KR20170066878A - 병풀 부정근 배양방법 - Google Patents

Abstract

유도체(elicitation) 처리를 통해 2차 대사산물 함량 증진을 모색하여 효율적으로 부정근을 대량생산할 수 있도록 한 병풀 부정근 배양방법이 개시되어 있다. 본 발명은, 기내 보유중인 병풀 부정근을 잘라서, 1MS (Murashige and skoog) 배지와 수크로오즈 5% 또는 NAA(naphthaleneacetic acid)을 혼합하여 사용한 배지에 접종하고, SA(Salicyclic acid)로 유도체 처리를 하여 배양되도록 하는 것을 특징으로 한다.

Description

병풀 부정근 배양방법{METHOD FOR CULTIVATING ADVENTITIOUS ROOT OF Centella asiatica (L.)}

본 발명은 병풀 부정근 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 병풀(Centella asiatica (L.)) 의 생장조절제 처리를 통해 부정근을 대량 증식할 수 있으며, 유도체(elicitation) 처리를 통해 2차 대사산물 함량 증진을 모색하여 효율적으로 부정근을 대량생산할 수 있도록 한 병풀 부정근 배양방법에 관한 것입니다.

병풀( Centella asiatica (L.) Urban)은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로, 상기 병풀의 추출물인 아시아티코사이드(asiaticoside), 마데카소사이드(madecassoside), 아시아틱 액시드(asiatic acid) 및 마데카식 액시드(madecassic acid) 등과 같은 매우 유용한 약리성분을 함유하고 있어 피부 질환 및 상처 치료에 탁월하고 항치매, 천식, 두통, 임질, 매독, 피부병, 나병, 위장병 등에 효과가 있어 질병 치료제의 원료로 사용되고 있다.

특히 현재 시판되고 있는 피부 질환 치료제 마데카솔은 주성분으로 아시아티코사이드 (40%), 아시아틱 액시드 (28%)와 마데카식 액시드 (28%)로 이루어져 있는 데 그 중 항염증 성분인 아시아티코사이드가 주된 생리 활성 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

그러나 병풀은 주로 고온 다습한 곳에서 자생하기 때문에 국내에서는 난대지방에 속하는 제주도 및 남부 지방의 섬 외에는 극히 제한되어 자생될 뿐이어서 국내에서는 자생상태에서 채취하여 이를 치료약의 재료로 이용하는데는 한계가 있으며, 또한 급속한 산업화에 따른 환경오염과 국토개발에 의한 서식지의 훼손으로 인하여 식물의 자생지와 집단 및 개체 수 감소가 현저하여 이들의 채집을 더욱 어렵게 하고 있어 지금은 거의 전량을 수입에 의존하고 있다.

더구나 병풀은 포복경을 통한 측생장을 하기 때문에 토지 단위 면적당 병풀 생산량이 저조하여 자생상태에서 배양하기에는 매우 비경제적인 폐단을 갖는 것이다.

이처럼 병풀 식물체내에 상기에서 언급한 유용물질의 합성량은 저조하기 때문에 인공적 합성이 필요하나 구조가 복잡하고 합성하는데 비용이 많이 들고 어렵기 때문에 식물체내 고합성을 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.

또한 병풀 식물체를 아그로박테리움 리조지니스로 형질전환시켜 성장이 매우 빠른 모상근으로 유도하는 방법과 세포배양하는 방법 등을 이용하기도 하였으나, 전자는 병풀 조직내 유용물질인 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량이 매우 저조한 단점과 후자는 생산성이 너무 낮은 단점을 갖는 것이어서 모두 병풀 식물체의 재배에 있어서 유용한 방법이 되지 못한다.

아울러, 병풀 기내 배양에 대한 연구는 Solet 등(1993)의 세포배양에 의한 thiocholchicine의 thiocolchicoside로의 전환에 관한 biotransformation 연구 밖에 없으며, 특히 국산 병풀에 관한 기내 배양보고가 없어 병풀의 부정근을 통한 대량 증식체계의 확립과 2차대사사산물 생산 연구는 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 병풀(Centella asiatica (L.)) 의 생장조절제 처리를 통해 부정근을 대량 증식할 수 있으며, 유도체(elicitation) 처리를 통해 2차 대사산물 함량 증진을 모색하여 효율적으로 부정근을 대량생산할 수 있도록 한 병풀 부정근 배양방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 병풀 부정근 배양방법은,

기내 보유중인 병풀 부정근을 잘라서, 1MS(Murashige and skoog) 배지와 NAA(naphthaleneacetic acid) 또는 IBA를 혼합하여 사용한 배지에 접종하여 배양하도록 하는 것을 특징으로 한다.

상기 배양방법은, 기내 보유중인 병풀 부정근을 소정 길이로 자르는 단계; 1MS (Murashige and skoog, 1962) 배지에 NAA(naphthaleneacetic acid) 또는 IBA를 혼합하여 배지를 제조하는 단계; 상기 병풀 부정근을 상기 배지에 접종하는 단계; 및 상기 접종된 병풀 부정근을 암조건, 23±1℃에서 4주간 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제 2실시예에 따른 병풀 부정근 배양방법은,

기내 보유중인 병풀 부정근을 잘라서, 1MS (Murashige and skoog) 배지와 수크로오즈 5% 또는 NAA(naphthaleneacetic acid)을 혼합하여 사용한 배지에 접종하고, SA(Salicyclic acid)로 유도체 처리를 하여 배양되도록 하는 것을 특징으로 한다.

상기 배양방법은, 기내 보유중인 병풀 부정근을 소정 길이로 자르는 단계; 1MS (Murashige and skoog) 배지와 수크로오즈 5% 또는 NAA(naphthaleneacetic acid) 1 mg/L의 양으로 혼합하여 배지를 제조하는 단계; 상기 병풀 부정근을 상기 배지에 접종하는 단계; 상기 접종된 병풀 부정근을 암조건, 23±1℃에서 95rpm 진탕배양기에서 액체현탁배양하는 단계; 및 배양 3주차에 Salicyclic acid (SA)로 유도체(elicitation) 처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 병풀(Centella asiatica (L.)) 의 생장조절제 처리를 통해 부정근을 대량 증식할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 유도체(elicitation) 처리를 통해 2차 대사산물 함량 증진을 모색하여 효율적으로 부정근을 대량생산할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 IBA와 NAA의 단용, 혼용 및 다양한 농도에 따른 병풀 부정근의 증식 효과를 나타내는 사진이다.
도 2는 IBA와 NAA의 단용, 혼용 및 다양한 농도에 따른 병풀 부정근의 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 처리 1주일 후에 병풀 부정근상에 나타난 유도체 처리(MeJA, SA, LA, YE)의 효과를 보여주는 사진이다.
도 4는 병풀 부정근에 유도체 처리에 의한 영향에 따른 배양 4주 후의 전기전도도(EC) 및 pH를 보여주는 그래프이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명에 따른 병풀 부정근 배양방법의 다양한 실시예에 대하여 설명한다.

(실시예 1)

기내 보유중인 병풀 부정근을 1cm 길이로 잘라서, 1MS (Murashige and skoog, 1962) 배지에 수크로오즈 5%, NAA(naphthaleneacetic acid) 1 mg/L, 젤라이트(gelrite) 2.3 g/L의 양으로 첨가한 배지를 직경 55 mm plastic petri-dish 위에 분주하여, 암조건, 23±1℃에서 4주간 배양하여 부정근 증식 실험을 진행하였다.

증식 된 부정근의 부정근 출현율, 절편체 당 부정근 수, 부정근 길이를 측정한 결과, 하기 표 1과 도 1 및 도 2와 같은 결과를 얻을 수 있었다.

본 발명의 실시예 1에 의하면, 부정근 증식을 위하여 4주간 배양한 결과, 표 1에서 보는 바와 같이, 생존율은 모든 처리구에서 100%로 나타났으며, 절편체당 뿌리의 수는 IBA 처리구에서 NAA 단용, NAA와 IBA 단용보다 높았다. 특히 IBA 1 mg/L 처리구에서 뿌리의 수와 길이가 가장 길어 연속적 계대배양시 효율적이라 판단하였다. 부정근의 길이가 IBA 1 mg/L, NAA 1 mg/L에서 가장 길었으며 생체중 또한 가장 높았다. 병풀 부정근은 옥신류의 고농도처리나 혼용처리 보다 비교적 저농도로 처리하였을 때 증식에 효과가 높음을 확인할 수 있었다.

(실시예 2) Elicitor 처리

기내 보유중인 병풀 부정근을 1cm 길이로 잘라, 1MS (Murashige and skoog, 1962) 배지에 수크로오즈 5%, NAA(naphthaleneacetic acid) 1 mg/L의 양으로 첨가한 배지를 250 mL Erlenmeyer flask에 100 mL 분주하여, 암조건, 23±1℃에서 95 rpm 진탕배양기에서 액체현탁배양하였으며 Yeast extract은 3, 6 g/L로 배지를 만들 때 넣어 초기부터 elicitation 처리해주었다. 배양 3주차에 무처리, Methyl jasmonate (MeJA)와 Salicyclic acid (SA)를 각각 100, 200, 300 M, Linoleic acid (LA) 1, 5, 10 M로 처리 후 1주 후 수확하여 생육조사 하였다.

Elicitation 처리 한 부정근의 생체중, 건물중, 건물률을 측정한 결과 하기 표 2 및 도 3 의 결과를 얻었다. 또한, 배지의 pH, EC(dS/cm)를 측정하여 도 4의 결과를 도출하였다.

본 발명의 제 2실시예에 따르면, Elicitation 처리 후 무처리에 비하여 SA 처리를 제외한 모든 처리에서 생체중이 감소하였다. 특히, Yeast extract 처리는 생장을 증가시킨다는 기존의 문헌과 달리 무처리에 비하여 약 13배 이하로 생체중이 저조하였으나 건물률은 가장 높았다. MeJA 처리 또한 생장이 약 1.5배 이하로 감소하였으며 농도가 증가할수록 생장 감소가 크게 나타났다. 반대로, SA 처리의 경우 무처리보다 생장이 증가하였다. LA 처리 역시 무처리와 비교하였을 때 생장에 영향을 끼치지 않았다(표 2 참조). Elicitation 처리 후 생장이 저조하였던 MeJA와 YE 처리의 경우 부정근의 색이 무처리에 비하여 진하게 변화하였다(도 3 참조).

pH의 경우 생장이 저조했던 MeJA와 YE에서 pH가 비교적 낮았으며, EC의 경우 생장이 활발하였던 SA와 LA에서 낮음을 알 수 있었으며 이는 EC 값이 낮을수록 Bioreactor에서 부정근 생장에 좋은 영향을 준다는 기존의 연구들과 일치하는 것을 알 수 있다.

Claims (4)

1. 기내 보유중인 병풀 부정근을 잘라서, 1MS(Murashige and skoog) 배지와 NAA(naphthaleneacetic acid) 또는 IBA를 혼합하여 사용한 배지에 접종하여 배양하도록 하는 것을 특징으로 하는 병풀 부정근 배양방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 배양방법은,
   기내 보유중인 병풀 부정근을 소정 길이로 자르는 단계;
   1MS (Murashige and skoog, 1962) 배지에 NAA(naphthaleneacetic acid) 또는 IBA를 혼합하여 배지를 제조하는 단계;
   상기 병풀 부정근을 상기 배지에 접종하는 단계; 및
   상기 접종된 병풀 부정근을 암조건, 23±1℃에서 4주간 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 병풀 부정근 배양방법.
3. 기내 보유중인 병풀 부정근을 잘라서, 1MS (Murashige and skoog) 배지와 수크로오즈 5% 또는 NAA(naphthaleneacetic acid)을 혼합하여 사용한 배지에 접종하고, SA(Salicyclic acid)로 유도체 처리를 하여 배양되도록 하는 것을 특징으로 하는 병풀 부정근 배양방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 배양방법은,
   기내 보유중인 병풀 부정근을 소정 길이로 자르는 단계;
   1MS (Murashige and skoog) 배지와 수크로오즈 5% 또는 NAA(naphthaleneacetic acid) 1 mg/L의 양으로 혼합하여 배지를 제조하는 단계;
   상기 병풀 부정근을 상기 배지에 접종하는 단계;
   상기 접종된 병풀 부정근을 암조건, 23±1℃에서 95rpm 진탕배양기에서 액체현탁배양하는 단계; 및
   배양 3주차에 Salicyclic acid (SA)로 유도체(elicitation) 처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 병풀 부정근 배양방법.
   
   

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