KR20170119929A

KR20170119929A - 신규한 염료탈색균주 베르칸데라 아두스타 nibrkdfpfgc000002676 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법

Info

Publication number: KR20170119929A
Application number: KR1020160048219A
Authority: KR
Inventors: 조경숙; 이정인; 홍소다닉스; 정혜경; 김가우; 민다희; 류희욱; 배창환; 김순옥; 윤혁준; 여주홍; 김지형
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단; 대한민국(환경부 국립생물자원관장); 숭실대학교산학협력단
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2017-10-30
Also published as: KR101942475B1

Abstract

본 발명은 신규한 염료탈색균주 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676) 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 염료를 포함하는 시료에 탈색능을 나타내는 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 염료 탈색 균주, 상기 균주의 배양 방법, 상기 균주를 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법, 상기 균주를 포함하는 염료 탈색용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 신규한 베르칸데라 아두스타 균주는 다른 동종의 베르칸데라 아두스타 균주와 구별되는 염료의 탈색활성을 나타내므로, 보다 효과적인 염색폐수의 정화방법에 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 염료탈색균주 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법{Novel dye-decolorizing fungus, Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676, and method for treating dye wastewaters using the same}

본 발명은 신규한 염료탈색균주 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676) 및 이를 활용한 염색폐수 처리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 염료를 포함하는 시료에 탈색능을 나타내는 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 염료 탈색 균주, 상기 균주의 배양 방법, 상기 균주를 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색 방법, 상기 균주를 포함하는 염료 탈색용 조성물에 관한 것이다.

염색폐수의 색도는 심미적으로 불쾌감을 야기할 뿐 아니라 수체의 투명도와 가스 용해도에 영향을 미치고, 발암성 물질 등 유해물질이 포함되어 있어 수생태계와 인간의 건강에 악영향을 미칠 수 있다. 이러한, 염색폐수를 처리하기 위해 응집-부상법, 막여과, 전기분해, 흡착, 펜톤산화, 오존산화, 이온교환, 침전 등 다양한 물리-화학적 방법이 사용되고 있으나, 낮은 경제성, 2차 오염물질 발생, 및 적용 가능한 염색폐수 범위가 제한적인 점 등의 문제가 있다. 예를 들면, 화학응집처리, 활성탄에 의한 흡착 처리 등은　염색폐수　내의 오염물질을 광범위하게 처리할 수 있으나, 많은 슬러지를 발생시켜 2차 처리를 해야 하는 단점이 있다. 또한, 펜톤 산화법(Fenton oxidation)을 사용하는 방법은 미반응 물질이 폐수 내에 존재하는 위험성을 내포하고 있으며, 오존(ozone) 처리법은 오존 발생을 위한 경제적 비용이 많이 들고 위험성이 높다는 문제점이 있다. 따라서, 물리-화학적 방법 이외에 염료를 흡착하거나 생분해할 수 있는 곰팡이를 이용한 생물학적 방법이 개발되고 있다. 이러한 생물학적 방법은 물리-화학적 방법보다는 물사용량이 적고 환경친화적이고 경제적이며, 슬러지 발생이 적고 최종분해산물의 독성이 없다는 장점이 있다.

생물학적 방법을 이용한 염색폐수 처리기술은 다음과 같은 다양한 생물 반응기를 이용한 방법이 제안되어 있다.

기계충버섯 균주(I. lacteus)을 oak wood cylinder에 고정화한 회전생물반응기를 회분식으로 운전하는 방법(P. Hasal et al, 2012, Procedia Eng., 42, 1579-1586), 느타리버섯 균주(P. ostreatus) 및 구름버섯 균주(T. vesicolor)의 혼합 균주를 사과나무가지 및 사과껍질 등의 농산물 폐기물 담체에 부착한 후 이 담체를 반투과성 막에 넣어 용액으로 빠져나가지 못하도록 고안한 충전층 반응기를 이용한 산성염료 혼합폐수를 처리하는 방법(Iandolo, D. et al, 2011, Bioresour. Technol., 102, 7603-7607), 구름버섯 균주(T. vesicolor)를 이용한 반응성 염료를 처리한 후 역삼투막으로 여과하는 방법으로 염색폐수를 처리하는 방법(Kim, T.-H. et al, 2004, Desalination, 168, 287-293), 작은 모래입자에 아와워스 플라버스(A. flavus)를 부착하여 유동층 반응기로 drimarene blue K2PL 염료의 탈색과 생분해시키는 방법(Andleeb, S. et al, 2012, Environ. Sci. Pollut. Res., 19, 1728-1737), 폴리비닐 알콜-하이드로젤(Polyvinyl alcohol-hydrogel)에 고정화한 구름버섯(T. versicolor)을 교반반응기에서 poly R-478 염료의 탈색 및 생분해시키는 방법 등이 알려져 있다(Leidig, E. et al, 1999, Bioprocess Eng., 21, 5-12).

그러나, 공기부양식 생물반응기를 이용한 염색폐수 처리방법은 많은 연구가 이루어지지 않았다.

공기부양식 생물반응기는 외부에서 주입하는 공기에 의하여 배양기 내의 유체흐름이 일어나 배양체가 일정한 형식으로 움직이면서 생장 및 증식이 일어나도록 하는 것이다. 즉, 기계적 교반에 의존하지 않고 반응기의 저부에서 공기를 보내어 산소공급을 하는 동시에, 기포의 상승 및 하강의 순환 작용에 의한 유체의 흐름으로 액의 교반, 혼합이 이뤄지는 형태이다. 이러한 공기부양식 생물반응기는 배양체에 적게 스트레스를 주며, 반응기의 디자인 및 제작이 매우 단순하고, 장기간 배양시 비교적 오염율이 낮다. 또한, 반응기의 배양시 주된 동력소모는 공기를 주입하기 위한 공기압축기(air compressor)의 가동만으로 발생되므로 운영에 비교적 낮은 동력원이 사용되는 장점이 있다.

지금까지 공기부양식 생물반응기를 이용한 연구는 동물, 식물, 미생물 세포를 대량으로 배양하기 위한 목적으로만 사용되어 왔다. 예를 들어, 한국공개특허 제10-2001-0077869호에는 세포 및 조직 배양을 목적으로 공기부양식 생물반응기를 개시하고 있고, 한국공개특허 제10-2011-0133331호에는 공기부양식 생물반응기를 이용한 물푸레나무의 대량 중식 방법을 개시하고 있으며, 제10-2014-0033957호에는 녹차의 종자로부터 캘러스를 유도 및 중식한 뒤, 공기부양식 생물반응기를 이용하여 대량배양 생산하는 방법 등이 보고되어 있다. 그러나, 공기부양식 생물반응기를 이용하여 염색폐수를 처리하는 방법에 있어서, 효과적으로 탈색효율을 나타내는 균주는 아직 많은 연구가 이루어지지 않은 실정이다. 이에 본 발명자들은 공기부양식 생물반응기에 보다 적합한 염료 탈색 신규 생물 자원을 확보하며 이들로부터 새로운 탈색효소를 탐색하고, 관련 탈색 효소 유전자 확보를 통한 재조합 균주의 개발과 이를 이용한 염색폐수 처리기술 연구가 필요함을 인식하였다.

이러한 배경 하에서, 염료를 포함하는 염색폐수의 탈색시키기 위한 기술 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 신규한 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676가 다양한 염료(산성, 분산성, 반응성)에 대해 탈색능을 가지고 공기부양식 생물반응기(airlift bioreactor)에서도 상기 다양한 염료에 대해 탈색능을 가지고 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 염료를 포함하는 시료에 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주 또는 그의 배양물을 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 염료 탈색능을 나타내는 상기 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 염료 탈색용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 염료를 포함하는 염색폐수의 탈색시키기 위한 기술을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 새로이 발굴한 베르칸데라 아두스타 균주가 다른 동종의 균주에 비하여 염료에 대한 새로운 탈색활성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명자에 의하여 분리동정된 신규한 베르칸데라 아두스타 균주는 다른 동종의 베르칸데라 아두스타 균주에 비하여 violet 5에 대하여 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다.

이에 본 발명자들은 상기 신규한 베르칸데라 아두스타 균주를 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676)이라 명명하고, 2015년 10월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁하고, 수탁번호 KACC83004BP를 부여받았다. 상기 균주는 다른 동종의 균주와 명확히 구별되는 염료 특이적 탈색활성을 나타내므로, 다른 동종의 균주와 조합하여 사용할 경우, 보다 넓은 범위의 염료를 탈색시킬 수 있고, 상기 균주를 공기부양식 생물반응기와 함께 사용할 경우, 일반 반응기에 비해 염료의 탈색에 소요되는 시간을 절반이상 감소시킬 수 있어, 보다 효과적인 염료 탈색에 활용될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 하나의 양태로서, 본 발명은 염료를 포함하는 시료와, 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676) 균주 또는 그의 배양물을 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "염료"는 현재 염색 염료 공장에서 염료 생산 공정 또는 염색 가공 공정에서 사용되는 염료를 의미하는 것으로, 구체적으로, 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 산성 염료는 red 114, blue 62, orange 7 또는 black 172 일 수 있고, 상기 분산성 염료는 red 1, blue 79, orange 3 또는 black 1 염료일 수 있고, 상기 반응성 염료는 red 120, blue 4, orange 16), black 5 또는 violet 5 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 red 114, blue 62, orange 7, black 172, red 1, blue 79, orange 3, black 1, red 120, blue 4, orange 16, black 5에 대하여, 상기 베르칸데라 아두스타 균주가 고체배지에서 모두 높은 탈색능을 나타내었고(도 7), red 114, blue 62, black 172, red 120, blue 4, orange 16, black 5에 대하여, 상기 균주가 2 내지 3일내에 높은 탈색능을 나타내었다.(도 8)

또한, 염료에 의하여 균주의 성장 및 세포 활성이 별다른 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 5 및 6). 특히, violet 5에 대하여, 본 발명에서 제공하는 균주가 베르칸데라 아두스타 DSM 11310 (Bjerkandera adusta DSM 11310)보다 우수한 염료 탈색 속도 및 탈색 효율을 나타냄을 확인하여(표 2), 본 발명에서 제공하는 균주가 우수한 탈색능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 용어 "염료를 포함하는 시료"는 상기 염료를 포함하고, 본 발명에서 제공하는 균주에 의해 상기 염료를 탈색시켜야 하는 대상을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 시료는 염료를 포함하는 배지, 염료를 포함하는 염색폐수 등이 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 균주의 배양 결과 얻어지는 물질로, 배지, 배양되는 균주, 및 배양되는 미생물로부터 분비되는 물질을 모두 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 균체를 배양하기 위해 필요한 영양 공급원, 예를 들어 탄소원, 질소원 등 이외에 무기염 성분, 아미노산, 비타민, 핵산 및/또는 기타 일반적으로 배양 배지에 함유될 수 있는 성분들이 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 용어 "혼합하는 단계"는 염료를 포함하는 시료에 본 발명에서 제공하는 균주 또는 그의 배양물을 가하여 상기 염료를 탈색시키는 과정을 의미한다. 구체적으로, 상기 혼합하는 단계는 공기가 지속적으로 주입되는 생물반응기에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 생물반응기는 공기부양식 생물반응기일 수 있다.

본 발명의 용어 "공기부양식 생물반응기(airlift bioreactor)"는 외부에서 주입하는 공기에 의하여 배양기 내의 유체 흐름이 일어나 배양체가 일정한 형식으로 움직이면서 생장 및 증식이 일어나도록 하는 반응기로, 다양한 염료 또는 염색폐수에 대하여 본 발명에서 제공하는 균주를 접종 및 배양하여 탈색반응이 유도하고자 사용하였다. 상기 생물 반응기는 구체적으로 배기구(1), 주입부(2), 흡출관(3 및 4), 실린지(5), 공기주입관(6), 공기필터(7)를 포함하는 것일 수 있다(도 12). 배기구(1)는 생물 반응기 내로 주입되는 공기 배출되는 출구, 주입부(2)는 본 발명에서 제공하는 염료를 주입하는 입구, 흡출관(3 및 4)은 반응기 내에 위치할 때 유체 흐름에 대한 통로를 제공하는 양 말단에서 개방되는 하나 이상의 관, 실린지(5)는 반응기 내 샘플을 수득하기 위한 흡입기, 공기주입관(6)은 외부의 공기를 반응기 내부로 주입하는 관, 공기필터(7)는 외부로부터 주입되는 공기를 정화해는 장치를 의미한다. 특히, 본 발명에서 제공하는 균주를 이용하여 염료를 탈색시킬 경우, 일반 반응기에서 염료의 탈색에 소요되는 시간을 절반 이상 감소시킬 수 있어, 효과적인 염료 탈색에 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 red 114, blue 62, black 172, red 120, blue 4, black 5에 대하여, 공기부양식 생물반응기에서 상기 본 발명에서 제공하는 균주에 의해 탈색반응이 일어남을 확인하였다(도 13 내지 18). 또한, 상기 결과를 일반 반응기에서 염료의 80 % 이상을 탈색시키는데 약 3일의 시간이 소요됨을 나타내는 반면(도 8), 본 발명에서 제공하는 균주는 공기부양식 생물반응기를 사용할 경우, 염료의 탈색에 소요되는 시간을 50 % 이상 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 20 내지 35 ℃의 온도조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 혼합하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 23 ℃ 내지 30 ℃, 보다 구체적으로 23 ℃ 내지 28 ℃의 온도조건일 수 있다. 본 발명자들은 20 ℃ 내지 35 ℃의 온도조건에서 혼합할 경우 최대 탈색속도의 절반 이상의 높은 탈색속도를 나타내는 효과가 있음을 확인하였다(도 9). 반면, 상기 35 ℃의 온도를 초과할 경우 온도가 증가할수록 탈색속도가 감소하는 문제가 있다.

예를 들어, 상기 혼합하는 단계에서 상기 시료는 blue 62이고, 상기 온도조건은 20 내지 35 ℃인 것일 수 있다. 구체적으로, 23 ℃ 내지 30 ℃, 보다 구체적으로, 23 ℃ 내지 28 ℃의 온도조건 일 수 있다. 본 발명자들은 20 ℃ 내지 35 ℃의 온도조건에서 혼합할 경우 220 mg L^-1d^-1 이상의 높은 탈색속도를 나타내는 효과가 있음을 확인하였다. 반면, 35 ℃의 온도를 초과할 경우 온도가 증가할수록 탈색속도가 감소하는 문제가 있다.

또한, 상기 혼합하는 단계에서 상기 시료는 black 172이고, 상기 온도조건은 20 ℃ 내지 35 ℃인 것일 수 있다. 구체적으로, 20 ℃ 내지 32 ℃, 보다 구체적으로, 23 ℃ 내지 28 ℃의 온도조건 일 수 있다. 본 발명자들은 20 ℃ 내지 35 ℃의 온도조건에서 혼합할 경우 20 mg L^-1d^-1 이상의 높은 탈색속도를 나타내는 효과를 확인하였다. 반면, 35 ℃의 온도를 초과할 경우 온도가 증가할수록 탈색속도가 감소하는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 시료 내 염료농도가 800 mg/L 미만이 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 상기 혼합하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 혼합하는 단계는 구체적으로, 시료 내 염료농도가 800 mg/L 미만, 보다 구체적으로, 시료 내 염료농도가 700 mg/L 미만, 보다 더 구체적으로, 시료 내 염료농도가 250 mg/L 내지 700 mg/L, 가장 구체적으로 시료 내 염료농도가 400 mg/L 내지 700 mg/L이 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 시료 내 염료농도가 800 mg/L 미만이 되도록 전처리 시킨 후 혼합할 경우 염료농도가 증가함에 따라 탈색속도가 증가하고, 특히, 일부 염료에 대하여 500 mg/L이상의 고농도조건일 때 200 mg L^-1d^-1이상의 높은 탈색속도를 나타내는 효과가 있음을 확인하였다(도 11). 반면, 시료 내 염료농도가 800 mg/L 초과되도록 전처리 시킨 후 혼합할 경우 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 감소하거나 더 이상 증가하지 않는 문제가 있다.

상기 전처리는 적절한 배지 또는 용매를 이용하여 시료를 희석하는 방법으로 수행할 수 있다.

예를 들어, 상기 혼합하는 단계에서 상기 시료는 blue 62이고, 상기 혼합하는 단계는 시료 내 염료농도를 100 mg/L 내지 700 mg/L가 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 시료 내 염료농도가 300 mg/L 내지 700 mg/L, 보다 구체적으로, 550 mg/L 내지 700 mg/L가 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것 일 수 있다. 본 발명자들은 시료 내 염료농도가 100 내지 700 mg/L 되도록 전처리 시킨 후 혼합할 경우 100 mg L^-1d^- ¹이상의 높은 탈색속도를 나타내는 효과가 있음을 확인하였다. 반면, 시료 내 염료농도가 700 mg/L 초과되도록 전처리 시킨 후 혼합할 경우 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 감소하는 문제가 있다.

또한, 상기 혼합하는 단계에서 상기 시료는 black 172이고, 상기 혼합하는 단계는 시료 내 염료 농도를 100 mg/L 내지 800 mg/L가 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 시료 내 염료농도가 400 mg/L 내지 800 mg/L, 보다 구체적으로 600 mg/L 내지 800 mg/L가 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것일 수 있다. 본 발명자들은 시료 내 염료 농도가 100 내지 800 mg/L이 되도록 전처리 시킨 후 혼합할 경우 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 증가하는 효과가 있음을 확인하였다. 반면, 시료 내 염료 농도가 800 mg/L 초과되도록 전처리 시킨 후 혼합하는 경우 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 더 이상 증가하지 않는 문제가 있다.

본 발명에 따른 탈색방법은 혼합하는 단계 이후, 배지를 첨가하여 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 혼합하는 단계 이후 탈색속도가 느려질 경우 균주를 추가하지 않더라도 추가적인 배지 첨가만으로도 탈색속도를 증가시킬 수 있다(도 17 및 도 18).

다른 양태로서, 본 발명은 염료 탈색능을 나타내는 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주를 제공한다.

상기 염료에 대한 정의 및 설명은 상기한 바와 같다.

본 발명의 용어 "베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676)"는 베르칸데라 아두스타 균주의 일종으로서 서열번호 1의 18s rDNA 서열이 상기 균주와 높은 상동성을 갖고, 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료에 속하는 적색(red 114, red 1, red 120), 청색(blue 62, blue 79, blue 4), 주황색(orange 7, orange 3, orange 16, 흑색(black 172, black 1, black 5) 등의 다양한 염료에 대한 탈색활성을 나타내며, violet 5 등의 염료에 대하여 다른 동종의 베르칸데라 아두스타 균주보다도 현저하게 우수한 탈색활성을 나타내는 균주를 의미한다. 상기 균주는 2015년 10월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁하고, 수탁번호 KACC83004BP를 부여받았다.

본 발명에 있어서, 상기 균주 또는 그의 배양물은 염료를 탈색시키기 위한 핵심적인 수단으로 사용될 수 있다.

상기 균주는 리그닌 퍼옥시다아제, 망간 퍼옥시다아제 및 리가아제를 포함하는 세포 외 효소 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 균주를 효모추출물이 0 g/L 초과 내지 10 g/L인 배지에 접종하고, 이를 배양하는 경우, 리그닌 퍼옥시다제, 망간 퍼옥시다제 및 리가아제를 포함하는 세포외 효소 활성이 효모추출물 첨가량이 증가함에 따라 상기 세포 외 활성이 증가함을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주의 배양방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양방법은 상기 균주를 효모추출물이 1 g/L 내지 10 g/L인 배지에 접종하고, 이를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 효모추출물은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로, 3 g/L 내지 10 g/L 인 배지에 접종하여 배양하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 6 g/L 내지 10 g/L 배지에 접종하여 배양하는 것일 수 있다. 본 발명자들은 상기 균주를 효모추출물이 1 g/L 내지 10 g/L인 배지에 접종하는 경우, 효모추출물이 증가할수록 균주의 성장 및 세포 외 효소 활성이 증가하는 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 배양방법은 상기 균주를 접종하고, 20 내지 35 ℃의 온도조건에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양방법은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로, 23 ℃ 내지 32 ℃의 온도조건에서 배양하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 26 ℃ 내지 29 ℃의 온도조건에서 배양하는 것일 수 있고 가장 구체적으로, 28 ℃의 온도조건에서 배양하는 것일 수 있다. 본 발명자들은 상기 균주를 20 ℃ 내지 35 ℃의 온도조건에서 배양시킬 경우 40시간 이후 균총의 크기가 20 mm이상을 나타내는 효과가 있음을 확인하였다(도 1의 (a)). 반면, 20 ℃ 미만의 온도에서 배양시킬 경우 균총의 크기가 크게 증가하지 않는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배양방법은 상기 균주를 접종하고, pH 4 내지 pH 7의 산도조건에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양방법은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로, pH 5 내지 pH 7의 산도조건에서 배양하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, pH 6 내지 7의 산도조건에서 배양하는 것일 수 있고, 가장 구체적으로, pH 7의 산도조건에서 배양하는 것일 수 있다. 본 발명자들은 상기 균주를 pH 4 내지 pH 7에서 배양시킬 경우 pH 증가에 따라 균총의 크기가 증가하는 효과가 있음을 확인하였다(도 2의 (a)).

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.

배양시 pH, 온도, 효모 추출물(yeast extract) 첨가 조건 외에는 당업자에게 널리 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

배양 시 배지는 적당한 탄소원 또는 질소원을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 탄소원은 주로 CO₂와 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.

상기 배지는 아미노산, 비타민, 인원, 무기화합물을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주 또는 그의 배양물을 포함하는 염료 탈색용 조성물을 제공한다.

상기 조성물에는 상기한 것과 같은 같은 배지가 포함될 수 있다. 상기 균주, 배양물, 염료의 정의는 상기한 것과 같다.

본 발명에서 제공하는 신규한 베르칸데라 아두스타 균주는 다른 동종의 베르칸데라 아두스타 균주와 구별되는 염료의 탈색활성을 나타내므로, 보다 효과적인 염색폐수의 정화방법에 활용될 수 있다.

도 1은 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주의 성장에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프이다. 도 1의 (a)는 본 발명에서 제공하는 균주의 온도별 배양시간에 따른 균총 크기를 나타내는 그래프이다. 도 1의 (b)는 도 1의 (a) 값을 토대로 계산한, 본 발명에서 제공하는 균주의 온도별 상대 성장속도를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 균주의 성장에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프이다. 도 2의 (a)는 본 발명에서 제공하는 균주의 pH 별 배양시간에 따른 균총 크기를 나타내는 그래프이다. 도 2의 (b)는 도 2의 (a) 값을 토대로, 본 발명에서 제공하는 균주의 pH 별 상대 성장속도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 제공하는 균주의 성장에 미치는, 배지 내 C/N 비율의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4은 본 발명에서 제공하는 균주의 세포 외 효소 활성에 미치는 효모 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 균주의 성장에 미치는 염료의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6는 본 발명에서 제공하는 균주의 세포활성에 미치는 염료의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 고체배지에서 12종 염료배지(red 114, blue 62, orange 7, black 172, red 1, blue 79, orange 3, black 1, red 120, blue 4, orange 16, black 5)의 위치 (a) 및 본 발명에서 제공하는 균주에 의한 탈색능 (b)을 나타내는 사진 및 개략도이다.
도 8은 액체배지에서 본 발명에서 제공하는 균주의 각각 4종의 산성 (a) 및 반응성 (b) 염료 에 대한 탈색능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9은 20 내지 35 ℃ 온도 조건에서 본 발명에서 제공하는 균주의 blue 62와 black 172 염료에 대한 탈색 속도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10는 pH 4 내지 7의 산도 조건에서 본 발명에서 제공하는 균주의 blue 62와 black 172 염료에 대한 탈색 속도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 다양한 염료 농도 조건(blue 62: 150 내지 700 mg/L, black 172: 100 내지 800 mg/L)에서 균주의 blue 62 와 black 172 탈색 속도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12은 공기부양식 생물반응기(Airlift bioreactor)의 모식도이다.
도 13는 공기부양식 생물반응기에서 본 발명에서 제공하는 균주의 blue 62 염료에 대한 탈색능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 14은 공기부양식 생물반응기에서 본 발명에서 제공하는 균주의 red 114 염료에 대한 탈색능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 15는 공기부양식 생물반응기에서 본 발명에서 제공하는 균주의 black 172 염료에 대한 탈색능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 16는 공기부양식 생물반응기에서 본 발명에서 제공하는 균주의 blue 4 염료에 대한 탈색능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 17은 공기부양식 생물반응기에서 본 발명에서 제공하는 균주의 red 120 염료의 탈색능을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 18은 공기부양식 생물반응기에서 본 발명에서 제공하는 균주의 black 5 염료의 탈색능을 나타내는 사진 및 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신규한 베르칸데라 아두스타 균주의 분리 및 동정

오대산(37°43'54.5"N 128°35'33.1"E)에서 2015년 6월 25~26일, 7월 7~8일, 8월 8~9일에 채집하여 분리한 곰팡이(버섯) 균주의 18s rDNA 서열(서열번호 1)을 분석한 후, Blast(NCBI)를 이용하여 동정하였다.

그 결과, 상기 18s rDNA 서열은 베르칸데라 아두스타 균주의 염기서열과 높은 상동성을 나타냄을 확인하여, 상기 균주를 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676)이라 명명하고, 2015년 10월 28일자로 농업생명공학연구원에 기탁하고, 수탁번호 KACC83004BP를 부여받았다. 아울러, 상기 서열을 베르칸데라 아두스타 균주 (Bjerkandera adusta)에 속하는 "OBR 105" 균주의 "partial 18s rDNA"라 명명하여 NCBI에 등록번호 SRX1315521로 등재하였다.

실시예 2. 신규한 베르칸데라 아두스타 균주의 성장 및 세포활성 조건 규명

실시예 2.1. 성장에 있어 온도 조건에 따른 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 성장에 있어 온도에 따른 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 동정된 균주를 PDA 배지에 접종한 후, 15 ℃, 20 ℃, 25 ℃, 28 ℃, 35 ℃의 온도조건으로, 7일 간 배양하였다. 자란 균총의 크기를 측정하고 이를 이용하여 균주의 성장속도를 계산하였다. 균총의 크기는 도 1의 (a)에 나타내었고, 성장속도는 균총크기 mm / 배양시간 h의 식으로 계산한 후, 최대성장속도를 기준으로 상대 성장률(%)을 도 1의 (b)에 나타내었다.

도 1의 (a) 및 (b)에서 보듯이, 상기 균주는 15 내지 28 ℃에서 온도에 따라 균총의 크기가 증가하였고, 특히, 28 ℃에서 최대로 나타났다.

실시예 2.2. 성장에 있어 pH 조건에 따른 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 성장에 있어 pH에 따른 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1.1에서 분리한 균주는 2 N HCl 혹은 2 N NaOH 용액을 첨가하여 pH를 4, 5, 6, 7로 맞춘 PDA 배지에 접종하고 28 ℃의 온도 조건에서 7 일간 배양하였다. 자란 균총의 크기를 측정하고 이를 이용하여 균주의 성장속도를 계산하였다. 균총의 크기는 도 2의 (a)에 나타내었고, 성장속도는 균총크기 mm / 배양시간 d의 식으로 계산하여 도 2의 (b)에 나타내었다.

먼저 도 2의 (a) 및 (b) 에서 보듯이, pH 4 내지 7에서 상기 균주는 pH 증가에 따라 균총의 크기가 빠르게 성장하였다.

실시예 2.3: 성장에 있어 효모 추출물(yeast extract)에 따른 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 성장에 있어 효모 추출물 첨가에 따른 영향을 확인하기 위하여, 배양액 부피당 효모 추출물(yeast extract, YE)을 0, 1, 5, 10 g/L 첨가하여 효모 추출물 첨가량이 다른 PDB 배지를 제조하고, 실시예 1에서 동정된 균주를 상기 배지에 접종한 후 28 ℃, 150 rpm의 조건으로 배양하였다. 배양 2, 4, 6일째 각 배양액 1L를 원심분리(3500 rpm, 10 분)하여, 각 균사체를 수득하였으며, 수득한 균사체를 70 ℃에서 1일 동안 건조하고 바이오매스 중량(배양액 부피당 바이오매스 중량)을 측정하였다.

도 3에서 보듯이, 상기 균주는 1 g/L 내지 10g/L 의 효모추출물의 첨가 범위에서 효모추출물이 첨가가 증가할수록 균주 성장수준이 증가됨을 확인하였다.

실시예 2.4: 세포 외 효소 활성에 있어 효모 추출물에 따른 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 세포 외 효소 활성에 있어 효모 추출물 첨가에 따른 영향을 확인하기 위하여, 실시예 2.3의 방법으로 배양 및 원심분리 후 각 상등액을 수득하였으며, 수득한 상등액을 이용하여 실시예 2.3에서 얻은 바이오매스 중량 당 3 종의 세포 외 효소(라카아제(laccase), 리그닌 퍼옥시다제(lignin peroxidase), 망간 퍼옥시다제(Mn dependent peroxidase)) 활성(specific enzyme activity)을 측정하였다.

상기 세포 외 효소 활성은 배양 4일 째인 것을 사용하였고, 대조군으로써 효모 추출물을 첨가하지 않은 PDB 배지에서의 세포 외 활성을 1로 정하고, 이에 상대적으로 효모 추출물을 첨가한 PDB 배지에서의 세포 외 효소 활성을 계산하였다.

도 4에서 보듯이, 효모추출물 첨가량이 증가함에 따라 세포 외 효소 활성이 증가함을 확인하였고, 특히 망간 퍼옥시다제의 세포 외 효소 활성이 가장 현저하게 증가함을 확인하였다.

실시예 2.5: 성장에 있어 염료가 미치는 영향

염료가 실시예 1에서 동정된 균주의 성장에 미치는 효과를 분석하기 위하여, 실시예 1에서 동정된 균주는 각 4종의 산성 염료 또는 반응성 염료를 200 mg/L의 농도로 첨가한 PDB 배지에 접종하고, 28 ℃, 140 rpm 조건으로 9일 동안 진탕배양한 다음, 배양된 균주의 중량을 측정하였다.

도 5에서 보듯이, Orange 7을 제외하고는 성장수준의 변화는 ±10 % 수준에 불과함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 염료에 의하여 성장에 별다른 영향을 받지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2.6: 세포활성에 있어 염료가 미치는 영향

실시예 1에서 동정된 균주를 이용하여 염료를 탈색시킬 경우 균주의 세포 활성의 변화를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 동정된 균주는 PDB 배지에 접종 후 실시예 2.5의 방법으로 15일 동안 배양하고, 배양이 종료된 후, pH 변화를 확인하였다.

도 6에서 보듯이, orange 7을 제외하고는 pH 수준의 변화는 ±0.3 수준에 불과함을 확인하였다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 염료를 탈색시킬 경우에도, 세포활성이 특별히 변화되지 않음을 알 수 있었다.

실시예 3. 신규한 베르칸데라 아두스타 균주의 염료 탈색능 평가 및 비교

베르칸데라 아두스타 균주는 염료에 대한 탈색활성을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 실시예 1에서 동정된 균주가 다양한 염료에 대하여 탈색활성을 나타낼 수 있는지의 여부와 다른 동종의 균주대비 탈색능 향상 여부를 확인하고자 하였다.

실시예 3.1. 고체배지에서 염료 탈색능 평가

실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능을 확인하기 위하여, 시판중인 염료(Sigma Aldrich)인 하기 표 1의 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료는 200 mg/L의 농도가 되도록 PDA 배지에 첨가하였고, 12웰 플레이트에 2 mL씩 부어 탈색평가 배지를 제작하였다. 이어, 상기 제작된 탈색평가 배지에, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균사체는 동일한 양으로 접종하고, 28 ℃에서 7 일간 암배양하여, 각 염료에 대한 탈색능을 평가하였다.

사용된 산성, 분산성 및 반응성 염료

구분	염료명
산성(acid)	Red 114
	Blue 62
	Orange 7
	Black 172
분산성(disperse)	Red 1
	Blue 79
	Orange 3
	Black 1
반응성(reactive)	Red 120
	Blue 4
	Orange 16
	Black 5

도 7의 (b)에서 보듯이, 실시예 1에서 동정된 균주가 접종되지 않은 대조군과 비교하여, 실시예 1에서 동정된 균주가 12종의 염료를 모두 탈색시키는 것을 확인하여, 염료에 대해 우수한 탈색능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 3.2: 액체배지에서 염료 탈색능 평가

실시예 1에서 동정된 균주의 우수한 탈색능을 확인하기 위하여, 표 1의 각 4종의 산성 및 반응성 염료에 대해 탈색능을 평가하였다.

총 8종의 염료를 실시예 2.5의 방법으로 PDB 배지에 접종 후 진탕배양하여 배양물을 수득하였으며, 이를 원심분리하여 상등액을 얻은 후 상등액의 흡광도를 UV/VIS Spectrophotometer(Mecasys, Optizen 2120 UV Plus)로 측정하였다. 상기 흡광도는 하기식에 대입하여 탈색율(Decolorization Index, %)을 산출하였다.

탈색율(Decolorization Index, %) = (A_o-A_t) × 100/A_o

상기 식에서 A_o는 배양시작시에 측정한 흡광도이고, A_t는 배양 t일째 측정한 흡광도이다.

먼저, 도 8의 (a)에서 보듯이, 4종의 산성 염료 중에서 orange 7를 제외한 염료는 3일 경과 후 탈색되었다.

또한, 도 8의 (b)에서 보듯이, 4종의 반응성 염료는 모두 2일 경과 후에 탈색되었다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 고체배지와 마찬가지로, 액체배지에서도 산성염료와 반응성 염료에 대해 우수한 탈색능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3.3: 다른 동종의 균주와 염료탈색 활성 비교

실시예 1에서 동정된 균주와 동종의 균주인 베르칸데라 아두스타 DSM 11310가 reactive orange 96, reactive violet 5 또는 reactive black 5의 아조 염료(azo dye) 에 대해 탈색능을 나타낸다고 보고되었으므로(A. Heinfling et al., Appl Microbiol Biotechnol, 48: 261±266, 1997), 실시예 1에서 동정된 균주와 상기 다른 동종의 균주의 탈색능을 비교하고자 하였다.

구체적으로, 상기 violet 5를 200 mg/L 농도가 되도록 PDB 배지 200 mL에 첨가하였고, 실시예 1에서 동정된 균주를 PDB 배지에 접종하고, 28 ℃, 140 rpm의 속도로 6일 동안 진탕배양하여 배양물을 수득하였다. 이를 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 실시예 3.2의 방법으로 각 염료에 대한 탈색율을 산출하였으며, 이를 베르칸데라 아두스타 DSM 11310 균주의 탈색율과 비교하였다(표 2).

violet 5에 대한 탈색율 비교

배양시간 (일)	violet 5 염료 탈색 효율 (%)
배양시간 (일)	베르칸데라 아두스타 DSM 11310	실시예 1에서 동정된 균주
1	2	10
2	30	42
4	60	87

표 2에서 보듯이, 실시예 1에서 동정된 균주는 violet 5를 첨가한 배지에서 1 내지 6일의 배양시간 동안 다른 동종의 균주보다 염료 탈색속도가 빠르고 염료 탈색효율이 높은 것을 확인하였고, 특히 4일째에 다른 동종의 균주보다 약 17 % 정도 탈색효율이 높은 것을 확인하였다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주가 다른 동종의 균주보다 염료 탈색 속도 및 탈색 효율이 우수함을 알 수 있었다.

이처럼, 실시예 1에서 동정된 균주는 다른 동종의 균주와는 상이한 탈색능을 나타내고, 특히 특정염료에 특이적으로 우수한 탈색능을 나타내었으므로, 다른 동종의 균주와는 구별되는 새로운 균주임을 확인하였다.

실시예 3.4: 신규한 베르칸데라 아두스타 균주의 최적 염료 탈색 조건 규명

실시예 1에서 동정된 균주가 다른 동종의 균주보다 우수한 탈색능을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 탈색능에 영향을 미치는 온도, pH 및 염료 농도를 조사하고자 하였다. 이를 위해, blue 62, black 172 염료를 첨가한 PDB 배지에 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하여 배양시킨 후 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 이용하여 배양시간별 염료의 흡광도를 측정한 후(blue 640 mm, black 570 mm), 상기 흡광도 값을 흡광도-농도와의 검량식에 적용하여 염료농도로 환산하였다. 상기 염료농도를 통해 배양시간별 염료 탈색량을 계산한 후 배양 온도별 염료의 탈색속도(mg-dye/L/d, mg L^-1 d^-1)를 확인하였다. 구체적인 실험은 다음과 같다.

실시예 3.4.1: 염료 탈색에 미치는 온도 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능에 있어 온도에 따른 영향을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.

blue 62 또는 black 172 염료를 최종농도가 300 또는 150 mg/L가 되도록 PDB 배지에 첨가하고, 실시예 1에서 동정된 균주를 접종한 후, 20, 25, 28 및 35 ℃의 온도 조건에서, 150 rpm으로 6일 동안 배양하여, 배양 온도별 염료의 탈색속도(mg L^-1d^-1)를 평가하였다.

도 9에서 보듯이, blue 62는 23 ℃ 내지 30 ℃ 에서 비교적 높은 탈색능을 나타내었고, 25 ℃에서 가장 빠른 탈색속도(294.8 mg L^-1d^- ¹)를 나타내었다. black 172는 20 ℃ 및 33 ℃에서 비교적 높은 탈색능을 나타내었고, 공통적으로 23 ℃ 내지 28 ℃, 특히 25 ℃에서 가장 빠른 탈색속도(40.5 mg L^-1d^-1)를 나타내었다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 염료의 종류와 온도에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타내었으나, 공통적으로 25 ℃에서 가장 빠르게 탈색됨을 알 수 있었다.

실시예 3.4.2: 염료 탈색에 미치는 pH 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능에 있어 pH에 따른 영향을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.

실시예 3.4.1과 같이 blue 62 또는 black 172 염료의 최종농도가 300 mg/L 또는 150 mg/L가 되도록 첨가하고, 이에 2 N HCl 혹은 2 N NaOH 용액을 첨가하여 pH를 4, 5, 6, 7로 맞춘 PDB-염료 배지를 제조하였다. 발명의 균주를 접종한 후, 28 ℃에서 150 rpm으로 6일 동안 배양하여, 배양 pH별 염료의 탈색속도를 평가하였다.

도 10에서 볼 수 있듯이, blue 62는 pH 4 내지 pH 5.4 에서 비교적 높은 탈색속도를 나타내었고, 특히, pH 5.0에서 가장 빠른 탈색속도(289.7 mg L^-1d^- ¹)를 나타내었다. black 172는 pH 4 내지 pH 7에서 pH가 증가할수록 탈색속도가 증가하여 pH 7.0에서 최고 수준의 탈색속도(41.0 mg L^-1d^-1)를 나타내었다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 염료의 종류와 pH에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3.4.3: 염료 탈색에 미치는 염료농도 영향

실시예 1에서 동정된 균주의 탈색능에 있어 염료농도에 따른 영향을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.

구체적으로, 다양한 농도의 blue 62(150, 300, 550 또는 700 mg/L) 또는 black 172(100, 150, 400 또는 800 mg/L)를 포함하는 PDB 배지에 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하고 28 ℃에서 150 rpm의 조건하에 6일 동안 진탕배양하면서, 탈색속도의 변화를 비교하였다.

도 11에서 보듯이, blue 62와 black 172 모두 염료농도가 증가할수록 탈색속도가 증가하는 경향을 나타내었으나, 세부적으로는 다소 차이를 나타내었다. blue 62는 250 mg/L 내지 700 mg/L의 농도일 때 비교적 높은 탈색속도를 나타내었고, 특히, 550 mg/L의 농도일 때 최대 탈색속도(337.7 mg L^-1d^- ¹)를 나타내었다. black 172는 100 mg/L 내지 800 mg/L에서 농도 증가에 따라 탈색속도가 증가하였고, 800 mg/L의 농도일 때 가장 빠른 탈색속도(102 mg L^-1d^- ¹)를 나타내었다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 염료의 종류 및 농도에 따라 상당한 수준의 탈색속도의 차이를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4. 공기부양식 생물반응기(Airlift bioreactor )를 이용한 염료 탈색

실시예 4.1: 공기부양식 생물반응기 설계 및 제작

실시예 1에서 동정된 균주를 이용한 염색폐수 정화 효율을 높이기 위하여, 운전비가 저렴하고 유지 관리가 용이한 공기부양식 생물반응기를 설계하고 제작하였다.

반응기는 원통형 아크릴로 제작하였고, 반응기의 작업량(working volume)을 4 L 혹은 2 L로 유동적으로 운전할 수 있도록, 흡출관(draft tube, 3 및 4)은 2가지 종류로 설계하였다. 반응기 운전 동안 공기에 의한 다른 미생물의 오염을 최소화하기 위하여 공기주입관(6)에 멸균한 공기 필터(7)를 장착하였고, 나머지 배관재를 연결하였다. 또한, 반응기로부터 결과물을 수득하기 위하여 반응기 옆에 실린지(5)를 장착하였다. 생물 반응기 뚜껑에는 시료의 주입 및 공기의 배출을 용이하게 하기 위하여, 시료의 주입부(2) 및 배기구(1)를 제작하였다(도 12).

실시예 4.2: 공기부양식 생물반응기에서 염료 탈색 특성 규명

상기 실시예 4.1에서 제작된 공기부양식 생물반응기를 이용하여, 실시예 1에서 동정된 균주의 염료 탈색 특성을 규명하고자 하였다.

실시예 4.2.1: blue 62 염료의 탈색능

먼저, PDB 배지 4L를 포함하는 10 L 유리 배양기를 고압증기로 멸균시킨 후 실시예 1에서 동정된 균주를 접종하였고, 상온에서 150 rpm으로 6 내지 8일 동안 진탕배양하였다. 그런 다음 상기 실시예 4.1에서 제작된 공기부양식 생물반응기에 공기를 1 L/min의 속도로 주입하면서, 상기 균주 배양액 2 L를 주입하였다. 상기 균주 배양액을 주입 후, 생물반응기의 뚜껑을 닫고, 뚜껑에 구비된 주입부를 통하여 최종농도 180 mg/L가 되도록 blue 62를 주입하였다. 이어, 상기 생물반응기에 1 L/min의 속도로 공기를 지속적으로 주입하면서 배양하고, 배양시간 별로 시료를 수득하였으며, 수득한 시료의 흡광도(640 nm)를 측정하였다. 측정된 흡광도를 하기 식에 적용하여, 상기 시료에 포함된 염료의 농도를 산출함으로써, blue 62 염료에 대한 탈색능을 분석하였다.

시료내 염료농도 = (255.7 X 흡광도) - 1.330

도 13에서 보듯이, 배양 후 10시간이 경과된 시점에서 약 80 % 이상이 탈색되었고, 탈색반응 부산물은 생성되지 않음을 확인하였다.

실시예 4.2.2: red 114 염료의 탈색능

최종농도 40 mg/L가 되도록 red 114를 주입하고, 흡광도를 505 nm에서 측정하며, 하기의 염료농도 산출식을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4.2.1과 동일한 방법을 수행하여, red 114 염료에 대한 탈색능을 분석하였다.

시료 내 염료농도 = (52.9 X 흡광도) + 0.384

도 14에서 보듯이, 배양 후 10시간이 경과된 시점에서 약 90 % 이상 탈색되었고, 탈색반응 부산물은 생성되지 않음을 확인하였다.

실시예 4.2.3: black 172 염료의 탈색

최종농도 80 mg/L가 되도록 black 172를 주입하고, 570 nm에서 측정하며, 하기의 염료농도 산출식을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4.2.1과 동일한 방법을 수행하여, black 172 염료에 대한 탈색능을 분석하였다.

시료내 염료농도 = (84.3 X 흡광도) - 0.406

도 15에서 보듯이, 배양 후 15시간이 경과 전에 염료의 약 90 % 이상이 탈색되었고, 탈색반응 부산물은 생성되지 않음을 확인하였다.

실시예 4.2.4: blue 4 염료의 탈색능

최종농도 80 mg/L가 되도록 blue 4를 주입하고, 흡광도를 595 nm에서 측정하며, 하기의 염료농도 산출식을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4.2.1과 동일한 방법을 수행하여, blue 4 염료에 대한 탈색능을 분석하였다.

시료내 염료 농도 = (86.9 X 흡광도) - 1.26

도 16에서 보듯이, 배양 후 15시간이 경과된 시점에서 염료의 약 90 % 이상이 탈색되었고, 약 4시간이 경과된 시점에서는 탈색반응 부산물이 생성되었으나, 15시간이 경과된 시점에서는 탈색반응 부산물이 생성되지 않음을 확인하였다.

실시예 4.2.5: red 120 염료의 탈색 특성

최종농도 40 mg/L가 되도록 red 120을 주입하고, 흡광도를 530 nm에서 측정하며, 하기의 염료농도 산출식을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4.2.1과 동일한 방법을 수행하여, red 120 염료에 대한 탈색능을 분석하였다.

시료 내 염료농도 = (40.6 X 흡광도) - 0.194

도 17에서 보듯이, 배양 후 20시간이 경과된 시점부터 반응속도가 느려졌으므로, 37시간이 경과된 시점에서 6배 농축 PDB 배지 100 mL을 추가한 결과, 약 10시간동안 반응이 지연된 후, 다시 빠른 속도로 반응이 수행됨을 확인하였다. 또한, 탈색반응 부산물은 생성되지 않음을 확인하였다.

실시예 4.2.6: black 5 염료의 탈색능

최종 농도 40 mg/L가 되도록 black 5 염료를 주입하고, 흡광도를 595 nm에서 측정하며, 하기의 염료농도 산출식을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4.2.1과 동일한 방법을 수행하여, black 5 염료에 대한 탈색능을 분석하였다.

시료 내 염료농도 = (34.9 X 흡광도) - 0.360

도 18에서 보듯이, 배양 후 30시간이 경과되기 전까지는 느린 반응속도를 나타내었기 때문에, 35시간이 경과된 시점에서 6배 농축 PDB 배지 100 mL을 추가한 결과, 약 10시간 동안 반응이 지연된 후, 빠른 속도로 반응이 수행됨을 확인하였다.

한편, 68시간이 경과된 시점에서 반응물의 색은 흑적색으로 변화되었다. 이때, 반응물의 흡광도를, 반응시작시의 흡광도와 비교한 결과, black 5 염료의 파장인 595 nm를 포함하는 500 내지 650 nm 영역에서의 흡광도는 감소되었으나, 그외 영역에서의 흡광도는 전체적으로 증가하였으므로, 상기 반응물의 색변화는 반응 부산물에 의한 것으로 분석되었다. 따라서, 상기 반응은 68 시간 미만으로 수행되는 것이 바람직하다.

상기 실시예 4.2.1 내지 4.2.6의 결과를 종합하면, 실시예 1에서 동정된 균주는 공기부양식 생물반응기에서 대체로 짧은 시간 내에 다양한 염료들을 탈색시킬 수 있고, 특히, blue 62, red 114, black 172 및 blue 4에 대하여는 15시간 이내에 염료의 80 % 이상을 탈색시킬 수 있음을 확인하였다.

상기 결과를 일반 반응기에서 염료의 80 % 이상을 탈색시키는데 약 3일의 시간이 소요됨을 나타내는 도 8의 결과와 비교하면, 실시예 1에서 동정된 균주는 공기부양식 생물반응기를 사용할 경우, 염료의 탈색에 소요되는 시간을 50 % 이상 감소시킬 수 있는 것으로 분석되었다.

따라서, 실시예 1에서 동정된 균주는 공기부양식 생물반응기를 사용하여 더욱 효과적으로 염색폐수와 같이 염료를 포함하는 다양한 시료를 정화시키는데, 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

농업생명공학연구원

KACC83004BP

20151028

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation Soongsil University Research Consortium techno-PARK National Institute of Biological Resources <120> Novel dye-decolorizing fungus, Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676, and method for treating dye wastewaters using the same <130> KPA151313-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676_18s rDNA <400> 1 ggaatggatg tattcatctg agctaatatt ggcgagagac gatagcgaac aagtaccgtg 60 agggaaagat gaaaagcact ttggaaagag agttaaacag tacgtgaaat tgctgaaagg 120 gaaacgattg aagtcagtcg cgtgtgctag aactcagcct tgcttttgct tggtgcattt 180 tctagtgtac gggccagcat cagttttggc cgccggaaaa aggccttggg aatgtggcac 240 cttcgggtgt gttatagccc ttggttgtat acggtggctg ggactgagga acatagcatg 300 cctttatggc ggggcttcgg ccaccttcat gctttggatg ctggcgcaat ggctttaaac 360 gacccgtctt gaaacacgta ccaaggagtc taacttgcct gcgagtgttt gggtgggaaa 420 tttgagcgcg tcattgaagt taatggtggg atttctgtct cgcaaggctc ctaagctctg 480 gccggaacta ccgaggacgg gatcacaggg gaaatcctta ccaactaaac ccccacacaa 540 aatttggttt catggatgtg ggtctctgga ttgaaatctc caatcgaatc atgtgtctcg 600 ttctttgtct ccttcctccg ctcgcttaga ttctgattgt cagttttttt ctttttagta 660 ataaaaaaaa a 671

Claims

염료를 포함하는 시료와, 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 (Bjerkandera adusta NIBRKDFPFGC000002676) 균주 또는 그의 배양물을 혼합하는 단계를 포함하는 염료의 탈색방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 공기가 지속적으로 주입되는 생물반응기에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 탈색방법.
제1항에 있어서, 상기 염료는 산성 염료, 분산성 염료 또는 반응성 염료인 것인, 탈색방법.
제3항에 있어서, 상기 산성 염료는 적색 114(red 114), 청색 62(blue 62), 주황색 7(orange 7) 또는 흑색 172(black 172)이고, 상기 분산성 염료는 적색 1(red 1), 청색 79(blue 79), 주황색 3(orange 3) 또는 흑색 1(black 1)이고, 상기 반응성 염료는 적색 120(red 120), 청색 4(blue 4), 주황색 16(orange 16), 흑색 5(black 5), 또는 보라색 5(violet 5) 염료인 것인, 탈색방법.
제1항에 있어서, 상기 염료를 포함하는 시료는 염색폐수인 것인, 탈색방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 20 ℃ 내지 35 ℃의 온도조건에서 수행되는 것인, 탈색방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 시료 내 염료농도가 700 mg/L 미만이 되도록 전처리 시킨 후 수행되는 것인, 탈색방법.
염료 탈색능을 나타내는 기탁번호 KACC83004BP로 기탁된 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주.
제8항에 있어서, 상기 균주는 리그닌 퍼옥시다아제, 망간 퍼옥시다아제, 리가아제를 포함하는 세포 외 효소 활성을 나타내는 것인, 균주.
제8항의 균주를 효모추출물(yeast extract)이 1 g/L 내지 10 g/L인 배지에 접종하는 단계; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주의 배양방법.
제8항의 균주를 배지에 접종하는 단계; 및 이를 20 내지 35 ℃의 온도조건 및 pH 4 내지 8의 산도조건에서 배양하는 단계를 포함하는 베르칸데라 아두스타 NIBRKDFPFGC000002676 균주의 배양방법.
제8항의 균주 또는 그의 배양물을 포함하는 염료 탈색용 조성물.