KR20170068560A - 암 치료에서의 병용 요법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 항문 또는 질 종양 및 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 인간 대상물에서 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 방법으로서, 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는, 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료에서의 병용 요법{COMBINATION THERAPY FOR USE IN CANCER THERAPY}
본 발명은 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 항문 또는 질 종양 및 항문 또는 질 암을 치료하는 방법을 제공한다.
리스테리아 모노사이토게네스(Lm)는, 인간에게, 특히, 노인, 신생아, 임산부, 및 면역이 손상된 환자에게 때때로 질환을 야기할 수 있는 식품 매개 그람 양성 세균이다. 타고난 면역성을 강력하게 활성화하고 항원 제시 세포(APC) 기능을 향상시키는 시토카인 반응을 유도하는 것에 외에, Lm은, 주로 리스테리오리신 O(LLO) 단백질의 작용을 통해 파고리소좀으로부터 벗어난 후 APC의 시토졸에서 복제하는 능력을 갖는다. 이러한 고유한 세포내 생활 주기는, Lm에 의해 분비되는 항원들이 MHC 클래스 I 및 II 분자들 모두의 관점에서 가공 및 제시될 수 있게 하여, 세포에 독성이 될 수 있는 CD8+ 및 Th1 CD4+ T-세포-매개 면역 반응을 초래할 수 있다. Lm은 임상전 모델의 암 면역요법을 위한 벡터로서 널리 연구되어 왔다.
발암 위험성이 높은 인간 유두종 바이러스형(HR-HPV)에 의한 고질적인 감염은, 자궁경부의 침습성 암종(ICC)에 대한 전적인 원인은 아니지만 불가피한 원인으로서 인식된다. HPV 16과 18은, 악성 병변의 가장 일반적인 유형으로서, ICC의 70%를 넘게 차지하고 고도 전구물질 병변의 50%를 넘게 차지한다.
항문암은 직장 끝의 개구인 항문에서 시작되는 드문 악성 종양이다. 미국 암학회는 2015년에 7,270건의 항문암이 진단될 것이며(발생률은 여전히 증가), 그 해 항문암으로 인한 약 1,010명의 사망자가 발생할 것으로 추정한다. 전체 항문암의 약 절반은 악성 종양이 1차 부위 너머로 퍼지기 전에 진단되지만, 13% 내지 25%는 암이 림프절로 퍼진 후 진단되고, 10%는 멀리 떨어져 있는 장기로 암이 퍼지거나 전이된 후 진단된다. 조기에 발견되는 경우, 항문암은 쉽게 치료할 수 있지만, 멀리 떨어져 있는 장기로 암이 퍼진 경우, 5명의 환자 중 약 1명이 5년 이상 생존한다.
수용성 항문 성교는 항문암 발병과 밀접한 관련이있다. 생식기 사마귀를 초래하는 인간 유두종 바이러스(HPV)에 의한 항문 감염은 암의 주요 위험 인자이고, 면역이 손상된 환자는 항문암에 걸리기 쉽다. 이러한 하위군에서, 예후는 비-면역 손상 환자의 경우보다 더 나쁘다.
항문암은 주로 화학요법과 방사선의 조합으로 치료된다. 이로 인해 인공 항문의 필요성은 줄어들고 5년 생존율 결과는 70%를 초과하게 된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방식의 항문암의 치료는 1974년 이후 변하지 않았고 상기 요법에 실패한 환자만이 수술을 받는다. 따라서, 항문암 치료에 대한 대안적 접근법이 필요하다. 이러한 접근법 중 하나는 리스테리아 모노사이토게네스 백신 벡터와 같은 재조합 약독화 생백신 벡터를 이용한 면역치료적 접근법이다. 본 발명은 항문암 치료를 위한 약독화 생 리스테리아 백신 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 대상물에서 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 방법으로서, 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 대상물에서 항문 또는 질 신생물을 치료하는 방법으로서, 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 신생물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 인간 대상물에서 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하기 위한 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 치료는 상기 대상물에게 화학방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 인간 대상물에서 항문 또는 질 신생물을 치료하기 위한 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 치료는 상기 대상물에게 화학방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 신생물을 치료하는 용도에 관한 것이다.
관련 양태에서, 본 발명은 인간 대상물에서 항종양 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 대상물에게 상기 병용 요법을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본원에 개시된 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 실시예들과 도면들로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 수정은 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예들은 본 발명의 바람직한 구현예들을 나타내면서 단지 예시적으로만 주어지는 것으로 이해해야 한다.
본 발명으로 간주되는 기술적 사상은 본 명세서의 결론 부분에서 특히 지적되고 명확하게 청구된다. 그러나, 본 발명은, 그 목적, 특징 및 장점과 함께, 구성 및 동작 방법 모두에 관하여 첨부된 도면들을 읽을 때 다음과 같은 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 수도 있다:
도 1. Lm-E7과 Lm-LLO-E7은 E7을 발현 및 분비하도록 서로 다른 발현계를 사용한다. Lm-E7은, 유전자 카세트를 L 모노사이토게네스 게놈(A)의 orfZ 도메인에 도입함으로써 생성되었다. hly 촉진자는, hly 신호 서열 및 HPV-16-E7이 뒤따르는 LLO의 처음 5개의 아미노산(AA)의 발현을 구동한다. B), Lm-LLO-E7은, PrfA-균주 XFL-7을 플라스미드 pGG-55로 형질전환함으로써 생성되었다. pGG-55는, LLO-E7의 비용혈성 융합의 hly 촉진자 구동 발현을 갖는다. pGG-55는, 또한, 생체 내 XFL-7에 의한 플라스미드의 보유를 선택하기 위한 PrfA 유전자를 함유한다.
도 2. Lm-E7과 Lm-LLO-E7은 E7을 분비한다. Lm-Gag(레인 1), Lm-E7(레인 2), Lm-LLO-NP(레인 3), Lm-LLO-E7(레인 4), XFL-7(레인 5), 및 10403S(레인 6)를 37℃의 Luria-Bertoni 액체 배지에서 밤새 성장시켰다. 600 nm 흡광도에서 OD에 의해 결정된 바와 같은 균등 개수의 세균을, 펠릿 처리하고, 각 상청액 18 ml를 TCA 침전시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 E7 발현을 분석하였다. 블롯을 항-E7 mAb에 의해 프로빙한 후, HRP-접합된 항-마우스(Amersham) 처리한 다음, ECL 검출 시약을 사용하여 발현시켰다.
도 3. LLO-E7 융합의 종양 면역 치료 효능. 마우스의 밀리미터 단위의 종양 크기가 종양 접종 7일후, 14일후, 21일후, 28일후, 및 56일후에 대하여 도시되어 있다. 원시(naive) 마우스: 개방 원형; Lm-LLO-E7: 채워진 원형: Lm-E7: 정사각형; Lm-Gag: 개방 다이아몬드형; 및 Lm-LLO-NP: 채워진 삼각형.
도 4. Lm-LLO-E7 면역 마우스로부터의 비장 세포는 TC-1 세포에 노출시 증식한다. C57BL/6 마우스를 면역화하고 Lm-LLO-E7, Lm-E7, 또는 대조 rLm 균주로 추가투여하였다. 추가투여 후 6일째에 비장 세포를 채취하고, 방사선 조사된 TC-1 세포를 도시된 비로 발랐다. 세포를, 3H 티미딘으로 펄스 처리하고 채취하였다. Cpm은 (실험 cpm) - (no-TC-1 대조군)으로서 정의된다.
도 5a. 비장에서의 E7-특이성 IFN-감마-분비 CD8+ T 세포의 유도, 및 TC-1 종양 세포가 투여된 후 Lm-E7, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7이 투여되거나 백신이 투여되지 않은(원시) 마우스에서의 종양을 통과하는 개수. 도 5b. (A)에 대하여 설명한 마우스의 비장과 종양에서의 E7-특이성 CD8+ 세포의 유도 및 통과.
도 6. PEST 영역들을 함유하는 리스테리아 구성물은, 종양 내에 더욱 높은 퍼센트의 E7-특이성 림프구를 유도한다. 도 6a. 실험 1로부터의 대표적인 데이터. 도 6b. 모든 3회 실험으로부터의 데이터의 평균 및 SE.
도 7a. 재조합 리스테리아 백신 벡터들의 세균 로드(병독성)에 대한 계대 효과. 상단 패널. Lm-Gag. 하단 패널. Lm-LLO-E7. 도 7b. 비장에서의 재조합 Lm-E7의 세균 로드에 대한 계대 효과. 4개 마우스로부터의 비장 균질액의 밀리리터당 생 세균의 평균 CFU를 도시한다.
도 8은 계대 Lm-Gag 대 미계대 Lm-Gag 투여 후 HIV-Gag 및 LLO에 대한 항원-특이성 CD8+ T 세포의 유도를 도시한다. 103 (A, B, E, F) 또는 105 (C, D, G, H) CFU 계대 리스테리아 백신 벡터로 마우스를 면역 처리하고, 항원-특이성 T 세포를 분석하였다. B, D, F, H: 미계대 리스테리아 백신 벡터. MHC 클래스 I HIV-Gag 펩타이드에 대한 A-D 면역 반응. E-H: LLO 펩타이드에 대한 면역 반응. I: 105 CFU 계대 Lm-Gag로 면역 처리된 마우스로부터의 비장 세포를 HPV E7로부터의 대조 펩타이드로 자극하였다.
도 9a는 LB 안정성 연구를 통한 플라스미드 분리를 도시한다. 도 9b는, TB 안정성 연구를 통한 플라스미드 분리를 도시한다. 도 9c는 TB 안정성 연구의 정량을 도시한다.
도 10은 LB에서 성장한 세균으로부터 많은 생존가능 세균 클로람페니콜(CAP)-저항성 및 CAP-민감성 콜로니-형성 유닛들(CFU)을 나타낸다. 어두운 막대: CAP+; 흰 막대: CAP-. 각 시점마다 두 개의 어두운 막대와 두 개의 흰 막대는 중복 샘플을 도시한다.
도 11은 TB에서 성장한 세균으로부터의 많은 살아 있는 세균 CAP-저항성 및 CAP-민감성 CFU를 도시한다. 어두운 막대: CAP+; 흰 막대: CAP. 각 시점마다 두 개의 어두운 막대와 두 개의 흰 막대는 중복 샘플을 도시한다.
도 12. D133V 돌연변이의 영역(화살표)을 보여주는 실제 크로마토그램. 혼합비는 괄호 안에 도시되어 있다.
도 13. 반응에서 증폭된 PrfA 유전자의 세그먼트 및 ADV451, 452, 453 프라이머의 위치를 나타낸다.
도 14. 프라이머 ADV451 및 ADV453을 사용한 PCR 반응의 특이성.
도 15. 프라이머 ADV452 및 ADV453을 사용한 PCR 반응의 특이성.
도 16. 프라이머 ADV452 및 1 ng을 DNA의 초기량으로서 사용하여 야생형 PrfA 서열을 검출하는 PCR 반응의 민감성.
도 17. 프라이머 ADV452 및 5 ng을 DNA의 초기량으로서 사용하여 야생형 PrfA 서열을 검출하는 PCR 반응의 민감성.
도 18. 도16에 도시한 PCR로부터의 대역들의 평균 밀도.
도 19. 도 17에 도시한 PCR로부터의 대역들의 평균 밀도.
도 20. 프라이머 ADV452를 사용하여 야생형 PrfA 서열을 검출하는 PCR 반응의 검증.
도 21. 도16에 도시한 PCR로부터의 대역들의 평균 밀도.
도 22. Lm-LLO-E7에서의 D133V PrfA 돌연변이의 분석. A, 밀도 측정에 사용된 초기 화상; B, 화상을 디지털 향상시켜 저밀도 대역들의 가시화를 용이하게 하였다.
도 23. 환자의 치료 일정 #1을 나타낸다. 일정은 화학방사선 요법 전에 ADXS-HPV(ADX)의 1차 투여량 투여를 포함하고, 2 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 주어진다.
도 24. 화학방사선 요법 중에 ADXS-HPV의 2차 투여량이 투여되는, 환자의 치료 일정 #2를 나타낸다.
예시의 단순성 및 명확성을 위해, 도면들에 도시된 요소들이 반드시 일정한 비율로 도시되지 않았음은 이해될 것이다. 예를 들어, 상기 요소들의 일부의 치수들은 명확성을 위해 다른 요소들에 비해 과장될 수도 있다. 또한, 적절하다고 인정되는 경우, 참조 부호들은 대응하거나 유사한 요소들을 나타내기 위해 도면들에 반복될 수도 있다.
본 발명은, 일부 구현예에서, 질병을 치료하고, 질병으로부터 보호하고, 질병에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로, 리스테리오리신 O(LLO) 단편 및 상기 질병에 의해 발현된 이종 항원 또는 그 단편을 포함하는 융합 펩타이드를 발현하는 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한, 재조합 리스테리아 균주를 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상물에서 항질환 세포독성 T-세포(CTL) 반응을 유도하고, 상기 질환에 연관된 장애 및 증상을 치료하기 위한 방법들을 제공한다. 일 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주가 본원에 제공되고, 상기 재조합 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하되, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 재조합 핵산은 돌연변이 prfA 유전자를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함한다. 일 구현예에서, 돌연변이 PrfA 유전자는 133번째 아미노산 위치에서 아미노산 D 또는 Asp 또는 아스파르트산염(또는 아스파르트산)으로부터 아미노산 V 또는 Val 또는 발린으로의 점 돌연변이를 암호화하는 것이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 동일한 리스테리아에 의해 포함된 플라스미드를 통해 보완되는 prfA 돌연변이 또는 결실을 포함하며, 플라스미드는 D133V 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 PrfA 단백질을 암호화하는 돌연변이 prfA 유전자를 포함한다.
다른 구현예에서, 재조합 리스테리아는 약독화된 리스테리아이다. "약독화" 및 "약독화된"이라는 것은, 숙주에 대한 독성을 감소시키도록 변형되는, 세균, 바이러스, 기생충, 감염성 유기체, 프리온, 종양 세포, 감염성 유기체의 유전자 등을 포함할 수 있다. 숙주는, 인간 또는 동물 숙주일 수 있고, 또는 장기, 조직, 또는 세포일 수 있다. 세균은, 비제한적인 일례로, 약독화되어 숙주 세포에 대한 결합을 감소시키거나, 하나의 숙주 세포로부터 다른 숙주 세포로의 확산을 감소시키거나, 세포외 성장을 감소시키거나, 또는 숙주 세포의 세포내 성장을 감소시킬 수 있다. 약독화는, 예를 들어, 독성의 징후 또는 징후들, LD50, 장기로부터의 청소율, 또는 경쟁 지수를 측정하여 평가될 수 있다(예를 들어, Auerbuch 등 (2001) Infect. Immunity 69:5953-5957 참조). 일반적으로, 약독화에 따라, LD50 및/또는 청소율은 적어도 25%, 더욱 일반적으로는 적어도 50%, 가장 일반적으로는, 적어도 100%(2배), 통상적으로는 적어도 5배, 더욱 통상적으로는 적어도 10배, 가장 통상적으로는, 적어도 50배, 흔히 적어도 100배, 더욱 흔하게는 적어도 500배, 가장 흔하게는 적어도 1000배, 일상적으로 적어도 5000배, 더욱 일상적으로는 적어도 10,000배, 가장 일상적으로는 적어도 50,000배, 가장 흔하게는 적어도 100,000배 증가한다.
당업자라면, "약독화된 유전자"라는 용어가 독성, 병리, 또는 병독성을 숙주에, 숙주 내의 성장, 또는 숙주 내의 생존에 대해 매개하는 유전자를 포함할 수 있음을 충분히 인식할 것이며, 여기서, 유전자는 독성, 병리, 또는 병독성을 완화, 감소, 또는 제거하는 식으로 돌연변이된다. 감소 또는 제거는, 돌연변이 유전자에 의해 매개되는 병독성 또는 독성을 비돌연변이(또는 부) 유전자에 의해 매개된 병독성 또는 독성과 비교함으로써, 평가될 수 있다. "돌연변이 유전자"는, 유전자의 조절 영역, 유전자의 암호화 영역, 유전자의 비암호화 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 결실, 점 돌연변이, 및 프레임시프트 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 인간 대상물에서 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 방법으로서, 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후 및 상기 재조합 리스테리아 균주의 1 내지 3회 추가투여 전에 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주와 동시에 투여된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 제공된 재조합 리스테리아의 4회 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 재조합 리스테리아는 N-말단 LLO의 융합 단백질 및 이종 항원을 발현한다. 다른 구현예에서, 이종 항원은 인간 유두종 바이러스 E7 항원(HPV-E7)이다. 다른 구현예에서, HPV 항원은 HPVE6이다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 병용 요법의 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고 2차 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 투여된다(본원 실시예 11 참조). 다른 구현예에서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고, ADXS-HPV의 2차 투여량은 화학방사선 요법 중에 투여되며, 3차 내지 4차 투여량은 화학방사선 요법 완료 후 28일마다 투여된다(실시예 11 참조).
일 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아와 함께 사용하기 위한 화학방사선 섭생 또는 화학방사선 요법이 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 화학방사선 요법은 미토마이신 및 플루오로우라실(5-FU) 및 방사선 요법을 포함한다. 다른 구현예에서, 화학방사선 요법은, 이들로 제한하는 것은 아니지만, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 클루람부실, 멜파란, 니트르소 요소, 테모졸로미드, 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 젬시타빈, 하이드록시요소, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 또는 티오구아닌(이전에는 Thioguanine)을 포함하여 당해 분야에 알려지 임의의 다른 화학요법제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 화학방사선 섭생 또는 화학방사선 요법은 동시 방사선(강도 변조 방사선 요법에 의한 30 분할의 54 Gy)과 함께 미토마이신, 5-FU의 두 과정을 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 방사선 요법은 약 6주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 3주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 4주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 5주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 7주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 8주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 6~8주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 4~6주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 2~4주간 지속된다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 8~10주간 지속된다.
다른 구현예에서, 인간 대상물에서 항종양 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 대상물에게 상기 병용 요법을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 인간 대상물에서 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 재조합 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 재조합 핵산은 돌연변이 prfA 유전자를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함함으로써, 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 자궁경부암으로부터 인간 대상물을 보호하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 재조합 리스테리아 균주로 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 이종 항원 또는 그 단편을 포함하는 면역원성 조성물로 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 대상물의 세포가 이종 항원을 발현하게 하는 면역원성 조성물로 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 세포는 종양 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 백신으로 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 항종양 또는 항암 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 재조합 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 재조합 핵산은 대사 효소를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함함으로써, 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 리스테리아는 내인성 prfA 유전자 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 리스테리아는 내인성 dal /dat 및 actA 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 이종 항원 또는 그 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 이종 항원에 융합된 N-말단 LLO를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 분자는 대사 효소를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 결여되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 다른 구현예에서, 제2 개방 해독틀에 의해 암호화된 대사 효소는 알라닌 라세마아제 효소(dal)이다. 다른 구현예에서, 제2 개방 해독틀에 의해 암호화된 대사 효소는 D-아미노산 전이효소(dat)이다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 리스테리아 균주는 게놈 dal, dat, 또는 actA 유전자에서의 돌연변이, 결실 또는 불활성화를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 리스테리아 균주는 게놈 dal, dat, 및 actA 유전자에서의 돌연변이, 결실 또는 불활성화를 포함한다. 다른 구현예에서, 리스테리아는 게놈 dal, dat, 또는 actA 유전자가 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 리스테리아는 게놈 dal, dat, 및 actA 유전자가 결여되어 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 LLO 단백질과 ActA 단백질의 관점에서 그 단편은, LLO 또는 ActA 단백질들의 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는, LLO 또는 ActA 단백질 또는 폴리펩타이드의 적어도 10개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 20개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 40개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 50개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 60개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 70개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 80개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 90개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 100개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 125개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 150개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 175개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 200개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 250개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 300개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 350개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 400개의 연속 아미노산 잔기, 또는 적어도 450개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
다른 구현예에서, 단편은 N-말단 LLO/이종 항원 융합 단백질 또는 N-말단 ActA/이종 항원 융합 단백질의 형태일 때 질병 관련된 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 기능적 단편이다. 다른 구현예에서, 단편은 면역원성 단편이다. 다른 구현예에서, 단편은 비융합 형태로 기능적이다.
본 발명은, 특정 구현예들에서, 리스테리아에 대하여 이종인 핵산 또는 리스테리아에 대하여 내인성인 핵산의 코돈 최적화를 제공한다. 각 아미노산마다 L. 모노사이토게네스에 의해 이용되는 최적의 코돈은 본원에 참조로 통합된 미국 특허 공개 제2007/0207170호에 개시되어 있다. 핵산의 적어도 하나의 코돈이 초기 서열의 코돈보다 그 아미노산을 위해 L. 모노사이토게네스에 의해 더욱 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체되면 코돈-핵산은 최적화된다.
N-말단 LLO 단백질 단편과 이종 항원은, 다른 구현예에서, 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편과 이종 항원을 암호화하는 유전자들은 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편과 이종 항원은 링커 펩타이드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편과 이종 항원은 이종 펩타이드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편은 이종 항원에 대한 N-말단이다. 다른 구현예에서, N-말단 LLO 단백질 단편은 융합 단백질의 N-최말단부이다. 본원에 개시된 바와 같이, LLO-항원 융합체를 발현하는 재조합 리스테리아 균주는 항종양 면역(실시예 1)을 유도하고, 항원 특이적 T 세포 증식(실시예 2)을 유도하고, 항원 특이적 종양-침윤 T 세포(실시예 3)를 생성한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물의 자궁경부암을 치료하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에게 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는 HPV E7 항원 및 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하고, 이에 의해 재조합 리스테리아 균주는 E7 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써, 인간 대상물의 자궁경부암을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 자궁경부암으로부터 인간 대상물을 보호하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에게 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는 HPV E7 항원 및 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하고, 이에 의해, 재조합 리스테리아 균주는 E7 항원에 대하여 면역 반응을 유도함으로써, 자궁경부암으로부터 인간 대상물을 보호하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물의 자궁경부암에 대하여 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에게 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는 HPV E7 항원 및 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함함으로써, 인간 대상물의 자궁경부암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물의 자궁경부암을 치료하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는 이종 항원 및 ActA 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하고, 이에 의해 재조합 리스테리아 균주가 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써, 인간 대상물의 자궁경부암을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 자궁경부암으로부터 인간 대상물을 보호하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는, 이종 항원 및 ActA 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하고, 이에 의해 재조합 리스테리아 균주가 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써, 자궁경부암으로부터 인간 대상물을 보호하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 자궁경부암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는 이종 항원 및 ActA 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함함으로써, 인간 대상물의 자궁경부암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
N-말단 ActA 단백질 단편과 이종 항원은, 다른 구현예에서, 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, 이종 항원 및 N-말단 ActA 단백질 단편을 암호화하는 유전자들은 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편 및 이종 항원은 링커 펩타이드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편과 이종 항원은 이종 펩타이드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편은 이종 항원에 대한 N-말단이다. 다른 구현예에서, N-말단 ActA 단백질 단편은 융합 단백질의 N-최말단부이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 자궁경부암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 리스테리아 균주는 이종 항원 및 PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하고, 이에 의해 재조합 리스테리아 균주가 이종 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써, 인간 대상물의 자궁경부암을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 자궁경부암로부터 인간 대상물을 보호한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 인간 대상물의 자궁경부암을 치료한다.
PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드 및 이종 항원은, 다른 구현예에서, 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드 및 이종 항원을 암호화하는 유전자들은 서로 직접 융합된다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드 및 이종 항원은 링커 펩타이드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드 및 이종 항원은 이종 펩타이드를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드는 이종 항원에 대한 N-말단이다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열-함유 펩타이드는 융합 단백질의 N-최말단부이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 HPV에 대하여 인간 대상물을 예방접종하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 리스테리아는 HPV E7 항원을 발현하고, 리스테리아는 돌연변이 PrfA 유전자를 발현하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 돌연변이 PrfA 유전자는 D133V PrfA 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 돌연변이 PrfA 유전자는 상기 재조합 리스테리아에서 플라스미드에 있다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 일 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 2가 에피솜 발현 벡터를 포함하고, 벡터는 이종 항원 폴리펩타이드 또는 그 기능적 단편을 암호화하는 제1 및 제2 핵산 분자를 포함하고, 제1 및 제2 핵산 분자는 각각 N-말단 또는 절단 또는 해독된 리스테리오리신 O 단백질(LLO), 또는 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열로 개방 해독틀에서 이종 항원 폴리펩타이드 또는 그 기능적 단편을 암호화한다.
일 구현예에서, 2가 발현 벡터에 의해 발현되는 이종 항원은 HPV16 E7 및 HPV18 E7이다.
일 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 3가 에피솜 발현 벡터를 포함하고, 벡터는 각각 이종 항원 폴리펩타이드 또는 그 기능적 단편을 암호화하는 제1, 제2 및 제3 핵산 분자를 포함하고, 제1 내지 제3 핵산 분자 각각은 N-말단 또는 절단 또는 해독된 리스테리오리신 O 단백질(LLO), 절단된 ActA 단백질, 또는 PEST 아미노산 서열로 개방 해독틀에서 이종 항원 폴리펩타이드 또는 그 기능적 단편을 암호화한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 2가, 3가 또는 4가 재조합 리스테리아 균주는 염색체 외 플라스미드 또는 에피솜에서 개방 해독틀로부터 적어도 하나의 이종 항원을 발현한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 2가, 또는 3가 재조합 리스테리아 균주는 적어도 하나의 염색체 외 플라스미드 또는 에피솜에서 개방 해독틀로부터 적어도 하나의 이종 항원을 발현한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 2가 재조합 리스테리아 균주는 두 개의 염색체 외 플라스미드 또는 에피솜의 개방 해독틀로부터 두 개의 이종 항원 각각을 발현한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 3가 재조합 리스테리아 균주는 세 개의 염색체 외 플라스미드 또는 에피솜의 개방 해독틀로부터 세 개의 이종 항원 각각을 발현한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 4가 재조합 리스테리아 균주는 네 개의 염색체 외 플라스미드 또는 에피솜의 개방 해독틀로부터 네 개의 이종 항원 각각을 발현한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 2가, 3가 또는 4가 재조합 리스테리아 균주는 리스테리아의 게놈에서 개방 해독틀로부터 적어도 하나의 이종 항원을 발현한다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 2가, 3가 또는 4가 재조합 리스테리아 균주는 염색체 외 플라스미드 또는 에피솜, 및 본원에 제공된 리스테리아의 게놈, 양측으로부터 적어도 하나의 이종 항원을 발현한다. 다른 구현예에서, 각각의 이종 항원은 본원에 제공된 PEST-함유 폴리펩타이드 또는 펩타이드와의 융합 단백질에서 발현된다.
일 구현예에서, 본 발명에 포함된 2가 및 다가 재조합 리스테리아는 US 공개 제2011/0129499호 및 US 공개 제2012/0135033호에 기재되어 있고, 이들 공개는 모두 본원에 그 전체가 참조로 통합된다.
다른 구현예에서, 대상물은 HPV 매개 발암(예, 자궁경부암)을 일으킬 위험이 있다. 다른 구현예에서, 대상물은 HPV 양성이다. 다른 구현예에서, 대상물은 자궁경부 상피내 신생물을 나타낸다. 다른 구현예에서, 대상물은 편평 상피내 병변을 나타낸다. 다른 구현예에서, 대상물은 자궁경부의 이형성을 나타낸다.
일 구현예에서, 이종 항원은 당해 분야에 공지되고 본원에 제공된 임의의 종양 관련 항원이다. 다른 구현예에서, 이종 항원은 자가 면역 항원이다. 다른 구현예에서, 이종 항원은 감염성 질환 항원이다. 다른 구현예에서, 이종 항원은 HPV-관련 항원이다.
본원에 개시된 표적인 HPV는, 다른 구현예에서, HPV 16이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-18이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-16 및 HPV-18로부터 선택된다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-31이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-35이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-39이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-45이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-51이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-52이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-58이다. 다른 구현예에서, HPV는 고위험 HPV 형이다. 다른 구현예에서, HPV는 점막 HPV 형이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물을 예방접종하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심있는 항원을 포함하거나 발현하는 재조합 리스테리아 균주를 인간 대상물에 정맥내 투여하는 단계를 포함하고, 제1 펩타이드는 (a) LLO 단백질의 N-말단 단편; (b) ActA 단백질 또는 그 N-말단 단편; 및 (c) PEST 아미노산 서열 함유 펩타이드로부터 선택되고, 이에 따라 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물을 예방접종한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물을 예방접종하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역원성 조성물을 인간 대상물에게 정맥내 투여하는 단계를 포함하고, 관심있는 항원에 대한 제1 펩타이드의 융합을 포함하고, 제1 펩타이드는 (a) LLO 단백질의 N-말단 단편; (b) ActA 단백질 또는 그 N-말단 단편; 및 (c) PEST 아미노산 서열 함유 펩타이드로부터 선택되고, 이에 따라 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물을 예방접종한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물을 예방접종하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 인간 대상물에게 정맥내 투여하는 단계를 포함하고, 재조합 폴리펩타이드는 관심있는 항원에 융합된 제1 펩타이드를 포함하고, 제1 펩타이드는 (a) LLO 단백질의 N-말단 단편; (b) ActA 단백질 또는 그 N-말단 단편; 및 (c) PEST 아미노산 서열 함유 펩타이드로부터 선택되고, 이에 따라 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물을 예방접종한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물에서 CTL 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심있는 항원을 포함하거나 발현하는 재조합 리스테리아 균주를 인간 대상물에게 투여하는 단계를 포함함으로써, 관심있는 항원에 대하여 인간 대상물에서 CTL 반응을 유도한다. 다른 구현예에서, 상기 투여하는 단계는 정맥내 투여이다.
본원에 개시된 바와 같이, LLO-항원 융합체를 발현하는 재조합 리스테리아 균주는 항종양 면역(실시예 1)을 유도하고, 항원 특이적 T 세포 증식(실시예 2)을 유도하고, 항원 특이적 종양-침윤 T 세포(실시예 3)를 생성한다. 따라서, 본원에 개시된 백신은 E7 및 E6에 대하여 면역 반응을 유도하는 데 효과적이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상물에서 암의 퇴행을 유도하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상물에서 암의 재발 빈도를 감소시키는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상물에서 종양의 형성을 억제하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상물에서 암의 완화를 유도하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 종양의 성장을 방해하는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상물에서 종양의 크기를 감소시키는 방법으로서, 본원에 제공된 재조합 리스테리아 균주를 대상물에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 질환은 감염성 질환, 자가면역 질환, 호흡기 질환, 전암성 상태 또는 암이다.
용어 "전암성 상태"가 이형성증, 종양전 결절; 거대 재생 결절(MRN); 저급 이형성 결절(LG-DN); 고급 이형성 결절(HG-DN); 담도 상피 이형성증; 변형된 간세포 병소(FAH); 변형된 간세포 결절(NAH); 염색체 불균형; 텔로머라제의 비정상적 활성화; 텔로머라제의 촉매 서브유닛의 재발현; CD31, CD34, 및 BNH9 같은 내피 세포 마커의 발현을 포함할 수 있음은 당업자가 잘 이해할 것이다(예를 들어, Terracciano 및 Tomillo (2003) Pathologica 95:71-82; Su 및 Bannasch (2003) Toxicol. Pathol. 31:126-133; Rocken 및 Carl-McGrath (2001) Dig. Dis. 19:269-278; Kotoula 등 (2002) Liver 22:57-69; Frachon 등 (2001) J. Hepatol. 34:850-857; Shimonishi 등 (2000) J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 7:542-550; Nakanuma 등 (2003) J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 10:265-281 참조). 암 및 이형성증의 진단방법이 개시되어 있다(예컨대, Riegler (1996) Semin. Gastrointest. Dis. 7:74-87; Benvegnu 등 (1992) Liver 12:80-83; Giannini 등 (1987) Hepatogastroenterol. 34:95-97; Anthony (1976) Cancer Res. 36:2579-2583 참조).
일 구현예에서, 감염성 질환은 다음과 같은 병원체들 중 어느 하나에 의해 야기되지만, 이에만 제한되는 것은 아니다: BCG/결핵, 말라리아, 말라리아 원충, 변형체 원충, 변형체 삼일열, 로타바이러스, 콜레라, 디프테리아-파상풍, 백일해, 인플루엔자 균, B 형 간염, 인간 유두종 바이러스, 계절성 인플루엔자), 대유행 인플루엔자 A (H1N1), 홍역과 풍진, 유행성 이하선염, 수막염 A+C, 경구 소아마비 백신, 1가, 2가, 3가, 폐렴 구균, 광견병, 파상풍 톡소이드, 황열병, 탄저균 (탄저병), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소 (보툴리누스 중독), 페스트 균 (전염병), 천연두 (마마) 및 기타 관련 수두 바이러스, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) (야토병), 바이러스성 출혈열, 아레나바이러스 (LCM, 후닌 바이러스, 맞추포 바이러스(Machupo virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 라사 발열(Lassa Fever), 버냐바이러스(Bunyaviruses) (한타바이러스(Hantaviruses), 리프트 밸리 열병), 플라비바이러스(Flaviruses) (뎅기열), 필로바이러스 (에볼라, 마르부르크), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii) (Q 열병), 브루셀라 종 (브루셀라증), 부르크홀데리아 말레이 (마비저(glanders)), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) (앵무새병), 리신 독소 (피마자 유래), 클로스트리디움 퍼프린젠스의 엡실론 독소, 황색포도상구균 장독소 B, 발진티푸스 발열 (리케치아 프로바제키), 기타 리케치아, 식품- 및 수용성 병원체, 세균 (설사유발 대장균, 병원성 비브리오스, 시겔라 종, 살모넬라 BCG/, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)) 바이러스 (칼리시바이러스, A 형 간염, 웨스트 나일 바이러스, 라크로스(LaCrosse), 캘리포니아 뇌염, VEE, EEE, WEE, 일본 뇌염 바이러스, 키아사누 포레스트(Kyasanur Forest) 바이러스, 니파 바이러스, 한타바이러스(hantaviruses), 참진드기 매개 출혈열 바이러스, 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 크림-콩고 출혈열 바이러스, 참진드기 매개 뇌염 바이러스, B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종 바이러스 (HPV)), 원생동물 (작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 원포자충(Cyclospora cayatanensis), 람블편모충(Giardia lamblia), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 톡소포자충(Toxoplasma)), 균류 (미포자충), 황열, 약제 내성 결핵 포함 결핵, 광견병, 프리온, 중증 급성 호흡기 증후군 연관 코로나 바이러스 (SARS-CoV), 콕시디오이데스 포사다시(Coccidioides posadasii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 세균성 질증, 클라미디아 트라코마티스, 거대세포 바이러스, 서혜부 육아종, 헤모필루스 듀크레이(Hemophilus ducreyi), 나이세리아 임질, 매독 균, 질트리코모나스, 또는 여기에 나열되지 않은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 감염성 질환.
다른 구현예에서, 감염성 질환은 가축 감염성 질환이다. 다른 구현예에서, 가축 질환은 사람에게 전염될 수 있으며, "동물원성 질환"이라고 부른다. 다른 구현예에서, 이러한 질환들로는 구제역, 웨스트 나일 바이러스, 광견병, 개 파보 바이러스(canine parvovirus), 고양이 백혈병 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 소의 전염성비기관염 (IBR), 위광견병(pseudorabies), 고전적 돼지열 (CSF), 소의 소 헤르페스 바이러스 1 형 (BHV-1) 감염에 의해 야기된, IBR, 및 돼지 내 위광견병 (아제스즈키 병), 톡소플라즈마증, 탄저병, 수포성 구내염 바이러스, 로도코커스 에쿠이(rhodococcus equi), 야토 병, 전염병 (페스트 균), 트리코모나스를 포함하지만, 이들에만 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 본원에 제공되는 질환은 호흡기 또는 염증성 질환이다. 다른 구현예에서, 호흡기 또는 염증성 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)이다. 다른 구현예에서, 질환은 천식이다.
일 구현예에서, 생 약독화 리스테리아 균주는 항염증제 또는 기관지 확장제와 같은 다른 치료제의 병용 투여 없이 천식 증상을 경감할 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 생 약독화 리스테리아 균주 및 하나 이상의 치료제를 대상물에게 공동-투여하는 단계를 추가 포함한다. 다른 구현예에서, 치료제는 항-천식제이다. 다른 구현예에서, 상기 제제는 소염제, 비-스테로이드성 소염제, 항생제, 항콜린제(antichlolinerginc agent), 기관지 확장제, 코르티코스테로이드, 단기 작용 베타 작용제, 장기 작용 베타 작용제, 복합 흡입기, 항히스타민제, 또는 이들의 조합이다.
일 구현예에서, 본원에 제공되는 질병은 암 또는 종양이다. 일 구현예에서, 종양은 암성 종양이다. 다른 구현예에서, 암은 유방암이다. 다른 구현예에서, 암은 자궁 경부암이다. 다른 구현예에서, 암은 Her2 함유 암이다. 다른 구현예에서, 암은 흑색종이다. 다른 구현예에서, 암은 췌장암이다. 다른 구현예에서, 암은 난소암이다. 다른 구현예에서, 암은 위암이다. 다른 구현예에서, 암은 췌장의 암종 병변이다. 다른 구현예에서, 암은 폐 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 아교 모세포종의 홍반이다. 다른 구현예에서, 암은 대장 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 폐 편평상피 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 위 선암이다. 다른 구현예에서, 암은 난소 표면 상피 종양(예를 들어, 그것의 양성, 증식성 또는 악성 변종)이다. 다른 구현예에서, 암은 구강 편평 세포 암종이다. 다른 구현예에서, 암은 비소세포 폐암종이다. 다른 구현예에서, 암은 자궁내막 암종이다. 다른 구현예에서, 암은 방광 암이다. 다른 구현예에서, 암은 두경부 암이다. 다른 구현예에서, 암은 전립선 암종이다. 다른 구현예에서, 암은 구인두암이다. 다른 구현예에서, 암은 폐암이다. 다른 구현예에서, 암은 항문암이다. 다른 구현예에서, 암은 대장암이고, 다른 구현예에서, 암은 질암이다. 다른 구현예에서, 암은 식도암이다. 본원에 개시된 방법에 의해 표적화되는 자궁경부 종양은, 다른 구현예에서, 편평 세포 암종이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 선암이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 선편평 암종이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 소세포 암종이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 자궁경부 종양이다.
일 구현예에서, 본원에 제공되는 질병은 신생물이다. 다른 구현예에서, 신생물은 항문 상피내 신생물(AIN)이다. 다른 구현예에서, 신생물은 질 상피내 신생물(VIN)이다.
본원에 개시된 방법에 의해 표적화되는 자궁경부 종양은, 다른 구현예에서, 편평 세포 암종이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 선암이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 선편평 암종이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 소세포 암종이다. 다른 구현예에서, 자궁경부 종양은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 자궁경부 종양이다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 항원은 이종 종양 항원으로서, 본원에서 "종양 항원", "항원성 폴리펩타이드" 또는 "외부 항원"으로도 지칭된다. 다른 구현예에서, 항원은 인간 파필로마 바이러스-E7(HPV-E7) 항원이고, 일 구현예에서는, HPV16 유래이고(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAD33253) 다른 구현예에서는, HPV18 유래이다(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 P06788). 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 HPV-E6이며, 이는 일 구현예에서, HPV16 유래(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAD33252, AAM51854, AAM51853 또는 AAB67615)이고, 다른 구현예에서, HPV18 유래 (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 P06463)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 Her/2-neu 항원이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 전립선 특이 항원 (PSA) (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 CAD30844, CAD54617, AAA58802, 또는 NP―001639)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 각질층 키모트립신 효소 (SCCE) 항원 (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAK69652, AAK69624, AAG33360, AAF01139, 또는 AAC37551)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 빌름스(Wilms) 종양 항원 1이고, 이는 다른 구현예에서 WT-1 텔로머라아제 (유전자은행 등록 번호 P49952, P22561, NP―659032, CAC39220.2, 또는 EAW68222.1)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 hTERT 또는 텔로머라제 (유전자은행 등록 번호 No. NM003219 (변이체 1), NM198255 (변이체 2), NM 198253 (변이체 3), 또는 NM 198254 (변이체 4)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 단백질분해효소 3(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 M29142, M75154, M96839, X55668, NM 00277, M96628 또는 X56606)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP2) (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 NP―001913, ABI73976, AAP33051, 또는 Q95119)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 고 분자량 흑색종 관련 항원 (HMW-MAA) (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 NP―001888, AAI28111, 또는 AAQ62842)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 테스티신(Testisin)(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAF79020, AAF79019, AAG02255, AAK29360, AAD41588, 또는 NP―659206)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 NY-ESO-1 항원(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 CAA05908, P78358, AAB49693, 또는 NP―640343)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 PSCA (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAH65183, NP―005663, NP―082492, O43653, 또는 CAB97347)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 인터루킨 (IL) (13) 수용체 알파 (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 NP―000631, NP―001551, NP―032382, NP―598751, NP―001003075, 또는 NP―999506)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 탄산 탈수효소 IX (CAIX) (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 CAI13455, CAI10985, EAW58359, NP―001207, NP―647466, 또는 NP―001101426)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 암 배아 항원 (CEA) (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAA66186, CAA79884, CAA66955, AAA51966, AAD15250, 또는 AAA51970.)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 MAGE-A (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 NP―786885, NP―786884, NP―005352, NP―004979, NP―005358, 또는 NP―005353)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 서바이빈(survivin)(일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAC51660, AAY15202, ABF60110, NP―001003019, 또는 NP―001082350)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 GP100 (일 구현예에서, 유전자은행 등록 번호 AAC60634, YP―655861, 또는 AAB31176)이다. 다른 구현예에서, 항원성 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 항원성 폴리펩타이드이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법의 항원성 펩타이드는 항원성 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 포함한다.
다른 구현예에서, 항원은 HPV-E6이다. 다른 구현예에서, 항원은 텔로머라아제(TERT)이다. 다른 구현예에서, 항원은 LMP-1이다. 다른 구현예에서, 항원은 p53이다. 다른 구현예에서, 항원은 메소텔린이다. 다른 구현예에서, 항원은 EGFRVIII이다. 다른 구현예에서, 항원은 탄산 탈수효소 IX (CAIX)이다. 다른 구현예에서, 항원은 PSMA이다. 다른 구현예에서, 항원은 HMW-MAA이다. 다른 구현예에서, 항원은 HIV-1 Gag이다. 다른 구현예에서, 항원은 티로시나제 관련 단백질 2이다. 다른 구현예에서, 항원은 HPV-E7, HPV-E6, Her-2, HIV-1 Gag, LMP-1, p53, PSMA, 암 배아 항원 (CEA), LMP-1, 칼리크레인 관련 펩티다제 3 (KLK3), KLK9, Muc, 티로시나제 관련 단백질 2, Muc1, FAP, IL-13R 알파 2, PSA (전립선 특이 항원), gp-100, 열 충격 단백질 70 (HSP-70), 베타-HCG, EGFR-III, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 안지오제닌, 안지오포이에틴-1 Del-1, 섬유 모세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 또는 염기성 (bFGF), 폴리스타틴, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/분산 인자 (SF), 인터루킨-8 (IL-8), 렙틴, 미드카인, 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자-BB (PDGF-BB), 플레이오트로핀 (PTN), 프로그라눌린(Progranulin), 프로리페린(Proliferin), 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)/혈관 투과성 인자 (VPF), VEGFR, VEGFR2 (KDR/FLK-1) 또는 그 단편, FLK-1 또는 그의 에피토프, FLK-E1, FLK-E2, FLK-I1, 엔도글린 또는 그 단편, 뉴로필린 1 (NRP-1), 안지오포이에틴 1 (Ang1), Tie2, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 엔도글린, TGF-β 수용체, 단핵구 주화성 단백질-1 (MCP-1), VE-카데린, CD31, 에프린(ephrin), ICAM-1, V-CAM-1, VAP-1, E-셀렉틴, 플라스미노겐 활성화제, 플라스미노겐 활성제 억제제-1, 산화 질소 합성효소 (NOS), COX-2, AC133, 또는 Id1/ID3, 안지오포이에틴 3, 안지오포이에틴 4, 안지오포이에틴 6, CD105, EDG, HHT1, ORW, ORW1 또는 TGFbeta 공동 수용체, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 항원은 그 전문이 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허출원 공개 제2011/0142791호에 개시된 바와 같이 키메라 Her2/neu 항원이다. 본원에서 제공된 항원의 단편의 용도 또한 본 발명에 포함된다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 이종 종양 항원은 종양 관련 항원으로서, 일 구현예에서, 다음과 같은 종양 항원들 중 하나이다: MAGE (흑색종-연관 항원 E) 단백질, 예를 들어, MAGE (흑색종-연관 항원 E) 단백질, 예를 들어, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, 티로시나제; 돌연변이 ras 단백질; 돌연변이 p53 단백질; p97 흑색종 항원, 진행 암과 연관된 ras 펩타이드 또는 p53의 펩타이드; 자궁경부암과 연관된 HPV 16/18 항원, 유방암과 연관된 KLH 항원, 대장암과 연관된 CEA (암 배아 항원), 흑색종과 연관된 MART1 항원, 또는 전립선암과 연관된 PSA 항원. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 대한 항원은 흑색종-연관 항원으로, 일 구현예에서, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, HSP-70, 베타-HCG, 또는 이들의 조합이다. 당업자라면 본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 본원에 언급되지 않았지만 당해 분야에 공지된 임의의 이종 항원을 사용할 수 있을 것이라는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 개시된 항원 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산을 포함하는 약독화 리스테리아를 제공하지만 이에 한정되는 것은 아니라는 것도 이해되어야 한다. 본 발명은, 개시된 항원들의, 돌연변이, 뮤테인, 스플라이스 변이체, 단편, 절단된 변이체, 용해성 변이체, 세포외 도메인, 세포내 도메인, 성숙 서열 등을 암호화하는 핵산을 포함한다. 이러한 항원들의 에피토프, 올리고 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 또한, 코돈 최적화된, 즉, 리스테리아의 발현에 최적화된 구현예들을 제공한다. 참조 문헌, 유전자은행 등록 번호, 및 본원에 개시된 핵산, 펩타이드, 및 폴리펩타이드의 내용 모두는, 본원에 참조로 통합된다. 다른 구현예에서, 선택된 핵산 서열은, 전체 길이 또는 절단된 유전자, 융합 또는 태그된 유전자를 암호화할 수 있고, cDNA, 게놈 DNA, 또는 DNA 단편, 바람직하게는, cDNA일 수 있다. 이는 돌연변이되거나 원하는대로 변형될 수 있다. 이러한 변형은, 선택된 숙주 세포 또는 세균, 즉, 리스테리아의 코돈 사용을 최적화하는 코돈 최적화를 포함한다. 선택된 서열은 또한, 분비, 세포질, 핵산, 막 결합 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
일 구현예에서, 혈관 내피 성장 인자(VEFG)는, 혈관형성(초기 순환계의 형성) 및 혈관신생(기존의 혈관구조로부터 혈관의 성장)에 관여하는 중요한 신호전달 단백질이다. 일 구현예에서, VEGF 활동성은, 제한된 수의 다른 세포 유형에 영향을 미치지만(예를 들어, 자극 모노사이트/매크로파지 이동), 주로 혈관 내피 세포로 제한된다. 생체 외에서, VEGF는 내피 세포 분화 및 세포 이동을 자극하는 것으로 나타났다. VEGF는 또한, 미세혈관 투과성을 향상시키고, 때로는, 혈관 투과성 인자로 지칭된다.
일 구현예에서, VEGF 과의 모든 멤버들은, 세포 표면 상의 티로신 키나제 수용체(VEGFR)에 결합함으로써 세포 반응을 자극하여, 이들이 이합체로 되게 하여 인산 전이 반응을 통해 활성화되게 한다. VEGF 수용체는, 7개의 면역글로불린형 도메인, 단일 트랜스멤브레인 이음 영역, 및 분할된 티로신-키나제 도메인을 함유하는 세포내 부분으로 이루어지는 세포외 부분을 갖는다.
일 구현예에서, VEGF-A는 VEGFR-2(KDR/Flk-1) 리간드 및 VEGFR-1(Flt-1) 리간드이다. 일 구현예에서, VEGFR는 알려져 있는 세포 반응의 거의 모두를 VEGF로 매개한다. VEGFR-1의 기능은 덜 확립되어 있지만, 일 구현예에서, VEGFR-2 결합으로부터 VEGF를 격리함으로써 VEGFR-2 신호전달을 변조하는 것으로 여겨지며, 이는 일 구현예에서, 배아의 혈관 형성 동안 특히 중요하다. 일 구현예에서, VEGF-C 및 VEGF-D는 VEGFR-3 수용체의 리간드이며, 이는, 일 구현예에서, 림프관 형성을 매개한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은, VEGF 수용체 또는 그 단편을 포함하며, 이는, 일 구현예에서, VEGFR-2이고, 다른 구현예에서, VEGFR-1, 다른 구현예에서, VEGFR-3이다.
일 구현예에서, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEFGR2)는, 활성화된 내피 세포(EC)에 크게 발현되고, 새로운 혈관 형성에 참여한다. 일 구현예에서, VEGFR2는 VEGF의 모든 5개의 이소폼을 결합한다. 일 구현예에서, EC 상의 VEGFR2를 통한 VEGF의 신호전달은, 증식, 이동, 및 최종 분화를 유도한다. 일 구현예에서, VEGFR2의 마우스 상동체는 태아 간 키나제 유전자-1(Flk-1)이며, 이는, 강력한 치료 표적이며, 종양의 성장, 침투, 및 전이에 중요한 역할을 한다. 일 구현예에서, VEGFR2는 키나제 삽입 도메인 수용체(유형 III 수용체 티로신 키나제(KDR)), 분화 309의 클러스터(CD309), FLK1, Ly73, Krd-1, VEGFR, VEGFR-2, 또는 6130401C07로 지칭되기도 한다.
다른 구현예에서, 상기 항원은 진균 병원체, 세균, 기생충, 연충(helminth) 또는 바이러스로부터 유래한다. 다른 구현예에서, 항원은 파상풍 톡소이드, 인플루엔자 바이러스 유래 헤마그글루티닌 분자, 디프테리아 톡소이드, HIV gp120, HIV gag 단백질, IgA 프로테아제, 인슐린 펩타이드 B, 스폰고스포라 수브테라네아 항원, 비브리오스(vibriose) 항원, 살모넬라 항원, 폐렴 구균 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 헤모필루스 인플루엔자 외막 단백질, 헬리코박터 파이로리 우레아제, 나이세리아 뇌수막염 필린, N. 임질 필린, 흑색종 관련 항원 (TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, MART-1, HSP-70, 베타-HCG), HPV-16, -18, -31, -33, -35 또는 -45 인간 유두종 바이러스 유래 인간 유두종 바이러스 항원 E1 및 E2, 종양 항원 CEA, ras 단백질, 돌연변이 또는, p53 단백질, 돌연변이 또는, Muc1, 또는 pSA로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 상기 항원은 다음 질환들 중 하나와 연관된다: 콜레라, 디프테리아, 헤모필루스, A 형 간염, B 형 간염, 인플루엔자, 홍역, 수막염, 유행성 이하선염, 백일해(pertussis), 천연두, 폐렴 구균성 폐렴, 소아마비, 광견병, 풍진, 파상풍, 결핵, 장티푸스, 수두-대상물 포진, 백일기침3(whooping cough3) 황열병, 애디슨 병 유래 면역원 및 항원, 알레르기, 아나필락시스, 브루톤 증후군, 고체 및 혈액 매개 종양을 비롯한 암, 습진, 하시모토 갑상선염, 다발성 근염, 피부 근염, 1 형 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군, 신장, 심장, 췌장, 폐, 뼈, 간 이식 등의 이식 거부, 그레이브스 병(Graves' disease), 다선(polyendocrine) 자가면역 질환, 간염, 현미경적 다발성 동맥염, 결절성 다발 동맥염, 천포창, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 소아 지방 변증, 항체-매개 신염, 사구체 신염, 류마티스 질환, 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 혈청음성 척추 관절병증, 비염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 전신성 경화증, 경화성 담관염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 포진, 건선, 백반증, 다발성 경화증, 뇌척수염 피부염, 길렝-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 중증 근무력증, 램버트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 공막(sclera), 상공막(episclera), 포도막염, 만성 피부 점막 칸디다증, 두드러기, 유아기의 일시적인 저감마글로불린혈증, 골수종, X-연결 하이퍼 IgM 증후군, 비스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 운동 실조의 모세혈관 확장, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 아밀로이드증, 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 말라리아 환상포자소체(malarial circumsporozite) 단백질, 미생물 항원, 바이러스 항원, 자가항원 및 리스테리아증(lesteriosis).
다른 구현예에서, 자궁경부암에 대한 치료, 보호, 또는 면역 반응을 유도하기 위한 본원에 개시된 방법에서 E7 항원 대신 또는 이에 추가하여 HPV E6 항원이 사용된다.
다른 구현예에서, 자궁경부암에 대한 치료, 보호, 또는 면역 반응을 유도하기 위한 본원에 개시된 방법에서 LLO 단편 대신 또는 이에 추가하여 ActA 단백질 단편이 사용된다.
다른 구현예에서, 자궁경부암에 대한 치료, 보호, 또는 면역 반응을 유도하기 위한 본원에 개시된 방법에서 LLO 단편 대신 또는 이에 추가하여 PEST 아미노산 서열 함유 단백질 단편이 이용된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 리스테리아의 재조합 형태를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에 개시된다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 면역원성 조성물은 본 발명의 재조합 백신 벡터를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 본 발명의 플라스미드를 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 보강제를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 백신 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 백신은 보강제와 함께 전달된다. 일 구현예에서, 보강제는 주로 Th1-매개 면역 반응을 촉진한다. 다른 구현예에서, 보강제는 Th1-타입 면역 반응을 촉진한다. 다른 구현예에서, 보강제는 Th1-매개 면역 반응을 촉진한다. 다른 구현예에서, 보강제는 항체-매개 반응보다 세포-매개 면역 반응을 촉진한다. 다른 구현예에서, 보강제는 당업계에 공지된 다른 종류의 보강제다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 종양 세포에 존재하는 표적 단백질에 대한 T 세포 면역 반응의 형성을 유도한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상물에서 항-E7 세포독성 T 세포(CTL) 반응을 유도하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 재조합 리스테리아 균주는 LLO 단백질의 N-말단 단편 및 HPV E7 항원을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함함으로써, 인간 대상물에서 항-E7 CTL 반응을 유도한다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 재조합 리스테리아 균주로 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 E7 항원을 포함하는 면역원성 조성물로 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 대상물의 세포가 E7 항원을 발현하게 하는 면역원성 조성물로 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, CTL 반응은 HPV 매개 질환, 장애 또는 증상에 대한 치료적 효능이 가능하다. 다른 구현예에서, CTL 반응은 HPV 매개 질환, 장애 또는 증상에 대한 예방적 효능이 가능하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상물에서 HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료하거나 완화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 재조합 리스테리아 균주는 LLO 단백질의 N-말단 단편 및 HPV E7 항원을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하고, 이에 의해 상기 재조합 리스테리아 균주는 E7 항원에 대한 면역 반응을 유도함으로써, 대상물에서 HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료하거나 완화한다. 다른 구현예에서, 대상물은 인간 대상물이다. 다른 구현예에서, 대상물은 비-인간 포유 동물이다. 다른 구현예에서, 대상물은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 대상물이다.
질병, 장애 또는 증상을 유발하는 HPV는, 다른 구현예에서, HPV 16이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-18이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-31이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-35이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-39이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-45이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-51이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-52이다. 다른 구현예에서, HPV는 HPV-58이다. 다른 구현예에서, HPV는 고위험 HPV 형이다. 다른 구현예에서, HPV는 점막 HPV 형이다.
다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상은 생식기 사마귀(genital warts)이다. 다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상은 비-생식기 사마귀이다. 다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상은 호흡기 유두종이다. 다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 HPV 매개 질환, 장애 또는 증상이다.
다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 개선시키기 위한 본원에 개시된 방법에서 E7 항원 대신 또는 이에 추가하여 HPV E6 항원이 사용된다.
다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 개선시키기 위한 본원에 개시된 방법에서 LLO 단편 대신 또는 이에 추가하여 ActA 단백질 단편이 사용된다.
다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 개선시키기 위한 본원에 개시된 방법에서 LLO 단편 대신 또는 이에 추가하여 PEST 아미노산 서열 함유 단백질 단편이 사용된다.
다른 구현예에서, HPV 매개 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 개선시키기 위한 본원에 개시된 방법에서 E7 항원 대신 또는 이에 추가하여 HPV E6 항원이 사용된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 항원은, 다른 구현예에서, HPV E7 단백질이다. 다른 구현예에서, 항원은 HPV E6 단백질이다. 다른 구현예에서, 항원은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 HPV 단백질이다.
"E7 항원"은, 다른 구현예에서, E7 단백질을 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 E7 단편을 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 E7 펩타이드를 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 E7 항원을 의미한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 E7 단백질은, 다른 구현예에서, HPV 16 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-18 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-31 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-35 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-39 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-45 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-51 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-52 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 HPV-58 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 고위험 HPV 형의 E7 단백질이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 점막 HPV 형의 E7 단백질이다.
"E6 항원"은, 다른 구현예에서, E6 단백질을 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 E6 단편을 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 E6 펩타이드를 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 E6 항원을 의미한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 E6 단백질은, 다른 구현예에서, HPV 16 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-18 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-31 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-35 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-39 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-45 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-51 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-52 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 HPV-58 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 고위험 HPV 형의 E6 단백질이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 점막 HPV 형의 E6 단백질이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은, 다른 구현예에서, T 세포 반응이다. 다른 구현예에서, 면역 반응은 T 세포 반응을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 다른 구현예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은, 일 구현예에서 항-혈관형성 특성을 갖는, 인터페론-감마의 강한 선천적 자극을 유도한다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아는, 일 구현예에서 항-혈관형성 특성을 갖는, 인터페론-감마의 강한 선천적 자극을 유도한다(Dominiecki 등, Cancer Immunol Immunother. 2005 May; 54(5):477-88. Epub 2004 Oct 6, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨; Beatty and Paterson, J Immunol. 2001 Feb 15; 166(4): 2276-82, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시킨다. 일 구현예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD4+T 세포에 의해 매개된다 (Beatty 및 Paterson, 2001). 다른 구현예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD8+ T 세포에 의해 매개된다. 다른 구현예에서, 리스테리아 예방접종의 결과로서 IFN-감마 분비는 NK 세포, NKT 세포, Th1 CD4+ T 세포, TC1 CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합에 의해 매개된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 하나 이상의 항-혈관형성 단백질 또는 인자들의 생산을 유도한다. 일 구현예에서, 항-혈관형성 단백질은 IFN-감마이다. 다른 구현예에서, 항-혈관형성 단백질은 색소 상피세포 유래 인자(PEDF); 안지오스타틴; 엔도스타틴; fms-유사 티로신 키나제(sFlt)-1; 또는 수용성 엔도글린(endoglin) (sEng)이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 항-혈관형성 인자의 방출에 관여하므로, 일 구현예에서, 대상물에 항원을 도입하기 위한 벡터 역할뿐만 아니라 치료제 역할을 갖는다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물의 투여는 왕성한 전신 항원 특이적 면역력을 유도한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물의 투여는 에피토프 확산을 유도한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물의 투여는 자가 유도된 종양 또는 신생물 항원에 대한 광범위한 반응을 유도한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은 종양 또는 신생물 미세환경(TME)에서 억제인자 및 효과기 면역 세포의 전반적인 균형의 개선을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은 억제인자 및 효과기 면역 세포의 전신 균형의 개선을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 그의 사용 방법은 종양 또는 신생물에 침투하고, 종양 세포를 파괴하고, 질병을 근절할 수 있는 효과기 T 세포를 생성한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 사용 방법은 T 효과기 세포에 의한 종양 침윤을 증가시킨다. 다른 구현예에서, T 효과기 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, T 효과기 세포는 CD4+ T 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 종양 침투 림프구(TIL)는 대장암, 난소암 및 흑색종과 같은 몇몇 종양에서의 더 나은 예후와 관련된다. 대장암의 경우, 미세전이의 징후가 없는 종양은 면역 세포 침윤의 증가와 Th1 발현 프로파일을 보이는데, 이는 환자의 생존율 개선과 연관성이 있다. 또한, T 세포에 의한 종양 침윤은 임상 전 시험 및 인간을 대상으로 한 시험 모두에서의, 면역치료 접근법의 성공과 관련된다. 일 구현예에서, 종양 부위로의 림프구 침윤는 일반적으로 IFN-γ, TNF-α 및 IL-1과 같은 전 염증성 사이토카인에 의한, 종양 맥관 구조의 내피 세포 중의 부착 분자의 상향조절에 의존적이다. 세포간 부착 분자 1(ICAM-1), 혈관내피 세포 부착 분자 1(V-CAM-1), 혈관 접착 단백질 1(VAP-1) 및 E-셀렉틴을 포함하는 몇몇 부착 분자는 종양 내 림프구 침윤 과정과 관련되어왔다. 그러나, 이들 세포 부착 분자는 종양 맥관 구조 내에서 일반적으로 하향조절된다. 따라서, 일 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 암 백신은 TIL을 증가시키고, 부착 분자(일 구현예에서, ICAM-1, V-CAM-1, VAP-1, E-셀렉틴, 또는 이들의 조합)를 상향조절하며, 전 염증성 사이토카인(일 구현예에서, IFN-γ, TNF-α, IL-1, 또는 이들의 조합)을 상향조절하거나, 또는 이들의 조합을 야기한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 N-말단 LLO 단백질 단편은, 다른 구현예에서, 서열번호 2를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 단편은 LLO 신호 펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 단편은 서열번호 2를 포함한다. 　 다른 구현예에서, 상기 단편은 대략 서열번호 2로 이루어진다. 　 다른 구현예에서, 상기 단편은 본질적으로 서열번호 2로 이루어진다. 다른 구현예에서, 상기 단편은 서열번호 2에 해당한다. 다른 구현예에서, 상기 단편은 서열번호 2와 상동적이다. 다른 구현예에서, 상기 단편은 서열번호 2의 단편과 상동적이다. 시스테인 484을 함유하는 활성 도메인에 포함되는 아미노기 말단으로부터 88 잔기가 절단됨에 따라 실시예들 중 일부에 사용되는 ΔLLO는 416 AA 길이였다(신호 서열 제외). 활성 도메인이 없는, 특히, 시스테인 484이 없는, 어떤 ΔLLO라도 본 발명의 방법 및 조성물에 적합하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 AA 서열, 서열번호 1을 포함한, 임의의 ΔLLO에 대한 E7 또는 E6 항원의 융합은, 항원의 세포 매개 및 항종양 면역을 향상시킨다.
본원에 개시된 백신을 구축하기 위해 사용되는 LLO 단백질은, 다른 구현예에서, 다음 서열을 가진다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE (유전자은행 등록 번호 P13128; 서열번호: 3; 핵산 서열은 유전자은행 등록 번호 X15127에 기재). 이 서열에 해당하는 프로단백질의 처음 25 AA는 신호 서열이고 박테리아에 의해 분비되는 경우 LLO로부터 절단(cleave)된다. 따라서, 본 구현예에서, 전장 활성 LLO 단백질은 504 잔기 길이이다. 다른 구현예에서, 상기 LLO 단편은 본 발명의 백신에 포함되는 LLO 단편의 소스로서 사용된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 LLO 단백질의 N-말단 단편은 다음 서열을 가진다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD (서열번호 2).
다른 구현예에서, LLO 단편은 본원에서 사용된 LLO 단백질의 약 AA 20-442에 해당한다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 다음 서열을 가진다:
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (서열번호 4).
다른 구현예에서, "절단된 LLO" 또는 "ΔLLO"는 PEST 아미노산 도메인을 포함하는 LLO의 단편을 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 PEST 서열을 포함하는 LLO 단편을 의미한다.
다른 구현예에서, 이 용어는 아미노 말단에서 활성 도메인을 함유하지 않고 시스테인 484를 포함하지 않는 LLO 단편을 의미한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 용혈성이 아닌 LLO 단편을 의미한다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 상기 활성화 도메인의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 시스테인 484의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 다른 위치에서 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 약 처음 441 AA로 구성된다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 LLO의 약 처음 420 AA로 구성된다. 다른 구현예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 비용혈 형태이다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 해당하는 상동성 LLO 단백질의 잔기들을 포함하고 있다. 잔기 수는 필요하지 않으며, 다른 구현예에서, 위에 열거된 잔기 수와 정확히 일치한다; 예를 들면 상동성 LLO 단백질이 본원에서 이용되는 LLO 단백질에 대해 상대적인, 삽입 또는 결실을 가지는 경우, 그 잔기 수는 적절히 조절될 수 있다.
다른 구현예에서, LLO 단편은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 LLO 단편이다.
다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 1 x 109 ~ 3.31 x 1010 CFU 투여량으로 인간 대상물에게 투여된다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 7~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 10~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 20~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 30~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 50~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 70~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 100~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 150~500 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~300 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~200 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~150 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~100 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~70 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~50 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~30 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5~20 x 108 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 1~30 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 1~20 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2~30 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 1~10 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2~10 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 3~10 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2~7 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2~5 x 109 CFU이다. 다른 구현예에서, 투여량은 3~5 x 109 CFU이다.
다른 구현예에서, 투여량은 1 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 1.5 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 3 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 4 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 6 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 7 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 8 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 10 x 109 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 1.5 x 1010 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2 x 1010 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 2.5 x 1010 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 3 x 1010 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 3.3 x 1010 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 4 x 1010 유기물이다. 다른 구현예에서, 투여량은 5 x 1010 유기물이다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법의 재조합 폴리펩타이드는 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현된다. 다른 구현예에서, 상기 발현은 재조합 리스테리아 균주에 의해 운반되는 뉴클레오티드 분자에 의해 매개된다.
다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 구현예에서, 플라스미드는 세균 전사 인자를 암호화하는 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 플라스미드는 리스테리아 전사 인자를 암호화한다. 다른 구현예에서, 전사 인자는 PrfA이다. 다른 구현예에서, PrfA는 돌연변이 PrfA이다. 다른 구현예에서, PrfA 돌연변이 단백질은 D133V 아미노산 돌연변이를 포함한다.
다른 구현예에서, 플라스미드는 대사 효소를 암호화하는 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 세균 대사 효소이다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 리스테리아 대사 효소이다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 아미노산 대사 효소이다. 다른 구현예에서, 아미노산 대사 유전자는 세포벽 합성 경로에 관여한다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 D-아미노산 아미노기 전이효소 유전자 (dat)의 생성물이다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 알라닌 라세마아제 유전자 (dal)의 생성물이다. 다른 구현예에서, 대사 효소는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 대사 효소이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 재조합 리스테리아 균주로 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 추가투여 접종에 사용되는 재조합 리스테리아 균주는 초기 "시동투여" 접종에 사용된 균주와 동일하다. 다른 구현예에서, 추가투여 균주는 시동투여 균주와 다르다. 다른 구현예에서, 동일한 투여량이 시동투여와 추가투여 접종에 사용된다. 다른 구현예에서, 더 큰 투여량이 추가투여에 사용된다. 다른 구현예에서, 더 작은 투여량이 추가투여에 사용된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 E7 항원을 포함하는 면역원성 조성물로 인간 대상물을 접종하는 단계를 더 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 재조합 E7 단백질 또는 그 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 재조합 E7 단백질 또는 그 단편을 발현하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 비-리스테리아 접종은 리스테리아 접종 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 비-리스테리아 접종은 리스테리아 접종 전에 투여된다.
"추가투여(Boosting)"란, 다른 구현예에서, 대상물에 추가 백신 투여량을 투여하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은, 2회 추가투여 (또는 총 3회 접종)가 투여된다. 다른 구현예에서, 3회 추가투여가 투여된다. 다른 구현예에서, 4회 추가투여가 투여된다. 다른 구현예에서, 5회 추가투여가 투여된다. 다른 구현예에서, 6회 추가투여가 투여된다. 다른 구현예에서, 6회가 넘는 추가투여가 투여된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는, 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 실링게리 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 그라이 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 이바노비 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 무라이 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 웰쉬메리 균주이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 리스테리아 종의 재조합 균주이다.
본 발명은, 본 발명의 약독화된 리스테리아를 제조하거나 유전자 조작하기 위한 다수의 리스테리아 종 및 균주를 제공한다. 일 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 10403S 야생형이다(Bishop and Hinrichs (1987) J. Immunol. 139: 2005-2009; Lauer 등 (2002) J. Bact. 184: 4177-4186 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4056(파지 처리형)(Lauer 등 (2002) J. Bact. 184: 4177-4186 참조)이다. 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는, 파지 처리되고 hly 유전자에 결실된 L. 모노사이토게네스 DP-L4027이다(Lauer 등 (2002) J. Bact. 184: 4177-4186; Jones and Portnoy (1994) Infect. Immunity 65: 5608-5613 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는, 파지 처리되고 ActA에 결실된 L. 모노사이토게네스 DP-L4029이다(Lauer 등 (2002) J. Bact. 184: 4177-4186; Skoble 등 (2000) J. Cell Biol. 150: 527-538 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4042(델타 PEST)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4097(LLO-S44A)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4364(델타 lplA; 리포산 단백질 리가아제)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4405(델타 inlA)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4406(델타 inlB)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 CS-L0001(델타 ActA-델타 inlB)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 CS-L0002(델타 ActA-델타 lplA)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 CS-L0003(L461T-델타 lplA)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4038(델타 ActA-LLO L461T)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4384(S44A-LLO L461T)이다(Brockstedt 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13832-13837; supporting information 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스이다. 리포산 단백질 돌연변이(O'Riordan 등 (2003) Science 302: 462-464 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DP-L4017이다(10403S hly (L461T), 헤모리신 유전자의 점 돌연변이를 가짐) (2003년 7월 24일 출원된 미국 가특허 출원 제60/490,089호 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 EGD이다(유전자은행 등록 번호 AL591824 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 EGD-e이다(유전자은행 등록 번호 NC_003210. ATCC 등록 번호 BAA-679 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 uvrAB에 결실된 L. 모노사이토게네스 DP-L4029이다(2004년 2월 2일 출원된 미국 가특허출원 제60/541,515호; 2003년 7월 24일 출원된 미국 가특허출원 제60/490,080호 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 ActA-/inlB - 이중 돌연변이이다(ATCC 등록 번호 PTA-5562 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 lplA 돌연변이 또는 hly 돌연변이이다(Portnoy 등의 미국 특허 출원 제20040013690호 참조). 다른 구현예에서, 리스테리아 균주는 L. 모노사이토게네스 DAL/DAT 이중 돌연변이이다 (Frankel 및 Portnoy의 미국 특허 출원 제20050048081호 참조). 본 발명은 상기 리스테리아 균주 뿐만 아니라, 예를 들어 플라스미드 및/또는 게놈 통합에 의해, 변형된 이 균주들을 포함해서, 다음과 같은 유전자들 중 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 핵산을 포함하는, 시약 및 방법을 포괄한다: hly (LLO; 리스테리오리신); iap (p60); inlA; inlB; inlC; dal (알라닌 라세마아제); dat (D-아미노산 아미노기 전이효소); plcA; plcB; actA; 또는 단일 벽 소포의 성장, 확산, 분해, 이중 벽 소포의 분해, 숙주 세포에 대한 결합, 숙주 세포에 의한 흡수를 매개하는 임의의 핵산. 본 발명은 상기 개시된 특정 균주에 의해 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 동물 숙주를 통해 계대배양되었다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 백신 벡터로서 균주의 효능을 극대화한다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 안정화시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 안정화시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정한 서브-균주를 제거한다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정한 서브-균주의 유병률을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 상기 리스테리아 균주는 항원 함유 재조합 펩타이드를 암호화하는 유전자의 게놈 삽입을 포함하고 있다. 다른 구현예에서, 상기 리스테리아 균주는 항원 함유 재조합 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 운반한다. 다른 구현예에서, 상기 계대는 본원에서 기재된 바와 같이 수행된다 (예, 실시예 12). 다른 구현예에서, 상기 계대는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수행된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 재조합 리스테리아 균주는 동결 세포 은행에 보관되었다. 다른 구현예에서, 재조합 리스테리아 균주는 동결건조된 세포 은행에 보관되었다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 세포 은행은 마스터 세포 은행(master cell bank)이다. 다른 구현예에서, 세포 은행은 제조용 세포 은행(working cell bank)이다. 다른 구현예에서, 세포 은행은 우수 제조 기준 (Good Manufacturing Practice; GMP) 세포 은행이다. 다른 구현예에서, 세포 은행은 임상 등급 물질의 제조를 위해 의도된다. 다른 구현예에서, 세포 은행은 인간 사용을 위한 규제 실무에 부합한다. 다른 구현예에서, 세포 은행은 당해 분야에서 공지된 세포 은행의 임의의 다른 유형이다.
"우수 제조 기준"은, 다른 구현예에서, 연방 규정의 미국 코드 중 (21 CFR 210-211)에 의해 정의된다. 다른 구현예에서, "우수 제조 기준"은 임상 등급 물질의 생산 또는 식용을 위한 기타 표준에 의해 정의된다; 예를 들면 미국 이외의 국가의 표준들.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 이용되는 재조합 리스테리아 균주는 백신 투여량 배치로부터 유래한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 이용되는 재조합 리스테리아 균주는 본원에 참조로 통합된, 미국 특허 번호 제8,114,414호에 제공된 방법에 의해 제조된 동결 또는 동결건조된 스톡으로부터 유래한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩타이드는 융합 펩타이드이다. 다른 구현예에서, "융합 펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 다른 화학 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 단백질을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 다른 구현예에서, 단백질은 펩타이드 또는 다른 화학 결합에 의해 직접 함께 연결되어 있다. 다른 구현예에서, 단백질은 2개 이상의 단백질 사이의 하나 이상의 AA (예, "스페이서")와 함께 연결되어 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 백신은 보강제(adjuvant)를 더 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용되는 보강제는, 다른 구현예에서, 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질이다. 다른 구현예에서, 보강제는 GM-CSF 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 분자이다. 다른 구현예에서, 보강제는 GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 사포닌 QS21이다. 다른 구현예에서, 보강제는 사포닌 QS21을 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 모노포스포릴 리피드 A이다. 다른 구현예에서, 보강제는 모노포스포릴 리피드 A를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 SBAS2이다. 다른 구현예에서, 보강제는 SBAS2을 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 보강제는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인이다. 다른 구현예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인을 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 뉴클레오티드 분자이다. 다른 구현예에서, 보강제는 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 퀼 글리코시드이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 세균 미토겐이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 세균 독소이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 보강제는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 보강제이거나 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 뉴클레오티드는, 리스테리아 균주에서 암호화된 펩타이드의 발현을 구동하는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 유전자의 기본구성 발현을 구동하는 데 유용한 프로모터/조절 서열은, 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 리스테리아의 PhlyA, PActA, 및 p60 프로모터, Streptococcus bac 프로모터, Streptomyces griseus sgiA 프로모터, 및 B. thuringiensis phaZ 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩타이드를 암호화하는 핵산의 유도가능 및 조직 특이적 발현은, 유도가능 또는 조직 특이적 프로모터/조절 서열의 제어 하에 펩타이드를 암호화하는 핵산을 배치함으로써 달성된다. 이 목적에 유용한 조직 특이성 또는 유도가능 프로모터/조절 서열의 예는, MMTV LTR 유도가능 프로모터 및 SV40 만기 증강제/프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에서는, 금속, 글루코코르티코이드 등의 유도제에 반응하여 유도되는 프로모터를 이용한다. 따라서, 본 발명이, 임의의 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 원하는 단백질의 발현을 구동할 수 있으며 알려져 있는 또는 알려져 있지 않은 임의의 프로모터/조절 서열을 이용하는 것을 포함한다는 점은 이해될 것이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용되는 ActA 단백질의 N-말단 단편은, 다른 구현예에서, 서열번호 5에 기재된 서열을 갖는다:
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP. 다른 구현예에서, ActA 단편은 서열번호 5에 기재된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, ActA 단편은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 ActA 단편이다.
다른 구현예에서, ActA 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 뉴클레오티드는 서열번호 6에 기재된 서열을 포함한다:
Atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagc
gacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcg
aggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaa
tcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtcc
aaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgacc
gaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaaga
aggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaa
taagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcag
cagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaata
aaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataa
aagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgc
caccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcct
gctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgcc
agagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgc
ctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggg
gatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaac
agaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca. 다른 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 서열번호 6에 기재된 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 ActA 단백질의 단편을 암호화하는 임의의 다른 서열을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 다른 구현예에서, PEST 아미노산 AA 서열은 E7 또는 E6 항원에 융합된다. 본원에 개시된 바와 같이, PEST 아미노산 서열-항원 융합체를 발현하는 재조합 리스테리아 균주는 항종양 면역(실시예 3)을 유도하고, 항원 특이적 종양-침윤 T 세포(실시예 4)를 생성한다. 또한, 항원 및 PEST 아미노산 AA 서열 KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (서열번호 1)을 함유한 LLO를 포함하는 융합 단백질에 대한 개선된 세포 매개 면역성이 증명되었다.
따라서, 다른 LM PEST 아미노산 서열과 다른 원핵생물 유래의 PEST 아미노산 서열에 대한 항원의 융합 또한 항원의 면역원성을 향상시킬 것이다. PEST 아미노산 AA 서열은, 다른 구현예에서, 서열번호 7~12로부터 선택된 서열을 가진다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 LM ActA 단백질로부터의 PEST 아미노산 서열이다. 다른 구현예에서, PEST 서열은 KTEEQPSEVNTGPR (서열번호: 7), KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK (서열번호: 8), KNEEVNASDFPPPPTDEELR (서열번호: 9), 또는 RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR (서열번호: 10)이다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 Streptococcus sp의 Streptolysin O 단백질로부터 유래한다. 다른 구현예에서, PEST 서열은 스트렙토코쿠스 피오게네스 스트렙토리신 O, 예를 들어, AA 35-51에서 KQNTASTETTTTNEQPK (서열번호: 11)로부터 유래한다. 다른 구현예에서, PEST 서열은 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스 스트렙토리신 O, 예를 들어, AA 38-54에서 KQNTANTETTTTNEQPK (서열번호: 12)로부터 유래한다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 원생생물로부터 유래한 또 다른 PEST 아미노산 AA 서열이다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 PEST 아미노산 서열이다.
다른 원핵생물의 PEST 아미노산 서열은 예를 들면 LM에 대한 Rechsteiner 및 Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271)에 기재된 것과 같은 방법에 따라 식별될 수 있다. 대안적으로, 다른 원핵생물의 PEST 아미노산 AA 서열은 이 방법에 기초하여 식별될 수 있다. 다른 원핵생물은 여기서 PEST 아미노산 AA 서열이 다른 리스테리아 종을 포함할 것으로 예상될 것이지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 항원 단백질 내에 내장된다. 그러므로, 다른 구현예에서, "융합"은 항원 및 항원의 일 말단에 연결되거나 항원 내부에 끼워진 PEST 아미노산 서열 둘 다를 포함하는 항원성 단백질을 의미한다.
다른 구현예에서, PEST 아미노산 서열은 당해 분야에 공지된 임의의 방법 또는 알고리즘, 예를 들어 CaSPredictor를 이용하여 식별된다(Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE.Bioinformatics.2005 Jun;21 Suppl 1:i169-76). 다른 구현예에서, 다음과 같은 방법이 사용된다:
PEST 지수는 1의 값을 아미노산 Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn, 또는 Gln에 할당하여 각각의 30-35 AA 스트레칭에 대해 산출된다. PEST 잔기의 각각에 대한 계수 값(CV)은 1이고, 다른 AA (비-PEST)의 각각에 대해서는 0이다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 LLO 단백질, ActA 단백질 또는 그 단편은 본원에 기재된 서열에 정확하게 기재되어 있는 것일 필요는 없으며, 오히려 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 항원에 융합된 LLO 또는 ActA 단백질의 기능적 특성을 보유하는 다른 변형, 수정 또는 변화가 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 LLO 단백질, ActA 단백질, 또는 그 단편의 유사체를 이용한다. 유사체는, 다른 구현예에서, 보존적 AA 서열 차이에 의해, 또는 서열에 영향을 미치지 않는 변형에 의해, 또는 둘 다에 의해 자연 발생하는 단백질 또는 펩타이드와 다르다.
다른 구현예에서, 전체 E7 단백질 또는 그 단편 중 하나는 LLO 단백질, ActA 단백질 또는 PEST 아미노산 서열 함유 펩타이드에 융합되어서, 본 발명의 방법의 재조합 펩타이드를 생성한다. (전체 또는 단편의 소스로서) 이용되는 E7 단백질은, 다른 구현예에서, 서열
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (서열번호 13)을 갖는다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 상동체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 변이체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 서열번호 13의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, E7 단백질의 서열은:
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ (서열번호 14)이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 상동체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 변이체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 14의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, E7 단백질은 다음의 유전자은행 항목 중 하나에 기재된 서열을 갖는다: M24215, NC_004500, V01116, X62843, 또는 M14119. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 상동체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 변이체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E7 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, 전체 E6 단백질 또는 그 단편 중 하나는 LLO 단백질, ActA 단백질 또는 PEST 아미노산 서열 함유 펩타이드에 융합되어서, 본 발명의 방법의 재조합 펩타이드를 생성한다. (전체 또는 단편의 소스로서) 이용되는 E6 단백질은, 다른 구현예에서, 서열
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (서열번호 15)을 갖는다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 상동체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 변이체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 15의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, E6 단백질의 서열은:
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV (서열번호 16)이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 상동체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 변이체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 서열번호 16의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, E6 단백질은 다음의 유전자은행 항목 중 하나에 기재된 서열을 갖는다: M24215, M14119, NC_004500, V01116, X62843, 또는 M14119. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 상동체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 변이체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 이성질체이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 상동체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 변이체의 단편이다. 다른 구현예에서, E6 단백질은 상기 유전자은행 항목 중 하나로부터의 서열의 이성질체의 단편이다.
다른 구현예에서, "상동성"이란 70% 초과의 LLO 서열에 대한(예, 서열번호 2~4 중 하나에 대한) 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 64% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 68% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 72% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 75% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 78% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 80% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 82% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 83% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 85% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 87% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 88% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 90% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 92% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 93% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 95% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 96% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 97% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 98% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 99% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 100% 초과의 서열번호 2~4 중 하나에 대한 동일성을 의미한다.
다른 구현예에서, "상동성"이란 70% 초과의 E7 서열에 대한(예, 서열번호 13~14 중 하나에 대한) 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 62% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 64% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 68% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 72% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 75% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 78% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 80% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 82% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 83% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 85% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 87% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 88% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 90% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 92% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 93% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 95% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 96% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 97% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 98% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 99% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 100% 초과의 서열번호 13~14 중 하나에 대한 동일성을 의미한다.
다른 구현예에서, "상동성"이란 70% 초과의 E6 서열에 대한(예, 서열번호 15~16 중 하나에 대한) 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 64% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 68% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 72% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 75% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 78% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 80% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 82% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 83% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 85% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 87% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 88% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 90% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 92% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 93% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 95% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 96% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 97% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 98% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 99% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 100% 초과의 서열번호 15~16 중 하나에 대한 동일성을 의미한다.
다른 구현예에서, "상동성"이란 70%를 초과하는 PEST 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 1 및 7~12 중 하나) 또는 ActA 서열(예컨대, 서열번호 5~6중 하나)에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 60% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5-6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 64% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 68% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 72% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 75% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 78% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 80% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 82% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 83% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 85% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 87% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 88% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 90% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 92% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 93% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 95% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 96% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 97% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 98% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 99% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다. 다른 구현예에서, "상동성"이란 100% 초과의 서열번호 1, 7~12 중 하나 또는 서열번호 5~6 중 하나에 대한 동일성을 의미한다.
본원에서 열거되는 임의의 AA 서열에 대한 단백질 및/또는 펩타이드 상동성은, 일 구현예에서, 면역블롯 분석을 통한 당업계에 널리 알려져 있는 방법들에 의해, 또는 확립된 방법들을 통해 이용가능한 다수의 소프트웨어 패키지 중 임의의 것을 이용하는 AA 시퀀스의 컴퓨터 알고리즘 분석을 통해 결정된다. 이러한 패키지들 중 일부는, FASTA, BLAST, MPsrch, 또는 Scanps 패키지를 포함하고, 다른 구현예에서는, 예를 들어, Smith and Waterman 알고리즘의 사용, 및/또는 분석을 위한 글로벌/로컬 또는 BLOCK 정렬을 채택한다.
다른 구현예에서, LLO 단백질, ActA 단백질, 또는 그 단편은, 화학적 접합에 의해 항원에 부착된다. 다른 구현예에서, 글루타알데히드는 접합에 사용된다. 다른 구현예에서, 접합은, 당업계에 알려져 있는 임의의 적절한 방법을 이용하여 수행된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 융합 단백질은, 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝 및 제한을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해, 또는 후술하는 방법들에 의한 직접적인 화학 합성에 의해 제조된다. 다른 구현예에서, 부분 서열들은 클로닝되고, 적절한 부분 서열들은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단된다. 이어서, 단편들은, 다른 구현예에서, 원하는 DNA 서열을 생성하도록 연결된다. 다른 구현예에서, 융합 단백질을 암호화하는 DNA는, DNA 증폭 방법을 사용하여, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 생성된다. 먼저, 새로운 말단의 양측 상의 고유 DNA의 세그먼트들이 개별적으로 증폭된다. 증폭된 하나의 서열의 5' 말단은 펩타이드 링커를 암호화하는 한편, 다른 증폭된 서열의 3' 말단도 펩타이드 링커를 암호화한다. 제1 단편의 5' 말단은 제2 단편의 3' 말단에 대하여 상보적이므로, (예를 들어, LM 아가로스 상의 부분적 정제 후의) 그 두 개의 단편은, 제3 PCR 반응에 있어서 중첩 템플릿 상에서 사용될 수 있다. 증폭된 서열은, 코돈, (이제 아미노 서열을 형성하는) 개구 부위의 카르복시측 상의 세그먼트, 링커, 및 (이제 카르복실 서열을 형성하는) 개구 부위의 아미노측의 서열을 함유한다. 이어서, 삽입체가 플라스미드에 연결된다.
다른 구현예에서, LLO 단백질, ActA 단백질, 또는 그 단편, 및 항원 또는 그 단편은, 당업자에게 알려져 있는 수단에 의해 접합된다. 다른 구현예에서, 항원 또는 그 단편은, 직접적으로 또는 링커(스페이서)를 통해 ActA 단백질 또는 LLO 단백질에 접합된다. 다른 구현예에서, 키메라 분자는, 단일 쇄 융합 단백질로서 재조합적으로 발현된다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 융합 펩타이드는, 표준 화학 펩타이드 합성 기술을 이용하여 합성된다. 다른 구현예에서, 키메라 분자는 단일 연속 폴리펩타이드로서 합성된다. 다른 구현예에서, LLO 단백질, ActA 단백질, 또는 그 단편, 및 항원 또는 그 단편은, 개별적으로 합성된 후, 한 분자의 아미노 말단과 다른 분자의 카르복실 말단의 축합에 의해 융합되고, 이에 따라 펩타이드 결합을 형성한다. 다른 구현예에서, ActA 단백질 또는 LLO 단백질 및 항원은, 펩타이드 스페이서 분자의 일 말단과 각각 축합되고, 이에 따라 연속 융합 단백질을 형성한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩타이드와 단백질은, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.에서 Stewart 등이 설명한 바와 같이; 또는 Bodanszky와 Bodanszky(The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York)가 설명한 바와 같이, 고상 펩타이드 합성(SPPS)에 의해 제조된다. 다른 구현예에서, 적절하게 보호되는 AA 잔기는, 가교 결합된 폴리스티렌 또는 폴리아미드 수지 등의 유도된 불용성 폴리머 지지부에 카르복실기를 통해 부착된다. "적절히 보호"라는 것은, 아미노산의 알파-아미노기 및 임의의 측쇄 기능기 둘 다에 보호기가 존재함을 의미한다. 측쇄 보호기는, 일반적으로, 합성 전체에 걸쳐 사용되는 용매, 시약, 및 반응 조건에 대하여 안정적이며, 최종 펩타이드 산물에 영향을 끼치지 않는 조건 하에서 제거가능하다. 올리고펩타이드의 단계별 합성은, 초기 AA로부터 N-보호기를 제거한 후, 여기에 원하는 펩타이드의 서열에서의 다음 AA의 카르복실 말단을 결합함으로써 수행된다. 이 AA도 적절히 보호된다. 인입되는 AA의 카르복실은, 반응기로의 형성, 예컨대 카르보디이미드, 대칭 산 무수물 또는 히드록시벤조트리아졸 또는 펜타플루오로페닐 에스테르와 같은 "활성 에스테르"기로의 형성에 의해, 지지체 결합된 AA의 N-말단과 반응하도록 활성화될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 백신, 애플리케이터, 및 본 발명의 방법의 사용을 설명하는 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 모델 키트들을 후술하지만, 다른 유용한 키트들의 내용은, 본 발명의 관점에서 당업자에게 명백할 것이다.
실험 세부사항 부분
실시예 1: LLO -항원 융합은 항종양 면역성을 유도한다
재료 및 실험 방법( 실시예 1-2)
세포주
C57BL/6 동계 TC-1 종양을, HPV-16 E6 및 E7로 무한증식하고 c-Ha-ras 종양유전자로 형질전환하였다. T. C. Wu (존스홉킨스 의과대학, 메릴랜드주 볼티모어) 에 의해 제공되는 TC-1은, 낮은 수준의 HPV-16 E6과 E7을 발현하고 c-Ha-ras 종양 유전자로 형질전환된 고 종양 형성 폐 상피 세포이다. 10% CO2와 37°에서, RPM 1640, 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μM 비필수 아미노산, 1 mM 소듐 피루베이트, 50 마이크로몰(mcM) 2-ME, 400 마이크로그램(mcg)/ml G418, 및 10% 내셔컬 컬렉션형 배양물-109 배지에서 TC-1을 성장시켰다. C3은, HPV16의 완전한 게놈으로 무한 증식되고 pEJ-ras로 형질전환된 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 배아 세포이다. EL-4/E7은, E7로 레트로바이러스 변환된 티모마 EL-4이다.
L . 모노사이토게네스 균주 및 전파
사용된 리스테리아 균주는, Lm-LLO-E7(에피솜 발현계의 hly-E7 융합 유전자; 도 1a), Lm-E7(리스테리아 게놈에 통합된 단일 카피 E7 유전자 카세트), Lm-LLO-NP("DP-L2028"; 에피솜 발현계의 hly-NP 융합 유전자), 및 Lm-Gag("ZY-18"; 염색체에 통합된 단일 카피 HIV-1 Gag 유전자 카세트)이었다. E7는 프라이머 5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3' (서열번호: 17; XhoI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (서열번호: 18; SpeI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었으며 pCR2.1 (Invitrogen사, 캘리포니아주 샌디에고)에 연결되었다. E7을 XhoI/ SpeI 소화에 의해 pCR2.1로부터 잘라내고, pGG-55에 연결하였다. hly-E7 융합 유전자 및 다능성 전사 인자 PrfA는 다중복제 셔틀 플라스미드 (Wirth R 등, J Bacteriol, 165: 831, 1986)인, pAM401로 클로닝되어 pGG-55를 생성하였다. hly 프로모터는 hly 유전자 산물 (용혈성 C-말단이 결여됨, "ΔLLO"로서 하기에 언급되고, 서열번호 25에 기재된 서열을 가짐)의 처음 441 AA 아미노산의 발현을 구동하며, 이것은 E7 유전자의 Xhol 위치에 의해 결합되며, LLO-E7로서 전사되고 분비된 hly-E7 융합 유전자를 산출한다. 플라스미드의 생체내 보유를 위해 선택된 PGG-55에 의한 (펜실바니아대 Hao Shen 박사에 의해 제공되는) 리스테리아 XFL-7의 PrfA 음성 균주의 형질전환(도 1a-1b). hly 프로모터 및 유전자 단편은 프라이머 5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (서열번호: 19; NheI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3' (서열번호: 20; XhoI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 생성되었다. PrfA 유전자는 프라이머 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3' (서열번호: 27; XbaI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (서열번호: 21; SalI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR 증폭되었다. E7의 분비와 발현을 구동하는 신호 서열과 hly 촉진제를 함유하는 발현 카세트를 LM 게놈의 orfZ 도메인 내에 도입하여 Lm-E7을 생성하였다. E7는 프라이머 5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3' (서열번호: 22; BamHI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3' (서열번호: 23; XbaI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서, E7을 pZY-21 셔틀 벡터에 연결하였다. LM 균주 10403S를 형성 플라스미드인 pZY-21-E7로 형질전환하였으며, 이 플라스미드는, LM 게놈의 X, Y, Z 도메인에 대응하는 1.6kb 서열의 중간에 삽입된 발현 카세트를 포함한다. 상동 도메인은, 상동 재조합에 의한 E7 유전자 카세트의 orfZ 도메인 내로의 삽입을 허용한다. E7 유전자 카세트의 orfZ 도메인 내로의 통합을 위해 클론들을 선별하였다. (Lm-LLO-E7 및 Lm-LLO-NP)가 있는 또는 (Lm-E7 및 ZY-18) 클로로암페니콜(20 μg/ml)이 없는 뇌 심장 주입 배지에서 세균을 성장시켰다. -80℃에서 알리코트에서 세균을 동결하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 발현을 검증하였다(도 2).
웨스턴 블롯팅
37℃에서 루리아-베르토니 배지에서 리스테리아 균주를 성장시키고, 600 nm에서 측정되는 동일한 광 밀도에서 채취하였다. 상청액을TCA 침전시키고, 0.1N NaOH가 보충된 1x 샘플 버퍼에서 재부유시켰다. 각 세포 펠릿 또는 각 TCA-침전된 상청액의 동일한 양을 4-20% Tris-글리신 SDS-PAGE 겔(NOVEX, 캘리포니아주 샌디에고)에 로딩하였다. 겔들을 폴리비닐리덴 디플루오라이드로 형질전환하고, 항-E7 모노클로날 항체(mAb)(Zymed Laboratories, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로 프로빙한 후, HRP-접합된 항-마우스 이차 Ab(Amersham Pharmacia Biotech, 영국 리틀 챌폰트)로 배양하고, Amersham ECL 검출 시약으로 현상하고, Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)에 노출시켰다.
종양 성장의 측정
최단 표면 직경과 최장 표면 직경에 걸친 캘리퍼로 하루 걸러 종양을 측정하였다. 이러한 두 개의 측정값의 평균을 다양한 시점에 대하여 밀리미터 단위의 평균 종양 직경으로서 플롯팅하였다. 종양 직경이 20 mm에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 각 시점에 대한 종양 측정값은 생존하고 있는 마우스에 대해서만 도시되어 있다.
확립된 종양 성장에 대한 리스테리아 재조합체의 영향
6주 내지 8주된 C57BL/6 마우스(Charles River)는 좌측 옆구리에 2x105 TC-1 세포를 피하식으로 수용하였다. 종양 접종 후 1주일째, 종양은 직경이 4~5mm인 감지가능한 크기에 도달하였다. 이어서, 7일째와 14일째 0.1 LD50, Lm-LLO-E7 (107 CFU), Lm- E7 (106 CFU), Lm-LLO-NP (107 CFU), 또는 Lm-Gag (5 x 105 CFU)로 8개 마우스 군을 복강내 치료하였다.
51 Cr 방출 분석
6 내지 8주된 C57BL/6 마우스를, 0.1LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, 또는 Lm-Gag로 복강내 면역시켰다. 예방 접종후 10일째, 비장을 채취하였다. 지지 세포(feeder cell)로서 방사선 조사 TC-1 세포가 있는 배양물에서 세포를 확립하였고(100:1, 비장 세포: TC-1), 5일 동안 생체 외에서 자극한 후, EL-4, EL-4/E7, 또는 E7 H-2b 펩타이드(RAHYNIVTF)로 펄스 처리된 EL-4 표적들을 사용하여 표준 51Cr 방출 분석에 사용하였다.). 3회 수행된 E:T 세포 비는 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 및 2.5:1이었다. 37℃에서의 4시간 배양 후에, 세포를 펠릿 처리하고, 50 μl 상청액을 각 웰로부터 제거하였다. Wallac 1450 섬광 계수기(Gaithersburg, MD)로 샘플들을 분석하였다. 퍼센트 특이성 용해를, [(분당 실험 카운트(cpm)-순간 cpm)/(총 cpm-순간 cpm)] x 100으로서 결정하였다.
TC -1 특이성 증식
C57BL/6 마우스를 0.1 LD50로 면역시키고, 1 LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP 또는 Lm-Gag로 20일째 복강내 주입에 의해 추가투여하였다. 추가투여 후 6일째, 면역된 원시 마우스로부터 비장을 채취하였다. E7 Ag의 소스로서 웰 당 2.5 x 104, 1.25 x 104, 6 x 103, 또는 3 x 103 방사선 조사된 TC-1 세포가 있는, 또는 TC-1 세포가 없는, 또는 10 μg/ml Con A가 있는, 바닥이 평평한 96개의 웰 판에서 5x105/웰로 배양액에 비장 세포를 확립하였다. 45시간 후에 세포를 0.5 μCi [3H]티미딘/웰로 펄스 처리하였다. Tomtec harvester 96 (코네티컷주 오렌지)을 사용하여18시간 후에 평판들을 거두고, Wallac 1450 섬광 계수기로 증식을 분석하였다. cpm의 변화를 실험적 cpm-no Ag cpm으로서 산출하였다.
유동 세포 분석
C57BL/6 마우스를 0.1 LD50 Lm-LLO-E7 또는 Lm-E7로 정맥 내(i.v.) 면역시키고 30일 후 추가투여하였다. CellQuest? 소프트웨어를 구비한 FACSCalibur? 유동 세포 분석기(Becton Dickinson, 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 CD8 (53-6.7, PE 접합형), CD62 리간드(CD62L; MEL-14, APC 접합형), 및 E7 H-2Db 테트라머에 대한 3색 유동 세포 분석을 수행하였다. 추가투여 후 5일째 채취한 비장 세포를, E7 펩타이드(RAHYNIVTF) 또는 대조(HIV-Gag) 펩타이드가 로딩된 H-2Db 테트라머로 실온(rt)에서 염색하였다. 사합체들을 1/200 희석으로 사용하고, Dr. Larry R. Pease (Mayo Clinic, 미네소타주 로체스터) 및 NIAID Tetramer Core Facility 및 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program에 의해 제공되였다. 테트라머+, CD8+, CD62Llow 세포를 분석하였다.
B16F0 -난자 실험
24 C57BL/6 마우스를 5x105 B16F0-난자 세포로 접종하였다. 3일, 10일, 및 17일째, 0.1 LD50 Lm-OVA (106 cfu), Lm-LLO-OVA (108 cfu)로 8개 마우스의 군을 면역시키고, 8마리 동물은 치료하지 않은 상태로 두었다.
통계
종양 직경의 비교를 위해, 각 군에 대한 종양 크기의 평균 및 SD를 측정하고, 스튜던트 t 검정에 의해 통계 유의성을 결정하였다. p ≤ 0.05가 유의성을 갖는 것으로 간주되었다.
결과
TC-1 성장에 영향을 미치는 능력에 대하여 Lm-E7 및 Lm-LLO-E7을 비교하였다. C57BL/6 마우스의 좌측 옆구리에 피하 종양을 확립하였다. 이후 7일째, 종양이 검출가능한 크기(4~5 mm)에 도달하였다. 0.1 LD50 Lm-E7, Lm-LLO-E7, 또는 대조군인 Lm-Gag 및 Lm-LLO-NP로 7일째와 14일째 마우스를 예방접종하였다. Lm-LLO-E7은 확립된 TC-1 종양의 75%의 완벽한 퇴행을 유도한 한편, 군의 다른 2마리 마우스에서 종양 성장을 제어하였다(도 3). 대조적으로, Lm-E7과 Lm-Gag에 의한 면역화는 종양 퇴행을 유도하지 않았다. 이 실험을 여러 번 반복하였으며, 항상 매우 유사한 결과를 얻었다. 또한, 서로 다른 면역화 프로토콜들 하에서 Lm-LLO-E7에 대하여 유사한 결과들을 얻었다. 다른 실험에서, 확립된 5 mm TC-1 종양이 있는 마우스를 단일 면역화로 치료할 수 있었다.
다른 실험들에서, 2개의 다른 E7-발현 종양 세포주, C3 및 EL-4/E7로 유사한 결과를 얻었다. Lm-LLO-E7에 의한 예방접종의 효능을 확인하기 위해, 종양이 제거된 동물들을 상대로 60일째 또는 40일째 TC-1 또는 EL-4/E7 종양 세포로 각각 재도전하였다. Lm-LLO-E7로 면역된 동물들은, 실험 종료(TC-1의 경우엔 124일 및 EL-4/E7의 경우엔 54일)까지 종양이 없었다.
따라서, ΔLLO를 이용한 융합 단백질로서 항원의 발현은 항원의 면역원성을 향상시킨다.
실시예 2: LM- LLO -E7 치료는 TC -1 특이성 비장 세포 증식을 유발한다
Lm-LLO-E7을 이용한 Lm-E7에 의한 T 세포의 유도를 측정하기 위해, 항원-특이성 면역 능력의 척도인 TC-1-특이성 증식 반응을 면역된 마우스에서 측정하였다. Lm-LLO-E7로 면역된 마우스로부터의 비장 세포는, 20:1, 40:1, 80:1, 및 160:1의 비장 세포: TC-1 비로 E7의 소스로서 방사선 조사된 TC-1 세포에 노출시 증식되었다(도 4). 역으로, Lm-E7과 rLm 대조군 면역 마우스로부터의 비장 세포는 백그라운드 수준의 증식만을 나타내었다.
실시예 3: LLO , ActA , 또는 PEST 아미노산 서열으로의 E7의 융합은 E7-특이 면역성을 향상시키고, 종양 침윤 E7-특이성 CD8 + 세포를 생성한다.
재료 및 실험 방법
인산 완충 식염수 (PBS) 중 2 x 105 TC-1 종양 세포 100 mcl와 MATRIGEL? (BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.) 400 mcl를 포함하는 MATRIGEL? 500 mcl (마이크로리터)를 12 C57BL/6 마우스 (n=3)의 좌측 옆구리에 피하 내 이식하였다. 7일, 14일, 및 21일째 마우스를 복강내 면역시키고, 28일째 비장과 종양을 채취하였다. 마우스로부터 종양 MATRIGEL을 제거하고, 얼음 상에 2 ml의 RP 10 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 4℃에서 배양하였다. 종양을 겸자로 갈고, 2 mm 블록들로 절단하고, 3 ml의 효소 혼합물(0.2 mg/ml 콜라게나제-P, PBS 내 1 mg/ml DNAse-1)로 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 조직 현탁액을 나일론 메시를 통해 필터링하고, 테트라머 및 IFN-감마 염색을 위해 5% 소태아혈청 + PBS 내 0.05%의 NaN3로 세척하였다.
브레펠딘 A의 존재 하에 5시간 동안 1 마이크로몰(mcm)의 E7 펩타이드를 이용하여 비장 세포와 종양 세포를 107 세포/ml로 배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 또는 밤새 50 mcl의 항-마우스 Fc 수용체 상청액(2.4 G2)에서 배양하였다. 세포를 표면 분자 CD8 및 CD62L에 대하여 염색하고, 침투 키트 Golgi-stop? 또는 Golgi-Plug? (Pharmingen, 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 침투, 고정하고, IFN-감마에 대해 염색하였다. 이중-레이저 유동 세포 분석기 FACSCalibur 를 사용하여 500,000개 이벤트를 얻고, Cellquest 소프트웨어(Becton Dickinson, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 분석하였다. 활성화된 (CD62Llow) CD8+ T 세포 내의 IFN-감마 분비 세포의 퍼센트를 산출하였다
테트라머 염색의 경우, 피코에리트린(PE)-접합 E7 펩타이드(RAHYNIVTF, 서열번호: 24)로 H-2Db 테트라머를 로딩하고, 상온에서 1시간 동안 염색하고, 항-알로피코시아닌(APC) 접합 MEL-14 (CD62L) 및 FITC-접합 CD8β로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 비장 및 종양에서의 테트라머+CD8+ CD62Llow 세포를 비교하여 세포를 분석하였다.
결과
항원 특이 면역성을 향상시키는 Lm-ActA-E7의 능력을 분석하기 위해, 마우스에 TC-1 종양 세포를 이식하고, Lm-LLO-E7(1 x 107 CFU), Lm-E7 (1 x 106 CFU), 또는 Lm-ActA-E7(2 x 108 CFU)로 면역시켰거나, 또는 치료하지 않았다(원시 상태). Lm-LLO-E7과 Lm-ActA-E7군으로부터의 마우스의 종양은 Lm-E7 또는 원시 마우스보다 높은 퍼센트의 IFN-감마-분비 CD8+ T 세포(도 5a) 및 테트라머-특이성 CD8+ 세포(도 5b)를 함유하였다.
다른 실험에서는, 종양이 있는 마우스에 Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-ΔPEST-E7, 또는 Lm-E7epi를 투여하고, 종양 내의 E7-특이성 림프구의 레벨을 측정하였다. 7일째와 14일째, 4개 백신의 0.1 LD50으로 마우스를 치료하였다. 21일째 종양을 채취하고, CD62L, CD8 항체로 염색하고, E7/Db 테트라머로 염색하였다. Lm-LLO-E7 및 Lm-PEST-E7로 예방접종된 마우스에 있어서, 종양 내의 테트라머-양성 림프구의 증가된 퍼센트를 볼 수 있었다(도 6a). 이 결과는, 3회의 실험에 걸쳐 재현되었다(도 6b).
따라서, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7, 및 Lm-PEST-E7 각각은, 종양-침윤 CD8+ T 세포의 유도 및 종양 퇴행에 효과적이다.
실시예 4: 마우스를 통한 리스테리아 백신 벡터의 계대는 이종 및 내인성 항원들에 대하여 증가된 면역 반응을 이끌어낸다.
재료 및 실험 방법
세균 균주
L. 모노사이토게네스 균주 10403S, 혈청형 1(ATCC, Manassas, Va.)은 이러한 연구에서 사용된 야생형 유기체였으며, 구성물의 부 균주는 후술한다. 균주 10403S는, BALB/c 마우스에 복강내 주입되는 경우 약 5 x 104 CFU의 LD50을 갖는다. "Lm-Gag"는, 변형된 셔틀 벡터 pKSV7을 사용하여 리스테리아 염색체 내에 안정적으로 통합되는 HIV-1 균주 HXB(신시튬 형성 표현형의 서브타입 B 연구실 균주) gag 유전자의 카피를 함유한 재조합 LM 균주다. Gag 단백질은, 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이 균주에 의해 발현 및 분비되었다. 모든 균주를 뇌-심장 주입(BHI) 액체 배지 또는 한천 평판(Difco Labs, 미시간주 디트로이트)에서 성장시켰다.
세균 배양
패신저 항원 및/또는 융합 단백질을 발현하는 단일 클론으로부터의 세균을 선택하여 BHI 액체 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액의 알리코트를 첨가제 없이 -70℃에서 동결하였다. 이 스톡으로부터, 배양액을 600 nm에서 0.1 내지 0.2 O.D.로 성장시키고, 알리코트를 첨가제 없이 -70℃에서 다시 동결하였다. 클로닝된 세균 풀을 준비하기 위해, 전술한 절차를 이용하였지만, 본원에서 설명한 바와 같이, 각 계대 후, 다수의 세균 클론을 선택하고 표적 항원의 발현을 체크하였다. 외부 항원의 발현이 확인된 클론들을 다음 계대에 사용하였다.
마우스 내 세균의 계대
6주 내지 8주된 암컷 BALB/c(H-2d) 마우스를 Jackson Laboratories (메인주 바 하버)로부터 구매하고, 병원체 없는 마이크로분리기 환경에서 유지하였다. -70℃에서 동결 보관된 스톡 배양액의 알리코트에서 생존가능한 세균의 역가를, 융해시 및 사용 전 BHI 한천 평판 상에 발라서 결정하였다. 모든 경우에, 5x105 세균을 BALB/c 마우스에 정맥내 주입하였다. 3일 후, 비장을 채취하고, 균질화하고, 비장 균질물의 일련의 희석액들을, BHI 액체 배지에서 밤새 배양하고 BHI 한천 평판 상에 발랐다. 추가 계대를 위해, 알리코트를 다시 0.1 내지 0.2 O.D.로 성장시키고, -70℃에서 동결하고, 일련의 희석에 의해 세균 역가를 다시 결정하였다. 초기 계대(계대 0) 후, 이 서열을 총 4번 반복하였다.
IFN -감마에 대한 세포내 사이토카인 염색
1 마이크로몰의 농도의 HIV-GAG (AMQMLKETI; 서열번호 25), 리스테리아 LLO(GYKDGNEYI; 서열번호: 26) 또는 HPV 바이러스 유전자 E7(RAHYNIVTF; 서열번호 24)에 대한 세포독성 T-세포(CTL) 에피토프의 존재 또는 부재 하에, 50 U/ml의 인간 재조합 IL-2 및 1 마이크로리터/ml의 브레펠딘 A(GolgistopTM; PharMingen, 캘리포니아주 샌디에고)로 보충된 완전 RPMI-10 배지에서 5시간 동안 림프구를 배양하였다. 세포는, 먼저, 표면 염색한 후, 세척하고, 제조사 추천권장 사항(PharMingen, 캘리포니아주 샌디에고)에 따라 Cytofix/Cytoperm 키트를 사용하여 세포내 시토카인 염색을 하였다. 세포내 IFN-감마 염색을 위해, FITC-접합된 쥐 항-마우스 IFN-감마 모노클론 항체(클론 XMG 1.2) 및 그 이소타입 대조군 Ab(쥐 IgG1: 이들 모두는 PharMingen에서 온 것임)를 사용하였다. 모두, 1% 보빈 세럼 알부민 및 0.02% 소듐 아지드(FACS 버퍼)를 함유하는 PBS에서 106 세포들을 30분 동안 4℃에서 염색한 후, FACS 버퍼에서 세번 세척하였다. FACScanTM 유동 세포 분석기 또는 FACSCaliburTM기기(Becton Dickinson, 캘리포니아주 산호세)에서 샘플 데이터를 얻었다. FACSCaliburTM 유동 세포 분석기를 사용하여 CD8(PERCP 접합형, 쥐 항-마우스, 클론 53-6.7 Pharmingen, 캘리포니아주 샌디에고), CD62L(APC 접합형, 쥐 항-마우스, 클론 MEL-14)에 대한 3색 유동 세포 분석, 및 세포내 IFN-감마를 수행하고, CELLQuest 소프트웨어(Becton Dickinson, 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 데이터를 추가 분석하였다. CD8+ 및 세포내 IFN-감마 염색에 대하여 분석하기 전에, 세포를 CD8 하이 및 CD62Llow로 게이팅 처리하였다.
결과
마우스의 계대는 , 재조합 리스테리아 모노사이토게네스의 독성을 증가시킨다.
서로 다른 3개의 구성물을 사용하여, 재조합 리스테리아 백신 벡터에 대한 계대의 영향을 결정하였다. 이러한 구성물들 중 두 개는, 패신저 항원의 게놈 삽입을 운반하고, 제1 구성물은 HIV gag 유전자(Lm-Gag)를 포함하고, 제2 구성물은 HPV E7 유전자(Lm-E7)를 포함한다. 제3 구성물(Lm-LLO-E7)은, 리스테리아 독성 인자를 제어하는 양성 조절 인자인 PrfA를 암호화하는 유전자 및 절단된 버전의 LLO와 융합된 패신저 항원을 위한 융합 유전자(HPV E7)를 갖는 플라스미드를 포함한다. 이 플라스미드는, 살아있는 숙주에 있어서, 선택 압력이 플라스미드의 보존을 지지하도록 prfA 음성 돌연변이를 보완하는 데 사용되었는데, 그 이유는 그것이 없으면 세균이 무독성이기 때문이다. 모든 3개의 구성물은 많은 세균 세대를 위해 생체 외에서 널리 전파되었다.
세균을 계대시킴으로써, 비장에서 생존하는 세균의 개수에 의해 측정시, 세균 독성이 증가하였으며, 첫번째 2개 각각은 계대한다. Lm-Gag 및 Lm-LLO-E7에 대하여, 독성은, 계대 2까지 각 계대마다 증가하였다(도 7a). 플라스미드-함유 구성물인 Lm-LLO-E7은 독성의 가장 급격한 증가를 입증하였다. 계대 전에, Lm-LLO-E7의 초기 면역화 투여량은, 107 세균으로 증가시켜야 했으며, 비장은 세균을 복원하도록 2일째에 채취해야 했다(반면, Lm-Gag에 대한 105 세균의 초기 투여량은 3일째 채취하였다). 초기 계대 후, Lm-LLO-E7의 표준 투여량은 3일째 채취가 가능하도록 충분하였다. Lm-E7에 대하여, 독성은 미계대 세균에 비해 1.5배만큼 증가하였다(도 7b).
따라서, 마우스를 통한 계대는, 리스테리아 백신 균주의 독성을 증가시킨다.
계대는 , CD8 + T 세포들을 유도하는 L. 모노사이토게네스의 능력을 증가시킨다.
다음으로, HIV-Gag 펩타이드 AMQMLKETI(서열번호 25) 및 LLO 91-99(GYKDGNEYI; 서열번호 26)를 사용한 MHC 클래스 I에 특이적인 면역우세 펩타이드로 세포내 사이토카인 염색을 하여 항원-특이성 CD8+ T 세포의 유도에 대한 계대의 영향을 측정하였다. 마우스 내로 계대된 103 CFU의 세균(Lm-Gag)을 주입함으로써, 상당한 개수의 HIV-Gag-특이성 CD8+ T 세포를 이끌어낸 한편, 동일한 투여량의 비계대 Lm-Gag는 검출가능한 Gag-특이성 CD8+ T 세포를 유도하지 못했다. 미계대 세균의 투여량을 100배로 더욱 증가시켜 상대적 무독성을 보상하지 못했으며, 사실상, 더욱 많은 투여량으로도 검출가능한 Gag-특이성 CD8+ T 세포를 끌어내지 못했다. 계대된 세균이 Gag-특이성 T 세포 유도를 50%만큼 증가시킴에 따라 동일한 투여량이 증가한다(도 8). 항원-특이성 CD8+ T 세포 유도의 동일한 패턴을 LLO-특이성 CD8+ T 세포에서 관찰하였으며, 이는, 이들이 내인성 리스테리아 항원인 LLO에서 관찰되었으므로, 이러한 결과들이 패신저 항원의 특성들에 의해 야기되지 않았음을 나타낸다.
따라서, 마우스를 통한 계대가 리스테리아 백신 균주의 면역원성을 증가시킨다.
실시예 5: PrfA -함유 플라스미드는 항생제가 없는 PrfA 결실이 있는 LM 균주에서 안정적이다
재료 및 실험 방법
세균
L. 모노사이토게네스 균주 XFL7은, 독성을 부분적으로 복원하고 CAP 저항을 제공하는 pGG55를 운반하는 PrfA 유전자 XFL7에 300 염기 쌍 결실을 함유하며, 미국 특허 출원 공개 제200500118184호에 기재되어 있다.
리스테리아로부터의 플라스미드 추출물에 대한 프로토콜 개발
1mL의 리스테리아 모노사이토게네스 Lm-LLO-E7 연구 작용 세포 뱅크 바이얼을 34 μg/mL CAP을 함유하는 27mL BH1 배지 내에 접종하고, 37℃ 200rpm에서 24시간 동안 성장시켰다.
7개의 2.5 mL 배양액 샘플을 펠릿 처리하고(5분 동안 15000 rpm), 0~60분으로 시간 양을 가변하면서 50 μl 리소자임 용액으로 37℃에서 펠릿들을 배양하였다.
리소자임 용액:
- 29 μl 1M 이염기 인산칼륨
- 21 μl 1M 단일염기 인산칼륨
- 500 μl 40% 수크로스 (0.45/μm 필터에 의한 필터 살균)
- 450 μl 물
- 60 μl 리소자임 (50 mg/mL)
리소자임에 의한 배양 후, 현탁액들을 이전처럼 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 각 펠릿을, 수정 버전의 QIAprep Spin Miniprep Kit? (Qiagen, 메릴랜드주 제르맨타운) 프로토콜에 의해 플라스미드 추출을 실시하였다. 프로토콜의 변경은 다음과 같았다.
1. 버퍼 PI, P2, N3의 부피를 모두 세 배로 증가시켜 증가된 바이오매스의 용해를 완료할 수 있게 하였다.
2. P2 첨가 전에 2 mg/mL의 리소자임을 재현탁된 세포에 첨가하였다. 이어서, 중성화 전에 15분 동안 37℃에서 용해액을 배양하였다.
3. 플라스미드 DNA를 50 μL가 아닌 30 μL 에서 재현탁하여 농도를 증가시켰다.
다른 실험들에서는, P1 버퍼+리소자임에서 15분 동안 세포를 배양한 후, 실온에서 P2(용해 버퍼) 및 P3(중성화 버퍼)로 배양하였다.
각 부배양액으로부터 분리된 플라스미드 DNA의 균등 볼륨을, 에티디윰 브로마이드로 염색된 0.8% 아가로스 겔 상에 흐르게 하고, 구조적 또는 분리 불안정성의 임의의 사인에 대하여 가시화하였다.
결과들은, L. 모노사이토게네스 Lm-LLO-E7로부터의 플라스미드 추출이, 리소자임에 의한 배양 시간 증가에 따라 효율을 약 50분의 배양에서의 최적 레벨까지 증가시킴을 나타내었다.
이러한 결과들은 리스테리아 백신 균주로부터 플라스미드 추출에 효과적인 방법을 제공한다.
복제 평판
초기 배양액의 희석액을, 34 μg/mL CAP이 있는 경우에 또는 없는 경우에 LB 또는 TB 한천을 함유하는 판들 상에 발랐다. 선택적 및 비선택적 한천 간의 차이를 이용하여, 플라스미드의 현저한 분리 불안정성이 있는지 여부를 결정하였다.
결과
항생제 부존재 하에서 L. 모노사이토게네스 균주 XFL7 내의 pGG55 플라스미드의 유전적 안정성(즉, 선택압, 예컨대, 항생제 선택압의 부존재 하에서 박테리아에 의해 플라스미드가 보유되거나 박테리아와 안정적으로 연관된 채로 유지되는 정도)을 루리아-베르타니 배지(LB: 5 g/L NaCl, 10 g/ml 대두 펩톤, 5 g/L 효모 추출물)와 테리픽 브로스(Terrific Broth) 배지(TB: 10 g/L 글루코오스, 11.8 g/L 대두 펩톤, 23.6 g/L 효모 추출물, 2.2 g/L KH2PO4, 9.4 g/L K2HPO4) 내에서 연속 계대배양, 중복 배양(duplicate culture)에 의해 평가하였다. 250 mL의 배플 셰이크 플라스크 내 50 mL의 새로운 배지를, 고정된 개수의 세포(1 ODmL)로 접종하였으며, 이어서 24시간 간격으로 부배양하였다. 37℃ 및 200 rpm에서 오비탈 셰이커에서 배양액을 접종하였다. 각 부배양에 있어서, OD600을 측정하고 사용하여, LB에서 30개 세대에 도달하고 TB에서 42개의 세대에 도달할 때까지 경과된 세포 배가 시간(또는 세대)을 산출하였다. 각 부배양 스테이지에서(대략 매 4 세대) 알려져 있는 개수의 세포(15 ODmL)를 원심 분리에 의해 펠릿 처리하고, 전술한 Qiagen QIAprep Spin Miniprep? 프로토콜을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 정제 후, 플라스미드 DNA를 대상으로 아가로스 겔 전기영동을 실시한 후 에티디윰 브로마이드 염색을 하였다. 조제물에서의 플라스미드의 양은 샘플들 간에 약간 달랐지만, 전체적인 경향은, 세균의 세대 개수에 대하여 플라스미드의 양은 일정하였다(도 9a와 도 9b). 따라서, pGG55는, 항생제가 없는 경우에도 균주 XFL7의 안정성을 나타내었다.
부배양물의 각 스테이지에서 한천 평판 상에 복제 평판하여 안정성 연구 동안 플라스미드 안정성도 모니터링하였다. 아가로스 겔 전기영동의 결과와 부합하여, LB 또는 TB 액체 배양물에서의 연구 전체에 걸쳐 플라스미드 함유 세포의 개수의 전체적 변화가 없었다(각각 도 10과 도 11).
이러한 결과는, PrfA-암호화 플라스미드가, rfA 유전자 돌연변이를 함유하는 리스테리아 균주에 항생제가 없는 경우 안정성을 나타냄을 입증한다.
재료 및 방법 ( 실시예 6 내지 실시예 10)
PCR 시약.
PrfA 유전자의 증폭과 D133V 돌연변이의 판별에 사용된 프라이머들을 표 1에 나타내었다. 프라이머 ADV451, 452, 453를 TE 버퍼에서 400 μM로 희석하여 그 프라이머들의 스톡 용액들을 준비하였다. 스톡 용액의 알리코트를 20 μM의 물(PCR 급)에 추가로 희석하여 작용 용액을 준비하였다. 프라이머들을 -20℃에서 보관하였다. PCR에 사용된 시약들을 표 2에 나타내었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
플라스미드 DNA 준비
prfA돌연변이가 있는 pGG55플라스미드(pGG55 D133V) 및 prfA돌연변이가 없는 pGG55플라스미드(pGG55 WT)를, 제조사의 지시에 따라, PureLink™ HiPure Plasmid Midiprep Kit (Invitrogen, K2100-05)를 사용하여 대장균 또는 리스테리아 모노사이토게네스로부터의 중간준비에 의해 추출하고 정제하였다. 리스테리아로부터 플라스미드 정제를 위해, PGG55 D133V 또는 WT 플라스미드를 운반하는 세균 균주를, 클로람페니콜이 보충된(25 μg/ml) BHI 한천 평판에서 동결된 스톡으로부터 펴 발랐다. 각 균주로부터의 단일 콜로니를, 37℃에서 6시간 동안 5 ml의 선택적 배지(25 μg/ml 클로람페니콜이 있는 BHI 액체 배지)에서 격렬하게 흔들어 성장시키고, 유사한 조건 하에서 밤새 성장하도록 100ml의 선택적 배지에서 1:500로 부접종(subinoculate)하였다. 밤새 배양된 배양물로부터 세균을, 10분 동안 4,000 x g로 원심분리하여 채취하고, 2 mg/ml의 리소자임(Sigma, L7001)을 함유하는 버퍼 R3(재현탁 버퍼)에서 재현탁하였다. 규칙적 프로토콜로 진행하기 전에 37℃에서 적어도 1시간 동안 세균 현탁액을 배양하였다. 용출된 플라스미드의 농도와 순도를, 260 nm와 280 nm에서 스펙트로포토미터로 측정하였다. 템플릿 DNA를 준비하기 위해, pGG55 D133V 및 WT 플라스미드를 물에 현탁하여 중간준비 스톡 용액으로부터 1 ng/μl의 최종 농도를 갖게 하였다. PGG55 WT 플라스미드를 위해, 10-1 내지 10-7 희석액에 해당하는, 1 ng/μl 용액으로부터의 일련의 10배 희석액을 준비하였다.
임상 등급 재료를 테스트하기 위한 prfA 특이성 PCR 프로토콜
반응 혼합물은, 1xPCR 버퍼, 1.5 mM MgCl2, 0.8 mM dNTP, 0.4 μM의 각 프라이머, 0.05 U/μl의 Taq DNA 폴리머라제, 및 0.04 ng/μl의 pGG55 D133V 템플릿 플라스미드를 함유하였다. 각 테스트마다, 10개 튜브가 필요하였으며, 25 μl 반응시 각 튜브의 주요 성분들을 표 3에 나타내었다. PCR 반응을 위해, 표 4에 나타낸 바와 같이 11개 반응을 위한 충분한 시약으로 마스터 혼합물을 준비하였으며, 이러한 24 μl의 PCR 혼합물을 각 튜브에 첨가하였다. 후속하여, 총 1 μl의 일련의 희석된 pGG55 WT 플라스미드를 해당 튜브에 첨가하였다: 튜브 3에는 1 ng, 튜브 4에는 100 pg, 튜브 5에는 10 pg, 튜브 6에는 1 pg, 튜브 7에는 100 fg, 튜브 8에는 10 fg, 튜브 9에는 1 fg, 튜브 10에는 0.1 fg. 이러한 일련의 희석을 이용하여 표준 곡선을 교정하여 방법 민감도를 결정하였다. 또한, 0.5 μl의 물과 0.5 μl의 프라이머 ADV451(20 μM 스톡)을 튜브 1에 첨가하고, 1 μl 물을 튜브 2에 첨가하여, 최종 부피 25 μl을 완성하였다. 25 μl 반응에 대한 튜브당 각 시약의 양을 표 5에 나타내었다. 반응에 사용된 PCR 사이클링 조건을 표 6에 나타내었다.
PCR 반응의 종결 후, 5 μl의 겔 로딩 버퍼(6x, 브로모페놀 청색)를 각 샘플에 첨가하고, TBE 버퍼 내 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동에의해 10 μl를 분석하였다. 겔 치수는 15개 샘플 웰(1 mm x 2 mm) 콤(comb)에 있어서 7 cm x 7 cm x 1 cm이었다. 브로모페놀 청색 염료가 겔의 중간에 도달할 때까지 겔을 ~30분 동안 100 V에서 흐르게 하였다. 20분 동안 에티디윰 브로마이드(0.5 μg/ml)에서 겔을 염색하고, 10분 동안 물로 오물을 제거하였다. UV 광에 의한 조명에 의해 겔을 가시화하고, 촬상한다. 대역 밀도분석 소프트웨어(Quantity One version 4.5.1, BioRad)를 사용하여 화상을 분석하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
시퀀싱:
디데옥시 시퀀싱 방법을 이용하여 플라스미드의 시퀀싱을 행하였다. 플라스미드 pGG55 D133V와 pGG55 WT를 서로 다른 비(1:1, 1:10, 1;100, 1:1,000, 1:10,000)로 혼합하였다. 혼합물에서 플라스미드의 총량(500 μg)을 일정하게 유지하였고, 야생형 서열을 함유하는 플라스미드를 D133V 플라스미드에 대하여 10배로 일련 희석하여 방법의 민감도를 결정하였다.
결과
실시예 6: 시퀀싱은 D133V 돌연변이의 전이를 검출하는 민감한 방법이 아니다.
야생형 prfA 서열의 검출시 시퀀싱의 민감도를 추정하기 위해, pGG55D133V와 WT 플라스미드를 서로 다른 비로 혼합하고 시퀀싱하였다. 그 결과는, 도 12에 도시되어 있으며, 시퀀싱이 prfA D133V 돌연변이 판별에 있어서 높은 특이성을 가짐을 나타낸다(도 12). 반면, 민감도는 낮으며, 서열에서 검출가능한 피크가 있는 야생형 prfA pGG55 플라스미드의 최대 희석은 1/10이었다(도 12). 결론적으로, 시퀀싱이 매우 특이성이 있지만, 방법의 민감도는 낮으며, Lm-LLO-E7 샘플에서 prfA D133V 돌연변이의 복귀 돌연변이와 같은 희귀 이벤트의 존재를 선별하는 데 적절하지 않다.
실시예 7: D133V 돌연변이의 전환을 검출하는 고 특이성 및 민감성 PCR 방법의 개발.
희귀한 이벤트를 검출하도록 시퀀싱의 저 민감도가 주어진 경우, D133V 돌연변이의 야생형으로의 전이를 검출하도록 유사한 특이성을 갖는 더욱 민감한 방법을 개발할 필요가 있었다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 야생형 서열을 특이적으로 증폭하고 D133V 돌연변이 서열의 10,000,000개 카피 중 prfA의 적어도 1개의 야생형 카피를 검출할 정도로 민감한 PCR기반 방법을 설계하였다. 이 방법을 위해 3개의 프라이머를 설계하였다: ADV451, ADV452 및 ADV453 (표 1). ADV451과 ADV452는 모두 포워드 프라이머이며, prfA 유전자의 위치 398에서의 AT (D133V) 돌연변이를 판별하도록 3' 위치에서 마지막 뉴클레오티드에서 다르다. ADV 453 프라이머는, ADV451과 ADV452 프라이머들의 어닐링 부위의 약 300bp 하류측에 위치하는 역 프라이머이다(도 13). ADV451 또는 ADV452 및 ADV453 프라이머에 의해 얻어지는 예상 PCR 대역은 326bp이다. 엄격한 조건 하에서, ADV451 프라이머는 pGG55 D133V 플라스미드를 증폭해야 하는 한편, ADV452는 야생형 prfA 서열에 대하여 특이적일 것이다.
실시예 8: PCR 방법의 특이성.
프라이머 ADV451를 사용한 반응은, 매우 특이적이며, 돌연변이 D133V prfA 서열(레인 1 내지 3)을 증폭하였지만, 야생형 서열(레인 4 내지 6)은 증폭하지 않았다. 그러나, 5 ng의 템플릿 DNA를 사용하였을 때, 레인 4에서 매우 희미한 대역을 검출할 수 있지만, 1 ng을 사용할 때에는 검출할 수 없다(도 14).
도 15에 도시한 바와 같이, ADV452 프라이머를 사용한 반응은, 야생형 prfA 서열(레인 4, 5, 6)만을 증폭하였으며, D133V prfA 돌연변이를 운반하는 pGG55가 템플릿으로서 사용되었을 때(레인 1, 2, 3), 반응에 5nm의 플라스미드가 사용되었더라도 대역을 검출하지 못했다(도 16). 결론적으로, 프라이머 ADV451과 ADV452를 이용한 PCR 반응은, 매우 특이적이며, pGG55 플라스미드의 prfA 유전자의 위치 398에서 AT (D133V) 돌연변이를 판별할 수 있다. 이러한 결과들에 기초하여, 반응에 사용될 템플릿 DNA의 표준 양으로서 1n의 양을 선택하였다.
실시예 9: PCR 방법의 민감도.
1 ng의 템플릿 DNA를 사용하여 반응 민감도를 테스트하였다. 야생형 prfA 서열을 운반하는 플라스미드에 대하여, (10-1 내지 10-7의 10배 희석액에 해당하는) 감소된 양의 DNA를, 또한, 반응에 포함시켜 민감도를 추정하였다. 이러한 반응들에서, 프라이머 ADV452와 ADV453만을 사용하였다. 30 사이클의 PCR 반응(10 사이클에서는 어닐링 온도가 53℃이고 추가 20사이클에서는 어닐링 온도가 50℃)에 있어서, 방법의 민감도는 1/100,000이었다(데이터는 나타내지 않음). 도 5에 도시한 바와 같이, PCR 사이클의 개수를 37로 증가시킴으로써, 특이성을 크게 손상시키지 않고, D133V 복귀 돌연변이의 검출 방법의 가시적 민감도를 10-6까지 개선하였다. 1 ng의 플라스미드를 DNA의 초기량으로서 사용하였을 때, 백만 D133V 돌연변이에서 1 카피의 야생형 서열 검출 레벨에 해당하는 10-6 희석액에서 깨끗한 대역을 볼 수 있었다. 긴 노출 후 레인 1과 9에서 매우 약한 대역만이 가시화될 수 있어서, 방법의 견고한 특이성을 확실히 할 수 있다. 반면, 5 ng의 DNA로 시작하면, 10-7 희석액에서 대역이 쉽게 검출될 수 있어서, PCR의 민감도를 증가시킬 수 있다. 그러나, pGG55 D133V 플라스미드가 있는 유사한 강도 대역도 검출될 수 있어서, 방법의 특이성 한계값을 나타낸다(도 17). PGG55 D133V 플라스미드와 함께 관찰된 이 대역은, 사이클 증가에 따라 상당히 축적될 수 있는 프라이머 ADV452가 있는 D133V 돌연변이의 비특이적 증폭으로 인한 것일 수 있다. 이러한 결과들은, 이 방법에 대한 민감도 한계값이, 특이성을 크게 손상시키지 않고, 1 대 1,000,000 내지 1 대 10,000,000에 있음을 나타낸다.
실시예 10: E7에 대한 LLO의 융합 단백질(LM- LLO -E7)을 발현하는 재조합 리스테리아
이 균주는, 야생형 부 균주 10403S보다 4~5로그 더 약독화되고, 융합 단백질 tLLO-E7을 분비한다. 이 면역요법은 백본 XFL7에 기초하며, 이는 독성 유전자 전사 활성제 prfA의 비가역성 결실에 의해 10403S로부터 유도된다. PrfA는, L. 모노사이토게네스의 생체내 세포내 성장 및 생존에 요구되는 리스테리오실린 O(LLO), ActA, PlcA(포스포리파제 A), PlcB(포스포리파제 B), 등의 여러 독성 유전자들의 전사를 조절한다. 플라스미드 pGG55는 '클로람페니콜' 선택에 의해 생체 외에서 Lm-LLO-E7에 의해 보유된다. 그러나, Lm-LLO-E7에 의한 플라스미드의 생체내 보유를 위해, 돌연변이 prfA(D133V)의 카피를 운반하며, 이는 독성 유전자의 전사의 활성화 및 DNA 결합에 있어서 야생형 prfA보다 덜 활성적인 것으로 입증되었다. 돌연변이 prfA를 이용한 보완에 따라, 야생형 균주 10403S에 비해 Lm-LLO-E7로부터 분비된 LLO의 양이 약 40배 감소하였음을 관찰하였다. 이는, 균주 Lm-LLO-E7이 actA, inlA, inlB, inlC, plcB 등의 prfA에 의해 조절되는 독성 유전자들의 발현 감소를 나타낼 수 있음을 의미한다. Lm-LLO-E7에 있어서, prfA의 돌연변이 카피를 이용한 보완은, prfA에 의해 조절되는 서로 다른 독성 유전자들의 발현 감소를 야기할 수 있어서, 약 4~5로그의 전체적인 약독화가 발생할 수 있다.
실시예 11: 항문암 치료를 위한 화학방사선을 이용한 면역요법
I-II기 연구
자격 기준
* 새로 진단된 국소 진행된 항문암:
* 단계: T > 4 cm 또는 노드 +.
* PS 0-1
* CT/MRI 또는 PET 스캔에 의한 병기 결정.
* 심각한 심장 또는 폐 질환 없음. 적절한 골수 및 신장 기능.
ADXS - HPV 치료
* 1x109 cfu로 ADXS-HPV 투여
o 30분에 걸쳐 500 ml의 IV 주입
* ADXS-HPV 치료를 위한 예비투약
o 나프로신 500 mg BID, -1일, 0일
o 프로메타진 25 mg PO, BID(예비투여량, 8시간)
* 주입 후 항생제
o 암피실린 500 mg QID, 3~9일
치료 일정(도 23 내지 도 24 참조).
원격 전이 없이 4 cm 초과의 원발 종양 또는 림프절 침습과 함께 새로 진단된 항문암이 있는 환자가 자격이 있다. 모든 환자는 동시 방사선(강도 변조 방사선 요법[IMRT]에 의한 30 분할의 54 Gy)과 함께 미토마이신, 5-FU의 두 과정을 받는다. 환자는 약 28일마다 한번 정맥 주사로 ADXS-HPV, 1x109 콜로니 형성 유닛의 4차례 치료를 받는다. 치료 일정 #1(도 23)에서, 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 주어지고, 2 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 주어진다. 치료 일정 #2(도 24)에서, ADXS-HPV의 2차 투여량이 화학방사선 요법 중에 투여된다.
결과
8명의 환자가 국소 진행된 항문암 시험에 대해 치료되었다. 7명은 치료를 완료했고 질병의 증거를 갖고 있지 않다(NED)(표 1). (등급 5 관련 없는 심장 사건이 있는 환자만이 살아있지 않고 질병의 증거는 없다. - 표 1 참조)
Figure pct00007
독성
* 흔히 메페리딘을 필요로 하는 약 24시간 동안 지속되는 경직은 가장 흔한 독성이다.
* 세균 감염의 증거 없음.
* 화학방사선 요법과 중복되는 독성 없음(1 등급 3 호중구 감소증).
본 발명의 소정의 특징들이 예시되고 기술되었지만 많은 변형, 치환, 변경 및 등가물이 이제 숙련자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 바와 같은 모든 변형 및 변경을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA PATERSON, Yvonne <120> COMBINATION THERAPY FOR TREATING CANCER <130> P-78112-PC <140> PCT/US15/999999 <141> 2015-10-14 <150> 62/063,828 <151> 2014-10-14 <150> 62/065,973 <151> 2014-10-20 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 1 Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys 20 25 30 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 2 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp 435 440 <210> 3 <211> 529 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 3 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val 435 440 445 Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe 450 455 460 Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr 465 470 475 480 Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile 485 490 495 Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp 500 505 510 Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile 515 520 525 Glu <210> 4 <211> 416 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 4 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 <210> 5 <211> 390 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 5 Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile 1 5 10 15 Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu 35 40 45 Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg 50 55 60 Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn 85 90 95 Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu 100 105 110 Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His 115 120 125 Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys 130 135 140 Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp 145 150 155 160 Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala 165 170 175 Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu 180 185 190 Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys 195 200 205 Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu 260 265 270 Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu 275 280 285 Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg 290 295 300 Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala 305 310 315 320 Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp 325 330 335 Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe 340 345 350 Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser 355 360 365 Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn 370 375 380 Gly Arg Gly Gly Arg Pro 385 390 <210> 6 <211> 1170 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 6 atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60 atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120 aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180 gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240 gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300 aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360 gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420 aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480 aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540 agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600 aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660 cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720 ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780 ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840 tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900 gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960 acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020 atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080 agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 7 Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 8 Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met 1 5 10 15 Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 20 25 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 9 Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp 1 5 10 15 Glu Glu Leu Arg 20 <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 10 Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly 1 5 10 15 Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Arg <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Streptococcus sp. G148 <400> 11 Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Streptococcus equisimilis <400> 12 Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 13 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 13 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 14 <211> 105 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 14 Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu 1 5 10 15 Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser 20 25 30 Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His 35 40 45 Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met 50 55 60 Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln 100 105 <210> 15 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 15 Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu 35 40 45 Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly 50 55 60 Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu 85 90 95 Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn 100 105 110 Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys 115 120 125 Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met 130 135 140 Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu 145 150 155 <210> 16 <211> 158 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 16 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val 145 150 155 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ggctcgagca tggagataca cc 22 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ctccctcgag atcataattt acttcatc 28 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gcggatccca tggagataca cctac 25 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gctctagatt atggtttctg ag 22 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 24 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 25 Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 26 Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile 1 5 <210> 27 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala Cys Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys 20 25 30 Cys Cys Gly Gly Gly Ala Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala 35 40 45 Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr 50 55 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADV451 forward primer <400> 28 cctagctaaa tttaatgt 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADV452 forward primer <400> 29 cctagctaaa tttaatga 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADV453 reverse primer <400> 30 taattttccc caagtagcag g 21

Claims (150)

  1. 인간 대상물에서 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는 방법으로서, 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항문 종양 또는 항문 암은 상피암인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 질 종양 또는 질 암은 질내 상피암인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후에 투여되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 전에 투여되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후 및 상기 재조합 리스테리아 균주의 1 내지 3회 추가투여 전에 투여되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주와 동시에 투여되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 재조합 리스테리아의 4회 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고 2차 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고, ADXS-HPV의 2차 투여량은 화학방사선 요법 중에 투여되고, 3차 내지 4차 투여량은 화학방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 미토마이신 및 플루오로우라실(5-FU) 및 방사선 요법을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 동시 방사선(강도 변조 방사선 요법에 의한 30 분할의 54 Gy)과 함께 미토마이신, 5-FU의 두 과정을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선 요법은 약 6주간 지속되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리스테리아는 내인성 prfA 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 돌연변이 prfA 유전자를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함함으로써 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암에 대한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 prfA 유전자는 D133V 돌연변이를 포함하는 PrfA 단백질을 암호화하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 PrfA 단백질은 prfA 게놈 돌연변이 또는 결실을 보완하는, 재조합 리스테리아.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LLO 단백질의 N-말단 단편은 서열번호 2를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 1 x 109 ~ 3.31 x 1010 유기물의 투여량으로 상기 인간 대상물에게 투여되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 투여 단계 전에, 동물 숙주를 통해 계대된, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주로 상기 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E7 항원을 포함하거나 그 발현을 유도하는 면역원성 조성물로 상기 인간 대상물을 접종하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 동결 또는 동결건조된 세포 은행에 보관된, 방법.
  28. 인간 대상물에서 항종양 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 종양 또는 암에 대해 인간 대상물을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 TNF-알파 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 효과기 세포에 의한 종양 침윤 증가를 포함하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 효과기 세포는 CD8+T 세포 또는 CD4+T 세포인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 에피토프 확산을 더 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 자가 유도된 종양 항원에 대한 광범위한 반응의 유도를 더 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 종양 미세환경에서 억제인자와 효과기 면역 세포의 전반적인 균형의 개선을 더 포함하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 억제인자와 효과기 면역 세포의 전신 균형의 개선을 더 포함하는, 방법.
  39. 인간 대상물에서 항문 또는 질 신생물을 치료하는 방법으로서, 화학방사선 요법과 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 신생물을 치료하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항문 신생물은 항문 상피내 신생물인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 질 신생물은 질 상피내 신생물인, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후에 투여되는, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 전에 투여되는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후 및 상기 재조합 리스테리아 균주의 1 내지 3회 추가투여 전에 투여되는, 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주와 동시에 투여되는, 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 재조합 리스테리아의 4회 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고 2차 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 방법.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고, ADXS-HPV의 2차 투여량은 화학방사선 요법 중에 투여되고, 3차 내지 4차 투여량은 화학방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 방법.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 미토마이신 및 플루오로우라실(5-FU) 및 방사선 요법을 포함하는, 방법.
  50. 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 동시 방사선(강도 변조 방사선 요법에 의한 30 분할의 54 Gy)과 함께 미토마이신, 5-FU의 두 과정을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제39항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선 요법은 약 6주간 지속되는, 방법.
  52. 제39항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리스테리아는 내인성 prfA 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  53. 제39항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 돌연변이 prfA 유전자를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함함으로써 상기 항문 또는 질 신생물에 대한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  54. 제39항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 prfA 유전자는 D133V 돌연변이를 포함하는 돌연변이 PrfA 단백질을 암호화하는, 방법.
  55. 제39항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 PrfA 단백질은 prfA 게놈 돌연변이 또는 결실을 보완하는, 재조합 리스테리아.
  56. 제39항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 방법.
  57. 제39항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LLO 단백질의 N-말단 단편은 서열번호 2를 포함하는, 방법.
  58. 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 1 x 109 ~ 3.31 x 1010 유기물의 투여량으로 상기 인간 대상물에게 투여되는, 방법.
  59. 제39항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주인, 방법.
  60. 제39항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 투여 단계 전에, 동물 숙주를 통해 계대된, 방법.
  61. 제39항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현되는, 방법.
  62. 제39항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 방법.
  63. 제39항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주로 상기 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  64. 제39항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E7 항원을 포함하거나 그 발현을 유도하는 면역원성 조성물로 상기 인간 대상물을 접종하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  65. 제39항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 동결 또는 동결건조된 세포 은행에 보관된, 방법.
  66. 인간 대상물에서 항신생물 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 제39항 내지 제65항 중 어느 한 항의 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 항문 또는 질 신생물에 대해 인간 대상물을 치료하는 방법으로서, 제39항 내지 제66항 중 어느 한 항의 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 제39항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 방법.
  69. 제39항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  70. 제39항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 TNF-알파 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  71. 제39항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 효과기 세포에 의한 신생물 침윤 증가를 포함하는, 방법.
  72. 제39항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 효과기 세포는 CD8+T 세포 또는 CD4+T 세포인, 방법.
  73. 제39항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 에피토프 확산을 더 포함하는, 방법.
  74. 제39항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 자가 유도된 신생물 항원에 대한 광범위한 반응의 유도를 더 포함하는, 방법.
  75. 제39항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 신생물 미세환경에서 억제인자와 효과기 면역 세포의 전반적인 균형의 개선을 더 포함하는, 방법.
  76. 제39항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 억제인자와 효과기 면역 세포의 전신 균형의 개선을 더 포함하는, 방법.
  77. 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 인간 대상물에서 항문 또는 질 종양 또는 암을 치료하기 위한 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 치료는 상기 대상물에게 화학방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암을 치료하는, 용도.
  78. 제77항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후에 투여되는, 용도.
  79. 제77항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 전에 투여되는, 용도.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후 및 상기 재조합 리스테리아 균주의 1 내지 3회 추가투여 전에 투여되는, 용도.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주와 동시에 투여되는, 용도.
  82. 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도는 상기 재조합 리스테리아의 4회 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 용도.
  83. 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고 2차 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 용도.
  84. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고, ADXS-HPV의 2차 투여량은 화학방사선 요법 중에 투여되고, 3차 내지 4차 투여량은 화학방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 용도.
  85. 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 미토마이신 및 플루오로우라실(5-FU) 및 방사선 요법을 포함하는, 용도.
  86. 제77항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 동시 방사선(강도 변조 방사선 요법에 의한 30 분할의 54 Gy)과 함께 미토마이신, 5-FU의 두 과정을 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  87. 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선 요법은 약 6주간 지속되는, 용도.
  88. 제77항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리스테리아는 내인성 prfA 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 용도.
  89. 제77항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 돌연변이 prfA 유전자를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함함으로써 상기 항문 또는 질 종양 또는 항문 또는 질 암에 대한 면역 반응을 유도하는, 용도.
  90. 제77항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 prfA 유전자는 D133V 돌연변이를 포함하는 돌연변이 PrfA 단백질을 암호화하는, 용도.
  91. 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 PrfA 단백질은 prfA 게놈 돌연변이 또는 결실을 보완하는, 재조합 리스테리아.
  92. 제77항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 용도.
  93. 제77항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LLO 단백질의 N-말단 단편은 서열번호 2를 포함하는, 용도.
  94. 제77항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 1 x 109 ~ 3.31 x 1010 유기물의 투여량으로 상기 인간 대상물에게 투여되는, 용도.
  95. 제77항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주인, 용도.
  96. 제77항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 투여 단계 전에, 동물 숙주를 통해 계대된, 용도.
  97. 제77항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현되는, 용도.
  98. 제77항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 용도.
  99. 제77항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주로 상기 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함하는, 용도.
  100. 제77항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E7 항원을 포함하거나 그 발현을 유도하는 면역원성 조성물로 상기 인간 대상물을 접종하는 단계를 더 포함하는, 용도.
  101. 제77항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 동결 또는 동결건조된 세포 은행에 보관된, 용도.
  102. 인간 대상물에서 항종양 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 제77항 내지 제101항 중 어느 한 항의 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  103. 제77항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 암에 대한 인간 대상물 치료는 상기 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  104. 제77항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 용도.
  105. 제77항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 용도.
  106. 제77항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 TNF-알파 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 용도.
  107. 제77항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 효과기 세포에 의한 종양 침윤 증가를 포함하는, 용도.
  108. 제77항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 효과기 세포는 CD8+T 세포 또는 CD4+T 세포인, 용도.
  109. 제77항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 에피토프 확산을 더 포함하는, 용도.
  110. 제77항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 자가 유도된 종양 항원에 대한 광범위한 반응의 유도를 더 포함하는, 용도.
  111. 제77항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 종양 미세환경에서 억제인자와 효과기 면역 세포의 전반적인 균형의 개선을 더 포함하는, 용도.
  112. 제77항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 억제인자와 효과기 면역 세포의 전신 균형의 개선을 더 포함하는, 용도.
  113. 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 리스테리아 균주는 재조합 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 인간 대상물에서 항문 또는 질 신생물을 치료하기 위한 이종 항원 또는 그 단편에 융합된 LLO 단백질의 N-말단 단편을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 개방 해독틀을 포함하고, 상기 치료는 상기 대상물에게 화학방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함함으로써, 상기 인간 대상물에서 상기 항문 또는 질 신생물을 치료하는, 용도.
  114. 제113항에 있어서, 상기 항문 신생물은 항문 상피내 신생물인, 용도.
  115. 제113항에 있어서, 상기 질 신생물은 질 상피내 신생물인, 용도.
  116. 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후에 투여되는, 용도.
  117. 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 투여 전에 투여되는, 용도.
  118. 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주의 1차 투여 후 및 상기 재조합 리스테리아 균주의 1 내지 3회 추가투여 전에 투여되는, 용도.
  119. 제113항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 상기 재조합 리스테리아 균주와 동시에 투여되는, 용도.
  120. 제113항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도는 상기 재조합 리스테리아의 4회 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 용도.
  121. 제113항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고 2차 내지 4차 투여량은 방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 용도.
  122. 제113항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아의 1차 투여량은 화학방사선 요법 전에 투여되고, ADXS-HPV의 2차 투여량은 화학방사선 요법 중에 투여되고, 3차 내지 4차 투여량은 화학방사선 요법 완료 후 28일마다 투여되는, 용도.
  123. 제113항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 미토마이신 및 플루오로우라실(5-FU) 및 방사선 요법을 포함하는, 용도.
  124. 제113항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학방사선 요법은 동시 방사선(강도 변조 방사선 요법에 의한 30 분할의 54 Gy)과 함께 미토마이신, 5-FU의 두 과정을 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  125. 제113항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선 요법은 약 6주간 지속되는, 용도.
  126. 제113항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리스테리아는 내인성 prfA 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 용도.
  127. 제113항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 돌연변이 prfA 유전자를 암호화하는 제2 개방 해독틀을 더 포함함으로써 상기 항문 또는 질 신생물에 대한 면역 반응을 유도하는, 용도.
  128. 제113항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 prfA 유전자는 D133V 돌연변이를 포함하는 돌연변이 PrfA 단백질을 암호화하는, 용도.
  129. 제113항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 PrfA 단백질은 prfA 게놈 돌연변이 또는 결실을 보완하는, 재조합 리스테리아 균주.
  130. 제113항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 용도.
  131. 제113항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LLO 단백질의 N-말단 단편은 서열번호 2를 포함하는, 용도.
  132. 제113항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 1 x 109 ~ 3.31 x 1010 유기물의 투여량으로 상기 인간 대상물에게 투여되는, 용도.
  133. 제113항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주인, 용도.
  134. 제113항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 투여 단계 전에, 동물 숙주를 통해 계대된, 용도.
  135. 제113항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현되는, 용도.
  136. 제113항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 상기 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 용도.
  137. 제113항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주로 상기 인간 대상물에 추가투여하는 단계를 더 포함하는, 용도.
  138. 제113항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E7 항원을 포함하거나 그 발현을 유도하는 면역원성 조성물로 상기 인간 대상물을 접종하는 단계를 더 포함하는, 용도.
  139. 제113항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주는 동결 또는 동결건조된 세포 은행에 보관된, 용도.
  140. 인간 대상물에서 항신생물 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 제113항 내지 제139항 중 어느 한 항의 병용 요법을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  141. 제113항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 항문 또는 질 신생물에 대한 인간 대상물 치료는 상기 재조합 리스테리아 균주를 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  142. 제113항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 경구 투여인, 용도.
  143. 제113항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 인터페론-감마 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 용도.
  144. 제113항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 TNF-알파 생산 세포의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 용도.
  145. 제113항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 T 효과기 세포에 의한 신생물 침윤 증가를 포함하는, 용도.
  146. 제113항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 효과기 세포는 CD8+T 세포 또는 CD4+T 세포인, 용도.
  147. 제113항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 에피토프 확산을 더 포함하는, 용도.
  148. 제113항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 자가 유도된 신생물 항원에 대한 광범위한 반응의 유도를 더 포함하는, 용도.
  149. 제113항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 신생물 미세환경에서 억제인자와 효과기 면역 세포의 전반적인 균형의 개선을 더 포함하는, 용도.
  150. 제113항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 억제인자와 효과기 면역 세포의 전신 균형의 개선을 더 포함하는, 용도.
KR1020177012858A 2014-10-14 2015-10-14 암 치료에서의 병용 요법 KR20170068560A (ko)

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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8791237B2 (en) 1994-11-08 2014-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of non-hodgkins lymphoma
US9012141B2 (en) 2000-03-27 2015-04-21 Advaxis, Inc. Compositions and methods comprising KLK3 of FOLH1 antigen
US8771702B2 (en) * 2001-03-26 2014-07-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-hemolytic LLO fusion proteins and methods of utilizing same
CA2829960A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 John Rothman Listeria-based adjuvants
WO2013138337A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Advaxis Suppressor cell function inhibition following listeria vaccine treatment
CN106456726A (zh) 2014-02-18 2017-02-22 阿德瓦希斯公司 生物标志物导向的多靶点免疫治疗
SG10202011841WA (en) 2014-04-24 2021-01-28 Advaxis Inc Recombinant listeria vaccine strains and methods of producing the same
MA41644A (fr) 2015-03-03 2018-01-09 Advaxis Inc Compositions à base de listeria comprenant un système d'expression de minigènes codant pour des peptides, et leurs procédés d'utilisation
KR20190082850A (ko) 2016-11-30 2019-07-10 어드박시스, 인크. 반복되는 암 돌연변이를 표적화하는 면역원 조성물 및 그것의 사용 방법
AR110730A1 (es) * 2017-01-05 2019-04-24 Advaxis Inc Vacunas de cepas recombinantes de listeria y método para usarlas en inmunoterapia de cáncer
WO2018170313A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Advaxis, Inc. Methods and compositions for increasing efficacy of vaccines
CN106978381A (zh) * 2017-03-23 2017-07-25 上海理工大学 prfA基因缺失单核细胞增生李斯特氏菌及制备方法
WO2019006401A2 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Advaxis, Inc. LISTERIA-BASED IMMUNOGENIC COMPOSITIONS COMPRISING HETERICCLIENT WILMS TUMOR PROTEIN ANTIGENS AND METHODS OF USE THEREOF
NZ762881A (en) 2017-09-19 2024-03-22 Advaxis Inc Compositions and methods for lyophilization of bacteria or listeria strains
CN111349645B (zh) * 2018-12-24 2022-05-17 上海若泰医药科技有限公司 一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8114414B2 (en) * 1994-11-08 2012-02-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treatment of cervical cancer
US7662396B2 (en) * 2001-03-26 2010-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for enhancing the immunogenicity of antigens
US6099848A (en) 1997-11-18 2000-08-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunogenic compositions comprising DAL/DAT double-mutant, auxotrophic, attenuated strains of Listeria and their methods of use
US6855320B2 (en) 2000-03-29 2005-02-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fusion of non-hemolytic, truncated form of listeriolysin O to antigens to enhance immunogenicity
CA2404164A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for enhancing immunogenicity of antigens
US8771702B2 (en) * 2001-03-26 2014-07-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-hemolytic LLO fusion proteins and methods of utilizing same
US7794728B2 (en) 2002-05-29 2010-09-14 The Regents Of The University Of California Attenuated Listeria spp. and methods for using the same
KR101192652B1 (ko) 2003-02-06 2012-10-19 앤저 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 비포식 세포로의 침투가 약화된 리스테리아, 리스테리아를 포함하는 백신, 및 그것의 사용방법
MXPA05008340A (es) 2003-02-06 2006-03-13 Cerus Corp Microbios de vida libre modificados, composiciones de vacuna y metodos de uso de los mismos.
EP1682173A4 (en) * 2003-10-15 2007-10-31 Medimmune Inc EPHA2 VACCINE ON LISTERIA BASE
US8906664B2 (en) * 2004-08-13 2014-12-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines
WO2007059030A2 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Llo-encoding dna/nucleic acid vaccines and methods comprising same
RU2462513C2 (ru) * 2007-05-15 2012-09-27 Трансген С.А. Векторы для множественной генной экспрессии
US8114484B2 (en) 2007-07-19 2012-02-14 Applied Materials, Inc. Plasma enhanced chemical vapor deposition technology for large-size processing
US9084747B2 (en) * 2009-11-11 2015-07-21 Advaxis, Inc. Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of HER2/NEU over-expressing tumors
US20110223187A1 (en) * 2010-02-15 2011-09-15 Vafa Shahabi Live listeria-based vaccines for central nervous system therapy
DK2640842T3 (en) * 2010-11-17 2018-08-13 Aduro Biotech Inc Methods and compositions for inducing an immune response to EGFRVIII
WO2013138337A1 (en) * 2012-03-12 2013-09-19 Advaxis Suppressor cell function inhibition following listeria vaccine treatment
KR101621470B1 (ko) 2013-07-31 2016-05-16 건국대학교 산학협력단 MoS2 박막 및 이의 제조방법
US20170080064A1 (en) * 2014-03-05 2017-03-23 Advaxis, Ins. Methods and compositions for increasing a t-effector cell to regulatory t cell ratio
SG10202011841WA (en) * 2014-04-24 2021-01-28 Advaxis Inc Recombinant listeria vaccine strains and methods of producing the same

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