KR20170064533A

KR20170064533A - 이상 단일 사슬 인슐린 유사체

Info

Publication number: KR20170064533A
Application number: KR1020177006438A
Authority: KR
Inventors: 마이클 웨이쓰
Original assignee: 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티
Priority date: 2014-10-06
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2017-06-09
Also published as: AU2015328222B2; US20180265560A1; EP3204410A2; US11142560B2; KR102569743B1; US10392429B2; JP2017536337A; AU2015328222B9; CA2961037A1; EP3204410B1; IL251503A0; US20190375814A1; WO2016057529A2; BR112017004544A2; CN107108716A; WO2016057529A3; EP3204410A4; AU2015328222A1; JP6829928B2

Abstract

단일 사슬 인슐린은 C-도메인의 N-말단 측에서 적어도 2개의 산성 잔기 및 C-도메인 펩티드의 C-말단 측에서 적어도 2개의 염기성 잔기를 포함하는 6개 내지 11개 아미노산 잔기의 C-도메인, 인간 인슐린의 A8에 해당하는 위치에서 염기성 아미노산 잔기, 및 인간 인슐린의 A14에 해당하는 위치에서 산성 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 C-도메인은 상기 산성 및 염기성 잔기들 사이에 2개 내지 4개의 아미노산 조인트 영역을 포함할 수 있다. 잔기 C1 및 C2는 -1 또는 -2의 순음전하를 가질 수 있고, 나머지 C-도메인은 2개의 염기성 잔기로서 완결된다. 약학적 조성물은 7.0 내지 8.0의 범위내의 pH에서 제형화된 상기 단일 사슬 인슐린을 포함하고, 0.6 mM 내지 5.0 mM의 농도 및/또는 U-100 내지 U-1000의 강도로 제형화될 수 있다.

Description

이상 단일 사슬 인슐린 유사체{Biphasic Single-Chain Insulin Analogues}

연방정부가 지원한 연구 및 개발에 대한 진술

본 발명은 보조금 번호 DK040949 및 DK074176하에서 미국 국립보건원에 의해 수여된 협력 협정하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 일정 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 증가된 열역학적 안정성, 실온보다 높은 온도에서 열적 피브릴화(thermal fibrillation)에 대한 증가된 저항성, 감소된 미토겐성(mitogenicity), 및/또는 변경된 약동학적 및 약력학적 특성, 즉 (a) 해당하는 식사시(prandial) 또는 야생형 인간 호르몬의 가용성 제형과 유사한 신속작용 성분(fast-acting component) 및 (b) 야생형 인슐린 또는 인슐린 유사체의 NPH 제형과 유사한 지연 성분(prolonged component)에 대한 작용의 이상 시간 경로(biphasic time course)를 부여하는 것과 같은 향상된 약학적 특성을 나타내는 폴리펩티드 호르몬 유사체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 (i) 첫 번째 및 두 번째 위치에서 산성 잔기를 갖는 A 도메인과 B 도메인 사이의 새로운 부류의 단축된(foreshortened) 연결 (C) 도메인을 포함하고, (ii) 위치 A8에서 아미노산 치환을 포함하고, (iii) 위치 A14에서 산성 잔기를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되는 인슐린 유사체에 관한 것이다. 길이 6 내지 11 잔기들 중에서, 이러한 부류의 C 도메인은 야생형 프로인슐린(proinsulin)과 유사하게, N-말단 산성 구성요소(element) 및 C-말단 절편 염기성 구성요소로 이루어진다. 본 발명의 단일 사슬 인슐린 유사체는 신속 작용을 부여하는 것으로 당업계에서 알려진 위치 B28 및 B29와 같은, A 또는 B 도메인 내의 다른 부위에서 표준 또는 비표준 아미노산 치환을 선택적으로 포함할 수 있다.

치료제 및 백신을 비롯한 비표준 단백질들의 조작은 광범위한 의학적 및 사회적인 이점을 가질 수 있다.

천연 단백질(일반적으로 인간, 다른 포유동물, 척추 생물, 무척추 생물, 또는 진핵 세포의 게놈에서 암호화된)은 다수의 생물학적 활성을 부여할 수 있다. 비표준 단백질의 이점은 암세포의 성장의 촉진과 같은 의도하지 않거나 바람직하지 못한 부작용과 관련된 상동(homologous) 세포 수용체에의 감소된 결합과 같은 선택적인 활성을 달성할 수 있다는 것이다. 사회적인 이점의 또 다른 예는 운반, 분포 및 사용을 촉진하는 것으로, 실온 이상의 온도에서 분해에 대한 증가된 저항성일 수 있다. 치료 단백질의 예는 인슐린에 의해 제공된다. 야생형 인간 인슐린 및 다른 포유동물의 게놈에서 암호화되는 인슐린 분자들은, RNA 스플라이싱의 택일적인 모드 또는 전사후 당화의 선택적인 패턴을 통해 발생된 수용체 아형에 상관없이, 다수의 장기 및 여러 종류의 세포에서 인슐린 수용체에 결합한다. 또한, 야생형 인슐인은 상동의 제1형 인슐린 유사 성장 인자 수용체(IGF-1R)에 더욱 낮은 친화력으로 결합한다.

추가의 의학적 이점의 예는, 인슐린 작용의 시간 과정이 두 개의 상, 즉 신속 상 및 지연 상을 가지도록 하는 가용성 제형의 약동학적 특성의 최적화일 수 있다(도 1). 신속 상 및 지연 상의 이러한 조합은 아연 이온 및 프로타민 또는 포로타민 관련 염기성 펩티드와 조합하여 제조된 동일 유사체의 미소결정성 현탁액과 아연 인슐린 유사체 헥사머(인슐린 리스프로(lispro) 및 인슐린 아스파르트(aspart) 등에 의해 제공된)의 용액의 혼합물에 의해 부여되는 것으로 당업계에서 알려져 있다. 상기 전자의 현탁액 성분은 당업계에서는 중성 프로타민 헤지돈(Neutral Protamine Hagedorn (NPH)) 미소결정성 현탁액으로 알려져 있다. 당업계에서 알려진 예비혼합된 인슐린 생성물은 여러 가지 비율의 이러한 두 성분, 예를 들어, 25% 가용성 상 및 75% 미소결정성 상, 30% 가용성 상 및 70% 미소결정성 상, 또는 50%의 각각의 상을 포함한다. 이러한 예비혼합된 생성물은 식사시(신속 작용) 인슐린 제형(또는 식사시 인슐린 유사체 제형) 및 야생형 인슐린 또는 인슐린 유사체의 NPH 미소결정성 현탁액의 개별적인 투여와 비교하여 사용이 용이하고 피하 주사의 횟수가 감소되기 때문에 개발도상국의 당뇨병 환자들에 의해 널리 사용되고 있다. 또한, 예비혼합된 이상 인슐린 생성물에 의해 제공된 인슐린의 인슐린 요법의 단순화는 (i) 식사시 인슐린 유사체 제형 단독에 의한 치료가 부분최적화된 혈당 조절 또는 과도한 체중 증가를 유발하거나, (ii) NPH 인슐린 생성물 또는 기본 인슐린 유사체 제형 단독에 의한 치료가 식사 후 3 시간 이내에 혈당 농도의 증가로 인해 부분최적화된 혈당 조절을 유발하는 부유한 사회의 당뇨병 환자, 또는 (iii) 경구 작용제(예, 메트포르민)의 첨가가 만족스러운 혈당 조절을 유발하지 않는 상기 두 부류의 환자에게 이점이 있는 것으로 입증되었다.

기존의 이상 인슐린 생성물은 NPH 미소결정을 성장시키기 위해 필요한 발효후 및 정제후 단계들로 인해 복잡하고 값비싼 제조 방법을 필요로 한다. 또한, 이러한 생성물은 상기 가용성 및 미소결정성 성분들 모두는 실온 초과의 온도에서 물리적 및 화학적으로 분해될 수 있는 고유한 감수성이 있다. 이들 예비혼합된 생성물의 이상(biphasic) 약동학적 특성은 상기 가용성 상 및 미소결정성 상 사이의 인슐린 분자들의 교환으로 인해 실온 초과의 온도에서 바이알의 보관시 변화할 수 있다. 끝으로, 미소결정성 현탁액의 사용은, 주사기 내로 주입된 미소결정들의 수가 동일 바이알로부터 인출하는 경우에도 인출시마다 변화할 수 있기 때문에, 투여의 불확실성과 관련이 있을 수 있다.

기존의 이상 인슐린 생성물의 상기 단점들을 고려하면, 단일 성분 가용성 용액으로서의 그의 약동학적 특성이 인슐린 작용의 이상 패턴을 부여하는 인슐린 유사체의 조작을 통해 이상 인슐린 제형의 치료적 및 사회적 이점이 향상될 수 있다. 추가의 이점은, 신규한 가용성 인슐린 유사체가 제조하기가 더욱 간단하고 비용이 덜 들고(즉, 미소결정화의 요건을 회피함으로써)/들거나 신규한 가용성 인슐린 유사체가 실온 이상의 온도에서 야생형 인슐린과 비교하여 화학적 및 물리적 분해에 대하여 더욱 내성이 있는 경우에 발생할 수 있었다. 실온 이상의 온도에서 이러한 분해에 대한 내성은 전기 및 냉장이 시종일관 이용될 수 없는 개발도상국의 영역에서 사용을 용이하게 하는 것으로 기대된다. 이러한 분해에 의해 제기된 도전과제는 아프리카 및 아시아에서 당뇨병의 계류중인 유행으로 인해 더욱 깊어진다. 피브릴화는 실온 초과의 온도에서 분해의 주요한 경로를 나타내기 때문에, 피브릴화 내성 제형을 디자인하면 이러한 도전 영역에서 인슐린 대체 치료의 안전성 및 효능리 향상될 수 있다. 여전히 추가적인 치료적 및 사회적인 이점은, 가용성 이상 인슐린 유사체가 인간 암세포주의 인슐린 촉진 증식을 모니터하기 위해 개발된 분석법에서 감소된 미토겐성(mitogenicity)을 나타내는 경우에 발생할 수 있었다.

인슐인의 투여는 당뇨병의 치료를 위해 오랫동안 확립되어 왔다. 당뇨병 환자에서 통상적인 인슐린 대체 요법의 주요한 목적은 혈당 농도를 타이트하게 조절하여 건강한 인간 개체의 특징적인 정상 범위 초과 또는 미만으로 그 혈당 범위가 벗어나는 것을 예방하는 것이다. 정상 범위 미만으로 감소하는 것은 즉각적인 아드레날린 및 신경저혈당 증상과 관련이 있는데, 이러한 증상은 심한 경우 경련, 혼수 및 사망을 유발한다. 정상 범위를 초과하여 증가하는 것은 망막 병증, 맹목 및 신부전을 비롯한, 미소혈관 질환의 증가된 장기 위험과 관련이 있다. 인슐린은 척추동물의 대사에서 주요한 역할을 하는 작은 구형 단백질이다. 인슐린은 두 개의 사슬, 즉, 21개의 사슬을 포함하는 A 사슬 및 30개의 사슬을 포함하는 B 사슬을 포함한다. 그 호르몬은 췌장의 β-세포에서 Zn² ⁺-안정화 헥사머로 저장되지만, 혈류에서는 Zn² ⁺-이 없는 단량체로 존재한다. 인슐린은 단일 사슬 전구체인 프로인슐인의 생성물인데, 프로인슐린에서는 연결 영역(35개 잔기)이 B 사슬의 C-말단 잔기(잔기 B30)를 A 사슬의 N-말단 잔기에 연결한다. 다양한 증거는 프로인슐린은 인슐린 유사 코어 및 무질서한 연결 펩티드로 구성되어 있다는 것을 나타내고 있다. 세 개의 특정의 디설파이드 브릿지(disulfide bridge) (A6 내지 A11, A7 내지 B7, 및 A20 내지 B19)의 형성은 조면 소포체(ER)에서 프로인슐린의 산화적인 접합에 결부되는 것으로 생각된다. ER로부터 골지(Golgi) 장치로의 수송 직후에 프로인슐린은 조립되어 가용성 Zn² ⁺-배위 헥사머를 형성한다. 엔도단백질 분해 절단(Endoproteolytic digestion) 및 인슐린으로의 전환은 미성숙 분비 과립에서 발생한 다음, 형태학적으로 축합(morphological condensation)된다. 성숙 저장 과립 내의 아연 인슐린 헥사머의 결정성 배열은 전자 현미경분석(EM)을 통해 시각화되어 왔다. 개개의 잔기들은 그 아미노산의 정체(일반적으로는 표준 3문자 암호를 이용하여), 그 사슬 및 서열 위치(일반적으로는 위첨자로서)에 의해 나타내어 진다. 본 발명에 속하는 것은, 인간 프로인슐인의 특징적인 36개 잔기 야생형 C 도메인 대신에 그리고 A 사슬의 위치 A8 및 A14 및 선택적으로 B 사슬의 위치 B28 및 B29에서의 아미노산 치환과 함께 N-말단 산성 모티프(motif) 및 C-말단 염기성 모티프를 포함하는 것으로, 길이 6 내지 11개 잔기의 신규한 단축된 C 도메인의 발명이다.

당뇨병의 치료를 위한 인슐린 및 인슐린 유사체의 제조, 보관 및 사용에서 중요한 고려사항인 피브릴화(fibrillation)는 더욱 높은 온도, 더욱 낮은 pH, 교반, 또는 우레아, 구아니딘, 에탄올 공용매, 또는 소수성 표면의 존재에 의해 증가된다. 현재의 미국 의약품 법규에 따르면, 인슐린은 피브릴화가 1% 이상의 수준으로 발생하는 경우 버려야 한다. 피브릴화는 온도가 높을수록 증가되기 때문에, 당뇨병 환자는 사용 전에 인슐린을 냉장 상태로 최적으로 유지하여야 한다. 인슐린은 25℃ 초과의 온도에서 매 10℃ 증가시마다 10배 이상의 분해 속도의 증가를 나타낸다. 따라서, 가이드라인은 30℃ 미만의 온도에서 보관, 바람직하게는 냉장 보관을 요구하고 있다. 기존의 이상 인슐린 생성물의 NPH 미소결정성 성분은 실온 초과의 온도에서 피브릴화를 받기 쉬울 뿐만 아니라, A 사슬 내의 기수분해 절단으로 인해 특이한 모드의 화학적 분해를 받기 쉬우며, 이러한 분해는 인슐린 또는 인슐린 유사체를 불활성화한다.

상기 NPH 미소결정 내의 인슐린 A 사슬의 절단은 화학적 결합의 파괴를 포함하는 과정을 나타낸다. 이러한 파괴는 인슐린 분자내의 원자들의 상실 또는 재배열을 유발할 수 있거나 여러 인슐린 분자들 사이의 화학적 결합의 형성을 유발하여, 중합체의 형성을 유발할 수 있다. NPH 미소결정 내의 A 사슬의 절단은 접혀진 상태의 표면에서 발생하는 것으로 생각되지만, 화학적 결합의 다른 변화는 단백질의 접혀지지 않은 상태 또는 단백질의 부분적으로 접혀지지 않은 상태에서 매개되므로, 그의 열역학적 안정성을 증가시키는 인슐린의 변형은 화학적 분해를 지연 또는 예방할 수 있다. 따라서, 인슐린 유사체의 바람직한 특성은 그의 변성의 자유 에너지(화학적 세제의 농도에 따라 나선(helix)-민감성 파장에서 원형 이색성(dichroism)을 통해 일반적으로 측정됨)가 야생형 인슐린의 것 이상이어야 하거나 현재 임상에 사용중인 식사시(신속 작용) 인슐린 유사체의 것 이상이어야 한다는 것이다.

또한, 인슐린은 물리적 분해를 받기 쉽다. 단백질 피브릴화의 현재의 이론은 피브릴화의 기작이, 응집하여 아밀로이드생성 핵(amyloidogenic nucleus)을 형성하는 부분적으로 접합된 중간체 상태를 통해 진행하는 것으로 가정하고 있다. 이러한 이론에 있어서, 천연 상태를 안정화하는 아미노산 치환은 부분적으로 접합된 중간체 상태를 안정화하거나 하지 않을 수 있고 천연 상태와 중간체 상태 사이의 자유 에너지 장벽을 증가(또는 감소)시키거나 시키지 않을 수 있다. 따라서, 그 현재의 이론은 피브릴화의 위험을 증가 또는 감소시키려는 2개 인슐린 분자내의 소정의 아미노산 치환의 경향은 전혀 예측될 수 없다는 것을 나타낸다. 인슐린 분자의 구조의 모델은 베타-시트들의 평행한 배열이 B-사슬들의 연속적인 스태킹(stacking) 및 A-사슬들의 연속적인 스태킹을 형성하면서 세 개의 알파-나선(천연 상태에서 확인되는 바와 같은)의 거의 완전한 비접합(unfolding)을 나타내는데, 사스들 사이 및 A-사슬 내의 천연 디설파이드 짝지음(disulfide pairing)이 유지된다. 이러한 평행한 크로스-베타 시트는 A 사슬의 N-말단과 B-사슬의 C-말단 사이의 실질적인 분리(30Å 초과)를 필요로 하는데, 그 말단들은 인슐린 단량체의 천연 상태에서는 보통은 아주 근접하여 있다(10Å 미만). 단축된 C-도메인을 갖는 단일 사슬 유사체의 피브릴화에 대한 현저한 저항성은 당업계에 알려져 있고, 단축된 C-도메인으로 인해 A-사슬의 N-말단과 B-사슬의 C-말단 사이의 거리가 프로토필라멘트(protofilament)에서 바람직하지 않게 되는 천연 디설파이드 짝지음을 갖는 단일 사슬 인슐린 유사체의 구조와 인슐린 프로토필라멘트 내의 평행한 크로스-베타 시트들의 벌어진 구조 사이의 위상적인 불일치(topological incompatibility)를 반영하는 것으로 생각된다. 단일 사슬 인슐린 유사체의 리본 모델이 도 2에서 도시되어 있고, 인슐린 부분(moiety)의 공간 채움 모델(space-filling model)이 조작된 연결 도메인의 역할을 강조하기 위해 도 3에서 도시되어 있다((C 도메인; 도 3에서 막대로 표시).

본 발명은 오늘날의 예비혼합된 일반적인 NPH 이상 인슐린 생성물이 것과 유사한 스케쥴로 1일에 2회 주사를 위해 예정된 중성 pH의 가용성 단일상 제형에서 이상 단일 사슬 인슐린 유사체를 조작하기 위한 의학적이고 사회적인 필요성에 의해서 동기를 받았다. 본 발명의 단일 사슬 디자인은 (i) 분해에 대한 내성을 (ii) 실질적인 셍체내 혈당강하 효능, (iii) IGF-1R에의 감소된 교차 결합 및 (iv) 미소결정성 현탁액으로 구성되는 성분의 부재하에서 본질적인 이상 약동학 및 약력학적 특성을 조합하기 위한 것이다. 따라서, 가용성의 단백질 용액으로서, 피하 주사시 이상 약력학 및 약동학적 특성을 나타내어 작용의 신속한 개시 및 작용의 지연된 종료(tail) 모두가 달성되도록 하여 "Humalog®Mix75/25" 또는 "NovaMix®30"으로 예시한 바와 같은 에비혼합 생성물들의 것과 유사한 전체 프로필을 유도하는 단일 사슬 인슐린 유사체를 발명하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이상 인슐린 유사체 제형은 선진국 및 개발도상국에서 임상적 이점이 있는 단순화된 1일에 2회 투여용 볼러스(bolus) 기반 용법을 제공한다. 또한, 단일 사슬 이상 인슐린 유사체 제형은 T2DM의 치료에서 널리 사용된 최초의 경구용 제제인 메트포르민에 의해서는 잘 조절되지 않는 인슐린 무경험 환자에서 개시될 수 있다. 두 개의 성분들의 약동학적 특성에 기반한 오늘날의 표준적인 NPH 예비혼합 생성물의 이상 작용의 기작은 도 4A에서 개략적으로 도시되어 있다. 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 본 발명의 유사체에 의한 이상 약동학적 특성의 가능한 기작이 도 4B에서 개략적으로 도시되어 있다.

본 발명자들은 본 발명의 생성물이, 더욱 복잡한 용법에 대한 그의 순응도가 불확실한 서양 사회의 환자에게 불균형하게 이로운 것으로 판단한다. 당업계에서는 건강 관리 결과 -및 T2DM 및 대사성 증후군과 같은 만성 질환에서 처방 용법의 장기 고수-는 사회경제적인 상태, 정식 교육, 가족 구조 및 문화적 신념 계통의 복잡한 함수인 것으로 알려져 있다. 실제로, 이러한 사회적인 이슈는 아프리카인, 아메리카인, 라틴 아메리카인 및 토착 아메리카인을 비롯한 소수 민족에서 증가하는 당뇨병 및 T2DM에 대한 염려가 증가하고 있다. 따라서, 본 발명의 단일 사슬 이상 인슐린 유사체 제형은, 기본 인슐린 요법 단독에 의해서는 혈당 조절이 불충분하지만 완전한 기본 볼러스 요법이 실시될 수 없는 인슐린을 필요로 하는 T1DM 및 T2DM 환자에게 이롭게 하기 위한 것이다.

따라서, 본 발명은 일 측면은 피하 주시시 이상 약동학 미 약략학적 특성을 제공하는 단일 사슬 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.

본 발명이 유사체는 위치 B10에서 히스티딘을 포함함으로써, 이러한 위치에서 산성 치환(아스파르트 산 또는 글루탐산)과 관련이 있는 발암에 관한 염려를 회피한다. 본 발명의 추가의 측면은 IR-A 및 IR-B에 대한 단일 사슬 인슐린 유사체의 절대 시험관내 친화력이 야생형 인간 인슐린을 기준으로 5 내지 100%의 범위에 있으므로, 호르몬 수용체 복합체 내에서 지연된 체류 시간을 나타내지 않는다는 것이다.

상기 특징들의 조합은 단축된 연결 폴리펩티드(길이 6 내지 11개 잔기)가 N-말단 산성 구성요소(잔기 C1 및 C2), 유연한 조인트 또는 힌지 (C3 및 C4), 및 천연 프로인슐린에서 관찰되는 것들과 유사한 염기성 잔기들의 쌍((C5 및 C6)을 포함하는 C-말단 단편을 포함하고 있는 신규한 C-도메인 디자인에 의해 부여된다. 상기 C-말단 길이에 대한 11의 상한계는 향상된 IGF-1R-결합 활성을 갖는 키메라 인슐린 유사체에서 설명된 12개 잔기 IGF-I-유래 링커 미만이도록 선택되었다(Kristensen, 등. 1995). 4의 하한계는 연결 도메인의 N-말단 부분에서 산성 부분(Glu-Glu 등)을 보존하고 연결 도메인의 C-말단 부분에서 염기성 부분(예, Arg-Arg 등)을 보존하도록 선택되었다. 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 본 발명자들은 상기 2개 잔기 산성 잔기가 유사체의 IGF-1R에의 결합시 바람직하지 못한 정전기적 반발을 도입하지만, 인슐린 수용체 아형에 의해 잘 허용되는 것으로 생각한다. 또한, 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 본 발명자들은 C-말단의 염기성 부분이 단순한 테더(tether) 또는 공간 구성요소보다는 부분적인 피하 응집에 기여하는 것으로 생각한다.

일반적으로, 본 발명은 본 발명의 C-도메인 및 위치 A8 및 A14에서 치환을 포함하는 변형된 A-사슬을 포함하는 단일 사슬 인슐린 유사체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 연결 도메인(C 도메인)이 4 내지 11개 잔기의 길이를 갖고 두 개의 구성요소(element)로 이루어져 있는 새로운 부류의 단일 사슬 인슐린 유사체에 속한다. 상기 N-말단 구성요소는 제1의 두 개의 잔기(C1 및 C2로 명명함, 연장된 인슐린 B-사슬의 잔기 B31 내지 B32에 해당함)로 구성되는데, 상기 C1 및 C2는 적어도 하나의 산성 결 사슬을 포함하고 pH 7.4에서 -1 또는 -2의 순형식 정전하(net formal electrostatic charge)를 갖는다. 상기 C-말단 구성요소는 Arg-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys 또는 Lys-Arg와 같은 2개의 염기성 잔기를 포함한다. 따라서, 4개 잔기 연결 도메인의 경우, 본 발명의 서열들은 Glu-Glu-Arg-Arg, Glu-Ala-Arg-Arg, Ala-Glu-Arg-Arg, Asp-Glu-Arg-Arg, Glu-Glu-Lys-Arg, Glu-Glu-Arg-Lys, 및 Glu-Glu-Lys-Lys를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 4개 초과의 길이(즉 5 개 내지 11개)의 연결 도메인의 경우 N- 과 C-말단 구성요소들의 사이에서, 그 연결 도메인은 유연한 조인트(flexible joint)를 포함한다. 6개 잔기 연결 도메인의 예에서, 이러한 서열들은 위치 C3 및 C4에서 Gly-Pro, Ser-Pro, Ala, Pro, Gly-Ser, Ser-Ser, Gly-Gly, 또는 Ala-Ala를 포함할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이러한 가능성으로 제한되는 것은 아니다. 상기 A-사슬은 산-촉매화 탈아미드화 또는 다른 모드의 Asn-관련 화학적 분해를 회피하기 위하여 A8에서 염기성 치환(리신, 아르기닌, 또는 히스티딘) 또는 A21에서 치환(Gly, Ala, 또는 Ser)을 포함한다. 일 예에서, 상기 B-사슬은 효소 내에서의 생합성 동안 Lys-특이적 단백질분해 절단을 회피하기 위하여 치환 Lys^B29→Arg를 또한 포함한다. 또한, 본 발명의 유사체는 안정성 및 활성을 향상하기 위한 목적으로 위치 A8에서 치환 (Ala, Glu, Gln, His, Lys, 또는 Arg), 및 아마도 야생형 TyrA14에 의해 유발된 역소수성(reverse-hydrophobic) 효과를 회피하고 추가의 음전하를 예방하기 위한 목적으로 A14에서 치환(Glu)을 포함한다. 또한, 위치 A14에서의 다른 가능한 치환이 고려된다.

본 발명은 증가된 열역학적 안정성, 실온보다 높은 온도에서 열적 피브릴화(thermal fibrillation)에 대한 증가된 저항성, 감소된 미토겐성(mitogenicity), 및/또는 변경된 약동학적 및 약력학적 특성과 같은 향상된 약학적 특성을 나타내는 폴리펩티드 호르몬 유사체를 제공할 수 있다.

도 1. 이상 인슐린 생성물의 개략도. 최초의 실시는 야생형 인슐린(표준 및 NPH)를 사용한 반면에, 오늘날의 생성물은 식사시 인슐린 유사체를 유용한다. 이러한 도면은 MedScape Multispeciality의 R. Beaser & S. Braunstein로부터 얻었다 (Education/CME section; 2009) (http://www.medscape.org/viewarticle/708784).
도 2. 57개 잔기 SCI의 리본 모델. α-나선은 적색(외측) 및 황색(내측)으로 도시되고, B24-B28 β-가닥은 청색(화살표)으로 도시된다. 세 개의 디설파이드 브릿지(시스테인)가 도시되어 있다(별표). C-도메인(서열 GGGPRR)은 잘 정렬되어 있다(Hua, Q.X. 등. J. Biol. Chem. 283, 14703-16 (2008)).
도 3. 57개 잔기 SCI 플랫폼(platform)의 분자 구조. 6개 잔기 C-도메인(막대; 하늘색)는 A- 및 B 도메인 사이에 테더(tether)(공간 채움으로 표시)를 제공한다. 표면은 표준 GRASP 포맷에서 정전위에 따라 컬러로 암호화된다(적색, 음전성; 자주색, 양전성; 및 백색, 중성). 이러한 이미지는 Weiss 실험실에서 NMR 연구에 기반하여 PDB entry 2jzq로부터 얻었다(Hua, Q.X. 등. J. Biol . Chem. 283, 14703-16 (2008)).
도 4. 종래 예 및 신규 예. (A) 현재의 이상 인슐린 생성물은 가용성 상(아연 헥사머; 녹색) 및 불용성 상 (NPH 미소결정성 현탁액; 청색)을 포함한다. (B) 제안된 신규한 예는 단량체성 인슐린 유사체 (I), 아연이 없는 이량체(I₂), 아연-안정화 및/또는 아연이 없는 핵사머 (I₆) 및 가용성 응집체(I_6n) 사이의 결합된 평형을 이용하고자 한다. TR 전이: 도시되지 않음.
도 5. 효소인 P. pastoris에서 Thermalin-이상(버젼 1 및 2)의 과발현. Coomasie-염색된 SDS-PAGE 겔: (A) 분자 질량 마커(a)에 대한 SCI-57PE (레인 b 내지 d). (B) 양성 대조구(f) 및 표준 (e)으로서 His^A8-미니프로인슐린 (MPI)에 대한 SCI-57DP (레인 g). SCI는 이동함 약 6 킬로-당톤 (K_d); 5.8 Kd에 근접한 미니-프로인슐린.
도 6. 당뇨병 쥐(400 ± 20 mg/dl의 시간 0 혈당)에게 1 유닛의 나타낸 인슐린 유사체/300 g 체중을 피하 주사했다. A. (X) Humalog (lispro) 대 (Δ) Humalog 25/75-Premix 대 (▲) 신선한 SCI-57PE (도면에서는 표지된 SCI-1) 대 (◆) 신선한 SCI-57DP (표지된 SCI-2) 대 (●) 희석제. B. 주사후 처음 1 시간 동안의 혈당 감소(동일한 기호 부호). 각 그룹의 쥐의 수(n)가 표시된다: 오차 막대, 표준 오차로 나타낸다.
도 7. 나타낸 인슐린 유사체의 1 유니트 피하 주사 후 [혈당]의 감소의 초기 속도: +는 45℃에서 25일간 교반된 SCI-57PE (표지된 SCI-1)를 나타내고, ++는 45℃에서 57일간 교반된 SCI-57DP (표지된 SCI-2)를 나타낸다. *p<0.05 모든 다른 인슐린과 비교하여. ** p<0.05 예비혼합된 리스프로 75/25와 비교하여. 데이터는 주사후 첫 번째 시간에 해당하는 것이다(도 8B 참조); 오차 막대, 표준 오차.
도 8. 당뇨병 쥐(410 ± 20 mg/dl의 시간 0 혈당)에게 1 유닛의 나타낸 인슐린 유사체/300 g 체중을 피하 주사했다. A. 신선한 시료: (◆) SCI-57DP (표지된 SCI-2), (△) Lantus (glargine), (X) Humalog (lispro), 및 (●) 희석제. A. 신신선한 인슐린. B. 고온에서 교반의 영향: (◆) 신선한 SCI-57DP 대 (□) 45℃에서 57일간 교반된 SCI-57DP 대 (○) 45℃에서 11일간 교반된 Lantus (glargine).
도 9. Lilly Co² ⁺-EDTA 격리(sequestration) 분석: 가시 파장 574 nm에서의 정규화 흡광도가 25℃에서 R₆ 코발트 인슐린 헥사머 또는 SCI-1 헥사머의 용액에 EDTA (10배 몰 과량)의 첨가후의 시간에 따라 도시되어 있다. 야생형 인슐린(흑색선): 시간 상수 6.3(±0.1) 분에 따른 단일 지수 전이(mono-exponential transition) (녹색선): 시간 상수 0.9(±0.1) 분(신속 상) 및 14.1(±0.1) 분(지연 상)에 따른 이상 전이; r²=0.998. 단백질은 1 mM NaSCN, 0.2 mM CoCl₂ 및 50　mM 페놀을 포함하는 50　mM Tris-HCl (pH 7.4)에서 3.5　mg/ml 이었다.

본 발명은 연장된 작용 기간, 5 내지 100%의 범위(하한계는 프로인슐린에 해당하도록 선택됨)의 절대 친화력을 갖는 야생형 인슐린의 것과 유사한 IR-A/IR-B 수용체 결합 친화성의 비, IGF-1R에 대한 증가된 구별, 위치 A21에서 화학적 분해에 대한 내성의 추정된 증가(Asn by Gly, Ala 또는 Ser의 치환으로 인해), 실온 초과의 온도에서 피브릴화에 대한 내성의 추정된 증가(단일 사슬 토폴로지로 인해), 및 열역학적 활성의 추정된 증가(부분적으로는, 염기성 곁사슬에 의한 Thr^A8 의 치환으로 인해; Arg, Lys, His, Orn)를 제공하는 단일 사슬 인슐린 유사체에 관한 것이다.

본 발명의 특징은 피하 침착물(subcutaneous depot)로 부터의 이상 흡수 동적특성(kinetics)이, 단백질의 투명하고 기용성인 단일상 용액으로 제형화되는 때 단일 사슬 인슐린 유사체에 의해 발생될 수 있다는 것이다. 당업계에서 알려진 바와 같은 통상적인 예비혼합된 생성물은 자기 조립의 상태들 사이의 가능한 결합된 평형들의 연속체의 극단(extreme end)을 나타낸다(도 4A). 신속 및 지연 흡수의 조합을 제공하기 위한 대안의 전략이 고려되는데, 이는 개략도인 도 4B에서 도시한 바와 같이 이러한 결합된 평형을 제어하는 속도 상수 및 상대적인 열역학적 안정성에 의존한다. 이러한 전략의 분자적 실시는 (i) 아연이 없는 단량체로서 아주 안정하고 (ii) 더욱 높은 정도의 응집을 받을 수 있는 안정한 아연-매개 헥사머(바이알 또는 펜에서 가용성이지만 침착물에서는 어쩌면 불용성임)를 형성할 수 있는 인슐린 유사체를 필요로 한다. 이론에 구속되는 것을 바라지는 않지만, 아연이 없는 단량체 및 이량체는 식사시(prandial) 성분을 제공할 수 있고, 아연-매개 헥사머 응집체는 장기 지속 성분을 제공할 수 있었다. 또한, 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 단일 사슬 인슐린 유사체는 혈류 내에서 단량체성 단백질 분자로 존재하는 경우, 그들의 호르몬-수용체 신호전달 복합체의 본질적인 특징을 통해 포적 세포에서 이상 신호전달 특성을 나타내어, 그의 약력학적 특성이 기존의 표준 NPH 예비혼합 생성물의 이상 약동학적 특성을 모방할 수 있다.

본 발명의 특징은 그 단일 사슬 유사체의 등전점이 6.8 내지 7.8 이어서, 가용성 제형이 6개 단백질 단량체 당 2 내지 3개의 아연 이온의 존재 또는 헥사머 조립이 불완전한 6개 단백질 단량체 당 2개 미만의 아연 이온의 존재하에서 중성 조건(pH 7.0 내지 8.0)하에서 가용성 제형이 가능하다는 것이다. 따라서, 본 발명의 특징은 단일 사슬 인슐린 유사체가 T₆ 인슐린 헥사머, T₃R^f ₃ 인슐린 헥사머 또는 R₆ 인슐린 헥사머로서 당업계에 알려져 있는 고전적인 아연 인슐린 헥사머와 유사한 단백질 헥사머의 아연 이온 독립적 형성을 받는 능력을 보유한다는 것이다.

또한, 상기 단일 사슬 유사체는 돼지, 소, 말 및 개과동물 인슐린과 같은 동물 인슐린 유래의 A- 및 B-도메인 서열을 이용하여 제조될 수 있는 것으로 생각된다. 부가적이거나 택일적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 잔기 B1 내지 B3의 결실을 포함할 수 있거나, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ), 스트렙토마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisciae ) 또는 다른 효소 발현 종 또는 균주에서 효소 생합성에서의 전구체 폴리펩티드의 Lys-지향 단백질가수분해를 회피하기 위하여 리신이 결실된 변이 B 사슬(예를 들어, 야생형 인간 인슐린에서 LysB29)와 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 단일 사슬 인슐린의 B-영역은 열역학적 안정성, 수용체 결합 친화성 및 피브릴화에 대한 내성을 증가시키기 위한 목적으로 위치 B20 및/또는 B23에서 D-아미노산과 같은 비표준 치환, Phe^B24의 2 고리 위치에서 할로겐 변형(즉, 오르토-F-Phe^B24, 오르토-Cl-Phe^B24, 또는 오르토-Br-Phe^B24; 열역학적 안정성 및 피브릴화에 대한 내성을 증가시키기 위한 목적), Phe^B24의 2-메틸 고리 변형(수용체-결합 친화성을 향상시키기 위한 목적), 및/또는 Tyr^B16 및/또는 Tyr^B26의 방향족 고리 내의 요오드 치환의 도입(3-모노-아이오도-Tyr 또는 [3,5]-디-아이오도-Tyr); 열역학적 안정성 및 수용체 결합 친화성을 향상시키기 위한 목적)을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, C-도메인 내의 Thr^B27, Thr^B30, 또는 하나 이상의 세린 잔기들이 단독 또는 조합으로 변형될 수 있는 것으로 생각되는데; 그 예들은 O-결합 N-아세틸-β-D-갈락토시피라노시다제(GalNAc-O^β-Ser 또는 GalNAc-O^β-Thr로 명명함), O-결합 α-D-만노피라노시다제(만노스-O^β-Ser 또는 만노스-O^β-Thr), 및/또는 α-D-글루코피라노시다제(글루코스-O^β-Ser 또는 글루코스-O^β-Thr로 명명함)에 의해 제공된다.

또한, 인간과 동물 인슐린들 사이의 유사성 및 인간 당뇨병 환자에서 과거의 동물 인슐린의 사용을 고려하면, 인슐린의 서열의 다른 덜 중요한 변형, 특히 보존적인 것으로 간주된 변형들이 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노 산들의 추가의 치환이 본 발명을 벗어나지 않고, 유사한 곁사슬들을 갖는 아미노산들의 그룹 내에서 이루어질 수 있다. 이에는 하기의 중성 소수성 아미노 산들이 포함된다: 알라닌 (Ala 또는 A), 발린 (Val 또는 V), 루신 (Leu 또는 L), 이소루신 (Ile 또는 I), 프롤린 (Pro 또는 P), 트립토판 (Trp 또는 W), 페닐알라닌 (Phe 또는 F) 및 메티오닌 (Met 또는 M). 마찬가지로, 하기의 중성 극성 아미노산들이 그들의 그룹 내에서 서로 치환될 수 있다: 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 티로신 (Tyr 또는 Y), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Glu 또는 Q), 및 아스파라긴 (Asn 또는 N). 염기성 아미노 산은 리신 (Lys 또는 K), 아르기닌 (Arg 또는 R) 및 히스티딘 (His 또는 H)를 포함하는 것으로 생각된다. 산성 아미노산은 아스파르트산 (Asp 또는 D) 및 글루탐산 (Glu 또는 E). 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백한 경우, 본원에서 나타낸 아미노산들은 L-아미노산인 것으로 판단하여야 한다. 또한, 표준 아미노산들이 동일한 화학적 부류에 속하는 비표준 아미노산들로 치환될 수 있다. 비제한적인 예로서, 염기성 곁 사슬인 Lys는 더욱 짧은 곁 사슬 길이의 염기성 아미노산(오르니틴, 디아미노부틸산, 또는 디아미노프로피온산)으로 치환될 수 있다. 또한, Lys는 중성 지방족 이소스테르(isostere)인 노르루신(Nle)으로 치환될 수 있고, 이는 다시 더욱 짧은 지방족 곁 사슬(아미노부틸산 또는 아미노프로피온산)을 포함하는 유사체로 치환될 수 있다.

인간 프로인슐린의 아미노산 서열을 비교 목적을 위하여 서열번호 1로 제공된다.

서열번호: 1 (인간 프로인슐린)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

인간 인슐린의 A 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 2로 제공된다.

서열번호: 2 (인간 A 사슬)

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 3으 제공된다.

서열번호: 3 (인간 B 사슬)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

KP-인슐린(insulin lispro, Humalog®의 유효 성분; Eli Lilly and Co.사)의 변형된 B 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 4로서 제공된다.

서열번호: 4 (인간 "KP" B 사슬)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr

서열번호 5는, 이미 개시되었고(Hua, Q.X., 등. J. Biol . Chem. 283, 14703-16 (2008)) 그의 구조가 도 1 및 도 2에서 도시되어 있는 단일 사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 유사체와 다르게, 이러한 서열은 위치 A14, C1 및 C2의 산 잔기들이 결실되어 있고, 위치 B10에서 산성 잔기를 포함하며, 이에 따른 얻어지는 단일 사슬 인슐린 유사체는 본 발명의 원하는 이상 약력학적 특성을 나타내지 않는다.

본 발명의 단일 사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열은 단일 사슬 인슐린 유사체에 해당하는 서열번호 6 내지 19에서 부분적으로 표시되어 있다. 이러한 서열들은 당업계에 알려진 바와 같이, 표준 단일문자 암호를 이용하므로, Ala은 A로 표시되고, 시스테인은 C로 표시되고, 아스파르트산은 D로 표시되고, 글루탐산은 E로 표시되는 것 등이다. 적색의 구성요소는 야생형 인슐린 또는 야생형 프로인슐린에 존재하지 않는 서열 또는 치환을 나타낸다. 서열번호 13 및 서열번호 19에서의 생략표현(dash)은 N-말단 잔기인 B1-B3의 결실(des-B1-B3 유사체로 명명함)을 나타낸다.

또한, 본 발명의 단일 사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열은, X₁, X₂ 등에 의해 나타낸 위치에서 임의의 구성요소들을 갖는 단일 사슬 인슐린 유사체에 해당하는 서열번호 20 내지 서열번호 34에서 표시되는데, 이러한 위치들은 녹색으로 나타낸다. 위와 같이, 적색으로 나타낸 구성요소는 야생형 인슐린 또는 야생형 프로인슐린에 존재하지 않는 서열 또는 치환을 나타낸다. 서열번호 13 및 서열번호 19에서의 생략표현(dash)은 N-말단 잔기인 B1-B3의 결실(des-B1-B3 유사체로 명명함)을 나타낸다.

여기서, X₁은 그룹 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu 또는 Lys로부터 선택되고; X₂ 는 그룹 Ala, Arg, Gln, Glu 또는 Lys로부터 선택되고; X₃는 그룹 Gln, Glu, Phe, Trp 또는 Tyr로부터 선택되고; X₁은 그룹 Ala, Arg, Glu, Lys 또는 Pro로부터 선택된다.

또한, 본 발명의 단일 사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열은, Y₁, Y₂등(자홍색)에 의해 나타낸 바와 같은 연결 도메인의 위치에서 임의의 구성요소를 갖는 단일 사슬 인슐린 유사체에 해당하고 녹색으로 나타낸 바와 같이 상기의 임의적인 서열 특징 X₁, X₂ 등을 포함하는 서열 번호 35 내지 49에서 표시되어 있다. 위와 같이, 적색으로 나타낸 구성요소는 야생형 인슐린 또는 야생형 프로인슐린에 존재하지 않는 서열 또는 치환을 나타낸다. 서열번호 13 및 서열번호 19에서의 생략표현(dash)은 N-말단 잔기인 B1-B3의 결실(des-B1-B3 유사체로 명명함)을 나타낸다.

여기서, X₁은 그룹 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu 또는 Lys로부터 선택되고; X₂는 그룹 Ala, Arg, Gln, Glu 또는 Lys로부터 선택되고; X₃는 그룹 Gln, Glu, Phe, Trp 또는 Tyr로부터 선택되고; X₁은 그룹 Ala, Arg, Glu, Lys 또는 Pro로부터 선택되고; Y₁ 및 Y₂는 각각 Asp 또는 Glu 이다.

또한, 본 발명의 단일 사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열은, Y₁, Y₂ 등 (자홍색)로 나타낸 바와 같은 연결 도메인 내의 위치에서 임의의 구성요소들을 갖는 추가의 1 내지 5개의 아미노산 잔기(하기에서 청색으로 B_1-5로 나타냄) 단일 사슬 인슐린 유사체에 해당하고 녹색으로 나타낸 바와 같이 상기의 임의의 서열 특징 X₁, X₂ 등을 포함하는 서열번호 50 내지 서열번호 64에서 표시된다. 위와 같이, 적색으로 나타낸 구성요소는 야생형 인슐린 또는 야생형 프로인슐린에 존재하지 않는 서열 또는 치환을 나타낸다. 서열번호 13 및 서열번호 19에서의 생략표현(dash)은 N-말단 잔기인 B1-B3의 결실(des-B1-B3 유사체로 명명함)을 나타낸다.

여기서, X₁은 그룹 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu 또는 Lys로부터 선택되고; X₂는 그룹 Ala, Arg, Gln, Glu 또는 Lys로부터 선택되고; X₃은 그룹 Gln, Glu, Phe, Trp 또는 Tyr로부터 선택되고; X₁은 그룹 Ala, Arg, Glu, Lys 또는 Pro로부터 선택되고; Y₁ 및 Y₂은 각각 Asp 또는 Glu 이고; 잔기 B₁, B₂, B₃, B₄, B₅는 각각 선택적으로 존재할 수 있고 그룹 Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser 또는 Thr로부터 선택될 수 있다.

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 6(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 65

TTCGTCAATCAACACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCATTGTACTTGGTCTGTGGTGAGAGAGGATTCTTCTACACCGATCCAACTGGTGGTGGTCCTAGAAGAGGAATCGTCGAGCAATGTTGCCACTCCATTTGTTCCTTGGAACAATTGGAAAACTACTGCAACTAA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 7(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 66

TTCGTCAATCAACACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCATTGTACTTGGTCTGTGGTGAGAGAGGATTCTTCTACACCGATCCAACTGGTGAGGGTCCTAGAAGAGGAATCGTCGAGCAATGTTGCCACTCCATTTGTTCCTTGGAACAATTGGAAAACTACTGCAACTAA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 8(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 67

TTCGTCAATCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTGATCCAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 9(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 68

TTCGTCAATCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTGATCCAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTGGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 10(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 69

TTCGTCAATCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTCCAGAAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 11(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 70

TTCGTCAATCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAGAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 12(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 71

TTCGTCAATCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTGAGCCAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 13(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 72

TTCGTCAAACAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTCCAGAAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 15(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 73

TTCGTTAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTGATCCAACTGAAGAGAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTAA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 16(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 74

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 17(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 75

TTCGTTAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTGATCCAACTGAAGAGAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTAA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 18(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 76

TTCGTCAATCAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTCAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTCCAGAAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

하기의 DNA 서열은 피키아 파스토리스에서의 사용 패턴을 위해 최적화된 코돈을 갖는 서열번호 19(상기 참조)에서 나타낸 단일 사슬 인슐린 유사체를 암호화한다.

서열번호 77

TTCGTCAAACAGCACTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAGGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAGAGAGGTTTCTTCTACACTGACCCAACTGAAGAGGGTCCAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAGTGTTGTCACTCCATCTGTTCCTTGGAGCAGTTGGAGAACTACTGTAACTGA

유사한 합성 유전자들을 제조하여, 서열번호 31 내지 서열번호 37에서 구체화된 바와 같이 SCI-59A (하기 참조) 및 SCI-59A의 유도체 및 추가적인 치환 Glu^B13→Gln을 포함하는 SCI-59B를 암호화하는 피키아 파스토리스에 클로닝했다.

본 발명의 두 개의 단일 사슬 인슐린 유사체(서열번호 8 및 서열번호 10에 의해 암호화됨; 각각 SCI-57DP 및 SCI-57PE로 명명함)를, 피키아 파스토리스에서 전구체 폴리펩티드의 생합성을 통해 제조했는데, 이러한 계는 절단 N-말단 연장 펩티드를 갖는 천연 디설파이드 브릿지를 포함하는 접혀진 단백질을 분비한다. 과발현의 효율(> 200 mg/발효시 배양 l)이 도 5에서 도시되어 있다. 그 절단된 단일 사슬 인슐린 생성물은 30개 잔기 B-도메인, 6개 잔기 C-도메인(각각의 경우마다 서열 EEGPRR) 및 21개 잔기 A-도메인의 합인 57개 잔기의 길이를 가졌다. SCI-57DP 및 SCI-57PE의 형식(formal) 등전점(pI)은 각각의 경우마다, 야생형 B29 (LysB29)에서 양전하의 제거, B28 또는 B29에서의 산성 치환(TyrA14→Glu) 및 C-도메인에서의 염기성 및 산성 곁 사슬들의 오프셋을 통해 5.0 미만으로 이동한 것으로 추정되었다.

상기 단일 사슬 유사체들의 열역학적 안정성을 예전에 설명된 바와 같이 CD-모니터 구아니딘 변성을 통해 탐지했다(Hua, Q.X., 등. J. Biol. Chem. 283, 14703-16 (2008)). 그 결과(하기 표 1의 칼럼 2)는 SCI-57DP 및 SCI-57PE 각각은 야생형 인슐린 또는 KP-인슐린과 비교하여 화학적 변성에 대하여 더욱 안정하다는 것을 나타낸다. 각각의 경우에 있어서, 그 단백질의 50% 접힘을 달성하기 위하여 더욱 높은 농도의 구아니딘-HCl이 요구되었고(표 1의 칼럼 3), m의 더욱 높은 값에 대한 경향이 관찰되어(칼럼 4), 접혀진 상태에서 비극성 표면들의 더욱 효율적인 탈용매화(desolvation)가 확인되었다. 37℃에서 부드러운 교반시 피브릴화에 대한 SCI-57PE의 감수성은 야생형 인슐린 또는 KP-인슐린과 비교하여 현저히 지연된 것으로 확인되었다(표 1의 칼럼 5). 야생형 인슐린 및 KP-인슐린은 이러한 조건하에서 10일 이내에 피브릴을 형성하는 반면에, SCI-57PE는 최소한 9개월 동안 피브릴화에 대하여 내성이 있다.

SCI-57DP 및 SCI-57PE의 수용체 결합 친화성을 야생형 인간 인슐린과 비교하여 측정했다. 그 분석법은 인슐린 수용체의 A 아형을 이용했다. 인간 인슐린(평형 해리 상수 0.05(±0.01) nM)과 비교하여, SCI-57DP 및 SCI-57PE는 각각 0.06(±0.01) nM 및 0.08(±0.01) nM의 결합 상수를 나타냈다. 미토겐 1형 IGF-I 수용체에 대한 SCI-57DP의 친화력은 야생형 인간 인슐린의 것보다 적어도 5배 더 낮았다. 수용체 결합 활성의 분석을 위한 프로토콜은 다음과 같았다. 마이크로타이터 스트립 플레이트(Nunc Maxisorb사)를 AU5 IgG (인산염 완충 염수에서 40 mg/ml의 웰 당 100 ㎕)와 함께 4℃에서 밤새 정치했다. 2부위 순차 모델(two-site sequential model)을 통해 결합 데이터를 분석했다. 데이터는 비특이적 결합(1 mM 인간 인슐린의 존재하에서 관련된 막에 남아있는 방사능의 양)에 대하여 보정했다. 모든 분석에 있어서, 경쟁 리간드의 부재하에서 결합된 트레이서(tracer)의 비율은 리간드-결핍 인공산물을 회피하기 위하여 15% 미만이었다. 해리 상수(K_d)는 Whittaker 및 Whittaker (2005. J. Biol . Chem . 280: 20932-20936)에 의해 설명된 바와 같이 수학적 모델에의 피팅(fitting)을 통해 결정했고, 그 모델은 이종 경쟁의 가정에 따라 비선형 회귀를 이용했다(Wang, 1995, FEBS Lett . 360: 111-114).

유사체	△Gub kcal/mol	C _mid (M)^c	m ( kcal/mol/M)^d	피프릴화 지연 시간^e
야생형 인슐린	3.6 ± 0.1	4.9 ± 0.07	0.73 ± 0.01	3-6 일
KP-인슐린	3.1 ± 0.1	4.5 ± 0.1	0.69 ± 0.01	2-4 일
SCI-57DP	4.3 ± 0.1	5.7 ± 0.13	0.74 ± 0.02	ND^f
SCI-57PE	4.6 ± 0.1	5.7 ± 0.11	0.80 ± 0.02	>9 mo

25℃에서 인슐린 유사체의 열역학적 및 물리적 안정성^a

^a열역학적 안정성은 0의 변성제 농도에 외삽된 2상태 모델에 의해 분석된 25℃에서의 CD-검출 구아니딘 변성(222 nm)으로부터 추정되었다.

^b△G_u는 2상태 모델에 의해 1의 변성제 농도에 외삽된 바와 같이 구아니딘-HCl에서 변성시 자유 에너지의 외견상 변화.

^c C _mid 는 단백질의 50%가 접혀지는 구아니딘-HCl의 농도로서 정의된다.

^dThe m 값은 변성제의 몰 농도에 대한 접혀지는 자유 에너지 △G_u의 기울기로서, 변성시 비극성 표면의 노출의 정도와 관련이 있다.

^e피브릴화 지연 시간은 티오플라빈-T-양성 응집의 개시 이전의 측정치(일)로서, 삼중의 유사체들이 U-100의 공칭 강도에서 Tris-HCl 제형에서 45℃에서 온화하게 진동되었다.

^fND; 측정되지 않음.

생물학적 활성 및 약력학적 특성은 스트렙토조토신에 의해 당뇨를 유발시킨 수컷 Sprague-Dawley 쥐(약 300 g)에서 시험했다(도 6). U-100 (0.6 mM) SCI-57PE 및 SCI-57DP의 피하 주사의 PD 영향은 Humalog® 및 25-75 Humalog® pre-mix와 비교하여 평가하였는데, 혈당 농도의 얻어지는 전체 프로필(도 6A)은 예비혼합된 Lilly 생성물과 유사하다는 것을 나타내어, 그의 장기 지속성(120 내지 540 분) 및 신속 작용 성분들이 확인되었다(도 6B). 주사 후 첫 번째 시간에 걸친 혈당 농도의 초기 감소 속도가 도 7에서 도시되어 있다.

SCIs의 열적 안정성. 현재의 인슐린 생성물의 신속 분해에 유리한 조건(즉, 공기-액체 계면의 존재하에서 유리 바이알에서 45℃에서 부드러운 교반)하에 상기 쥐에서 평가했다(도 8). 도 8A에서는 신선한(fresh) 물질이 이용되었다. 대조구는 Humalog® 및 Lantus®에 의해 제공되었다. Lantus®은 11일 후에 불활성화되고(도 8B) Humalog®은 5일 이내에 불활성화된 반면(미도시), SCI-2 (◆ 및 □)은 57일 후에 투명한 용액으로 검사한 때 완전한 활성을 유지했다(도 8B). SCI-57PE (이의 G_u는 SCI-DP의 것보다 큼; 상기 표 1 참조)은 분해에 대하여 유사한 내성을 나타낸다(미도시).

구조적인 연구는 원형 이색성(CD) 및 NMR 분광분석을 이용했다. SCI-57DP 및 SCI-57PE의 원자외선 CD 스펙트럼은 인간 인슐린의 찬연 구조 및 단일 사슬 인슐린 유사체의 용액 구조에 따라 알파-나선이 압도적임을 나타냈다(Hua, Q.X., 등. J. Biol . Chem. 283, 14703-16 (2008)). NMR 연구는 < 1 mM의 단백질 농도에서 그의 단량체 상태의 측면에서 아연 이온의 부재하에서 수용액중의 SCI-57DP에 집중되었다. 스펙트럼은 700 MHz의 양자 주파수에서 획득했다. 2D-NMR NOESY 스펙트럼 및 ¹H-¹⁵N 이종핵 단일-양자 결맞음(HSQC) 2D "핑거프린트" 스펙트럼은 접혀진 구조에 대한 증거를 제공하였는데, NOE의 패턴 및 화학적 이동은 57개 잔기 단일 사슬 인슐린 유사체의 이전의 분석과 일치한다(Hua, Q.X. 등. J. Biol . Chem. 283, 14703-16 (2008)).

헥사머 해체(hexamer disassembly )의 속도를 가시 흡수 스펙트럼을 통해 25℃ 및 pH 7.4에서 R₆ 코발트 헥사머에서 평가했다. 이러한 분석법은 과량의 킬레이터 EDTA에 의한 금속 이온 방출 및 격리의 속도를 모니터하기 위해 2개의 4면체형 Co²⁺ 부위의 청색 d-d 흡수 밴드를 이용하는데, 8면체형 Co² ⁺-EDTA 복합체는 무색이다. 특히, 야생형 인슐린의 Lilly Co² ⁺-EDTA 격리 분석(sequestration)은 이러한 조건하에서 574 nm에서 흡광도의 단일 지수적 손실을 유발하는 반면(도 9에서 흑색선), SCI-1는 신속 상(인슐린 리스프로(lispro )보다 빠름) 및 느린 상(야생형 인슐린보다 느림)을 가지고서 이중 지수적 전이를 나타낸다(도 9의 녹색선). CWRU의 Weiss 그룹에 의해 시험된 2개 사슬 인슐린 유사체의 포트폴리오 중에서, EDTA 분석에서의 이러한 이상 동적 거동은 새로운 것이다. 이러한 분석은 동물(및 이후에 인간)에서의 PK 연구와 관련이 있었는데, 이러한 분광분석 결과는 본 발명의 SCI들이 피하 침착물(쥐에서와 같은)에서 이상 PK 특성을 나타낸다는 본 발명자들의 포괄적인 가설의 동기가 되었다. 이러한 이상 거동의 분자적 기작은 확인된 상태로 남아있지만, 인슐린 데글루덱(degludec ) (Novo-Nordisk사의 새로운 기본 유사체)에서 확인되는 바와 같은 페놀-의존적 RT 전이를 포함할 수 있다.

당뇨병 환자를 치료하기 위한 방법은 본원에 기재한 바와 같은 단일 사슬 인슐린 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 단일 사슬 인슐린 유사체가 효소(파키아 파스토리스)에서 또는 천연 단편 결찰을 통한 전체 화학적 합성을 통해 제조될 수 있다는 것이다. 그 재조의 합성 방법은 Phe 또는 Tyr의 방향족 고리 내의 할로겐 치환, D-아미노산 치환과 같은 비표준 변형, 또는 탄수화물에 의한 세린 또는 트레오닌의 O-결합 변형의 경우에 바람직하지만, 확장된 유전자 코드 기술 또는 4개 염기 코돈 기술에 의해 비표준 변형을 포함하는 단일 사슬 유사체들의 서브세트를 제조하는 것이 가능하다(검토를 위하여, Hohsaka, T., & Sisido, M., 2012 참조). 본 발명의 여전히 또 다른 측면은 비표준 아미노산 치환의 사용이 화학적 분해 또는 물리적 분해에 대한 단일 사슬 인슐린 유사체의 저항성을 증가시킬 수 있다는 것이다. 또한, 본 발명자들은 당뇨병 또는 대사성 증후군의 치료 방법을 제공하는 본 발명의 유사체를 고려한다. 인슐린 유사체의 전달 경로는 주사기 또는 펜 기기(pen device)의 사용을 통한 피하 주사이다.

또한, 본 발명의 단일 사슬 유사체는 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 공계류중인 미국 특허출원 제 13/018,011호에 더욱 충분히 기재된 바와 같이 위치 B24, B25 또는 B26에서 할로겐 원자와 같은 다른 변형을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 인슐린 유사체는 공계류중인 미국 가특허출원 제 61/589,012호에 기재된 바와 같이 잔기 B1 내지 B3의 결실로 인해 단축된 B-사슬을 포함할 수도 있다.

약학적 조성물은 이러한 인슐린 유사체를 포함할 수 있고, 아연을 선택적으로 포함할 수 있다. 아연 이온은 인슐린 유사체 헥사머 1개당 2.2개 아연 원자 내지 인슐린 유사체 헥사머 1개당 10개 아연 원자의 범위에서 변화하는 아연 이온:단백질 비로 포함될 수 있다. 그 제형의 pH는 pH 7.0 내지 8.0의 범위일 수 있는데, 환충액(대표적으로는 인산나트륨 또는 트리스-히드로클로라이드)가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 이러한 제형에서, 인슐린 유사체의 농도는 일반적으로 약 0.6 내지 5.0 mM일 수 있고, 5 mM 이하의 농도가 바이알 또는 펜에서 사용될 수 있고, 더욱 높은 농도의 제형(U-200 이상)은 두드러진 인슐린 저항성을 갖는 환자에서 특히 이점을 가질 수 있다. 부형제는 글리세롤, 글리신, 아르기닌, 트리스, 다른 완충액 및 염, 및 페놀 및 메타-크레졸과 같은 항균성 보존제를 포함할 수 있는데, 후자의 보존제는 인슐린 헥사머의 안정성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 약학적 조성물은 생리학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 당뇨병 또는 다은 의학적 상태를 갖는 환자에게 투여함으로써 상기 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

전술한 개시내용에 기초하여, 상기 제공된 단일 사슬 인슐린 유사체는 위에서 기재된 목적을 수행할 수 있다는 것이 명백하게 된다. 즉, 상기 인슐린 유사체는 피브릴화에 대하여 향상된 저항성을 나타내면서, 바람직한 악동학적 및 약력학적 특징을 보유하고(이상 작용을 부여함) 야생형 인슐린의 생물학적 활성의 적어도 일부분을 유지한다. 따라서, 명백하게 되는 임의의 변화는 청구한 본 발명의 범위에 속하므로, 본원에 개시 및 기재한 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 특정 구성 요소들의 선택이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본원에 기재된 실험 및 분석 방법들이 당업자에 의해 이해될 수 있다는 것을 입중하기 위해 하기의 문헌들이 언급된다.

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25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 6 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Gly 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 7 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Gly Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 8 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 9 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Trp Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 10 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 11 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Arg Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 12 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 13 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Glu Glu Gly Pro Arg 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 14 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 15 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 16 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu 35 40 45 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 17 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 18 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 19 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu Gly Pro Arg 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 20 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 20 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Ser 20 25 30 Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 21 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 21 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Ser Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 22 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 22 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Gly Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 23 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 23 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 24 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 24 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Xaa Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 25 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 25 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 26 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 26 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 27 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 27 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 28 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 28 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu Gly Pro Arg 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 29 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 29 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 30 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 30 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 31 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 31 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa 35 40 45 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 32 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 32 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 33 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 33 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 34 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 34 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Glu Glu Gly Pro Arg 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 35 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 35 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Ser 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 36 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 36 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Ser Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 37 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 37 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 38 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 38 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 39 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 39 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Xaa Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 40 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 40 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 41 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 41 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 42 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 42 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 43 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(29) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 43 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa Gly Pro Arg 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 44 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 44 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 45 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 45 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 46 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 46 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa 35 40 45 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 47 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 47 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 48 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 48 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 49 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(29) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 49 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa Gly Pro Arg 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln 35 40 45 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 50 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 50 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Ser 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 51 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 51 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Ser Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 52 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 52 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Glu 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 53 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 53 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 54 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is Ala, Arg, Glu, Lys, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 54 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Xaa Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 55 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 55 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 56 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 56 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 57 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 57 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 58 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(29) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(36) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 58 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa Gly Pro Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile 35 40 45 Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 59 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 59 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 60 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(38) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 60 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa 35 40 45 Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 61 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(37) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 61 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser 35 40 45 Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 62 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(37) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 62 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile 35 40 45 Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 63 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(39) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 63 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60 <210> 64 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(29) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(36) <223> Xaa is 0-5 amino acids independently selected from the group Ala, Asn, Gln, Gly, Pro, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa is Ala, Arg, Gln, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Gln, Glu, Phe, Trp, or Tyr <400> 64 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr Xaa Xaa Gly Pro Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile 35 40 45 Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 65 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 ttcgtcaatc aacacttgtg tggttcccac ttggttgagg cattgtactt ggtctgtggt 60 gagagaggat tcttctacac cgatccaact ggtggtggtc ctagaagagg aatcgtcgag 120 caatgttgcc actccatttg ttccttggaa caattggaaa actactgcaa ctaa 174 <210> 66 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 ttcgtcaatc aacacttgtg tggttcccac ttggttgagg cattgtactt ggtctgtggt 60 gagagaggat tcttctacac cgatccaact ggtgagggtc ctagaagagg aatcgtcgag 120 caatgttgcc actccatttg ttccttggaa caattggaaa actactgcaa ctaa 174 <210> 67 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 ttcgtcaatc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgatccaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 68 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 ttcgtcaatc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgatccaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttcctgggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 69 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 ttcgtcaatc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tccagaaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 70 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ttcgtcaatc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tccaagaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 71 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 ttcgtcaatc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgagccaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 72 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 ttcgtcaaac agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tccagaaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 73 <211> 168 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 ttcgttaacc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgatccaact gaagagagaa gaggtatcgt tgagcagtgt 120 tgtcactcca tctgttcctt ggagcagttg gagaactact gtaactaa 168 <210> 74 <211> 168 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 ttcgttaacc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgatccaact gaagagagaa gaggtatcgt tgagcagtgt 120 tgtcactcca tctgttcctt ggagcagttg gagaactact gtaactaa 168 <210> 75 <211> 165 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 ttcgttaacc agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgatccaact gaagagagag gtatcgttga gcagtgttgt 120 cactccatct gttccttgga gcagttggag aactactgta actaa 165 <210> 76 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 ttcgtcaatc agcacttgtg tggttcccac ttggttcagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tccagaaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174 <210> 77 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 ttcgtcaaac agcacttgtg tggttcccac ttggttgagg ctttgtactt ggtttgtggt 60 gagagaggtt tcttctacac tgacccaact gaagagggtc caagaagagg tatcgttgag 120 cagtgttgtc actccatctg ttccttggag cagttggaga actactgtaa ctga 174

Claims

C-도메인의 N-말단 측에서 적어도 2개의 산성 잔기 및 C-도메인 펩티드의 C-말단 측에서 적어도 2개의 염기성 잔기를 포함하는 6개 내지 11개 아미노산 잔기의 C-도메인,
인간 인슐린의 A8에 해당하는 위치에서 염기성 아미노산 잔기, 및
인간 인슐린의 A14에 해당하는 위치에서 산성 아미노산 잔기를
포함하는 단일 사슬 인슐린.
제 1 항에 있어서, 상기 C-도메인이 C-도메인의 N-말단 측에서 아미노산인 Glu-Glu를 갖는, 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 C-도메인이 C-도메인의 C-말단 측에서 아미노산인 Arg-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys, 또는 Lys-Arg를 갖는, 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-도메인이 상기 산성 잔기와 상기 염기성 잔기의 사이에서 2개 내지 4개 아미노산의 조인트 영역을 포함하는, 단일 사슬 인슐린.
제 4 항에 있어서, 상기 조인트 영역이 글리신, 세린 및 프롤린 잔기들 중 하나 이상으로 본질적으로 구성되는, 단일 사슬 인슐린.
제 5 항에 있어서, 상기 조인트 영역이 Gly-Pro를 포함하거나 그로 구성되는, 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A8에 해당하는 위치에서의 아미노산이 Lys, Arg, Hist 또는 Orn인, 단일 사슬 인슐린.
제 7 항에 있어서, 상기 A8에 해당하는 위치에서의 아미노산이 Lys 또는 Arg인, 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A14에 해당하는 위치에서의 아미노산이 Glu인, 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 B28 및/또는 B29에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 단일 사슬 인슐린.
제 10 항에 있어서, 상기 B28 및/또는 B29에 해당하는 위치에서의 아미노산 치환이 산성 아미노산인, 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 인슐린의 B10에 해당하는 위치에서 히스티딘 치환을 갖는 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 위치 A21에서 Asn에 대하여 Gly, Ala 또는 Ser의 치환을 갖는 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 서열번호 6 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 단일 사슬 인슐린.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 5.0 미만의 예측된 등전점을 갖는 단일 사슬 인슐린.
7.0 내지 8.0의 범위내의 pH에서 제형화된, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 단일 사슬 인슐린을 포함하는 약학적 조성물.
제 16 항에 있어서, pH 완충액을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 0.6 mM 내지 5.0 mM의 농도로 제형화되는, 약학적 조성물.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 U-100, U-200, U-300, U-400 또는 U-500의 강도로 제형화되는, 약학적 조성물.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 단일 사슬 인슐린이 U-500 내지 U-1000의 강도로 제형화되는, 약학적 조성물.
제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 헥사머 1개당 2개 내지 4개의 아연 이온을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 헥사머 1개당 2개 미만의 아연 이온을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
당뇨병을 치료하는 방법으로서, 제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 피하 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 1일에 2회 투여되는, 방법.