KR20170058498A

KR20170058498A - 신규 항균 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20170058498A
Application number: KR1020150161837A
Authority: KR
Inventors: 이태훈; 김재윤; 김재왕; 기선호
Original assignee: (주)노바셀테크놀로지
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2017-05-29
Also published as: JP2019506362A; HK1253725A1; US20180319840A1; DK3378870T3; CN108473533B; CN108473533A; JP6611291B2; EP3378870A4; KR101855170B1; WO2017086596A1; EP3378870B1; US10421781B2; EP3378870A1

Abstract

본 발명은 항균 효과와 면역 세포의 활성 조절 기능을 함께 가지는 새로운 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 면역세포의 활성을 조절하는 한편, 그람 음성균 및 그람 양성균 등의 각종 박테리아에 대하여 항균활성도 나타내고 있어 아토피 피부염과 같은 각종 면역 질환의 치료는 물론 병원성 세균의 감염으로 인한 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규 항균 펩타이드 및 그의 용도{A novel antimicrobial peptide and use thereof}

본 발명은 신규 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 항균효과와 면역세포의 활성 조절 기능을 함께 가지는 신규한 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

항균 펩타이드는 자연계에서 발견되기도 하고 합성 펩타이드로부터 그 활성이 보이기도 한다. 이러한 항균 펩타이드들은 일반적인 단백질에 비해 비교적 짧은 아미노산 서열(10 여개 내지 100 여개)로 이루어져 있고, 주로 세포막에 결합하면 1) 세포막에 이온채널을 형성하여 미생물의 에너지 생성을 저해하거나, 2) 세포막에 큰 구멍을 만들게 되어 결과적으로 세포가 죽게 된다. 이렇게 물리적으로 미생물을 파괴하므로, 미생물의 세포벽이나 세포 내 고분자 합성을 저해하는 기존의 항생제들과는 달리 미생물들이 항균 펩타이드에 대한 내성을 갖게 되기는 매우 어려우며, 현재까지도 내성이 생기지 않는 것으로 보고되고 왔다. 현재까지 알려진 많은 항균 펩타이드들 사이에서 서열상의 유사성은 거의 나타나지 않지만, 구조나 활성의 측면에서는 몇 가지 일반적인 경향성을 보인다. 대표적으로 항균 펩타이드는 라이신, 아르기닌, 히스티딘과 같은 양전하를 띠는 부분과 소수성을 지닌 부분이 존재한다는 점이다. 현재 항균 펩타이드의 작용기작에 관련된 가설 중 가장 타당성 있게 제시되고 있는 Shai-Matsuzaki-Huang(SMH) 모델에서는 항균 펩타이드의 서열상의 특징과 작용기전을 하기와 같이 설명한다: 양전하를 띤 친수성 부분이 음전하를 띤 박테리아의 세포막과 결합하고 난 뒤, 세포막과 결합된 펩타이드의 소수성 부분이 세포막 인지질(phospholipid)의 소수성 부분과 상호작용하여, 세포막 상에 구멍을 형성하게 되어 세포막의 투과도를 변화시키게 됨으로써 세포를 파쇄하게 된다. 호중구(neutrophil) 및 모노사이트와 같은 식세포(phagocytic cell)에서 발현되는 포르밀 펩타이드 수용체 족(formyl peptide receptor 1(FPR1) 및 formyl peptide receptor 2(FPR2))은 병원균 감염에 대한 숙주의 대항(defense)에서 중요한 역할을 한다(Mangmool, S. et al., Toxins, 3: 884-899, 2011). 상기 수용체는 백일해 톡신-민감성(pertussis toxin-sensitive) Gi 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있다(Nakashima, K., et al., J. Biol. Chem., 290(22): 13678-91, 2015). 그 중에서도 FPR2는 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. FPR2의 활성화는 Gαi 서브유닛에서 Gβγ 서브유닛의 분리를 유도하고, βγ-서브유닛은 포스포리파제 Cβ 또는 포스포이노시타이드 3-카이나제의 활성화를 유도한다(Duru, E.A., et al., J. Surg. Res., 195(2): 396-405, 2015). 이러한 분자들의 활성화는 복잡한 하류(downstream) 신호전달을 유도하여 주화성 이동(chemotactic migration), 탈과립화(degranulation), 및 수퍼옥사이드 생성(superoxide generation)와 같은 세포 반응을 다양화하여 생체 내의 면역반응을 조절하게 된다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 항균 작용과 면역 활성을 동시에 갖는 신규 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 아울러, 상기 펩타이드를 포함하는 항균제, 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물, 및 아토피성 피부 개선용 화장료 조성물 등 상기 펩타이드의 다양한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 신규 항균 및 면역조절 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 N-말단에 옥타노일기가 부가된 펩타이드의 그람양성균(Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus) 및 그람 음성균(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli)에 대한 항균활성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 면역세포에서 FPR2 의존적인 세포 내 칼슘 이온 증가 활성을 나타낸 것으로, A는 RBL세포, RBL세포에서 FPR2과 FPR1를 각각 과발현 시킨 세포에서 펩타이드의 FL 비율을 나타낸 그래프이고, B는 FPR2 가 과발현된 RBL세포에서 서열 1 펩타이드의 농도에 따른 칼슘 이온 증가 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 캡사이신 유도 아토피 피부염 모델에서상기 펩타이드 처리시 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 펩타이드 처리시 캡사이신 유도 아토피 피부염 모델에서 진피, 진피의 적용부위에서 피부염 개선 효과 확인 결과를 나타내는 것으로, A는 캡사이신을 처리하여 아토피 피부염을 유발시킨 신생 집쥐(Neo-Cap)에서의 피부염 개선효과를 나타낸 그래프이고, B는 캡사이신을 처리하여 아토피 피부염을 유발시킨 생후 2주 경과 집쥐(2 W Cap)에서의 피부염 개선효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 펩타이드(NCP112) 처리시 신생 모델동물(Neo-Cap, A) 및 생후 2주 경과 모델동물(2W Cap, B)의 펩타이드 처리 후 시간 경과(3주 내지 5주)에 따른 피부상태를 대조군과 비교하여 촬영한 일련의 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 펩타이드(NCP112)를 각각 신생 모델동물(Neo-Cap, 상단) 및 생후 2주 경과 모델동물(2 W Cap)에 처리하고 5주 경과 후의 피부조직 상태를 현미경을 관찰한 조직염색 사진(좌측 판넬) 및 상피의 두께를 측정한 결과를 나타내는 그래프(우측 판넬)이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 용어 "면역 조절 펩타이드"는 비면역글로불린 단백질 형태를 가지고 있으면서 직접 또는 간접적으로 항균 및 항바이러스 작용, 염증반응 조절, natural killer cell 자극, antibody dependent cellular cytotoxicity 조절 등과 같은 면역강화 작용을 하는 펩타이드를 의미한다. 다른 의미로는 상기 유전자에 의해 해독된 단백질은 호중구(neutrophil) 및 모노사이트와 같은 식세포(phagocytic cell)에서 발현되는 포르밀 펩타이드 수용체 족(formyl peptide receptor 1 (FPR1) 및 formyl peptide receptor 2 (FPR2))은 병원균 감염에 대한 숙주의 대항(defense)에서 중요한 역할을 한다. 상기 수용체는 백일해 톡신-민감성(pertussis toxin-sensitive) Gi 단백질과 결합하는 것으로 알려져 있다. FPR1과 FPR2의 활성화는 Gαi 서브유닛에서 Gβγ 서브유닛의 분리를 유도하고, βγ-서브유닛은 포스포리파제 Cβ 또는 포스포이노시타이드 3-카이나제의 활성화를 유도한다. 이러한 분자들의 활성화는 복잡한 하부(downstream) 시그널링을 유도하여 주화성 이동(chemotactic migration), 탈과립화(degranulation), 및 수퍼옥사이드 생성(superoxide generation)와 같은 세포 반응을 다양화한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "항균 펩타이드"는 일반적으로 비교적 단순한 구조로 이루어진 양이온성 펩타이드(cationic peptide) 화합물로서 그람 양성균(gram-positive bacteria), 그람 음성균(gram-negative bacteria), 진균, 바이러스 등에 대한 광범위한 항균 스펙트럼을 지니고 있으며, 그 기전이 완전히 밝혀져 있지는 않지만 일반적으로 미생물의 세포막을 파괴하는 작용 기전을 통하여 항균력 을 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "아토피 피부염"은 유아와 소아에서 가장 흔한 염증성 피부질환으로 심한 소양감, 홍반, 부종, 삼출, 가피, 인설, 태선화 등을 특징으로 하며, 재발이 잦고 만성으로 경과하며 반복적인 소파로 인한 찰상과 태선화 등 2차적인 병변이 특징적으로 나타난다.

발명의 상세한 설명:

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

상기 펩타이드는 N-말단에 옥타노일기(octanoyl group, CH₃(CH₂)₆CO-, 이하 'Oct-'로 약칭함)가 부착된 것일 수 있고, C-말단에 1 내지 6개의 아미노산이 부가된 것일 수 있다.본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균제가 제공된다.

상기 항균제는 그람음성균 및 그람양성균에 대하여 항균활성을 가질 수 있고, 상기 그람음성균은 대장균(E. coli), 살모넬라균(Salmonella sp.), 비브리오균(Vibrio sp.) 또는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있고, 상기 그람양성균은 황색포도상 구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상 구균(Staphylococcus epidermidis), 여드름균(Propionibacterium acnes) 또는 충치균(Streptomyces mutans)일 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올에서 선택되는 약학적 희석제중 1종 이상 포함할 수 있으며, 희석제는 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 투여목적 및 질병에 따라 상이하게 적용될 수 있다. 실질적으로 투여되는 활성 성분의 양은 다양한 관련 요소, 즉 치료하고자 하는 질병, 환자상태의 정도, 다른 약제(예를 들어 주화성 약제)와 공동투여여부, 환자의 나이 성별, 체중, 음식, 투여시간, 투여경로, 및 조성물의 투여비율(ratio)을 고려하여 결정하여야 한다. 상기 조성물은 투여량 및 투여경로가 질병의 형태 및 심각성에 따라 조절될 수 있기는 하지만 하루에 한번 또는 1-3번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 물질을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 경구 이외의 투여경로, 즉 직장, 정맥, 복막 및 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구, 및 피하를 통한 약제투여를 의미한다. 상기 펩타이드 또는 물질을 포함하는 약학 조성물은 경구 투여 형태, 주입 가능한 용액 또는 국소제제와 같은 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다. 제제화는 경구 및 주입 가능한 투여(진용액(true solution), 현탁액 또는 에멀젼)에 적합하도록 제조되는 것이 바람직하며, 정제, 캡슐, 연질캡슐, 수성 약제, 환제, 과립 등과 같은 경구 형태로 제조되는 것이 가장 바람직하다. 상기 제제화에서 본 발명의 펩타이드는 부형제(excipient)없이 연질 캡슐에 충전되며, 담지체와 혼합되거나 희석된 후에 적당한 제제로 만들어진다. 적합한 담지체의 예로는 전분, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 등이 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 펩타이드를 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 화장료 조성물의 제형에 사용되는 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 예컨대, 그러한 첨가제에는 1, 3-부칠렌 글리콜, 대두 인지질 콜린, 스핑고신, 콜레스테롤, 트윈 80, 피토스핑고신, 살리실산, 피부보습제(습윤제), 유연제, 천연 오일, 케라틴, 리포이드, 흡수 수용성 물질, 각질층 세라마이드, 표피 지질 산성막 지방산, 콜레스테릴 에스테르, 에탄올, 증류수 등이 포함될 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예 및 실험예를 통해 더 상세히 설명된다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 항균 펩타이드의 제조

본 발명자들은 기초 스크리닝을 통해 항균활성을 갖는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(KFKWRYm)로 구성된 펩타이드를 탐색하였다. 상기 펩타이드는 통상의 아미노산 합성법(Umbarger, H. E., Ann. Rev. Biochem., 47: 533-606, 1978)을 이용하여 제조될 수 있다.

실시예 2: 항균 펩타이드의 수식

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 기초 탐색된 펩타이드의 항균활성을 보다 향상시키기 위해, 팔미토일기, 옥타노일기 등 다양한 지질성분을 상기 펩타이드의 N-말단에 부착시킨 수식 펩타이드를 합성하여, 항균활성을 조사하였다. 그 결과, 옥타노일기가 부착된 수식 펩타이드가 가장 활성이 좋은 것으로 확인되어, 이후 실험예에서는 Oct-KFKWRYm 펩타이드(이하, 'NCP112'으로 명명함)를 사용하였다.

실시예 1: 신규 펩타이드의 항균활성 실험

상기 실시예 2에서 제조된 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 항균검사를 수행하였다. 그람양성균(Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus)과 그람음성균(Pseudomonas aeruginosa 및 E. coli)을 준비하여, 한천 평판배지에 4차 도말하여 36℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. 다음 날 한천 평판배지 상에 생성된 균주 콜로니를 3 ml 영양배지에 접종하여 36℃, 220 rpm 조건으로 교반 배양기에서 밤새 배양하였다. 다음날 각 균들을 희석하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 0.5 가 되도록 조정하였다. 그 뒤 영양배지에 1:100 비율로 희석하였다. 그런 다음 상기 실시예 2에서 제조된 펩타이드를 영양배지에 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 및 20 μM 의 농도로 순차희석하여 1 ml 씩 제조한 후, 상기 희석된 균 1 ml을 접종하였다. 이어, 36℃, 220 rpm의 조건에서 교반 배양 18시간 동안 배양한 후, 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 결과를 분석하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 농도 의존적으로 시험한 모든 균에 대하여 항균활성을 나타냈다. 특히 10 μM의 농도에서는 네 종의 균의 생육을 완전히 억제시켰다. 네 종의 균 중 녹농균(P. aeruginosa)의 경우 항균효과가 가장 좋은 것으로 나타났다.

실시예 2: FPRL1 을 통한 세포내 Ca 이온 활성 분석

본 발명자들은 이어 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 펩타이드가 생체의 면역기능을 활성화시키는지 여부를 확인하기 위해 칼슘 이온 투과성의 변화를 관찰하였다. 구체적으로 상기 펩타이드가 FPR2를 활성화시키는지 확인하기 위하여 세포 내 칼슘이온의 농도를 측정하였다. 이를 위해 FPR2를 발현하지 않은 RBL세포와 RBL세포에서 FPR1을 과발현시킨 세포(FPR1-RBL)와 FPR2를 과발현시킨 세포(FPR2-RBL)를 사용하였고, 세포내 칼슘 이온의 유리를 예민하게 측정할 수 있는 방법으로 칼슘에 결합력이 강한 염색물질인 Fura-2/AM을 이용하였다. 즉, 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 RPMI 배지에 배양하고 대수기 상태일 때(mid-log phase, 1-3×10⁷ 세포/ml) 원심분리하여 수확한 다음 우태아 혈청이 함유되지 않은 RPMI 배지로 수회 세척하고 이를 1×10⁷ 세포/ml이 되도록 RPMI 배지에 재현탁하였다. 이어서 최종 3 μM 농도의 Fura-2/AM 을 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 45분 동안 계속 교반하면서 배양하였다. 적정 시간이 경과한 다음 세포를 수확하여 다시 RPMI 배지로 수회 세척한 다음 이를 250 μM 농도의 설핀피라존이 첨가된 적정량의 RPMI 배지에 현탁하여 세포 내로 들어간 Fura-2가 세포 외부로 유실되는 것을 방지하였다. 약 2×10⁶ 개의 세포를 매번 취하여 급속 원심분리로 수확하고 이를 칼슘 이온이 첨가되지 않고 EGTA가 첨가된 로크(Locke) 용액 1 ml에 재현탁하여 분광광도계 상 에서 340 nm 및 380 nm의 두 파장에서의 흡광도 비를 모니터링하였는데, 약 1분 간격으로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 농도를 달리하여(1 μM, 0.1 μM 및 0.01 μM) 처리한 후 두 파장에서의 흡광도 차이를 조사하였고, 이를 나중에 그린키에윅즈(Grynkiewicz)의 방법에 따라 세포 내로 유리된 칼슘 이온의 농도로 환산하였다. 그 결과는 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 처리시 FPR2-RBL세포에서만 특이적으로 세포 내 칼슘이온이 급격하게 증가하였으며(A), 펩타이드 처리에 따른 칼슘 이온의 세포 내 농도 증가량은 농도의존적인 양상을 나타냈다(B). 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드가 FPR2에의 결합 및 활성화를 통해 개체의 면역기능을 조절할 수 있다는 점을 시사하는 것이다.

실험예 3: 아토피 피부염 모델에서의 피부염 개선 효과

3-1: 외형적 변화 분석

이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 펩타이드가 실제 생체 내에서 면역기능을 활성화시킴으로써 면역관련 질환을 치료할 수 있는지 확인하기 위해, 아토피 동물모델에 상기 펩타이드를 처리하여 아토피 피부염의 증상을 개선할 수 있는지 조사하였다. 구체적으로 발명자들은 캡사이신 유도 아토피 피부염 모델에서 피부염 개선 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드(NCP112)를 아토피 모델 동물에서(Neo-Cap 및 2 W Cap)의 아토피 유발 피부조직의 진피, 진피 적용부위 및 긁은 부위에 처리한 후 피부 개선 정도를 관찰하였다. 상기 Neo-Cap은 태어난지 48시간 이내의 신생 집쥐(Sprague Dawley rat)의 등 피부에 50 mg/kg의 캡사이신을 피하 주사하여 아토피 피부염을 유발시킨 것으로 아토피 피부염의 대표적 모델 동물이다. 2 W Cap은 생후 2주 경과된 집쥐에 25 mg/kg의 캡사이신을 2회 피하 주사하여 아토피 피부염을 유발시킨 모델 동물로서, 청소년기 혹은 성인 발병 아토피 피부염을 모사하는 모델이다.

구체적인 실험 처치과정은 도 3에 나타나 있다. Neo-Cap 모델에서는 캡사이신 주사 2주 후에 피부염 점수를 측정한 뒤, 대조군(PBS)과 NCP112를 10 μM의 농도로 매일 등(200 μl)과 양쪽 귀(50 μl)에 도포하고 1주일 간격으로 3주 동안 피부염 점수를 측정하였다. 피부염 점수는 얼굴, 귀, 등(total)과 귀, 등 (application site)에서 피부 상태에 따라 점수를 측정하였고, 시작점인 2주째에서의 점수를 1로 하여 표준화하여, 도 4에 나타내었는데, 그 기준은 하기 표 1과 같다.

위치	점수	피부 상태
얼굴	0	정상
	1	성긴 털
	2	탈모 및 발적
	3	출혈 혹은 궤양 병변
귀	0	정상
	1	발적
	2	출혈
	3	귀 조직 손실
등	0	정상
	1	성긴 털
	2	탈모 및 발적
	3	출혈 혹은 궤양 병변

2W-Cap모델에서는 캡사이신 주사 1주 후에 피부염 점수를 측정한 뒤, 대조군(PBS)과 NCP112를 10μM의 농도로 매일 등(200 μl)과 양쪽 귀(50 μl)에 도포하고 1주일 간격으로 2주 동안 Neo-Cap 모델과 같은 방식으로 피부염 점수를 측정하였다. 시작점인 3w에서의 점수를 1로 하여 표준화 하여 도 4에 나타내었다.

3-2: 아토피 피부염의 피부조직병리 및 두께 평가

상기 실험예 3-1에서 분석한 마우스를 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 처리 5주 경과 후 희생시킨후 캡사이신 처리에 의해 피부염이 유발된 부위의 피부조직을 3 × 3 cm 정도의 크기로 적출한 후 적출된 피부조직을 2∼3일 정도 4% paraformaldehyde 용액에 고정하였다. 고정된 조직은 다시 1 × 0.5 cm의 크기로 다시 세분화하여 조직용 cassette에 담아 Tissue processor(Leica microsystems, Germany)로 탈수, 투명, 파라핀화 과정을 거쳐 -20℃에서 보관하였다. 박절을 하기 위해 Microtome(Leica microsystems, Germany)으로 파라핀블록을 5 ㎛의 두께로 자른 후 얇게 잘려진 조직리본은 항온수조에 띄워 평평하게 펴준 후 슬라이드 글라스에 조직의 절편을 부착하고 40℃ heating plate에서 건조시켰다. 마우스 피부조직의 병리학적 평가를 하기 위해 피부조직의 절편을 xylene으로 3분씩 3차례 탈파라핀을 하고 70 내지 100% 에탄올에 각각 1분씩 담그는 순서로 마지막으로 증류수에 수세를 하고 헤마톡실린 용액에 담가 조직세포의 핵부위를 염색하고 증류수로 수세한 후 다시 에오신으로 세포질을 염색하였다. 염색된 조직은 탈파라핀 과정의 역행으로 70 내지 100% 에탄올에서 자일렌 순으로 진행하며 마지막으로 포매제(embedding reagent)를 도포한 후 커버 글라스를 덮어 봉입하였다. 광학현미경 관찰을 하기 위해 200×의 배율로 염색된 조직을 촬영하여 병리학적 평가를 하였다. 도 5는 시간의 경과에 따른 아토피 피부염 유발된 부위의 피부조직의 상태를 촬영한 사진이고, 도 6은 아토피 피부염이 유발된 부위의 피부조직에 대한 조직 염색 결과를 나타내는 광학현미경 사진으로, Neo-Cap 및 2 W Cap 군 모두 대조군은 상피가 두터워져 전형적인 아토피 피부염의 증상을 나타냈으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 처리군(NCP112)의 경우 Neo-Cap에서는 상피층의 두께가 약간 감소하였고, 2 W Cap 군에서는 현저하게 감소하여 거의 정상 수준을 회복하였음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 동물 실험 결과 Neo-Cap 및 2 W Cap 모델 모두에서 아토피 피부염 증상을 개선하는 효과가 있었으며, 특히 2 W Cap 모델 동물에서는 거의 정상상태와 버금가는 피부상태를 나타내어, 매우 효율적임을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> NOVACELL TECHNOLOGY <120> A novel antimicrobial peptide and use thereof <130> PD15-5305 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anitimicrobial peptide <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> D-form amino acid <400> 1 Lys Phe Lys Trp Arg Tyr Met 1 5

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 신규 항균 및 면역조절 펩타이드.
제1항에 있어서,
N-말단에 옥타노일기(octanoyl group, CH₃(CH₂)₆CO-)가 부가된 것인, 펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서,
C-말단에 1 내지 6개의 아미노산이 부가된, 펩타이드.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균제.
제3항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균제.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물.
제3항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부 개선용 화장료 조성물.
제3항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부 개선용 화장료 조성물.