KR20170067162A - 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents
수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수용성 진주분말 또는 이의 수용액을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진주분말은 인터페론-α 또는 인터페론-β의 유전자 발현을 증가시켜, 면역기능을 향상시키는 효과가 우수하여, 항바이러스제, 항암제 및 각종 면역질환에 대한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
바이러스는 유전자와 그를 둘러싼 껍질로 구성된 매우 간단하고 작은 생명체로, 인체에 감염되어 바이러스성 질환을 유발한다. 바이러스는 많은 성질이 세균과 달라서 일반적인 항생제로는 증식이 억제되지 않기 때문에 바이러스 감염증은 기존의 항생제로는 치료가 어려우며, 바이러스를 죽이는 항바이러스 제제로만 치료할 수 있다. 그러나 현재까지 바이러스 감염을 치료하는 항바이러스 제제의 종류나 수가 매우 빈약하여 대부분의 바이러스 감염증은 환자 스스로 치유하기를 기대하는 형편이다.
한편, 인터페론 알파(IFN-α)와 베타(IFN-β)는 모두 제1형 인터페론으로 면역세포 또는 바이러스에 감염된 세포가 생산하며, 바이러스에 감염된 세포뿐 아니라 감염되지 않은 세포에서도 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 매우 강력한 항바이러스 기능을 보여주는 면역 단백질이다. 또한, 인터페론은 바이러스 감염의 초기단계에 작용하며, 감염된 바이러스의 종류에 상관없이 증식을 억제해주는 성질을 가지고 있어서, IFN-α와 IFN-β는 다양한 바이러스의 감염을 막아줄 수 있으며, 결과적으로 여러 바이러스 감염증의 치료에 적용되고 있다. IFN-α와 IFN-β는 모두, IFN-α/β 수용체(IFNAR)에 결합하여 작용하여, 작용세포가 단백질 키나아제 R(protein kinase R; PKR)를 활성화하여, 상기 단백질이 eIF-2 단백질을 인산화하고, 인산화된 eIF-2가 eIF2B 단백질과 복합체를 형성하게 하고, 이들 복합체가 세포에서 단백질 합성을 방해하여 바이러스의 증식을 억제한다. 또한, 인터페론은 세포에서 주조직적합복합체(MHC) 단백질의 발현을 촉진하여, 바이러스에 대한 면역반응을 증가시키기도 한다. 실제로 인터페론은 다양한 바이러스 감염증 치료에 사용되고 있다. B형 간염 (hepatitis B) 및 C형 간염 (hepatitis C) 바이러스 감염증의 경우, 종종 다른 항바이러스제와 함께 인터페론을 치료에 이용한 결과, 바이러스 감염이 줄어들고 바이러스 감염이 완치된 경우가 있다. 또한, C형 간염 바이러스의 감염의 경우, 감염 후 즉시, 인터페론을 투여하면 만성 C형 간염 바이러스 감염이 나타나지 않았으며, 결과적으로 C형 간염 바이러스와 연관된 간암(hepatocellular carcinoma)의 발생도 줄어든 것으로 나타났다. 또한, 이들 인터페론은 자연살해세포(natural killer cells)나 대식세포(macrophages)를 활성화하여 바이러스에 대한 면역반응을 강화시킨다. 인터페론은 세포의 RNAse L 효소를 활성화하여 바이러스의 RNA를 분해하도록 하여, 바이러스 단백질이 합성되는 것을 더욱 억제한다. IFN-α 와 IFN-β는 바이러스 증식을 억제할 뿐 아니라, 다양한 면역세포에 작용하여 면역 조절기능도 한다. 또한, 인터페론은 세포에서 인터페론에 의해 자극된 유전자(interferon-stimulated genes, ISGs)들을 활성화시켜 다양한 기능을 유도하며, p53 단백질의 활성을 자극하여 바이러스에 감염된 세포가 죽도록 유도하기도 한다. 또한, 인터페론은 단순포진 바이러스(herpes simplex virus)의 피부 감염증에도 사용되고 있다. 인터페론 치료법은 다발성신경염(multiple sclerosis)과 같은 일부 자가면역질환의 재발을 막아주는 데에도 활용되고 있으며, 일부 종양의 치료에도 활용되고 있다.
한편, 진주분말(Pearl Powder)은 민물에서 양식된 진주로부터 얻어지며, 진주를 마이크론 크기의 미세분말로 분쇄한 원료로서, 물에 거의 녹지 않는 분말이다. 진주는 대부분 아라고나이트(aragonite)라는 탄산칼슘으로 구성되어 있으며, 그 외에 나트륨, 마그네슘 등의 미네랄로 구성되어 있다. 또한, 단백질과 비타민, 아미노산, 펩타이드 및 점액다당체 등의 유기물질이 소량 함유되어 있다. 진주분말은 다양한 기능성을 가진 것으로 오래전부터 알려진 소재로, 중국, 이집트 및 마야 등에서 피부미용에도 활용하였을 뿐 아니라 건강을 위하여 복용하기도 한 소재이다. 특히, 중국에서는 3000년 전부터 담수 진주를 수확하여 진주를 고운 분말로 만들어 수많은 미인들이 미용 및 건강식품으로 이용하였다. 이는 진주분말이 피부 대사를 촉진하고 피부톤을 유지시키며, 모공을 줄여주고 피부 발적을 감소시켜주고, 피부에 광채를 내고 피부를 부드럽고 윤기 있게 만들어 주는 기능이 있기 때문이다. 또한, 전통 중국 의약에서는 담수 진주 분말을 염증, 간질, 고혈압, 불면증, 시력감퇴 등의 다양한 질병의 치료에도 사용하여 왔으며, 노화를 늦추고 젊음을 유지하는 목적으로도 사용하였다. 그러나, 상기 수용성 진주분말이 인터페론의 발현을 증가시켜, 항바이러스, 항암 및 면역관련질환등에 사용되었다는 보고는 전혀 없었다.
이에 본 발명의 발명자는, 본 발명의 수용성 진주분말이 인터페론의 발현을 증가시켜 바이러스의 증식을 억제시킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
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본 발명의 목적은 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물을 제공함에 있다.
따라서, 본 발명은 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다. 본 발명의 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적 조성물, 피부 외용제 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 진주분말은 수용성 진주분말 또는 이의 수용액일 수 있다.
상기 수용성 진주분말은 진주분말로부터 칼슘만을 회수하는데 초점을 맞춘 기존의 방법과 달리 상온에서 0.01 내지 10%, 바람직하게는 0.2 내지 5%의 약산으로 진주분말의 이온화를 유도하고, 동결건조하여 이온화 및 유기성분의 소실이 최소화되었다. 본 발명에서 약산은 pH 4 내지 6.5의 산을 말하고, 약산의 종류는 한정되지는 않으나, 초산(acetic acid)이 바람직하다.
본 발명의 수용성 진주분말은 인터페론-α 또는 인터페론-β의 유전자 발현을 증가시킴으로써, 면역기능을 향상시킬 수 있어, 이를 항바이러스제, 항암제 및 각종 면역질환의 치료제로 유용하게 이용할 수 있다.
따라서, 상기 본 발명의 면역증강용 조성물은, 바이러스성 질환인 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬바이러스, 수포성구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 콕사키바이러스(Cossackievirus), 수족구바이러스(Enterovirus-71), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 구제역바이러스(Foot and mouth disease, FMD), 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 간염바이러스 B형, 간염바이러스 C형, 돼지열병바이러스, 소바이러스성 설사병(Bovine Viral Diarrhea Virus), 돼지생식기호흡기증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지오제스키병, 로타바이러스, 파보바이러스등이 일으키는 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 비바이러스성 질환인 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종 등의 종양을 비롯하여 다발성신경염(multiple sclerosis), 과민성 알레르기, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 관절 류머티스, 전신성 홍반(erythematisus)등의 면역질환을 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 이에 한정되는 것은 아니지만 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 파우더, 젤, 연고, 크림 등의 외용제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 항생제, 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피를리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
*19경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 수용성 진주분말의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 수용성 진주분말은 1일 0.0001~100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 면역증강용 외용제로 사용할 수 있다. 피부 외용제란 피부 상에 도포하여 사용하는 제제를 의미하는 것으로서, 화장료 또는 약제의 한 형태일 수 있다. 이 경우 피부 외용제의 제형은 크림, 젤, 연고, 액체, 파우더 또는 분무제일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 피부 외용제의 경우, 바람직한 효과를 위해서 본 발명에 따른 수용성 진주분말은 0.001~30 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 면역증가용 건강기능식품으로 사용할 수 있다.
상기 건강기능식품의 제형은 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등일 수 있다.
본 발명에 따른 수용성 진주분말은 건강기능식품의 제조에 사용할 경우에 식품 총 중량에 대해 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료의 제조에 사용할 경우에 상기 본 발명의 수용성 진주분말의 양은 전체 음료 100㎖를 기준으로 0.02 내지 5.00g, 또는 0.3 내지 1.0g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 건강기능식품으로 사용할 때, 필수 성분으로서 상기 화합물 외에 다른 성분을 포함할 수 있으며, 통상 첨가할 수 있는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 이에 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g의 비율로 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 수용성 진주분말은 인터페론-α 또는 인터페론-β의 유전자 발현을 증가시켜, 면역기능을 향상시키는 효과가 우수하여, 항바이러스제, 항암제 및 각종 면역질환에 대한 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 수용성 진주분말 및 이의 수용액 제조 공정을 나타낸 도이다.
도 2는 수용성 진주분말 수용액의 IFN-α 또는 IFN-β 유전자의 발현 증가 효과를 나타낸 도이다(a): IFN-α 유전자의 발현양 비교; b): IFN-β 유전자의 발현양 비교; 1번줄: 증류수를 식이한 생쥐에서의 발현양; 2번줄: 수용성 진주분말을 식이한 생쥐에서의 상대적인 발현양; 대조군과 비교한 IFN-α와 IFN-β 유전자의 발현양의 유의성은 P<0.01임).
도 3은 수용성 진주분말 수용액의 Ad5 바이러스 증식에 대한 효과를 나타낸 도이다(a):수용성 진주분말로 처리한 HEK293A 세포에서 Ad5 증식에 따른 형광의 양을 나타냄; b):수용성 진주분말의 HEK293A 세포 증식 효과; 1, 2번줄:수용성 진주분말을 2mg/ml 또는 1mg/ml 처리한 배양; 3번줄: 증류수로 처리한 배양. 모든 실험은 3번 반복하였으며, a)의 경우, 형광의 양을 비교한 결과의 유의성은 P<0.05; b)의 경우, 세포증식 효과는 증식 정도 차이에 대한 유의성이 없음).
도 4는 수용성 진주분말 수용액의 Ad5 바이러스 증식 억제효과의 지속성을 니타낸 도이다(rfu:임의의 형광단위; : 수용성 진주분말 수용액 처리 후, Ad5를 접종한 세포배양에서 보여주는 형광의 양; : 증류수 처리 후, Ad5를 접종한 세포배양에서 보여주는 형광의 양; 모든 실험은 3번 반복하였으며, 형광의 양의 차이에 대한 유의성은 P<0.05; 3일 경과 후, 그 차이가 없음).
도 2는 수용성 진주분말 수용액의 IFN-α 또는 IFN-β 유전자의 발현 증가 효과를 나타낸 도이다(a): IFN-α 유전자의 발현양 비교; b): IFN-β 유전자의 발현양 비교; 1번줄: 증류수를 식이한 생쥐에서의 발현양; 2번줄: 수용성 진주분말을 식이한 생쥐에서의 상대적인 발현양; 대조군과 비교한 IFN-α와 IFN-β 유전자의 발현양의 유의성은 P<0.01임).
도 3은 수용성 진주분말 수용액의 Ad5 바이러스 증식에 대한 효과를 나타낸 도이다(a):수용성 진주분말로 처리한 HEK293A 세포에서 Ad5 증식에 따른 형광의 양을 나타냄; b):수용성 진주분말의 HEK293A 세포 증식 효과; 1, 2번줄:수용성 진주분말을 2mg/ml 또는 1mg/ml 처리한 배양; 3번줄: 증류수로 처리한 배양. 모든 실험은 3번 반복하였으며, a)의 경우, 형광의 양을 비교한 결과의 유의성은 P<0.05; b)의 경우, 세포증식 효과는 증식 정도 차이에 대한 유의성이 없음).
도 4는 수용성 진주분말 수용액의 Ad5 바이러스 증식 억제효과의 지속성을 니타낸 도이다(rfu:임의의 형광단위; : 수용성 진주분말 수용액 처리 후, Ad5를 접종한 세포배양에서 보여주는 형광의 양; : 증류수 처리 후, Ad5를 접종한 세포배양에서 보여주는 형광의 양; 모든 실험은 3번 반복하였으며, 형광의 양의 차이에 대한 유의성은 P<0.05; 3일 경과 후, 그 차이가 없음).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실시예 1] 수용성 진주분말의 제조
수용성 진주분말 소재를 만들기 위하여, 저온에서 물리적 연삭법으로 가공되어, 대략 100nm 크기의 입자로 분쇄한 나노담수 진주분말(중국산 식품등급 나노 진주 파우더)을 0.2 내지 5%의 저농도 초산으로 상온에서 반응시켜 진주분말을 이온화를 유도하여, 탄산칼슘이 녹은 진주분말 용액을 제조하였다. 이후, 상기 이온화된 수용성 진주분말 용액을 여과지로 걸러서 이온화된 진주분말 용액을 회수한 후, 동결건조를 시켜 본 발명의 수용성 진주분말을 제조하였다. 이후, 동결건조된 수용성 진주분말을 물에 용해를 시켜 수용성 진주분말 수용액을 제조하였고, 상기 수용성 진주분말 또는 이의 수용액의 제조과정을 도 1에 대략적으로 나타내었다. 이 방법으로 얻어진 수용성 진주분말의 대부분은 칼슘 이온을 포함한 무기질이었지만, 약 0.5% 정도에 해당하는 유기성분도 포함하고 있다.
[
실시예
2] 수용성 진주분말의
식이에
따른 혈중 백혈구에서의 인터페론 유전자 발현에 대한 효과 확인
암컷 5주령 ICR 생쥐에 하루에 한 번씩, 한 마리 당 실시예 1에서 제조한 수용성 진주분말 수용액(20mg/ml)을 100㎕씩 3일간 경구 투여하였다. 대조군으로는 증류수를 100㎕씩 3일간 경구 투여하였다. 생쥐는 각 3마리씩 수용성 진주분말 투여군과 증류수 투여 대조군 두 그룹으로 나누어 진행하였다. 3일간 시료를 경구 투여한 후, 생쥐를 희생하여 혈액을 채취하고, 혈액의 세포로부터 RNA를 분리하였다. 혈액세포로부터 RNA의 분리는 QIAamp RNA Blood Mini Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 분리하였다. 분리된 RNA로부터 Doctor Protein cDNA Synthesis Kit(엠지메드, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, Real-time PCR을 이용하여 IFN-α와 IFN-β 유전자의 발현정도를 비교하였다. 실시간 PCR(Real-time PCR)은 Quanti Mix SYBR Kit (PhileKorea Technology, Korea)을 이용하여 ABI PRISM 7300 실시간 DNA 증폭기(Applied Biosystems, USA)로 증폭하여 RNA 양을 정량적으로 비교하였다. β-actin 유전자 증폭을 위하여, GGCACCAGGGTGTGATGG/ ACGGTTGGCCTTAGGGTTC 프라이머 세트를 사용하였으며, IFN-α 유전자의 증폭을 위하여 AGGACAGGAAGGATTTTGGA/ GCTGCTGATGGAGGTCATT 프라이머 세트를, IFN-β 유전자의 증폭을 위하여 CACAGCCCTCTCCATCAACT/GCATCTTCTCCGTCATCTCC 프라이머 세트를 이용하였다. 실시간 PCR 반응은 모두 50에서 2분, 95에서 10분 동안 1 cycle 반응시키고, denaturation은 95에서 15초, annealing과 extension을 60에서 1분씩 총 40 cycle 증폭하였다. 각각의 증폭결과는 2-CT 방법으로 β-actin 유전자의 증폭결과로 보정하여 정량적으로 비교하였다 (Livak and Schmittgen, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-CT Method. Methods, 2001, 25 : 402 408). 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 수용성 진주분말을 식이한 생쥐의 말초 혈액세포는 대조군에 비하여 IFN-α와 IFN-β 유전자의 발현이 모두 5배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 상기의 결과는 수용성 진주분말은 소화관에서 흡수되어 혈액의 백혈구에 작용하여, 이들 IFN-α와 IFN-β 유전자의 발현을 증가시켜 주어 다양한 조직에서 바이러스의 감염을 억제할 수 있음을 보여주는 것이다.
[실시예 3] 수용성 진주분말 수용액의 바이러스 증식 억제 효과 확인
1.
GFP
단백질을 이용한 수용성 진주분말 수용액의 바이러스 증식 억제효과 확인
수용성 진주분말의 항바이러스 효과를 확인하기 위하여, HEK293A 세포에 GFP를 발현하는 Ad5 벡터 아데노바이러스(Invitrogen, USA)를 감염시키고, 감염된 Ad5 벡터 바이러스의 증식 결과로 나타나는 형광을 이용하여 바이러스의 증식 정도를 관찰하였다. GFP를 발현하는 재조합 Ad5 벡터 아데노바이러스는 Ad5 아데노바이러스에서 바이러스 DNA 복제에 필수적인 E1 유전자를 결실시켰으며, 또한 형광을 보여주는 eGPF 유전자가 삽입된 재조합 Ad5 아데노바이러스 벡터이다. 이 바이러스벡터는 E1 단백질을 생산하는 HEK293A 세포에 감염되면 E1 단백질을 보충받아 증식하여 새로운 Ad5 벡터 바이러스입자를 생산할 수 있다. 이와 같이, HEK293A/Ad5 시스템은 Ad5 벡터 아데노바이러스의 증식을 허용하는 숙주와 바이러스 체계로서, 감염된 바이러스의 증식 정도를 GFP 단백질의 형광의 양을 측정하여 간단한 방법으로 정량적으로 비교할 수 있는 방법이다(Andersson et al., 2010 Small-Molecule Screening Using a Whole-Cell Viral Replication Reporter Gene Assay Identifies 2-{[2-(Benzoylamino)Benzoyl]Amino}-Benzoic Acid as a Novel Antiadenoviral Compound. Antimicrob. Agents Chemother. 54; 38713877).
보다 구체적으로, HEK293A 세포를 배양 접시에 5×104되게 세포를 접종한 후, 수용성 진주분말을 2mg/ml 또는 1mg/ml 되게 첨가하고, Ad5 바이러스 5×103개를 접종하였다(숙주세포 대 바이러스 비율 MOI 0.1임). 대조군으로는 증류수를 첨가한 배양을 사용하였다. Ad5 벡터 아데노바이러스를 접종한 후, 2일째 되는 날 세포배양에서 형광의 양을 Synergy HT multi-mode microplate reader(BioTek®Instruments, Inc., USA)을 이용하여 측정하였다. 이의 결과를 도 3의 a에 나타내었다.
도 3의 a)에 나타난 바와 같이, 수용성 진주분말로 처리한 세포의 경우, 형광의 양이 증류수로 처리한 대조군에 비하여, 낮게 측정됨을 확인하였다.
또한, 바이러스 증식 억제 효과는 수용성 진주분말을 2mg/ml이 되도록 처리한 세포의 경우, 1mg/ml이 되도록 처리한 세포의 경우보다 더 강하게 나타남을 확인하여, 수용성 진주분말이 HEK293A 세포에서 농도비례적으로 Ad5 벡터 바이러스의 증식을 억제해주는 것으로 확인하였다.
2. MTT assay를 이용한 수용성 진주분말의 숙주세포 증식에 대한 영향 조사
상기 실시예 3.1과 같은 형광 감소 효과가 수용성 진주분말의 바이러스 증식의 억제로부터 오는지, 수용성 진주분말의 숙주 세포 증식 억제로부터 오는지 확인하기 위하여, TACS MTT assay kit (R&D system, USA)을 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 살아있는 세포의 양을 측정하였다. 간단히, HEK293A 세포를 배양접시에 5×104되게 접종한 후, 바이러스를 감염시키지 않고, 수용성 진주분말만을 2mg/ml 또는 1mg/ml 되게 첨가하고, 2일째 되는 날 각 well에 MTT용액을 첨가한 후 37에서 2시간 정도 침전이 형성될 때까지 배양하였다. 계면활성제(Detergent reagent)를 첨가하여 세포를 녹인 후, 595nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 양을 비교하였다. 이의 결과를 도 3의 b)에 나타내었다.
도 3의 b)에 나타난 바와 같이, 수용성 진주분말은 사용된 어떤 농도에서도 배양중인 HEK293A 세포의 증식에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 상기의 결과는 수용성 진주분말은 2mg/ml 또는 1mg/ml 농도에서 숙주세포의 증식에는 영향을 미치지 않으면서, 숙주세포에 감염된 Ad5 vector 아데노바이러스의 증식을 억제해주는 것을 보여주는 결과이다.
3. 감염 후 시간에 따른, 수용성 진주분말의 바이러스 증식 억제효과 확인
수용성 진주분말의 Ad5 벡터 아데노바이러스 증식 억제효과가 감염 후 시간별로 어떻게 나타나는지를 확인하여, 이의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 배양 2일까지는 수용성 진주분말을 첨가한 세포에서는 Ad5 벡터 아데노바이러스에 의한 GFP 형광양이 대조군에 비하여 느리게 증가하였으며, 배양 3일째부터는 비슷한 수준의 형광양을 보여주었다.
상기의 결과는 수용성 진주분말이 Ad5 벡터 아데노바이러스의 증식을 느리게 만드는 것을 보여주는 결과이며, 바이러스가 충분히 자라서 대부분의 숙주세포가 감염되는 배양 3일째에는 더이상 Ad5 벡터 아데노바이러스가 증식하지 못하기 때문에 세포의 형광양도 더이상 증가되지 않고, 대조군의 형광양과 같게 나타나는 것을 보여주는 결과이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (6)
- 인터페론-α 또는 인터페론-β의 발현을 증가시키는 수용성 진주분말의 제조방법에 있어서,
진주분말을 약산으로 이온화 하는 단계;
상기 이온화 된 진주분말 용액을 여과지로 걸러 이온화된 진주분말 용액을 얻는 단계; 및
상기 이온화된 진주분말 용액을 동결건조 시키는 단계;
를 포함하는 수용성 진주분말 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 약산의 농도는 0.2 내지 5%인 것을 특징으로 하는 수용성 진주분말 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 약산은 초산인 것을 특징으로 하는 수용성 진주분말 제조방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따라 제조된 수용성 진주분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 바이러스 감염에 의한 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 바이러스는 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬바이러스, 수포성구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 콕사키바이러스(Cossackievirus), 수족구바이러스(Enterovirus-71), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 구제역바이러스(Foot and mouth disease, FMD), 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 간염바이러스 B형, 간염바이러스 C형, 돼지열병바이러스, 소바이러스성 설사병(Bovine Viral Diarrhea Virus), 돼지생식기호흡기증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지오제스키병, 로타바이러스 및 파보바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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