KR20170096377A - 프로히비틴 단백질에 대한 항체를 포함하는 혈액암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈액암 진단용 키트 - Google Patents

프로히비틴 단백질에 대한 항체를 포함하는 혈액암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈액암 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로히비틴 단백질에 대한 항체를 포함하는 혈액암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈액암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로히비틴 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 혈액암 진단용 조성물은 종래 프로히비틴 분석용 키트에 사용된 조성물보다 검출 항체의 농도가 낮음에도 불구하고, 프로히비틴 검출능이 매우 우수하며, 특히 프로히비틴-2 발현 정도를 빠르게 확인할 수 있고, 진단의 정확도 및 재현성이 높아 혈액암 진단, 바람직하게 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정 또는 백혈병 치료효과 판정용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프로히비틴 단백질에 대한 항체를 포함하는 혈액암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈액암 진단용 키트{Composition for prognosing susceptibility to hematologic cancers comprising an antibody against prohibitin protein and prognosis kit of hematologic cancers comprising therof}
본 발명은 프로히비틴 단백질에 대한 항체를 포함하는 혈액암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈액암 진단용 키트에 관한 것이다.
혈액암 중에서도 백혈병(leukemia)은 다양한 발병원인이 밝혀지고 있으나, 가장 일반적인 원인은 유전자변이 및 이를 포함하는 염색체변이에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있어, 주로 염색체변이의 종류에 따라, 예후가 달라지며 이에 따라 환자의 치료방향을 결정하고 있다.
현재 백혈병 진단을 위해서는 세포형태학적 소견, 면역표현학소견 및 유전자변이를 포함한 염색체변이를 이용하고 있다. 유전자 및 염색체변이를 확인하기 위해 전통적인 염색체검사와 중합효소연쇄반응을 기반으로한 분자유전학적 방법이 이용되고 있으며, 실제 검사현장에서 용이하게 적용할 수 있는 다양한 분자유전검사법 개발에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.
예를 들어, 장거리 역방향 중합효소연쇄반응(long distance inverse polymerase chain reaction)을 이용하여 융합유전자의 배열을 확인하는 방법(참조: Joseph Wiemeles et al., Blood, 99:3801-3805, 2003), 세포유전학과 FISH(fluorescent in situ hybridization)를 결합한 진단방법(참조: Mancini et al, British Journal of Haematology, 91:878-884, 1995), 체세포 DNA에 대한 PCR을 이용한 방법(참조: Tashiro et al, Japanese Journal of Cancer Research, 84:110-113, 1993) 및 RT-PCR을 이용한 방법(참조: Castaigne et al., Blood, 79:3110-3115, 1991; Fukutani et al, Leukemia, 9:588-593, 1995) 등이 개발되었다.
그러나 상기 방법 중 FISH는 염색체 전좌가 발생된 개별세포를 직접 검출하는 방법으로, 백혈병의 초기에는 검출되지 않으며, PCR 또는 RT-PCR에 의한 방법은 민감도는 뛰어나나, 시료의 오염 등으로 인하여 오류양성(false-positive) 반응을 나타낼 수 있으며, 질병의 진행정도를 정확하게 파악할 수 없다는 단점이 있다.
상술한 단점을 극복하기 위한 방법으로, 최근에는 미량의 시료로부터 표적 RNA의 정량까지 가능한 실시간 RT-PCR 방법을 활용한 백혈병 진단 키트들이 개발되어 시판되고 있으나, 한명의 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 할 경우에도, 진단의 정확성을 향상시키기 위하여 백혈병의 발병과 관련된 다양한 유전자를 검사하여야만 하므로, 상당한 비용과 시간이 소요되기 때문에, 보다 신속한 백혈병의 진단을 수행하기가 어렵다는 단점이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 신속한 혈액암, 바람직하게는 백혈병 진단을 위한 프로히비틴 단백질에 대한 항체를 포함하는 혈액암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈액암 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. (A) 포획 항체; (B) 상기 포획 항체와 특이적으로 결합하는 항원; 및 (C) 상기 항원과 특이적으로 결합하는 검출 항체;를 포함하고, 상기 검출 항체는 프로히비틴 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 혈액암 진단용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 포획 항체는 프로히비틴 단백질 또는 프로히비틴-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 혈액암 진단용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 포획 항체는 인간 프로히비틴 단백질 또는 인간 프로히비틴-2 단백질을 토끼, 쥐 또는 염소에 면역시켜 얻은 것이 특징인 혈액암 진단용 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 포획 항체는 클론 E1Z5A, 클론 A-2, 클론 T-22, 클론 C-13, 클론 II-14-10 및 클론 5H7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 항원은 인간 프로히비틴 재조합 단백질인 혈액암 진단용 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 검출 항체는 인간 프로히비틴 단백질 또는 인간 프로히비틴-2 단백질을 토끼, 쥐 또는 염소에 면역시켜 얻은 것이 특징인 혈액암 진단용 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 검출 항체는 클론 E1Z5A, 클론 A-2, 클론 T-22, 클론 C-13, 클론 II-14-10 및 클론 5H7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 조성물.
8. 위 1에 있어서, 상기 검출 항체는 비오틴화(biotinylated)되거나 FIFC 또는 PE로 콘쥬게이션(Conjugated)된 것인 혈액암 진단용 조성물.
9. 위 1에 있어서, 상기 검출 항체는 2차 항체를 더 포함하는 것인 혈액암 진단용 조성물.
10. 위 9에 있어서, 상기 2차 항체는 g염소 유래 항-토끼 IgG-F(ab') 접합체, 당나귀 유래 항-토끼 IgG, 당나귀 유래 항-마우스 IgG 및 당나귀 유래 항-염소 IgG로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 조성물.
11. 위 1에 있어서, 상기 포획 항체와 검출 항체의 혼합 비율은 1 내지 10 : 1인 혈액암 진단용 조성물.
12. 위 1에 있어서, 상기 검출 항체 농도는 0.1 내지 0.5 μg/ml인 혈액암 진단용 조성물.
13. 위 1에 있어서, 상기 혈액암은 만성 골수성 백혈병인 혈액암 진단용 조성물.
14. 위 1에 있어서, 상기 혈액암 진단용 조성물은 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정 또는 백혈병 치료효과 판정에 사용되는 것인 혈액암 진단용 조성물.
15. 위 1의 혈액암 진단용 조성물을 포함하는 혈액암 진단용 키트.
16. 위 15에 있어서, 상기 키트는 항체-샌드위치 ELISA 키트인 혈액암 진단용 키트.
17. 위 16에 있어서, 상기 키트는 프로히비틴-2 단백질의 발현 정도를 측정하는 것인 혈액암 진단용 키트.
18. 위 15에 있어서, 상기 키트에 사용되는 검체는 전혈, 소변, 타액 및 조직액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 키트.
본 발명에 따른 프로히비틴 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 혈액암 진단용 조성물은 종래 프로히비틴 분석용 키트에 사용된 조성물보다 검출 항체의 농도가 낮음에도 불구하고, 프로히비틴 검출능이 매우 우수하며, 특히 프로히비틴-2 발현 정도를 빠르게 확인할 수 있고, 진단의 정확도 및 재현성이 높아 혈액암 진단, 바람직하게 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정 또는 백혈병 치료효과 판정용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 (A) 포획 항체; (B) 상기 포획 항체와 특이적으로 결합하는 항원; 및 (C) 상기 항원과 특이적으로 결합하는 검출 항체;를 포함하고, 상기 검출 항체는 프로히비틴 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 혈액암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 프로히비틴 단백질은 혈액암 환자, 바람직하게 백혈병 환자의 조직에서 특이적으로 발현이 증가함에 따라 혈액암 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 포획 항체는 프로히비틴 단백질 또는 프로히비틴-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 상기 포획 항체는 인간 프로히비틴 단백질 또는 인간 프로히비틴-2 단백질을 토끼, 쥐 또는 염소에 면역시켜 얻은 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 포획 항체는 클론 E1Z5A, 클론 A-2, 클론 T-22, 클론 C-13, 클론 II-14-10 및 클론 5H7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 상기 항원은 인간 프로히비틴 재조합 단백질일 수 있다.
본 발명의 상기 검출 항체는 인간 프로히비틴 단백질 또는 인간 프로히비틴-2 단백질을 토끼, 쥐 또는 염소에 면역시켜 얻은 것일 수 있고, 바람직하게 상기 검출 항체는 클론 E1Z5A, 클론 A-2, 클론 T-22, 클론 C-13, 클론 II-14-10 및 클론 5H7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 포획 항체 및 검출 항체는 서로 상이한 것을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 항체는 비오틴화(biotinylated)되거나 발색반응을 하는 통상의 발색제인 HRP(horseradish peroxidase), 염기성탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocya nate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체로 콘쥬게이션(Conjugated)된 것을 포함할 수 있으며, 상기 검출 항체는 2차 항체를 더 포함할 수 있다.
상기 2차 항체는 염소 유래 항-토끼 IgG-F(ab') 접합체, 당나귀 유래 항-토끼 IgG, 당나귀 유래 항-마우스 IgG 및 당나귀 유래 항-염소 IgG로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 프로히비틴 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 상기 포획 항체와 검출 항체의 혼합 비율은 1 내지 10 : 1이고, 상기 검출 항체 농도는 0.1 내지 0.5 μg/ml이다.
본 발명에서는 pairing test, Optimization test를 통해 포획 항체와 검출 항체를 이용한 프로히비틴 Sandwich indirect ELISA system의 최적 조건을 구축하였고, 그 결과, 종래 1 μg/ml의 PHB2 (E1Z5A, CST) antibody 농도를 0.25 μg/ml로 낮추었으며, Blank 대비 signal의 상승은 유지한 최적의 실험 조건을 확인하였고, 시판중인 키트 보다 PHB-2 정량 분석을 위한 ELISA kit로서 적합한 것을 확인하였다.
본 발명의 상기 혈액암은 만성 골수성 백혈병이다.
본 발명의 상기 혈액암 진단용 조성물은 바람직하게, 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정 또는 백혈병 치료효과 판정에 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 혈액암 진단용 조성물을 포함하는 혈액암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트는 항체-샌드위치 ELISA 키트이고, 상기 키트는 프로히비틴-2 단백질의 발현 정도를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 키트에 사용되는 검체는 전혈, 소변, 타액 및 조직액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
특히 본 발명의 상기 키트는 일반적으로 검체로 사용되는 혈액으로부터 혈장이나 혈청을 따로 분리하여 사용하지 않고도 전혈, 소변, 타액 및 조직액 등으로부터 프로히비틴-2 단백질의 발현 정도를 쉽게 측정할 수 있다.
상기 혈액암 진단용 키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량 분석 및 정성 분석함으로써 혈액암 진단, 바람직하게는 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정, 백혈병 치료효과 판정 등에 유용하게 사용할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
재료
본 발명에 사용된 암세포주, 항원, 1차 항체 및 2차 항체는 하기에 나타낸 바와 같다.
(1) 암 세포주
K562: 만성골수성백혈병(Human immortalised myelogenous leukemia) 세포주
MCF-7: 유방암(Human breast adenocarcinoma) 세포주
HeLa: 자궁경부암(uman epithelial adenocarcinoma) 세포주
HT-29: 대장암(Human colorectal adenocarcinoma) 세포주
(2) 항원(antigen)
인간 PHB 재조합 단백질(TP301229, Origene)
인간 PHB 재조합 단백질(ab28492, abcam)
(3) 1차 항체
구분 Target clonality Host Isotype epitope
1 E1Z5A PHB2 mono 염소 IgG PHB2 전체
2 A-2 PHB2 mono 마우스 IgG C 말단, 220-299
3 T-22 PHB2 poly 토끼 IgG -
4 C-13 total PHB poly 염소 IgG -
5 II-14-10 total PHB mono 마우스 IgG1 재조합 인간 PHB
6 5H7 total PHB mono 마우스 IgG1 Ecoli 에서 발현된 재조합 인간 PHB
(4) 2차 항체
구분 reactivity clonality Host
1 염소 유래 항-토끼 IgG-F(ab') 접합체 토끼 poly 염소
2 나귀 유래 항-토끼 IgG 토끼 poly 당나귀
3 당나귀 유래 항-마우스 IgG 마우스 poly 당나귀
4 당나귀 유래 항-염소 IgG 염소 poly 당나귀
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 4
혈액암 진단, 바람직하게는 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정 또는 백혈병 치료효과 판정 목적의 PHB2 정량 분석용 ELISA 키트를 제작하기 위해, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, PHB2 (A-2, Santa Cruz), PHB (II-14-10, Thermo), PHB (C-13, Santa Cruz), PHB2 (E1Z5A, CST), PHB2 (T-22, Santa Cruz) 및 PHB (5H7, Antibodies online) 6종의 항체를 조합하였다.
특히 상기 6종의 항체는 Capture antibody : Detection antibody = poly : mono를 기본으로 하되, 농도는 각각 0.5 μg/ml로 가능한 모든 조합을 구성하였으며, Antibody의 host의 구분, Antibody epitope의 구분 (PHB1과 PHB2의 domain의 비교, PHB의 구조적인 부분 비교)하여 조합하였다.
구분 Capture antibody Detection antibody
실시예 1 PHB (5H7, Antibodies online) PHB2 (T-22, Santa Cruz)
실시예 2 PHB2 (T-22, Santa Cruz) PHB (C-13, Santa Cruz)
실시예 3 PHB2 (E1Z5A, CST) PHB (C-13, Santa Cruz)
실시예 4 PHB2 (E1Z5A, CST) PHB (II-14-10, Thermo)
실시예 5 PHB (II-14-10, Thermo) PHB2 (E1Z5A, CST)
비교예 1 PHB2 (E1Z5A, CST) PHB (5H7, Antibodies online)
비교예 2 PHB (II-14-10, Thermo) PHB2 (T-22, Santa Cruz)
비교예 3 PHB (C-13, Santa Cruz) PHB2 (T-22, Santa Cruz)
비교예 4 PHB2 (T-22, Santa Cruz) PHB (C-13, Santa Cruz)
실험예 1
상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 4에서 얻은 조합된 항체들은 Sandwich indirect ELISA 실험을 통해 항체 페어링(Pairing) 테스트를 수행하였다.
상기 실시예 1 내지 8 및 비교예 1의 각각의 항체를 희석하여 100 μL/well로 첨가 후 RT에서 17 시간 동안 배양하였고, 0.05 M 카보네이트-바이카보네이트를 코팅 버퍼로 사용하여 항체를 희석하였다.
블로킹은 well당 블로킹 버퍼 300 μL를 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, 항원을 25 ng/ml 농도로 희석하여 100 μL/well 첨가 후 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한 다음 세척 버퍼를 사용하여 350 μL/well로 3회 반복 세척하였고, 그 다음 항원을 완충액으로 희석하여 100 μL/well로 첨가 후 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 다시 세척 버퍼를 이용하여 350 μL/well로 3회 반복 세척 하는 과정을 수행하였다.
상기 세척 과정을 수행한 다음 상기 항체를 HRP(horseradish-peroxidase)로 희석하여 100 μL/well씩 첨가하고, 37 ℃에서 30 분 동안 배양한 다음 세척 버퍼를 이용하여 350 μL/well로 3회 반복 세척 하는 과정을 수행하고, 다시 항원에 TMB(Tetramethylbenzidine)를 100 μL/well로 첨가한 후, 차광하여 상온에서 20분 동안 배양하는 과정을 수행하였다. 마지막으로 정지액(stop solution) 1 N H2SO4를 100 μL/well 처리 하였다.
Sandwich indirect ELISA의 측정파장은 450 nm이고, 참조파장은 620 nm로 수행하였다.
구분 PHB 재조합 단백질
25 ng/ml		 블랭크
실시예 1 0.112 0.084
실시예 2 0.088 0.071
실시예 3 0.109 0.057
실시예 4 0.027 0.019
실시예 5 0.092 0.032
비교예 2 0.059 0.134
비교예 3 0.029 0.032
비교예 4 1.34 1.39
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, PHB 재조합 단백질을 이용한 Sandwich indirect ELISA에서 PHB (II-14-10, Thermo)-PHB2 (E1Z5A, CST) 조합이 가장 높은 signal 상승을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6 내지 11 및 비교예 5
상기 실험예 1에서 가장 높은 signal 상승을 나타낸 PHB (II-14-10, Thermo)-PHB2 (E1Z5A, CST) 조합에 있어서, 각각의 농도에 따라 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 페어링 하였다.
구분 capture antibody detection antibody
II-14-10(μg/ml) E1Z5A(μg/ml)
실시예 6 0.5 0.1
실시예 7 1 0.1
실시예 8 2 0.1
실시예 9 1 0.5
실시예 10 2 0.5
실시예 11 1 0.25
비교예 5 1 0.125
실험예 2
상기 실시예 5 내지 10의 농도에 따른 signal 변화를 확인한 결과를 하기 표 6에 나타내었다. PHB 재조합 단백질은 origene사에서 제조된 것을 사용하였다.
구분 PHB 재조합 단백질
25 ng/ml		 블랭크
실시예 5 0.766 0.046
실시예 6 0.343 0.021
실시예 7 0.443 0.023
실시예 8 0.431 0.022
실시예 9 0.443 0.023
실시예 10 0.431 0.022
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, capture antibody의 경우에는 농도에 따른 signal의 변화를 보이지 않는 반면, detection antibody의 경우, 농도에 따른 signal 변화가 나타나는 것이 확인되었다.
실험예 3
재조합 PHB 단백질과 HeLa cell을 이용하고, HRP 희석 농도를 변화하여, 실시예 11 및 비교예 5의 PHB2 (E1Z5A, CST), PHB2 (II-14-10, Thermo) antibody의 농도에 따른 signal 변화를 확인한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
구분 HRP 희석 농도 PHB 재조합 단백질
25 ng/ml		 HeLa cell 블랭크
실시예 11 1:2000 0.89 0.372 0.039
실시예 11 1:1000 1.097 0.619 0.054
실시예 11 1:1500 1.512 0.726 0.082
비교예 5 1:1500 1.067 0.714 0.082
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, HRP-conjugated antibody의 농도를 변화한 Sandwich indirect ELISA실험을 통해, HRP 농도가 1:5000인 경우, 가장 높은 signal의 상승을 보인 것을 확인하였다. 또한 위의 조건들은 Recombinant PHB protein과 HeLa cell lysate를 통해 동일한 signal 상승을 보인 것을 토대로 확인할 수 있었으며, 종래 1 μg/ml의 PHB2 (E1Z5A, CST) antibody 농도를 0.25 μg/ml로 낮추었으며, Blank 대비 signal의 상승은 유지한 최적의 실험 조건을 구축하였다.
실험예 4
상기 실시예 11의 Sandwich indirect ELISA를 통한 HeLa 세포주와 HT-29 세포주 내의 Prohibitin 발현 정도를 확인한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
구분 프로히비틴(ng/ml)
실시예 11 HeLa (100 μg) 25.94
HeLa (10 μg) 3.16
HT-29 (100 μg) 15.84
HT-29 (10 μg) 8.26
BLUE GENE kit HeLa (400 μg) 4.16
CUSABIO kit HeLa (400 μg) 2.4
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, Recombinant PHB protein을 이용해 standard curve를 구성하였고, HeLa cell과 HT-29 cell내에서 검출된 Prohibitin을 확인 할 수 있었다.
실험예 5
최적의 실험 조건을 구축한 PHB2 (E1Z5A, CST) - PHB (II-14-10, Thermo)의 Sandwich indirect ELISA system에서 정확성 (Accuracy), 정밀성 (Precision)을 standard curve를 통해 확인하였다.
측정파장은 450 nm로 하고 참조파장은 620 nm로 하여 측정하였고, 검체를 넣지 않은 well을 blank로 하여 standard의 흡광도 값에서 제거하였으며, Triplicate로 수행하여 standard curve의 정확성을 높였다.
그 결과 시판중인 PHB ELISA kit (BLUE GENE, CUSABIO)를 이용한 비교실험에서는 두 group간의 차이가 없는 것이 확인되었고, 결론적으로 본 실험을 통해 개발된 system은 시판중인 키트 보다 PHB-2 정량 분석을 위한 ELISA kit로서 적합하다고 판단되었다.
실험예 6
PHB Sandwich indirect ELISA kit와 PHB commercial kit (BLUEGENE 및 KUSABIO)를 이용하여 Leukemia 환자군과 정상군 샘플의 비교를 통해 PHB의 detection을 최종적으로 확인해 본 결과, commercial kit에서는 환자군과 정상군과의 차이가 없었지만, 개발된 kit에서는 두 실험군 사이의 차이를 확인할 수 있었다.
위에서 살펴본 바와 같이, 상기 Pairing test, Optimization test를 통해 PHB2 (E1Z5A, CST), PHB (II-14-10, Thermo) antibody를 이용한 PHB Sandwich indirect ELISA system의 최적 조건을 구축하였다. 또한, validation 실험 및 환자군과 정상군의 검출 실험을 통해 개발된 kit가 PHB2 정량 분석 ELISA kit로서 적합함을 확인하였다.

Claims (18)

  1. (A) 포획 항체;
    (B) 상기 포획 항체와 특이적으로 결합하는 항원; 및
    (C) 상기 항원과 특이적으로 결합하는 검출 항체;를 포함하고,
    상기 검출 항체는 프로히비틴 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 혈액암 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 포획 항체는 프로히비틴 단백질 또는 프로히비틴-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 혈액암 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 포획 항체는 인간 프로히비틴 단백질 또는 인간 프로히비틴-2 단백질을 토끼, 쥐 또는 염소에 면역시켜 얻은 것이 특징인 혈액암 진단용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 포획 항체는 클론 E1Z5A, 클론 A-2, 클론 T-22, 클론 C-13, 클론 II-14-10 및 클론 5H7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 항원은 인간 프로히비틴 재조합 단백질인 혈액암 진단용 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 검출 항체는 인간 프로히비틴 단백질 또는 인간 프로히비틴-2 단백질을 토끼, 쥐 또는 염소에 면역시켜 얻은 것이 특징인 혈액암 진단용 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 검출 항체는 클론 E1Z5A, 클론 A-2, 클론 T-22, 클론 C-13, 클론 II-14-10 및 클론 5H7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 검출 항체는 비오틴화(biotinylated)되거나 HRP(horseradish peroxidase), 염기성탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocya nate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 콘쥬게이션(Conjugated)된 것인 혈액암 진단용 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 검출 항체는 2차 항체를 더 포함하는 것인 혈액암 진단용 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 2차 항체는 염소 유래 항-토끼 IgG-F(ab') 접합체, 당나귀 유래 항-토끼 IgG, 당나귀 유래 항-마우스 IgG 및 당나귀 유래 항-염소 IgG로로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 포획 항체와 검출 항체의 혼합 비율은 1 내지 10 : 1인 혈액암 진단용 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 검출 항체 농도는 0.1 내지 0.5 μg/ml인 혈액암 진단용 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈액암은 만성 골수성 백혈병인 혈액암 진단용 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈액암 진단용 조성물은 백혈병 진단, 백혈병 잔류병소 측정 또는 백혈병 치료효과 판정에 사용되는 것인 혈액암 진단용 조성물.
  15. 청구항 1의 혈액암 진단용 조성물을 포함하는 혈액암 진단용 키트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 키트는 항체-샌드위치 ELISA 키트인 혈액암 진단용 키트.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 키트는 프로히비틴-2 단백질의 발현 정도를 측정하는 것인 혈액암 진단용 키트.
  18. 청구항 15에 있어서,
    상기 키트에 사용되는 검체는 전혈, 소변, 타액 및 조직액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 혈액암 진단용 키트.
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