 증폭에 사용되는 프라이머 또는 프로브에 의해 도입되는 서열을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 분자에 적용되는 "서열 동일성(sequence identity)" 또는 "동일한 퍼센트"는 서열 동일성의 일부로서 임의의 핵산 잔기 치환을 고려하지 않고서 최대 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬한 후 대상 핵산 분자 서열과 동일한 후보 핵산 분자 서열에서의 핵산 잔기의 백분율이다. 핵산 서열 동일성은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 CLUSTALW, T-COFFEE, BLASTN을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "충분히 상보적인"은 일련의 상보적 염기들 간의 수소 결합에 의해 다른 염기 서열에 혼성화할 수 있는 인접 핵산 염기 서열을 말한다. 상보적 염기 서열은 표준 염기 쌍형성(e.g., G:C, A:T 또는 A:U)을 사용함으로써 올리고머 서열에 각 위치에서 상보적일 수 있거나, 상보적이지는 않지만(비염기 위치를 포함함), 전체 상보적 염기 서열이 적절한 혼성화 조건에서 다른 염기 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 잔기를 함유할 수 있다. 인접 염기들은 올리고머가 혼성화하고자 하는 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 100% 상보적일 수 있다. 실질적으로 상보적인 서열은, 기준 서열(reference sequence)에 비해, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 또는 그 미만, 또는 이들 사이의 임의의 숫자의 동일성 퍼센트에 이르는 서열을 나타낼 수 있다. 숙련가는 염기 서열 조성에 기초하여 예측될 수 있는 적절한 혼성화 조건을 용이하게 선택할 수 있거나, 일반적인 실험에 의해 결정할 수 있다(문헌 참조; Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "멀리플렉스 PCR"은 하나 이상의 프라이머 세트가 하나의 단일 표적, 또는 둘 이상의 상이한 표적이 단일 반응관에서 증폭될 수 있도록 하는 반응에 포함되는 PCR의 한 유형을 말한다. 멀티플렉스 PCR은, 예를 들면, 실시간 PCR일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 조성물
본원에 기재된 바와 같이, 핵산 증폭은 샘플 중의 칸디다 종, 트리코모나스 바지날리스, 및/또는 BV-관련 박테리아의 존재, 부재 및/또는 수준을 결정하기 위해 수행될 수 있다. C . 알비칸스 , C. 두블리니엔시스 , C. 트로피칼리스 , C. 파랍실로시스 , C. 크루세이 , 및 C. 글라브라타를 포함하지만 이에 제한되지 않는 일부 칸디다 종은 VVC와 연관된 것으로 알려져 있다. 락토바실러스 균주(예를 들면 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) 및 락토바실러스 젠세니이(L. jensenii)), 가드네렐라 바지날리스(G. vaginalis), 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1(Megasphaera -1), 및 BVAB -2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 박테리아가 또한 BV와 관련된 것으로 알려져 있다. 몇몇 실시형태에서, VVC-연관 칸디다 종, T. 발지날리스, 및 BV-관련 박테리아의 존재, 부재 및/또는 수준은 DNA 증폭과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 표적 유기체 각각의 하나 이상의 표적 유전자를 검출함으로써 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 멀티플렉스 PCR은 표적 칸디다 종, T. 발지날리스, 및/또는 BV-관련 박테리아 각각에 대해 존재, 부재 또는 수준을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 멀티플렉스 PCR은 표적 VVC-연관 칸디다 종, T. 발지날리스, L. 크리스파투스, L. 제세니이, G. 바지날리스, 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1, 및 BVAB -2의 각각에 대해 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, VVC-연관 칸디다 종은 C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이 , 및 C. 글라브라타이다.
각각의 표적 VVC-연관 칸디다 종, T. 발지날리스, 및 BV-관련 박테리아는 DNA 증폭에서 별도의 채널을 사용하여 검출될 수 있다. 몇몇 경우에, VVC-연관 칸디다 종, T. 발지날리스, 및 BV-관련 박테리아 중의 둘 이상의 존재, 부재, 및/또는 수준을 검출하기 위해 단일 형광 채널을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 단일 형광 채널은 두 가지 BV-관련 박테리아(e.g., BVAB -2 및 메가스파에라-1)의 존재, 부재, 및/또는 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 조합은, 몇몇 실시형태에서, 실험을 수행하는데 필요한 시약의 양을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 BV 결정을 평가할 수 있는 정확한 정성적 계량법을 제공할 수 있다. 특정 이론에 결부됨이 없이, 조합된 마커의 사용은 검정의 감도 및 특이성을 증가시킬 수 있는 것으로 믿어진다. 몇몇 실시형태에서, 별도의 형광 채널이 각각의 락토바실러스 균주(예를 들면 L. 크리스파투스 및 L. 제세니이), G. 바지날리스, 및 아토포비움 바지나에의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하는데 사용되며, 단일 형광 채널이 BVAB -2 및 메가스파에라-1의 존재, 부재, 및/또는 수준을 검출하는데 사용된다.
VVC-연관 칸디다 종, T. 발지날리스, L. 크리스파투스, L. 제세니이, G. 바지날리스, 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1(메가스파에라 -1), 및 BVAB -2에서 표적 유전자 영역에 (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, e.g., 표준 PCR 조건, 및/또는 엄격한 혼성화 조건하에서) 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 증폭 프라이머 및 프로브), 또는 이의 보체가 제공된다. 샘플(예를 들어, 질 면봉 샘플)에서 유기체의 표적 유전자 영역의 증폭이, 몇몇 실시형태에서, 샘플에서 유기체의 존재, 부재, 및/또는 수준을 나타낼 수 있다.
표적 유전자 영역은 변할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 유기체에서 16S 리보솜 RNA(16S rRNA)를 암호화하는 유전자 영역에 (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어, 표준 PCR 조건, 및/또는 엄격한 혼성화 조건하에서) 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 유기체는 아토포비움 바지나에이다. 몇몇 실시형태에서, 유기체는 BVAB2이다. 몇몇 실시형태에서, 유기체는 메가스파에라 타입 1이다. 몇몇 실시형태에서, 유기체는 L. 크리스파투스이다. 몇몇 실시형태에서, 미생물은 L. 제세니이이다. 몇몇 실시형태에서, 16S rRNA 유전자는 샘플 중의 아토포비움 바지나에, BVAB-2, 메가스파에라 타입 1, L. 크리스파투스, 및/또는 L. 제세니이의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위해 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. BVAB -2에서 16S rRNA 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 4-6 및 서열 번호 4-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 메가스파에라 타입 1에서 16S rRNA 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 7-9 및 서열 번호 7-9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브가 생물학적 샘플에서 아토포비움 바지나에의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 사용된다. 아토포비움 바지나에에서 16S rRNA 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 1-3 및 서열 번호 1-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. L . 크리스파투스 및 L. 제세니이에서 16S rRNA 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 14-16 및 서열 번호 14-16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
독소 바지놀리신(VLY)은 유전자 vly 에 의해 암호화되는 G. 바지날리스의 주요 독성 인자이다. VLY는 기공 형성 독소 계열인 콜레스테롤 의존적 세포용해소에 속하며, 혈장 막을 파열시켜 세포 용해를 야기하는 것으로 알려져 있으며 G. 바지날리스의 독성에 주요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 몇몇 실시형태에서, G. 바지날리스에서 vly를 암호화하는 유전자 영역에 (e.g., 표준 핵산 증폭 조건, e.g., 표준 PCR 조건, 및/또는 엄격한 혼성화 조건하에서) 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 바지놀리신(vly) 유전자가 샘플에서 G. 바지날리스의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위해 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. 몇몇 실시형태에서, G. 바지날리스의 vly 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플에서 G. 바지날리스의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 사용된다. G . 바지날리스에서 vly 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 10-13 및 서열 번호 10-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
단백질 AP65는 기생 생물 T. 바지날리스에 의한 65KDa 단백질이며, 이것은 철분 과다시 질 상피 세포에의 기생충의 세포부착을 매개하는 표면 부착소로서 작용한다. 본원에 개시된 몇몇 실시형태에서, T. 바지날리스에서 AP65를 암호화하는 유전자 영역에 (e.g., 표준 핵산 증폭 조건, e.g., 표준 PCR 조건, 및/또는 엄격한 혼성화 조건하에서) 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, AP65 유전자는 샘플에서 T. 바지날리스의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위해 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. T . 바지날리스에서 AP65 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 17-19 및 서열 번호 17-19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
칸디다 종에서 발견되는 연장 인자 1 알파(tef1) 유전자는 단백질 합성 동안 번역 과정에 관여하는 단백질 합성 인자 EF를 암호화한다. 당업계에 공지된 바와 같이, tef1 유전자를 종종 tef1 유전자 또는 tuf 유전자라고도 한다. 본원에 개시된 몇몇 실시형태에서, 칸디다 종에서 tef를 암호화하는 유전자 영역에 (e.g., 표준 핵산 증폭 조건, e.g., 표준 PCR 조건, 및/또는 엄격한 혼성화 조건하에서) 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, tef1 유전자가 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위해 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. 몇몇 실시형태에서, VVC-연관 칸디다 종은 C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이, 및 C. 글라브라타를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, VVC-연관 칸디다 종은 칸디다 크루세이이다. 몇몇 실시형태에서, VVC-연관 칸디다 종은 칸디다 글라브라타이다. 몇몇 실시형태에서, VVC-연관 칸디다 종은 C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, 또는 이들의 조합이다. C . 글라브라타에서 tef1 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 20-22 및 서열 번호 20-22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. C . 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, 및 C. 파랍실로시스에서 tef1 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 23-26 및 서열 번호 23-26으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. C . 크루세이에서 tef1 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열 번호 27-29 및 서열 번호 27-29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
표 1.
VVC
-연관
칸디다
종,
T.
바지날리스
및
BV
-관련 종의 검출을 위한
프라이머
및
프로브
서열 번호 1-32와 적어도 80% 동일한(예를 들면 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 보체를 포함하여, 서열 번호 1-32에 대해 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 미스매치 또는 범용 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 증폭 프라이머 또는 프로브) 또는 이의 보체가 또한 본원에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1-32로부터 선택되는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1-32로부터 선택되는 서열과 적어도 약 85% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1-32로부터 선택되는 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1-32로부터 선택되는 서열과 적어도 약 85% 동일한 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
본원에 제공된 핵산은 다양한 형태일 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 핵산은 용액, 예를 들면 완충액에 (단독으로 또는 각종 다른 핵산과 함께) 용해된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 단독으로 또는 다른 단리된 핵산과 함께 염으로서 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 재구성될 수 있는 동결건조된 형태로 제공된다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 단리된 핵산은 동결건조된 팰렛 단독으로, 또는 다른 단리된 핵산과 동결건조된 팰렛으로 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 비드, 막 등과 같은 고체 성분에 부착되어 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 숙주 세포, 예를 들면 플라스미드를 지닌 세포주, 또는 안정하게 통합된 서열을 지닌 세포로 제공된다.
아토포비움 바지나에, BVAB-2, 메가스파에라 타입 1, L. 크리스파투스, 및/또는 L. 제세니이의 16S rRNA 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및/또는 프로브), 또는 이의 보체를 포함하는 조성물, 반응 혼합물 및 키트가 또한 본원에 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 하나 이상의 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 1 또는 2의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 1 또는 2의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 1 또는 2의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 1 또는 2의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 3의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 3의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 3의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 3의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 BVAB-2의 16S rRNA 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 4 또는 5의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 4 또는 5의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 4 또는 5의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 4 또는 5의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 BVAB-2의 16S rRNA 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 6의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 6의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 6의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 6의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 7 또는 8의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 7 또는 8의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 7 또는 8의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 7 또는 8의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 9의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 9의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 9의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 9의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 L. 크리스파투스 및/또는 L. 제세니이의 16S rRNA 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 14 또는 15의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 14 또는 15의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 14 또는 15의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 14 또는 15의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 L. 크리스파투스 및/또는 L. 제세니이의 16S rRNA 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 16의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 16의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 16의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 16의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
G. 바지날리스의 vly 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및/또는 프로브), 또는 이의 보체를 포함하는 조성물, 반응 혼합물, 및 키트가 또한 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 G. 바지날리스의 vly 유전자 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머 서열 번호 10, 11, 또는 12의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 10, 11 또는 12의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 10, 11 또는 12의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 10, 11 또는 12의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 G. 바지날리스의 vly 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 13의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 13의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 13의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 13의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
T. 바지날리스의 AP-65 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및/또는 프로브), 또는 이의 보체를 포함하는 조성물, 반응 혼합물, 및 키트가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 T. 바지날리스의 AP-65 유전자 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 17 또는 18의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 17 또는 18의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 17 또는 18의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 17 또는 18의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 T. 바지날리스의 AP-65 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 19의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 19의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 19의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 19의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
하나 이상의 칸디다 종의 tef1 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(e.g., 증폭 프라이머 및/또는 프로브), 또는 이의 보체를 포함하는 조성물, 반응 혼합물, 및 키트가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 칸디다 글라브라타의 tef1 유전자 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 20 또는 21의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 20 또는 21의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 20 또는 21의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 20 또는 21의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 칸디다 글라브라타의 tef1 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 22, 26 또는 29의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 22의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 22의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 22의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 하나 이상의 칸디다 종의 tef1 유전자 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함하며, 여기서, 칸디다 종은 C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, 및 C. 파랍실로시스를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 20, 21, 23, 24, 25, 27, 또는 28의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 23, 24 또는 25의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 23, 24 또는 25의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 23, 24 또는 25의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 하나 이상의 칸디다 종의 tef1 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함하며, 여기서, 칸디다 종은 C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, 및 C. 파랍시를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 26의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 26의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 26의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 26의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 칸디다 크루세이의 tef1 유전자 서열의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 27 또는 28의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 27 또는 28의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 27 또는 28의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 서열 번호 27 또는 28의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 칸디다 크루세이의 tef1 유전자의 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브, 또는 이의 보체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 29의 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 29의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 29의 서열로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 서열 번호 29의 서열과 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다.
올리고뉴클레오타이드 프로브는, 몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 방사능 표지를 포함할 수 있다. 방사능 표지의 비제한적인 예는 3H, 14C, 32P, 및 35S를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 리간드, 형광단, 화학발광제, 효소, 및 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 비-방사능 검출 가능한 마커 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 감도를 증가시킬 수 있는, 프로브에 사용하기 위한 기타의 검출 가능한 마커는 비오틴 및 방사성-뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 표지의 선택은 이것이 프로브에 결합되는 방식을 나타낸다는 것은 통상의 숙련가에게 자명할 것이다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 프로브는, 주형 핵산에 혼성화시 검출 가능한 형광도 변화가 생성되도록 하나 이상의 염료로 표지된다. 비-특이 염료가 몇몇 용도에서 바람직할 수 있지만, 서열-특이 프로브가 증폭의 더욱 정확한 측정을 제공할 수 있다. 서열-특이 프로브의 한 가지 배열은 형광단에 부착된 프로브의 한쪽 말단 및 켄처에 부착된 프로브의 다른 말단을 포함할 수 있다. 프로브가 비혼성화되는 경우, 이것은 줄기-루프 배열을 유지할 수 있으며, 여기서 형광단이 켄처에 의해 소광되어 형광단이 형광을 내는 것을 방지한다. 프로브가 주형 핵산 서열에 혼성화되는 경우, 이것은 선형화되어, 형광단이 켄처로부터 멀어져 형광단이 형광을 낼 수 있게 한다. 서열-특이 프로브의 또 다른 배열은 FRET 쌍의 제1 형광단에 부착된 제1 프로브, 및 FRET 쌍의 제2 형광단에 부착된 제2 프로브를 포함할 수 있다. 제1 프로브와 제2 프로브는, 제1 프로브와 제2 프로브가 동일한 앰플리콘에 혼성화되는 경우 FRET에 의한 에너지 전달이 가능해지도록 충분히 가까이 있는 앰플리콘의 서열에 혼성화하도록 배열될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 서열 특이 프로브는 형광단에 접합된 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 프로브는 둘 이상의 형광단에 접합된다. 형광단의 예는 크산텐 염료, e.g, 플루오레세인 및 로다민 염료, 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 2-[에틸아미노)-3-(에틸이미노)-2-7-디메틸-3H-크산텐-9-일]벤조산 에틸 에스테르 모노하이드로클로라이드(R6G)(약 500 내지 560 nm 범위의 파장에서 반응 방사선을 방출함), 1,1,3,3,3',3'-헥사메틸인도디카보시아닌 요오다이드(HIDC)(약 600 내지 660 nm 범위의 파장에서 반응 방사선을 방출함), 6-카복시플루오레세인(약어 FAM 및 F로 일반적으로 알려짐), 6-카복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인(HEX), 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE 또는 J), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA 또는 T), 6-카복시-X-로다민(ROX 또는 R), 5-카복시로다민-6G(R6G5 또는 G5), 6-카복시로다민-6G(R6G6 또는 G6), 및 로다민 110; 시아닌 염료, e.g. Cy3, Cy5 및 Cy7 염료; 쿠마린, e.g., 엄벨리페론; 벤즈이미드 염료, e.g. Hoechst 33258; 페난트리딘 염료, e.g. 텍사스 레드(Texas Red); 에티듐 염료; 아크리딘 염료; 카바졸 염료; 페녹사진 염료; 포르피린 염료; 폴리메틴 염료, e.g. 시아닌 염료, 예를 들면, Cy3(약 540 내지 580 nm 범위의 파장에서 반응 방사선을 방출함), Cy5(약 640 내지 680 nm의 파장에서 반응 방사선을 방출함) 등; BODIPY 염료 및 퀴놀린 염료를 포함한다. 관심을 끄는 특정 형광단은 피렌, 쿠마린, 디에틸아미노쿠마린, FAM, 플루오레세인 클로로트리아지닐, 플루오레세인, R110, 에오신, JOE, R6G, HIDC, 테트라메틸로다민, TAMRA, 리사민, ROX, 나프토플루오레세인, 텍사스 레드, 나프토플루오레세인, Cy3, 및 Cy5, CAL 플루오르 오렌지 등을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 프로브는 켄처에 접합된다. 켄처는 전자기 방사선을 흡수하여 이를 열로서 소산시킴으로써 계속 어두울 수 있다. 켄처의 예는 Dabcyl, NFQ's, 예를 들면, BHQ-1 또는 BHQ-2(Biosearch), IOWA BLACK FQ(IDT), 및 IOWA BLACK RQ(IDT)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 켄처는 형광단과 쌍을 이루어 형광단에 의해 방출되는 전자기 방사선을 흡수하도록 선택된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 유용한 형광단/켄처 쌍은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 문헌[참조; Marras, "Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes" available at www.molecular-beacons.org/download/marras,mmb06%28335%293.pdf]에 기재된 바와 같이 찾아볼 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 형광단은 프로브의 제1 말단에 부착되고, 켄처는 프로브의 제2 말단에 부착된다. 부착은 공유 결합을 포함할 수 있으며, 프로브와 형광단 또는 켄처 사이에 위치한 적어도 하나의 링커 분자를 임의로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형광단은 프로브의 5' 말단에 부착되고 켄처는 프로브의 3' 말단에 부착된다. 몇몇 실시형태에서, 형광단은 프로브의 3' 말단에 부착되고, 켄처는 프로브의 5' 말단에 부착된다. 정량적 핵산 증폭에서 사용될 수 있는 프로브의 예는 분자 비콘, SCORPION™ 프로브(Sigma), TAQMAN™ 프로브(Life Technologies) 등을 포함한다. 본원에 개시된 실시형태에서 유용한 기타의 핵산 검출 기술은 나노입자 프로브 기술(참조; Elghanian, et al. (1997) Science 277:1078-1081.) 및 Amplifluor 프로브 기술(참조: U.S. 특허 제5,866,366호; 제6,090,592호; 제6,117,635호; 및 제6,117,986호)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태들은 다수의 BV-관련 박테리아의 검출을 위한 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물은 L. 크리스파투스 및/또는 L. 제세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); G. 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, L. 크리스파투스 및/또는 L. 제세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 1의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 2의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어지고; BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 4의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 5의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어지며; 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 7의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어지고; G. 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 10의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어지며; 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 12의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 15의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어진다.
조성물은 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 개시된 몇몇 실시형태들은 생물학적 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종 및 T. 발지날리스의 검출을 위한 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물은 다음을 포함한다: Ca. 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); C. 알비칸스 , C. 트로피칼리스 , C. 두블리니엔시스 , 및 C. 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25의 서열, 또는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); C. 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및 T. 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 서열, 또는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다).
몇몇 실시형태에서, C. 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 21의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어지고; C. 알비칸스 , C. 트로피칼리스 , C. 두블리니엔시스 , 및 C. 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 23의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 24의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 25의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어며; C. 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 27의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 28의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어지고; T. 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 17의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 18의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나, 이로 이루어진다.
조성물은, 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 기재된 임의의 프로브는 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 반응 혼합물은 본원에 개시된 프라이머 중의 하나 이상, 본원에 개시된 프로브 중의 하나 이상(e.g., 형광단-함유 프로브), 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 반응 혼합물은 본원에 개시된 프라이머 및/또는 프로브-함유 조성물 중의 하나 이상을 포함한다. 반응 혼합물은 또한 각종 부가 성분을 포함할 수 있다. 반응 혼합물 중의 부가 성분의 예는 주형 DNA, DNA 폴리머라제(e.g., Taq DNA 폴리머라제), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 완충 용액, 이가 양이온, 일가 양이온 칼륨 이온, 및 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 반응 혼합물은 실시간 PCR을 위한 마스터 믹스(master mix)이다.
샘플
본원에 개시된 방법 및 조성물은 광범위하게 다양한 샘플에서 VVC, 질편모충증 및 BV와 같은 질 질환을 검출하는데 적합하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "샘플"은 VVC, 질편모충증, 및/또는 BV를 앓는 것으로 의심되는 한 명 이상의 대상체로부터 채취한 생물학적 기원의 임의 유형의 물질을 가리킨다. 샘플은, 예를 들면, 체액, 조직 또는 세포를 포함할 수 있다. 샘플은 대생체로부터 직접 채취한 생물학적 물질, 또는 배양된 세포 또는 조직, 또는 생물학적 물질로부터 생산되거나 유래된 임의의 분획 또는 산물을 포함할 수 있다. 샘플은 정제되거나, 부분 정제되거나, 정제되지 않거나, 배양되거나(enriched), 증폭될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 임상 샘플일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 질, 요도, 음경, 항문, 인후, 자궁경부, 발효 브로스, 세포 배양물 등과 같은 생물학적 공급원으로부터 채취된다. 샘플은, 예를 들면, 질로부터의 체액 및 세포를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 (i) 대상체 또는 공급원으로부터 입수된 대로 바로, 또는 (ii) 샘플의 특징을 변형시키기 위해 전처리 후 사용될 수 있다. 따라서, 시험 샘플은, 예를 들면, 세포 또는 바이러스 입자를 분해시키고, 고체 물질로부터 액체를 제조하고, 점성 체액을 희석시키고, 액체를 여과하고, 액체를 농축시키고, 간섭 성분들을 불활성화시키고, 시약을 첨가하고, 핵산을 정제하는 등에 의해 사용 전에 전처리될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 임상적 또는 생물학적 시료로부터 추출된 핵산(DNA, RNA 또는 전체 핵산)을 포함한다. 샘플 제조는 또한 완충액, 염, 세제, 및/또는 분석을 위해 샘플을 제조하는데 사용되는 기타를 함유하는 용액을 사용하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 분자 시험 전에 가공한다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 바로 분석하거나, 시험 전에 미리 가공하지 않는다. 샘플은, 예를 들면, 단일 질 면봉 샘플과 같은 질 샘플일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 질염 및/또는 질증의 임상 증후를 지닌 여성으로부터의 질 면봉 샘플이다.
질 또는 소변 샘플은 종종 다수의 유기체로 감염된다. 개시된 프라이머 및 프로브는 질 또는 소변 기질의 혼합 감염에 대해 내성이 있다.
몇몇 실시형태에서, 시험하고자 샘플은 본원에 개시된 방법을 수행하기 전에 가공된다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 샘플은 본원에 개시된 방법을 수행하기 전에 단리하거나, 농축시키거나, 또는 다양한 기타 가공 공정에 적용될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 샘플은 본원에 개시된 바와 같이 샘플을 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키기 전에 샘플로부터 핵산을 단리하도록 가공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 시험관내에서 배양하지 않고서 샘플 상에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 바와 같이 샘플을 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키기 전에 샘플로부터 핵산을 단리하지 않고서 샘플 상에서 수행된다.
샘플 추출
전형적인 샘플 추출에서, 세포는 표적 유기체를 용해시키기 위해 전문이 본원에 참고로 포함된 US 특허 제7,494,771호에 기재된 바와 같이 유리 비드를 사용한 기계적 전단(shearing)에 의해 용해된다. 제WO03/008636호에 개시된 바와 같이, 세포 용해의 이러한 일반적인 방법은 광범위하게 다양한 표적 유기체 및 시료 기질에 대해 효율적이다. 특정 종 또는 그룹의 유기체를 표적으로 하도록 특별하게 고안되거나, 특정의 효소적 또는 화학적 활성을 이용하는 기타의 덜 보편적인 용해 방법이 또한 존재한다. 예를 들면, ACP 효소는 그람-양성 유기체(Ezaki et al., J. Clin. Microbiol., 16(5):844-846 (1982); Paule et al., J. Mol. Diagn., 6(3):191-196 (2004); US 특허 제3,649,454호; 모두 전문이 본원에 참고로 포함됨) 및 마이코박테리아(전문이 본원에 참고로 포함된 US 특허 제5,185,242호)의 용해에 일반적으로 사용되지만 일반적으로 이. 콜라이 (E. coli ) 및 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa )와 같은 그람-음성 종의 용해에 대해서는 덜 효율적인 것으로 간주된다(전문이 참고로 포함된 US 특허 제3,649,454호).
본 발명의 발명자는 놀랍게도, ACP와 프로테이나제 K 중 어느 것도 칸디다 세포 벽을 효율적으로 용해시킬 수 없으며, US 특허 제3,716,452호(전문이 참고로 포함됨)에 기재된 리티카제(lyticase)가 칸디다 종의 세포 벽을 효과적으로 용해시킬 수 있음을 밝혀내었다. 세포 용해는 다양한 온도, 예를 들면 18℃ 내지 75℃, 예를 들면, 37℃ 내지 50℃ 하에서 수행될 수 있다. 50℃(LND490E38)에 비해 더 높은 용해 효율을 달성하기 위해서는 37℃에서 세포를 용해시키는 것이 유리하다. 몇몇 실시형태에서, 리티카제가 C. 알비칸스, C. 크루세이, C. 파랍실로시스, C. 트로피칼리스, 및 C. 글라브라타를 포함하지만 이에 제한되지 않는 칸디다 종을 용해시키는데 사용된다. 샘플에 대해 목적하는 용해 효율을 달성하는데 필요한 시간은 특별히 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 샘플의 목적하는 용해 효율을 달성하기 위해서는 약 10분이 소요된다.
핵산 시험
본원에 기재된 방법은, 예를 들면, 핵산 시험을 포함할 수 있다. 예를 들면, 시험은 샘플에서 표적 핵산 서열에 대한 시험을 포함할 수 있다. 핵산 증폭을 수반하는 시험을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 핵산 시험이 본원에 개시된 실시형태에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 증폭은 서열-특이 방법을 사용하여 표적 핵산 서열의 다중 복제물 또는 이의 보체 또는 이의 단편을 수득하기 위한 임의의 공지된 과정을 가리킨다. 공지된 증폭 방법의 예는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 고리-매개 등온 증폭(LAMP), 가닥 변위 증폭(SDA)(e.g., 다중 변위 증폭(MDA)), 레플리카아제-매개 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 자가-유지 서열 복제(3SR), 회전 환 증폭, 및 전사-매개 증폭(TMA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Mullis, "Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Acid Sequences," U.S. Pat. No. 4,683,195; Walker, "Strand Displacement Amplification," U.S. Pat. No. 5,455,166; Dean et al, "Multiple displacement amplification," U.S. Pat. No. 6,977,148; Notomi et al., "Process for Synthesizing Nucleic Acid," U.S. Pat. No. 6,410,278; Landegren et al. U.S. Pat. No. 4,988,617 "Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids"; Birkenmeyer, "Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction," U.S. Pat. No. 5,427,930; Cashman, "Blocked-Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit," U.S. Pat. No. 5,849,478; Kacian et al., "Nucleic Acid Sequence Amplification Methods," U.S. Pat. No. 5,399,491; Malek et al., "Enhanced Nucleic Acid Amplification Process," U.S. Pat. No. 5,130,238; Lizardi et al., BioTechnology, 6:1197 (1988); Lizardi et al., U.S. Pat. No. 5,854,033 "Rolling circle replication reporter systems"]을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 상기한 핵산 증폭 방법들 중의 둘 이상을, 예를 들면, 연속적으로 수행할 수 있다.
예를 들면, LCR 증폭은 다중 주기의 혼성화, 결찰, 및 변성을 사용함으로써 표적 및 이의 상보적 가닥을 증폭시키기 위해 적어도 네 개의 별도의 올리고뉴클레오타이드를 사용한다(EP 특허 제0 320 308호). SDA는 표적 서열을 포함하는 반변형된 DNA 이중나선의 한 가닥을 절단(nick)하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 함유하는 프라이머를 사용한 다음 일련의 프라이머 연장 및 가닥 변위 단계에서 증폭시킴으로써 증폭된다(Walker 등의 U.S. 특허 제5,422,252호).
PCR은 핵산의 증폭을 위해 당업게에서 널리 알려져 있는 방법이다. PCR은 표적 서열이 측면에 있는 둘 이상의 연장 가능한 서열-특이 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 표적 서열의 증폭을 포함한다. 관심을 끄는 표적 서열을 함유하는 핵산을 프라이머, 열안정성 DNA 폴리머라제(e.g., Taq 폴리머라제) 및 각종 dNTP의 존재하에 다중 라운드의 열 사이클(변성, 어닐링 및 연장)의 프로그램에 적용하여, 표적 서열의 증폭을 야기시킨다. PCR은 다중 라운드의 프라이머 연장 반응을 사용하며, 여기서는 DNA 분자의 정의된 영역의 상보적인 가닥들이 열안정성 DNA 폴리머라제에 의해 동시에 합성된다. 각 사이클의 말기에서, 각각의 새로 합성된 DNA 분자가 다음 사이클을 위한 주형으로서 작용한다. 이러한 반응의 반복된 라운드 동안, 새로 합성된 DNA 가닥의 수는, 20 내지 30회 반응 사이클 후, 초기 주형 DNA가 수 천 배 또는 수 백만 배 복제되도록 기하급수적으로 증가한다. 상이한 유형 및 방식의 PCR을 수행하기 위한 방법들이 예를 들면, 문헌[참조; "PCR Primer: A Laboratory Manual" Dieffenbach and Dveksler, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에, 및 Mullis 등에 의해 특허(e.g., U.S. 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호) 및 과학 출판물(e.g. Mullis et al. 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350)에 충분히 설명되어 있으며, 여기서 각 참고문헌의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
PCR은 증폭후 가공에 적합한 이중-가닥 증폭 산물을 생성할 수 있다. 경우에 따라, 증폭 산물은 아가로스 겔 전기영동을 사용한 가시화에 의해, 프로브-기반 비색 검출을 사용한 효소 면역분석 포맷에 의해, 형광 방출 기술에 의해, 또는 당업계의 숙련가에게 알려진 기타의 검출 수단에 의해 검출될 수 있다.
광범위하게 다양한 PCR 방법이 각 방면에, 예를 들면, 문헌[참조; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Section 15, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)]에 기재되어 있다. PCR 방법의 예는 실시간 PCR, 종점 PCR, AFLP-PCR(Amplified fragment length polymorphism PCR), Alu-PCR, 비대칭 PCR, 콜로니 PCR, DD-PCR, 변성 PCR, 핫-스타트(Hot-start) PCR, 인시투(In situ) PCR, 역 PCR 긴-PCR, 멀티플렉스 PCR, 중첩(Nested) PCR, PCR-ELISA, PCR-RFLP, PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism), QC-PCR(quantitative competitive PCR), RACE-PCR(rapid amplification of cDNA ends-PCR), RAPD-PCR(Random Amplification of Polymorphic DNA-PCR), 실시간 PCR, Rep-PCR(Repetitive extragenic palindromic-PCR), RT-PCR(reverse transcriptase PCR), TAIL-PCR, Touchdown PCR 및 Vectorette PCR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(QRT-PCR)으로도 불리우는 실시간 PCR이 소정의 핵산 분자의 특정 부분을 동시에 정량하고 증폭시키는데 사용될 수 있다. 이것은 특정 서열이 샘플에 존재하는지; 및 이것이 존재한다면 존재하는 서열의 복제 수를 결정하는데 사용될 수 있다. 용어 "실시간"은 PCR 동안의 주기적인 모니터링을 말한다. ABI 7700 및 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)과 같은 특정 시스템이 예비-결정되거나 사용자-정의된 시점에서 각각의 열 사이클 동안 모니터링을 수행한다. 형광 공명 에너지 전달(FRET) 프로브로의 PCR의 실시간 분석은 사이클 간의 형광 염료 신호 변화, 바람직하게는 마이너스 임의의 내부 제어 신호를 측정한다. 실시간 과정은 PCR의 일반적인 패턴을 따르지만, 핵산은 각 라운드의 증폭 후 정량된다. 정량 방법의 두 가지 예는 이중-가닥 DNA에 개재되는 형광 염료(e.g., SYBRGreen), 및 상보적 DNA와 혼성화되는 경우 형광을 띠는 변형된 DNA 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용이다. 개재성 제제(intercalating agent)는 결합되지 않는 경우에는 비교적 낮은 형광을 갖고 이중-가닥 핵산에 결합시에는 비교적 높은 형광을 갖는다. 이와 같이, 개재성 제제는 핵산 증폭 반응 동안의 이중 가닥 핵산의 축적을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 실시형태에서 유용한 이러한 비특이 염료의 예는 SYBR 그린 I(Molecular Probes), 요오드화프로피듐, 브롬화에티듐 등과 같은 개재성 제제를 포함한다.
질 샘플은 종종 다중 유기체로 감염된다. 개시된 프라이머 및 프로브는 질 기질의 혼합 감염에 대해 내성이 있다. 특이 표적 서열, 프라이머 및 프로브 때문에, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종, T. 바지날리스, 및/또는 BV-관련 박테리아의 존재/부재 또는 수준을 높은 감도, 특이성 및 정확도로 검출하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 프라이머는 질 유기체의 검출을 위한 검정 패널을 제공하기 위해, 전반적인 검정 감도 및 견고성을 개선시키기 위해 균일 화학 및 열 PCR을 사용하는 추가의 PCR 시스템과 병행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 멀티플렉스 PCR은 VVC-연관 칸디다 종, T. 바지날리스, 및 BV-관련 박테리아의 존재 또는 부재를, e.g., 직접 또는 간접 수단에 의해 증폭 및 검출하여 VVC, 질편모충증 및 BV를 한가지 검사를 사용하여 진단할 수 있도록 하기 위해 수행된다. 멀티플렉스 PCR에서, VVC-연관 칸디다 종의 존재 또는 부재는 C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이, 및 C. 글라브라타의 tef1 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있고; T. 바지날리스의 존재 또는 부재는 T. 바지날리스의 AP-65 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있으며; L. 크리스파투스, L. 제세니이, G. 바지날리스, 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1, 및 BVAB -2를 포함하는 BV-관련 박테리아의 존재 또는 부재는 아토포비움 바지나에, BVAB-2, 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자의 존재 또는 부재, 및 G. 바지날리스의 vly 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있다.
따라서, 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종, T. 바지날리스, 및 BV-관련 박테리아의 검출 및/또는 확인을 위한 몇몇 실시형태는 시험 샘플을 제공하는 단계; 및 샘플을 (1) C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이, 및 C. 글라브라타의 tef1 유전자, (2) T. 바지날리스의 AP-65 유전자, (3) 아토포비움 바지나에, BVAB -2, 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자, 및 (4) G. 바지날리스의 vly 유전자를 특이적으로 혼성화 및 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 및 표준 핵산 증폭 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건하에서 (1) C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이, 및 C. 글라브라타의 tef1 유전자 영역, (2) T. 바지날리스의 AP-65 유전자 영역, (3) 아토포비움 바지나에, BVAB -2, 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자 영역, 및 (4) G. 바지날리스의 vly 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 샘플은 프라이머 및 프로브 모두와 즉시 접촉될 수 있거나, 먼저 프라이머 및 프로브의 일부와 접촉된 다음 나머지 프라이머 및 프로브와 접촉될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 (1) C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이, 및 C. 글라브라타의 tef1 유전자, 및 (2) T. 바지날리스의 AP-65 유전자를 특이적으로 혼성화 및 증폭시킬 수 있는 프라이머, 및 (1) C. 알비칸스, C. 두블리니엔시스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 크루세이, 및 C. 글라브라타의 tef1 유전자 영역, 및 (2) T. 바지날리스의 AP-65 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉된다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 아토포비움 바지나에, BVAB -2, 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자, 및 G. 바지날리스의 vly 유전자를 특이적으로 혼성화 및 증폭시킬 수 있는 프라이머, 및 아토포비움 바지나에, BVAB -2, 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자, 및 G. 바지날리스의 vly 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉된다.
올리고뉴클레오타이드 프로브는, 예를 들면, 약 10 내지 약 45개 뉴클레오타이드 길이일 수 있으며, 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 접촉은 표적 유기체가 샘플에 존재한다면 상응하는 표적화 유전자 영역으로의 프라이머의 특정 혼성화를 가능케 하는 조건하에서 수행된다. 상응하는 표적화 유전자 영역(시험되는 샘플에 존재한다면)에 특이적으로 결합되는 프로브의 존재 및/또는 양이 결정될 수 있으며, 여기서 결합된 프로브는 샘플 중의 상응하는 표적 유기체의 존재를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 결합된 프로브의 양은 샘플 중의 상응하는 표적 유기체의 양을 결정하는데 사용된다.
결정 단계는 접촉 단계 후 현장(in situ) 혼성화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 혼성 이중체의(즉, 표적화 유전자 영역에 특이적으로 결합된 프로브의) 검출은 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 전형적으로, 혼성화 이중체를 비혼성화 핵산으로부터 분리한 다음 이중체에 결합된 표지를 검출한다. 이러한 표지는 당업계의 표준 사용의 방사능, 형광, 생물학적 또는 효소적 태크 또는 표지를 가리킨다. 표지는 생물학적 샘플로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 핵산에 접합될 수 있다. 당업계의 숙련가들은 과량의 샘플/표적 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브(및, 경우에 따라, 비결합된 접합체)를 씻어내기 위해 세척 단계가 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 게다가, 표준 불균질 검정 포맷이 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브 상에 존재하는 표지를 사용하여 혼성체를 검출하는데 적합하다.
몇몇 실시형태는 생물학적 샘플에서 다수의 BV-관련 박테리아를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 방법은 다음을 포함한다: 생물학적 샘플을 다수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계[여기서, 다수의 프라이머 쌍은 L. 크리스파투스 및 L. 제세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); G. 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다), 및 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)를 포함한다]; 상기 생물학적 샘플이 BV-관련 박테리아 중의 하나 이상을 포함한다면 상기 생물학적 샘플로부터 아토포비움 바지나에, BVAB2, 메가스파에라 타입 1, 및/또는 L. 크리스파투스 및 L. 제세니이의 16S rRNA 서열의 앰플리콘, 및/또는 G. 바지날리스의 vly 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플에서 BV-관련 박테리아의 존재의 표시로서 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계.
몇몇 실시형태에서, 다수의 프라이머 쌍은 서열 번호 1의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 2의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 8의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 10의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 11의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 12의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 15의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 1 및 2를 포함하고; BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 4 및 5를 포함하고; 메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 7 및 8을 포함하고; G. 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 (a) 서열 번호 10 및 12, (b) 서열 번호 11 및 12, 또는 이의 조합을 포함하고; 아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 1 및 2를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계는 증폭된 산물을 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브(여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 각각의 프로브는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다.
생물학적 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종 및 T. 발지날리스를 검출하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: 생물학적 샘플을 다수의 프라이머 쌍[여기서, 다수의 프라이머 쌍은 C. 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); C. 알비칸스 , C. 트로피칼리스 , C. 두블리니엔시스, 및 C. 파랍실로시스 중의 적어도 하나에 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25의 서열, 또는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); C. 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및 T. 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 서열, 또는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)과 접촉시키는 단계; 및 상기 생물학적 샘플이 VVC-연관 칸디다 종 및/또는 T. 바지날리스 중의 하나 이상을 포함한다면 상기 생물학적 샘플로부터 칸디다 종의 tef1 서열의 앰플리콘 및/또는 T. 바지날리스의 AP-65 유전자의 앰플리콘을 생성하는 단계; 상기 생물학적 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종 및 T. 발지날리스의 존재의 표시로서 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계.
몇몇 실시형태에서, 다수의 프라이머 쌍은 서열 번호 20의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 21의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 23의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 24의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 25의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 27의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 28의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 17의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 18의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, C. 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 20 및 21을 포함하고; C. 알비칸스 , C. 트로피칼리스 , C. 두블리 니엔시스, 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 (a) 서열 번호 23 및 24, (b) 서열 번호 23 및 35, 또는 (c) 이의 조합을 포함하고; C. 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 27 및 28을 포함하고; T. 발지날리스의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는 서열 번호 17 및 18을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계는 증폭된 산물을 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브(여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각은 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 기재된 바와 같이, 증폭은 실시간 PCR, 예를 들면, 정량적 실시간 PCR(QRT-PCR)에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 프라이머는 증폭 자체에 상당한 영향 없이 증폭 산물의 증폭후 조작을 가능케 하는 외생 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머에는 5' 말단에 형광단 및 3' 말단에 형광 켄처를 포함하는 상보적 서열이 측면에 있을 수 있다.
본원에 개시된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법을 자동화하도록 수정하여, 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종, T. 바지날리스, 및 BV-관련 박테리아의 검출 및/또는 정량을 위한 고속-처리 옵션을 제공할 수 있다. 다양한 멀티플렉스 PCR 플랫폼, e.g., BD MAXTM, ViperTM, 또는 ViperTM LT 플랫폼이 개시된 방법의 하나 이상의 단계를 수행하는데 사용될 수 있다. 방법은 멀리플렉스 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭 및/또는 검출은, 몇몇 실시형태에서, 멀티플렉스 PCR을 수행함을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 당해 기술이 적용될 수 있는 특정 상황 및 설정을 입증하기 위해 제공되며 본 발명의 범위 및 본 발명에 포함된 청구항을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
1
질 면봉 샘플에서의
VVC
,
질편모충증
및
BV의
검출
당해 실시예에 기재된 연구는 질 면봉 샘플에서 자동화된 정성적 시험관내 진단 검사를 사용한 VVC와 관련된 칸디다 종, 질편모충증 및 BV의 검출을 보여준다. 검사는 DNA 표적의 증폭을 위한 실시간 PCR 및 표적 유기체의 검출 및 확인을 위한 형광 혼성화 프로브를 사용한다.
질 면봉을 질염/질증의 임상 증후를 지닌 여성으로부터 수집하였다. 질 시료를 T. 바지날리스에 대해서는 In Pouch™ TV로 특성화하는 반면 칸디다 종에 대해서는 배양한 다음 BD Phoenix™ 확인을 사용하였으며 BV에 대한 참조 방법으로서 뉴젠트 스코어(Nugen et al., J. Clin. Microbiol. 29(2):297-301 (1991))를 사용하였다. 암셀 기준(Amsel et al., Am. J. Med. 74(1):14-22 (1983))은 중간 뉴젠트 스코어(뉴젠트 스코어 4-6)를 가진 시료에 대한 BV 상태를 결정하는데에만 사용되었다. 세 개의 면봉은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 사용한 질편모충증, VVC와 관련된 칸디다 종, 및 BV의 검출을 위한 BD MAX ™ 시스템(Becton, Dickinson and Company, New Jersey)에서의 시험을 위한 것이었다. BV의 진단은 락토바실러스 종, G. 바지날리스, 아토포비움 바지나에, BVAB -2, 및 메가스파에라-1를 포함한 BV-관련 박테리아의 검출을 위해 PCR 파라미터에 기반한 알고리즘을 사용하여 결정하였다.
DNA 표적의 증폭을 위한 실시간 PCR은 표 1에 제공된 프라이머를 사용하여 수행하였으며 표 1에 제공된 형광 혼성화 프로브가 각각의 질 면봉 샘플에서 VVC와 관련된 칸디다 종, T. 바지날리스, 및 BV-관련 박테리아 L. 크리스파투스, L. 제세니이, G. 바지날리스, 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1, 및 BVAB2를 검출하는데 사용되었다.
포용도 연구(inclusivity study)를 12개국으로부터 기원한 배양 가능한 균주를 사용하여 수행하였다. 포용도 연구 분석은 확립된 PCR 파라미터 역치에 따라 각각의 개별 표적의 양성/음성 상태에 기반하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 검정은 VVC, 질편모충증 및 BV에 관련되는 종에 속하는 매우 다양한 균주를 검출할 수 있다. 혼합물 중의 특정 유기체의 검출 수준은 높은 수준의 분석 감도를 입증하며, 이는 임상의가 질 감염에 관련된 병원균(들)의 명확한 확인을 수득하고 단지 한 가지 질 시료를 사용하여 치료법을 선택할 수 있음을 나타낸다.
표 2. 포용도 연구
시뮬레이션된 공동-감염 연구에서는, 저 부하의 T. 바지날리스 또는 저 부하의 C. 글라브라타 및 C. 크루세이를 고 부하의 C. 알비칸스의 존재하에서 시험하고; 저 부하의 T. 바지날리스를 고 부하의 C. 글라브라타의 존재하에서 시험하였다. 상기 각 연구에 대해, 증상이 없는/증상이 있는 여성으로부터의 질 균총(vaginal flora)에서의 일부 표적의 존재로 인해 질 기질보다는 시뮬레이션된 기질을 사용하였다. 시뮬레이션된 공동-감염 연구의 결과가 표 3에 나타내어져 있다.
표 3. 질 패널의
시뮬레이션된
공동-감염 연구
임상 시료를 칸디다 종 및 T. 바지날리스에 대한 음성/양성 샘플로서 정의하였다. 표 4에 나타낸 성능 연구의 결과는 본원에 개시된 질 패널이 T. 바지날리스 및 칸디다 종을 높은 감도 및 특이성으로 검출하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
표 4. TV 및
칸디다
종에 대한 성능 연구
BV의 검출을 위한 검정 성능은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 사용하여 확립하였다. 락토바실러스 종, g. 바지날리스, 아토포비움 바지나에, BVAB -2 및 메가스파에라 -1의 증폭 및 검출로부터의 PCR 계량법을 사용하여, 로지스틱 회귀 모델-기반 알고리즘을 수립하여 BV 양성 확률을 추정하고 단일 BV 양성 또는 BV 음성 세포를 제공하였다. 환자의 추정 확률이 ROC 곡선 분석에 의해 결정된 역치를 초과한다면 환자가 BV를 갖는 것으로 간주하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 771개의 전체 특성화된 임상 샘플의 분석에 기초한 예비 검정 성능 결과(감도/특이성)는 91.9%(감도)/86.2%(특이성)이거나, 중간 뉴젠트 스코어 및 암셀 기준 결과를 고려하지 않은 경우 95.4(감도)/92.5%(특이성)로 증가되었다.
표 5.
BV
검출을 위한 성능 연구
당해 실시예는 본원에 개시된 조성물 및 방법이 높은 특이성 및 감도로 VVC, TV, 및 BV와 관련된 유기체를 검출하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예
2
질 샘플에서
VVC
,
질편모충증
및
BV의
복합 검출을 위한
프라이머
및
프로브의
선택
다양한 프라이머 및 프로브를 VVC-연관 칸디다 종, T. 바지날리스, 및 BV의 증폭 및 검출에서의 이들의 성능에 대해 개별적으로 또는 복합 방식으로 설계하고 시험하였다. 표 6a 및 6b는 약한 신호, 증폭의 부족, 큰 크기의 앰플리콘, 거짓 양성 신호, 비특이 검출, 온도 변화에 대한 민감성, 다수의 변종 균주 검출 실패, 복합 검정에 있어서의 제한, 파트너 프라이머/프로브의 선택, 다른 프라이머/프로브와의 상호작용을 포함한 다수의 바람직하지 않은 특성들 때문에 선택되지 못한 다양한 프라이머, 프라이머 쌍, 및 프로브를 제공한다. 놀랍게도, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 다수의 프라이머 및 프로브가 개별적으로 또는 복합 방식으로 VVC-연관 칸디다 종, T. 바지날리스, 및 BV의 증폭 및 검출에서 우수한 성능을 보이는 것으로 밝혀졌다. 이러한 프라이머, 프로브 및 이들의 몇몇 조합의 더욱 우수한 특성은 예상되지 못하였다. 더욱이, 서열 번호 1-16의 올리고뉴클레오타이드가 멀티플렉스 실시간 PCR 반응에서 효과적으로 성능을 나타내는(즉, 표적 DNA를 특이적으로 증폭시키고 검출시키는) 능력은 예상되지 못하였다. 유사하게, 서열 번호 17-29의 올리고뉴클레오타이드가 멀티플렉스 실시간 PCR 반응에서 효과적으로 성능을 나타내는(즉, 표적 DNA를 특이적으로 증폭시키고 검출시키는) 능력 또한 예상되지 못하였다.
표 6a.
BV의
검출을 위한 비-선택된
프라이머
및
프로브
표 6b.
VVC
및
질편모충증의
검출을 위한 비-선택된
프라이머
및
프로브
표 7a 및 7b는 거짓 양성 신호 및 변종 균주 검출 실패를 포함한 다수의 바람직하지 않은 특성 때문에 선택되지 못한 프라이머 및 프로브의 다수의 마스터 믹스를 제공한다.
표 7a.
BV의
검출을 위한 비-선택된 마스터
믹스
표 7b.
VVC
및
질편모충증의
검출을 위한 비-선택된 마스터
믹스
다양한 측면들 및 실시형태들이 본원에 개시되어 있지만, 기타의 측면들 및 실시형태들이 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다. 본원에 개시된 다양한 측면들 및 실시형태들은 예시 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 진정한 범위 및 취지는 하기 청구항에 의해 나타내어진다.
당업계의 숙련가는, 본원에 기재된 이러한 및 기타의 공정 및 방법에 대해, 공정 및 방법에서 수행되는 작용들은 상이한 순서로 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 게다가, 요약된 단계들 및 작업들은 단지 예로서 제공되며, 단계들 및 작업들 중의 일부는, 개시된 실시형태들의 본질에서 벗어나지 않으면서, 임의선택적이거나, 더 적은 단계들 및 작업들에 조합되거나, 추가의 단계들 및 작업들로 확장될 수 있다.
본원에서 실질적으로 임의의 복수형 및/또는 단수형의 사용과 관련하여, 당업계의 숙련가들은 맥락 및/또는 적용에 적합한 한 복수형을 단수형으로 및/또는 단수형을 복수형으로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 순열이 명료성을 위해 본원에 명백히 제시될 수 있다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 용어는, 특히 첨부된 청구항에서(e.g., 첨부된 청구항의 본문) 일반적으로 "개방(open)" 용어로서 의도되는 것으로 당업계내에서 이해될 것이다(e.g., 용어 "포함하는(including)"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는(including but not limited to)"으로 해석되어야 하고 용어 "갖는(having)"은 "적어도 갖는(having at least)"으로 해석되어야 하며 용어 "포함한다(includes)"는 "포함하지만 이에 제한되지 않는다(includes but is not limited to)" 등으로 해석되어야 한다). 특정 횟수의 도입된 청구항 인용이 의도된다면, 이러한 의도가 청구항에 명백히 언급될 것이며 이러한 설명의 부재하에서는 이러한 의도는 존재하지 않는 것으로 당업계내에서 추가로 이해될 것이다. 예를 들면, 이해를 돕기 위해, 하기 첨부된 청구항은 청구항 인용을 도입하기 의해 도입구 "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 이상의(one or more)"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 어구의 사용은, 동일한 청구항이 도입구 "하나 이상의" 또는 "적어도 하나" 및 단수형("a" 또는 "an")과 같은 부정 관사(e.g., 단수형("a" 및/또는 "an")은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다)를 포함하더라도, 단수형 ("a" 또는 "an")에 의한 청구항 인용의 도입이 이러한 도입된 청구항 인용을 함유하는 임의의 특정 청구항을 단지 하나의 이러한 인용을 함유하는 실시형태에 제한하는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다; 이는 청구항 인용을 도입하는데 사용되는 정관사의 사용에 적용된다. 또한, 특정 횟수의 도입된 청구항 인용이 명백히 언급되더라도, 당업계의 숙련가들은 이러한 인용이 적어도 인용된 횟수를 의미하는 것으로 해석되어야 함을 인지할 것이다(e.g., "두 개의 인용"의 드러난 인용은, 다른 수식어 없이, 적어도 두 개의 인용, 또는 두 개 이상의 인용을 의미한다). 더욱이, "A, B, 및 C 중의 적어도 하나 등"과 유사한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구성은 당업계의 숙련가가 관례를 이해한다는 의미로 의도된다(e.g., "A, B, 및 C 중의 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다). "A, B, 또는 C 중의 적어도 하나 등"과 유사한 관례가 사용되는 경우에, 일반적으로 이러한 구성은 당업계의 숙련가가 관례를 이해한다는 의미로 의도된다(e.g., "A, B, 또는 C 중의 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다). 둘 이상의 대체 용어를 나타내는 거의 모든 이접적 접속사(disjunctive) 단어 및/또는 어구가, 설명부에서든, 청구항에서든, 또는 도면에서든, 용어 중의 하나, 용어 중의 어느 하나, 또는 용어 둘 다를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되는 것으로 당업계내에서 더욱 이해될 것이다. 예를 들면, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 개시내용의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹 측면에서 기재되어 있는 경우, 당업계의 숙련가들은 개시내용이 이에 의해 마쿠쉬 그룹의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 측면에서 또한 기재됨을 인지할 것이다.
당업계의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 예를 들면, 작성된 설명을 제공한다는 측면에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 이의 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 열거된 범위는 동일 범위를 충분히 설명하고 이를 적어도 정확히 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 세분할 수 있는 것으로 용이하게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 용이하게 세분될 수 있다. 당업계의 숙련가에 의해 또한 이해되는 바와 같이, "이하(up to)", "적어도(at least)" 등과 같은 모든 언어는 언급된 횟수를 포함하며 상기 논의된 바와 같이 하위범위로 실질적으로 세분될 수 있는 범위를 가리킨다.
다양한 값들이 본원에 제공될 때에는 언제든지, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 범위는 출발 값, 종료 값, 각각의 개별 값, 또는 이들 사이의 값을 포함하는 것으로 한다. 예를 들면, "0.2 내지 0.5(from 0.2 to 0.5)"는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5; 0.2-0.3, 0.3-0.4, 0.2-0.4와 같은 이들 사이의 범위; 0.25, 0.35, 0.225, 0.335, 0.49와 같은 이들 사이의 증분; 0.26-0.39와 같은 증분 범위; 등을 의미한다. 또 다른 예로서, 1-3개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 세포를 갖는 그룹을 나타낸다. 유사하게, 1-5개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 세포 등등을 갖는 그룹을 나타낸다.
상기로부터, 본 발명의 다양한 실시형태들이 예시 목적으로 본원에 기재되었으며, 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 다양한 실시형태들은 제한하는 것으로 의도되지 않고, 진정한 범위와 취지는 하기 청구항에 의해 나타내어진다.
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agctgatcat gcgatctgct ttc 23
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 77
gcctatagaa attcttcgga atggaca 27
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 78
caaatggtat cccagactta aggg 24
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 79
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<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
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<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 81
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<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 82
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<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 83
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<210> 84
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 84
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<210> 85
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 85
gaactaacag atttacttcg gtaatg 26
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 86
aaactctaga catgcgtcta gt 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 87
gtttccaaat ggtatcccag a 21
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 88
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 89
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 92
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 93
tgcattagct agttggtaag gtaac 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 95
aggcttacca aggcgatgat 20
<210> 96
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cggcttacca aggcaatgat 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 98
gcctatagaa attcttcgga atggaca 27
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 99
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 100
ctctagacat gcgtctagtg 20
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 101
caaatggtat cccagactta aggg 24
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 102
agctgatcat gcgatctgct ttc 23
<210> 103
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 103
cggcggatgg gtgagtaac 19
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 104
cggcggatgg gtgagtaac 19
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 105
ccaagagact gggataacac ctg 23
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 106
cgcatctgct aaggatgttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 107
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<210> 108
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 108
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 109
caggcttggc atattgtcca t 21
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 110
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<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 111
cccaggtgcg ctgttccgcg ctga 24
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 112
ggcggcgaaa gtgctgtc 18
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 113
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<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 114
ttaagcatcc aactaagagc tctgt 25
<210> 115
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 115
tcttcggaat ggacatagat acaagcta 28
<210> 116
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 116
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 117
cgggtgggaa attcggt 17
<210> 118
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 118
caatgatcgg tatcgggt 18
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 119
cagcttgtag taaagaatta ctcac 25
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 120
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<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 121
ttcgcatatt gcactaaaca g 21
<210> 122
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 122
caacgccaac gaagacaag 19
<210> 123
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 123
ccagctttgt ttgcatcaa 19
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 124
aaagccgatg gtagtagaaa actgc 25
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 125
ttgaacatct ccagtttcaa aggt 24
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 126
gttggcgttg gcaatagctc tg 22
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 127
cgcctcttga tggtgatgat 20
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 128
tccggtatca cctggctc 18
<210> 129
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 129
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<210> 130
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 130
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<210> 131
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 131
aggcttgctc tttgtcgggc gagcgaacg 29
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 132
caggtcacag agatttcatc aag 23
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 133
gaaattcggt ggtacgctcc 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 134
gaaattcggt ggtactctcc 20
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 135
gttgtgactc tttcaatgcc caa 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 136
gttgtgactc tttcaacgct caa 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 137
gatgtgactc cttcaatgct caa 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 138
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<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 139
gaaagccaat agagcgtgtt ctc 23
<210> 140
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 140
gatcggtatc gggtgcttg 19
<210> 141
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 141
gatcggtatc gggttcttg 19
<210> 142
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 142
cagcgtcacc ggatttgac 19
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 143
tgattattgc tggtgg 16
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 144
tgcttgtaaa ttcgacactt tg 22
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 145
tgtaaattcg acaccttggt tga 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 146
ttgtaaattc gacactttgg ttg 23
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 147
cgacactttg attgaaaaga ttgac 25
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 148
gggtttgctt gaaagacggt a 21
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 149
cgtggtaact tattttaagc g 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 150
gggtttggtg ttgagcgata c 21
<210> 151
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 151
ttgaagatat acgtggtgga cgtta 25
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 152
gcttaagttc agcgggtagt ccta 24
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 153
ggagtttgta ccaatgagtg gaaa 24
<210> 154
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 154
acctaagcca ttgtcaaagc gatcccg 27
<210> 155
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 155
tggccaccat ttatttcata actttgacc 29
<210> 156
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 156
ctccgccttt ctttcaagca aacccag 27
<210> 157
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 157
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<210> 158
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 158
agcaacggct gggaat 16
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 159
caatgatcgg tatcgggt 18
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 160
taaagcctca ccacgatttt gacac 25
<210> 161
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 161
cccaaaaatg gccgtaagta tg 22
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 162
ctgcttgaaa gaaatatcgg agac 24
<210> 163
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 163
cgactggttg acgataatca gaggagatgg g 31
<210> 164
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 164
acccaccaaa ggctgct 17
<210> 165
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 165
cgacccacca aaggctgct 19
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 166
actgtcacac cgcccacatt 20
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 167
atagagtagc tcggtccc 18
<210> 168
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 168
tagtgatcgg tatcgagtt 19
<210> 169
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 169
cggtatcgag tttccatg 18
<210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 170
ccaaagttgt acaagcaagt acca 24
<210> 171
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 171
gagccacggt aaagaataca ca 22
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 172
tttaaagtga cccggatacc 20
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 173
ctttggatgg tcttcaacag a 21
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 174
atcaccagac ttgacgg 17
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 175
agtctgttga agaccatcca 20
<210> 176
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 176
atgtaagttc gacgaattaa tc 22
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 177
tctggcaaga tcaaggacat 20
<210> 178
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 178
gaagattctg gcaagatca 19
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 179
catctgtaac gacaatgcag c 21
<210> 180
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 180
gacaatgcag cggat 15
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 181
aactacccac gccaggacat 20
<210> 182
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 182
ccgcaactac ccacgcca 18
Claims (46)
- 생물학적 샘플에서 다수의 BV-관련 박테리아(여기서, 다수의 BV-관련 박테리아는 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 아토포비움 바지나에(Atopobium vaginae), 메가스파에라(Megasphaera) 타입 1, 및 BVAB2를 포함한다)를 검출하는 방법으로서,
상기 생물학적 샘플을 다수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계[여기서, 다수의 프라이머 쌍은 다음을 포함한다:
락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열, 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다), 및
아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)];
상기 생물학적 샘플이 BV-관련 박테리아 중의 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 생물학적 샘플로부터 아토포비움 바지나에, BVAB2, 메가스파에라 타입 1, 및/또는 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 서열의 앰플리콘, 및/또는 가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
상기 생물학적 샘플에서 BV-관련 박테리아의 존재의 표시로서 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 임상 샘플인, 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 요도, 음경, 항문, 인후, 자궁경부, 또는 질로부터 수집되는, 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 질 샘플인, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 프라이머 쌍이 서열 번호 1의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열 번호 2의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열 번호 7의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열 번호 8의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열 번호 10의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 서열 번호 11의 서열을 포함하는 제8 프라이머, 서열 번호 12의 서열을 포함하는 제9 프라이머, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 제10 프라이머, 및 서열 번호 15의 서열을 포함하는 제11 프라이머를 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 4 중의 어느 한 항에 있어서,
락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍이 서열 번호 1 및 2이고;
BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍이 서열 번호 4 및 5이고;
메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍이 서열 번호 7 및 8이고;
가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍이
a) 서열 번호 10 및 12, 또는
b) 서열 번호 11 및 12이고;
아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍이 서열 번호 1 및 2인, 방법. - 청구항 1 내지 6 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 고리-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 변위 증폭 (SDA), 레플리카아제-매개 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-유지 서열 복제 (3SR), 회전 환 증폭, 및 전사-매개 증폭 (TMA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행되는, 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 PCR이 실시간 PCR인, 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 PCR이 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)인, 방법.
- 청구항 1 내지 9 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머가 증폭 자체에는 상당한 영향 없이 증폭 산물의 증폭후 조작을 가능케 하는 외생(exogenous) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 9 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머가 5' 말단에 형광단 및 3' 말단에 형광 켄처(fluorescence quencher)를 포함하는 상보적 서열이 측면에 있는(flanked), 방법.
- 청구항 1 내지 11 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계가 증폭된 산물을 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 12에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 13에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어지는, 방법.
- 청구항 12 내지 14 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브 중의 적어도 하나가 형광 이미터 모이어티(fluorescence emitter moiety) 및 형광 켄처 모이어티(fluorescence quencher moiety)를 포함하는, 방법.
- 다수의 BV-관련 박테리아(여기서, 다수의 BV-관련 박테리아는 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 젠세니이, 가드네렐라 바지날리스, 아토포비움 바지나에, 메가스파에라 타입 1, 및 BVAB2를 포함한다)의 검출을 위한 조성물로서,
락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 15와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
BVAB2의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 서열 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다),
가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 서열 번호 10-12로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다), 및
아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)를 포함하는, 조성물. - 청구항 16에 있어서,
락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 상기 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 1의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 2의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
BVAB2a의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 상기 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 4의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 5의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
메가스파에라 타입 1의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 상기 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 7의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 8의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
가드네렐라 바지날리스의 vly 유전자에 혼성화할 수 있는 상기 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 10의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
아토포비움 바지나에의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 상기 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 12의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 14의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 15의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는, 조성물. - 청구항 16 또는 17에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함하고, 여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 18에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 19에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어지는 조성물.
- 청구항 18 내지 20 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 프로브 중의 적어도 하나가 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함하는, 조성물.
- 생물학적 샘플에서 외음질 칸디다증(VVC)-연관 칸디다 종[여기서, VVC-연관 칸디다 종은 칸디다 글라브라타(Candida glabrata ), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 두블리니엔시스(C. dubliniensis), 칸디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 칸디다 크루세이(C. krusei)를 포함한다] 및 트리코모나스 발지날리스를 검출하는 방법으로서,
상기 생물학적 샘플을 다수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계[여기서, 다수의 프라이머 쌍은 다음을 포함한다:
칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 다수의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25의 서열, 또는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및
트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 서열, 또는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)]; 및
상기 생물학적 샘플이 VVC-연관 칸디다 종 및/또는 트리코모나스 바지날리스 중의 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 생물학적 샘플로부터 칸디다 종의 tef1 서열의 앰플리콘 및/또는 트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
상기 생물학적 샘플에서 VVC-연관 칸디다 종 및 트리코모나스 바지날리스의 존재의 표시로서 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 22에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 임상 샘플인, 방법.
- 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 요도, 음경, 항문, 인후, 자궁경부, 또는 질로부터 수집되는, 방법.
- 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 질 샘플인, 방법.
- 청구항 22 내지 25 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 프라이머 쌍이 서열 번호 20의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열 번호 21의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열 번호 23의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열 번호 24의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열 번호 25의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열 번호 27의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열 번호 28의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 서열 번호 17의 서열을 포함하는 제8 프라이머, 및 서열 번호 18의 서열을 포함하는 제9 프라이머를 포함하는, 방법.
- 청구항 22 내지 25 중의 어느 한 항에 있어서,
칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 20 및 21이고;
칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머는
a) 서열 번호 23 및 24,
b) 서열 번호 23 및 35, 또는
c) 이들의 조합이고;
칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 27 및 28로 이루어지고;
트리코모나스 바지날리스의 16S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머의 쌍은 서열 번호 17 및 18인, 방법. - 청구항 22 내지 27 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 고리-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 변위 증폭 (SDA), 레플리카아제-매개 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-유지 서열 복제 (3SR), 회전 환 증폭, 및 전사-매개 증폭 (TMA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행되는, 방법.
- 청구항 28에 있어서, 상기 PCR이 실시간 PCR인, 방법.
- 청구항 28에 있어서, 상기 PCR이 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)인, 방법.
- 청구항 22 내지 30 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머가 증폭 자체에는 상당한 영향 없이 증폭 산물의 증폭후 조작을 가능케 하는 외생 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 22 내지 31 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머가 5' 말단에 형광단 및 3' 말단에 형광 켄처를 포함하는 상보적 서열이 측면에 있는, 방법.
- 청구항 22 내지 32 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 증폭된 산물의 존재 또는 양을 결정하는 단계가 증폭된 산물을 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 33에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 34에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 3, 6, 9, 13, 및 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어지는, 방법.
- 청구항 33 내지 35 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브 중의 적어도 하나가 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함하는, 방법.
- 생물학적 샘플에서 외음질 칸디다증(VVC)-연관 칸디다 종(여기서, VVC-연관 칸디다 종은 칸디다 글라브라타 , 칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스, 칸디다 파랍실로시스 , 칸디다 크루세이를 포함한다) 및 트리코모나스 바지날리스의 검출을 위한 조성물로서,
칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스, 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 다수의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25의 서열, 또는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 25와 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다);
칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다); 및
트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머(여기서, 상기 적어도 한 쌍의 프라이머 중의 각각의 프라이머는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18의 서열, 또는 서열 번호 17 또는 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다)를 포함하는, 조성물. - 청구항 37에 있어서,
칸디다 글라브라타의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 21의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
칸디다 알비칸스 , 칸디다 트로피칼리스 , 칸디다 두블리니엔시스 , 및 칸디다 파랍실로시스 중의 적어도 하나의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 다수의 프라이머는 서열 번호 23의 서열을 포함하는 프라이머, 서열 번호 24의 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열 번호 25의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
칸디다 크루세이의 tef1 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 27의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 28의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
트리코모나스 바지날리스의 AP-65 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 한 쌍의 프라이머는 서열 번호 17의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열 번호 18의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는, 조성물. - 청구항 37 또는 38에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가로 포함하고, 여기서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 39에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 40에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오타이드 프로브의 각각이 서열 번호 22, 26, 29, 및 19로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어지는 조성물.
- 청구항 39 내지 41 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 프로브 중의 적어도 하나가 형광 이미터 모이어티 및 형광 켄처 모이어티를 포함하는, 조성물.
- 가드네렐라 바지날리스의 바지놀리신 유전자(vly)에 혼성화할 수 있는 약 100개 이하 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머로서, 서열 번호 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머.
- 청구항 43에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열 번호 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어지는, 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머.
- 청구항 43에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열 번호 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머.
- 청구항 43에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열 번호 10, 11 및 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어지는, 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머.
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