KR20170132855A - 인간 피부 세포주를 향한 청색광에 대한 루테인의 보호 작용 - Google Patents

인간 피부 세포주를 향한 청색광에 대한 루테인의 보호 작용 Download PDF

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KR20170132855A
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케민 인더스트리즈, 인코포레이티드
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Abstract

인간 피부는 유효량의 루테인의 피부로의 적용에 의해 청색광에 대한 노출시의 손상에 대해 보호될 수 있다.

Description

인간 피부 세포주를 향한 청색광에 대한 루테인의 보호 작용
관련 출원
본 출원은 2015년 4월 8일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/144,409호를 우선권으로 주장하며, 상기 특허 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 인간 피부를 광 손상에 대해 보호하는 것에 관한 것으로, 더욱 구체적으로, 청색광에 대한 노출에 의한 손상으로부터 인간 피부를 보호하기 위한 루테인의 용도에 관한 것이다.
지표면에 도달하는 태양 스펙트럼의 전자기 에너지는 자외선, 가시광선 및 적외선으로 구성된다. 피부 및 조직에 대한 광 및 방사선의 효과는 과거에 특히 병리학적인 피부학적 질환을 치료하기 위한 광 및 방사선 조사원의 용도에 대해 광범위하게 연구되어 왔다(Frain-Bell W. The effect of light on the skin. British Journal of Dermatology.1988, 119:479-485). 광은 광자로서 이동하고, 생리학적 시스템 내 분자 구조에 의한 광자의 흡수는 광생물학적 반응을 개시시킨다(Rupert C.S. The biological effectiveness of Ultraviolet light. National cancer institute monograph. 1978, 50:85-89. ISSN: 0083-1921).
자외선(UV)(UVA 및 UVB 둘 모두)에 대한 피부 노출의 해로운 영향은 널리 공지되어 있다. 자외선은 UVC, UVB 및 UVA의 3개의 영역으로 분류된다. 대부분의 UVC는 오존층에 의해 여과되고, 고 에너지의 낮은 파장의 UVB는 피부의 상층부, 즉, 표피 영역에 흡수되는 한편, UVA는 피부의 진피 영역으로 좀 더 깊이 침투한다. 지금까지, 광에 대한 피부 노출에 대한 대부분의 연구는 자외선의 고 에너지, 광 반응성 및 피부에 대한 관련 손상으로 인해 자외선의 역할에 집중된 반면, 가시광선의 역할은 덜 광범위하게 연구되어 왔다(Mahmoud B.H., Hexsel C.L., Hamzavi I.H. and Lim H.W. Effects of Visible Light on the Skin. Photochem Photobiol, 2008, 84: 450-462). 사이토카인 방출, 기질 금속단백분해효소(MMP) 생성과 관련한 피부에 대한 가시광선의 영향은 리벨 등(Liebel et al) 및 몇몇 연구자에 의해 연구되었으나, 피부에 대한 청색광의 영향은 광범위하게 조사되지 않았다(Liebel F, Kaur S, Ruvolo E, Kollias N and Southall M.D. Irradiation of Skin with Visible Light Induces Reactive Oxygen Species and Matrix-Degrading Enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 2012. 132: 1901-1907; doi:10.1038/jid.2011.476).
가시광선은 전자기 스펙트럼에서 400-700 nm의 광 영역이다. 청색광은 400-500 nm 범위의 파장을 갖는 가시 영역 내 전자기 스펙트럼의 일부이다. 청색광의 파장은 UVA 스펙트럼(315-400 nm)에 가깝고, 가시 스펙트럼의 청색 영역은 더 긴 파장으로 인해 자외선보다 깊게 조직을 침투할 수 있는 비교적 고 에너지 및 긴 파장을 갖기 때문에 특히 중요하다(Godley B.F., Shamsi F.A., Liang F.Q., Jarrett S.G., Davies S. and Boulton M., Blue light induces mitochondrial DNA damage and free radical production in epithelial cells, J. Biol. Chem. 280 (2005) 21061-21066; Oplander C., Hidding S., Frauke B., Werners F.B., Born M., PalluaN. And Suschek C.V. Effects of blue light irradiation on human dermal fibroblasts. Journal of Photochemistry and photobiology B: Biology. 2011. 103: 118-125).
다양한 세포주에 대한 청색광의 유해 효과는 과거에 여러 연구 그룹에 의해 연구되었고, 그 중 일부는 문헌[Oplander et al.]에 간단히 요약되어 있다. 특히, 망막 세포에서의 청색광의 침투에 많은 초점이 맞추어졌고, 연령 관련 황반 변성의 발생에 대한 이의 영향이 많은 연구 그룹에 의해 연구되었다. 피부 및 관련 조직에 대한 청색광의 독성 효과에 대해서는 단지 적은 연구가 집중되었다.
본 연구의 목적은 인간 피부 각질세포(HEK) 및 인간 피부 섬유모세포(HDF)에서의 세포 생존력, 증식 및 활성산소종의 발생에 대한 청색광의 영향을 연구하고, 청색광에 대한 Kemin의 FloraGLO™ 루테인의 보호 효과를 확인하는 것이었다. 세포 생존력 및 활성산소종 발생 검정을 이용하여, FloraGLO 루테인이 청색광에 대해 사용된 경우 세포 독성의 감소가 HDF 및 HEK 세포에서 연구되었다.
피부는 태양으로부터의 가시광선 및 자외선(UV)에 대한 노출에 의해 유도된 스트레스를 받는다. 환경 스트레스에 대한 신체의 자연 반응으로서, 피부 세포는 광범위한 배열의 사이토카인 및 단백질 분해성 효소, 예를 들어, 기질 금속단백분해효소(MMP)를 방출하며, 이는 콜라겐 및 다른 세포외 기질 단백질의 분해를 발생시켜, 궁극적으로는 미세 주름 및 주름의 외관을 발생시킨다.
청색광은 UVA 스펙트럼에 가까운 400-500 nm의 가시 스펙트럼의 파장을 함유한다. 가시 스펙트럼의 청색 영역(400-500 nm)은 자외선보다 깊은 조직을 침투할 수 있는 비교적 고 에너지 및 긴 파장을 갖기 때문에 특히 중요하다. 세포 생존력/증식 연구 및 활성산소종 검정을 인간 피부 각질세포 및 섬유모세포에서 수행하여, 청색광의 독성 및 청색광에 대한 루테인의 보호 작용을 결정하였다. 세포 배양 연구로부터, 청색광은 상기 세포주에서 독성을 유도하며, 루테인은 보호 효과를 제공할 수 있었다.
도 1은 활성산소종(ROS) 검정 계획의 차트이다.
도 2는 인간 표피 각질세포에서의 청색광의 노출에 대한 다양한 처리에 대한 세포 생존력 %로 제시되는 세포 생존력의 차트이다. "미처리" 대조군은 생물학적 후드의 실온 및 CO2 인큐베이터의 37℃에서 청색광에 대한 노출이 없는 것이다. 표시된 데이터 포인트는 n= 3의 평균 ± S.D.이다(동일 문자를 갖는 평균은 서로 통계적으로 유의하지 않다).
도 3은 인간 피부 섬유모세포에서의 청색광의 노출에 대한 다양한 처리에 대한 세포 생존력 %로 제시되는 세포 생존력의 차트이다. "미처리" 대조군은 생물학적 후드의 실온 및 CO2 인큐베이터의 37℃에서 청색광에 대한 노출이 없는 것이다. 표시된 데이터 포인트는 n= 3의 평균 ± S.D.이다(동일 문자를 갖는 평균은 서로 통계적으로 유의하지 않다).
도 4a 및 4b는 (a) 각질세포 및 (b) 섬유모세포 배지에서의 2',7'-디클로로디하이드로플루오레신(DCF) 검정에 대한 표준 교정 곡선이며; 0-10000 nM로부터 제조된 DCF(x-축)가 상대 형광 단위(y-축)에 대해 작도되었다.
도 5는 청색광의 노출에 대한 다양한 처리에 대한 인간 표피 각질세포를 이용한 ROS 검정 결과의 차트이며; 음성 대조군은 실온에서 청색광에 대한 노출이 없는 것이고; 표시된 데이터 포인트는 n= 3의 평균 ± S.D.이고; 순수한 DMSO로 처리되고 청색광에 노출된 세포가 DMSO 효과에 대한 대조군으로 제공된다(동일 문자를 갖는 평균은 서로 통계적으로 유의하지 않다).
도 6은 청색광의 노출에 대한 다양한 처리에 대한 인간 피부 섬유모세포를 이용한 ROS 검정 결과의 차트이며; 음성 대조군은 실온에서 청색광에 대한 노출이 없는 것이고; 표시된 데이터 포인트는 n= 3의 평균 ± S.D.이고; 순수한 DMSO로 처리되고 청색광에 노출된 세포가 DMSO 효과에 대한 대조군으로 제공된다(동일 문자를 갖는 평균은 서로 통계적으로 유의하지 않다).
본 개시는 루테인을 함유하는 미용 및/또는 약학적 제제에 관한 것이다.
예시적 미용 조성물은, 예를 들어, 일광차단 조성물, 청색광 및/또는 자외선 보호 조성물, 노화 방지 조성물, 주름 방지 조성물, 보습제 조성물, 피부 진정 조성물, 피부 연화 조성물, 피부 치료 조성물, 항염증 조성물, 항산화 조성물, 및 자유 라디칼 억제 조성물을 포함한다.
루테인을 기초로 하는 미용 및/또는 약학적 제제는 놀랍게도 높은 피부학적 적합성과 결부된 스트레스 및 환경 영향에 대한 우수한 피부 및 관리 및 보호 특성을 나타낸다. 상기 제제는 또한 한편으로 염증 반응 및 산화-유도 피부 노화 과정에 대해 피부를 보호하는 높은 항산화 능력을 특징으로 하며; 다른 한편으로, 미용 제제는 동시에 산화 분해(악화)에 대해 보호된다. 또한, 이와 같이 획득된 생성물은 청색광에 의한 인간 섬유모세포 및 각질세포의 손상을 방지할 수 있고, 이에 따라 화장품에서 태양 보호 인자로 사용될 수 있다. 상기 제제는 항산화 스트레스 적용 및 또한 손상된 피부(청색광 및 일반 손상 둘 모두)의 복구에 유용하다.
언급된 제제에서 사용되는 루테인의 양은 개별적 성분의 농도 및 추출물이 사용되는 방식에 의해 결정된다. 일반적으로, 루테인은 최종 미용 및/또는 약학적 제제를 기초로 한 양, 예를 들어, 약 10 중량ppm 내지 약 1 중량%, 바람직하게는 약 0.25 중량ppm 내지 약 0.1 중량%, 더욱 특히 약 50 중량ppm 내지 약 500 중량ppm의 양으로 사용된다. 상기 제제는 당 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 개시는 또한 특히 스트레스에 대한 피부 및/또는 모발 관리 제제, 및 수분-조절 보습제에서의 루테인의 용도에 관한 것이다. 상기 제제는 항산화 스트레스 적용 및 또한 손상된 피부 및 모발(청색광 및 일반 손상 둘 모두)의 복구에 특히 유용하다.
본 개시의 상황에서의 관리 제제는 피부 관리 제제인 것으로 이해된다. 이들 관리 제제는 청색광 보호 특성을 갖는다. 원칙적으로, 본 개시에 따른 추출물은 다양한 미용 제품에 사용될 수 있다.
조성물의 보습 시스템은 피부의 보호와 동시에 피부에 실질적인 보습을 제공하도록 제형화될 수 있다. 피부에 대한 실질적인 보습은 본 개시의 보습 시스템에 의해 달성될 수 있음이 밝혀졌다.
적합한 임의의 보습 성분은 1종 이상의 폴리올, 실록산, 천연 발생 지방 및 오일, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
보습 성분으로 사용될 수 있는 1종 이상의 폴리올은 글리세린, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 카프릴릴 글리콜, 소르비톨, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시에서 보습 성분으로 사용될 수 있는 1종 이상의 실록산은 디메티콘, 사이클로메티콘, 페닐 트리메티콘, 페닐 디메티콘, 세틸 디메티콘, 스테아릴 디메티콘, 아모디메티콘, C30-45 알킬 디메티콘, C30-45 알킬 메티콘, 세테아릴 메티콘, 디메티콘 코폴리올, 사이클로펜타실록산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시에서 보습 성분으로 사용될 수 있는 1종 이상의 천연 발생 지방 및 오일은 시어 버터, 시어 버터 오일, 코코아 버터, 호호바 버터, 알로에 버터, 올리브 버터, 코코넛 오일, 호호바 오일, 올리브 오일, 해바라기 종자 오일, 메도우폼(meadowfoam) 종자 오일, 마카다미아넛 오일, 참기름, 보리지(borage) 종자 오일, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 UV 필터는 디벤조일메탄, 옥시벤존, 술리소벤존, 디옥시벤존, 멘틸 안트라닐레이트, 파라 아미노벤조산(PABA) 에스테르, 벤조페논-3, 부틸디벤조일메탄, 디메틸 신나메이트, 옥틸 메톡시신나메이트, DEA 메톡시신나메이트, 옥토크릴렌, 드로메트리졸 트리실록산, 옥틸 살리실레이트, 호모멘틸 살리실레이트, 옥틸 디메틸 PABA, TEA 살리실레이트, 4-메틸 벤질리덴 캠퍼, 3-벤질리덴 캠퍼, 벤질리덴 캠퍼 설폰산 에스테르, 옥틸 트리아존, 페닐 벤즈이미다졸 설폰산 에스테르, 테레프탈리디엔 디캠퍼 설폰산 에스테르, 디-t-부틸 하이드록시벤질리덴 캠퍼, 에틸 PABA, 부틸메톡시 디벤조일메탄(아보벤존), 테레프탈리디엔 메틸렌 비스-벤조트리아조일테트라메틸부틸-페놀, 디에틸헥실-2,6-나프탈레이트, 비스-에틸헥실옥시페놀 메톡시페놀 트리아진, 하이드록시 메틸페닐 벤조트리아졸, 메틸렌 비스-벤조트리아조일테트라메틸부틸페놀, 비스-에틸헥실옥시페놀 메톡시페놀 트리아진, 하이드록시벤조페논, 벤조트리아졸, 디벤조일 메탄, 옥사닐리드, 하이드록시 신나메이트, 오일 분산성 티타늄 디옥사이드, 오일 분산성 아연 옥사이드, 실리콘-고정 일광차단제, 파라 아미노벤조산(PABA), 살리실산, TEA 살리실레이트, 벤질리덴 캠퍼 설폰산, 페닐 벤즈이미다졸 설폰산, 테레프탈리디엔 디캠퍼 설폰산, 하이드록시 신남산, 이들의 임의의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 적합한 첨가제는 항산화제, 예를 들어, 에리트로브산, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트, 로즈마리 추출물, 토코페롤, 토코페롤의 유도체, 예를 들어, 토코트리엔, 카로틴, 카로티노이드, 루테인 또는 루테인 에스테르, 카로티노이드, 페놀성 항산화제, 바이오플라보노이드, 식물 추출물, 또는 이들의 임의의 조합물; 각질용해제, 예를 들어, 살리실산, 레조르시놀, 유기산의 퍼옥사이드, 또는 이들의 임의의 조합물; 항염증제, 예를 들어, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제, 항염증 활성이 입증된 식물 추출물, 또는 이들의 임의의 조합물; 비타민, 예를 들어, 비타민 K, 비타민 C, 레티놀(비타민 A), 토코페롤, 또는 이들의 임의의 조합물; 피부연화제, 예를 들어, 세테아릴 옥타노에이트, 옥틸 팔미테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 카프릴릭 트리글리세라이드, 카프릭 트리글리세라이드, 또는 이들의 임의의 조합물; 습윤제, 예를 들어, 히알루론산, 히알루론산의 1종 이상의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합물; 피부 침투 향상제, 예를 들어, 오존, SEPA, 부틸렌 글리콜, 불포화 지방산의 시스-이성질체, 또는 이들의 임의의 조합물; 유화제, 예를 들어, 글리세릴 스테아레이트, 세테아릴 알콜, 세틸 알콜, PEG-40 스테아레이트, 또는 이들의 임의의 조합물; 증점제, 예를 들어, 잔탄 검, 카르보머, 점토, 하이드록시에틸 셀룰로스, 또는 이들의 임의의 조합물; 보존제, 예를 들어, 알킬 파라벤, 알콜, 벤조산의 염, 소르브산의 염, 또는 이들의 임의의 조합물; 착색제, 예를 들어, 합성 및 천연 착색제, 헤너, 캐러멜, 광변색 및 열변색 착색제 및 안료, 표면-처리 또는 소수성으로 변형된 착색제, 또는 이들의 임의의 조합물; 유기산 및 이들의 유도체, 예를 들어, 시트르산, 글리콜산, 글루탐산, 글루코 델타 락톤, 또는 이들의 임의의 조합물; 킬레이트제, 예를 들어, 디소듐 EDTA; 약 3.0 내지 약 7.5로 pH를 조정하거나 유지시키기 위한 pH 조절제, 예를 들어, 산, 염기, 완충제, 또는 이들의 임의의 조합물; 방향제; 단백질; 펩티드; 및 아미노산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
조성물은 바디 워시, 막대 비누, 액체 비누, 비누거품, 피부 및/또는 모발 관리 제제, 크림, 발포체(foam), 젤, 로션, 용액, 에멀젼, 포마드, 무스, 밤(balm), 스틱(stick), 펌프 스프레이, 에어로졸 스프레이, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 개인 관리 제품 형태에 적용 가능하다.
본 개시는 유효량의 루테인 및 1종 이상의 보습 시스템을 갖는 조성물을 피부에 국소적으로 적용하는 단계를 갖는, 동시적으로 청색광에 대해 피부를 보호하고 피부를 보습하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 태양 보호 제제, 예를 들어, 일광차단제에서의 루테인의 용도에 관한 것이다. 본 개시의 상황에서의 태양 보호 인자 또는 청색광 보호 인자는 직접 및 간접 태양 방사선의 유해한 영향에 대해 인간 피부 및/또는 모발을 보호하는데 유용한 광 보호 인자이다.
루테인을 함유하는 조성물은 청색광 방사선을 무해한 열로 전환시키는 청색광 필터로 사용된다. 이들은 추가로 다른 태양 보호 인자 또는 UV 보호 인자와 함께 존재할 수 있다.
이들 UV 보호 인자는, 예를 들어, 실온에서 액체 또는 결정체이며, 자외선을 흡수하고, 흡수된 에너지를 더 긴 파장의 방사선, 예를 들어, 열의 형태로 방출할 수 있는 유기 물질(광 필터)이다. UV-B 필터는 유용성 또는 수용성일 수 있다. 다음은 유용성 물질의 예이다: 3-벤질리덴 캠퍼 또는 3-벤질리덴 노르캠퍼 및 이들의 유도체, 예를 들어, EP-B1 0693471에 기재된 바와 같은 3-(4-메틸벤질리덴)-캠퍼; 4-아미노벤조산 유도체, 바람직하게는 4-(디메틸아미노)-벤조산-2-에틸헥실 에스테르, 4-(디메틸아미노)-벤조산-2-옥틸 에스테르 및 4-(디메틸아미노)-벤조산 아밀 에스테르; 신남산의 에스테르, 바람직하게는 4-메톡시신남산-2-에틸헥실 에스테르, 4-메톡시산남산 프로필 에스테르, 4-메톡시산남산 이소아밀 에스테르, 2-시아노-3,3-페닐신남산-2-에틸헥실 에스테르(옥토크릴렌); 살리실산의 에스테르, 바람직하게는 살리실산-2-에틸헥실 에스테르, 살리실산-4-이소프로필벤질 에스테르, 살리실산 호모멘틸 에스테르; 벤조페논의 유도체, 바람직하게는 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논, 2-하이드록시-4-메톡시-4'-메틸벤조페논, 2,2'-디하이드록시-4-메톡시벤조페논; 벤잘말론산의 에스테르, 바람직하게는 4-메톡시벤즈말론산 디-2-에틸헥실 에스테르; 트리아진 유도체, 예를 들어, 2,4,6-트리아닐리노-(p-카르보-2'-에틸-1'-헥실옥시)-1,3,5-트리아진 및 옥틸 트리아존 또는 디옥틸 부타미도 트리아존; 프로판-1,3-디온, 예를 들어, 1-(4-터트.부틸페닐)-3-(-4'-메톡시페닐)-프로판-1,3-디온; 케토트리사이클로(5.2.1.0)데칸 유도체.
일광차단제 제조를 위해, 루테인을 함유하는 조성물은 일광차단제 조성물에 일광차단 증강 효과를 부여하는데 효과적인 양으로 존재할 수 있고, 직접 및 간접 태양 방사선의 유해한 효과에 대해 인간 피부 및/또는 모발을 보호하는데 있어서 통상적인 일광차단제 제제의 효과를 증가시킬 수 있다.
본 개시는 또한 청색광 방사선에 의한 섬유모세포 및/또는 각질세포 손상에 대한 제제에서 및 항염증 첨가제로서의 루테인 함유 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 개시에 따른 수분 조절 보습제는 피부 수분을 조절하도록 의도된 피부 관리 제제인 것으로 이해된다. 본 개시의 상황에서, 이는 보습제의 정의와 일치한다. 이들은 피부 표면에 적용하여 피부 상에 퍼진 후 각질층(각질 층)으로부터 수분의 방출을 감소시키는 능력을 미용 및/또는 약학적 제제에 제공하는 물질 또는 물질의 혼합물이다.
본 개시에 따른 조성물은 피부 관리에 사용되는 미용 및/또는 약학적 제제를 위한 피부 진정 및/또는 피부 연화 첨가제로 사용될 수 있다.
원칙적으로, 본 개시에 따른 조성물은 피부의 염증에 대해 및 따라서 피부 관리에서 사용되는 임의의 미용 및/또는 약학적 제제를 위한 항염증성 첨가제로 사용될 수 있다. 피부의 염증은 다양한 요인에 의해 야기될 수 있다.
구체예에서, 미용 조성물은 피부에 국소적으로 적용되도록 제공된다. 본 개시의 미용 조성물은 국소 투여용으로 제형화될 수 있고, 산화 스트레스를 감소시키기 위해 피부에 적용될 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 시스템에서 자유 라디칼 연쇄 반응을 종결시키는 능력을 갖는 항산화 특성을 갖는 조성물이다. 산화 스트레스는 항산화 방어 시스템과 자유 라디칼을 포함하는 활성산소종 형성 사이의 불균형의 결과이다. 산화 스트레스는 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물을 손상시킬 수 있고, 또한 세포내 신호전달 과정을 변경시킬 수 있다. 상기 손상은 세포 손상 및 사멸에 기여할 수 있고, 노화 과정을 가속화시킬 수 있고, 많은 질병, 예를 들어, 암, 심혈관 질환, 및 파킨슨병을 촉진시킬 수 있다. 상기 제제는 항산화 스트레스 적용 및 또한 손상된 피부 및 모발(청색광 및 일반 손상 둘 모두)의 복구에 특히 유용하다.
본 개시는 또한 항산화제 또는 라디칼 트랩(radical trap)으로서 루테인을 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 항산화제는 보호되는 물질에서 산소 및 기타 산화 과정의 영향에 의해 야기되는 변화를 억제하거나 방지할 수 있다. 항산화제의 효과는 주로 자가산화 동안 발생하는 자유 라디칼에 대한 라디칼 트랩으로서의 이들의 작용으로 이루어진다. 조성물은 원하는 자유 라디칼 제거 활성을 나타낸다.
본 개시의 미용 조성물은 통상적으로 국소 형태로 사용된다. 국소 형태는 용액, 에멀젼, 세럼, 피부 및/또는 모발 클렌저, 바디 워시, 바디 스크럽, 막대 비누, 액체 비누, 샴푸 거품, 탈취제, 피부 및/또는 모발 관리 제제, 발포체, 무스, 크림, 로션, 포마드, 밤, 스틱, 젤, 펌프 스프레이, 에어로졸 스프레이, 및 이들의 조합물일 수 있다. 예시적 구체예에서, 본 개시의 미용 조성물은 개인 관리 용도, 예를 들어, 비누, 샴푸, 피부 클렌저, 거품 입욕제, 면도 비누, 경구용 제품 등의 발포체에서 사용된다. 미용 조성물은 원하는 발포, 유화, 세정, 분산, 및/또는 피부 진정 특성을 부여할 수 있다.
본 개시의 조성물은 조성물이 피부에 적용되는 경우 이의 분포 및 흡수를 촉진하기 위해 성분에 대한 희석제, 분산제 또는 담체로서 작용하는 "미용적으로 허용되는 담체"를 포함한다. 물이 아닌 또는 물에 더한 비히클은 액체 또는 고체 피부연화제, 용매, 습윤제, 증점제, 분말, 및 향수를 포함할 수 있다.
본 개시의 상황에서, 생물기원 제제는, 예를 들어, 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 토코페롤 팔미테이트, 아스코르브산, 데옥시리보핵산, 레티놀, 비사보롤, 알란토인, 피탄트리올, 판테놀, 아미노산, 세라미드, 슈도세라미드, 정유, 기타 식물 추출물 및 비타민 복합체이다. 생물기원 제제는 일반적으로 약 0.01 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10 중량%의 양으로 본 개시의 조성물에 존재할 수 있다. 생물기원 제제는 당 분야에 공지된 통상적인 물질이다.
통상적인 수용성 첨가제는, 예를 들어, 보존제, 수용성 향수, pH 조절제, 예를 들어, 완충제 혼합물, 수용성 증점제, 예를 들어, 수용성 천연 또는 합성 중합체, 예를 들어, 잔탄 검, 하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 또는 고분자량 폴리에틸렌 옥사이드이다. 수용성 첨가제는 일반적으로 약 0.01 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10 중량%의 양으로 본 개시의 조성물에 존재할 수 있다. 수용성 첨가제는 당 분야에 공지된 통상적인 물질이다.
적합한 보존제는, 예를 들어, 페녹시에탄올, 포름알데하이드 용액, 파라벤, 펜탄디올 또는 소르브산이다. 보존제는 당 분야에 공지된 통상적인 물질이다.
본 발명의 조성물은 생물학적 시스템에서 자유 라디칼 연쇄 반응을 종결시키는 능력을 가지며, 따라서 소비자에게 추가적인 건강상의 이익을 제공할 수 있는 강한 항산화 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 항산화 방어 시스템과 자유 라디칼을 포함하는 활성산소종의 형성 사이의 불균형의 결과인 심각한 산화 스트레스는 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물을 손상시킬 수 있으며, 또한 세포내 신호전달 과정을 변경시킬 수 있다. 상기 손상은 세포 손상 및 사멸에 기여할 수 있고, 노화 과정을 가속화시킬 수 있고, 많은 질병, 예를 들어, 암, 심혈관 질환, 당뇨병, 관절염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 자유 라디칼 관련 질병을 촉진시킬 수 있다.
본 개시의 조성물은 많은 미용 적용에서 사용될 수 있다. 바람직한 미용 적용은, 예를 들어, 하기를 포함한다:
(i) 일광차단제 로션; 조성물이 청색광 방사선으로부터 피부를 보호하는 능력을 갖고, 태양 보호 로션을 제조하는데 사용될 수 있음에 따름;
(ii) 노화 방지 또는 주름 방지 크림; 상기 조성물은 인간 세포에 손상을 일으키는 라디칼을 제거하는 능력을 갖는 것에 더하여 천연 항산화 특성을 가지며; 이러한 특성은 노화 과정을 감속시키는 것으로 공지됨; 및
(iii) 보습제; 상기 조성물은 수분 손실로부터 피부를 보호할 잠재력을 가지며, 이는 궁극적으로 많은 피부 질환의 위험을 감소시킴.
실시예 1
재료 및 방법
세포 배양 연구. 모든 세포 배양 연구를 HEK 세포[HEK001 (ATCC® CRL-2404™) lot #61331463] 연속 세포주 및 인간 피부 섬유모세포(HDF)[CCD1093Sk (ATCC® CRL2115™) lot # 3296816] 세포주[ATCC, Manassas, VA]를 이용하여 수행하였다.
HEK 세포에 사용된 성장 배지는 ATCC 지침에 따라 제조하였다. 성장 배지는 5 ng/mL 인간 재조합 표피 성장 인자(EGF)(ATCC, lot # 1584416) 및 2 mM L-글루타민(ATCC, lot # 62195752)(소 뇌하수체 추출물 및 혈청을 함유하지 않음)을 갖고, 페니실린(10000 유닛) 및 스트렙토마이신(10 mg/mL) 용액(Gibco, lot # 1469707)이 보충된 각질세포 혈청 비함유 배지(GIBCO-BRL 17005042, lot # 1638561)로 구성된다. HDF 세포에 사용된 성장 배지는 10% FBS를 갖고, 페니실린(10000 유닛) 및 스트렙토마이신(10 mg/mL) 용액이 보충된 이글(eagle) 최소 필수 배지(EMEM)(ATCC-302003, lot #62028896)로 구성된다. 세포를 37℃에서 유지시키는 5% CO2 환경 인큐베이터(NuAire, MN)에서 약 80% 컨플루언스(confluence)까지 세포 배양 플라스크(75 cm2)[Fisher Scientific, 카탈로그 번호 10-126-37]에서 성장시켰다. 컨플루언스 세포를 중화 및 원심분리 후 트립신처리에 의해 이후 배양으로 통과시켰다. HEK 및 HDF 배양물을 일상적으로 모든 실험의 시작 및 종료, 및 배지 교환 및 분할 후에 시각적으로 관찰하였다. 모든 실험을 계대배양 횟수 97의 HEK 세포 및 계대배양 횟수 9의 HDF 세포로 수행하였다.
세포 생존력 및 증식 검정. 각질세포 및 섬유모세포에 대한 청색광의 효과를 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드), MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨), 및 대사적으로 활성인 세포의 생존력 및 증식을 측정함에 의한 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 검정을 이용하여 연구하였다. 컨플루언스에 도달한 후, 세포를 세포 배양 플라스크로부터 분리시키고, 100,000 세포/mL의 밀도(200 μL)로 투명/흑색/백색 벽 96-웰 마이크로플레이트(Fisher Scientific, 카탈로그 번호 07-200-87)에 시딩하였다. 10 μl 분취량의 세포 현탁액을 10 μl의 트립판 블루(Trypan blue) 착색제(0.4 %)[Life Technologies, Grand Island, NY]로 착색시킨 후 혈구계(Hausser scientific, PA)를 이용하여 세포 계수를 수행하였다.
FloraGLO™ 루테인(제품 번호 M080033, 로트(lot) 번호 1405102477, 제조일 06/04/2014)을 적어도 6시간 동안 간헐적 진탕과 함께 멸균 디메틸 설폭시드(DMSO)[ATCC, lot #61908420]에 용해시켜 2 mg/mL 용액의 스톡을 획득하였다. 스톡으로부터 2.5, 5 및 10 μl의 루테인 용액을 100 μl 배지를 함유하는 웰에 첨가하여, 해당 웰에서 50, 100 및 200 ppm의 최종 루테인 농도를 획득하였다. 1 mM의 과산화수소(H2O2)[Sigma, lot #WKBS8306V] 용액을 모든 연구에서 양성 대조군으로 제공하였다. 2.5, 5 및 10 μl의 순수한 DMSO를 몇몇 웰에 첨가하여 DMSO 대조군을 만들었다.
처리 및 모든 대조군 첨가 후, 마이크로플레이트를 30 cm 떨어진 거리에서 9시간 동안 청색 LED 광(476 nms, 1900 lux)[품목 번호 #LED72-B(QL-72B); Mainlandmart]에 노출시켰다. 루테인으로 처리되지 않은 세포를 청색광 대조군으로 제공하였다. 청색광에 노출되지 않은 유사한 방식으로 제조된 또 다른 마이크로플레이트를 미처리 대조군으로 제공하였다. 9시간의 처리 기간 종료 후, 세포 생존력 검정을 수행하였다.
MTS 검정. CellTiter 96® AQueous 원 솔루션 시약(one solution reagent)(Promega, Madison, WI, 카탈로그 번호 G3580, lot # 0000120696)을 사용 전에 10분 동안 37℃의 수조에서 완전히 해동시키고, 상기 시약 20 μl를 세포를 함유하는 96 웰 플레이트 내의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 4시간 동안 가습화된 5% CO2 대기하에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 490 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax® Me5, Molecular Devices, LLC. Sunnyvale, CA)를 이용하여 기록하였다.
MTT 검정. CellTiter 96® 비-방사성 세포 증식 검정(Promega, Madison, WI, 카탈로그 번호 G4002, lot # 0000130044)은 테트라졸륨 염의 포르마잔 생성물로의 세포 전환을 기초로 한다. CellTiter 96® 검정으로부터의 사전 혼합된 최적화 염료 용액(15 μl)을 96-웰 플레이트의 배양 웰에 첨가하고, 4시간 동안 인큐베이션하였다. 살아 있는 세포는 염료 용액의 테트라졸륨 성분을 포르마잔 생성물로 전환시킨다. 가용화 용액/정지 혼합물(100 μl)을 배양 웰에 첨가하여 포르마잔 생성물을 용해시키고, 흡광도를 570 nm에서 측정하였다.
CellTiter - Glo ® 발광 세포 생존력 검정. CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 검정(Promega, Madison, WI, 카탈로그 번호 G755A, lot # 0000104605)은 대사적으로 활성인 세포의 존재를 신호하는 존재하는 ATP의 정량을 기초로 하여 배양물 내의 살아 있는 세포의 수를 결정하는 균일한 방법이다. 균일한 검정 절차는 혈청-보충 배지에서 배양되는 세포에 단일 시약(CellTiter-Glo® 시약)을 직접 첨가하는 것을 포함한다. 100 μl의 Cell Titer-Glo 시약을 100 μl 기본 배지와 함께 세포를 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 안정화 후, 발광을 기록하였다. 균일한 "첨가-혼합-측정" 포맷은 세포 용해 및 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호의 발생을 초래한다. ATP의 양은 배양물에 존재하는 세포의 수에 직접 비례한다. CellTiter-Glo® 검정은 안정적인 "글로우(glow)-타입" 발광 신호를 발생시키는 전매의 열안정성 루시페라제(Ultra-Glo™ 재조합 루시페라제)의 특성에 의존한다.
청색광의 차폐. 세포를 상기 기재된 바와 같이 컨플루언스로 성장시켰다. 청색광에 대한 FloraGLO 루테인의 차폐 능력을 관찰하기 위해, HEK 및 HDF 세포로 시딩된 마이크로플레이트를 디메틸 설폭시드(DMSO)를 이용하여 50, 100 및 200 ppm 농도로 제조된 FloraGLO™ 루테인을 상부에 함유하는 또 다른 편평 바닥 멸균 플레이트로 덮었다. 이들 세포를 9시간 동안 청색 LED 광에 노출시켰고, 세포를 함유하는 덮지 않은 마이크로플레이트(청색광의 직접 노출)를 청색광 대조군으로 제공하였다. 청색광으로부터 멀리 떨어져 있는 마이크로플레이트에 시딩된 세포를 미처리 대조군으로 제공하였다. 청색광원을 배양 플레이트 위에 위치시켰다. 노출 9시간 후, 세포 생존력을 테트라졸륨 화합물이 살아 있는 세포에 의해 생체 환원되어 포르마잔을 생성시키는 비색 검정(MTS 검정)을 이용하여 측정하였다.
활성산소종 ( ROS ) 검정. 활성산소종(ROS) 검정 계획의 차트가 도 1에 제시된다. ROS 활성을 Oxiselect™ 세포내 ROS 검정 키트(Cell BioLabs, San Diego, CA, 카탈로그 번호 STA 342, lot #59342025)를 이용하여 측정하였다. 세포를 100,000 세포/mL의 밀도(200 μL)로 96-웰 마이크로플레이트에 시딩하였다. 둘 모두의 세포주를 세포 투과성 형광 프로브 2',7'-디클로로하이드로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA)로 처리하였다. 세포를 D-PBS로 몇번 세척하고, 다양한 농도의 루테인으로 처리하고, 9시간 동안 청색 LED 광(476 nm)에 노출시켰다(루테인으로 처리되지 않은 세포가 청색광 대조군으로 제공될 것이다). 순수한 DMSO로 처리된 세포를 청색광의 존재 및 부재하에서의 DMSO 효과에 대한 대조군으로 제공하였다. 세포를 D-PBS로 2-3회 다시 세척하고, 100 μL의 신선한 배지 및 100 μL의 2X 세포 용해 완충제를 첨가하였다. 5분 인큐베이션 후, 150 μL의 상기 배지를 흑색 벽 96-웰 플레이트로 옮기고, 형광을 측정하였다. 1 mM의 과산화수소를 양성 대조군으로 사용하였다.
통계 분석. 값을 평균 ± 표준 편차(SD)로 보고하였다. 데이터를 독립표본 t-검정을 이용하여 분석하였다. P < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
결과
FloraGLO™ 루테인을 DMSO에 용해시키고, 세포 배양물에 적용하였다. 루테인은 이의 친지질성 특성으로 인해 세포 배양 상용성 배지에 용해되지 않는다. DMSO에서의 루테인의 제한된 용해도로 인해, 세포 배양 웰에서 루테인의 50-200 ppm 최종 농도를 달성하기 위해 사용된 DMSO 부피는 높았다. 다양한 검출 메커니즘을 갖는 세포 생존력 검정을 위한 본 발명의 초기 시도에서, 상기 고농도의 DMSO는 세포 배양막과 상호작용하여, 세포 증식에서의 감소 및 대조군에 비한 세포 생존력에서의 감소를 야기시킬 수 있다.
세포 배양 연구에서 고농도의 DMSO의 존재로 인한 세포 생존력 연구에서의 제한된 성공으로, 세포를 함유하는 마이크로플레이트의 상부에 차폐제로서의 루테인 용액을 놓아 루테인 용액으로 청색광의 침투를 차단함으로써 청색광의 침투를 방지하도록 실험을 설계하였다.
루테인을 이용한 청색광 차폐 연구로부터의 세포 증식 검정. HEK 및 HDF 세포에서 청색광의 차폐를 이용한 세포 생존력 검정의 결과가 도 2 및 3에 제시된다. 상기 연구를 MTS 검정을 이용하여 수행하였다. 미처리 대조군에 비해 청색광 노출의 경우 세포 증식에서의 유의한 감소(도 2의 HEK 세포의 경우 약 52% 및 도 3의 HDF 세포의 경우 약 55%)가 있었다(p <0.05). 마찬가지로, 50, 100 및 200 ppm 농도의 루테인의 존재하에서 청색광에 노출된 세포의 경우, 세포 증식은 청색광 대조군 연구에서의 세포에 비해 유의하게 개선되었고(p <0.05), 이는 루테인이 둘 모두의 세포주에서 청색광에 의해 야기되는 손상을 방지할 수 있음을 암시한다.
ROS 검정. 세포내 활성산소종(ROS) 활성 및 산화 스트레스를 세포 내의 하이드록실, 퍼옥실 및 다른 자유 라디칼을 측정할 수 있는 Oxiselect™ 세포내 ROS 검정 키트를 이용하여 측정하였다. 활성산소종은 세포 수준에서 산화 스트레스를 야기시킬 수 있고, 산화 스트레스는 NF-κB 신호전달 경로, 스트레스-활성화 키나제를 활성화시킬 수 있으며, 괴사에 의한 세포 사멸을 발생시킬 수 있다.
세포로의 첨가시, 비-형광 DCFH-DA는 세포막을 가로질러 잘 침투하고, 세포 에스테라제에 의해 비-형광 2',7'-디클로로디하이드로플루오레신(DCFH)으로 신속히 탈아세틸화된다. DCFH는 활성산소종의 존재하에서 형광 2',7'-디클로로디하이드로플루오레신(DCF-녹색 형광)으로 신속히 산화될 것이다. 형광 강도는 세포의 세포질 내의 ROS 수준에 비례한다. 상대 형광 단위(RFU)를 이용하여 둘 모두의 세포 배지에서 다양한 농도(0 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM 및 10,000 nM)의 표준 DCF로 표준 교정 곡선을 작도하였다(도 4a 및 4b).
상대 형광 단위와 관련하여 HEK 및 HDF 세포 둘 모두에서의 활성산소종의 발생이 도 5 및 6에 제시된다. 세포가 청색광에 노출된 경우, ROS에 의해 발생된 세포 내에서의 DCF의 존재를 나타내는 형광 신호에서의 유의한 증가가 있었다. 세포가 50, 100 및 200 ppm 농도의 루테인의 존재하에서 청색광에 노출된 경우, 형광 신호는 낮았고, 이는 루테인이 청색광을 흡수하고, ROS의 발생을 방지함으로써 청색광으로부터의 보호를 발생시키는 것을 입증한다. ROS 생성에서의 DMSO의 임의의 가능한 간섭을 확인하기 위해 10 μl 및 20 μl 부피의 순수한 DMSO를 사용하여 청색광의 존재 및 부재하에서 DMSO 대조군 연구를 또한 수행하였다.
논의
9시간 동안 청색광에 대한 노출 후, 미처리 대조군에 비해 세포 증식에서 약 50-55% 감소가 있었다. 1 mM로 사용되는 H2O2를 이들 세포에서 세포독성을 유도하기 위한 양성 대조군으로 제공하였다. 도 2 및 3으로부터, 50, 10 및 200 ppm 농도로 제조된 루테인 용액은 청색광 노출에 대한 세포 증식 %에서 관찰될 수 있는 바와 같이 청색광을 효과적으로 차폐하였다. 결과는 루테인이 시험된 모든 농도에서 청색광을 흡수함으로써 각질세포 및 섬유모세포에 대한 청색광의 노출을 방지하는 것을 나타낸다. 생체활성인 루테인은 HEK 및 HDF 세포에서 세포독성을 유도하는 유해한 청색광선을 차단함으로써 피부 손상 및 조기 노화 징후를 방지하는 잠재적 이점을 갖는다. ROS 연구로부터, 세포 배양 연구에서 루테인의 존재가 청색광에 노출된 경우에도 활성산소종의 발생을 방지할 수 있고, 루테인이 청색광 노출에 의해 야기될 수 있는 산화 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있음을 명백히 알 수 있다.
상기 설명 및 도면은 본 발명의 예시적 구체예를 포함한다. 본원에 기재된 상기 구체예 및 방법은 당업자의 능력, 경험 및 선호를 기초로 하여 변화될 수 있다. 단지, 특정 순서로 방법의 단계를 목록화시키는 것은 방법의 단계의 순서에 대한 임의의 제한을 두는 것이 아니다. 상기 설명 및 도면은 단지 본 발명을 설명하고 예시하는 것이며, 본 발명은 여기에 제한되지 않으며, 단지 청구범위로 제한된다. 본 개시를 미리 숙지한 당업자는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 본원에서 변형 및 변화를 가능하게 할 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. 유효량의 루테인을 함유하는 조성물을 피부에 적용하는 단계를 포함하는 청색광에 대한 노출시의 손상에 대해 인간 피부를 보호하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 루테인이 청색광을 흡수함으로써 각질세포 및 섬유모세포에 대한 청색광의 노출을 방지하는 방법.
  3. 유효량의 루테인을 함유하는 조성물을 피부에 적용하여 청색광선을 차단함으로써 HEK 및 HDF 세포에서의 세포독성의 유도를 감소시키는 단계를 포함하는 인간 피부의 조기 노화 징후를 보호하는 방법.
  4. 유효량의 루테인을 함유하는 조성물을 피부에 적용시키는 단계를 포함하는 청색광에 노출시 인간에서의 활성산소종의 발생을 감소시키는 방법.
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