KR20170121549A - 글리시리진 및 리퀴리틴 함유 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

글리시리진 및 리퀴리틴 함유 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감초를 추출한 후 부형제를 첨가하여 분무건조함으로써 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 감초 추출물을 포함하는 조성물은 제약 및 식품 분야에서 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 간기능 개선용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

글리시리진 및 리퀴리틴 함유 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease comprising licorice extract having glycyrrhizin and liquiritin}
본 발명은 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글리시리진 및 리퀴리틴을 특정 비율로 함유하는 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
감초(Licorice, Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)는 콩과(Lequminosae)에 속하는 다년생 초본으로, 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer), 광과감초(G. glabra Linne), 창과감초(G. inflata Batal)의 뿌리 및 뿌리줄기로서 그대로 또는 주피를 제거하여 사용된다. 감초는 중국의 내몽고 지역이나 동북부 흑룡강성 지역, 시베리아 지역, 스페인이나 이태리 남부지역, 이란이나 이라크의 중동 지역 등의 건조한 사막 기후에서 자생하며, 한국에서는 함경도 및 충북 산간 지역의 기후 조건에서만 감초 재배가 적합한 것으로 알려져 있다(동의보감 감초 편). 특히, 한국에서 재배되는 제천 감초는 소비자가 안전하고 위생적으로 공급받을 수 있도록 생산 단계부터 유통 판매 단계에 걸쳐 위해 요소를 관리해주는 '우수농산물 품질관리제도'(Good Agricultural Practice, GAP) 하에서 생산되고 있다.
감초에는 글리시레트산(glycyrrhetic acid), 리퀴리틴 아피오사이드(liquiritin apioside), 이소리퀴리틴(isoliquiritin) 및 글라브리딘(glabridin) 등의 플라보노이드계 생리활성 물질; 리코리시딘(licoricidin) 및 글라브라(glabra) 등의 이소플라보노이드 계열 물질; 헤르니아린(herniarin), 움벨리페론(umbelliferone) 등의 코마린 유도체(coumarin derivation) 성분; 및 알라닌(alanine), 아스파라긴(asparagine), 글라이신(glycine) 등의 아미노산 성분이 함유되어 있는 것으로 보고되고 있다.
또한, 감초에는 하기 화학식 1 내지 화학식 4의 성분이 포함되어 있는 것으로 보고된 바 있다.
<화학식 1>
Figure pat00001
<화학식 2>
Figure pat00002
<화학식 3>
Figure pat00003
<화학식 4>
Figure pat00004
한편, 매년 전세계적으로 알코올 섭취량이 증가함에 따라 알코올성 간 질환에 대한 관심도 늘어나고 있다. 특히, 한국의 경우 1인당 알코올 섭취량 빈도가 늘어남에 따라 간 보호 효능에 대한 관심이 높아져 식물 추출물들의 간 보호 효과에 대한 연구가 더 필요한 실정이다. 일반적으로 간 질환에 대한 몇몇 생약(herbal medicine)의 상당한 인기에도 불구하고 간 질환에 대한 치료방법으로 받아들여지지 않고 있다. 이에 대한 이유로서 (i) 생약의 표준화와 활성성분의 확인 부족, (ii) 무작위 대조 임싱시험(RCTs)의 부족, (iii) 독성 평가의 부족 등을 들 수 있다 (Dhiman and Chawla, Digestive Diseases and Sciences, 50(10): 1807-1812, 2005).
현재까지 간 보호 효능을 나타내는 식물 추출물에 대하여 효능 및 주요 성분 관련한 연구는 충분히 수행되지 못하였으며, 따라서, 독성 여부 및 함유 성분 관련한 간 보호 효능을 나타내는 식물 추출물의 개발이 요구된다.
대한민국 특허등록 제10-1581240호(2015.12.23.) 대한민국 특허등록 제10-0697056호(2007.03.13.)
Biol. Pharm. Bull. 30(10) 1898-1904 (2007)
본 발명자들은 간 보호 효과를 나타내는 식물 추출물에 대하여 연구하던 중, 감초를 추출한 후 부형제를 첨가하여 분무건조함으로써 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되도록 조절된 감초 추출물이 독성이 없을 뿐만 아니라, 시험관내 및 생체내 시험에서 간 보호 효능이 있다는 것으로 확인함으로써, 상기 추출방법에 의해 제조된 감초 추출물이 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 추출 후 부형제를 첨가하여 분무건조함으로써 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되도록 조절된 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계; (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; 및 (c) 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되고, 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(c)의 상기 부형제는 덱스트린일 수 있다. 또한, 일 구현예에서, 단계(c)의 상기 농축물 온도는 70 내지 90℃ 이고, 송풍 온도 150 내지 190℃에서 분무건조될 수 있다.
일 구현예에서, 간질환은 간염 또는 지방간일 수 있으며, 바람직하게는 알코올성 지방간일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, (a) 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계; (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; 및 (c) 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되고, 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(c)의 상기 부형제는 덱스트린일 수 있다. 또한, 일 구현예에서, 단계(c)의 상기 농축물 온도는 70 내지 90℃ 이고, 송풍 온도 150 내지 190℃에서 분무건조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품 또는 식품 첨가제의 형태인 것을 특징으로 하는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 감초 추출물은 간세포에 대한 독성이 없을 뿐만 아니라, 간 보호 효능이 있는 양성 대조군(밀크씨슬 추출물)에 비하여 유사하거나 더 우수한 GOT/GPT 수치 저하 효능을 나타내고, 간 조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현 증가를 억제하는 효과를 나타내어 간 보호 효능이 있는 것으로 나타났고, 특히, 알코올성 간손상 모델에서 간 손상으로 인해 증가된 ALT, AST, GTP의 수치를 유의적으로 감소시켰으며, 알코올에 의한 지방 축적을 현저히 감소시킬 뿐만 아니라, 내인성 항산화 물질의 유지 효과가 우수하여, 간 기능 보호 작용이 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 감초 추출물은 제약 및 식품 분야에서 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 간기능 개선용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 (A) 배양 간세포(HepG2)에 감초 추출물을 처리한 결과, 및 (B) 아세트아미노펜으로 간세포 독성을 유발한 배양 간세포(HepG2)에 감초 추출물을 처리하여 세포 생존율을 측정한 그래프이다(APAP: 아세트아미노펜, 감초 A: 감초 추출물 3).
도 2는 BV2 세포에서 감초 추출물에 포함된 3개 성분(글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌)의 LPS에 의한 NO 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 3은 감초 추출물에 포함된 3개 성분[(A) 글리시리진, (B) 리퀴리틴 및 (C) 리퀴리티게닌]의 염증성 분자생물학적 지표(iNOS, COX2)를 측정한 그래프이다.
도 4는 감초 추출물에 포함된 3개 성분[(A) 글리시리진, (B) 리퀴리틴 및 (C) 리퀴리티게닌]의 염증성 분자생물학적 지표(TNF-α, IL-1β, IL-6)를 측정한 그래프이다.
도 5는 HepG2 세포에서 t-BHP의 용량 및 처리 시간에 따른 간 독성 유발 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 감초 내 유효성분들의 t-BHP로 유발된 간세포 독성의 억제 효과를 비교한 그래프이다(G: 글리시리진, LQ: 리퀴리틴, LQG: 리퀴리티게닌).
도 7은 감초 추출물의 처리에 따른 마우스에서의 간보호 효과를 측정한 그래프이다(control: 대조군, EX3: 감초 추출물 3, M: 밀크씨슬 추출물).
도 8은 t-BHP로 간 독성을 유발한 간 조직에서 감초 추출물 처리에 따른 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 발현 정도를 비교한 웨스턴 블랏 결과 및 이를 수치화한 그래프이다.
도 9는 만성적인 알코올 공급에 의하여 혈액 중 (A) ALT, (B) AST, (C) GTP의 변화를 나타낸 그래프이다(ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test, P<0.05).
도 10은 만성적인 알코올 공급에 의하여 간 내 지방함량의 변화를 나타낸 그래프(A) 및 지방축적을 나타내는 사진(B)이다(ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test, P<0.05).
도 11은 만성적인 알코올 공급에 의하여 간의 GSH 변화를 나타낸 그래프이다(ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test, P<0.05).
도 12는 각 추출 방법에 따른 감초 추출물의 간 기능 보호 효과를 나타낸 그래프이다(S-1: 감초 추출물 1, S-2: 감초 추출물 2, S-3: 감초 추출물 3).
도 13은 각 추출 방법에 따른 감초 추출물을 마우스에 처리한 후, 항염증 억제 효능과 관련된 분자생물학적 지표(TNF-α, IL-1β, IL-6)를 측정한 그래프이다.
본 발명은 (a) 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계; (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; 및 (c) 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되고, 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 감초의 추출방법은 부작용이 있는 사포닌 계열 화합물인 글리시리진의 함량을 낮추고 플라보노이드 계열의 리퀴리틴 함량을 높여 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되도록 조절할 수 있는 방법이다.
(a) 단계는 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계이다.
본 발명의 추출 방법은 당업계에 공지된 감초 추출물 제조를 위한 추출 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 15 내지 40℃에서 추출할 수 있다. 추출 시간은 1 내지 5시간일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 4시간일 수 있다. 추출 용매는 주정 50 내지 80% 일 수 있으며, 바람직하게는 주정 70% 일 수 있다.
추출 전에 감초의 전처리 과정으로 통상적인 선별, 수세, 절단 등의 단계를 거칠 수도 있으며, 추출 후에는 여과 과정을 거칠 수 있다.
(b) 단계는 상기 추출물을 농축하는 단계이다.
농축은 용액 중의 용매를 제거하고 용질의 농도를 높이는 것을 말한다. 상기 추출물은 당업계에 공지된 농축장치 또는 농축법에 의해 농축할 수 있으며 예를 들어 침전농축, 증발농축, 감압농축, 한외여과법, 역삼투법, 원심분리법 일 수 있다.
본 발명의 농축은 바람직하게 35 내지 50 ℃에서 감압 농축할 수 있다.
(c) 단계는 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무 건조하는 단계이다.
상기 건조는 분무건조법, 동결건조법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 분무건조 방법을 이용하여 농축액 온도가 70 내지 90℃ 이고, 송풍 온도 150 내지 190 ℃에서 분무건조할 수 있다. 더 바람직하게는 농축액 온도가 75 내지 80 ℃ 이고, 송풍 온도 170 내지 180 ℃에서 분무건조 할 수 있다.
상기 부형제는 덱스트린, 락토오스, 녹말, 셀룰로오즈 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 덱스트린을 사용할 수 있다. 덱스트린 첨가량은 바람직하게는 감초 농축액 대비 10 내지 20 중량% 일 수 있다.
일 구현예에서, 간질환은 간염 또는 지방간일 수 있으며, 바람직하게는 알코올성 지방간일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 감초 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 감초 추출물은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 감초 추출물을 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계; (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; 및 (c) 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되고, 글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 단계(c)의 상기 부형제는 덱스트린일 수 있다. 또한, 일 구현예에서, 단계(c)의 상기 농축물 온도는 70 내지 90℃ 이고, 송풍 온도 150 내지 190℃에서 분무건조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품 또는 식품 첨가제의 형태인 것을 특징으로 하는 식품 조성물일 수 있다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 방법에 의해 제조된 감초 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 감초 추출물과 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀 국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 방법으로 제조된 감초 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 감초 추출물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량% 이다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 감초 추출물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 방법
감초 원재료(원물)는 한국 충북 제천의 한국감초영농조합법인에서 제공받아 사용하였고, 하기 3개 방법으로 제조하였다.
(1) 감초 추출물 1(EX1)
감초 원물(잔가지, 30 g)에 증류수(270 g)을 이용하여 50 ℃에서 3 시간 동안 추출하였으며, 40 메쉬(mesh)로 여과하여 잔사를 제거한 다음 추출액은 감압진공농축(40 ℃)을 통하여 용매를 제거하여 시료를 제조하였다. 얻어진 추출물 1은 오일상의 페이스트(paste) 상태였다.
(2) 감초 추출물 2(EX2)
감초 원물(잔가지, 30 g)에 70% 주정(270 g)을 이용하여 50 ℃에서 3 시간 동안 추출하였으며, 40 메쉬로 여과하여 잔사를 제거한 다음 감압진공농축(40 ℃)를 통하여 용매를 완전히 제거하여 시료를 제조하였다. 얻어진 추출물 2는 오일상의 페이스트 상태였다.
(3) 감초 추출물 3(EX3)
감초 원물(잔가지, 1 kg)에 70% 주정(10 kg)을 이용하여 3 시간 동안 순환 추출하였으며, 30~35℃로 추출물을 냉각하였다. 75 ㎛ 카트리지(cartridge)를 이용하여 여과한 후 원심분리(15,000 rpm)하여 감초 원물 추출 잔사를 제거하여 0.9 kg를 얻었다. 추출액은 감압진공농축(55~58℃)을 통하여 잔류 주정을 제거하고 20 브릭스(brix)까지 농축시켜, 0.3 kg를 얻었다. 농축액에 덱스트린 0.3 kg을 배합하여 용해시킨 다음, 95℃에서 30분간 살균한 후 분무건조(액온 75~80 ℃, 송풍온도 180 ℃, atomizer 18,000 rpm)하여 감초 추출물 분말 0.23 kg을 제조하였다.
2. 감초 추출물의 분석
감초 추출물의 유효 지표성분인 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin) 계열인 글리시리진산(glycyrrhizic acid, GA; glycyrrhizin) 및 플라보노이드 계열의 리퀴리틴(liquiritin, LQ)을 정성/정량 분석하기 위하여 미국약전(USP35, p.1362-1364)과 대한약전(제9개정, p. 903-905), 및 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC) 규정, AOAC 방법 등에 따라 함량 분석을 수행하였다.
(1) LC-MS/MS 조건
감초 추출물의 주요성분인 글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌을 정량분석하기 위하여 내부표준물질로는 디곡신(digoxin)을 사용하였으며, 각각 물질의 성분 분리를 위하여 컬럼(LUNA C18 column, 2.0 x 150 mm, 5μm)를 사용하였다. HPLC(Shiseido사) 및 ESI 소스(ABSIEX사)의 질량분석기를 사용하여 하기 표 1[감초추출물의 LC-MS/MS 분석 조건] 및 표 2[감초 기능성분 표준물질의 Mass 측정 파라미터]와 같은 조건으로 분석을 수행하였다(multiple reaction monitoring(MRM) 모드).
(2) 검량선 작성
글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌의 표준품에 대한 검량선은 12.5, 25, 50, 100, 300, 500, 1000, 2500 및 5000 ng/mL의 농도로 작성하여 내부표준물질인 디곡신을 500ng /mL이 되게 투여하여 분석물질/내부표준 물질의 비에 의하여 검량선을 작성하였으며, 작성된 검량선의 직선성은 상관계수(r2)를 구하여 판단하였다. 검출한계와 정량한계는 3.3 x slope/ δ 와10 x slope/ δ, 각 식에 대입하여 구하였다.
HPLC 조건
컬럼
유속
주입량(부피)
컬럼 온도
오토샘플러 온도		 Luna C18 RP column(2.0 x 150mm, 5μm)
0.3 mL/min
5μL
40 ℃
4 ℃
이동상 분(min) A(%) B(%)
0
1
6.5
8
8.5
15		 90
90
10
10
90
90		 10
10
90
90
10
10
A : 1.0% 아세트산 포함 수용액
B : 1.0% 아세트산 포함 아세토니트릴 액
Mass 조건
Ion source
Curtain Gas
Collision Gas
Ionspray Voltage
Source temperature
Gas 1
Gas 2
Turbo spray ( Negative )
30psi
N2( Medium )
- 4.0 kV
400 ℃
40 psi
50 psi
성분명 DP(V) EP(V) CXP(V) CE(eV) Precursor
m/z
[M-H]- 		Product ion
m/z
[M-H]-
글리시리진 -105 -9.5 -60 -30 821.4 351.0
리퀴리틴 -40 -10 -24 -28 417.1 255.0
리퀴리티게닌 -40 -4 -12 -30 255.0 119.0
디곡신(IS) -105 -9.5 -52 -44 779.4 649.4
(3) 분석 결과
감초 추출물의 주요 구성성분인 글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌의 3종의 성분을 LC-MS/MS를 이용하여 동시에 정량분석을 시행하였다. 분석 결과, 글리시리진, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌 및 내부표준물질인 디곡신은 m/z 821.4, m/z 417.1, m/z 255.0 및 m/z 779.4에서 각각의 [M-H]- 형태의 분자이온을 확인하였으며, 각 화합물의 충돌 에너지(collision energy)를 표 1과 같이 주었을 때 글리시리진, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌 및 내부표준물질인 디곡신은 m/z 351.0, m/z 255.0, m/z 119.0 및 m/z 649.4의 생성이온이 생기는 것을 확인하였다. 이는 글리시리진은 m/z 821.4에서 글루코오스 2분자가 떨어진 아글리콘(aglycon) 형태의 [M-H-2Glu]- 형태의 m/z 351.2로 검출되며, 리퀴리틴은 m/z 417.1에서 글루코오스 1분자가 떨어진 아글리콘 형태의 [M-H-Glu]- 형태로 m/z 255.0으로 검출되며, 리퀴리티게닌은 m/z 255.0에서 C8H8O8와 H2O 분자가 떨어진 [M-H-C8H6O7]- 형태의 m/z 119.0으로 검출된 것이다.
확립된 감초 추출물의 LC-MS/MS MRM 모드에서 글리시리진, 리퀴리틴, 리퀴리티게닌 및 내부표준물질인 디곡신은 7.14, 5.37, 6.22 및 6.44 분에서 각각 검출되었다.
(4) 감초 추출물의 건조 방법에 대한 시험
건강기능식품 또는 메디컬 푸드 등으로 적용시키기 위하여 분말이 보관과 사용에 용이할 것으로 생각되어 70% 주정으로 추출한 추출액에 대하여 분무건조, 동결건조, 부형제를 첨가하는 등 건조 방법을 검토하였다. 실험 결과 GA와 LQ는 분무건조와 동결건조 조건에서 함량의 큰 차이가 없었다. 일반적으로 동결건조의 경우는 분무건조보다 건조 시간이 오래 걸리고, 비용이 많이 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 감초 추출물의 생산 시간을 단축시키고 제조 단가를 낮춰 비용 절감을 위하여 분무건조 방법을 선택하였으며, 원료의 안정성을 확보하기 위하여 부형제 덱스트린을 첨가하여 생산하는 것이 효율적일 것이다.
3. 각 추출물의 성분 비교
감초 추출물 1 내지 감초 추출물 3에 포함된 성분을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
감초 추출물 GA (mg/g) LQ (mg/g) GA:LQ의 비율 비고
1 (EX1) 12.4 20.6 1.0:1.66 물추출, 페이스트
2 (EX2) 16.5 16.5 1.0:1.0 70% 주정 추출, 페이스트
3 (EX3) 20.6 12.4 1.66:1.0 70% 주정 추출, 분말
*GA: 글리시리진, LQ: 리퀴리틴
< 시험예 >
1. 배양 간세포에서의 시험관내 ( in vitro ) 간세포 독성 완화 효능 평가
(1) 감초 추출물의 세포 독성 예비 평가
배양 간세포(HepG2)에 아세트아미노펜으로 간세포 독성을 하기와 같이 유발하였다.
먼저 감초 추출물의 세포독성 테스트(MTT assay)를 수행하였다. HepG2(hepatocellular carcinoma cell line)를 이용하여 세포 독성을 확인하기 위해 세포 생존율을 측정하였다. 시험 전 날 96-웰 플레이트에 1×104 cells/well의 각 세포를 분주하고 다음 날 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 후 키트 CCK-8(cell counting kit-8; DOJINDO, Tokyo, Japan) 사용하여 매뉴얼에 명시되어 있는 방법으로 배지의 1/10 부피(volume)를 각각의 웰에 넣어주고 2시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응 시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450 nm의 파장에서 CCK-8의 활성을 측정하였다.
도 1(A)에 나타난 바와 같이, 배양 간세포(HepG2)에서 감초 추출물 자체(EX3)이 독성을 나타내는지 하기와 같이 확인한 결과, 감초 추출물(EX3)은 1.0 %까지 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
이후 아세트아미노펜(APAP)에 의한 간세포의 독성을 감초추출물이 완화하거나 억제시킬 수 있는지 알아보았다. APAP의 간 독성 정도를 알아보기 위해 HepG2 세포에 각각 10, 20 mM의 농도로 APAP를 처리하였다. APAP를 각각의 농도로 처리하고 감초 추출물의 자체 독성이 나타나지 않은 0.1, 1%의 감초 추출물(EX3)을 각각 처리하여 세포독성 테스트를 통해 세포 생존율을 측정하였다.
도 1(B)에 나타난 바와 같이, 감초 추출물(EX3)은 아세트아미노펜으로 유발한 간세포 독성을 완화시키는 것으로 확인되었다.
(2) 감초 추출물 유래 단일성분의 항염증 효과 평가
감초 추출물 유래 단일성분의 항염증 효과를 규명하기 위하여 글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌을 각각 10, 20, 50 uM 농도로 BV2 세포에 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide, 리포폴리사카라이드)에 의한 NO 생성 억제를 24시간 후에 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 3개 성분 모두 농도가 증가함에 따라 NO 생성 억제 효과를 나타냈으며, 특히, 50 uM 농도에서는 3개 성분 모두 유의적인 억제 효과를 나타내었다. 3개 성분 중 리퀴리티게닌이 가장 우수한 효능을 나타내었다.
(3) 감초 추출물 유래 단일성분의 분자생물학적 지표에 미치는 효과 측정
감초 추출물 유래 단일성분의 항염증 효과의 기전을 분자생물학적으로 규명하기 위하여 하기와 같이 시험을 수행하였다. 세포에 염증 유발 물질인 LPS를 BV2 세포에 처리한 후, 증가되는 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인, iNOS(inducible nitric oxide, iNOS), COX2(cyclooxygenase-2) 등의 변화를 3개 성분(글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌)이 어느 정도 억제하는지를 PCR 기법을 사용하여 mRNA 변화로써 측정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 감초 유래 단일성분들은 모두 NO 생성 억제 효과(항염증)를 나타내었고, 리퀴리틴(B)이 글리시리진(A)보다 더 강력하게 iNOS 및 COX2의 발현을 감소시켰으며, 리퀴리티게닌(C) 또한 감소 효과를 나타내었다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 염증 관련 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 발현은 글리시리진(A)이 다른 2개 성분보다 더 강력한 억제 효과를 나타내었다.
(4) 감초 추출물 유래 단일성분의 간 독성 완화 효능 평가
배양 간세포(HepG2)에서 선행문헌(Lee et al., Liver International, 2005;25:1069-1073)에 기재된 방법에 따라 t-부틸 하이드로퍼옥사이드(t-butyl hydroperoxide, t-BHP)를 사용하여 간 독성을 유발하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, t-BHP는 처리 후 3시간 및 24시간 후에 용량 의존적으로 간독성을 나타낸 것이 확인되었다.
글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌을 각각 100 uM 농도로 처리하였으며, 상기 농도의 각 화합물은 세포에 독성을 나타내지 않는 것으로 판단하였다. 각각의 성분들에 대한 세포 생존율을 측정했을 때 95% 이상으로 세포 독성이 없는 것으로 확인되었기 때문이다. 반면 t-BHP를 처리했을 때는 30% 정도로 세포 생존율이 급감하는 것을 알 수 있었다(도 6).
도 6에 나타난 바와 같이, 배양 간세포에서 글리시리진, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌은 처리 농도에 따라 증가되는 간세포 독성 억제 효과를 나타내었다.
2. 감초 추출물의 생체내 ( in vivo ) 간 보호 효능 평가
(1) 감초 추출물의 간독성 지표에 미치는 영향 평가
ICR 마우스에 t-BHP를 1.5 mmol/kg 용량으로 복강투여하여 간 독성을 유발하였고, t-BHP처리 3일 전에 감초 추출물(EX3, 300 mg/kg)을 3일간 경구로 투여하였다. 마우스에 t-BHP를 처리하면 혈중 AST(aspartate aminotransferase, 아스파르테이트 아미노전이요소, GOT, glutamic oxalacetic transaminase) 및 ALT(alanine aminotransferase, 알라닌 아미노전이요소, GPT, glutamic pyruvate transaminase)가 증가하여 간독성이 유발됨을 확인하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 마우스에 감초 추출물(EX3)을 전처리하면 혈중 AST 및 ALT의 증가가 유의적으로 감소하여 간독성이 저하되었음을 확인하였다. 감초 추출물(EX3)의 간 보호 효능은, 간 보호 효능이 있는 것으로 알려져 있는 밀크씨슬 추출물에 비하여 유사하거나 더 우수한 GOT/GPT 수치 저하 효능이 있는 것으로 측정되었다.
(2) 감초 추출물의 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향 평가
마우스에서 감초 추출물의 간 보호 효능과 관련하여 분자생물학적 지표에 미치는 변화를 측정하기 위하여 하기와 같이 시험하였다. ICR 마우스에 t-BHP를 1.5 mmol/kg 용량으로 복강투여하여 간 독성을 유발하였고, t-BHP 처리 3일 전에 감초 추출물(EX3, 300 mg/kg)을 3일간 경구투여하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 마우스에 t-BHP를 처리한 경우에 간 조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현이 증가하였고, 감초 추출물(EX3)을 3일간 경구투여한 경우에는 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현 증가가 억제되는 효과를 나타내었다.
3. 알코올성 간손상 동물모델에서 감초 추출물의 간 보호 효능 평가
(1) 동물 시험 방법
소 동물(마우스 또는 랫드)에 알코올 함유 식이를 투여하여 알코올성 간 손상을 유발한 후, 감초 추출물(EX3)의 간 보호 효능을 측정하기 위하여 하기와 같이 시험하였다.
마우스(C57BL/6N 마우스, 6주령, 웅성)를 ① 정상 식이군(control), ② 알코올식이군, ③ 알코올식이 + 감초 추출물(EX3) 처리군, ④ 알코올식이 + 밀크씨슬 추출물 처리군(10마리/군)으로 분류한 후, 해당 군에 에탄올 함유 식이(Ethanol Lieber-DeCarli liquid diet)를 4주간 대조식이(pair-fed) 방식으로 공급하여 알코올성 간 손상을 유발하였다. 정상 식이 및 알코올 함유 식이의 조성 및 공급 기간은 하기 표 4와 같다. 사료는 미국 Dyets 사에서 조제된 사료를 구입하여, 정상 식이는 물 1 L 에 221.78 g이 포함되도록 용해하였고, 알코올 함유 식이는 132.18 g의 조제사료 및 95% 알코올 67.3 ml을 혼합하여 최종부피 1 L 가 되도록 물을 첨가하여 제조하였다.
정상 식이(1000 kcal/L)
성분 조성
지방(fat) 35 %
단백질(protein) 18 %
탄수화물(carbohydrate) 47 %
알코올 함유 식이(1000 kcal/L)
지방(fat) 35 %
단백질(protein) 18 %
탄수화물(carbohydrate) 11 %
에탄올(ethanol) 36 %
각 해당 군에 감초 추출물(EX3)(100 mg/kg) 및 밀크씨슬 추출물(100 mg/kg)을 알코올식이 공급 기간과 동일한 기간 동안 매일 경구로 투여하였고, 4주 후 각 군의 혈액 및 장기(간, 신장 등)를 적출하였다.
(2) 혈청 생화학적 지표 분석 방법
혈액시료는 원심분리(3,500 g, 10분, 4 ℃)하여 혈청을 취하였고, 혈청 중 ALT(Alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), 감마-GTP(gamma-glutamyl transpeptidase, 감마-글루타밀 트랜스퍼라제)는 자동 혈액분석기(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)를 사용하여 측정하였다.
간의 트리글리세리드(Triglyceride)는 마우스 간을 균질화하여 클로로포름/메탄올+염화나트륨 용액으로 추출한 후 함량 측정하였다.
간조직 내 축적된 지방 분석을 위하여, 간의 왼쪽 바깥엽을 절편으로 만들고, 조직 절편을 6시간 동안 완충 포르말린(10% buffered neutral formalin)으로 고정한 다음, 두께 4 mm로 절단하여 검사 전에 H&E 염색을 수행하였다. 염색(Oil Red O)을 위해 동결시킨 간 조직을 10mm 두께로 절단하여 현미경용 슬라이드에 부착한 후, 실온에서 24시간 건조하였다. 간조직 절편을 10분 동안 염료(Oil Red O, Sigma, St. Louis, MO) 시약으로 염색하고 물로 세척한 후 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.
간의 글루타치온(glutathione) 함량을 측정하기 위하여, 마우스 간을 균질화하여 20배 부피의 냉 메탄올(ice-cold methanol)을 가하고, 분쇄기(polytron)로 분쇄한 다음 원심분리하여 상등액을 사용하였다. OPA(Ο-phthaldialdehyde)를 이용하여 유도체화하고, 역상 컬럼(column, Kromasil) 및 검출기(FS-920 fluorescence detector, JASCO, JAPAN)가 장착한 HPLC로 측정하였다. 농도구배를 주기 위해 2개 펌프(pump, Jasco Model PU-980, Jasco Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다.
(3) 혈액 중 간 손상 지표의 변화 측정 결과
간 손상의 생화학적 지표를 상기와 같이 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 만성적(4주간 투여) 알코올 식이군(Alcohol)은 정상 식이군(control)에 비해 간 손상 지표인 ALT, AST, GTP의 수치가 증가한 것으로 나타났으며, 이로써 만성적인 알코올 식이로 인하여 간 손상이 유발되었음을 확인하였다. 감초 추출물을 투여한 군에서는 만성적 알코올 식이로 유발된 간 손상으로 인해 증가된 ALT, AST, GTP의 수치가 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며, 그 정도는 간 기능 개선 효능이 있는 것으로 알려진 밀크씨슬 추출물보다 우수하거나 유사한 것으로 나타났다.
(4) 간 조직 내 트리글리세리드 함량 및 지방 축적 결과
간 조직 내 트리글리세리드 함량을 상기와 같이 측정하여 그 결과를 도 10(A)에 나타내었고, 지방 축적 결과를 도 10(B)에 나타내었다.
만성적인 알코올 섭취에 의한 초기 증상은 간 조직 내 지방 축적이므로, 지속적인 알코올 섭취로 인하여 지방간을 야기할 수 있다. 도 10(A)에 나타난 바와 같이, 마우스의 간 내 트리글리세리드 함량을 측정한 결과, 정상 식이군에 비하여 알코올 식이로 인한 간 내 트리글리세리드 함량이 급격히 증가되었음이 확인되었다.
감초 추출물을 투여한 군에서는 알코올에 의한 지방 축적이 현저히 감소되었으며, 그 감소 정도는 밀크씨슬 추출물보다도 현저히 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 조직학적 염색 결과(oil red staining)를 통해서도 뚜렷하게 나타났으며(도 10(B) 참조), 양성 대조군인 밀크씨슬 추출물 공급군에 비하여도 더 효과적인 경향을 보이는 것으로 나타났다. 이를 통하여 감초 추출물은 알코올 섭취로 인한 간 조직 내 지방축적을 유의적으로 차단시켜 간 보호 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
(5) 간 조직 내 글루타치온 ( GSH ) 함량 측정 결과
글루타치온은 체내에서 합성되는 대표적인 내인성 항산화 물질로서, 만성적인 알코올 섭취에 의한 글루타치온의 감소는 조직 손상과 밀접한 연관성을 가진다.
도 11에 나타난 바와 같이, 정상 식이군 대비 만성 알코올 식이 투여군에서는 간 조직 내 GSH의 수치가 현격히 감소됨을 확인하였다. 감초 추출물을 투여한 군에서는 정상 식이군과 유사한 수준으로 GSH 함량이 유지되는 것으로 나타났다. 특히, 밀크씨슬 추출물 투여군에서는 GSH 함량 감소 억제 효과가 관찰되기는 하였지만, 그 정도가 정상 식이군에 유사한 정도로 나타나지는 않은 반면에, 감초 추출물을 투여한 군에서는 정상 식이군과 유사한 수준으로 GSH 함량이 유지되는 것으로 나타나, 감초 추출물의 내인성 항산화 물질의 유지 효과가 간 보호 효능이 공지된 물질(양성 대조군)에 비하여 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 이를 통하여 감초 추출물에 의한 알코올성 간 손상의 보호 기전은 부분적으로 간 조직내 항산화 체계의 유지와 연관성이 있음을 시사하였다.
4. 감초 추출물 내의 유효성분 조성 비율에 따른 간 기능 보호 효능 평가
(1) 동물 시험
ICR 마우스에 t-BHP(1.8 mmol/kg)을 처리하여 간 독성을 유발하였고, t-BHP 처리 3일 전에 감초 추출물 3종(S-1: 감초 추출물 1, S-2: 감초 추출물 2, S-3: 감초 추출물 3)을 300 mg/kg 용량으로 경구투여하였다. 간 독성 유발 24 시간 후 ICR 마우스의 혈액 샘플을 채취하여 GOT(AST) 및 GPT(ALT)를 측정하였다. 간 조직은 균질화하여 단백질과 mRNA를 얻어 염증성 사이토카인의 발현 유무를 확인하였다.
(2) 간 기능 보호 지표의 분석 결과
간 독성 유발된 마우스의 혈액 중 GOT(AST) 및 GPT(ALT)를 측정한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 바와 같이, 마우스에 t-BHP를 처리하면 혈중 GOT(AST) 및 GPT(ALT)가 증가하여 간 독성이 유발됨을 확인하였다. 감초 추출물 1(S-1), 감초 추출물 2(S-2), 감초 추출물 3(S-3)을 투여한 군에서는 GOT(AST) 및 GPT(ALT) 수치가 현저히 감소하였으며, 특히, 다른 감초 추출물에 비하여 감초 추출물 3(S-3)에서 그 감소 정도가 크게 나타났다.
(3) 염증성 사이토카인인 측정 결과
간 독성 유발된 마우스의 간 조직 단백질과 mRNA로부터 염증성 사이토카인 발현 유무를 확인한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타난 바와 같이, 마우스에 t-BHP를 처리하면 간 조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현이 증가됨을 확인하였다. 감초 추출물 1(S-1), 감초 추출물 2(S-2), 감초 추출물 3(S-3)을 투여한 군에서는 염증성 사이토카인의 발현이 억제되었으며, 특히, 다른 감초 추출물에 비하여 감초 추출물 3(S-3)에서 발현 억제 정도가 뚜렷한 것으로 확인되었다.
따라서, GA:LQ 비율이 1.66:1.0인 경우의 감초 추출물(감초 추출물 3)이, 이와는 상이한 조성 비율을 갖는 감초 추출물보다 간 보호 효능이 우수함을 확인하였다.

Claims (10)

  1. (a) 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; 및
    (c) 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되고,
    글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 단계(c)의 상기 부형제가 덱스트린인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 단계(c)의 상기 농축물 온도가 70 내지 90℃ 이고, 송풍 온도 150 내지 190℃에서 분무건조하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간질환이 간염 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간질환이 알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  7. (a) 감초의 잔가지를 50 내지 80%의 주정으로 1 내지 5시간 동안 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출물을 농축하는 단계; 및
    (c) 상기 농축물에 부형제를 첨가하여 분무건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되고,
    글리시리진 : 리퀴리틴 함량이 1.5 내지 1.8 : 1의 비율로 함유되어 있는 감초 추출물을 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 단계(c)의 상기 부형제가 덱스트린인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 단계(c)의 상기 농축물 온도가 70 내지 90℃ 이고, 송풍 온도 150 내지 190℃에서 분무건조하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 식품 조성물이 기능성 식품(functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품(health food) 또는 식품 첨가제(food additives)의 형태인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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